ES2236396T3 - Conjugados de factor ixy un polimero biocompatible. - Google Patents

Conjugados de factor ixy un polimero biocompatible.

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ES2236396T3 ES02013607T ES02013607T ES2236396T3 ES 2236396 T3 ES2236396 T3 ES 2236396T3 ES 02013607 T ES02013607 T ES 02013607T ES 02013607 T ES02013607 T ES 02013607T ES 2236396 T3 ES2236396 T3 ES 2236396T3
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Abstract

Un proceso para mejorar la función in vivo de un factor IX protegiendo dianas expuestas del factor IX, que comprende: (a) inmovilizar el factor IX por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico; (b) activar un polímero biocompatible; (c) conjugar el polímero biocompatible activado con sitios externos del factor IX inmovilizado; y (d) eluir el conjugado del adsorbente.

Description

Conjugados de factor IX y un polímero biocompatible.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un proceso para mejorar la función in-vivo de un polipéptido protegiendo dianas expuestas de dicho polipéptido, inmovilizando el polipéptido en un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos fabricados por síntesis de química orgánica, activando el polímero biocompatible, conjugando el polímero biocompatible activado de esta manera con el polipéptido inmovilizado, y posteriormente eluyendo el conjugado del adsorbente. Específicamente, el polipéptido es el factor IX.
Antecedentes de la invención
Es bien conocido que la estabilidad in-vitro y la vida media in-vivo de los polipéptidos puede aumentarse por medio de la unión covalente de polímeros biocompatibles (proceso denominado en lo sucesivo conjugación o modificación). La modificación de la superficie del polipéptido también tiene la ventaja de reducir la inmunogenicidad presentada por el polipéptido.
La pegilación, es decir, el acoplamiento de diversos polietilenglicoles (PEG) a un polipéptido, es una técnica usada ampliamente para aumentar la estabilidad in-vitro y la vida media in-vivo de, por ejemplo, proteínas. En la pegilación se han propuesto muchas técnicas a lo largo de los años. En este caso se hace referencia a Zalipsky, S. et al en Poly(Ethylene Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, Nueva York (1992), y Katre N.V., Adv. Drug Deliv. Rev. 10, 91-114 (1993).
Para algunos polipéptidos se ha reconocido una pérdida de actividad o función como consecuencia de esta conjugación, un efecto que aumenta con el grado de modificación (Inada, Y. et al. Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). Se han creado métodos para hacer que el acoplamiento sea más selectivo, para solucionar este problema. Por ejemplo, se ha aplicado mutagénesis de localización dirigida para la interleuquina-2 recombinante (rIL-2). Puede crearse una diana específica por inserción de una cisteína (Goodson, R.J. y Katre, N.V., Bio/Technology 8, 344-346 (1990); Katre 1993, véase anteriormente). Tal vía generalmente no es aplicable para proteínas terapéuticas, ya que la substitución de aminoácidos puede cambiar las características originales de la molécula y, por lo tanto, supone una controversia. Como alternativa, el polímero puede dirigirse hacia sitios glicosilados de una proteína, por ejemplo el factor IX como se describe en el documento WO 94/29370 (Enzon). Sin embargo, esto implica una oxidación de los restos carbohidrato que puede conseguirse por reacción de la glicoproteína con peryodato sódico o enzimáticamente por medio de la galactosa oxidasa. Estas condiciones a menudo son perjudiciales para la molécula. En este caso particular, los sitios glicosilados destinados para la conjugación se localizaron en una secuencia peptídica del factor IX que se retira durante la activación proteolítica in-vivo. Por lo tanto, el polímero biocompatible no tiene ninguna influencia sobre la función del polipéptido activo.
En el documento WO 94/13322 (Farmitalia Carlo Erba) se demuestra que la pegilación puede realizarse sin perjudicar a la función de ciertos sitios esenciales para la función de la proteína particular ("primera substancia"). Esto se consigue protegiendo los sitios poniendo en contacto la primera substancia con una segunda substancia que se une específicamente a dichos sitios. Más particularmente, la pegilación se realiza inmovilizando la proteína particular en una resina con ligandos que tienen afinidad específica por dicha proteína. Por ejemplo, la segunda substancia es una molécula biológica complementaria. Son ejemplos de parejas descritas en el documento WO 94/13322 anticuerpo (primera substancia) - antígeno correspondiente (segunda substancia); inhibidor específico (primera substancia) - enzima (segunda substancia); factor de crecimiento (primera substancia) - receptor correspondiente (segunda substancia), o el inverso de cada una de esta parejas.
Sin embargo, en un proceso destinado para la producción farmacéutica es ventajoso que el uso de substancias de complejidad biológica pueda mantenerse en un mínimo. Esto se debe principalmente a los requisitos estrictos para la documentación sobre la homogeneidad bioquímica y seguridad para el uso de dichas substancias. Por lo tanto, sería ventajoso el uso de ligandos de afinidad producidos por síntesis de química orgánica.
El documento DE 3717210 se refiere a un proceso para la modificación de biopolímeros, preferiblemente biopolímeros que llevan carga, por medio de la inmovilización del biopolímero en, por ejemplo, un adsorbente de intercambio iónico, la reacción del biopolímero con reactivos, por ejemplo, enzimas u otros reactivos bioquímicos, para obtener un producto de reacción y la posterior desorción del producto de reacción del adsorbente. El producto de reacción preferiblemente es un ácido nucleico escindido con un enzima de restricción. En el documento DE 3717210 el estado adsorbido del biopolímero se utiliza para exponer mejor el biopolímero a reactivos, aumentando de esta manera la eficacia de la modificación. No hay ninguna indicación de la protección de dianas expuestas ni un propósito de retener la actividad del biopolímero, con lo que podría aprovecharse una función del biopolímero in-vivo. La invención del documento DE 3717210 sólo se dirige a la localización de propiedades de biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, cambiando el carácter original por un procesamiento real o aumentando el número de entidades funcionales de la macromolécula, tal como la incorporación de isótopos radiactivos.
Se han conjugado muchas proteínas destinadas al uso terapéutico, comúnmente por medio del uso de diversas técnicas de pegilación (Francis, G.E. et al. en Stability of Protein Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3, 235-263 (1992); Inada, Y. et al., Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). En la mayoría de los ejemplos se utiliza la administración intravenosa. Sin embargo, después de la administración subcutánea, se ha descrito la adsorción en plasma, pulmón, hígado y bazo de algunos alergenos conjugados con mPEG, y la inmunoterapia con alergenos conjugados con mPEG administrados por vía subcutánea ha resultado ser eficaz (Dreborg, S y Akerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)). También se ha usado la administración intramuscular en ensayos clínicos de adenosina desaminasa (Hershfield, M.S. et al, New Eng. J. Med. 316, 589-596 (1987). También se ha reivindicado que la pegilación, en algunos casos, es beneficiosa para la vía oral. De esta manera, en el documento EP-A-0614373 de Mount Sinai School of Medicine se ha descrito la pegilación de IgG para administración oral. En Sakuragawa et al, Acta Med. Biol., 34(3), 77-84 (1987) y en la Solicitud de Patente Japonesa Nº 44509/83 de Nippon Chemifar Company se ha descrito la pegilación del factor VIII y el factor IX para administración oral.
El factor IX es el proenzima del factor IXa descrito anteriormente. Es una proteasa de serina y es una de las proteínas de la coagulación dependientes de vitamina K. La masa molecular es de aproximadamente 55 kDa (DiScipio et al., 1977, Biochemistry, 16, p. 698). El factor IXa interacciona específicamente con otros componentes que participan en la activación del factor X (En: Haemostasis and Thrombosis, 1994, vol. 1, tercera edición, ed. Bloom A. et al.).
En la mayoría de las técnicas de acoplamiento, el reactivo polimérico reacciona con grupos e-amino de restos de lisina del polipéptido. A menudo se extienden sobre toda la superficie del polipéptido, y pueden ocasionar una conjugación adyacente a un sitio funcional. Como consecuencia, por medio del acoplamiento aleatorio, a menudo se altera la actividad o la función. Es nuestra experiencia que cuando se aplican tales técnicas a preparaciones muy puras, tales como un factor VIII recombinante con el dominio B delecionado con actividad coagulante, esta actividad se reduce severamente ya con un grado de modificación de aproximadamente 5 mPEG/molécula de factor VIII.
Sumario de la invención
Los inventores de la presente invención han descubierto que la actividad específica de polipéptidos conjugados puede retenerse en un alto grado, puramente inmovilizando el polipéptido sobre un adsorbente con especificidad de grupo antes de la reacción de acoplamiento, seguido de la desorción del conjugado por técnicas convencionales. Esto es bastante sorprendente, ya que previamente se ha considerado esencial usar adsorbentes con propiedades de unión específicas con respecto al polipéptido en cuestión para conseguir una protección de ciertos dominios, lo cual es importante para las funciones biológicas.
El efecto beneficioso de modificar polímeros biocompatibles a menudo depende del grado de modificación. De esta manera, normalmente se requiere un alto grado de modificación, es decir, un alto número de polímeros biocompatibles por molécula de polipéptido para una protección eficaz contra la actividad proteolítica. Con la ayuda de la presente invención, en la que los polímeros biocompatibles se introducen más selectivamente, se ha retenido mejor la actividad específica.
El uso de adsorbentes con especificidad de grupo de acuerdo con la presente invención es más favorable desde el punto de vista económico en comparación con los adsorbentes descritos en la técnica anterior. El uso de adsorbentes con especificidad de grupo también facilitará el registro de los conjugados como agentes terapéuticos.
El presente proceso hace que sea posible mejorar la función in-vivo de los polipéptidos, especialmente mejorando la función farmacocinética incluyendo la biodisponibilidad, y reduciendo la inmunogenicidad mostrada por los polipéptidos.
De esta manera, la presente invención se refiere a un proceso para mejorar la función in-vivo de un polipéptido protegiendo dianas expuestas del factor IX, por medio de
a) la inmovilización del polipéptido por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos fabricados por síntesis de química orgánica;
b) la activación del polímero biocompatible;
c) la conjugación del polímero biocompatible activado con el polipéptido inmovilizado; y posteriormente
d) la elución del conjugado del adsorbente.
Descripción detallada de la invención
En la presente invención, el término sitio de interacción se refiere a diversos sitios esenciales para la función biológica del polipéptido particular.
En la presente invención, el término dianas expuestas se refiere a sitios externos en el polipéptido en cuestión susceptibles de reacciones indeseadas in-vivo. Los ejemplos de dianas expuestas incluyen epítopos antigénicos y sitios para la escisión proteolítica. Sin embargo, ciertos sitios para la escisión proteolítica se denominan sitios de interacción.
La presente invención hace que sea posible, en una medida que no se podía conseguir hasta ahora, reducir la influencia de reacciones indeseadas in-vivo, por ejemplo, la escisión proteolítica y posiblemente la agregación, dejando intactos al mismo tiempo los sitios de interacción fundamentales para la función biológica del polipéptido. Más específicamente, inmovilizando el polipéptido por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos fabricados por síntesis de química orgánica, los sitios de interacción del polipéptido se excluyen de la conjugación con el polímero biocompatible. Además, por medio de la conjugación del polímero biocompatible activado con el polipéptido en los sitios externos deseados, las dianas expuestas se protegen de la acción de, por ejemplo, proteasas.
En la presente solicitud, polipéptidos se refiere a proteínas y oligopéptidos con al menos 20 aminoácidos en la cadena. El número de aminoácidos del polipéptido producido de acuerdo con la presente invención convenientemente está en el intervalo de 30 hasta 4.500 aminoácidos, y preferiblemente en el intervalo de 40 hasta 3.000 aminoácidos. Los polipéptidos pueden proceder de mamífero, más específicamente de un ser humano, o pueden producirse por técnicas de ADN recombinante. Los polipéptidos que pueden conjugarse de acuerdo con la presente invención incluyen polipéptidos que presentan actividad coagulante o que tienen una función de soporte para la coagulación. Los polipéptidos pueden ser de longitud completa, es decir, la secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia correspondiente encontrada en mamíferos en general, y en seres humanos en particular. Los polipéptidos también pueden ser derivados de deleción de los polipéptidos de longitud completa, donde falta uno o más aminoácidos. El polipéptido convenientemente es el factor de coagulación IX.
El polímero biocompatible de la presente invención puede seleccionarse entre el grupo compuesto por homopolímeros, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo. Los polímeros biocompatibles pueden ser de cadena lineal o ramificada. El poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo convenientemente se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros de polietilenglicol y homopolímeros de polipropilenglicol. El polímero biocompatible preferiblemente es un homopolímero de polietilenglicol (PEG). El peso molecular del PEG puede estar en el intervalo de aproximadamente 300 hasta 20.000, convenientemente en el intervalo de 1.500 hasta 10.000 y preferiblemente en el intervalo de 3.000 hasta 5.000.
El polímero biocompatible debe estar protegido terminalmente en un extremo para evitar la derivatización cruzada. Son ejemplos de grupos adecuados para este fin grupos alcoxi inferior lineales o ramificados, preferiblemente el grupo monometoxi. Un polímero biocompatible particularmente preferido en la presente invención es monometoxi polietilenglicol (mPEG).
También son concebibles otros polímeros biocompatibles, por ejemplo, dextrano, polivinilpirrolidona y DL aminoácidos.
El polímero biocompatible debe activarse antes de la reacción de acoplamiento, para hacer que sea posible la formación de enlaces covalentes. Para este fin, el extremo del polímero biocompatible dirigido hacia el polipéptido debe tener unido un grupo hidroxilo susceptible de activación. Hay varias formas de activar el polímero biocompatible dependiendo del aminoácido seleccionado para la unión covalente. Son derivados adecuados de mPEG para el acoplamiento con grupos amino mPEG-succinimidil succinato, mPEG-succinimidil succinamida, mPEG-succinimidil propionato, succinimidil carbonato de mPEG, succinimidil éster de mPEG carboximetilado, mPEG-oxicarbonilimidazol, mPEG-carbonatos de nitrofenilo, mPEG-carbonato de triclorofenilo, mPEG-tresilato (este último descrito por Nilsson K., Mosbach K., Methods in Enzymology, Vol. 104, p 56-69 (1984)), (todos los reactivos mencionados comercializados por Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos), mPEG-anhídrido maleico y mPEG-anhídrido metilmaleico (Garman A., Kalindjian S.B., FEB Vol 223; 2, pág. 361-365), y anhídridos mixtos de mPEG-succinato, mPEG-ácido acético o mPEG-ácido propiónico, respectivamente (Dreborg S. y Akerblom E., véase anteriormente).
Los restos de cisteína pueden conjugarse con mPEG maleimida, mPEG vinilsulfona y mPEG-ortopiridildisulfuro (comercializado por Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos). Los reactivos adecuados en el caso de conjugación del grupo guanidino de la arginina son derivados de mPEG de fenilglioxal (Zalipski, véase anteriormente).
Los carbohidratos primero deben oxidarse de forma que estén presentes grupos aldehído y después pueden conjugarse con mPEG hidrazida (Zalipski, véase anteriormente).
El procedimiento de acoplamiento se realiza a un pH adecuado para el aminoácido a conjugar. También debe considerarse el pH adecuado para el polipéptido en general, así como la dependencia de pH de la reactividad del polímero biocompatible. Por lo tanto, normalmente, el pH para el acoplamiento está en el intervalo de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8, estableciéndose límite inferior para evitar un procedimiento de acoplamiento prolongado y el límite superior para proporcionar condiciones suaves para el polipéptido. El intervalo de pH anterior es adecuado en la conjugación que implica lisinas. También pueden ser adecuados en ciertos casos valores de pH fuera de este intervalo. De esta manera, la conjugación que implica cisteínas convenientemente se realiza a un pH inferior a aproximadamente 7, mientras que las argininas convenientemente se conjugan a un pH en el intervalo de aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 9,3.
El procedimiento de acoplamiento debe realizarse a una temperatura superior a 0ºC, convenientemente en el intervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 40ºC, y preferiblemente en el intervalo de 10 hasta 30ºC. De nuevo, debe considerarse una temperatura adecuada para el polipéptido en general, así como la influencia de la temperatura sobre la reactividad del polímero biocompatible. En los ejemplos de la presente solicitud, todas las etapas de acoplamiento se realizaron a temperatura ambiente.
El adsorbente usado en la presente invención tiene especificidad de grupo en relación con el polipéptido a inmovilizar. Los adsorbentes con especificidad de grupo tienen afinidad por varios polipéptidos. Además, a menudo se unen con menos fuerza y la elución puede realizarse en condiciones más suaves que con adsorbentes monoespecíficos, uniéndose estos últimos a un solo polipéptido o a un número muy pequeño de polipéptidos. En Jansson, J.-C. et al, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods, and Applications, VCH Publishers, p. 274-285 (1989), que se incorpora en este documento como referencia, se proporcionan ejemplos de adsorbentes con especificidad de grupo adecuados. El adsorbente de la presente invención además se caracteriza por llevar ligandos fabricados por síntesis de química orgánica. Son ejemplos de adsorbentes que satisfacen estos criterios resinas de cromatografía generalmente útiles para la adsorción de proteínas, por ejemplo, matrices biocompatibles a las que se han acoplado ligandos tales como grupos de intercambio aniónico y catiónico, grupos sulfhidrilo, grupos de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC), cadenas de hidrocarburo saturadas o insaturadas, lineales o ramificadas, y grupos aromáticos. También son útiles ligandos de función mixta, por ejemplo, con partes tanto iónicas como hidrófobas, tales como aminoalquil o dimetilaminopropil carbamilpentilo. También podrían usarse ligandos de mayor complejidad, tales como péptidos o fosfolípidos, fabricados por síntesis de química orgánica. Para los especialistas en la técnica, los ligandos de afinidad de grupos que se fabrican por síntesis de química orgánica incluyen una gran diversidad de substancias. De esta manera, ciertos colorantes textiles basados en triazina reactivos han demostrado ser útiles como adsorbentes para varios enzimas, tales como quinasas e hidrogenasas. Además, son útiles derivados de azúcares, nucleótidos y péptidos, y análogos de los mismos, fabricados por síntesis de química orgánica (Dechow, F.J., Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications, Park Ridge, NJ, Estados Unidos, p. 440-443 (1989)).
Otros ligandos adecuados para uso en la presente invención son grupos de intercambio aniónico adicionales, preferiblemente fuertes, tales como aminoetilo cuaternario (QAE), trimetilaminoetilo (TMAE) o aminometilo cuaternario (Q), más preferiblemente aminometilo cuaternario (Q). Los ligandos además pueden acoplarse fuertemente a la matriz, o con un espaciador tal como alquilamina, hexilamina, diaminodipropilamina, etilaminosuccinamida (Persson & Lagerström, en Packings and stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K.K., ed., Marcel Dekker Inc. 1990, p. 754), o con tentáculos ramificados a los que se unen los ligandos (un ejemplo adecuado es Fractogel^{TM} EMD, producido por Merck de Alemania).
Después de dicho procedimiento de acoplamiento, el polipéptido conjugado se eluye por técnicas convencionales. En este contexto, es esencial considerar las condiciones fisicoquímicas para evitar la degradación de los polipéptidos conjugados. De esta manera, si la ruta de acoplamiento implica un enlace de conjugación lábil dentro de un cierto intervalo de pH, debe evitarse este intervalo.
En el procedimiento de acoplamiento, cuando el polipéptido se inmoviliza sobre el adsorbente, el polipéptido puede entrar en contacto con un agente bloqueante soluble, con el fin de excluir otros sitios de la conjugación. Tal agente de bloqueo debe fabricarse por síntesis de química orgánica, y además debe estar conjugado con cualquiera de los ligandos identificados anteriormente unidos a un polímero seleccionado entre, por ejemplo, poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno), homopolímeros de polietilenglicol u homopolímeros de polipropilenglicol. El agente bloqueante también puede llevar entidades con afinidad específica por el polipéptido.
Después de la elución, el agente bloqueante soluble que ha estado en contacto con el polipéptido se desorbe por medio de la aplicación de condiciones químicas adecuadas. Por ejemplo, si el agente bloqueante se adsorbió por interacción hidrófoba, podría desorberse reduciendo la intensidad iónica o simplemente reduciendo la temperatura. El agente bloqueante soluble posteriormente se separa del conjugado por cromatografía de exclusión molecular en condiciones convencionales.
En la presente invención, la matriz del adsorbente puede ser cualquier resina comercial que se considere compatible con las moléculas biológicas. De esta manera, la matriz puede seleccionarse entre diversas matrices fuertemente hidrófilas, por ejemplo, matrices de agarosa tales como una amplia diversidad de matrices de Sepharose^{TM} vendidas por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia, matrices de polímeros orgánicos tales como TSK-GEL:s vendida por Tosoh Corp. de Tokio, Japón, o matrices de polímeros orgánicos muy porosos vendidas por Per Septive Biosystems de Boston, Estados Unidos. También son adecuadas matrices de membrana, por ejemplo, Sartobind^{TM} vendida por Sartorious de Alemania y MemSep^{TM} vendida por Millipore de Estados Unidos. La matriz preferiblemente es una matriz de agarosa. Son matrices de agarosa adecuadas en la presente invención, aparte de Sepharose^{TM}, Minileak^{TM} vendida por Kem-En-Tec A/S de Copenhage, Dinamarca y Bio-Gel A vendida por Bio-Rad, de Bruselas, Bélgica. Preferiblemente, la matriz está reticulada permitiendo un flujo rápido (FF) y, por lo tanto, una alta capacidad de producción. Más preferiblemente, la cromatografía de la presente invención se realiza en un gel de Q Sepharose^{TM}FF. Además, también pueden usarse ventajosamente resinas compuestas de copolímeros de oligoetilenglicol, metacrilato de glicidilo y dimetacrilato de pentaeritritol, tal como Fractogel^{TM} (comercializado por Merck de Alemania), celulosa y vidrio poroso.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible que se puede obtener por el presente proceso son nuevos. Con el presente proceso, la actividad del polipéptido después de la conjugación puede ser al menos un 30% de la actividad antes de dicha conjugación, convenientemente al menos un 50% y preferiblemente al menos un 70% de la actividad antes de dicha conjugación.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible que se puede obtener por el presente proceso pueden usarse como medicamentos. Especialmente, pueden usarse como medicamentos conjugados del factor IX y un polímero biocompatible producido de acuerdo con el presente proceso.
Además, el factor IX conjugado puede usarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia B, y en particular para la administración subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa de tal medicamento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo con fines ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse limitantes del alcance de la presente invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo comparativo 1
Preparación de factor recombinante VIII
La producción del factor VIII recombinante SQ (r-VIII SQ) se realizó esencialmente como se ha descrito en la patente WO-A-9109122, ejemplo 1-3. Una línea de células CHO con deficiencia de DHFR (DG44N.Y.) se sometió a electroporación con un vector de expresión que contenía el gen de r-VIII SQ y un vector de expresión que contenía el gen de la dihidrofolato reductasa. Después de la selección en un medio selectivo, se amplificaron las colonias supervivientes por medio del cultivo en cantidades crecientes por etapas de metotrexato. En el sobrenadante de las colonias resultantes se analizó individualmente la actividad del factor VIII. Se eligió un clon de producción y éste posteriormente se adaptó a una suspensión sin suero cultivada en un medio definido y finalmente se realizó un proceso de cultivo de células a gran escala. Después de ciertos periodos de tiempo se recogió el sobrenadante y se purificó adicionalmente como se describe más adelante.
El medio acondicionado se clarificó por filtración, se ajustó el pH y después el filtrado se introdujo en una columna de S Sepharose^{TM} FF (volumen de la columna 3 l). Después del lavado, el factor VIII se eluyó con un tampón de sal que contenía CaCl_{2} 5 mM y Triton^{TM} X-100 al 0,02%. Esta etapa de cromatografía de intercambio catiónico se realizó a 2-8ºC. El eluato de la etapa de S Sepharose^{TM}FF (S-eluato) se congeló hasta la purificación adicional.
Se descongelaron 700 ml del S-eluato y la temperatura se ajustó a temperatura ambiente. La inactivación del virus se realizó por incubación durante 30 minutos con tri-n-butil fosfato (TNBP) y Triton^{TM} X-100 a una concentración final del 0,3% (v/v) y 1,0% (v/v), respectivamente. Una columna de inmunoafinidad con anticuerpo monoclonal (mAb) con un volumen de 260 ml se equilibró con un tampón de S-eluato que contenía las cantidades correspondientes de agentes químicos de inactivación de virus. Después se introdujo la solución de factor VIII en la columna de mAb, que posteriormente se lavó. La elución se realizó con un tampón que contenía etilenglicol al 50%.
Una columna de Q Sepharose^{TM}se preequilibró a una alta concentración de cloruro sódico, y después se equilibró con un tampón de la misma composición que con el que se eluyó la columna de inmunoafinidad. Se introdujo el eluato de mAb y la columna después se lavó con tampón de equilibrio seguido de un tampón de lavado con una intensidad iónica fisiológica. La columna se eluyó elevando la concentración de cloruro sódico a 0,6 M. No se usó detergente para el lavado y la elución de la columna Q. Una columna de butil Sepharose^{TM}4 FF se equilibró con un tampón que contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 1,4 M, CaCl_{2} 50 mM y Tween^{TM} 80 al 0,02%, pH 6,8. Se añadió NH_{4}Ac al Q-eluato a una concentración final de 1,0 M y Tween^{TM} 80 al 0,02%. Esta solución se introdujo en la columna de butil-gel a un caudal lineal de 60 cm/hora. La columna después se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio y después se eluyó a un caudal lineal de 35 cm/hora con un tampón que contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 0,5 M, CaCl_{2} 50 mM y Tween^{TM}80 al 0,02%, pH 6,8. La pureza de esta preparación fue muy alta, proporcionando una actividad específica de 12.000-17.000 IU/ mg de proteína.
Análisis
En los ejemplos 1-8, se analizó la actividad del factor VIII con un ensayo cromogénico (Chromogenix AB de Mölndal, Suecia) a menos que se indique otra cosa. La cantidad de factor VIII se determinó espectrofotométricamente a A280 y por medio del análisis de aminoácidos. La cantidad de mPEG acoplado al polipéptido se midió con un método de RMN de protón (Dreborg, S. y \ring{A}kerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)).
Ejemplo 2 (ejemplo comparativo)
Factor VIII conjugado con un anhídrido mixto de mPEG-succinato
La composición del tampón del eluato de HIC, preparado de acuerdo con el ejemplo 1, se cambió por una cromatografía de exclusión molecular realizada en una columna Superose 12 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia), previamente equilibrada con un tampón de la siguiente composición: hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 7,8. A alícuotas de la solución r-VIII SQ se añadió un exceso molar de 35, 60 y 100 veces (con respecto a rVIII) de un anhídrido mixto de mPEG-succinato (PM 3.000). Las mezclas se dejaron reaccionar durante 1,5 horas en un dispositivo rotatorio a temperatura ambiente. Para retirar el exceso de mPEG-ácido succínico y separar la población heterogénea de rVIII conjugado de acuerdo con el tamaño, se realizó una cromatografía de exclusión molecular, ahora usando una columna Superose 6 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia). A partir de cada reacción de acoplamiento, se analizaron por separado las fracciones correspondientes a la primera y segunda mitad del pico de proteína (denominadas grupo 1 y grupo 2 en la tabla I). La tabla I presenta los resultados de la conjugación de r-VIII SQ con el anhídrido mixto de mPEG-succinato.
TABLA I
1
Como es evidente en la tabla 1, la actividad específica de rVIII se redujo espectacularmente incluso a este bajo grado de conjugación.
Ejemplo comparativo 3
Factor VIII adsorbido en un gel de Q Sepharose^{TM} FF durante el acoplamiento con un anhídrido mixto de mPEG-succinato
Las lisinas reactivas rodeadas por cargas negativas en la molécula de factor VIII se protegieron de la conjugación con mPEG por adsorción del factor VIII en un gel de intercambio aniónico. Para adsorber el factor VIII se usó una columna rellena con Q Sepharose^{TM} FF (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia) equilibrada con un tampón de la siguiente composición: L-histidina 50 mM, NaCl 0,15 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 6,5. En la columna se introdujo un eluato de HIC preparado de acuerdo con el ejemplo 1. Para conseguir las condiciones apropiadas para el acoplamiento de mPEG, la columna se lavó con un tampón que contenía hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 7,8 antes de la adición del mPEG. El gel se transfirió a un recipiente de reacción, y se añadió un anhídrido mixto de mPEG-succinato (PM 3000) a la suspensión en una cantidad correspondiente al exceso molar con respecto al factor VIII como se indica en la tabla II. La reacción se incubó con rotación durante 1,5 horas. La columna después se volvió rellenar y el rVIII conjugado se eluyó con un tampón de L-histidina 50 mM, NaCl 0,6 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 6,8. Se realizaron 4 preparaciones, a una cantidad constante de r-VIII SQ introducida por cantidad de gel. Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente. La tabla II presenta los resultados del r-VIII SQ conjugado adsorbido en un gel de Q Sepharose^{TM} FF.
TABLA II
2
Como es evidente en la tabla 2, la actividad específica del r-VIII SQ conjugado se retiene en un grado significativamente mayor en comparación con el r-VIII SQ conjugado del ejemplo 2.
Ejemplo comparativo 4
FVIII adsorbido en un gel de Q Sepharose^{TM} FF durante el acoplamiento con mPEG-tresilato
En este ejemplo, todas las etapas de adsorción, acoplamiento y elución de r-VIII SQ en gel de Q Sepharose^{TM} FF se realizaron como en el ejemplo 3. Para conjugar el factor VIII se usó mPEG-tresilato (PM 5.000). La tabla III presenta los resultados del r-VIII SQ conjugado adsorbido en un gel de Q Sepharose^{TM} FF con mPEG-tresilato de acuerdo con la invención.
TABLA III
3
En este caso, la actividad específica fue ligeramente menor que en el ejemplo 3, probablemente debido al mayor peso molecular de mPEG.
Ejemplo comparativo 5
Factor VIII adsorbido en un gel de intercambio aniónico con tentáculos durante el acoplamiento con un anhídrido mixto de mPEG-succinato
Se usó una columna rellena con Fractogel^{TM} EMD TMAE 650 (comercializado por Merck) para adsorber r-VIII SQ. Todas las etapas se realizaron como en el ejemplo 3. La tabla IV presenta los resultados de la conjugación del r-VIII SQ adsorbido en un gel de intercambio aniónico con tentáculos con un anhídrido mixto de mPEG-succinato de acuerdo con la invención.
TABLA IV
5
Ejemplo comparativo 6
Activación con trombina de factor VIII conjugado con mPEG
La activación con trombina de r-VIII SQ conjugado se ensayó en un ensayo in-vitro bien conocido por los especialistas en la técnica. Se ensayó una muestra preparada de acuerdo con el ejemplo 3, que tuvo como resultado un grado de derivatización de 4 mPEG/r-VIII SQ. El r-VIII SQ conjugado pudo activarse por la trombina humana de una manera dependiente de la dosis. Posteriormente se realizó la inactivación. En la fig. 1 se muestra la curva de cambios de actividad obtenida cuando se añadió 1 unidad NIH de trombina por 1 unidad de r-VIII SQ conjugado. Para el ensayo inmediato de muestras de la mezcla de reacción se realizó un método de coagulación de una etapa esencialmente de acuerdo con Mikaelsson et al., 1983, Blood 62, p. 1006. En un minuto se obtuvo una activación de treinta veces, que se continuó por inactivación. Los patrones de activación-inactivación obtenidos con la trombina estuvieron de acuerdo con los estudios publicados previamente sobre la interacción factor VIII-trombina (Fulcher et al., 1993, Blood, 61, p. 807, Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, p. 2979, Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25, p. 505, Rotblat et al., 1985, Biochemistry, 24, p. 4294).
Ejemplo comparativo 7
Ensayos de estabilidad del factor VIII mPEGilado con un extracto de tejido porcino
Para evaluar la influencia de la conjugación con mPEG sobre la estabilidad del factor VIII en una solución representante del medio subcutáneo, se realizó un ensayo in-vitro usando extracto de tejido porcino. Se produjeron dos preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG como se describe en el ejemplo 3 y se incubaron en el extracto y se analizaron alícuotas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas para determinar la actividad coagulante usando un ensayo cromogénico. Durante las primeras 6 horas, el grado de conjugación se correlacionaba con la actividad que quedaba.
TABLA V
6
Los resultados de la tabla V y la fig. 2 demuestran claramente que la conjugación con mPEG mejoró significativamente la estabilidad del factor VIII.
Ejemplo comparativo 8
Estudio de biodisponibilidad del factor VIII mPEGilado en monos cynomolgus
Para evaluar la influencia de la conjugación con mPEG sobre la estabilidad in-vivo del factor VIII, se realizó un estudio farmacocinético. Se produjeron dos preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG como se describe en el ejemplo 3 y se determinaron sus actividades específicas, como se indica en la tabla VI. Para conseguir una alta homogeneidad del material derivatizado producido por el procedimiento de acoplamiento, se realizó una fraccionación de cada preparación dos veces por cromatografía de exclusión molecular. Se usó una columna Superdex 200 PG XK 16/60 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia) equilibrada con L-histidina 19 mM, NaCl 0,31 M, CaCl_{2} 3,4 mM y Tween 80 al 0,02%, pH 7,0. La reducción de volumen de las soluciones de factor VIII antes de la segunda cromatografía de exclusión molecular se realizó en 30 concentradores Centriplus esterilizados en autoclave, que son dispositivos de ultrafiltración centrífugos (límite 30 kDa, comercializado por Amicon Inc. MA, Estados Unidos). Las soluciones se concentraron tres veces a 2.500 xg durante 45 minutos. Las fracciones reunidas obtenidas después de la segunda cromatografía de exclusión molecular posteriormente se diluyeron en tampón ajustado a la formulación final; L-histidina 19 mM, NaCl 0,31 M, CaCl_{2} 3,4 mM, Tween 80 al 0,02%, sacarosa 17,5 mM, pH 7,0. Las soluciones de proteína finalmente se filtraron usando filtros Millex GV de 0,22 \mum (comercializados por Millipore, MA, Estados Unidos) y posteriormente se introdujeron en frascos esterilizados en autoclave. Las soluciones se almacenaron a -70ºC hasta el uso.
A seis monos cynomolgus hembra se les administró una sola dosis intravenosa de Preparación 1 de 250 IU/kg y dosis subcutáneas individuales de preparación 1 y preparación 2 de 1.500 IU/kg en diferentes ocasiones. Todas las soluciones se diluyeron 1:1 con agua para inyección antes de la administración. El sitio de inyección para la administración subcutánea estaba en la región dorsal izquierda o derecha del animal, y para la administración intravenosa en las venas cefálicas izquierda o derecha respectivamente. Se recogieron muestras de sangre de todos los animales a través de una punción en la vena femoral en tubos que contenían citrato sódico como anticoagulante (10% del volumen total) a las siguientes duraciones después de la inyección:
Administración intravenosa: 0 (antes de la dosificación), 0,25, 1, 2, 4, 8, 24, 30, 48 h.
Administración subcutánea: 0 (antes de la dosificación), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30, 48 h.
Se realizó un estudio farmacocinético de factor VIII no conjugado en un estudio separado de la misma especie. En la tabla VI se muestran las dosis, la vía de administración y los resultados (media (\pm desviación típica (SD)).
TABLA VI
7
I.V. = intravenosa
S.C. = subcutánea
^{1)}F = \frac{AUC (S.C.) X DOSIS (I.V.)}{AUC (I.V.) X DOSIS (S.C.)}
donde AUC es el área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo.
Por la tabla VI es evidente que la administración subcutánea de las dos preparaciones del factor VIII conjugado con mPEG dio como resultado una biodisponibilidad notablemente mayor en comparación con la administración subcutánea de r-VIII SQ no conjugado. El análisis estadístico usando el ensayo t de Student confirmó que la diferencia era significativa.

Claims (5)

1. Un proceso para mejorar la función in vivo de un factor IX protegiendo dianas expuestas del factor IX, que comprende:
(a) inmovilizar el factor IX por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico;
(b) activar un polímero biocompatible;
(c) conjugar el polímero biocompatible activado con sitios externos del factor IX inmovilizado; y
(d) eluir el conjugado del adsorbente.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el polímero biocompatible se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros de polietilenglicol y homopolímeros de polipropilenglicol.
4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo es un monometoxi polietilenglicol (mPEG).
5. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde los grupos de intercambio aniónico se seleccionan entre el grupo compuesto por aminometilo cuaternario, aminoetilo cuaternario y trimetilaminoetilo, o una mezcla de los mismos.
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