ES2236396T3 - Conjugados de factor ixy un polimero biocompatible. - Google Patents
Conjugados de factor ixy un polimero biocompatible.Info
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Abstract
Un proceso para mejorar la función in vivo de un factor IX protegiendo dianas expuestas del factor IX, que comprende: (a) inmovilizar el factor IX por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico; (b) activar un polímero biocompatible; (c) conjugar el polímero biocompatible activado con sitios externos del factor IX inmovilizado; y (d) eluir el conjugado del adsorbente.
Description
Conjugados de factor IX y un polímero
biocompatible.
La presente invención se refiere a un proceso
para mejorar la función in-vivo de un
polipéptido protegiendo dianas expuestas de dicho polipéptido,
inmovilizando el polipéptido en un adsorbente con especificidad de
grupo que lleva ligandos fabricados por síntesis de química
orgánica, activando el polímero biocompatible, conjugando el
polímero biocompatible activado de esta manera con el polipéptido
inmovilizado, y posteriormente eluyendo el conjugado del adsorbente.
Específicamente, el polipéptido es el factor IX.
Es bien conocido que la estabilidad
in-vitro y la vida media
in-vivo de los polipéptidos puede aumentarse
por medio de la unión covalente de polímeros biocompatibles (proceso
denominado en lo sucesivo conjugación o modificación). La
modificación de la superficie del polipéptido también tiene la
ventaja de reducir la inmunogenicidad presentada por el
polipéptido.
La pegilación, es decir, el acoplamiento de
diversos polietilenglicoles (PEG) a un polipéptido, es una técnica
usada ampliamente para aumentar la estabilidad
in-vitro y la vida media
in-vivo de, por ejemplo, proteínas. En la
pegilación se han propuesto muchas técnicas a lo largo de los años.
En este caso se hace referencia a Zalipsky, S. et al en
Poly(Ethylene Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical
Applications, Plenum, Nueva York (1992), y Katre N.V., Adv. Drug
Deliv. Rev. 10, 91-114 (1993).
Para algunos polipéptidos se ha reconocido una
pérdida de actividad o función como consecuencia de esta
conjugación, un efecto que aumenta con el grado de modificación
(Inada, Y. et al. Trends in Biotechnology, 13,
86-91 (1995)). Se han creado métodos para hacer que
el acoplamiento sea más selectivo, para solucionar este problema.
Por ejemplo, se ha aplicado mutagénesis de localización dirigida
para la interleuquina-2 recombinante
(rIL-2). Puede crearse una diana específica por
inserción de una cisteína (Goodson, R.J. y Katre, N.V.,
Bio/Technology 8, 344-346 (1990); Katre 1993,
véase anteriormente). Tal vía generalmente no es aplicable para
proteínas terapéuticas, ya que la substitución de aminoácidos puede
cambiar las características originales de la molécula y, por lo
tanto, supone una controversia. Como alternativa, el polímero puede
dirigirse hacia sitios glicosilados de una proteína, por ejemplo el
factor IX como se describe en el documento WO 94/29370 (Enzon). Sin
embargo, esto implica una oxidación de los restos carbohidrato que
puede conseguirse por reacción de la glicoproteína con peryodato
sódico o enzimáticamente por medio de la galactosa oxidasa. Estas
condiciones a menudo son perjudiciales para la molécula. En este
caso particular, los sitios glicosilados destinados para la
conjugación se localizaron en una secuencia peptídica del factor IX
que se retira durante la activación proteolítica
in-vivo. Por lo tanto, el polímero
biocompatible no tiene ninguna influencia sobre la función del
polipéptido activo.
En el documento WO 94/13322 (Farmitalia Carlo
Erba) se demuestra que la pegilación puede realizarse sin perjudicar
a la función de ciertos sitios esenciales para la función de la
proteína particular ("primera substancia"). Esto se consigue
protegiendo los sitios poniendo en contacto la primera substancia
con una segunda substancia que se une específicamente a dichos
sitios. Más particularmente, la pegilación se realiza inmovilizando
la proteína particular en una resina con ligandos que tienen
afinidad específica por dicha proteína. Por ejemplo, la segunda
substancia es una molécula biológica complementaria. Son ejemplos de
parejas descritas en el documento WO 94/13322 anticuerpo (primera
substancia) - antígeno correspondiente (segunda substancia);
inhibidor específico (primera substancia) - enzima (segunda
substancia); factor de crecimiento (primera substancia) - receptor
correspondiente (segunda substancia), o el inverso de cada una de
esta parejas.
Sin embargo, en un proceso destinado para la
producción farmacéutica es ventajoso que el uso de substancias de
complejidad biológica pueda mantenerse en un mínimo. Esto se debe
principalmente a los requisitos estrictos para la documentación
sobre la homogeneidad bioquímica y seguridad para el uso de dichas
substancias. Por lo tanto, sería ventajoso el uso de ligandos de
afinidad producidos por síntesis de química orgánica.
El documento DE 3717210 se refiere a un proceso
para la modificación de biopolímeros, preferiblemente biopolímeros
que llevan carga, por medio de la inmovilización del biopolímero en,
por ejemplo, un adsorbente de intercambio iónico, la reacción del
biopolímero con reactivos, por ejemplo, enzimas u otros reactivos
bioquímicos, para obtener un producto de reacción y la posterior
desorción del producto de reacción del adsorbente. El producto de
reacción preferiblemente es un ácido nucleico escindido con un
enzima de restricción. En el documento DE 3717210 el estado
adsorbido del biopolímero se utiliza para exponer mejor el
biopolímero a reactivos, aumentando de esta manera la eficacia de la
modificación. No hay ninguna indicación de la protección de dianas
expuestas ni un propósito de retener la actividad del biopolímero,
con lo que podría aprovecharse una función del biopolímero
in-vivo. La invención del documento DE
3717210 sólo se dirige a la localización de propiedades de
biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, cambiando el carácter
original por un procesamiento real o aumentando el número de
entidades funcionales de la macromolécula, tal como la incorporación
de isótopos radiactivos.
Se han conjugado muchas proteínas destinadas al
uso terapéutico, comúnmente por medio del uso de diversas técnicas
de pegilación (Francis, G.E. et al. en Stability of Protein
Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3,
235-263 (1992); Inada, Y. et al., Trends in
Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). En la
mayoría de los ejemplos se utiliza la administración intravenosa.
Sin embargo, después de la administración subcutánea, se ha descrito
la adsorción en plasma, pulmón, hígado y bazo de algunos alergenos
conjugados con mPEG, y la inmunoterapia con alergenos conjugados con
mPEG administrados por vía subcutánea ha resultado ser eficaz
(Dreborg, S y Akerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys.
6(4), 315-365 (1990)). También se ha usado la
administración intramuscular en ensayos clínicos de adenosina
desaminasa (Hershfield, M.S. et al, New Eng. J. Med.
316, 589-596 (1987). También se ha
reivindicado que la pegilación, en algunos casos, es beneficiosa
para la vía oral. De esta manera, en el documento
EP-A-0614373 de Mount Sinai School
of Medicine se ha descrito la pegilación de IgG para administración
oral. En Sakuragawa et al, Acta Med. Biol., 34(3),
77-84 (1987) y en la Solicitud de Patente Japonesa
Nº 44509/83 de Nippon Chemifar Company se ha descrito la pegilación
del factor VIII y el factor IX para administración oral.
El factor IX es el proenzima del factor IXa
descrito anteriormente. Es una proteasa de serina y es una de las
proteínas de la coagulación dependientes de vitamina K. La masa
molecular es de aproximadamente 55 kDa (DiScipio et al.,
1977, Biochemistry, 16, p. 698). El factor IXa interacciona
específicamente con otros componentes que participan en la
activación del factor X (En: Haemostasis and Thrombosis, 1994, vol.
1, tercera edición, ed. Bloom A. et al.).
En la mayoría de las técnicas de acoplamiento, el
reactivo polimérico reacciona con grupos e-amino de
restos de lisina del polipéptido. A menudo se extienden sobre toda
la superficie del polipéptido, y pueden ocasionar una conjugación
adyacente a un sitio funcional. Como consecuencia, por medio del
acoplamiento aleatorio, a menudo se altera la actividad o la
función. Es nuestra experiencia que cuando se aplican tales técnicas
a preparaciones muy puras, tales como un factor VIII recombinante
con el dominio B delecionado con actividad coagulante, esta
actividad se reduce severamente ya con un grado de modificación de
aproximadamente 5 mPEG/molécula de factor VIII.
Los inventores de la presente invención han
descubierto que la actividad específica de polipéptidos conjugados
puede retenerse en un alto grado, puramente inmovilizando el
polipéptido sobre un adsorbente con especificidad de grupo antes de
la reacción de acoplamiento, seguido de la desorción del conjugado
por técnicas convencionales. Esto es bastante sorprendente, ya que
previamente se ha considerado esencial usar adsorbentes con
propiedades de unión específicas con respecto al polipéptido en
cuestión para conseguir una protección de ciertos dominios, lo cual
es importante para las funciones biológicas.
El efecto beneficioso de modificar polímeros
biocompatibles a menudo depende del grado de modificación. De esta
manera, normalmente se requiere un alto grado de modificación, es
decir, un alto número de polímeros biocompatibles por molécula de
polipéptido para una protección eficaz contra la actividad
proteolítica. Con la ayuda de la presente invención, en la que los
polímeros biocompatibles se introducen más selectivamente, se ha
retenido mejor la actividad específica.
El uso de adsorbentes con especificidad de grupo
de acuerdo con la presente invención es más favorable desde el punto
de vista económico en comparación con los adsorbentes descritos en
la técnica anterior. El uso de adsorbentes con especificidad de
grupo también facilitará el registro de los conjugados como agentes
terapéuticos.
El presente proceso hace que sea posible mejorar
la función in-vivo de los polipéptidos,
especialmente mejorando la función farmacocinética incluyendo la
biodisponibilidad, y reduciendo la inmunogenicidad mostrada por los
polipéptidos.
De esta manera, la presente invención se refiere
a un proceso para mejorar la función in-vivo
de un polipéptido protegiendo dianas expuestas del factor IX, por
medio de
a) la inmovilización del polipéptido por
interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva
ligandos fabricados por síntesis de química orgánica;
b) la activación del polímero biocompatible;
c) la conjugación del polímero biocompatible
activado con el polipéptido inmovilizado; y posteriormente
d) la elución del conjugado del adsorbente.
En la presente invención, el término sitio de
interacción se refiere a diversos sitios esenciales para la función
biológica del polipéptido particular.
En la presente invención, el término dianas
expuestas se refiere a sitios externos en el polipéptido en cuestión
susceptibles de reacciones indeseadas
in-vivo. Los ejemplos de dianas expuestas
incluyen epítopos antigénicos y sitios para la escisión
proteolítica. Sin embargo, ciertos sitios para la escisión
proteolítica se denominan sitios de interacción.
La presente invención hace que sea posible, en
una medida que no se podía conseguir hasta ahora, reducir la
influencia de reacciones indeseadas in-vivo,
por ejemplo, la escisión proteolítica y posiblemente la agregación,
dejando intactos al mismo tiempo los sitios de interacción
fundamentales para la función biológica del polipéptido. Más
específicamente, inmovilizando el polipéptido por interacción con un
adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos fabricados
por síntesis de química orgánica, los sitios de interacción del
polipéptido se excluyen de la conjugación con el polímero
biocompatible. Además, por medio de la conjugación del polímero
biocompatible activado con el polipéptido en los sitios externos
deseados, las dianas expuestas se protegen de la acción de, por
ejemplo, proteasas.
En la presente solicitud, polipéptidos se refiere
a proteínas y oligopéptidos con al menos 20 aminoácidos en la
cadena. El número de aminoácidos del polipéptido producido de
acuerdo con la presente invención convenientemente está en el
intervalo de 30 hasta 4.500 aminoácidos, y preferiblemente en el
intervalo de 40 hasta 3.000 aminoácidos. Los polipéptidos pueden
proceder de mamífero, más específicamente de un ser humano, o pueden
producirse por técnicas de ADN recombinante. Los polipéptidos que
pueden conjugarse de acuerdo con la presente invención incluyen
polipéptidos que presentan actividad coagulante o que tienen una
función de soporte para la coagulación. Los polipéptidos pueden ser
de longitud completa, es decir, la secuencia de aminoácidos es
idéntica a la secuencia correspondiente encontrada en mamíferos en
general, y en seres humanos en particular. Los polipéptidos también
pueden ser derivados de deleción de los polipéptidos de longitud
completa, donde falta uno o más aminoácidos. El polipéptido
convenientemente es el factor de coagulación IX.
El polímero biocompatible de la presente
invención puede seleccionarse entre el grupo compuesto por
homopolímeros, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de
alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo. Los polímeros
biocompatibles pueden ser de cadena lineal o ramificada. El
poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo
convenientemente se selecciona entre el grupo compuesto por
homopolímeros de polietilenglicol y homopolímeros de
polipropilenglicol. El polímero biocompatible preferiblemente es un
homopolímero de polietilenglicol (PEG). El peso molecular del PEG
puede estar en el intervalo de aproximadamente 300 hasta 20.000,
convenientemente en el intervalo de 1.500 hasta 10.000 y
preferiblemente en el intervalo de 3.000 hasta 5.000.
El polímero biocompatible debe estar protegido
terminalmente en un extremo para evitar la derivatización cruzada.
Son ejemplos de grupos adecuados para este fin grupos alcoxi
inferior lineales o ramificados, preferiblemente el grupo
monometoxi. Un polímero biocompatible particularmente preferido en
la presente invención es monometoxi polietilenglicol (mPEG).
También son concebibles otros polímeros
biocompatibles, por ejemplo, dextrano, polivinilpirrolidona y DL
aminoácidos.
El polímero biocompatible debe activarse antes de
la reacción de acoplamiento, para hacer que sea posible la formación
de enlaces covalentes. Para este fin, el extremo del polímero
biocompatible dirigido hacia el polipéptido debe tener unido un
grupo hidroxilo susceptible de activación. Hay varias formas de
activar el polímero biocompatible dependiendo del aminoácido
seleccionado para la unión covalente. Son derivados adecuados de
mPEG para el acoplamiento con grupos amino
mPEG-succinimidil succinato,
mPEG-succinimidil succinamida,
mPEG-succinimidil propionato, succinimidil carbonato
de mPEG, succinimidil éster de mPEG carboximetilado,
mPEG-oxicarbonilimidazol,
mPEG-carbonatos de nitrofenilo,
mPEG-carbonato de triclorofenilo,
mPEG-tresilato (este último descrito por Nilsson K.,
Mosbach K., Methods in Enzymology, Vol. 104, p 56-69
(1984)), (todos los reactivos mencionados comercializados por
Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos),
mPEG-anhídrido maleico y
mPEG-anhídrido metilmaleico (Garman A., Kalindjian
S.B., FEB Vol 223; 2, pág. 361-365), y anhídridos
mixtos de mPEG-succinato, mPEG-ácido acético o
mPEG-ácido propiónico, respectivamente (Dreborg S. y Akerblom E.,
véase anteriormente).
Los restos de cisteína pueden conjugarse con mPEG
maleimida, mPEG vinilsulfona y
mPEG-ortopiridildisulfuro (comercializado por
Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos). Los
reactivos adecuados en el caso de conjugación del grupo guanidino de
la arginina son derivados de mPEG de fenilglioxal (Zalipski, véase
anteriormente).
Los carbohidratos primero deben oxidarse de forma
que estén presentes grupos aldehído y después pueden conjugarse con
mPEG hidrazida (Zalipski, véase anteriormente).
El procedimiento de acoplamiento se realiza a un
pH adecuado para el aminoácido a conjugar. También debe considerarse
el pH adecuado para el polipéptido en general, así como la
dependencia de pH de la reactividad del polímero biocompatible. Por
lo tanto, normalmente, el pH para el acoplamiento está en el
intervalo de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8,
estableciéndose límite inferior para evitar un procedimiento de
acoplamiento prolongado y el límite superior para proporcionar
condiciones suaves para el polipéptido. El intervalo de pH anterior
es adecuado en la conjugación que implica lisinas. También pueden
ser adecuados en ciertos casos valores de pH fuera de este
intervalo. De esta manera, la conjugación que implica cisteínas
convenientemente se realiza a un pH inferior a aproximadamente 7,
mientras que las argininas convenientemente se conjugan a un pH en
el intervalo de aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 9,3.
El procedimiento de acoplamiento debe realizarse
a una temperatura superior a 0ºC, convenientemente en el intervalo
de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 40ºC, y preferiblemente
en el intervalo de 10 hasta 30ºC. De nuevo, debe considerarse una
temperatura adecuada para el polipéptido en general, así como la
influencia de la temperatura sobre la reactividad del polímero
biocompatible. En los ejemplos de la presente solicitud, todas las
etapas de acoplamiento se realizaron a temperatura ambiente.
El adsorbente usado en la presente invención
tiene especificidad de grupo en relación con el polipéptido a
inmovilizar. Los adsorbentes con especificidad de grupo tienen
afinidad por varios polipéptidos. Además, a menudo se unen con menos
fuerza y la elución puede realizarse en condiciones más suaves que
con adsorbentes monoespecíficos, uniéndose estos últimos a un solo
polipéptido o a un número muy pequeño de polipéptidos. En Jansson,
J.-C. et al, Protein Purification, Principles, High
Resolution Methods, and Applications, VCH Publishers, p.
274-285 (1989), que se incorpora en este documento
como referencia, se proporcionan ejemplos de adsorbentes con
especificidad de grupo adecuados. El adsorbente de la presente
invención además se caracteriza por llevar ligandos fabricados por
síntesis de química orgánica. Son ejemplos de adsorbentes que
satisfacen estos criterios resinas de cromatografía generalmente
útiles para la adsorción de proteínas, por ejemplo, matrices
biocompatibles a las que se han acoplado ligandos tales como grupos
de intercambio aniónico y catiónico, grupos sulfhidrilo, grupos de
cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC), cadenas de
hidrocarburo saturadas o insaturadas, lineales o ramificadas, y
grupos aromáticos. También son útiles ligandos de función mixta, por
ejemplo, con partes tanto iónicas como hidrófobas, tales como
aminoalquil o dimetilaminopropil carbamilpentilo. También podrían
usarse ligandos de mayor complejidad, tales como péptidos o
fosfolípidos, fabricados por síntesis de química orgánica. Para los
especialistas en la técnica, los ligandos de afinidad de grupos que
se fabrican por síntesis de química orgánica incluyen una gran
diversidad de substancias. De esta manera, ciertos colorantes
textiles basados en triazina reactivos han demostrado ser útiles
como adsorbentes para varios enzimas, tales como quinasas e
hidrogenasas. Además, son útiles derivados de azúcares, nucleótidos
y péptidos, y análogos de los mismos, fabricados por síntesis de
química orgánica (Dechow, F.J., Separation and purification
techniques in biotechnology, Noyes Publications, Park Ridge, NJ,
Estados Unidos, p. 440-443 (1989)).
Otros ligandos adecuados para uso en la presente
invención son grupos de intercambio aniónico adicionales,
preferiblemente fuertes, tales como aminoetilo cuaternario (QAE),
trimetilaminoetilo (TMAE) o aminometilo cuaternario (Q), más
preferiblemente aminometilo cuaternario (Q). Los ligandos además
pueden acoplarse fuertemente a la matriz, o con un espaciador tal
como alquilamina, hexilamina, diaminodipropilamina,
etilaminosuccinamida (Persson & Lagerström, en Packings and
stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K.K., ed.,
Marcel Dekker Inc. 1990, p. 754), o con tentáculos ramificados a los
que se unen los ligandos (un ejemplo adecuado es Fractogel^{TM}
EMD, producido por Merck de Alemania).
Después de dicho procedimiento de acoplamiento,
el polipéptido conjugado se eluye por técnicas convencionales. En
este contexto, es esencial considerar las condiciones fisicoquímicas
para evitar la degradación de los polipéptidos conjugados. De esta
manera, si la ruta de acoplamiento implica un enlace de conjugación
lábil dentro de un cierto intervalo de pH, debe evitarse este
intervalo.
En el procedimiento de acoplamiento, cuando el
polipéptido se inmoviliza sobre el adsorbente, el polipéptido puede
entrar en contacto con un agente bloqueante soluble, con el fin de
excluir otros sitios de la conjugación. Tal agente de bloqueo debe
fabricarse por síntesis de química orgánica, y además debe estar
conjugado con cualquiera de los ligandos identificados anteriormente
unidos a un polímero seleccionado entre, por ejemplo, poli(óxidos de
alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo, copolímeros o
copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno), homopolímeros de
polietilenglicol u homopolímeros de polipropilenglicol. El agente
bloqueante también puede llevar entidades con afinidad específica
por el polipéptido.
Después de la elución, el agente bloqueante
soluble que ha estado en contacto con el polipéptido se desorbe por
medio de la aplicación de condiciones químicas adecuadas. Por
ejemplo, si el agente bloqueante se adsorbió por interacción
hidrófoba, podría desorberse reduciendo la intensidad iónica o
simplemente reduciendo la temperatura. El agente bloqueante soluble
posteriormente se separa del conjugado por cromatografía de
exclusión molecular en condiciones convencionales.
En la presente invención, la matriz del
adsorbente puede ser cualquier resina comercial que se considere
compatible con las moléculas biológicas. De esta manera, la matriz
puede seleccionarse entre diversas matrices fuertemente hidrófilas,
por ejemplo, matrices de agarosa tales como una amplia diversidad de
matrices de Sepharose^{TM} vendidas por Pharmacia Biotech de
Uppsala, Suecia, matrices de polímeros orgánicos tales como
TSK-GEL:s vendida por Tosoh Corp. de Tokio, Japón, o
matrices de polímeros orgánicos muy porosos vendidas por Per Septive
Biosystems de Boston, Estados Unidos. También son adecuadas matrices
de membrana, por ejemplo, Sartobind^{TM} vendida por Sartorious de
Alemania y MemSep^{TM} vendida por Millipore de Estados Unidos. La
matriz preferiblemente es una matriz de agarosa. Son matrices de
agarosa adecuadas en la presente invención, aparte de
Sepharose^{TM}, Minileak^{TM} vendida por
Kem-En-Tec A/S de Copenhage,
Dinamarca y Bio-Gel A vendida por
Bio-Rad, de Bruselas, Bélgica. Preferiblemente, la
matriz está reticulada permitiendo un flujo rápido (FF) y, por lo
tanto, una alta capacidad de producción. Más preferiblemente, la
cromatografía de la presente invención se realiza en un gel de Q
Sepharose^{TM}FF. Además, también pueden usarse ventajosamente
resinas compuestas de copolímeros de oligoetilenglicol, metacrilato
de glicidilo y dimetacrilato de pentaeritritol, tal como
Fractogel^{TM} (comercializado por Merck de Alemania), celulosa y
vidrio poroso.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero
biocompatible que se puede obtener por el presente proceso son
nuevos. Con el presente proceso, la actividad del polipéptido
después de la conjugación puede ser al menos un 30% de la actividad
antes de dicha conjugación, convenientemente al menos un 50% y
preferiblemente al menos un 70% de la actividad antes de dicha
conjugación.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero
biocompatible que se puede obtener por el presente proceso pueden
usarse como medicamentos. Especialmente, pueden usarse como
medicamentos conjugados del factor IX y un polímero biocompatible
producido de acuerdo con el presente proceso.
Además, el factor IX conjugado puede usarse para
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia
B, y en particular para la administración subcutánea, intramuscular,
intradérmica o intravenosa de tal medicamento.
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo con
fines ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse limitantes
del alcance de la presente invención, que se define por las
reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo comparativo
1
La producción del factor VIII recombinante SQ
(r-VIII SQ) se realizó esencialmente como se ha
descrito en la patente WO-A-9109122,
ejemplo 1-3. Una línea de células CHO con
deficiencia de DHFR (DG44N.Y.) se sometió a electroporación con un
vector de expresión que contenía el gen de r-VIII SQ
y un vector de expresión que contenía el gen de la dihidrofolato
reductasa. Después de la selección en un medio selectivo, se
amplificaron las colonias supervivientes por medio del cultivo en
cantidades crecientes por etapas de metotrexato. En el sobrenadante
de las colonias resultantes se analizó individualmente la actividad
del factor VIII. Se eligió un clon de producción y éste
posteriormente se adaptó a una suspensión sin suero cultivada en un
medio definido y finalmente se realizó un proceso de cultivo de
células a gran escala. Después de ciertos periodos de tiempo se
recogió el sobrenadante y se purificó adicionalmente como se
describe más adelante.
El medio acondicionado se clarificó por
filtración, se ajustó el pH y después el filtrado se introdujo en
una columna de S Sepharose^{TM} FF (volumen de la columna 3 l).
Después del lavado, el factor VIII se eluyó con un tampón de sal que
contenía CaCl_{2} 5 mM y Triton^{TM} X-100 al
0,02%. Esta etapa de cromatografía de intercambio catiónico se
realizó a 2-8ºC. El eluato de la etapa de S
Sepharose^{TM}FF (S-eluato) se congeló hasta la
purificación adicional.
Se descongelaron 700 ml del
S-eluato y la temperatura se ajustó a temperatura
ambiente. La inactivación del virus se realizó por incubación
durante 30 minutos con tri-n-butil
fosfato (TNBP) y Triton^{TM} X-100 a una
concentración final del 0,3% (v/v) y 1,0% (v/v), respectivamente.
Una columna de inmunoafinidad con anticuerpo monoclonal (mAb) con un
volumen de 260 ml se equilibró con un tampón de
S-eluato que contenía las cantidades
correspondientes de agentes químicos de inactivación de virus.
Después se introdujo la solución de factor VIII en la columna de
mAb, que posteriormente se lavó. La elución se realizó con un tampón
que contenía etilenglicol al 50%.
Una columna de Q Sepharose^{TM}se preequilibró
a una alta concentración de cloruro sódico, y después se equilibró
con un tampón de la misma composición que con el que se eluyó la
columna de inmunoafinidad. Se introdujo el eluato de mAb y la
columna después se lavó con tampón de equilibrio seguido de un
tampón de lavado con una intensidad iónica fisiológica. La columna
se eluyó elevando la concentración de cloruro sódico a 0,6 M. No se
usó detergente para el lavado y la elución de la columna Q. Una
columna de butil Sepharose^{TM}4 FF se equilibró con un tampón que
contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 1,4 M, CaCl_{2} 50 mM y
Tween^{TM} 80 al 0,02%, pH 6,8. Se añadió NH_{4}Ac al
Q-eluato a una concentración final de 1,0 M y
Tween^{TM} 80 al 0,02%. Esta solución se introdujo en la columna
de butil-gel a un caudal lineal de 60 cm/hora. La
columna después se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de
equilibrio y después se eluyó a un caudal lineal de 35 cm/hora con
un tampón que contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 0,5 M, CaCl_{2}
50 mM y Tween^{TM}80 al 0,02%, pH 6,8. La pureza de esta
preparación fue muy alta, proporcionando una actividad específica de
12.000-17.000 IU/ mg de proteína.
En los ejemplos 1-8, se analizó
la actividad del factor VIII con un ensayo cromogénico (Chromogenix
AB de Mölndal, Suecia) a menos que se indique otra cosa. La cantidad
de factor VIII se determinó espectrofotométricamente a A280 y por
medio del análisis de aminoácidos. La cantidad de mPEG acoplado al
polipéptido se midió con un método de RMN de protón (Dreborg, S. y
\ring{A}kerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys.
6(4), 315-365 (1990)).
Ejemplo 2 (ejemplo
comparativo)
La composición del tampón del eluato de HIC,
preparado de acuerdo con el ejemplo 1, se cambió por una
cromatografía de exclusión molecular realizada en una columna
Superose 12 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala,
Suecia), previamente equilibrada con un tampón de la siguiente
composición: hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 7,8. A alícuotas de
la solución r-VIII SQ se añadió un exceso molar de
35, 60 y 100 veces (con respecto a rVIII) de un anhídrido mixto de
mPEG-succinato (PM 3.000). Las mezclas se dejaron
reaccionar durante 1,5 horas en un dispositivo rotatorio a
temperatura ambiente. Para retirar el exceso de mPEG-ácido succínico
y separar la población heterogénea de rVIII conjugado de acuerdo con
el tamaño, se realizó una cromatografía de exclusión molecular,
ahora usando una columna Superose 6 (comercializada por Pharmacia
Biotech de Uppsala, Suecia). A partir de cada reacción de
acoplamiento, se analizaron por separado las fracciones
correspondientes a la primera y segunda mitad del pico de proteína
(denominadas grupo 1 y grupo 2 en la tabla I). La tabla I presenta
los resultados de la conjugación de r-VIII SQ con el
anhídrido mixto de mPEG-succinato.
Como es evidente en la tabla 1, la actividad
específica de rVIII se redujo espectacularmente incluso a este bajo
grado de conjugación.
Ejemplo comparativo
3
Las lisinas reactivas rodeadas por cargas
negativas en la molécula de factor VIII se protegieron de la
conjugación con mPEG por adsorción del factor VIII en un gel de
intercambio aniónico. Para adsorber el factor VIII se usó una
columna rellena con Q Sepharose^{TM} FF (comercializada por
Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia) equilibrada con un tampón de
la siguiente composición: L-histidina 50 mM, NaCl
0,15 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 6,5. En la columna se introdujo un
eluato de HIC preparado de acuerdo con el ejemplo 1. Para conseguir
las condiciones apropiadas para el acoplamiento de mPEG, la columna
se lavó con un tampón que contenía hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM, pH
7,8 antes de la adición del mPEG. El gel se transfirió a un
recipiente de reacción, y se añadió un anhídrido mixto de
mPEG-succinato (PM 3000) a la suspensión en una
cantidad correspondiente al exceso molar con respecto al factor VIII
como se indica en la tabla II. La reacción se incubó con rotación
durante 1,5 horas. La columna después se volvió rellenar y el rVIII
conjugado se eluyó con un tampón de L-histidina 50
mM, NaCl 0,6 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 6,8. Se realizaron 4
preparaciones, a una cantidad constante de r-VIII SQ
introducida por cantidad de gel. Todas las etapas se realizaron a
temperatura ambiente. La tabla II presenta los resultados del
r-VIII SQ conjugado adsorbido en un gel de Q
Sepharose^{TM} FF.
Como es evidente en la tabla 2, la actividad
específica del r-VIII SQ conjugado se retiene en un
grado significativamente mayor en comparación con el
r-VIII SQ conjugado del ejemplo 2.
Ejemplo comparativo
4
En este ejemplo, todas las etapas de adsorción,
acoplamiento y elución de r-VIII SQ en gel de Q
Sepharose^{TM} FF se realizaron como en el ejemplo 3. Para
conjugar el factor VIII se usó mPEG-tresilato (PM
5.000). La tabla III presenta los resultados del
r-VIII SQ conjugado adsorbido en un gel de Q
Sepharose^{TM} FF con mPEG-tresilato de acuerdo
con la invención.
En este caso, la actividad específica fue
ligeramente menor que en el ejemplo 3, probablemente debido al mayor
peso molecular de mPEG.
Ejemplo comparativo
5
Se usó una columna rellena con Fractogel^{TM}
EMD TMAE 650 (comercializado por Merck) para adsorber
r-VIII SQ. Todas las etapas se realizaron como en el
ejemplo 3. La tabla IV presenta los resultados de la conjugación del
r-VIII SQ adsorbido en un gel de intercambio
aniónico con tentáculos con un anhídrido mixto de
mPEG-succinato de acuerdo con la invención.
Ejemplo comparativo
6
La activación con trombina de
r-VIII SQ conjugado se ensayó en un ensayo
in-vitro bien conocido por los especialistas
en la técnica. Se ensayó una muestra preparada de acuerdo con el
ejemplo 3, que tuvo como resultado un grado de derivatización de 4
mPEG/r-VIII SQ. El r-VIII SQ
conjugado pudo activarse por la trombina humana de una manera
dependiente de la dosis. Posteriormente se realizó la inactivación.
En la fig. 1 se muestra la curva de cambios de actividad obtenida
cuando se añadió 1 unidad NIH de trombina por 1 unidad de
r-VIII SQ conjugado. Para el ensayo inmediato de
muestras de la mezcla de reacción se realizó un método de
coagulación de una etapa esencialmente de acuerdo con Mikaelsson
et al., 1983, Blood 62, p. 1006. En un minuto se obtuvo una
activación de treinta veces, que se continuó por inactivación. Los
patrones de activación-inactivación obtenidos con
la trombina estuvieron de acuerdo con los estudios publicados
previamente sobre la interacción factor
VIII-trombina (Fulcher et al., 1993, Blood,
61, p. 807, Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci.,
83, p. 2979, Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25, p. 505,
Rotblat et al., 1985, Biochemistry, 24, p. 4294).
Ejemplo comparativo
7
Para evaluar la influencia de la conjugación con
mPEG sobre la estabilidad del factor VIII en una solución
representante del medio subcutáneo, se realizó un ensayo
in-vitro usando extracto de tejido porcino.
Se produjeron dos preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG
como se describe en el ejemplo 3 y se incubaron en el extracto y se
analizaron alícuotas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas para determinar la
actividad coagulante usando un ensayo cromogénico. Durante las
primeras 6 horas, el grado de conjugación se correlacionaba con la
actividad que quedaba.
Los resultados de la tabla V y la fig. 2
demuestran claramente que la conjugación con mPEG mejoró
significativamente la estabilidad del factor VIII.
Ejemplo comparativo
8
Para evaluar la influencia de la conjugación con
mPEG sobre la estabilidad in-vivo del factor
VIII, se realizó un estudio farmacocinético. Se produjeron dos
preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG como se describe en
el ejemplo 3 y se determinaron sus actividades específicas, como se
indica en la tabla VI. Para conseguir una alta homogeneidad del
material derivatizado producido por el procedimiento de
acoplamiento, se realizó una fraccionación de cada preparación dos
veces por cromatografía de exclusión molecular. Se usó una columna
Superdex 200 PG XK 16/60 (comercializada por Pharmacia Biotech de
Uppsala, Suecia) equilibrada con L-histidina 19 mM,
NaCl 0,31 M, CaCl_{2} 3,4 mM y Tween 80 al 0,02%, pH 7,0. La
reducción de volumen de las soluciones de factor VIII antes de la
segunda cromatografía de exclusión molecular se realizó en 30
concentradores Centriplus esterilizados en autoclave, que son
dispositivos de ultrafiltración centrífugos (límite 30 kDa,
comercializado por Amicon Inc. MA, Estados Unidos). Las soluciones
se concentraron tres veces a 2.500 xg durante 45 minutos. Las
fracciones reunidas obtenidas después de la segunda cromatografía de
exclusión molecular posteriormente se diluyeron en tampón ajustado a
la formulación final; L-histidina 19 mM, NaCl 0,31
M, CaCl_{2} 3,4 mM, Tween 80 al 0,02%, sacarosa 17,5 mM, pH 7,0.
Las soluciones de proteína finalmente se filtraron usando filtros
Millex GV de 0,22 \mum (comercializados por Millipore, MA, Estados
Unidos) y posteriormente se introdujeron en frascos esterilizados en
autoclave. Las soluciones se almacenaron a -70ºC hasta el uso.
A seis monos cynomolgus hembra se les administró
una sola dosis intravenosa de Preparación 1 de 250 IU/kg y dosis
subcutáneas individuales de preparación 1 y preparación 2 de 1.500
IU/kg en diferentes ocasiones. Todas las soluciones se diluyeron 1:1
con agua para inyección antes de la administración. El sitio de
inyección para la administración subcutánea estaba en la región
dorsal izquierda o derecha del animal, y para la administración
intravenosa en las venas cefálicas izquierda o derecha
respectivamente. Se recogieron muestras de sangre de todos los
animales a través de una punción en la vena femoral en tubos que
contenían citrato sódico como anticoagulante (10% del volumen total)
a las siguientes duraciones después de la inyección:
Administración intravenosa: 0 (antes de la
dosificación), 0,25, 1, 2, 4, 8, 24, 30, 48 h.
Administración subcutánea: 0 (antes de la
dosificación), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30, 48 h.
Se realizó un estudio farmacocinético de factor
VIII no conjugado en un estudio separado de la misma especie. En la
tabla VI se muestran las dosis, la vía de administración y los
resultados (media (\pm desviación típica (SD)).
I.V. = intravenosa |
S.C. = subcutánea |
^{1)}F = \frac{AUC (S.C.) X DOSIS (I.V.)}{AUC (I.V.) X DOSIS (S.C.)} |
donde AUC es el área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo. |
Por la tabla VI es evidente que la administración
subcutánea de las dos preparaciones del factor VIII conjugado con
mPEG dio como resultado una biodisponibilidad notablemente mayor en
comparación con la administración subcutánea de
r-VIII SQ no conjugado. El análisis estadístico
usando el ensayo t de Student confirmó que la diferencia era
significativa.
Claims (5)
1. Un proceso para mejorar la función in
vivo de un factor IX protegiendo dianas expuestas del factor IX,
que comprende:
(a) inmovilizar el factor IX por interacción con
un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de
intercambio aniónico;
(b) activar un polímero biocompatible;
(c) conjugar el polímero biocompatible activado
con sitios externos del factor IX inmovilizado; y
(d) eluir el conjugado del adsorbente.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el polímero biocompatible se selecciona entre el grupo
compuesto por homopolímeros, copolímeros o copolímeros de bloque de
poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con
monoalquilo.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2,
donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con
monoalquilo se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros
de polietilenglicol y homopolímeros de polipropilenglicol.
4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con
monoalquilo es un monometoxi polietilenglicol (mPEG).
5. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, donde los grupos de intercambio aniónico
se seleccionan entre el grupo compuesto por aminometilo cuaternario,
aminoetilo cuaternario y trimetilaminoetilo, o una mezcla de los
mismos.
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