JP2022517267A - 血友病aの遺伝子療法のための発現が上昇した組換えfviiiバリアントをコードするウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2019年1月16日に出願された米国仮特許出願第62/793,058号に対する優先権を主張し、その開示内容全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に援用するものである。
血液凝固は、凝固カスケードと呼ばれる相互依存的な生化学的反応の複雑かつ動的な生物学的経路を経る。凝固第VIII因子(FVIII)は、このカスケードにおける主要な構成要素である。第VIII因子は、出血部位に動員され、活性化した第IX因子(FIXa)及び第X因子(FX)とテナーゼ複合体を形成する。テナーゼ複合体はFXを活性化し、FXはプロトロンビンを活性化してトロンビンにし、次いでトロンビンは、凝固カスケードにおける他の構成要素を活性化して、安定した血餅を生成する(Saenko et al.,Trends Cardiovasc.Med.,9:185-92(1999)(非特許文献1)、Lenting et al.,Blood,92:3983-96(1998)(非特許文献2)にて概説されている)。
したがって、コード配列がより効率的に、遺伝子療法ベクターにパッケージングされ、遺伝子療法ベクターによって送達される、第VIII因子バリアントが必要とされている。また、第VIII因子をより効率的に発現する合成のコドン改変核酸も必要とされている。また、野生型第VIII因子または野生型Bドメイン欠失第VIII因子と比較して、フォールディング特性が改善され、発現細胞からの分泌が改善され、活性が上昇し、及び/またはin vivoの循環半減期が改善された、第VIII因子ポリペプチドをコードするコドン改変核酸も必要とされている。そのような第VIII因子バリアント及びコドン改変核酸は、第VIII因子欠損(例えば、血友病A)の治療の改善を可能にする。上記の欠損、及び第VIII因子欠損(例えば、血友病A)の治療に関連する他の問題は、本開示のコドン改変第VIII因子バリアントによって減少または解決する。
AAVベースの遺伝子療法は、血友病者の治療にきわめて有望である。血友病Bについては、最初の臨床データは、少なくとも一部の患者では1年超にわたって約10%のFIXレベルが維持され得るという点で期待が持てる。しかしながら、血友病Aについては、AAVベクターを用いて5~10%の治療的な発現レベルを達成するには、種々の理由で課題が残っている。第1には、第VIII因子コード配列は、従来のAAVベースのベクターには大きすぎる。第2には、工学操作されたBドメイン欠失型または切断型の第VIII因子構築物には、コドン最適化してもin vivoでの発現が乏しいという問題がある。第3には、これらのBドメイン欠失型または切断型の第VIII因子バリアント構築物は、in vivoでの半減期が短く、発現不良の影響を悪化させる。第4には、FVIIIは、発現しても、第IX因子などの他の凝固因子がそうであるように、細胞から効率的には分泌されない。
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別途記載しない限り、それらに与えられる意味を有する。
を含む。第VIII因子タンパク質には、翻訳後修飾を含むポリペプチドも含まれる。
によって定義されるように、予想されるCpGジヌクレオチド当たりの観察されるCpGジヌクレオチドの比率が、少なくとも0.6である場合、CpGアイランドである。CpGアイランドを同定する方法に関するさらなる情報については、Gardiner-Garden M.et al.,J Mol Biol.,196(2):261-82(1987)を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、第VIII因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変ポリヌクレオチドは、AAVベースの遺伝子療法構築物において投与すると、著しく改善された第VIII因子の生物作用能(例えば、活性)をもたらす。コドン改変ポリヌクレオチドはまた、従来的にコドン最適化された構築物と比較して改善されたAAV-ビリオンパッケージングを示す。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する核酸組成物には、CS12-FL-NA(配列番号1)と高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、ヒト第VIII因子の重鎖及び軽鎖、ならびに活性FVIIIaタンパク質のin vivoでの成熟を促進するフリン切断部位を含む短い14アミノ酸のBドメイン置換リンカー(「SQ」リンカー)を有する第VIII因子ポリペプチドをコードする、コドン改変第VIII因子ポリヌクレオチドが含まれ、第VIII因子ポリペプチドの重鎖は、5つのX5変異(完全長ヒト野生型第VIII因子配列に対するI105V、A127S、G151K、M166T、及びL171P(SPI))、及びSQリンカーに挿入されたNG5グリコシル化ペプチド(配列番号15)を含む。
上述のように、FVIIIの重鎖と軽鎖との間の連結部(例えば、野生型第VIII因子のBドメイン)は、本明細書に記載する第VIII因子バリアントでは改変されている。野生型第VIII因子構築物からのBドメインの除去は、活性化型酵素(例えば、FVIIIa)の活性に影響を及ぼさないようであるが、これは、Bドメインが活性化中に除去されるためだと考えられる。AAVパッケージング能力のサイズ制限のため、Bドメイン欠失型、切断型、及びまたはリンカー置換型のバリアントは、FVIII遺伝子療法構築物の有効性を改善するはずである。従来最も使用されているBドメイン置換リンカーは、リンカー配列としてBドメインの14アミノ酸のみを保持するSQ FVIIIのものである。ブタVIIIの別のバリアント(米国特許第6,458,563号に記載されている「OBI-1」)は、CHO細胞で良好に発現され、わずかに長い24アミノ酸のリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第VIII因子構築物は、SQ型Bドメインリンカー配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第VIII因子構築物は、OBI-1型Bドメインリンカー配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第VIII因子バリアントをコードする核酸組成物には、in vivoの発現を駆動し、第VIII因子バリアントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、1つ以上のシス作用性制御エレメント、例えば、プロモーター及び/またはエンハンサーエレメントも含まれる。この文脈において、「シス作用性」とは、制御エレメントが、それらが制御する遺伝子と同じDNA分子上に存在することを意味する。当業者には理解されるように、また以下に詳解するように、本発明で使用するのに好適な制御エレメントとしては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化シグナルエレメント、及び/または逆位末端反復エレメントが挙げられる。
本発明において有用なプロモーターは、コード領域に作動可能に連結しており、一般的には直接連結している(例えば、プロモーターとコード領域との間に付加的なヌクレオチドは含まれない)が、いくつかの実施形態では、例えば非機能的リンカーの使用によって、またはプロモーターの「下流」だがコード領域の「上流」で機能する付加的な制御エレメントが使用され得る場合には、間接的連結を使用してもよい。しかしながら、本発明のベクターのサイズ制限のため、これは一般的に好ましくない。
いくつかの実施形態では、1つ以上のエンハンサーエレメントが第VIII因子バリアント構築物に使用される。当該技術分野で知られているように、エンハンサーエレメントは概して、組織依存的に、例えば、主に特定の組織において発現を駆動する。一般に、後述するように、エンハンサーエレメントは概して、プロモーターエレメントの「上流」に位置付けられる。第VIII因子は主に肝臓で合成されるため、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物は、コードされる第VIII因子バリアントの発現を肝細胞に実質的に制限する肝臓特異的制御エレメントを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する構築物(例えば、第VIII因子バリアントをコードする核酸組成物)の制御エレメントは、例えば、図11の例示的構築物において示されるように、ポリアデニル化シグナルである制御エレメントである。ポリアデニル化シグナルは、第VIII因子ポリヌクレオチドから生成されるmRNA転写物の3’末端におけるポリAテールの合成を指示する。したがって、ポリアデニル化シグナルは、第VIII因子バリアントコード配列の3’側に位置付けられる。本明細書に記載する第IX因子遺伝子療法構築物に使用することのできるポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、合成ポリアデニル化シグナル、サルウイルス40(SV40)後期遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル、及び最小ウサギβ-グロビン(mRBG)遺伝子ポリアデニル化シグナルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第VIII因子バリアントをコードする核酸組成物はまた、第VIII因子バリアントコード配列及び関連する制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなど)に隣接するアデノ随伴ウイルス(AAV)内部末端反復(ITR)を含む。逆位末端反復は各々、ヘアピンを形成し、これは、第2のDNA鎖のプライマーゼ非依存的合成のための自己プライミングを促進する。ITRはまた、AAVゲノムのAAVビリオンへの封入及び宿主細胞ゲノムへの組み込みの促進に役立つ。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれる。発現ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター(例えば、遺伝子療法に好適なベクター)、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体などが挙げられる。一般に、本発明において有用な発現ベクターには2つの基本的な種類がある。すなわち、第VIII因子ポリペプチドを生成するために細胞培養下で使用されるものと、第VIII因子(タンパク質か活性かのいずれにせよ)の内因性レベルが上昇するように患者に投与するための遺伝子療法ベクターとして使用されるものである。
一実施形態において、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベースの遺伝子療法ベクターに組み込まれる。AAVシステムは、これまでに報告されており、当該技術分野で一般的によく知られている(Kelleher and Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)、Cotten et al.,Proc Natl Acad Sci USA,89(13):6094-98(1992)、Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64(1994)、Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol,158:97-129(1992)、及びAsokan A,et al.,Mol.Ther.,20(4):699-708(2012)。これらは各々、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される)。rAAVベクターの生成及び使用に関する詳細は、例えば、米国特許第5,139,941号及び同第4,797,368号に記載されており、これらは各々、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される。
本明細書に記載するコドン改変第VIII因子ポリヌクレオチド及びウイルスベクターは、核酸増幅及びベクター生成の従来の方法に従って生成される。いくつかのプラットフォームが、組換えAAVベクターの大規模生産のために開発されている。第1のプラットフォームは、AAVrep及びcap遺伝子、ならびにウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞に、所望のウイルスゲノムの配列を含むプラスミドを導入することに基づく。概説については、Kotin R.M.,Hum.Mol.Genet.,20(R1):R2-6(2011)、Penaud-Budloo,M.et al.,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)、及びAponte-Ubillus JJ et al.,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第2のプラットフォームは、例えば、野生型アデノウイルスと、所望のウイルスゲノムの配列を有する組換えアデノウイルスとを、哺乳動物細胞に同時感染させることにより、所望のウイルスゲノムが哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれている、安定な哺乳動物細胞株の構築に基づく。概説については、Penaud-Budloo,M.et al.,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第3のプラットフォームは、所望のウイルスゲノムの配列を有する第1の組換えHSVと、AAVrep及びcap遺伝子をコードする第2の組換えHSVとを、哺乳動物細胞に同時感染させることに基づく。概説については、Penaud-Budloo,M.et al.,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)、及びAponte-Ubillus JJ et al.,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第4のプラットフォームは、所望のウイルスゲノムの配列を有する第1の組換えバキュロウイルスと、AAVrep及びcap遺伝子をコードする第2の組換えバキュロウイルスとを、昆虫細胞に同時感染させることに基づく。概説については、Penaud-Budloo,M.et al.,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)、及びAponte-Ubillus JJ et al.,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第5のプラットフォームは、AAVrep及びcap遺伝子、ならびにウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む酵母細胞に、所望のウイルスゲノムの配列を含むプラスミドを導入することに基づく。概説については、Aponte-Ubillus JJ et al.,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物(例えば、第VIII因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチド)及び遺伝子療法ベクター(例えば、第VIII因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含むAAV粒子)は、公知の投与方法に従って、血友病Aの治療のために血友病A患者に投与される。遺伝子療法ベクターを投与する方法は、当該技術分野でよく知られている。これらは、限定するものではないが、静脈内投与、筋肉内注射、組織内注射、及び肝内投与(例えば、肝動脈内または肝静脈内)を含む。概説については、例えば、Chuah MK et al.,Hum Gene Ther.,23(6):557-65(2012)、Chuah MK et al.,J Thromb Haemost.,10(8):1566-69(2012)、Chuah MK et al.,J Thromb Haemost.11 Suppl 1:99-110(2013)、VandenDriessche et al.,Hum Gene Ther.23(1):4-6(2012)、High KA,Blood,120(23):4482-87(2012)、Matrai et al.,Mol Ther.,18(3):477-90(2010)、及びMatrai et al.,Curr Opin Hematol.,17(5):387-92(2010)を参照されたい。これらの各々の内容は、参照により本明細書に援用される。
血友病A治療の治療有効性は、例えば、治療されている対象の血液の第VIII因子依存性の凝固可能性を測定することにより、評価することができる。凝固可能性を評価するための基準としては、限定するものではないが、in vitro活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ(APPT)、第IX因子発色活性アッセイ、凝血時間、及び第VIII因子抗原レベル(例えば、第VIII因子特異的ELISAを使用する)が挙げられる。なお、治療的用量は、患者において野生型レベルの第VIII因子をもたらす必要はなく、むしろ、有意義または測定可能なかたちで症状を減少させるのに十分な発現が、本開示の目的では治療的とみなされることに留意されたい。
本明細書では、血友病Aの治療に使用される組成物が提供される。そのような組成物は、本明細書に記載するように、治療的に有効な量の核酸組成物、例えば、第VIII因子をコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含むAAV遺伝子療法ベクターを含む。治療的に有効な量のコドン改変VIIIポリヌクレオチド(例えば、コドン改変第VIII因子コード配列を含むAAV遺伝子療法ベクター)は、例えば、全身投与のために、好適な薬学的担体またはビヒクルと混合される。本明細書に開示するコドン改変第VIII因子ポリヌクレオチドの最終的な処方は、当業者の能力の範疇にある。
本発明の核酸組成物は、それを必要とする患者に投与される。投与される治療的遺伝子療法剤の量または用量は、特定のコドン改変VIIIポリヌクレオチド構築物、使用される送達ベクター、疾患の重症度、及び対象の全身的特徴などの要因に依存する。正確な用量は、治療の目的に左右され、当業者であれば公知の技術を使用して確認することができる(例えば、Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1 3,1992)、Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)、Pickar,Dosage Calculations(1999)、及びRemington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkinsを参照されたい)。特定の対象を治療するための特定の投与量及び投薬レジメンの決定は、熟練した医師の能力の範疇にある。
実施例1:N-グリコシル化リンカー配列の付加による、FVIIIを発現する一本鎖AAV8ベクター構築物の改善
BDD-FVIIIのSQ配列における付加的なN-グリコシル化部位がFVIIIタンパク質発現を上昇させるかどうかを調べるために、推定上のN-結合型グリコシル化部位を含む短いペプチド配列のセットを設計した。これまでに、McIntoshら(Blood 121(17):3335-44(2013))は、6つの潜在的部位(「V3ペプチド」)でのN-グリコシル化の概念が、マウスの血漿におけるFVIII発現レベルの向上をもたらしたことを示した。興味深いことに、「V3ペプチド」のin silico予測により、6つの部位のうち2つがin vivoで潜在的にN-グリコシル化されていることが確認された。
vCS04という、最初のFVIIIを発現するAAV8ベースの一本鎖ベクター構築物のプロモーターカセットは、肝臓特異的マウストランスサイレチン(TTR)遺伝子(Yan et al.,EMBO J,9:869-78(1990)、その内容は参照により本明細書に援用される)に由来するコアプロモーター及びエンハンサー配列を含む。図11を参照されたい。この肝臓特異的mTTRプロモーター/エンハンサーカセットは、2段階で修飾した。第1に、マウスのコア(基礎)プロモーター配列を、対応するヒト配列で完全に置換した。第2に、マウスエンハンサー配列を、最近報告された肝臓特異的シス制御性モジュールCRM8(Nair et al.,Blood,123:3195-99(2014)及びChuah et al.,Mol Ther,22:1605-13(2014)、これらの内容は参照により本明細書に援用される)で置換した。1つまたは2つのCRM8エレメントをヒトTTRコア(基礎)プロモーターの上流に挿入し、それぞれ、ベクター構築物vCS115及びvCS116を得た(図11)。
実施例1に示したデータに基づいて、構築物vNG5/CS04におけるN-グリコシル化リンカーNG5を選択して、新規なヒト肝臓特異的プロモーターである1xCRM8/hTTR及び2xCRM8/hTTRと組み合わせ、構築物vNG5/CS117及びvNG5/CS118を得た(図11)。vNG5/CS04構築物は、mTTRプロモーター/エンハンサーカセットを含む(図11)。vNG5/CS04のin vivo生物作用能レベルは、NG5リンカー配列に対する陽性効果に起因して、vCS04よりも1.9倍高かった(図12)。In vitroでは、生物作用能の上昇が、CRM8エレメント(複数可)を含むベクターであるvNG5/CS117及びvNG5/CS118について観察された。In vivoでは、vNG5/CS117及びvNG5/CS118の発現レベルは、vNG5/CS04)と同様であった(図12)。
FVIIIを発現するベクターをさらに改善させるために、X5バリアント(内容が参照により本明細書に援用されるWO2017/083762では、変異「m2」と記載されている)をBDD-FVIIIに導入した。X5バリアントは、重鎖のA1ドメイン内に、ヒトFVIIIを効率的に分泌させる、5つのブタFVIIIアミノ酸残基を含む(Cao et al.,2014,ASGCT abstract #460;バリアントの詳細は口頭説明によって開示された)。具体的には、BDD-FVIIIのX5バリアントを、mTTRプロモーター/エンハンサーと組み合わせて、vX5/CS24をもたらし、また、1つまたは2つのCRM8エレメント(複数可)とhTTRプロモーターと組み合わせて、構築物vX5/CS101及びvX5/CS105をもたらした(図11)。3つの新規構築物を、in vitroでは肝臓由来HepG2細胞株において、in vivoでは「系統E2」マウス[わずかな量のヒトFVIII cDNAを発現し、ヒトFVIIIへの免疫寛容をもたらす、トランスジェニックFVIIIノックアウトマウス系統(van Helden PM,et al.,Blood 118(13):3698-707(2011)、その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される)]において分析し、参照構築物vCS04と比較した。In vivoにおいて、vX5/CS24、vX5/CS101、及びvX5/CS105は、2.5~3.1倍のFVIII活性レベルの向上をもたらした(図12)。In vitroでは、生物作用能の上昇は、4.0~21.2の範囲であった。in vitro試験システムは、X5バリアント(構築物vX5/CS24)から生じた4.0倍の上昇を明らかにし、さらに、X5及び1コピーまたは2コピーのCRM8エレメントを含む構築物(それぞれ、構築物vX5/CS101及びvX5/CS105)により、7.3倍及び21.2倍上昇した。
さらなるベクターセットにおいて、N-グリコシル化リンカーNG5(実施例3)及びX5バリアント(実施例4)をBDD-FVIIIに並行して導入し、mTTRプロモーター/エンハンサー、1xCRM8/hTTR、及び2xCRM8/hTTRを含む3つの異なるプロモーターとさらに組み合わせて、それぞれ、構築物vX5/NG5/CS125、vX5/NG5/CS119、及びvX5/NG5/CS120を得た(図11)。vCS04と比較すると、vX5/NG5/CS125、vX5/NG5/CS119、及びvX5/NG5/CS120のin vivo及びin vitroの生物作用能は、それぞれ、3.6~5.5倍及び3.2~19.8倍上昇した。2つの新規修飾のX5及びNG5の導入は、一般的なプロモーターを各々が有する3シリーズの構築物について示されるように、in vivoでさらなる発現上昇を明らかにしている。例えば、2xCRM8/hTTRプロモーターを有するシリーズ(構築物vCS116、vNG5/CS118、vX5/CS105、及びvX5/NG5/CS120)において、NG5のみの存在は、FVIII発現レベルを1.9IU/mLから2.9IU/mLに上昇させ、X5のみの存在は、FVIII発現を1.9IU/mLから5.1IU/mLに上昇させ、X5とNG5の両方の存在は、FVIII発現を1.9IU/mLから11.4IU/mLに上昇させる。
わずかに過大のベクター構築物vX5/NG5/CS120のベクターサイズを削減するために(これにより、パッケージングが効率化するはずである)、隣接するITR内のすべての非機能DNA配列を欠失させた。これにより、5191ヌクレオチドから合計71ヌクレオチドが削減され、5120ヌクレオチドのサイズの発現カセットがもたらされた。欠失は、5’-ITRとCRM8配列との間の19ヌクレオチド、ヒトTTRプロモーターとKozak配列との間の9ヌクレオチド、BDD-FVIIIコード配列と合成ポリアデニル化部位の間の27ヌクレオチド、及び合成ポリアデニル化部位と3’-ITR配列との間の16ヌクレオチドを含んだ。このvX5/NG5/CS12というサイズ削減発現カセットは、2つのCRM8エレメント及びコアヒトTTRプロモーター配列を含むプロモーター、X5バリアントと共にNG5配列を含むBDD-FVIII配列、ならびに合成ポリアデニル化部位からなり、2つのAAV2ベースの逆位末端反復が隣接している。構築物vX5/NG5/CS12は、図11に概略的に示している。
Claims (26)
- 第VIII因子タンパク質をコードする第VIII因子ポリヌクレオチドを含む核酸組成物であって、前記第VIII因子ポリヌクレオチドが、CS12-FL-NA(配列番号1)の核酸配列を有する、前記核酸組成物。
- 前記第VIII因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、前記プロモーターポリヌクレオチドが、hTTR(配列番号6)の核酸配列を有する、請求項1に記載の核酸組成物。
- 前記プロモーターが、前記第VIII因子ポリヌクレオチドに直接結合している、請求項2に記載の核酸組成物。
- 前記第VIII因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含み、前記肝臓特異的エレメントが、CRM8(配列番号5)の配列を有する、請求項1~3のいずれか1項に記載の核酸組成物。
- 第2の肝臓特異的エレメントが、前記第VIII因子ポリペプチドに機能的に連結している、請求項4に記載の核酸組成物。
- 前記肝臓特異的エレメント及び前記プロモーターが、直接結合している、請求項4または5に記載の核酸組成物。
- CS12-CRM8.2-Vr(配列番号3)を含む核酸配列を有する、請求項1に記載の核酸組成物。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸組成物を含む、哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項8に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 前記AAVベクターが、血清型8アデノ随伴ウイルス(AAV-8)ベクターである、請求項9に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 前記核酸組成物が、前記第VIII因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、請求項8~10のいずれか1項に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸組成物を封入しているカプシドタンパク質を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 前記カプシドタンパク質が、血清型8アデノ随伴ウイルス(AAV-8)カプシドタンパク質を含む、請求項12に記載のAAV粒子。
- 前記核酸組成物が、前記第VIII因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、請求項12または13に記載のAAV粒子。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸組成物を血友病A患者に投与することを含む、血友病Aを治療するための方法。
- 血友病Aを治療するための、請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸組成物。
- 血友病Aの治療用の薬剤の製造のための、請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸組成物の使用。
- 請求項8~11のいずれか1項に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクターを血友病A患者に投与することを含む、血友病Aを治療するための方法。
- 血友病Aを治療するための、請求項8~11のいずれか1項に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 血友病Aの治療用の薬剤の製造のための、請求項8~11のいずれか1項に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクターの使用。
- 請求項12~14のいずれか1項に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を血友病A患者に投与することを含む、血友病Aを治療するための方法。
- 血友病Aを治療するための、請求項12~14のいずれか1項に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子。
- 血友病Aの治療用の薬剤の製造のための、請求項12~14のいずれか1項に記載のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子の使用。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載の核酸組成物を真核生物宿主細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を生成するための方法であって、
前記核酸組成物が、5’逆位末端反復配列(5’ITR)及び3’逆位末端反復配列(3’ITR)が隣接するCS12-FL-NA(配列番号1)の核酸配列を有する第VIII因子ポリヌクレオチドを含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、AAVrep遺伝子、AAVcap遺伝子、及びウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む、
前記方法。 - 前記核酸組成物が、CS12-CRM8.2-Vrp(配列番号10)の核酸配列を有するプラスミドである、請求項24に記載の方法。
- 前記AAVcap遺伝子が、血清型8アデノ随伴ウイルス(AAV-8)cap遺伝子である、請求項24または25に記載の方法。
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