BR112021013874A2

BR112021013874A2 - Composição de ácido nucleico, vetor de terapia de gene de mamífero, partícula de vírus adeno-associado, métodos para tratar hemofilia a e para produzir uma partícula de vírus adeno-associado, e, uso de uma composição de ácido nucleico e de um vetor de terapia de gene de mamífero

Info

Publication number: BR112021013874A2
Application number: BR112021013874-9A
Authority: BR
Inventors: Hanspeter Rottensteiner; Friedrich Scheiflinger
Original assignee: Baxalta Incorporated; Baxalta GmbH
Priority date: 2019-01-16
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2021-09-21
Also published as: CN113614104A; PE20220429A1; US20200289672A1; EA202191977A1; CL2021001880A1; KR20210117291A; SG11202107421YA; MX2021008550A; TW202039546A; US11707536B2; CA3127065A1; WO2020150375A1; EP3911672A1; US20230211017A1; IL284648A; JP2022517267A; CO2021009338A2; AR117825A1; AU2020208375A1; ECSP21060605A

Abstract

composição de ácido nucleico, vetor de terapia de gene de mamífero, partícula de vírus adeno-associado, métodos para tratar hemofilia a e para produzir uma partícula de vírus adeno-associado, e, uso de uma composição de ácido nucleico e de um vetor de terapia de gene de mamífero. a presente divulgação fornece, dentre outros aspectos, polinucleotídeos alterados por códon codificando variantes de fator viii para expressão em células de mamíferos. em algumas modalidades, a divulgação também fornece vetores de terapia de gene de mamífero e métodos para tratar hemofilia a.

Description

1 / 93 COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE TERAPIA DE GENE DE MAMÍFERO, PARTÍCULA DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADO,

MÉTODOS PARA TRATAR HEMOFILIA A E PARA PRODUZIR UMA PARTÍCULA DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADO, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO E DE UM VETOR DE TERAPIA DE GENE DE MAMÍFERO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. 62 / 793.058, depositado em 16 de janeiro de 2019, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.

FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO

[002] A coagulação sanguínea prossegue por meio de uma via biológica complexa e dinâmica de reações bioquímicas interdependentes, denominada cascata de coagulação. O fator VIII de coagulação (FVIII) é um componente chave na cascata. O Fator VIII é recrutado para os locais de sangramento e forma um complexo Xase com Fator IX (FIXa) e Fator X (FX) ativado. O complexo Xase ativa o FX, que por sua vez ativa a protrombina em trombina, que então ativa outros componentes na cascata de coagulação para gerar um coágulo estável (revisado em Saenko et al., Trends Cardiovasc. Med., 9:185-92 (1999); Lenting et al., Blood, 92:3983-96 (1998)).

[003] A hemofilia A é um distúrbio hemorrágico congênito ligado ao X, caracterizado por uma deficiência na atividade do fator VIII. A atividade diminuída do fator VIII inibe um ciclo de feedback positivo na cascata de coagulação. Isso causa coagulação incompleta, que se manifesta como episódios de sangramento com duração aumentada, hematomas extensos, sangramento oral e nasal espontâneo, rigidez articular e dor crônica e, possivelmente, sangramento interno e anemia em casos graves (Zhang et al., Clinic. Rev. Allerg. Immunol., 37:114-24 (2009)).

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[004] Convencionalmente, a hemofilia A é tratada pela terapia de substituição do Fator VIII, que consiste na administração da proteína do Fator VIII (por exemplo, Fator VIII derivado do plasma ou produzido de forma recombinante) a um indivíduo com hemofilia A. O Fator VIII é administrado profilaticamente para prevenir ou reduzir a frequência de episódios de sangramento, em resposta a um episódio de sangramento agudo e / ou perioperatório para controlar o sangramento durante a cirurgia. No entanto, existem várias características indesejáveis da terapia de reposição com Fator VIII.

[005] Primeiro, a terapia de reposição de Fator VIII é usada para tratar ou controlar a hemofilia A, mas não cura a deficiência de Fator VIII subjacente. Por causa disso, os indivíduos com hemofilia A precisam de terapia de reposição com Fator VIII para a duração de suas vidas. O tratamento contínuo é caro e requer que o indivíduo mantenha uma adesão estrita, pois perder apenas algumas doses profiláticas pode ter consequências graves para os indivíduos com hemofilia A grave.

[006] Em segundo lugar, porque o Fator VIII tem uma meia-vida relativamente curta in vivo, a terapia de substituição profilática convencional do Fator VIII requer a administração a cada segundo ou terceiro dia. Isso representa um fardo para o indivíduo manter a conformidade ao longo de sua vida. Embora as drogas do Fator VIII de "longa ação" de terceira geração possam reduzir a frequência de administração, a terapia de reposição profilática do Fator FVIII com essas drogas ainda requer administração mensal, semanal ou mais frequente em perpetuidade. Por exemplo, o tratamento profilático com ELOCTATE™ [fator anti-hemofílico (recombinante), proteína de fusão Fc] requer a administração a cada três a cinco dias (ELOCTATE™ Prescribing Information, Biogen Idec Inc., (2015)). Além disso, os efeitos de longo prazo de produtos biológicos quimicamente modificados (por exemplo, polipeptídeos peguilados) ainda não

3 / 93 são totalmente compreendidos.

[007] Terceiro, entre 15% e 30% de todos os indivíduos que recebem terapia de reposição com Fator VIII formam anticorpos inibidores anti-Fator VIII, tornando a terapia ineficiente. A terapia de desvio do Fator VIII (por exemplo, administração de concentrados de complexo de protrombina derivados de plasma ou produzidos de forma recombinante) pode ser usada para tratar hemofilia em indivíduos que formam anticorpos inibidores. No entanto, a terapia de desvio com Fator VIII é menos eficaz do que a terapia de substituição com Fator VIII (Mannucci P.M., J Thromb Haemost., 1(7):1349- 55 (2003)) e pode estar associada a um risco aumentado de complicações cardiovasculares (Luu and Ewenstein, Haemophilia, 10 Suppl. 2:10-16 (2004)).

[008] A terapia genética somática é uma grande promessa para o tratamento da hemofilia A porque remediaria a subexpressão da atividade funcional do Fator VIII subjacente (por exemplo, devido a mutações com erro ou sem sentido), em vez de fornecer uma dose única de atividade do Fator VIII para o indivíduo. Devido a esta diferença no mecanismo de ação, em comparação com a terapia de reposição do Fator VIII, a administração única de um vetor de terapia genética do Fator VIII pode fornecer a um indivíduo Fator VIII por vários anos, reduzindo o custo do tratamento e eliminando a necessidade de conformidade contínua do paciente.

[009] A terapia genética do Fator IX de coagulação (FIX) tem sido usada de forma eficaz para tratar indivíduos com hemofilia B, uma condição de coagulação sanguínea relacionada caracterizada pela atividade diminuída do Fator IX (Manno C.S., et al., Nat Med., 12(3):342-47 (2006)). No entanto, a terapia genética com Fator VIII apresenta vários desafios únicos. Por exemplo, o polipeptídeo Fator VIII de tipo selvagem de comprimento total (2351 aminoácidos; número de acessão UniProt P00451) é cinco vezes maior do que o polipeptídeo Fator IX de tipo selvagem de comprimento total (461

4 / 93 aminoácidos; número de acessão UniProt P00740). Como tal, a sequência de codificação do Fator VIII de tipo selvagem é de 7053 pares de bases, que é muito grande para ser empacotada em vetores de terapia genética de AAV convencionais. Além disso, a expressão recombinante relatada de variantes deletadas do domínio B do Fator VIII (BDD-FVIII) tem sido fraca. Como tal, vários grupos tentaram alterar a utilização de códons dos construtos BDD- FVIII, com sucesso limitado.

BREVE SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[0010] Consequentemente, há uma necessidade de variantes do Fator VIII cujas sequências de codificação sejam mais eficientemente empacotadas e distribuídas por meio de vetores de terapia genética. Há também uma necessidade de ácidos nucleicos sintéticos alterado por códons que expressem o Fator VIII de maneira mais eficiente. Há também uma necessidade de ácidos nucleicos alterado por códons que codificam polipeptídeos de Fator VIII com propriedades de dobramento melhoradas, secreção melhorada de células de expressão, atividade aumentada e / ou meia-vida de circulação melhorada in vivo, em comparação com Fator VIII de tipo selvagem ou Fator VIII excluído do domínio B de tipo selvagem. Essas variantes do Fator VIII e ácidos nucleicos alterado por códons permitem um tratamento melhorado das deficiências do Fator VIII (por exemplo, hemofilia A). As deficiências acima e outros problemas associados ao tratamento de deficiências do Fator VIII (por exemplo, hemofilia A) são reduzidos ou eliminados pelas variantes do Fator VIII alterado por códons divulgadas.

[0011] Em um aspecto, as composições de ácido nucleico (por exemplo, polinucleotídeos alterado por códons) que codificam variantes do Fator VIII são descritas. Em algumas modalidades, as composições de ácido nucleico incluem polinucleotídeos com alta identidade de sequência para as sequências CS04 (SEQ ID NO: 37) ou CS12 (SEQ ID NO: 1) que codificam variantes do Fator VIII, conforme descrito neste documento. Em algumas

5 / 93 modalidades, as composições de ácido nucleico aqui descritas fornecem expressão aumentada do Fator VIII e / ou atividade aumentada do Fator VIII no sangue de um animal em relação às sequências de codificação do Fator VIII de tipo selvagem e / ou outras sequências de codificação do Fator VIII otimizadas por códon. Em algumas modalidades, as composições de ácido nucleico também permitem o aumento da produção de vírions de terapia genética com base em AAV. Em algumas modalidades, as composições de ácido nucleico aqui descritas diminuíram o teor de GC e / ou incluem menos dinucleotídeos CpG, em comparação com as sequências de tipo selvagem que codificam o Fator VIII. Em algumas modalidades, a variante do Fator VIII codificada pelas composições de ácido nucleico é secretada no sangue de forma mais eficaz, in vivo, e / ou tem uma meia-vida de circulação aumentada no sangue, in vivo, em relação ao Fator VIII de tipo selvagem e / ou outras variantes do Fator VIII.

[0012] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do Fator VIII tendo uma sequência de aminoácidos de CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), onde o polinucleotídeo tem uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência) para um CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[0013] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui ainda um polinucleotídeo promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, em que o polinucleotídeo promotor tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para hTTR (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o promotor está diretamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0014] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico

6 / 93 inclui ainda um elemento específico do fígado operativamente ligado ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, o elemento específico do fígado é um elemento intensificador com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ou 100%) para CRM8 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui dois desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui três desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, um ou mais elementos específicos do fígado e o promotor estão diretamente ligados, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0015] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vr (SEQ ID NO: 3).

[0016] Em algumas modalidades, a composição de ácido tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vrp (SEQ ID NO: 10).

[0017] Em um aspecto, os vetores de terapia genética de mamíferos que incluem um ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII são descritos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o Fator VIII inclui um polinucleotídeo com alta identidade de sequência para as sequências CS04 (SEQ ID NO: 37) ou CS12 (SEQ ID NO: 1) que codificam as variantes do Fator VIII, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, os vetores de terapia genética de mamíferos aqui descritos fornecem expressão aumentada do Fator VIII e / ou atividade aumentada do Fator VIII no sangue de um animal em relação aos vetores de terapia genética

7 / 93 que incluem um polinucleotídeo variante do Fator VIII codificado nativamente ou outros polinucleotídeos variantes do Fator VIII otimizados por códon. Em algumas modalidades, os vetores de terapia genética de mamíferos aqui descritos codificam para uma proteína variante do Fator VIII que é secretada no sangue de forma mais eficaz, in vivo, e / ou tem uma meia- vida de circulação aumentada no sangue, in vivo, em relação ao Fator VIII de tipo selvagem e / ou outras variantes do Fator VIII.

[0018] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do Fator VIII tendo uma sequência de aminoácidos de CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), onde o polinucleotídeo tem uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência) para um CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[0019] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos inclui ainda um polinucleotídeo promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, em que o polinucleotídeo promotor tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para hTTR (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o promotor está diretamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0020] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos inclui ainda um elemento específico do fígado operativamente ligado ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, o elemento específico do fígado é um elemento intensificador com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ou 100%) para CRM8 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui dois desses

8 / 93 elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui três desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, um ou mais elementos específicos do fígado e o promotor estão diretamente ligados, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0021] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vr (SEQ ID NO: 3).

[0022] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos é incluído em um plasmídeo com uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vrp (SEQ ID NO: 10).

[0023] Em um aspecto, partículas de vírus adenoassociado (AAV) que incluem um ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII são descritas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o Fator VIII inclui um polinucleotídeo com alta identidade de sequência para as sequências CS04 (SEQ ID NO: 37) ou CS12 (SEQ ID NO: 1) que codificam as variantes do Fator VIII, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, as partículas de AAV aqui descritas fornecem expressão aumentada do Fator VIII e / ou atividade aumentada do Fator VIII no sangue de um animal em relação às partículas AAV que incluem um polinucleotídeo variante do Fator VIII codificado nativamente ou outros polinucleotídeos variantes do Fator VIII otimizado por códon. Em algumas modalidades, as partículas de AAV aqui descritas codificam para uma proteína variante do Fator VIII que é secretada no sangue de forma mais eficaz, in vivo, e / ou tem

9 / 93 uma meia-vida de circulação aumentada no sangue, in vivo, em relação ao Fator VIII de tipo selvagem e / ou outras variantes do Fator VIII.

[0024] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do Fator VIII tendo uma sequência de aminoácidos de CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), onde o polinucleotídeo tem uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência) para um CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[0025] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV inclui ainda um polinucleotídeo promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, em que o polinucleotídeo promotor tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para hTTR (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o promotor está diretamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0026] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV inclui ainda um elemento específico do fígado operativamente ligado ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, o elemento específico do fígado é um elemento intensificador com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ou 100%) para CRM8 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui dois desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui três desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, um ou mais elementos específicos do fígado e o promotor estão

10 / 93 diretamente ligados, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0027] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12- CRM8.2-Vr (SEQ ID NO: 3).

[0028] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV é produzido usando um plasmídeo com uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vrp (SEQ ID NO: 10).

[0029] Em um aspecto, são descritos métodos para o tratamento de hemofilia A pela administração de uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII a um paciente com hemofilia A. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui um polinucleotídeo com alta identidade de sequência para as sequências CS04 (SEQ ID NO: 37) ou CS12 (SEQ ID NO: 1) que codificam as variantes do Fator VIII, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, os métodos para tratar hemofilia A aqui descritos resultam em aumentos na expressão do Fator VIII e / ou aumentos na atividade do Fator VIII no sangue do paciente que são maiores do que aumentos na expressão do Fator VIII e / ou aumentos na atividade do Fator VIII no sangue de um paciente administrado com uma composição de ácido nucleico que inclui uma sequência de codificação do Fator VIII de tipo selvagem e / ou uma sequência de codificação do Fator VIII otimizada por códon diferente. Em algumas modalidades, a variante do Fator VIII codificada pela composição de ácido nucleico é secretada no sangue de forma mais eficaz, in vivo, e / ou tem uma meia-vida de circulação aumentada no sangue, in vivo, em relação ao Fator VIII de tipo selvagem e / ou outras variantes do Fator VIII.

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[0030] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico administrada inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do Fator VIII tendo uma sequência de aminoácidos de CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), onde o polinucleotídeo tem uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência) para um CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[0031] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico administrada inclui ainda um polinucleotídeo promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, em que o polinucleotídeo promotor tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para hTTR (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o promotor está diretamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0032] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico administrada inclui ainda um elemento específico do fígado operativamente ligado ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, o elemento específico do fígado é um elemento intensificador com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ou 100%) para CRM8 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui dois desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui três desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, um ou mais elementos específicos do fígado e o promotor estão diretamente ligados, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0033] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico

12 / 93 administrada tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vr (SEQ ID NO: 3).

[0034] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico administrada tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vrp (SEQ ID NO: 10).

[0035] Em um aspecto, são descritos métodos para o tratamento de hemofilia A pela administração de um vetor de terapia genética de mamífero que inclui um ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o Fator VIII inclui um polinucleotídeo com alta identidade de sequência para as sequências CS04 (SEQ ID NO: 37) ou CS12 (SEQ ID NO: 1) que codificam as variantes do Fator VIII, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, os métodos para tratar hemofilia A aqui descritos resultam em aumentos na expressão do Fator VIII e / ou aumentos na atividade do Fator VIII no sangue do paciente que são maiores do que aumentos na expressão do Fator VIII e / ou aumentos na atividade do Fator VIII no sangue de um paciente administrado com um vetor de terapia de genética de mamíferos que inclui uma sequência de codificação do Fator VIII de tipo selvagem e / ou uma sequência de codificação do Fator VIII otimizada por códon diferente. Em algumas modalidades, a variante do Fator VIII codificada pelo ácido nucleico dentro do vetor de terapia genética de mamíferos é secretada no sangue de forma mais eficaz, in vivo, e / ou tem uma meia-vida de circulação aumentada no sangue, in vivo, em relação ao Fator VIII de tipo selvagem e / ou outras variantes do Fator VIII.

[0036] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de

13 / 93 mamíferos administrado inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do Fator VIII tendo uma sequência de aminoácidos de CS12-FL- AA (SEQ ID NO: 2), onde o polinucleotídeo tem uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência) para um CS12- FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[0037] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos administrado inclui ainda um polinucleotídeo promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, em que o polinucleotídeo promotor tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para hTTR (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o promotor está diretamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0038] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos administrado inclui ainda um elemento específico do fígado operativamente ligado ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, o elemento específico do fígado é um elemento intensificador com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ou 100%) para CRM8 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui dois desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui três desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, um ou mais elementos específicos do fígado e o promotor estão diretamente ligados, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0039] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de

14 / 93 mamíferos administrado tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12- CRM8.2-Vr (SEQ ID NO: 3).

[0040] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de mamíferos administrado é incluído em um plasmídeo com uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vrp (SEQ ID NO: 10).

[0041] Em um aspecto, são descritos métodos para o tratamento da hemofilia A pela administração de uma partícula de vírus adenoassociado (AAV) que inclui um ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o Fator VIII inclui um polinucleotídeo com alta identidade de sequência para as sequências CS04 (SEQ ID NO: 37) ou CS12 (SEQ ID NO: 1) que codificam as variantes do Fator VIII, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, os métodos para tratar hemofilia A aqui descritos resultam em aumentos na expressão do Fator VIII e / ou aumentos na atividade do Fator VIII no sangue do paciente que são maiores do que aumentos na expressão do Fator VIII e / ou aumentos na atividade do Fator VIII no sangue de um paciente administrado com uma partícula de vírus adenoassociado (AAV) que inclui uma sequência de codificação do Fator VIII de tipo selvagem e / ou uma sequência de codificação do Fator VIII otimizada por códon diferente. Em algumas modalidades, a variante do Fator VIII codificada pelo ácido nucleico dentro da partícula de vírus adenoassociado (AAV) é secretada no sangue de forma mais eficaz, in vivo, e / ou tem uma meia-vida de circulação aumentada no sangue, in vivo, em relação ao Fator VIII de tipo selvagem e / ou outras variantes do Fator VIII.

[0042] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas

15 / 93 partículas de AAV administradas inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do Fator VIII tendo uma sequência de aminoácidos de CS12-FL- AA (SEQ ID NO: 2), onde o polinucleotídeo tem uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência) para um CS12- FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[0043] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV administradas inclui ainda um polinucleotídeo promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, em que o polinucleotídeo promotor tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para hTTR (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o promotor está diretamente ligado ao polinucleotídeo Fator VIII, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0044] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV administradas inclui ainda um elemento específico do fígado operativamente ligado ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, o elemento específico do fígado é um elemento intensificador com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ou 100%) para CRM8 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui dois desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico inclui três desses elementos específicos do fígado operativamente ligados ao polinucleotídeo do Fator VIII. Em algumas modalidades, um ou mais elementos específicos do fígado e o promotor estão diretamente ligados, por exemplo, como representado na Figura 11.

[0045] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas

16 / 93 partículas de AAV administradas tem uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vr (SEQ ID NO: 3).

[0046] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contido nas partículas de AAV administradas é produzido usando um plasmídeo com uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%) para CS12-CRM8.2-Vrp (SEQ ID NO: 10).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0047] As Figuras 1A e 1B mostram coletivamente a sequência de nucleotídeos otimizadas por códons CS12 (SEQ ID NO: 1) que codifica uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades ("CS12-FL-NA" para a sequência de codificação de comprimento total).

[0048] A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos variante do Fator VIII (SEQ ID NO: 2) codificada pela sequência de nucleotídeos alterada no códon CS12 de acordo com algumas modalidades ("CS12-FL-AA" para a sequência de aminoácidos de comprimento total).

[0049] As Figuras 3A e 3B mostram coletivamente a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) do vetor de terapia genética com nucleotídeo reduzido CS12-CRM8.2-Vr que codifica uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades.

[0050] A Figura 4 mostra a sequência de ácido nucleico de vários elementos genéticos úteis para vetores de terapia genética que codificam uma variante do Fator VIII, incluindo uma 5'-ITR (SEQ ID NO: 4), um elemento intensificador CRM8 (SEQ ID NO: 5), um promotor TTR humano (SEQ ID NO: 6), uma sequência Kozak mínima (SEQ ID NO: 7) e elemento de poliadenilação sintético (SEQ ID NO: 8) e uma 3'-ITR (SEQ ID NO: 9), de acordo com algumas modalidades.

17 / 93

[0051] As Figuras 5A, 5B e 5C mostram coletivamente a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 10) do plasmídeo CS12-CRM8.2-Vrp contendo um vetor de terapia genética que codifica uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades.

[0052] As Figuras 6A e 6B mostram coletivamente a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 38) do vetor de terapia genética CS12-CRM8.2- V que codifica uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades.

[0053] As Figuras 7A e 7B mostram coletivamente a sequência de nucleotídeos otimizadas por códons CS04 (SEQ ID NO: 37) que codifica uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades ("CS12-FL-NA" para a sequência de codificação de comprimento total).

[0054] As Figuras 8A e 8B mostram coletivamente sequências de aminoácidos e nucleotídeos para peptídeos de glicosilação exemplificativos que são inseridos no ligante substituído por domínio B de uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades. “NG1” ou NG1-AA” é o código para a sequência de aminoácidos, mostrado na linha superior. “NG1- NA” é o código para a sequência de ácido nucleico, mostrado na linha inferior de cada conjunto. A Figura 8A e 8B divulgam as sequências de aminoácidos como SEQ ID NOS 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35, e as sequências de nucleotídeos como SEQ ID NOS 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36, todos, respectivamente, em ordem de aparecimento.

[0055] A Figura 9 mostra a análise de Western blot de variantes do Fator VIII, com (vNG4 / CS04, vNG5 / CS04 e vNG16 / CS04) e sem (vCS04 com SQ) peptídeos de glicosilação engenheirados no ligante SQ, expresso em células Huh-7.

[0056] A Figura 10 mostra a análise de Western blot de variantes do Fator VIII, com (vNG4 / CS04, vNG5 / CS04 e vNG16 / CS04) e sem (vCS04 com SQ) peptídeos de glicosilação engenheirados no ligante SQ, expresso em

18 / 93 células HepG2 após a infecção de um vetor AAV8 de terapia genética.

[0057] A Figura 11 ilustra construtos de terapia genética de Fator VIII exemplificativos que codificam uma variante de Fator VIII de acordo com algumas implementações.

[0058] A Figura 12 mostra os níveis de atividade do Fator VIII in vivo em um modelo de camundongo tolerante a hFVIII de "linha E" e in vitro usando células HepG2, pós-infecção com vetores de terapia genética de AAV8 que codificam uma proteína variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades.

[0059] A Figura 13 mostra a análise eletroforética de gel de agarose dos vetores de terapia genética vCS04, vX5 / NG5 / CS120 e vX5 / NG5 / CS12 que codificam uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades.

[0060] A Figura 14 mostra os níveis de atividade do Fator VIII in vivo em um modelo de camundongo knock-in FVIII F17 e in vitro usando células HepG2, uma linhagem de células de fígado humano (ATCC # HB- 8065), pós-infecção com vetores de terapia genética de AAV8 que codificam uma proteína variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades.

[0061] A Figura 15 mostra ilustrações esquemáticas dos construtos de proteína do Fator VIII humana de tipo selvagem e tipo Refacto, bem como a proteína do Fator VIII codificada pelo polinucleotídeo CS12, que contém as mutações X5 e o peptídeo de glicosilação NG5.

[0062] A Figura 16 mostra uma sequência de aminoácidos do Fator VIII humano de tipo selvagem (SEQ ID NO: 39), de acordo com algumas modalidades ("FVIII-FL-AA").

[0063] A Figura 17 mostra sequências de codificação de exemplo (SEQ ID NOS 41-53, respectivamente, em ordem de aparecimento) para ligantes substituídos por domínio B de acordo com algumas modalidades. BDLO04 (SEQ ID NO: 41) é a porção das sequências de nucleotídeos

19 / 93 alteradas por códon CS04 que codificam o ligante substituído por domínio B.

[0064] A Figura 18 mostra um exemplo de espinha dorsal de plasmídeo (SEQ ID NO: 54) para integrar um genoma de terapia genética do Fator VIII, de acordo com algumas modalidades.

[0065] A Figura 19 mostra um exemplo de replicon ("pMB1 Replicon" - SEQ ID NO: 55) e marcador de resistência à ampicilina ("Bla (ApR)" - SEQ ID NO: 56) para um plasmídeo útil para integrar um genoma de terapia genética do Fator VIII, de acordo com algumas modalidades.

[0066] As Figuras 20A, 20B e 20C mostram coletivamente a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 57) do plasmídeo CS12-CRM8.2- Vp contendo um vetor de terapia genética que codifica uma variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO I. Introdução

[0067] A terapia genética baseada em AAV é uma grande promessa para o tratamento de hemofílicos. Para hemofilia B, os primeiros dados clínicos são encorajadores, pois os níveis de FIX de cerca de 10% podem ser mantidos em pelo menos alguns pacientes por mais de 1 ano. Para hemofilia A, no entanto, atingir níveis de expressão terapêutica de 5-10% com vetores AAV permanece um desafio por várias razões. Primeiro, a sequência de codificação do Fator VIII é muito grande para os vetores convencionais baseados em AAV. Em segundo lugar, os construtos de Fator VIII excluídos ou truncados de domínio B engenheirados sofrem de má expressão in vivo, mesmo quando otimizados por códon. Em terceiro lugar, estes construtos de variante de Fator VIII deletados ou truncados por domínio B têm meia-vida curta in vivo, exacerbando os efeitos de expressão fraca. Em quarto lugar, mesmo quando expresso, o FVIII não é secretado de forma eficiente pelas células, assim como outros fatores de coagulação, como o Fator IX.

[0068] A presente divulgação se refere, em parte, à descoberta de

20 / 93 vetores de terapia genética contendo sequências codificadoras de variantes do Fator VIII com alteradas por códons que resolvem estes e outros problemas associados à terapia genética do Fator VIII. Por exemplo, em algumas modalidades, os polinucleotídeos variantes do Fator VIII, polipeptídeos e construtos de terapia genética divulgados neste documento fornecem expressão melhorada do Fator VIII exógeno em células de mamíferos. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos variantes do Fator VIII, polipeptídeos e construtos de terapia genética divulgados neste documento fornecem biodisponibilidade melhorada (por exemplo, resultam em atividade melhorada do Fator VIII no sangue de um paciente) in vivo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos variantes do Fator VIII, polipeptídeos e construtos de terapia genética divulgados neste documento fornecem meia- vida de circulação melhorada para o Fator VIII exógeno no sangue de um paciente. Conforme descrito neste documento, uma ou mais dessas vantagens são realizadas usando qualquer combinação de uma ou mais das seguintes melhorias para o sistema de terapia genética.

[0069] Em algumas implementações, uma ou mais dessas vantagens são realizadas pela engenharia das mutações X5 em um polipeptídeo variante do Fator VIII que é codificado por um polipeptídeo do Fator VIII alterado por códon, conforme descrito neste documento. Vantajosamente, a inclusão das mutações X5 em um polipeptídeo codificado do Fator VIII, como aqui descrito, fornece biopotência melhorada do Fator VIII expresso exogenamente, in vivo e in vitro. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 4, a inclusão das cinco mutações X5 no domínio A1 da cadeia pesada de um polipeptídeo Refacto FVIII aumentou a biopotência do Fator VIII exógeno in vivo em camundongos da linha E2 em 3 vezes após a administração de um vetor de terapia genética de AAV que codifica a variante de Fator VIII-X5 Refacto, em comparação com camundongos administrados com um vetor de terapia genética idêntico que codifica uma variante de Fator VIII Refacto de

21 / 93 tipo selvagem (compare vX5 / CS24 com vCS04 na Figura 12). Consistente com os resultados in vivo, a inclusão das cinco mutações X5 no domínio A1 da cadeia pesada do Fator VIII aumentou a biopotência do Fator VIII exógeno in vitro em 4 vezes após a infecção de células HepG2 com um vetor de terapia genética de AAV que codifica um Fator VIII-X5 Refacto variante, em comparação com células HepG2 infectadas com um vetor de terapia genética idêntico que codifica uma variante do Fator VIII Refacto de tipo selvagem (compare vX5 / CS24 com vCS04 na Figura 12).

[0070] Em algumas implementações, uma ou mais dessas vantagens são realizadas por engenharia de um peptídeo de glicosilação NG5 em um ligante de domínio B de um polipeptídeo variante do Fator VIII que é codificado por um polipeptídeo do Fator VIII alterado por códon, conforme descrito neste documento. Vantajosamente, a inclusão do peptídeo de glicosilação NG5 em um polipeptídeo codificado do Fator VIII, como aqui descrito, fornece biopotência melhorada do Fator VIII expresso exogenamente, in vivo. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 3, a inclusão do peptídeo de glicosilação NG no ligante SQ de um polipeptídeo FVIII Refacto aumentou a biopotência do Fator VIII exógeno in vivo em camundongos da linha E2 em 2 vezes após a administração de um vetor de terapia genética de AAV que codifica a variante do Fator VIII-NG5 Refacto, em comparação com camundongos administrados com um vetor de terapia genética idêntico que codifica uma variante do Fator VIII Refacto de tipo selvagem (compare vNG5 / CS04 a vCS04 na Figura 12).

[0071] Em algumas implementações, uma ou mais dessas vantagens são realizadas pela engenharia de ambos as mutações X5 e o peptídeo de glicosilação NG5 em um polipeptídeo variante do Fator VIII que é codificado por um polipeptídeo do Fator VIII alterado por códon, conforme descrito neste documento. Vantajosamente, a inclusão das mutações X5 e do peptídeo de glicosilação NG5 em um polipeptídeo codificado do Fator VIII, como aqui

22 / 93 descrito, fornece biopotência melhorada do Fator VIII expresso exogenamente, in vivo e in vitro. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 5, a inclusão das cinco mutações X5 no domínio A1 da cadeia pesada e o peptídeo de glicosilação NG5 no ligante-SQ de um polipeptídeo Refacto FVIII aumentou a biopotência do Fator VIII exógeno in vivo em camundongos da linha E2 em 4,5 vezes após a administração de um vetor de terapia genética de AAV que codifica a variante de Fator VIII-X5/NG5 Refacto, em comparação com camundongos administrados com um vetor de terapia genética idêntico que codifica uma variante de Fator VIII Refacto de tipo selvagem (compare vX5/NG5/CS125 com vCS04 na Figura 12). Consistente com os resultados in vivo, a inclusão das cinco mutações X5 no domínio A1 da cadeia pesada e o peptídeo de glicosilação NG5 no ligante SQ de um polipeptídeo FVIII Refacto aumentou a biopotência do Fator VIII exógeno in vitro em 3 vezes após a infecção de células HepG2 com um vetor de terapia genética de AAV que codifica um Fator VIII-X5/NG5 Refacto variante, em comparação com células HepG2 infectadas com um vetor de terapia genética idêntico que codifica uma variante do Fator VIII Refacto de tipo selvagem (compare vX5/NG5/CS125 com vCS04 na Figura 12).

[0072] Em algumas implementações, uma ou mais dessas vantagens são realizadas usando um promotor hTTR humano e um ou mais elementos CRM8 específicos do fígado a montante da sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo variante do Fator VIII. Vantajosamente, o uso do promotor hTTR e um ou mais elementos CRM8 específicos do fígado fornece biopotência melhorada do Fator VIII expresso exogenamente em células humanas, in vitro. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2, o uso do promotor hTTR e um ou dois elementos de CRM8 específicos do fígado aumentaram a biopotência do Fator VIII exógeno in vivo em células HepG2 em cerca de 2 e 4 vezes, respectivamente, em comparação com o uso de sequências promotoras e intensificadoras de TTR de camundongo (compare

23 / 93 vCS115 e vCS116 a vCS04 na Figura 12).

[0073] Em algumas implementações, uma ou mais dessas vantagens são realizadas através da remoção de nucleotídeos estranhos posicionados entre vários elementos de um vetor de terapia genética de AAV que codifica uma proteína variante do Fator VIII. Vantajosamente, a remoção de nucleotídeos estranhos entre vários elementos fornece biopotência melhorada do Fator VIII expresso exogenamente em células humanas, in vitro. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 6, a remoção de apenas 71 nucleotídeos do vetor de terapia genética vX5 / NG5 / CS120 AAV que codifica uma variante do Fator VIII-X5 / NG5 Refacto melhorou a biopotência in vitro da variante de Fator VIII expressa em 50% (compare vX5 / NG5 / CS12 com vX5 / NG5 / CS120 na Figura 14).

[0074] Em algumas implementações, uma ou mais dessas vantagens são realizadas pela engenharia das mutações X5 e do peptídeo de glicosilação NG5 em um polipeptídeo variante do Fator VIII que é codificado por um polipeptídeo do Fator VIII alterado por códon e usando um promotor hTTR humano e um ou mais elementos CRM8 específicos do fígado a montante da sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo variante do Fator VIII. Vantajosamente, o uso desta combinação de melhorias fornece biopotência melhorada do Fator VIII expresso exogenamente, in vivo e in vitro. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 6, o uso desta combinação de melhorias em um vetor de terapia genética de AAV aumentou a biopotência in vivo 14,5 vezes, em relação ao uso de um vetor de terapia genética de AAV que inclui um polinucleotídeo tendo a mesma alteração de códon para um Fator VIII Refacto de tipo selvagem codificado usando o promotor TTR murino e sequências intensificadoras (compare vX5 / NG5 / CS120 com vSC04 na Figura 14). Consistente com os resultados in vivo, o uso desta combinação de melhorias em um vetor de terapia genética de AAV aumentou a biopotência in vitro 17 vezes, em relação ao uso de um vetor de terapia

24 / 93 genética de AAV que inclui um polinucleotídeo tendo a mesma alteração de códon para um Fator VIII Refacto de tipo selvagem codificado usando o promotor TTR murino e sequências intensificadoras (compare vX5 / NG5 / CS120 com vSC04 na Figura 14). Conforme relatado na Tabela 4 de WO 2017/083762 (o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência), o vetor vCS04 fornece biopotência FVIII mais de 70 vezes maior in vivo, em relação a um vetor de terapia genética equivalente que codifica para um polinucleotídeo de Fator VIII Refacto usando a sequência de codificação de tipo selvagem. Por conseguinte, seria esperado que o vetor de terapia genética vX5 / NG5 / CS120 proporcionasse um aumento de 1000 a 1250 vezes na biopotência de FVIII, em relação ao uso da sequência de codificação Refacto de tipo selvagem.

[0075] Em algumas implementações, uma ou mais dessas vantagens são realizadas pela engenharia das mutações X5 e do peptídeo de glicosilação NG5 em um polipeptídeo variante do Fator VIII que é codificado por um polipeptídeo do Fator VIII alterado por códon, usando um promotor hTTR humano e um ou mais elementos CRM8 específicos do fígado a montante da sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo variante do Fator VIII, e removendo nucleotídeos estranhos posicionados entre vários elementos do vetor de terapia genética de AAV. Vantajosamente, o uso desta combinação de melhorias fornece biopotência melhorada do Fator VIII expresso exogenamente, in vivo e in vitro. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo 6, o uso desta combinação de melhorias em um vetor de terapia genética de AAV aumentou a biopotência in vivo 14 vezes, em relação ao uso de um vetor de terapia genética de AAV que inclui um polinucleotídeo tendo a mesma alteração de códon para um Fator VIII Refacto de tipo selvagem codificado usando o promotor TTR murino e sequências intensificadoras (compare vX5 / NG5 / CS12 com vSC04 na Figura 14). Consistente com os resultados in vivo, o uso desta combinação de melhorias em um vetor de

25 / 93 terapia genética de AAV aumentou a biopotência in vitro 24 vezes, em relação ao uso de um vetor de terapia genética de AAV que inclui um polinucleotídeo tendo a mesma alteração de códon para um Fator VIII Refacto de tipo selvagem codificado usando o promotor TTR murino e sequências intensificadoras (compare vX5 / NG5 / CS12 com vSC04 na Figura 14). Conforme relatado na Tabela 4 de WO 2017/083762 (o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência), o vetor vCS04 fornece biopotência FVIII mais de 70 vezes maior in vivo, em relação a um vetor de terapia genética equivalente que codifica para um polinucleotídeo de Fator VIII Refacto usando a sequência de codificação de tipo selvagem. Por conseguinte, seria esperado que o vetor de terapia genética vX5 / NG5 / CS120 proporcionasse um aumento de 1000 a 1750 vezes na biopotência de FVIII, em relação ao uso da sequência de codificação Refacto de tipo selvagem. II. Definições

[0076] Como utilizados neste documento, os termos a seguir têm os significados atribuídos a eles, a menos que especificado de outra forma.

[0077] Como utilizados neste documento, os termos "Fator VIII" e "FVIII" são usados indistintamente e referem-se a qualquer proteína com atividade de Fator VIII (por exemplo, FVIII ativo, frequentemente referido como FVIIIa) ou precursor de proteína (por exemplo, pró-proteína ou pré-pró- proteína) de uma proteína com atividade de cofator de Fator IXa sob condições particulares, por exemplo, conforme medido usando o ensaio de ativação de Fator X cromogênico de duas etapas descrito no Capítulo 2.7.4 da Farmacopeia Europeia 9.0. Em uma modalidade exemplificativa, um polipeptídeo Fator VIII refere-se a um polipeptídeo que tem sequências com alta identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais) para as cadeias pesadas e leves de um polipeptídeo Fator VIII de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o domínio B de um polipeptídeo Fator VIII é deletado, truncado ou substituído por um

26 / 93 polipeptídeo ligante para reduzir o tamanho do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo Fator VIII.

[0078] Exemplos não limitativos de polipeptídeos de Fator VIII de tipo selvagem incluem pré-pró-Fator VIII humano (por exemplo, números de acessão do GenBank AAA52485, CAA25619, AAA58466, AAA52484, AAA52420, AAV85964, BAF82636, BAG36452, CAI41660, CAI41666, CAI41672, CAI43241, CAO03404, EAW72645, AAH22513, AAH64380, AAH98389, AAI11968, AAI11970, ou AAB61261), pró-Fator VIII correspondente, e variantes naturais do mesmo; pré-pró-Fator VIII porcino (por exemplo, números de acessão UniProt F1RZ36 ou K7GSZ5), o pró-Fator VIII correspondente e variantes naturais dos mesmos; pré-pró-Fator VIII de camundongo (por exemplo, números de acessão do GenBank AAA37385, CAM15581, CAM26492 ou EDL29229), pró-fator VIII correspondente e variantes naturais dos mesmos; pré-pró-Fator VIII de rato (por exemplo, número de acessão do GenBank AAQ21580), pró-Fator VIII correspondente e variantes naturais dos mesmos; pré-pró-Fator VIII de rato; e outros homólogos de Fator VIII de mamífero (por exemplo, macaco, hamster, porquinho da índia, etc.).

[0079] Como utilizado neste documento, um polipeptídeo Fator VIII inclui variantes naturais e construtos artificiais com atividade de cofator Fator IX. Conforme usado na presente divulgação, o Fator VIII abrange quaisquer variantes naturais, sequências alternativas, isoformas ou proteínas mutantes que retêm alguma atividade de cofator do Fator IX basal (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, ou mais da atividade de tipo selvagem correspondente).

[0080] Especificamente incluídas na definição de “Fator VIII” estão as variantes do Fator VIII, às vezes também chamadas de “variante FVIII”. As proteínas FVIII variantes têm pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com o FVIII de tipo selvagem humano. Exemplos de

27 / 93 variações de aminoácidos do Fator VIII (em relação a FVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 19)) encontradas na população humana incluem, sem limitação, S19R, R22T, Y24C, Y25C, L26P/R, E30V, W33G, Y35C/H, G41C, R48C/K, K67E/N, L69P, E72K, D75E/V/Y, P83R, G89D/V, G92A/V, A97P, E98K, V99D, D101G/H/V, V104D, K108T, M110V, A111T/V, H113R/Y, L117F/R, G121S, E129V, G130R, E132D, Y133C, D135G/Y, T137A/I, S138R, E141K, D145H, V147D, Y155H, V159A, N163K, G164D/V, P165S, C172W, S176P, S179P, V181E/M, K185T, D186G/N/Y, S189L, L191F, G193R, L195P, C198G, S202N/R, F214V, L217H, A219D/T, V220G, D222V, E223K, G224W, T252I, V253F, N254I, G255V, L261P, P262L, G263S, G266F, C267Y, W274C, H275L, G278R, G280D, E284K, V285G, E291G/K, T294I, F295L, V297A, N299I, R301C/H/L, A303E/P, I307S, S308L, F312S, T314A/I, A315V, G323E, L326P, L327P/V, C329F, I331V, M339T, E340K, V345A/L, C348R/S/Y, Y365C, R391C/H/P, S392L/P, A394S, W401G, I405F/S, E409G, W412G/R, K427I, L431F/S, R437P/W, I438F, G439D/S/V, Y442C, K444R, Y450D/N, T454I, F455C, G466E, P470L/R/T, G474E/R/V, E475K, G477V, D478N, T479R, F484C, A488G, R490G, Y492C/H, Y492H, I494T, P496R, G498R, R503H, G513S/V, I522Y, K529E, W532G, P540T, T541S, D544N, R546W, R550C/G/H, S553P, S554C/G, V556D, R560T, D561G/H/Y, I567T, P569R, S577F, V578A, D579A/H, N583S, Q584H/K/R, I585R/T, M586V, D588G/Y, L594Q, S596P, N601D/K, R602G, S603I/R, W604C, Y605H/S, N609I, R612C, N631K/S, M633I, S635N, N637D/I/S, Y639C, L644V, L650F, V653A/M, L659P, A663V, Q664P, F677L, M681I, V682F, Y683C/N, T686R, F698L, M699T/V, M701I, G705V, G710W, N713I, R717L/W, G720D/S, M721I/L, A723T, L725Q, V727F, E739K, Y742C, R795G, P947R, V1012L, E1057K, H1066Y, D1260E, K1289Q, Q1336K, N1460K, L1481P, A1610S, I1698T, Y1699C/F, E1701K, Q1705H, R1708C/H, T1714S, R1715G, A1720V, E1723K, D1727V, Y1728C, R1740G, K1751Q, F1762L, R1768H, G1769R,

28 / 93 L1771P, L1775F/V, L1777P, G1779E/R, P1780L, I1782R, D1788H, M1791T, A1798P, S1799H, R1800C/G/H, P1801A, Y1802C, S1803Y, F1804S, L1808F, M1842I, P1844S, T1845P, E1848G, A1853T/V, S1858C, K1864E, D1865N/Y, H1867P/R, G1869D/V, G1872E, P1873R, L1875P, V1876L, C1877R/Y, L1882P, R1888I, E1894G, I1901F, E1904D/K, S1907C/R, W1908L, Y1909C, A1939T/V, N1941D/S, G1942A, M1945V, L1951F, R1960L/Q, L1963P, S1965I, M1966I/V, G1967D, S1968R, N1971T, H1973L, G1979V, H1980P/Y, F1982I, R1985Q, L1994P, Y1998C, G2000A, T2004R, M2007I, G2013R, W2015C, R2016P/W, E2018G, G2022D, G2028R, S2030N, V2035A, Y2036C, N2038S, 2040Y, G2045E/V, I2051S, I2056N, A2058P, W2065R, P2067L, A2070V, S2082N, S2088F, D2093G/Y, H2101D, T2105N, Q2106E/P/R, G2107S, R2109C, I2117F/S, Q2119R, F2120C/L, Y2124C, R2135P, S2138Y, T2141N, M2143V, F2145C, N2148S, N2157D, P2162L, R2169C/H, P2172L/Q/R, T2173A/I, H2174D, R2178C/H/L, R2182C/H/P, M2183R/V, L2185S/W, S2192I, C2193G, P2196R, G2198V, E2200D, I2204T, I2209N, A2211P, A2220P, P2224L, R2228G/L/P/Q, L2229F, V2242M, W2248C/S, V2251A/E, M2257V, T2264A, Q2265R, F2279C/I, I2281T, D2286G, W2290L, G2304V, D2307A, P2319L/S, R2323C/G/H/L, R2326G/L/P/Q, Q2330P, W2332R, I2336F, R2339T, G2344C/D/S, e C2345S/Y. As proteínas do Fator VIII também incluem polipeptídeos contendo modificações pós-tradução.

[0081] Geralmente, os polinucleotídeos que codificam o Fator VIII codificam para um polipeptídeo de cadeia única inativo (por exemplo, uma pré-pró-proteína) que sofre processamento pós-tradução para formar uma proteína ativa do Fator VIII (por exemplo, FVIIIa). Por exemplo, com referência à Figura 15, a pré-pró-proteína do Fator VIII humano de tipo selvagem é primeiro clivada para liberar o peptídeo sinal codificado (não mostrado), formando uma primeira pró-proteína de cadeia única (mostrada como "FVIII de tipo selvagem humano). A pró-proteína é então clivada entre

29 / 93 os domínios B e A3 para formar um primeiro polipeptídeo que inclui a cadeia pesada do Fator VIII (por exemplo, os domínios A1 e A2) e o domínio B, e um segundo polipeptídeo que inclui a cadeia leve do Fator VIII (por exemplo, incluindo os domínios A3, C1 e C3). O primeiro polipeptídeo é ainda clivado para remover o domínio B, e também para separar os domínios A1 e A2, que permanecem associados com a cadeia leve do Fator VIII na proteína do Fator VIIIa maduro. Para uma revisão do processo de maturação do Fator VIII, ver Graw et al., Nat Rev Genet., 6 (6):488-501 (2005), cujo conteúdo é incorporado aqui por referência em sua totalidade para todos os fins.

[0082] Como utilizado neste documento, os termos "cadeia pesada do Fator VIII" ou simplesmente "cadeia pesada", referem-se ao agregado dos domínios A1 e A2 de um polipeptídeo do Fator VIII. Em uma modalidade exemplificativa, os aminoácidos 20-759 de hFVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 39) constituem uma cadeia pesada do Fator VIII.

[0083] Como utilizado neste documento, o termo "cadeia leve do Fator VIII" ou simplesmente "cadeia leve", refere-se ao agregado dos domínios A3, C1 e C2 de um polipeptídeo do Fator VIII. Em uma modalidade exemplificativa, os aminoácidos 1668-2351 de hFVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 39) constituem uma cadeia leve do Fator VIII. Em algumas modalidades, uma cadeia leve do Fator VIII exclui o peptídeo a3 acídico, que é liberado durante a maturação in vivo.

[0084] Geralmente, as cadeias pesadas e leves do Fator VIII são expressas como uma única cadeia polipeptídica, por exemplo, juntamente com um domínio B opcional ou ligante substituído por domínio B. No entanto, em algumas modalidades, uma cadeia pesada do Fator VIII e uma cadeia leve do Fator VIII são expressas como cadeias polipeptídicas separadas (por exemplo, coexpressas) e reconstituídas para formar uma proteína do Fator VIII (por exemplo, in vivo ou in vitro).

[0085] Como utilizado neste documento, os termos "ligante

30 / 93 substituído por domínio B" e "ligante de Fator VIII" são usados indistintamente e referem-se a versões truncadas de um domínio B do Fator VIII de tipo selvagem (por exemplo, aminoácidos 760-1667 de hFVIII-FL- AA (SEQ ID NO: 39)) ou peptídeos engenheirados para substituir o domínio B de um polipeptídeo Fator VIII. Como utilizado neste documento, um ligante do Fator VIII é posicionado entre o terminal C de uma cadeia pesada do Fator VIII e o terminal N de uma cadeia leve do Fator VIII em um polipeptídeo variante do Fator VIII de acordo com algumas modalidades. Exemplos não limitativos de ligantes substituídos por domínio B são divulgados nas Patentes U.S. 4.868.112, 5.112.950, 5.171.844, 5.543.502,

5.595.886, 5.610.278, 5.789.203, 5.972.885, 6.048.720, 6.060.447, 6.114.148,

6.228.620, 6.316.226, 6.346.513, 6.458.563, 6.924.365, 7.041.635, e

7.943.374; Publicação do Pedido de Patente U.S. 2013/024960, 2015/0071883 e 2015/0158930; e publicação PCT WO 2014/064277 e WO 2014/127215, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência, na sua totalidade, para todos os efeitos.

[0086] A menos que especificado de outra forma neste documento, a numeração dos aminoácidos do Fator VIII refere-se ao aminoácido correspondente na sequência do Fator VIII humano de tipo selvagem de comprimento total (hFVIII-FL-AA), apresentada como SEQ ID NO: 39 na Figura 16. Como tal, quando se refere a uma substituição de aminoácido em uma proteína variante do Fator VIII divulgada neste documento, o número de aminoácido recitado refere-se ao análogo (por exemplo, estrutural ou funcionalmente equivalente) e / ou homólogo (por exemplo, evolutivamente conservado na sequência de aminoácido primário) na sequência do Fator VIII de tipo selvagem de comprimento total. Por exemplo, uma substituição de aminoácido T2105N refere-se a uma substituição T por N na posição 2105 da sequência do Fator VIII humano de tipo selvagem de comprimento total (hFVIII-FL-AA; SEQ ID NO: 39), uma substituição T por N na posição 1218

31 / 93 da proteína variante do Fator VIII codificada por CS12 (CS12-FL-AA; SEQ ID NO: 2).

[0087] Conforme descrito neste documento, o sistema de numeração de aminoácidos do Fator VIII depende se o peptídeo sinal do Fator VIII (por exemplo, aminoácidos 1-19 da sequência do Fator VIII humano de tipo selvagem de comprimento total) está incluído. Onde o peptídeo sinal está incluído, a numeração é referida como "peptídeo sinal inclusive" ou "SPI". Onde o peptídeo sinal não está incluído, a numeração é referida como "peptídeo sinal exclusivo" ou "SPE". Por exemplo, F328S é a numeração SPI para o mesmo aminoácido que F309S, na numeração SPE. A menos que indicado de outra forma, toda a numeração de aminoácidos se refere ao aminoácido correspondente na sequência do Fator VIII humano de tipo selvagem de comprimento total (hFVIII-FL-AA), apresentada como SEQ ID NO: 39 na Figura 16.

[0088] Conforme descrito neste documento, os polinucleotídeos alterados por códon fornecem expressão aumentada do Fator VIII transgênico in vivo (por exemplo, quando administrado como parte de um vetor de terapia genética), em comparação com o nível de expressão do Fator VIII fornecido por um construto do Fator VIII codificado nativamente (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o mesmo construto de Fator VIII usando os códons humanos de tipo selvagem). Como utilizado neste documento, o termo "expressão aumentada" refere-se a um nível aumentado de atividade do Fator VIII transgênico no sangue de um animal administrado com o polinucleotídeo alterado por códon que codifica o Fator VIII, em comparação com o nível de atividade do Fator VIII transgênico no sangue de um animal administrado com um construto de Fator VIII codificado nativamente. Os níveis de atividade podem ser medidos usando qualquer atividade do Fator VIII conhecida na técnica, por exemplo, o ensaio de ativação do Fator X cromogênico em duas etapas descrito no Capítulo 2.7.4 da Farmacopeia

32 / 93 Europeia 9.0. Um ensaio exemplificativo para determinar a atividade do Fator VIII é o ensaio Technocromo FVIII (Technoclone, Viena, Áustria).

[0089] Em algumas modalidades, a biodisponibilidade aumentada refere-se a pelo menos 25% mais polipeptídeo do Fator VIII transgênico no sangue de um animal administrado com o polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em comparação com o nível de polipeptídeo do Fator VIII transgênico no sangue de um animal administrado a polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente. Em algumas modalidades, a biodisponibilidade aumentada refere-se a pelo menos 25% mais polipeptídeo do Fator VIII transgênico no sangue de um animal administrado com um vetor de terapia genética melhorado que inclui um polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em comparação com o nível de um polipeptídeo do Fator VIII transgênico no sangue de um animal administrado com um vetor de terapia genética diferente que inclui o mesmo ou um polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon diferente. Em algumas modalidades, a expressão aumentada se refere a pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 - vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 15 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 25 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, pelo menos 125 vezes maior, pelo menos 150 vezes maior, pelo menos 175 vezes maior, pelo menos 200 vezes maior, pelo menos 225 vezes maior ou pelo menos 250 vezes maior atividade do Fator VIII transgênico no sangue de um animal administrado com o polinucleotídeo do Fator VIII alterado por códon.

[0090] Por "atividade do Fator VIII" neste documento, entende-se a

33 / 93 capacidade de promover a clivagem de um polipeptídeo do Fator X pelo Fator IXa, por exemplo, a atividade do cofator do Fator IXa, por meio da hidrólise da ligação do peptídeo Arg194-Ile195 no Fator IX de tipo selvagem, ativando assim Fator X em Fator Xa. Os níveis de atividade podem ser medidos usando qualquer atividade do Fator VIII conhecida na técnica; ensaios adequados são descritos aqui. Um ensaio exemplificativo para determinar a atividade do Fator VIII é o ensaio de ativação do Fator X cromogênico de duas etapas descrito no Capítulo 2.7.4 da Farmacopeia Europeia 9.0.

[0091] Conforme usado neste documento, o termo "biopotência" refere-se à quantidade de atividade do Fator VIII no sangue de um sujeito, in vivo, ou em um sobrenadante de cultura de células, in vitro. Em algumas modalidades, a biopotência se referirá a uma quantidade de atividade por unidade de volume, como unidades de atividade do cofator do Fator XIa por mL de sangue, in vivo, ou por mL de sobrenadante de cultura de células, in vitro. Em algumas modalidades, a biopotência será expressa como um aumento de vezes em relação a um primeiro nível, por exemplo, uma proteína do Fator VIII codificada nativamente ou um Fator VIII nativo otimizado por códon (por exemplo, uma proteína Refecto FVIII de 'tipo selvagem'). Em algumas modalidades, como utilizado neste documento, a biopotência do Fator VIII expresso exogenamente refere-se à quantidade de atividade do Fator VIII fornecida por uma proteína do Fator VIII recombinante expressa a partir de um vetor de terapia genética. Ou seja, a quantidade de atividade do Fator VIII no sangue ou sobrenadante da cultura de células após contabilizar qualquer quantidade de linha de base da atividade do Fator VIII nativo. Assim, aumentos na biopotência podem ser alcançados por um, ou ambos, aumentando o nível de expressão de uma proteína do Fator VIII exógena e / ou aumentando a atividade específica de uma proteína do Fator VIII exógena, por exemplo, incluindo substituições de aminoácidos (como a mutação X5) que conferem maior atividade específica.

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[0092] Em algumas modalidades, o potencial terapêutico de uma composição de polinucleotídeo do Fator VIII é avaliado pelo aumento da atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com um polinucleotídeo do Fator VIII, por exemplo, em vez de, ou além de, expressão aumentada do Fator VIII e / ou biodisponibilidade. Em algumas modalidades, como utilizado neste documento, o aumento da atividade do Fator VIII refere- se a um maior aumento na atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com um polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em relação a uma atividade do Fator VIII de linha de base no sangue do animal antes da administração do polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em comparação com o aumento da atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com um polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente, em relação a uma atividade do Fator VIII de linha de base no sangue do animal antes de administração do polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente. Em algumas modalidades, o aumento da atividade do Fator VIII refere-se a pelo menos um aumento 25% maior na atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com o polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em relação a um nível de linha de base da atividade do Fator VIII no sangue do animal antes da administração do polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em comparação com o aumento no nível de atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com um polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente, em relação ao nível de linha de base da atividade do Fator VIII no animal antes da administração do polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente. Em algumas modalidades, o aumento da atividade do Fator VIII refere-se a pelo menos um aumento 25% maior na atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com um vetor de terapia genética melhorado que inclui um polinucleotídeo do Fator VIII alterado por códon, em relação a um nível de linha de base da atividade do Fator VIII no sangue

35 / 93 do animal antes da administração do vetor de terapia genética melhorado, em comparação com o aumento no nível de atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com um vetor de terapia genética diferente que inclui o mesmo ou diferente polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em relação ao, em relação ao nível de linha de base da atividade do Fator VIII no animal antes da administração do vetor de terapia genética diferente.

Em algumas modalidades, o aumento da atividade do Fator VIII refere-se a pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, em pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 15 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 25 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 - vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, pelo menos 125 vezes maior, pelo menos 150 vezes maior, pelo menos 175 vezes maior, pelo menos 200 vezes maior, pelo menos 225 vezes maior ou pelo menos 250 vezes maior atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com o polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em relação a um nível de linha de base da atividade do Fator VIII no sangue do animal antes da administração do polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em comparação com o aumento no nível de atividade do Fator VIII no sangue de um animal administrado com um polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente, ou um vetor de terapia genética diferente que inclui o mesmo ou diferente polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em relação ao nível de linha de base da atividade do Fator VIII no animal antes da administração do polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente ou vetor de terapia genética diferente que inclui o mesmo ou diferente polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon.

A atividade é medida

36 / 93 usando o ensaio de ativação do Fator X cromogênico de duas etapas descrito no Capítulo 2.7.4 da Farmacopeia Europeia 9.0, conforme descrito neste documento.

[0093] Conforme descrito neste documento, os polinucleotídeos alterados por códon fornecem produção de vetor aumentada, em comparação com o nível de produção de vetor fornecido por um construto de Fator VIII codificado nativamente (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o mesmo construto de Fator VIII usando os códons humanos de tipo selvagem). Como utilizado neste documento, o termo "produção aumentada de vírus" refere-se a um rendimento de vetor aumentado em cultura de células (por exemplo, título por litro de cultura) inoculado com o polinucleotídeo alterado por códon que codifica o Fator VIII, em comparação com o rendimento de vetor em cultura de células inoculadas com um construto de Fator VIII codificado nativamente. Os rendimentos de vetor podem ser medidos usando qualquer ensaio de título de vetor conhecido na técnica. Um ensaio exemplificativo para determinar o rendimento do vetor (por exemplo, de um vetor AAV) é qPCR direcionado às repetições terminais invertidas de AAV2 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part B 23:18-28 (2012)).

[0094] Em algumas modalidades, o aumento da produção de vírus refere-se a pelo menos 25% maior rendimento do vetor alterado por códon, em comparação com o rendimento de um construto de Fator VIII codificado nativamente no mesmo tipo de cultura. Em algumas modalidades, o aumento da produção de vírus se refere a pelo menos 25% maior rendimento de um vetor melhorado que inclui um polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, em comparação com o rendimento de um vetor diferente que inclui o mesmo ou diferente polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon. Em algumas modalidades, a produção aumentada de vetor se refere a pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo

37 / 93 menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 15 vezes maior, ou pelo menos 20 vezes maior rendimento do vetor alterado por códon.

[0095] Como utilizado neste documento, o termo "hemofilia" refere- se a um grupo de estados de doença amplamente caracterizados por redução da coagulação ou coagulação do sangue. A hemofilia pode referir-se à hemofilia do Tipo A, Tipo B ou Tipo C, ou ao composto de todos os três tipos de doenças. A hemofilia do tipo A (hemofilia A) é causada por uma redução ou perda da atividade do fator VIII (FVIII) e é o mais proeminente dos subtipos de hemofilia. A hemofilia do tipo B (hemofilia B) resulta da perda ou redução da função de coagulação do fator IX (FIX). A hemofilia do tipo C (hemofilia C) é uma consequência da perda ou redução da atividade de coagulação do fator XI (FXI). A hemofilia A e B são doenças ligadas ao X, enquanto a hemofilia C é autossômica. Os tratamentos convencionais para hemofilia incluem a administração profilática e sob demanda de fatores de coagulação, como FVIII, FIX, incluindo Bebulin®-VH e FXI, bem como FEIBA-VH, desmopressina e infusões de plasma.

[0096] Como utilizado neste documento, o termo "terapia genética de FVIII" inclui qualquer abordagem terapêutica de fornecer um ácido nucleico que codifica o Fator VIII a um paciente para aliviar, diminuir ou prevenir a recorrência de um ou mais sintomas (por exemplo, fatores clínicos) associados à hemofilia. O termo abrange administrar qualquer composto, droga, procedimento ou regime compreendendo um ácido nucleico que codifica uma molécula do Fator VIII, incluindo qualquer forma modificada do Fator VIII (por exemplo, variante do Fator VIII), para manter ou melhorar a saúde de um indivíduo com hemofilia. Um versado na técnica apreciará que o curso da terapia com FVIII ou a dose de um agente terapêutico com FVIII pode ser alterado, por exemplo, com base nos resultados obtidos de acordo com a presente divulgação.

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[0097] Como utilizado neste documento, o termo "terapia genética de Fator VIII" ou "terapia genética FVIII" inclui qualquer abordagem terapêutica de fornecer um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do Fator VIII a um paciente para aliviar, diminuir ou prevenir a recorrência de um ou mais sintomas (por exemplo, fatores clínicos) associados à deficiência de Fator VIII (por exemplo, hemofilia A). O termo abrange administrar qualquer composto, droga, procedimento ou regime compreendendo um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII, incluindo qualquer forma modificada de Fator VIII (por exemplo, uma variante de Fator VIII tendo as mutações X5, uma deleção de domínio B e / ou um peptídeo de glicosilação inserido em um polipeptídeo ligante de domínio B), para manter ou melhorar a saúde de um indivíduo com deficiência de Fator VIII (por exemplo, hemofilia A). Um versado na técnica apreciará que o curso da terapia genética com FVIII ou a dose de um agente terapêutico com terapia genética com FVIII pode ser alterado, por exemplo, com base nos resultados obtidos de acordo com a presente divulgação.

[0098] Como utilizado neste documento, o termo "terapia de desvio" inclui qualquer abordagem terapêutica de fornecimento de agentes hemostáticos não Fator VIII, compostos ou fatores de coagulação a um paciente para aliviar, diminuir ou prevenir a recorrência de um ou mais sintomas (por exemplo, fatores clínicos) associados à hemofilia. Compostos não Fator VIII e fatores de coagulação incluem, mas não estão limitados a, Atividade de Desvio do Inibidor do Fator VIII (FEIBA), fator VII ativado recombinante (FVIIa), concentrados de complexo de protrombina e concentrados de complexo de protrombina ativados. Estes compostos não Fator VIII e fatores de coagulação podem ser recombinantes ou derivados de plasma. Um versado na técnica apreciará que o curso da terapia de desvio ou a dose da terapia de desvio podem ser alterados, por exemplo, com base nos resultados obtidos de acordo com a presente divulgação.

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[0099] Como utilizado neste documento, uma "terapia de combinação" incluindo a administração de um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII e um agente terapêutico de hemofilia convencional A inclui qualquer abordagem terapêutica de fornecer um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII e uma molécula de Fator VIII e / ou agente hemostático não Fator VIII (por exemplo, agente terapêutico de desvio) a um paciente para aliviar, diminuir ou prevenir a recorrência de um ou mais sintomas (por exemplo, fatores clínicos) associados à hemofilia. O termo abrange administrar qualquer composto, droga, procedimento ou regime, incluindo um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII, incluindo qualquer forma modificada de fator VIII, que é útil para manter ou melhorar a saúde de um indivíduo com hemofilia e inclui qualquer um dos agentes terapêuticos aqui descritos.

[00100] Os termos "quantidade ou dose terapeuticamente eficaz" ou "quantidade ou dose terapeuticamente suficiente" ou "quantidade ou dose eficaz ou suficiente" referem-se a uma dose que produz efeitos terapêuticos para a qual é administrada. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma droga útil para o tratamento da hemofilia pode ser a quantidade que é capaz de prevenir ou aliviar um ou mais sintomas associados à hemofilia.

[00101] Em algumas modalidades, um tratamento terapeuticamente eficaz resulta em uma diminuição na frequência e / ou gravidade dos incidentes de sangramento em um sujeito.

[00102] Em algumas modalidades, um tratamento terapeuticamente eficaz resulta em aumento da atividade do Fator VIII na corrente sanguínea de um paciente, em comparação com a atividade anterior ao tratamento.

[00103] Como utilizado neste documento, o termo "gene" refere-se ao segmento de uma molécula de DNA que codifica uma cadeia polipeptídica (por exemplo, a região de codificação). Em algumas modalidades, um gene é

40 / 93 posicionado por regiões imediatamente anteriores, seguintes e / ou intervenientes na região de codificação que estão envolvidas na produção da cadeia polipeptídica (por exemplo, elementos regulatórios, como um promotor, intensificador, sequência de poliadenilação, região 5' não traduzida, região 3' não traduzida, ou íntron).

[00104] Como utilizado neste documento, o termo "elementos regulatórios" refere-se a sequências de nucleotídeos, tais como promotores, intensificadores, terminadores, sequências de poliadenilação, íntrons, etc., que proporcionam a expressão de uma sequência de codificação numa célula.

[00105] Como utilizado neste documento, o termo "elemento promotor" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que ajuda a controlar a expressão de uma sequência de codificação. Geralmente, os elementos promotores estão localizados a 5' do sítio de início da tradução de um gene. No entanto, em certas modalidades, um elemento promotor pode estar localizado dentro de uma sequência de íntron ou 3' da sequência de codificação. Em algumas modalidades, um promotor útil para um vetor de terapia genética é derivado do gene nativo da proteína alvo (por exemplo, um promotor do Fator VIII). Em algumas modalidades, um promotor útil para um vetor de terapia genética é específico para expressão em uma célula ou tecido particular do organismo alvo (por exemplo, um promotor específico do fígado). Em ainda outras modalidades, um de uma pluralidade de elementos promotores bem caracterizados é usado em um vetor de terapia genética aqui descrito. Exemplos não limitativos de elementos promotores bem caracterizados incluem o promotor precoce de CMV, o promotor β-actina e o promotor da proteína 2 de ligação de metil CpG (MeCP2). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo, que conduz a expressão substancialmente constante da proteína alvo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor induzível, que conduz a expressão da proteína alvo em resposta a um estímulo particular (por exemplo, exposição a um

41 / 93 tratamento ou agente particular). Para uma revisão da concepção de promotores para terapia genética mediada por AAV, consulte Gray et al. (Human Gene Therapy 22: 1143-53 (2011)), cujos conteúdos são expressamente incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins.

[00106] Como utilizado neste documento, um elemento "CRM8" refere-se ao módulo regulatório de ação cis derivado do gene SERPINA1 (número de acessão NCBI NM_000295.4) que intensifica a expressão de um gene ligado operativamente, por exemplo, uma sequência que codifica um polipeptídeo do Fator VIII, de um modo específico do fígado com alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o elemento CRM8 é idêntico à SEQ ID NO: 5. Como utilizado neste documento, um elemento CRM8 refere-se a uma única cópia do elemento regulatório que, em algumas modalidades, está incluída em uma ou mais cópias dentro de um polinucleotídeo do Fator VIII, por exemplo, 1, 2, 3 ou mais cópias. Para obter mais informações sobre elementos de CRM, como CRM8, consulte Chuah MK et al., Mol Ther., 22(9):1605-13 (2014), que é aqui incorporado por referência.

[00107] Como utilizado neste documento, o termo "operativamente ligado" refere-se à relação entre uma primeira sequência de nucleotídeos de referência (por exemplo, um gene) e uma segunda sequência de nucleotídeos (por exemplo, um elemento de controle regulatório) que permite que a segunda sequência de nucleotídeos afete uma ou mais propriedades associadas à primeira sequência de nucleotídeos de referência (por exemplo, uma taxa de transcrição). No contexto da presente divulgação, um elemento de controle regulatório está operativamente ligado a um transgene de Fator VIII quando o elemento regulatório está posicionado dentro de um vetor de terapia genética de modo que exerça um efeito (por exemplo, um efeito promotor ou seletivo de tecido) na transcrição do transgene do Fator VIII.

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[00108] Como utilizado neste documento, o termo "vetor" refere-se a qualquer veículo usado para transferir um ácido nucleico (por exemplo, codificando um construto de terapia genética do Fator VIII) para uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, um vetor inclui um replicon, que funciona para replicar o veículo, juntamente com o ácido nucleico alvo. Exemplos não limitativos de vetores úteis para terapia genética incluem plasmídeos, fagos, cosmídeos, cromossomos artificiais e vírus, que funcionam como unidades autônomas de replicação in vivo. Em algumas modalidades, um vetor é um veículo viral para a introdução de um ácido nucleico alvo (por exemplo, um polinucleotídeo alterado por códon que codifica uma variante do Fator VIII). Muitos vírus eucarióticos modificados úteis para terapia genética são conhecidos na técnica. Por exemplo, vírus adenoassociados (AAVs) são particularmente adequados para uso em terapia genética humana porque os humanos são hospedeiros naturais para o vírus, os vírus nativos não são conhecidos por contribuírem para quaisquer doenças e os vírus ilicitam uma resposta imune moderada.

[00109] Como utilizado neste documento, o termo "vetor viral de Fator VIII" refere-se a um vírus recombinante compreendendo um polinucleotídeo de Fator VIII, que codifica um polipeptídeo do Fator VIII, que é suficiente para a expressão do polipeptídeo do Fator VIII quando introduzido em um hospedeiro animal adequado (por exemplo, um humano). Especificamente incluídos na definição do vetor viral do Fator VIII estão os vírus recombinantes nos quais um polinucleotídeo do Fator VIII alterado por códon, que codifica um polipeptídeo do Fator VIII, foi inserido no genoma do vírus. Também especificamente incluídos na definição de vetores virais do Fator VIII estão os vírus recombinantes nos quais o genoma nativo do vírus foi substituído por um polinucleotídeo do Fator VIII, que codifica um polipeptídeo do Fator VIII. Incluídos na definição dos vetores virais do Fator VIII estão os vírus recombinantes que compreendem um polinucleotídeo do

43 / 93 Fator VIII, que codifica uma variante do Fator VIII com as mutações X5, uma deleção do domínio B e / ou um peptídeo de glicosilação inserido em um polipeptídeo ligante do domínio B.

[00110] Como utilizado neste documento, o termo "partícula viral de Fator VIII" refere-se a uma partícula viral que encapsula um polinucleotídeo do Fator VIII, que codifica um polipeptídeo do Fator VIII, que é específico para a expressão do polipeptídeo do Fator VIII quando introduzido em um hospedeiro animal adequado (por exemplo, um humano). Especificamente incluídas na definição de partículas virais de Fator VIII estão partículas virais recombinantes que encapsulam um genoma no qual um polinucleotídeo de Fator VIII alterado por códon, que codifica um polipeptídeo de Fator VIII, foi inserido. Também especificamente incluídas na definição de partículas virais de Fator VIII estão partículas virais recombinantes que encapsulam um polinucleotídeo do Fator VIII, que codifica um polipeptídeo do Fator VIII, que substitui o genoma natural do vírus. Incluídas na definição de partículas virais de Fator VIII estão partículas virais recombinantes que encapsulam um polinucleotídeo do Fator VIII, que codifica uma variante do Fator VIII com as mutações X5, uma deleção do domínio B e / ou um peptídeo de glicosilação inserido em um polipeptídeo ligante do domínio B.

[00111] Por "AAV" ou "vírus adenoassociado" neste documento, entende-se um Dependoparvovírus dentro do gênero de vírus Parvoviridae. Como utilizado neste documento, AAV pode referir-se a um vírus derivado de um genoma de AAV "de tipo selvagem" de ocorrência natural no qual um polinucleotídeo do Fator VIII foi inserido, um vírus recombinante derivado de um polinucleotídeo do Fator VIII recombinante empacotado em um capsídeo usando proteínas de capsídeo codificadas por um gene cap de AAV de ocorrência natural, ou um vírus recombinante derivado de um polinucleotídeo do Fator VIII recombinante empacotado em um capsídeo usando proteínas do capsídeo codificadas por um gene cap não natural do capsídeo. Incluídos na

44 / 93 definição de AAV estão AAV tipo 1 (AAV1), AAV tipo 2 (AAV2), AAV tipo 3 (AAV3), AAV tipo 4 (AAV4), AAV tipo 5 (AAV5), AAV tipo 6 (AAV6), AAV vírus tipo 7 (AAV7), AAV tipo 8 (AAV8) e AAV tipo 9 (AAV9) que encapsulam um polinucleotídeo do Fator VIII e vírus formados por uma ou mais proteínas do capsídeo AAV variantes encapsulando um polinucleotídeo do Fator VIII.

[00112] Por "AAV8", "AAV-8" ou "sorotipo 8 de AAV" neste documento, entende-se um vírus formado por uma proteína viral do capsídeo AAV8 que encapsula um polinucleotídeo do Fator VIII.

[00113] Como utilizado neste documento, o termo "CpG" refere-se a um dinucleotídeo citosina-guanina ao longo de uma única fita de DNA, com o "p" representando a ligação fosfato entre os dois.

[00114] Como utilizado neste documento, o termo "ilha CpG" refere-se a uma região dentro de um polinucleotídeo com uma densidade estatisticamente elevada de dinucleotídeos CpG. Como utilizado neste documento, uma região de um polinucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína do Fator VIII alterada por códon) é uma ilha CpG se, ao longo de uma janela de par de 200 bases: (i) a região tem teor de GC superior a 50%, e (ii) a razão de dinucleotídeos CpG observados por dinucleotídeos CpG esperados é de pelo menos 0,6, conforme definido pela relação: ≥ 0,6.

Para obter informações adicionais sobre métodos de identificação de ilhas CpG, consulte Gardiner-Garden M. et al., J Mol Biol., 196(2):261-82 (1987), cujo conteúdo é expressamente incorporado aqui por referência, em sua totalidade, para todos os efeitos.

[00115] Como utilizado neste documento, o termo "ácido nucleico" refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de fita simples ou dupla e complementos dos mesmos. O

45 / 93 termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos de estrutura modificados ou ligações, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e que são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2-O-metil ribonucleotídeos, e peptídeo-ácidos nucleicos (PNAs).

[00116] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural, incluindo aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Os aminoácidos de ocorrência natural podem incluir, por exemplo, D- e L-aminoácidos. Os aminoácidos podem ser aqui referidos pelos seus símbolos de três letras vulgarmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos.

[00117] Por "modificação", entende-se aqui uma substituição, inserção e / ou exclusão de aminoácidos em uma sequência polipeptídica ou uma alteração em uma fração quimicamente ligada a uma proteína. Por exemplo, uma modificação pode ser um carboidrato alterado ou uma estrutura de PEG ligada a uma proteína. Por "modificação de aminoácidos" aqui entende-se uma substituição, inserção e / ou deleção de aminoácidos em uma sequência polipeptídica. Para maior clareza, salvo indicação em contrário, a modificação de aminoácidos é sempre um aminoácido codificado pelo DNA, por exemplo, os 20 aminoácidos que possuem códons no DNA e no RNA.

[00118] Por "substituição de aminoácidos" ou "substituição" neste documento, entende-se a substituição de um aminoácido em uma posição

46 / 93 particular em uma sequência polipeptídica parental por um aminoácido diferente. Em particular, em algumas modalidades, a substituição é por um aminoácido de ocorrência não natural na posição específica, ou que de ocorrência não natural dentro do organismo ou em qualquer organismo. Por exemplo, a substituição G151K refere-se a um polipeptídeo variante, no qual a glicina na posição 151 é substituída por lisina. Para maior clareza, uma proteína que foi projetada para alterar a sequência de codificação de ácido nucleico, mas não o aminoácido inicial (por exemplo, trocar CGG (codificando arginina) por CGA (ainda codificando arginina) para aumentar os níveis de expressão do organismo hospedeiro) não é "substituição de aminoácidos"; isto é, apesar da criação de um novo gene que codifique a mesma proteína, se a proteína tiver o mesmo aminoácido na posição específica em que começou, não será uma substituição de aminoácidos. Consequentemente, cada variação de um ácido nucleico que codifica um mesmo polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita em relação ao produto de expressão, mas não em relação a construtos de terapia genética reais.

[00119] Por "inserção de aminoácidos" ou "inserção", como utilizado neste documento, entende-se a adição de uma sequência de aminoácidos em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental. Por exemplo, -233E ou 233E designa uma inserção de ácido glutâmico após a posição 233 e antes da posição 234. Além disso, -233ADE ou A233ADE designa uma inserção de AlaAspGlu após a posição 233 e antes da posição

234.

[00120] Por "deleção de aminoácidos" ou "deleção", como utilizado neste documento, entende-se a remoção de uma sequência de aminoácidos em uma posição particular em uma sequência polipeptídica parental. Por exemplo, E233- ou E233 #, E233 () ou E233del designa uma deleção de ácido glutâmico na posição 233. Além disso, EDA233- ou EDA233 # designa uma

47 / 93 deleção da sequência GluAspAla que começa na posição 233. Os termos "idênticos" ou porcentagem de identidade, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências peptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (ou seja, cerca de 60% de identidade, de preferência 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou maior identidade sobre uma região especificada, quando comparada e alinhada para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada) conforme medido usando um BLAST ou algoritmos de comparação de sequência BLAST 2.0 com parâmetros padrão descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual.

[00121] Como é conhecido na técnica, uma série de programas diferentes podem ser usados para identificar se uma proteína (ou ácido nucleico como discutido abaixo) tem identidade de sequência ou semelhança com uma sequência conhecida. A identidade de sequência e / ou similaridade é determinada usando técnicas padrão conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, o algoritmo de identidade de sequência local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade de sequência de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), pela busca do método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), o programa de sequências Best Fit descrito por Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984), de preferência usando as definições padrão, ou por inspeção. De preferência, o percentual de identidade é calculado por FastDB com base nos seguintes parâmetros: penalidade de disparidade de 1; penalidade de folga de 1; penalidade de tamanho de folga de

48 / 93 0,33; e penalidade de união de 30, “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, páginas 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc, todos os quais são incorporados por referência.

[00122] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de sequência múltipla de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos em pares progressivo. O mesmo também pode plotar uma árvore mostrado as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987); o método é semelhante ao descrito por Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989), ambos incorporados por referência. Parâmetros de PILEUP úteis incluindo um peso de folga padrão de 3,00, um comprimento de folga padrão de 0,10 e folgas de extremidade ponderada.

[00123] Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito em: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); and Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787 (1993), ambos incorporados por referência. Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 que foi obtido de Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html]. WU-BLAST-2 usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos mesmos é definida nos valores padrão. Os parâmetros ajustáveis são definidos com os seguintes valores: amplitude de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limiar de palavra (T) =

11. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa dependendo da composição da sequência particular e da composição da base de dados particular contra a qual a sequência de interesse está sendo pesquisada; entretanto, os valores podem ser ajustados para aumentar a sensibilidade.

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[00124] Um algoritmo útil adicional é BLAST dotado de folga conforme relatado por Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402, incorporado por referência. BLAST dotado de folga usa classificações de substituição BLOSUM-62; parâmetro T limiar definido em 9; o método de dois acertos para disparar extensões não dotadas de folga, cobra comprimentos de folga de k um custo de 10+k; Xu definido em 16, e Xg definido em 40 para estágio de pesquisa de base de dados e em 67 para estágio de saída dos algoritmos. Alinhamentos dotados de folga são disparados por uma classificação correspondendo a ~22 bits.

[00125] Um valor de % de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência "mais longa" na região alinhada. A sequência "mais longa" é aquela com os resíduos mais reais na região alinhada (as folgas introduzidas pelo WU-Blast-2 para maximizar a pontuação do alinhamento são ignoradas). De maneira semelhante, "porcentagem (%) de identidade de sequência de ácido nucleico" em relação à sequência de codificação dos polipeptídeos identificados é definida como a porcentagem de resíduos de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de nucleotídeos na sequência de codificação da proteína do ciclo celular. Um método preferido utiliza o módulo BLASTN de WU-BLAST-2 definido nos parâmetros padrão, com período de sobreposição e fração de sobreposição definidos em 1 e 0,125, respectivamente.

[00126] O alinhamento pode incluir introduzir folgas nas sequências a serem alinhadas. Além disso, para sequências que contêm mais ou menos aminoácidos do que a proteína codificada pela sequência da Figura 1 (SEQ ID NO: 1), entende-se que, em uma modalidade, a porcentagem de identidade de sequência será determinada com base no número de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos em relação ao número total de aminoácidos ou nucleotídeos. Assim, por exemplo, a identidade de sequência de sequências

50 / 93 mais curtas do que aquela mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO: 1), como discutido abaixo, será determinada usando o número de nucleotídeos na sequência mais curta, em uma modalidade. Em cálculos de porcentagem de identidade, o peso relativo não é atribuído a várias manifestações de variação de sequência, como inserções, deleções, substituições, etc.

[00127] Em uma modalidade, apenas as identidades são pontuadas positivamente (+1) e todas as formas de variação de sequência, incluindo intervalos, são atribuídos a um valor de "0", o que evita a necessidade de uma escala ponderada ou parâmetros conforme descrito abaixo para cálculos de similaridade de sequência. A identidade de sequência percentual pode ser calculada, por exemplo, dividindo o número de resíduos idênticos correspondentes pelo número total de resíduos da sequência "mais curta" na região alinhada e multiplicando por 100. A sequência "mais longa" é aquela que tem mais resíduos reais na região alinhada.

[00128] O termo "variantes alélicas" refere-se a formas polimórficas de um gene em um locus genético particular, bem como cDNAs derivados de transcritos de mRNA dos genes e os polipeptídeos codificados por eles. O termo "códon de mamífero preferido" refere-se a um subconjunto de códons dentre o conjunto de códons que codificam um aminoácido que são mais frequentemente usados em proteínas expressas em células de mamíferos escolhidas da seguinte lista: Gly (GGC, GGG); Glu (GAG); Asp (GAC); Val (GTG, GTC); Ala (GCC, GCT); Ser (AGC, TCC); Lys (AAG); Asn (AAC); Met (ATG); Ile (ATC); Thr (ACC); Trp (TGG); Cys (TGC); Tyr (TAT, TAC); Leu (CTG); Phe (TTC); Arg (CGC, AGG, AGA); Gln (CAG); His (CAC); e Pro (CCC).

[00129] Como utilizado neste documento, o termo alterado por códon refere-se a uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína variante do Fator VIII), onde pelo menos um códon do polinucleotídeo nativo que codifica o polipeptídeo foi alterado para

51 / 93 melhorar uma propriedade da sequência de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, a propriedade melhorada promove aumento da transcrição da codificação do mRNA para o polipeptídeo, aumento da estabilidade do mRNA (por exemplo, melhor meia-vida do mRNA), aumento da tradução do polipeptídeo e / ou aumento do empacotamento do polinucleotídeo dentro do vetor. Exemplos não limitativos de alterações que podem ser usados para alcançar as propriedades melhoradas incluem alterar o uso e / ou distribuição de códons para aminoácidos específicos, ajustar o conteúdo global e / ou local de GC, remover sequências ricas em AT, remover elementos de sequência repetidos, ajustar o teor de dinucleotídeo CpG global e / ou local, remover elementos regulatórios criptográficos (por exemplo, elementos de caixa TATA e CCAAT), remover sítios de emenda de íntron / éxon, melhorar as sequências regulatórias (por exemplo, introdução de uma sequência de consenso Kozak) e remover os elementos de sequência capazes de formar uma estrutura secundária (por exemplo, alças de haste) no mRNA transcrito.

[00130] Conforme discutido neste documento, existem várias nomenclaturas para se referir aos componentes da divulgação neste documento. "Número CS" (por exemplo, "CS12", "CS04", etc.) refere-se a polinucleotídeos alterados por códon que codificam polipeptídeos FVIII e / ou polipeptídeos codificados, incluindo variantes. Por exemplo, CS12-FL refere- se à sequência de polinucleotídeos de CS12 alterada por códon de comprimento total ou sequência de aminoácidos (às vezes aqui referida como "CS12-FL-AA" para a sequência de aminoácidos e "CS12-FL-NA" para a sequência de ácido nucleico) codificada pela sequência de polinucleotídeos CS12. Da mesma forma, "CS12-LC" refere-se à sequência de ácido nucleico alterada por códon ("CS12-LC-NA") que codifica a cadeia leve de um polipeptídeo FVIII ou a sequência de aminoácidos (também algumas vezes aqui referida como "CS12-LC- AA") da cadeia leve de FVIII codificada pela sequência de polinucleotídeos CS12. Da mesma forma, CS12-HC, CS12-HC-

52 / 93 AA e CS12-HC-NA são iguais para a cadeia pesada de FVIII. Como será apreciado por aqueles na técnica, para construtos como CS04, que são apenas alterados por códon (por exemplo, eles não contêm substituições de aminoácidos adicionais em comparação com Refacto), as sequências de aminoácidos serão idênticas, como as sequências de aminoácidos não são alteradas pela otimização por códon. Assim, os construtos de sequência da divulgação incluem, mas não estão limitados a, CS12-FL-NA, CS12-FL-AA, CS12-LC-NA, CS12-LC-AA, CS12-HC-AA e CS12-HC- NA.

[00131] Esta nomenclatura também se aplica a peptídeos de glicosilação como mostrado na Figura 8, de modo que "NG1-AA" se refere à sequência de aminoácidos e NG1-NA se refere à sequência de ácido nucleico.

[00132] A divulgação também inclui novas variantes do Fator VIII adicionais, conforme descrito abaixo, com a nomenclatura apropriada.

[00133] Como utilizado neste documento, o termo "expressão específica do fígado" refere-se à expressão preferencial ou predominante in vivo de um gene particular (por exemplo, um gene do Fator VIII transgênico alterado por códon) no tecido hepático, em comparação com outros tecidos. Em algumas modalidades, a expressão específica do fígado significa que pelo menos 50% de toda a expressão do gene particular ocorre nos tecidos hepáticos de um sujeito. Em outras modalidades, a expressão específica do fígado significa que pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% de toda a expressão do gene particular ocorre nos tecidos hepáticos de um sujeito. Consequentemente, um elemento regulatório específico do fígado é um elemento regulatório que conduz a expressão específica do fígado de um gene no tecido hepático.

[00134] Como utilizado neste documento, os termos "menor que" X e "menor que" X% referem-se a um intervalo de 0 a X, exclusivo do valor X, por exemplo, de 0% a X%, exclusivo de X%. Como utilizado neste documento, os termos são usados indistintamente com um intervalo

53 / 93 começando em 0 ou 0% até, mas não incluindo, X ou X%.

[00135] Como utilizado neste documento, os termos "não mais que" X ou "não mais que" X% referem-se a uma faixa de 0 a X, incluindo o valor X, por exemplo, de 0% a X%, incluindo X%. Como utilizado neste documento, os termos são usados indistintamente com um intervalo começando em 0 ou 0% até, e incluindo, X ou X%.

[00136] Como utilizado neste documento, os termos "maior que" X ou "maior que" X% referem-se a uma faixa de X a um limite superior, exclusivo do valor X, por exemplo, de X% a 100%, exclusivo de X%. Como utilizado neste documento, os termos são usados indistintamente com um intervalo começando em, mas não incluindo, X ou X% até um limite superior que é 100% no contexto de uma porcentagem.

[00137] Como utilizado neste documento, os termos "pelo menos" X ou "pelo menos" X% referem-se a uma faixa de X a um limite superior, incluindo o valor X, por exemplo, de X% a 100%, incluindo X%. Como utilizado neste documento, os termos são usados indistintamente com um intervalo começando em, e incluindo, X ou X% até um limite superior que é 100% no contexto de uma porcentagem.

[00138] Como utilizado neste documento, os termos “entre 'X' e 'Y',” “entre 'X'% e 'Y'%,” “de 'X' para 'Y',” e “de 'X'% para ' Y '% ”refere-se a uma faixa de X a Y, incluindo os valores X e Y, por exemplo, de X% a Y%, incluindo X% e Y%. Como utilizado neste documento, os termos são usados indistintamente com um intervalo começando em X ou X% até, e incluindo, Y ou Y%. III. Polinucleotídeos de Fator VIII alterados por códon

[00139] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece polinucleotídeos alterados por códon que codificam variantes do Fator VIII. Esses polinucleotídeos alterados por códon fornecem biopotência de Fator VIII marcadamente melhorada (por exemplo, atividade) quando

54 / 93 administrados em um construto de terapia genética baseada em AAV. Os polinucleotídeos com alterados por códon também demonstram empacotamento de AAV-vírion melhorado, em comparação com construtos convencionalmente otimizados por códons.

[00140] O Fator VIII de tipo selvagem é codificado com um peptídeo sinal de 19 aminoácidos (aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO: 39), que é clivado do polipeptídeo codificado antes da ativação do Fator VIII. Conforme apreciado por aqueles na técnica, o peptídeo sinal do Fator VIII pode ser mutado, substituído por peptídeos sinal de outros genes ou genes do Fator VIII de outros organismos, ou completamente removido, sem afetar a sequência do polipeptídeo maduro deixado após o peptídeo sinal ser removido por processamento celular.

[00141] Por conseguinte, em algumas modalidades, um polinucleotídeo alterado por códon (por exemplo, uma composição de ácido nucleico) fornecido neste documento tem uma sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência com as porções de CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica cadeias pesadas e leves do Fator VIII, e um ligante de domínio B curto de 14 aminoácidos (por exemplo, o ligante "SQ" contendo um sítio de clivagem de furina para facilitar a maturação de uma proteína FVIIIa ativa in vivo), que inclui ainda um ou mais dos cinco "mutações X5" (por exemplo, uma, duas, três, quatro ou todas as cinco mutações I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (numeração SPI; (numeração SPE é I86V / A108S / G132K / M147T / L152P, respectivamente)), em relação à sequência de Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e / ou um peptídeo de glicosilação curto (por exemplo, NG5; SEQ ID NO: 15) inserido no ligante substituído por domínio B (por exemplo, um ligante SQ).

[00142] Especificamente, o conjunto de mutações X5 é baseado no fato de que a substituição dos aminoácidos suínos 82-176 pelos aminoácidos humanos correspondentes em um construto de terapia genética com domínio

55 / 93 B deletado aumentou a atividade do Fator VIII quando expresso em células HEK293 (W. Xiao, communication). A mutação reversa de aminoácidos suínos únicos no construto BDD-FVIII humano identificou cinco aminoácidos dentro do domínio A1 que contribuem para este fenômeno: I105V, A127S, G151K, M166T e L171P (SPI). A introdução da combinação dessas mutações no construto humano recapitulou a atividade melhorada da substituição suína maior. (W. Xiao, communication). Por conseguinte, em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados do Fator VIII incluem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas de I105V, A127S, G151K, M166T e L171P, com todo o conjunto de 5 aminoácidos encontrando uso particular em muitas modalidades. Polinucleotídeos alterados por códon CS12

[00143] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico fornecida neste documento inclui um polinucleotídeo do Fator VIII alterado por códon que tem uma sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência para CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1) e codifica um polipeptídeo do Fator VIII com cadeias leves e pesadas do Fator VIII humano, e um ligante de domínio B curto de 14 aminoácidos (o ligante "SQ") contendo um sítio de clivagem de furina para facilitar a maturação de uma proteína FVIIIa ativa in vivo, onde a cadeia pesada do polipeptídeo do Fator VIII inclui as cinco mutações X5 (I105V, A127S, G151K, M166T e L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00144] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo do Fator VIII tem uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas

56 / 93 modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,5% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,9% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é idêntica a CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[00145] Em algumas modalidades, a variante do Fator VIII codificada pelo polinucleotídeo alterado por códon tem uma sequência de aminoácidos com alta identidade de sequência para CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00146] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da variante do Fator VIII codificado tem pelo menos 97% de identidade com CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00147] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da variante do Fator VIII codificado tem pelo menos 98% de identidade com CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00148] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da variante do Fator VIII codificado tem pelo menos 99% de identidade com

57 / 93 CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00149] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da variante do Fator VIII codificado tem pelo menos 99,5% de identidade com CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00150] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da variante do Fator VIII codificado tem pelo menos 99,9% de identidade com CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00151] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da variante do Fator VIII codificado é para CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Ligantes substituídos por domínio B do fator VIII

[00152] Conforme descrito acima, a ligação entre a cadeia pesada do FVIII e a cadeia leve (por exemplo, o domínio B no Fator VIII de tipo selvagem) é alterada nas variantes do Fator VIII aqui descritas. A remoção do domínio B dos construtos de Fator VIII de tipo selvagem não parece afetar a atividade da enzima ativada (por exemplo, FVIIIa), presumivelmente porque o domínio B é removido durante a ativação. Devido às restrições de tamanho da capacidade de empacotamento de AAV, as variantes de domínio B deletadas, truncadas e / ou substituídas por ligante devem melhorar a eficácia da construção de terapia genética de FVIII. O ligante substituído por domínio B mais convencionalmente usado é o de SQ FVIII, que retém apenas 14

58 / 93 aminoácidos do domínio B como sequência de ligante. Outra variante de VIII porcino ("OBI-1", descrita na Patente U.S. 6.458.563) é bem expressa em células CHO e tem um ligante ligeiramente mais longo de 24 aminoácidos. Em algumas modalidades, os construtos do Fator VIII codificados pelos polinucleotídeos alterados por códon aqui descritos incluem uma sequência de ligante de domínio B do tipo SQ. Em outras modalidades, os construtos do Fator VIII codificados pelos polinucleotídeos alterados por códon aqui descritos incluem uma sequência de ligante de domínio B do tipo OBI-1.

[00153] Embora o domínio B do Fator VIII seja dispensável para atividade, o domínio B contém vários resíduos que são modificados pós- tradução, por exemplo, por glicosilação ligada a N ou O. A análise in silico (Prediction of N-glycosylation sites in human proteins, R. Gupta, E. Jung and S. Brunak, in preparation (2004)) do domínio B do Fator VIII de tipo selvagem prediz que pelo menos quatro desses sítios são glicosilados in vivo. Pensa-se que essas modificações dentro do domínio B contribuem para a regulação pós-tradução e / ou meia-vida do Fator VIII in vivo. Assim, em algumas modalidades, o ligante polipeptídico dos construtos de Fator VIII codificados aqui descritos inclui uma ou mais sequências de glicosilação, para permitir a glicosilação in vivo. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico inclui pelo menos uma sequência de consenso de glicosilação (por exemplo, uma sequência de consenso de glicosilação ligada a N ou O). Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico inclui pelo menos duas sequências de glicosilação de consenso. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico inclui pelo menos três sequências de glicosilação de consenso. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico inclui pelo menos quatro sequências de glicosilação de consenso. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico inclui pelo menos cinco sequências de glicosilação de consenso. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico inclui pelo menos 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências de glicosilação de consenso.

59 / 93

[00154] Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico contém pelo menos uma sequência de glicosilação ligada a N N-X-S/T, onde X é qualquer aminoácido diferente de P, S ou T. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico contém pelo menos duas sequências de glicosilação ligadas a N N-X-S/T, onde X é qualquer aminoácido diferente de P, S ou T. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico contém pelo menos três sequências de glicosilação ligadas a N N-X-S/T, onde X é qualquer aminoácido diferente de P, S ou T. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico contém pelo menos quatro sequências de glicosilação ligadas a N N-X-S/T, onde X é qualquer aminoácido diferente de P, S ou T. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico contém pelo menos cinco sequências de glicosilação ligadas a N N-X-S/T, onde X é qualquer aminoácido diferente de P, S ou T. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico contém pelo menos 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências de glicosilação ligadas a N N-X-S/T, em que X é qualquer aminoácido diferente de P, S ou T.

[00155] Em algumas modalidades, os polipeptídeos codificados do Fator VIII aqui descritos incluem um ligante de domínio B do tipo SQ, incluindo os aminoácidos 760-762 / 1657-1667 do domínio B do Fator VIII humano de tipo selvagem (FVIII-FL-AA; SEQ ID NO: 39) (Sandberg et al. Thromb. Haemost. 85:93 (2001), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência). Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo SQ tem uma substituição de aminoácido em relação à sequência de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo SQ tem duas substituições de aminoácidos em relação à sequência de tipo selvagem correspondente.

[00156] Em algumas modalidades, um peptídeo de glicosilação é inserido no ligante de domínio B do tipo SQ. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação é selecionado daqueles mostrados na Figura 8 (SEQ ID NOS: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35, respectivamente,

60 / 93 em ordem de aparecimento). Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação é codificado por um polinucleotídeo respectivo mostrado na Figura 8 (SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36, respectivamente, em ordem de aparecimento. Em uma modalidade particular, o peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) é inserido no ligante de domínio B do tipo SQ dos polipeptídeos do Fator VIII aqui descritos. Em uma modalidade particular, o peptídeo de glicosilação NG5 é codificado por um polinucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16.

[00157] Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo SQ contendo o peptídeo de glicosilação codificado por um polinucleotídeo respectivo mostrado na Figura 17 (SEQ ID NOS: 40-53, respectivamente, em ordem de aparecimento. Em uma modalidade particular, o ligante de domínio B do tipo SQ contendo o peptídeo de glicosilação é codificado por um polinucleotídeo com uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 43.

[00158] Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico (por exemplo, o ligante de domínio B do tipo SQ) inclui um peptídeo de glicosilação com alta identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOS: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35, respectivamente, em ordem de aparecimento, como mostrado nas Figuras 8A-8B. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que duas substituições de aminoácidos em relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35, respectivamente, em ordem de aparecimento, como mostrado nas Figuras 8A-8B. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que uma substituição de aminoácido em relação a qualquer uma das SEQ ID NOS: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35, respectivamente, em ordem de aparecimento, como mostrado nas Figuras 8A-8B. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação tem uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOS: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 e 35,

61 / 93 respectivamente, em ordem de aparecimento, conforme mostrado nas Figuras 8A-8B. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação é codificado por uma sequência de polinucleotídeo com alta identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeos correspondente selecionada de SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36, respectivamente, em ordem de aparecimento, como mostrado nas Figuras 8A-8B.

[00159] Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que duas substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência polinucleotídica com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que duas substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência polinucleotídica com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que duas substituições de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência polinucleotídica com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 16.

[00160] Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que uma substituição de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência polinucleotídica com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que uma substituição de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência polinucleotídica com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação não tem mais que uma substituição de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência polinucleotídica com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 16.

[00161] Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência de polinucleotídeo com pelo menos 90% de identidade com a SEQ

62 / 93 ID NO: 16. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência de polinucleotídeo com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o peptídeo de glicosilação tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e é codificado por uma sequência de polinucleotídeo com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 16. Elementos Cis-Regulatórios

[00162] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, também inclui um ou mais elementos regulatórios de ação cis, por exemplo, elementos promotores e / ou intensificadores, que conduzem a expressão genética in vivo, que está operativamente ligada ao polinucleotídeo que codifica a variante do Fator VIII. Neste contexto, “ação cis” significa que os elementos regulatórios estão presentes na mesma molécula de DNA que o gene que regulam. Como será apreciado por aqueles na técnica e discutido abaixo, os elementos regulatórios adequados para uso na invenção incluem, mas não estão limitados a, promotores, elementos intensificadores, elementos de sinal de poliadenilação e / ou elementos de repetição terminal invertido. Promotores

[00163] Os promotores de uso na invenção estão operativamente ligados à região de codificação, geralmente diretamente ligados (por exemplo, nenhum nucleotídeo adicional é incluído entre o promotor e a região de codificação), embora em algumas modalidades, ligações indiretas possam ser usadas, por exemplo, através do uso de ligantes não funcionais, ou nos casos em que elementos regulatórios adicionais que funcionam "a jusante" do promotor, mas "a montante" da região de codificação podem ser usados. No entanto, devido às limitações de tamanho dos vetores da invenção, isso geralmente não é preferido.

63 / 93 Elementos Intensificadores

[00164] Em algumas modalidades, um ou mais elementos intensificadores são usados no construto variante do Fator VIII. Como é conhecido na técnica, os elementos intensificadores geralmente conduzem a expressão de um modo dependente do tecido, por exemplo, predominantemente em um tecido específico. Em geral, conforme descrito abaixo, os elementos intensificadores são geralmente posicionados "a montante" dos elementos promotores. Como o Fator VIII é sintetizado principalmente no fígado, em algumas modalidades, as composições de ácido nucleico aqui descritas incluem um elemento regulatório específico do fígado, que limita substancialmente a expressão da variante codificada do Fator VIII para células hepáticas.

[00165] Geralmente, os elementos regulatórios específicos do fígado podem ser derivados de qualquer gene conhecido por ser expresso exclusivamente no fígado. WO 2009/130208 identifica vários genes expressos de uma forma específica do fígado, incluindo inibidor de peptidase de serpina, membro do clado A 1, também conhecido como α-antitripsina (SERPINA1; GeneID 5265), apolipoproteína C-I (APOC1; GeneID 341), apolipoproteína C-IV (APOC4; GeneID 346), apolipoproteína H (APOH; GeneID 350); transtirretina (TTR; GeneID 7276), albumina (ALB; GeneID 213), aldolase B (ALDOB; GeneID 229), citocromo P450, família 2, subfamília E, polipeptídeo 1 (CYP2E1; GeneID 1571), cadeia alfa de fibrinogênio (FGA; GeneID 2243), transferrina (TF; GeneID 7018), proteína relacionada à haptoglobina (HPR; GeneID 3250). Em algumas modalidades, as composições de ácido nucleico aqui descritas incluem um elemento regulatório específico do fígado derivado dos loci genômicos de uma ou mais dessas proteínas. Vários exemplos de tais elementos são descritos em WO 2009/130208, cujo conteúdo é expressamente incorporado neste documento por referência, em sua totalidade, para todos os efeitos.

64 / 93

[00166] Um exemplo de um elemento regulatório específico do fígado é o gene da transtirretina (TTR), comumente referido como "TTRe" ou "TTREnh". Hsieh J.L., et al., Cancer Sci., 100(3):537-45 (2009), cujo conteúdo é expressamente incorporado neste documento por referência, em sua totalidade, para todos os efeitos. Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme descrito neste documento, inclui um elemento promotor de TTR humano. Em uma modalidade, o promotor TTR humano tem uma sequência de ácido nucleico com alta identidade de sequência para o promotor hTTR mostrado na Figura 4 (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o promotor TTR humano tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 6.

[00167] Outro exemplo de um elemento regulatório específico do fígado é do gene SERPINA1, conforme descrito na Publicação PCT WO 2016/146757, cujo conteúdo é expressamente incorporado neste documento por referência, em sua totalidade, para todos os fins. Um exemplo de tal elemento é o elemento de controle regulatório CRM8 mostrado na Figura 4 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, um elemento de controle regulatório derivado de SERPINA1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a CRM8 (SEQ ID NO: 5)

[00168] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, inclui um ou mais elementos de controle regulatório derivados de SERPINA1, conforme exemplificado pelos construtos ilustrados nas Figuras

11. Em uma modalidade, um polinucleotídeo do Fator VIII inclui um elemento de controle regulatório derivado de SERPINA1 (por exemplo, CRM8). Em outra modalidade, um polinucleotídeo do Fator VIII inclui dois elementos de controle regulatório derivados de SERPINA1 (por exemplo,

65 / 93 CRM8). Em ainda outras modalidades, um polinucleotídeo do Fator VIII inclui 3, 4, 5, 6 ou mais elementos de controle regulatório derivados de SERPINA1 (por exemplo, CRM8).

[00169] Em uma modalidade, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, inclui um ou mais elementos de controle regulatório derivados de SERPINA1 (por exemplo, CRM8) e um elemento promotor de TTR humano, conforme exemplificado na Figura 11. Em uma modalidade, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, inclui dois elementos CRM8 e um elemento promotor de TTR humano operativamente ligado ao polinucleotídeo que codifica a variante do Fator VIII.

[00170] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, inclui um ou mais elementos CRM8 posicionados a montante de um promotor TTR humano. Por exemplo, um ou mais elementos CRM8 estão posicionados a 5' do promotor TTR em um construto de fita dupla, em relação à orientação transcricional da molécula. Isso significa que em um construto de fita simples (+) (por exemplo, onde a fita simples codifica para a variante do Fator VIII), um ou mais elementos CRM8 estão posicionados a 5' do promotor TTR.

[00171] Conforme relatado no Exemplo 6, devido ao grande tamanho dos construtos de variante do Fator VIII aqui descritos, uma pequena redução no número de nucleotídeos em um polinucleotídeo do Fator VIII que faz parte de um vetor de terapia genética de AAV pode aumentar significativamente a biopotência do Fator VIII do vetor. Por conseguinte, em algumas modalidades, um ou mais elementos CRM8 estão diretamente ligados à extremidade 5' do promotor TTR, por exemplo, não há nucleotídeos estranhos posicionados entre o elemento CRM8 e o promotor TTR. Da mesma forma,

66 / 93 em algumas modalidades, o promotor TTR está diretamente ligado à extremidade 5' da sequência de codificação, ou a uma sequência de iniciação da tradução (por exemplo, uma sequência de Kozak), para o polipeptídeo variante do Fator VIII, por exemplo, não há nucleotídeos estranhos posicionados entre o promotor TTR e o gene variante do Fator VIII. Sinais de poliadenilação

[00172] Em algumas modalidades, o elemento regulatório para os construtos aqui descritos (por exemplo, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII) é um elemento regulatório que é um sinal de poliadenilação, por exemplo, conforme ilustrado nos exemplos de construtos na Figura 11. O sinal de poliadenilação direciona a síntese de uma cauda poli-A na extremidade 3' do transcrito de mRNA gerado a partir do polinucleotídeo do Fator VIII. Consequentemente, o sinal de poliadenilação está posicionado a 3' em relação à sequência de codificação da variante do Fator VIII. Exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação que podem ser usados nos construtos de terapia genética do Fator IX aqui descritos incluem sinais de poliadenilação sintéticos, sinais de poliadenilação derivados de um gene tardio do vírus símio 40 (SV40), um sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH) e um sinal mínimo de poliadenilação do gene da β-globina de coelho (mRBG).

[00173] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, inclui um sinal de poliadenilação sintético, conforme exemplificado pelos construtos ilustrados nas Figuras 11. Em uma modalidade, o sinal de poliadenilação sintético tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica ao sinal Poli-A sintético mostrado na Figura 4 (SEQ ID NO: 8).

[00174] Conforme relatado no Exemplo 6, devido ao grande tamanho dos construtos de variante do Fator VIII aqui descritos, uma pequena redução

67 / 93 no número de nucleotídeos em um polinucleotídeo do Fator VIII que faz parte de um vetor de terapia genética de AAV pode aumentar significativamente a biopotência do Fator VIII do vetor. Por conseguinte, em algumas modalidades, o sinal de poliadenilação é diretamente ligado à extremidade 3' da sequência de codificação do polipeptídeo variante do Fator VIII, incluindo um ou mais códons de parada que estão posicionados no final da sequência de codificação. Por exemplo, não há nucleotídeos estranhos posicionados entre o gene variante do Fator VIII e a sequência de poliadenilação. Repetições terminais invertidas

[00175] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, também inclui repetições terminais internas (ITRs) de vírus adenoassociados (AAV) flanqueando a sequência de codificação da variante do Fator VIII e elementos regulatórios associados (por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, etc.). As repetições de terminal invertido forma um grampo de cabelo, o que facilita a autoiniciação para a síntese primase-independente da segunda fita de DNA. As ITRs também ajudam a facilitar o encapsulamento dentro de um vírion de AAV e a integração do genoma de AAV no genoma da célula hospedeira.

[00176] Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, inclui uma ITR 5' com alta identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica) à ITR AAV2 5' mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, uma composição de ácido nucleico que codifica uma variante do Fator VIII, conforme fornecido neste documento, inclui uma ITR 3' com alta identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntico) para ITR AAV2 3' mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: 9).

[00177] Conforme relatado no Exemplo 6, devido ao grande tamanho

68 / 93 dos construtos de variante do Fator VIII aqui descritos, uma pequena redução no número de nucleotídeos em um polinucleotídeo do Fator VIII que faz parte de um vetor de terapia genética de AAV pode aumentar significativamente a biopotência do Fator VIII do vetor. Por conseguinte, em algumas modalidades, a ITR 5' está diretamente ligada à extremidade 5' do elemento específico do fígado (por exemplo, um ou mais elementos CRM8), de modo que nenhum nucleotídeo estranho seja posicionado entre a sequência ITR 5' e o elemento específico do fígado. Da mesma forma, em algumas modalidades, a ITR 3' está diretamente ligada à extremidade 3' do sinal de poliadenilação, de modo que nenhum nucleotídeo estranho seja posicionado entre o sinal de poliadenilação e a sequência de ITR 3'. IV. Vetores de expressão do Fator VIII

[00178] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos alterados por códon aqui descritos são integrados em vetores de expressão. Exemplos não limitativos de vetores de expressão incluem vetores virais (por exemplo, vetores adequados para terapia genética), vetores de plasmídeo, vetores de bacteriófago, cosmídeos, fagemídeos, cromossomos artificiais e semelhantes. Em geral, existem dois tipos básicos de vetores de expressão para uso na invenção: aqueles que são usados em cultura de células para produzir os polipeptídeos do Fator VIII e aqueles que são usados como vetores de terapia genética para administrar a pacientes de tal forma que os níveis endógenos do Fator VIII (seja proteína ou atividade) são aumentados.

[00179] Exemplos não limitativos de vetores virais incluem: retrovírus, por exemplo, vírus da leucemia murina Moloney (MMLV), vírus do sarcoma murino de Harvey, vírus do tumor mamário murino e vírus do sarcoma de Rous; adenovírus, vírus adenoassociados; vírus do tipo SV40; poliomavírus; vírus Epstein-Barr; vírus do papiloma; vírus do herpes; vírus vaccinia; e vírus da poliomielite.

[00180] Em muitas modalidades, os polinucleotídeos otimizados por

69 / 93 códon da invenção são usados em aplicações de terapia genética, de modo que a administração a um paciente resulte na produção de Fator VIII como geralmente descrito neste documento. Em geral, os vetores virais de terapia genética são preferencialmente deficientes em replicação, de modo que a introdução do vetor de terapia genética em um paciente não resulte em propagação viral.

[00181] Por conseguinte, em algumas modalidades, os polinucleotídeos alterados por códon aqui descritos são integrados em um vetor de terapia genética. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética é um retrovírus e, particularmente, um retrovírus com deficiência de replicação. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos alterados por códon aqui descritos são integrados em um vetor de expressão retroviral. Estes sistemas foram descritos anteriormente e são geralmente bem conhecidos na técnica (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). Em uma modalidade específica, o vetor retroviral é um vetor lentiviral (ver, por exemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641- 6649, 1997; Pat. U.S. 6.013.516 e 5.994.136). Os protocolos para a produção de retrovírus deficientes em replicação são conhecidos na técnica. Para revisão, ver Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

[00182] Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a expressão de um polipeptídeo de Fator VIII a partir de um polipeptídeo alterado por códon em cultura de células, incluindo vetores de expressão eucarióticos e procarióticos. Em certas modalidades, um vetor plasmídico é

70 / 93 contemplado para uso na expressão de um polipeptídeo do Fator VIII em cultura de células. Em geral, os vetores plasmídicos contendo sequências de replicon e controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com esses hospedeiros. O vetor pode transportar um sítio de replicação, bem como sequências de marcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. O plasmídeo incluirá o polinucleotídeo alterado por códon que codifica o polipeptídeo do Fator VIII, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle, por exemplo, um promotor.

[00183] Exemplos não limitativos de vetores para expressão procariótica incluem plasmídeos, tais como pRSET, pET, pBAD, etc., em que os promotores usados em vetores de expressão procariótica incluem lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em levedura, vetores como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc; (ii) para expressão em células de inseto, vetores como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores como pSVL, pCMV, pRc / RSV, pcDNA3, pBPV, etc., e vetores derivados de sistemas virais, como vírus vaccinia, vírus adeno-associados, vírus herpes, retrovírus, etc., usando promotores como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β- actina. Vetores de vírus adenoassociados (AAV)

[00184] Em uma modalidade, um polinucleotídeo alterado por códon, como aqui descrito, é integrado em um vetor de terapia genética baseado em vírus adenoassociado (AAV). Os sistemas AAV foram descritos anteriormente e são geralmente bem conhecidos na técnica (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994); Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994);

71 / 93 Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); and Asokan A, et al., Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012), cada um aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins). Os detalhes relativos à geração e uso de vetores rAAV são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S.

5.139.941 e 4.797.368, cada uma aqui incorporada por referência em sua totalidade para todos os fins.

[00185] Por conseguinte, em algumas modalidades, é fornecido um vetor de terapia genética de AAV que inclui um polinucleotídeo alterado por códon (por exemplo, uma composição de ácido nucleico), conforme descrito neste documento, que inclui uma sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência com as porções de CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica cadeias pesadas e leves do Fator VIII, e um ligante de domínio B curto de 14 aminoácidos (por exemplo, o ligante "SQ" contendo um sítio de clivagem de furina para facilitar a maturação de uma proteína FVIIIa ativa in vivo), e que inclui ainda um ou mais dos cinco mutações X5 (por exemplo, uma, duas, três, quatro ou todas as cinco mutações I105V, A127S, G151K, M166T, L171P (SPI), em relação à sequência de Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e / ou um peptídeo de glicosilação curto (por exemplo, NG5; SEQ ID NO: 15) inserido no ligante substituído por domínio B (por exemplo, um ligante SQ).

[00186] Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética de AAV inclui um polinucleotídeo do Fator VIII alterado por códon que tem uma sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência para CS12-FL- NA (SEQ ID NO: 1) e codifica um polipeptídeo do Fator VIII com cadeias leves e pesadas do Fator VIII humano, e um ligante de domínio B curto de 14 aminoácidos (o ligante "SQ") contendo um sítio de clivagem de furina para facilitar a maturação de uma proteína FVIIIa ativa in vivo, onde a cadeia pesada do polipeptídeo do Fator VIII inclui as cinco mutações X5 (I105V, A127S, G151K, M166T e L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII

72 / 93 de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo do Fator VIII tem uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, ou 100% de identidade com CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1).

[00187] Em algumas modalidades, a variante do Fator VIII codificada pelo polinucleotídeo alterado por códon do vetor de terapia genética de AAV tem uma sequência de aminoácidos com alta identidade de sequência para CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da variante do Fator VIII codificado tem pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, ou 100% de identidade com CS12-FL-AA (SEQ ID NO: 2), incluindo as cinco mutações X5 (I105V / A127S / G151K / M166T / L171P (SPI), em relação à sequência do Fator VIII de tipo selvagem humana de comprimento total) e um peptídeo de glicosilação NG5 (SEQ ID NO: 15) inserido no ligante SQ.

[00188] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a variante do Fator VIII dentro do vetor de terapia genética de AAV está operativamente ligado a um elemento promotor com uma sequência de ácido nucleico com alta identidade de sequência para o promotor hTTR mostrado na Figura 4 (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o elemento promotor tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 6.

[00189] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a variante do Fator VIII dentro do vetor de terapia genética de AAV está operativamente ligado a um ou mais elementos regulatórios específicos do fígado tendo uma sequência de ácido nucleico com alta identidade de

73 / 93 sequência para o elemento CRM8 mostrado na Figura 4 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, os elementos regulatórios específicos do fígado têm uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, conforme ilustrado na Figura 11, o polinucleotídeo inclui um elemento CRM8. Em algumas modalidades, conforme ilustrado na Figura 11, o polinucleotídeo inclui dois elementos CRM.

[00190] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a variante do Fator VIII dentro do vetor de terapia genética de AAV está operativamente ligado a um elemento CRM8 e um elemento promotor de TTR humano, conforme exemplificado na Figura 11. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a variante do Fator VIII dentro do vetor de terapia genética de AAV está operativamente ligado a dois elementos CRM8 e um elemento promotor de TTR humano, conforme exemplificado na Figura 11. Conforme descrito no Exemplo 2, o uso do promotor hTTR e um ou dois elementos de CRM8 específicos do fígado aumentaram a biopotência do Fator VIII exógeno in vivo em células HepG2 em cerca de 2 e 4 vezes, respectivamente, em comparação com o uso de sequências promotoras e intensificadoras de TTR de camundongo (compare vCS115 e vCS116 a vCS04 na Figura 12).

[00191] Conforme relatado no Exemplo 6, devido ao grande tamanho dos construtos de variante do Fator VIII aqui descritos, uma pequena redução no número de nucleotídeos em um polinucleotídeo do Fator VIII que faz parte de um vetor de terapia genética de AAV pode aumentar significativamente a biopotência do Fator VIII do vetor. Por conseguinte, em algumas modalidades, um ou mais elementos CRM8 estão diretamente ligados à extremidade 5' do promotor TTR, por exemplo, não há nucleotídeos estranhos posicionados entre o elemento CRM8 e o promotor TTR. Da mesma forma, em algumas modalidades, o promotor TTR está diretamente ligado à

74 / 93 extremidade 5' da sequência de codificação, ou a uma sequência de iniciação da tradução (por exemplo, uma sequência de Kozak), para o polipeptídeo variante do Fator VIII, por exemplo, não há nucleotídeos estranhos posicionados entre o promotor TTR e o gene variante do Fator VIII.

[00192] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a variante do Fator VIII dentro do vetor de terapia genética de AAV está operativamente ligado a um sinal de poliadenilação, por exemplo, como ilustrado nos exemplos de construtos na Figura 11. Em uma modalidade, o sinal de poliadenilação sintético tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, 95%, 97% ou 100% idêntica ao sinal Poli-A sintético mostrado na Figura 4 (SEQ ID NO: 8).

[00193] Conforme relatado no Exemplo 6, devido ao grande tamanho dos construtos de variante do Fator VIII aqui descritos, uma pequena redução no número de nucleotídeos em um polinucleotídeo do Fator VIII que faz parte de um vetor de terapia genética de AAV pode aumentar significativamente a biopotência do Fator VIII do vetor. Por conseguinte, em algumas modalidades, o sinal de poliadenilação é diretamente ligado à extremidade 3' da sequência de codificação do polipeptídeo variante do Fator VIII, incluindo um ou mais códons de parada que estão posicionados no final da sequência de codificação. Por exemplo, não há nucleotídeos estranhos posicionados entre o gene variante do Fator VIII e a sequência de poliadenilação.

[00194] Repetições terminais internas são elementos regulatórios cis necessários para vetores recombinantes baseados em AAV. Consequentemente, a variante do Fator VIII que codifica polinucleotídeos usados nos vetores de terapia genética de AAV aqui descritos incluem sequências ITR 5' e 3'. Em algumas modalidades, a ITR 5' tem alta identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica) a ITR 5' AAV2 mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, a alta identidade de sequência ITR 3' hsa (por exemplo,

75 / 93 pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica) para ITR 3' AAV2 mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: 9).

[00195] Conforme relatado no Exemplo 6, devido ao grande tamanho dos construtos de variante do Fator VIII aqui descritos, uma pequena redução no número de nucleotídeos em um polinucleotídeo do Fator VIII que faz parte de um vetor de terapia genética de AAV pode aumentar significativamente a biopotência do Fator VIII do vetor. Por conseguinte, em algumas modalidades, a ITR 5' está diretamente ligada à extremidade 5' do elemento específico do fígado (por exemplo, um ou mais elementos CRM8), de modo que nenhum nucleotídeo estranho seja posicionado entre a sequência ITR 5' e o elemento específico do fígado. Da mesma forma, em algumas modalidades, a ITR 3' está diretamente ligada à extremidade 3' do sinal de poliadenilação, de modo que nenhum nucleotídeo estranho seja posicionado entre o sinal de poliadenilação e a sequência de ITR 3'.

[00196] Em uma modalidade específica, como exemplificado na Figura 11, um polinucleotídeo incluído dentro de um vetor de terapia genética de AAV fornecido neste documento inclui, em uma orientação de 5' para 3', uma sequência ITR 5' (por exemplo, tendo alta identidade de sequência com SEQ ID NO: 4), um ou dois elementos CRM tendo alta identidade de sequência com SEQ ID NO: 5, um elemento promotor hTTR com alta identidade de sequência com SEQ ID NO: 6, uma sequência de consenso Kozak mínima com alta identidade de sequência com SEQ ID NO: 7, um polinucleotídeo variante do Fator VIII tendo alta identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, uma sequência de poliadenilação (por exemplo, tendo alta identidade de sequência com SEQ ID NO: 8) e uma sequência ITR 3' AAV (por exemplo, tendo alta identidade de sequência com SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo descrito tem alta identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade) com o vetor CS12-CRM8.2-Vr mostrado na Figura 3

76 / 93 (SEQ ID NO: 3).

[00197] Os vetores de terapia genética de AAV aqui descritos são usados com proteínas do capsídeo de AAV que encapsulam o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo variante do Fator VIII, como aqui descrito. Ou seja, a distribuição do vetor viral que produzirá o Fator VIII é feita usando uma partícula viral incluindo a "casca" das proteínas do capsídeo que encapsulam o vetor viral.

[00198] O sorotipo de um vetor AAV é tipicamente definido pelas proteínas do capsídeo utilizadas. Vários sorotipos de AAV foram caracterizados, incluindo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9. Geralmente, qualquer sorotipo de AAV pode ser usado para os construtos de terapia genética do Fator VIII aqui descritos. No entanto, os sorotipos têm tropismos diferentes, por exemplo, eles infectam preferencialmente tecidos diferentes. Em uma modalidade, porque o Fator VIII é produzido principalmente no fígado, um sorotipo de AAV para os construtos de terapia genética divulgados é selecionado com base em um tropismo de fígado, encontrado pelo menos nos sorotipos AAV7, AAV8 e AAV9. Consequentemente, em uma modalidade, um construto de terapia genética de Fator VIII é um vetor de sorotipo AAV7. Em outra modalidade, um construto de terapia genética de Fator VIII é um vetor de sorotipo AAV8. Em ainda outra modalidade, um construto de terapia genética de Fator VIII é um vetor de sorotipo AAV9.

[00199] Em algumas modalidades, polinucleotídeos de plasmídeo que incorporam genomas de terapia genética de Fator VIII alterados por códon também são fornecidos. Os plasmídeos são úteis para a produção das partículas finais de AAV (por exemplo, vírions de AAV que transportam o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo variante do Fator VIII), por exemplo, quando introduzidos em uma célula de mamífero competente para a produção de AAV recombinante (por exemplo, uma célula que abriga ácidos

77 / 93 nucleicos que codificam Genes rep e cap de AAV, bem como genes auxiliares (por exemplo, genes de adenovírus) para a produção de AAV. Em algumas modalidades, os plasmídeos incluem elementos regulatórios que permitem a replicação do plasmídeo (por exemplo, para aumentar a escala do plasmídeo) em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica, como uma bactéria, ou uma célula hospedeira eucariótica, como fermento).

[00200] Por exemplo, a sequência de um exemplo de plasmídeo carregando um genoma de terapia genética do Fator VIII alterado por códon é mostrada na Figura 5 (CS12-CRM8.2-Vrp; SEQ ID NO: 10), de acordo com uma modalidade da divulgação. O plasmídeo CS12-CRM8.2-Vrp inclui o genoma de terapia genética do Fator VIII CS12-CRM8.2-Vr (mostrado como SEQ ID NO: 3, na Figura 3) e a espinha dorsal do plasmídeo (mostrado como SEQ ID NO: 54, na Figura 18). Os elementos genéticos do genoma da terapia genética do fator VIII CS12-CRM8.2-Vr são mostrados na Figura 4, conforme descrito acima. A espinha dorsal do plasmídeo do plasmídeo CS12- CRM8.2-Vrp inclui um replicon pMB1 (mostrado como SEQ ID NO: 55 na Figura 19; Bolívar F., Life Sci., 25(10):807-17 (1979)) que facilita a replicação do plasmídeo em uma célula hospedeira bacteriana e um gene de resistência à ampicilina Bla (ApR) (mostrado como SEQ ID NO: 56 na Figura 19; Sutcliffe, P.N.A.S. U.S.A, 75(8):3737-41 (1978)) que facilita seleção de células hospedeiras bacterianas transformadas pelo plasmídeo. A localização de cada elemento no plasmídeo CS12-CRM8.2-Vrp é mostrada Tabela 1abaixo. Tabela 1. Elementos presentes no plasmídeo CS12-CRM8.2-Vrp. Nome do elemento Posição do Nucleotídeo SEQ ID NO: AAV2 5’-ITR 1-145 SEQ ID NO: 4 CRM8 146 – 217; 219 – 290 SEQ ID NO:5 Promotor TTR Humano 291 - 523 SEQ ID NO:6 Sequência Kozak 524 - 528 SEQ ID NO:7 Sequência de codificação FVIII- SEQ ID NO:1 529 - 4923 BDD com X5 e NG5 ATG códon inicial 529 - 531 TGA códons de parada 4921 – 4923; 4924 - 4926 Variante X5 (I86V; A108S; 841 – 843; 907 – 909; 979 – 981; G132K; M147T; L152P) 1024 – 1026; 1039 - 1041

78 / 93 Sequência NG5 2821 - 2841 SEQ ID NO:16 PoliA sintética 4927-4975 SEQ ID NO:8 AAV2 3’-ITR 4976 - 5120 SEQ ID NO:9 Espinha dorsal do plasmídeo 5121 - 7794 SEQ ID NO:54 • Rep (pMB1) • 5541 - 6155 SEQ ID NO:55 • Bla (ApR) • 6315 - 7175 SEQ ID NO:56

[00201] Em uma modalidade, um plasmídeo que incorpora um genoma de terapia genética variante do Fator VIII tem alta identidade de sequência com o plasmídeo CS12-CRM8.2-Vrp mostrado na Figura 5 (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo descrito tem alta identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade) com o plasmídeo CS12-CRM8.2-Vr mostrado na Figura 5 (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o polipeptídeo descrito inclui uma sequência de codificação do Fator VIII- BDD, por exemplo, uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade com um Fator VIII-BDD que codifica a sequência aqui divulgada, e alta identidade de sequência com a porção restante do plasmídeo CS12-CRM8.2-Vrp mostrado na Figura 5, por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade com os nucleotídeos 1-528 e 4924-7794 de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo descrito é um plasmídeo que compreende alguns ou todos os elementos mostrados em Tabela 1. Em algumas modalidades, um ou mais dos elementos mostrados em Tabela 1 são substituídos por um elemento comparável. Produção de vetores AAV

[00202] Os polinucleotídeos do Fator VIII alterado por códon e vetores virais aqui descritos são produzidos de acordo com métodos convencionais para amplificação de ácido nucleico e produção de vetor. Várias plataformas foram desenvolvidas para a produção em larga escala de vetores AAV recombinantes. Uma primeira plataforma é baseada na introdução de um plasmídeo contendo a sequência para o genoma viral desejado em uma célula de mamífero contendo polinucleotídeos que codificam genes rep e cap de

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AAV, bem como genes auxiliares de replicação viral.

Para revisão, consulte Kotin R.M., Hum.

Mol.

Genet., 20(R1):R2-6 (2011); Penaud-Budloo, M. et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 8(8):166-80 (2018); and Aponte-Ubillus JJ et al., Appl Microbiol Biotechnol., 102(3):1045-54 (2018), cujos conteúdos são expressamente incorporados neste documento por referência, em sua totalidade, para todos os fins.

Uma segunda plataforma é baseada na construção de uma linhagem de células de mamífero estável com o genoma viral desejado integrado no genoma da célula de mamífero, por exemplo, por coinfecção de uma célula de mamífero com adenovírus de tipo selvagem e adenovírus recombinante contendo a sequência para o genoma viral desejado.

Para revisão, ver Penaud-Budloo, M. et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 8(8):166-80 (2018), cujo conteúdo é expressamente incorporado neste documento por referência, em sua totalidade, para todos os propósitos.

Uma terceira plataforma é baseada na coinfecção de uma célula de mamífero com um primeiro HSV recombinante que abriga a sequência para o genoma viral desejado e um segundo HSV recombinante que codifica os genes rep e cap de AAV.

Para revisão, ver, Penaud-Budloo, M. et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 8(8):166-80 (2018); and Aponte-Ubillus JJ et al., Appl Microbiol Biotechnol., 102(3):1045-54 (2018), cujos conteúdos são expressamente incorporados neste documento por referência, em sua totalidade, para todos os fins.

Uma quarta plataforma é baseada na coinfecção de células de inseto com um primeiro baculovírus recombinante contendo a sequência para o genoma viral desejado e um segundo baculovírus recombinante que codifica os genes rep e cap de AAV.

Um quinta plataforma é baseada na introdução de um plasmídeo contendo a sequência para o genoma viral desejado em uma

80 / 93 célula de levedura contendo polinucleotídeos que codificam genes rep e cap de AAV, bem como genes auxiliares de replicação viral. Para revisão, ver Aponte-Ubillus JJ et al., Appl Microbiol Biotechnol., 102(3):1045-54 (2018), cujo conteúdo é expressamente incorporado neste documento por referência, em sua totalidade, para todos os efeitos. V. Métodos de tratamento da hemofilia A

[00203] Em algumas modalidades, as composições de ácido nucleico (por exemplo, polinucleotídeos alterados por códon que codificam uma variante do Fator VIII) e vetores de terapia genética (por exemplo, partículas de AAV contendo um polinucleotídeo alterado por códon que codifica uma variante do Fator VIII) descritos neste documento são administrados a um paciente com hemofilia A para o tratamento da hemofilia A, de acordo com métodos administrativos conhecidos. Os métodos para a administração de vetores de terapia genética são bem conhecidos na técnica. Estes incluem, sem limitação, administração intravenosa, injeção intramuscular, injeção intersticial e administração intra-hepática (por exemplo, artéria ou veia intra- hepática). Por exemplo, ver Chuah MK et al., Hum Gene Ther., 23(6):557-65 (2012); Chuah MK et al., J Thromb Haemost., 10(8):1566-69 (2012); Chuah MK et al., J Thromb Haemost. 11 Suppl 1:99-110 (2013); VandenDriessche et al., Hum Gene Ther. 23(1):4-6 (2012); High KA, Blood, 120(23):4482-87 (2012); Matrai et al., Mol Ther., 18(3):477-90 (2010); and Matrai et al., Curr Opin Hematol., 17(5):387-92 (2010), o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência, para revisão.

[00204] Consequentemente, a divulgação fornece métodos para o tratamento de uma deficiência de Fator VIII (por exemplo, hemofilia A). Em algumas modalidades, os métodos incluem administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma composição de ácido nucleico (por exemplo, um construto de polinucleotídeo do Fator VIII alterado por códon e / ou vetor AAV recombinante), conforme descrito neste documento. Em algumas

81 / 93 modalidades, a composição de ácido nucleico inclui um polinucleotídeo alterado por códon que codifica um polipeptídeo variante do Fator VIII, por exemplo, tendo alta identidade de sequência de ácido nucleico (por exemplo, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 %, 99,9% ou 100%) com CS12- FL-NA (SEQ ID NO: 1). Conforme descrito neste documento, em algumas modalidades, o polinucleotídeo alterado por códon que codifica o polipeptídeo variante do Fator VIII está operativamente ligado a um promotor (por exemplo, um promotor de TTR humano, como descrito neste documento) e um ou mais elementos regulatórios específicos do fígado (por exemplo, um ou dois elementos CRM8, conforme aqui descrito).

[00205] Em algumas modalidades, a composição de ácido nucleico é parte de um vetor de terapia genética de mamífero. Em uma modalidade específica, o vetor de terapia genética de mamífero é um vetor viral, por exemplo, um lentivírus, retrovírus, adenovírus ou vetor de vírus adenoassociado.

[00206] Em uma modalidade, o vetor de terapia genética é uma partícula de vírus adenoassociado (AAV) que abriga um vetor viral que codifica a sequência codificadora da variante do Fator VIII alterado por códon. Geralmente, o vetor viral inclui repetições terminais invertidas (ITR) em cada terminal, um ou mais elementos regulatórios de expressão (por exemplo, um promotor (por exemplo, um promotor de TTR humano, como aqui descrito) e um ou mais elementos regulatórios específicos do fígado (por exemplo, um ou dois elementos CRM8, como aqui descrito)), uma sequência de codificação do Fator VIII com alterado por códon e uma sequência de sinal poli-A. Avaliação da eficácia terapêutica

[00207] A eficácia terapêutica de um tratamento de hemofilia A pode ser avaliada, por exemplo, medindo o potencial de coagulação do sangue dependente do Fator VIII de um sujeito a ser tratado. As métricas para avaliar

82 / 93 o potencial de coagulação incluem, sem limitação, ensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada in vitro (APPT), ensaios de atividade cromogênica do Fator IX, tempos de coagulação do sangue e níveis de antígeno do Fator VIII (por exemplo, usando um ELISA específico para o Fator VIII). Deve-se notar que uma dose terapêutica não precisa resultar em níveis de Fator VIII de tipo selvagem em um paciente; em vez disso, a expressão suficiente para diminuir os sintomas de uma forma significativa ou mensurável é considerada terapêutica para os fins da divulgação.

[00208] De acordo com a National Hemophilia Foundation, um sujeito é classificado como portador de hemofilia A leve quando seu plasma sanguíneo contém entre 6% e 49% da atividade do Fator VIII do plasma sanguíneo humano normal. Sujeitos com hemofilia A leve normalmente experimentam sangramento apenas após lesão grave, trauma ou cirurgia. Em muitos casos, a hemofilia leve não é diagnosticada até que uma lesão, cirurgia ou extração dentária resulte em sangramento prolongado. O primeiro episódio pode não ocorrer até a idade adulta. Mulheres com hemofilia leve geralmente apresentam menorragia, períodos menstruais intensos e podem apresentar hemorragia após o parto.

[00209] De acordo com a National Hemophilia Foundation, um sujeito é classificado como portador de hemofilia A moderada quando seu plasma sanguíneo contém entre 1% e 5% da atividade do Fator VIII do plasma sanguíneo humano normal. Sujeitos com hemofilia A moderada tendem a ter episódios de sangramento após lesões. Os sangramentos que ocorrem sem causa óbvia são chamados de episódios de sangramento espontâneo.

[00210] De acordo com a National Hemophilia Foundation, um sujeito é classificado como portador de hemofilia A severa quando seu plasma sanguíneo contém menos que 1% da atividade do Fator VIII do plasma sanguíneo humano normal. Os sujeitos com hemofilia A grave apresentam sangramento após uma lesão e podem ter episódios de sangramento

83 / 93 espontâneo frequentes, geralmente nas articulações e nos músculos.

[00211] Em algumas modalidades, o plasma sanguíneo humano normal é definido como contendo 1 IU de atividade do Fator VIII por mL. Assim, em algumas modalidades, o plasma sanguíneo de um sujeito classificado com hemofilia A leve contém entre 0,06 e 0,49 IU de atividade do Fator VIII por mL. Em algumas modalidades, o plasma sanguíneo de um sujeito classificado com hemofilia A moderada contém entre 0,01 e 0,05 IU de atividade do Fator VIII por mL. Em algumas modalidades, o plasma sanguíneo de um sujeito classificado com hemofilia A severa contém entre 0,01 e 0,05 IU de atividade do Fator VIII por mL.

[00212] Em algumas modalidades, uma terapia é terapeuticamente eficaz quando diminui a gravidade de um sintoma de hemofilia A, por exemplo, aumentando o nível médio de atividade do Fator VIII no sangue do sujeito. Consequentemente, em algumas modalidades, a terapia de hemofilia A é terapeuticamente eficaz quando aumenta o nível médio de atividade do Fator VIII no sangue / plasma do sujeito. Em algumas modalidades, um tratamento terapeuticamente afetivo aumenta o nível médio de atividade do Fator VIII no sangue / plasma do sujeito em pelo menos 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8 %, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais.

[00213] Em algumas modalidades, um tratamento terapeuticamente eficaz aumenta o nível médio de atividade do Fator VIII no sangue do sujeito de modo que o sujeito seja classificado como tendo uma forma menos grave de hemofilia A. Por exemplo, em uma modalidade, um sujeito originalmente classificado com hemofilia A grave é reclassificado com hemofilia A moderada ou hemofilia A leve após ser submetido a um tratamento terapeuticamente eficaz. Em outra modalidade, um sujeito originalmente classificado com hemofilia A moderada é reclassificado com hemofilia A leve após ser submetido a um tratamento terapeuticamente eficaz. Em outra

84 / 93 modalidade, um sujeito originalmente classificado com hemofilia A leve é reclassificado como não tendo hemofilia A após ser submetido a um tratamento terapeuticamente eficaz. Formulações

[00214] As composições para uso no tratamento da hemofilia A são fornecidas aqui. Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de ácido nucleico, por exemplo, um vetor de terapia genética AAV incluindo um polinucleotídeo alterado por códon que codifica o Fator VIII, conforme descrito neste documento. Quantidades terapeuticamente eficazes do polinucleotídeo VIII alterado por códon (por exemplo, um vetor de terapia genética AAV incluindo a sequência de codificação do Fator VIII alterado por códon) são misturadas com um transportador ou veículo farmacêutico adequado para, por exemplo, administração sistêmica. A formulação final dos polinucleotídeos do Fator VIII alterado por códon aqui divulgados estará dentro das habilidades dos versados na técnica. Dosagens

[00215] As composições de ácido nucleico da invenção são administradas a pacientes em necessidade das mesmas. A quantidade ou dose do agente terapêutico de terapia genética administrado depende de fatores, tais como o construto de polinucleotídeo VIII alterado por códon particular, o vetor de distribuição usado, a gravidade da doença e as características gerais do sujeito. A dose exata dependerá do propósito do tratamento, e serão determináveis por um versado na técnica usando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1 3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins). Está dentro das capacidades do médico perito determinar uma

85 / 93 dosagem particular e um regime de dosagem para o tratamento de um sujeito particular. VI. Exemplos Exemplo 1 - Melhoria de um construto de vetor AAV8 de fita simples que expressa FVIII por adição de sequências ligantes de N-glicosilação

[00216] Para determinar se sítios de N-glicosilação adicionais dentro da sequência SQ de BDD-FVIII aumentam a expressão da proteína FVIII, um conjunto de pequenas sequências de peptídeos contendo sítios de glicosilação N-ligados putativos foi projetado. Anteriormente, McIntosh et al. (Blood 121(17):3335-44 (2013)) mostrou que o conceito de N-glicosilação com 6 sítios potenciais (“peptídeo V3”) resultou em níveis intensificados de expressão de FVIII no plasma de camundongos. Curiosamente, a predição in silico do "peptídeo V3" identificou dois dos 6 sítios como potencialmente N- glicosilados in vivo.

[00217] 12 sequências ligantes diferentes, mostradas como NG1-NG21 nas Figuras 8A-8B, foram projetadas dentro do contexto de uma sequência BDD-FVIII "CS01" otimizada por códons (ver WO 2017/083762, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência) por meio da aplicação do programa NetNGlyc-Database (Steentoft et al., H. EMBO J, 32(10):1478-88, 2013), com o objetivo de gerar sequências curtas contendo múltiplos sítios de N-glicosilação. A plataforma NetNGly combina nove redes neurais que analisam sequências de proteínas humanas para seu padrão de N-glicosilação. Com base no banco de dados NetNGly, os peptídeos projetados foram analisados quanto à probabilidade de transferir N-glicosilação como modificação pós-tradução, conforme descrito em Steentoft et al., H. EMBO J, 32(10):1478-88, (2013), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Dos 12 novos peptídeos alternativos, quatro ligantes NG promissores com baixa imunogenicidade predita (conforme explicado abaixo) foram inseridos na sequência SQ de 14 aminoácidos (SFSQN - novo peptídeo

86 / 93 - PPVLKRHQR) de uma sequência BDD-FVIII otimizada por códons denominada "CS04" (SEQ ID NO: 10).

[00218] A modificação pós-tradução dos sítios de N-glicosilação preditos foi confirmada experimentalmente para três vetores, incluindo vNG4 / CS04, vNG5 / CS04 e vNG16 / CS04, por transfecção de células Huh-7 hepáticas humanas e detecção de BDD-FVIII modificado por análises de Western blot anti-FVIII (Figura 9). Em comparação com BDD-FVIII contendo apenas a sequência SQ, cadeias pesadas de tamanho maior das versões modificadas de FVIII foram detectadas por eletroforese em gel, indicando a presença de novos sítios de N-glicosilação. Além disso, a infecção por AAV8 da linhagem de células de fígado humano HepG2 confirmou a N-glicosilação como mostrado exemplar para o vetor de expressão vNG5 / CS04 e a variante X5 altamente segregadora vX5 / NG5 / CS125 (Figura 10; vX5 / NG5 / CS125 será descrito nos Exemplos 3 e 5).

[00219] O foco para o desenho da sequência de ligação era gerar sequências peptídicas curtas (7-17 resíduos de aminoácidos) acompanhadas por baixo risco de imunogenicidade. Para isso, foi aplicado o perfil de imunogenicidade in silico EpibaseTM (Lonza) (ligação de HLA). O método de predição de epítopo do EpibaseTM compreende uma camada estrutural e uma camada estatística para a predição de imunogenicidade. A parte estrutural estima a afinidade de ligação com base na tecnologia Pepscope, conforme descrito em Desmet et al., Proteins. 58(1):53-69 (2005), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. A parte estatística extrai informações de sequências de peptídeos e suas afinidades de ligação experimentais. Com base nas contagens de epítopos críticos, os alótipos de HLA de classe II afetados (Krischmann et al., J Immunol. 15;155(12):5655- 62 (1995); Verreck et al., Int Immunol. 8(3):397-404 (1996), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência) e DRB1 (Laupeze et al., Hum Immunol. 60(7):591-7 (1999), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência), a

87 / 93 pontuação de risco foi usada para estimar o risco imunogênico das proteínas. Com base neste sistema de pontuação, o risco imunogênico do peptídeo NG16 é moderado, o de NG4 e NG10 é baixo e o de NG5 é ainda menor do que a sequência SQ não modificada de BDD-FVIII (Tabela 2). Tabela 2. Atividade do FVIII duas semanas após o tratamento com AAV in vivo. Camundongos Camundongos Ligante Epibase knock-out FVIII “linha E” Número de Número de Atividade Aumento Atividade Aumento Construto sítios de N- Imunogenicid ID resíduos de do FVIII em vezes do FVIII em vezes AAV glicosilação ade predita aminoáci-dos [IU/mL] vs Orth04 [IU/mL] vs Orth04 preditos vCS04 - 0 0 baixo 1,7 ± 0,5 1,0 1,4 ± 0,6 1,0 vNG4 / CS04 NG4 11 3 baixo 3,1 ± 0,6 1,8 n.d. n.d. vNG5 / CS04 NG5 7 2 muito baixo 3,8 ± 0,8 2,3 4,0 ± 2,8 3,0 vNG10 / NG10 17 2 baixo 4,1 ± 0,5 2,4 n.d. n.d. CS04 vNG16 / NG16 9 2 moderado 2,5 ± 0.8 1,4 n.d. n.d. CS04

[00220] Além disso, os vetores vNG4 / CS04, vNG5 / CS04, vNG10 / CS04 e vNG16 / CS04 foram analisados no modelo de camundongo knock- out do éxon 16 FVIII gerado no laboratório de Haig Kazazian na Universidade da Pensilvânia (Tabela 2). Duas semanas após a infecção com AAV8, os níveis de expressão de FVIII foram determinados pela atividade cromogênica de amostras de plasma de camundongo. Duas semanas após a infecção por AAV8 a uma dose de 4.0x1012, os níveis de expressão de FVIII foram 1,4 a 2,4 vezes mais elevados do que o construto de vCS04 livre de peptídeo. No geral, o construto vNG5 / CS04 exibiu as características mais favoráveis, incluindo os altos níveis de expressão de FVIII (3,8 IU / mL), o menor risco imunogênico e o menor tamanho de peptídeo (7 resíduos de aminoácidos). O construto vNG5 / CS04 foi ainda testado em outro modelo de camundongo FVIII, o modelo de "linha E", que é imunologicamente tolerante ao FVIII humano (descrito em Reipert et al., Haemophilia. 16 (Suppl 5):47-53 (2010) and van Helden et al., Blood 118(13):3698-707 (2011), cujos conteúdos são aqui expressamente incorporados por referência). Neste modelo de camundongo independente, a expressão aumentada de FVIII de

88 / 93 vNG5 / CS04 foi confirmada e avaliada como sendo 3 vezes maior que vCS04.

[00221] Tomados em conjunto, foi desenvolvido um vetor melhorado denominado vNG5 / CS04 contendo uma nova sequência curta de peptídeo de N-glicosilação com um risco imunogênico muito baixo e níveis aumentados de expressão de FVIII in vivo. Exemplo 2 - Melhoria de um construto de vetor AAV8 de fita simples que expressa FVIII por substituição de promotor / intensificador

[00222] O cassete do promotor do construto de vetor de fita simples baseado em AAV8 que expressa FVIII inicial denominado vCS04 contém um promotor de núcleo e uma sequência intensificadora derivada do gene da transtirretina murina específica do fígado (TTR) (Yan et al., EMBO J, 9:869- 78 (1990), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência), ver Figura 11. Esse cassete promotor / intensificador de mTTR específico do fígado foi modificado duas vezes, em primeiro lugar a sequência do promotor do núcleo murino (basal) foi totalmente substituída pela sequência humana correspondente. Em segundo lugar, a sequência intensificadora murina foi substituída pelo módulo regulatório cis específico do fígado recentemente descrito CRM8 (Nair et al., Blood, 123:3195-99 (2014) and Chuah et al., Mol Ther, 22:1605-13 (2014), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência). Um ou dois elementos CRM8 foram inseridos a montante do promotor do núcleo de TTR humano (basal), resultando nos construtos de vetor vCS115 e vCS116, respectivamente (Figura 11).

[00223] A força do novo cassete do promotor foi avaliada por análises in vitro e in vivo, em uma linhagem de células HepG2 derivada de fígado humano e em camundongos “linha E” a uma dose de 4,0E + 12 vg / kg. In vitro, os construtos com um elemento CRM8 (vCS115) e dois elementos CRM8 (vCS116) resultaram em unidades de biopotência 2,2 e 3,7 vezes maiores, respectivamente, em comparação com a referência (vCS04) (Figura

89 / 93 12). In vivo, o cassete do promotor CRM8 / hTTR teve um desempenho comparável ao promotor / intensificador mTTR (Figura 12).

[00224] O efeito de aumento relacionado a CRM8 na expressão de FVIII foi ainda avaliado em conjuntos triplos de construtos, nos quais os cassetes de promotor descritos incluindo promotor / intensificador de mTTR, 1xCRM8 / hTTR e 2xCRM8 / hTTR foram combinados com novas modificações de BDD-FVIII (ver abaixo, Exemplos 3 -5). No geral, os dados in vitro revelam um aumento nas unidades de biopotência com base na presença de um e dois elementos CRM8 comparando diretamente (1) vNG5 / CS04 com vNG5 / CS117 (2,5 vezes maior) e vNG5 / CS118 (4,0 vezes maior), (2) vX5 / CS24 com vX5 / CS101 (1,8 vezes maior) e vX5 / CS105 (5,3 vezes maior) e (3) vX5 / NG5 / CS125 com vX5 / NG5 / CS119 (4,4 vezes maior) e vX5 / NG5 / CS120 (6,2 vezes maior). Nenhum efeito dependente de CRM8 nos níveis de FVIII foi observado in vivo. No entanto, os dados in vivo mostram claramente que tanto o novo 1xCRM8 / hTTR quanto o cassete do promotor 2xCRM8 / hTTR funcionam igualmente bem no modelo de camundongo em comparação com o promotor / intensificador mTTR. Exemplo 3 - Melhoria de um construto de vetor AAV8 de fita simples que expressa FVIII pela introdução da variante "NG5"

[00225] Com base nos dados mostrados no Exemplo 1, o ligante de N- glicosilação NG5 no construto vNG5 / CS04 foi selecionado para ser combinado com os novos promotores específicos do fígado humano 1xCRM8 / hTTR e 2xCRM8 / hTTR, resultando nos construtos vNG5 / CS117 e vNG5 / CS118 (Figura 11). O construto vNG5 / CS04 contém o cassete promotor / intensificador mTTR (Figura 11). Os níveis de biopotência in vivo de vNG5 / CS04 foram 1,9 vezes maiores que vCS04, atribuindo o efeito positivo na sequência do ligante NG5 (Figura 12). In vitro, foi observado um aumento na biopotência para os vetores contendo elemento(s) CRM8 vNG5 / CS117 e

90 / 93 vNG5 / CS118. In vivo, os níveis de expressão de vNG5 / CS117 e vNG5 / CS118 foram semelhantes a vNG5 / CS04) (Figura 12). Exemplo 4 - Melhoria de um construto de vetor AAV8 de fita simples que expressa FVIII pela introdução da variante "X5"

[00226] A fim de melhorar ainda mais os vetores que expressam FVIII, a variante X5 (descrita como mutação 'm2' em WO 2017/083762, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência) foi introduzida em BDD-FVIII. A variante X5 contém cinco resíduos de aminoácidos FVIII suínos dentro do domínio A1 da cadeia pesada que conferem secreção eficiente ao FVIII humano (Cao et al., 2014, ASGCT abstract #460; detalhes das variantes divulgadas na apresentação oral). Especificamente, a variante X5 de BDD- FVIII foi combinada com o promotor / intensificador mTTR, resultando em vX5 / CS24, e com um ou dois elemento(s) CRM8 mais o promotor hTTR, resultando nos construtos vX5 / CS101 e vX5 / CS105 (Figura 11). Os três novos construtos foram analisados in vitro em uma linhagem de células HepG2 derivada do fígado e in vivo em camundongos "linha E2", uma linha de camundongos knock-out para FVIII transgênica que expressa quantidades mínimas de cDNA de FVIII humano levando à tolerância imunológica ao FVIII humano (van Helden PM, et al., Blood 118(13):3698-707 (2011), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência, em sua totalidade, para todos os fins), e em comparação com o construto de referência vCS04. In vivo, vX5 / CS24, vX5 / CS101 e vX5 / CS105 resultaram em níveis aumentados de atividade de FVIII por um fator de 2,5 - 3,1 (Figura 12). In vitro, o aumento da biopotência variou entre 4,0 e 21,2. O sistema de teste in vitro revelou um aumento de 4,0 vezes decorrente da variante X5 (construto vX5 / CS24), e foi ainda aumentado por um fator de 7,3 e 21,2 pelos construtos contendo X5 e uma ou duas cópias do elemento CRM8 (construtos vX5 / CS101 e vX5 / CS105, respectivamente). Exemplo 5 - Melhoria de um construto de vetor AAV8 de fita simples que

91 / 93 expressa FVIII pela introdução de ambas as variantes "X5" e "NG5"

[00227] Em um outro conjunto de vetores, o ligante de N-glicosilação NG5 (Exemplo 3) e a variante X5 (Exemplo 4) foram introduzidos em BDD- FVIII em paralelo e adicionalmente combinados com três promotores diferentes, incluindo o promotor / intensificador mTTR, 1x CRM8 / hTTR e 2xCRM8 / hTTR, resultando nos construtos vX5 / NG5 / CS125, vX5 / NG5 / CS119 e vX5 / NG5 / CS120, respectivamente (Figura 11). Em comparação com vCS04, as biopotências in vivo e in vitro de vX5 / NG5 / CS125, vX5 / NG5 / CS119 e vX5 / NG5 / CS120 foram elevadas por um fator de 3,6 - 5,5 e 3,2 - 19,8, respectivamente. A introdução das duas novas modificações X5 e NG5 revelam expressão ainda aumentada, in vivo, como mostrado para as três séries de construtos, cada uma tendo um promotor comum. Por exemplo, para a série com o promotor 2xCRM8 / hTTR (construtos vCS116, vNG5 / CS118, vX5 / CS105 e vX5 / NG5 / CS120), a presença de NG5 sozinho aumenta o nível de expressão de FVIII de 1,9 para 2,9 IU / mL, a presença de X5 sozinho aumenta a expressão de FVIII de 1,9 para 5,1 IU / mL, e a presença de X5 e NG5 aumenta a expressão de FVIII de 1,9 para 11,4 IU / mL.

[00228] Tomados em conjunto, o construto vX5 / NG5 / CS120 carregando o novo cassete do promotor 2xCRM8 / hTTR e, adicionalmente, uma sequência de nucleotídeos de BDD-FVIII "CS04" otimizada por códons com duas modificações, a variante X5 e a sequência NG5, foi determinada como sendo o construto com maiores biopotências in vitro e in vivo. Exemplo 6 - Redução de nucleotídeo de um construto de vetor AAV8 de fita simples

[00229] A fim de reduzir o tamanho do vetor do construto de vetor ligeiramente superdimensionado vX5 / NG5 / CS120 que deve resultar em um empacotamento mais eficiente, todas as sequências de DNA não funcionais dentro das ITRs de flanqueamento foram deletadas. Isso resultou na redução de um total de 71 nucleotídeos, de um cassete de expressão de 5191 para 5120

92 / 93 nucleotídeos. As deleções incluíram 19 nucleotídeos entre a 5'-ITR e a sequência CRM8, 9 nucleotídeos entre o promotor TTR humano e a sequência Kozak, 27 nucleotídeos entre a sequência de codificação BDD-FVIII e o sítio de poliadenilação sintético e 16 nucleotídeos entre o sítio de poliadenilação sintético e a sequência 3'-ITR. O cassete de expressão de tamanho reduzido, denominado vX5 / NG5 / CS12, consiste em um promotor com dois elementos CRM8 e a sequência principal do promotor TTR humano, a sequência BDD-FVIII incluindo a variante X5, bem como a sequência NG5 e um sítio de poliadenilação sintético e é flanqueado por duas repetições terminais invertidas baseadas em AAV2. O construto vX5 / NG5 / CS12 é mostrado esquematicamente na Figura 11.

[00230] A integridade do genoma do vetor das preparações do genoma do vetor AAV vCS04, vX5 / NG5 / CS120 e vX5 / NG5 / CS12 foi abordada por eletroforese em gel de agarose. Os resultados mostrados na Figura 13 demonstram que os vetores virais vCS04, vX5 / NG5 / CS120 e vX5 / NG5 / CS12 têm um genoma de tamanho semelhante, indicado por uma banda distinta de aproximadamente 5 kb. Apesar de um tamanho de vetor calculado de aprox. 5,2 kb, o genoma é uma banda homogênea que confirma o empacotamento correto do genoma marginalmente sobredimensionado (em relação a um genoma de tipo selvagem de AAV de 4,7 kb). A variante mais curta vX5 / NG5 / CS12 é preferida.

[00231] Um conjunto de vetores virais baseados em AAV8 incluindo vCS04, vX5 / NG5 / CS120 e vX5 / NG5 / CS12 foi administrado a camundongos knock-in FVIII F17 em doses de vetor de 5x1011 vg/kg, 1x1012 vg/kg, e 4x1012 vg/kg e os níveis de atividade do FVIII foram determinados no dia 14. Conforme mostrado na Figura 14, ambos vX5 / NG5 / CS12 e vX5 / NG5 / CS120 resultaram em níveis de expressão comparáveis de aproximadamente 4 IU / mL na dose de vetor de 1x1012 vg/kg. Em contraste com o construto de referência vCS04 com níveis de expressão de FVIII muito

93 / 93 baixos de 0,3 IU / mL a uma dose de 1x1012 vg/kg, os vetores melhorados vX5 / NG5 / CS12 e vX5 / NG5 / CS120 mostraram níveis de expressão de FVIII elevados por um fator de aproximadamente 14 (Figura 14). Mesmo na dose de 5x1011 vg/kg, níveis de expressão de 1,5 IU / mL de FVIII puderam ser obtidos para o vetor vX5 / NG5 / CS12. De acordo com os dados in vivo, as biopotências in vitro de vX5 / NG5 / CS120 e vX5 / NG5 / CS12 são fortemente elevadas aproximadamente por um fator de 17 e 24, respectivamente, infectando células HepG2 em igual multiplicidade de infecção (MOI) (Figura 14). Assim, como todos os vetores foram administrados na mesma concentração (multiplicidade de infecção), as diferenças na biopotência são devidas às variantes utilizadas e não são dependentes do tamanho.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo de Fator VIII codificando uma proteína de Fator VIII, o referido polinucleotídeo de Fator VIII tendo a sequência de ácido nucléico de CS12-FL-NA (SEQ ID NO: 1).

2. Composição de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo promotor ligado operativamente ao polinucleotídeo de Fator VIII, em que o polinucleotídeo promotor tem a sequência de ácido nucleico de hTTR (SEQ ID NO: 6)

3. Composição de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o promotor é diretamente fixado ao polinucleotídeo de Fator VIII.

4. Composição de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um elemento específico de fígado operativamente ligado ao polinucleotídeo de Fator VIII, em que o elemento específico de fígado tem uma sequência de CRM8 (SEQ ID NO: 5).

5. Composição de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que um segundo elemento específico de fígado é operativamente ligado ao referido polipeptídeo de Fator VIII.

6. Composição de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o elemento específico de fígado e o promotor são fixados diretamente.

7. Composição de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem uma sequência de ácido nucleico compreendendo CS12-CRM8.2-Vr (SEQ ID NO: 3).

8. Vetor de terapia de gene de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Vetor de terapia de gene de mamífero de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o vetor de terapia de gene de mamífero é um vetor de vírus adeno-associado (AAV).

10. Vetor de terapia de gene de mamífero de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o vetor AAV é um vetor de vírus adeno-associado de sorotipo 8 (AAV-8).

11. Vetor de terapia de gene de mamífero de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a composição de ácido nucléico é um polinucleotídeo de fita simples codificando a proteína de fator VIII.

12. Partícula de vírus adeno-associado (AAV), caracterizada pelo fato de que compreende proteínas de capsídeo encapsulando uma composição de ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

13. Partícula de vírus adeno-associado (AAV), de acordo com a reivindicação 12, caracterizadas pelo fato de que as proteínas de capsídeo compreendem proteínas de capsídeo de vírus adeno-associado 8 (AAV-8).

14. Partícula de vírus adeno-associado (AAV), de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizadas pelo fato de que a composição de ácido nucléico é um polinucleotídeo de fita simples codificando a proteína de Fator VIII.

15. Método para tratar hemofilia A, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente com hemofilia A uma composição de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

16. Composição de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que é para tratar hemofilia A.

17. Uso de uma composição de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de hemofilia A.

18. Método para tratar hemofilia A, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente com hemofilia A um vetor de terapia de gene de mamífero de qualquer uma das reivindicações 8 a 11.

19. Vetor de terapia de gene de mamífero de qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que é para tratar hemofilia A.

20. Uso de um vetor de terapia de gene de mamífero de qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de hemofilia A.

21. Método para tratar hemofilia A, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente com hemofilia A uma partícula de vírus adeno-associado (AAV) de qualquer uma das reivindicações 12 a 14.

22. Partícula de vírus adeno-associado (AAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que é para tratar hemofilia A.

23. Uso de uma partícula de vírus adeno-associado (AAV) de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de hemofilia A.

24. Método para produzir uma partícula de vírus adeno- associado (AAV), caracterizado pelo fato de que compreende introduzir uma composição de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em uma célula hospedeira eucariótica: em que: a composição de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo de Fator VIII tendo a sequência de ácido nucleico de CS12- FL-NA (SEQ ID NO: 1) flanqueada por uma sequência de repetição terminal invertida 5’ (5’ ITR) e uma sequência de repetição terminal invertida 3’ (3’ ITR), e a célula hospedeira de mamífero compreende um ou mais polinucleotídeos codificando um gene rep de AAV, um gene cap de AAV e genes helper de replicação viral.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a composição de ácido nucleico é um plasmídeo tendo a sequência de ácido nucleico de CS12-CRM8.2-Vrp (SEQ ID NO: 10).

26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o gene cap de AAV é um gene cap de vírus adeno-associado 8 (AAV-8) de sorotipo.