CZ298597B6 - Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid - Google Patents
Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid Download PDFInfo
- Publication number
- CZ298597B6 CZ298597B6 CZ20050048A CZ200548A CZ298597B6 CZ 298597 B6 CZ298597 B6 CZ 298597B6 CZ 20050048 A CZ20050048 A CZ 20050048A CZ 200548 A CZ200548 A CZ 200548A CZ 298597 B6 CZ298597 B6 CZ 298597B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peg
- polypeptide
- ifn
- beta
- group
- Prior art date
Links
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims abstract description 151
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 title claims description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 8
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 70
- -1 amino, sulfhydryl Chemical group 0.000 claims description 23
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 7
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical class C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 claims description 2
- BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;carbonic acid Chemical class OC(O)=O.C1=CC=C2NN=NC2=C1 BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 2
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 claims 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 claims 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical class NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 abstract description 5
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 18
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 17
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 11
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 10
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 7
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000654530 Tupaia virus (isolate Tupaia/Thailand/-/1986) Small hydrophobic protein Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- AWAFMFHOLVZLFG-UHFFFAOYSA-N 1-iodoaziridine-2,3-dione Chemical group IN1C(=O)C1=O AWAFMFHOLVZLFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 4,4'-dipyridyl disulfide Chemical class C=1C=NC=CC=1SSC1=CC=NC=C1 UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DSTWKJOBKSMVCV-UWVGGRQHSA-N Cys-Tyr Chemical group SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DSTWKJOBKSMVCV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920002560 Polyethylene Glycol 3000 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940060205 adagen Drugs 0.000 description 1
- 150000008431 aliphatic amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin PEG na polypeptid, pri nemž se nechá reagovat polypeptid s heterobifunkcní nebo homobifunkcní skupinou PEG s molekulovou hmotnostní 100 až 5000, obecného vzorce W-CH.sub.2.n.CH.sub.2.n.O(CH.sub.2.n.CH.sub.2.n.O).sub.n.n.CH.sub.2.n.CH.sub.2.n.-X, kde W a X jsou skupiny, nezávisle reagující s aminoskupinou, sulfhydrylovou, karboxylovou nebo hydroxylovou funkcní skupinou za vazby skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid, nacež se nechá reagovat skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností, vázaná na polypeptid s monofunkcní nebo bifunkcní skupinou PEG pro vazbu této monofunkcní nebo bifunkcní skupiny PEG na volné zakoncení skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností za vzniku konjugátu typu PEG-polypeptid.
Description
Vynález se týká způsobu postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid, při níž vznikají konjugáty, vhodné pro výrobu farmaceutických prostředků.
Dosavadní stav techniky
Interferon z lidských fibroblastů, IFN-beta, má protivirovou účinnost a může také stimulovat přirozené buňky zabíječe proti nádorovým buňkám. Jde o polypeptid s molekulovou hmotností přibližně 20 000, jehož tvorba je vyvolávána přítomností virů a RNA s dvojitým řetězcem.
Z nukleotidové sekvence genu pro interferon z fibroblastů, klonovaný rekombinantní technologií DNA odvodili Derynk a další v Nátuře, 285, 542-547, 1980 úplnou sekvenci aminokyselin této bílkoviny, která obsahuje 166 zbytků aminokyselin.
V publikaci Shepard a další, Nátuře, 294, 563-565, 1981 se popisuje mutace na bázi v poloze 842 (Cys-Tyr v poloze 141), při níž dochází k vymizení protivirové účinnosti a variantního klonu, z nějž byla vypuštěna sekvence nukleotidů 1119-1121.
V publikaci Mark a další, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 81(18): 5662-5666, 1984 se popisuje vytvoření umělé mutace tak, že se báze T v poloze 469 nahradí bází A, čímž dojde k záměně aminokyseliny Cys za Ser v poloze 17. Popisuje se, že výsledný IFN-beta je stejně účinný jako přirozený IFN-beta a mimo to je stálý při dlouhodobém skladování při teplotě -70 °C.
Kovalentní vazba hydrofilního polymeru polyethylenglykolu, PEG, známého také jako polyethylenoxid, PEG na různé molekuly, má důležité použití v biotechnologii a v lékařství. Ve své nejběžnější formě je PEG lineární polymer, který má na každém svém konci hydroxylovou skupinu
HO-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH.
Tento vzorec je možno vyjádřit kratším způsobem jako HO-PEG-OH, kde -PEG- znamená kostru polymeru bez jeho koncových skupin. -PEG- tedy znamená
-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH240 PEG se běžně užívá jako methoxy-PEG-OH (m-PEG), přičemž na jednom konci této látky se nachází poměrně inertní methoxyskupina, zatímco druhý konec tvoří hydroxylová skupina, která je snadno chemicky modifikována
CH3O-(CH2CH20)„CH2CH2-0H.
Běžně se užívají také rozvětvené typy PEG. Tyto látky je možno vyjádřit vzorcem R(-PEGOH)m, kde R znamená centrální skupinu, například pentaerythritol nebo glycerol a m znamená počet rozvětvení. Symbol m může mít hodnotu 3 až 100 nebo i více. I v tomto případě hydroxylové skupiny snadno podléhají chemické modifikaci.
Další rozvětvená forma byla popsána v dokumentu WO 96/21 469 a má jediné zakončení, podléhající chemické modifikaci. Tento typ PEG je možno vyjádřit vzorcem (CH3O-PEG-)pR-X, kde p znamená 2 nebo 3, R znamená centrální skupinu, například zbytek lysinu nebo glycerolu a X znamená funkční skupinu, například karboxylovou skupinu, která se snadno podrobí chemic-1 CZ 298597 B6 ké aktivaci. Ještě další rozvětvená forma obsahuje reaktivní skupiny, například karboxylové skupiny v průběhu řetězce PEG spíše než na jeho konci.
Kromě uvedených forem PEG je možno polymer také připravit tak, aby v řetězci obsahoval slabé nebo degradovatelné vazby. Například v patentové US přihlášce 06/026716 (Harris) se uvádí, že PEG je možno připravit s esterovými vazbami v polymemím řetězci, přičemž tato vazby je možno hydrolyzovat. Hydrolýzou se polymer rozštěpí na fragmenty s nižší molekulovou hmotností podle reakčního schématu -PEG-CO2-PEG- + H2O -> -PEG-CO2H + HO-PEG-.
V průběhu přihlášky vynálezu se pod pojmem polyethylenglykol nebo PEG rozumí kterákoliv ze svrchu popsaných forem.
Kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu jsou chemicky blízce příbuzné PEG a je možno je použít v řadě použití místo PEG. Tyto látky je možno vyjádřit obecným vzorcem HO-CH215 CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH, kde R znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu.
PEG je užitečný polymer, který je vysoce rozpustný ve vodě a také v celé řadě organických roz20 pouštědel. Je netoxický a nevyvolává reakci imunitního systému. V případě vazby PEG chemickým způsobem na sloučeninu, nerozpustnou ve vodě, je výsledný konjugát obvykle rozpustný ve vodě a také v řadě organických rozpouštědel.
Konjugáty PEG a proteinů jsou v současné době běžně užívány při náhradě bílkovin a pro další léčebná použití. Například polyethylenglykolovaná adenosindeamináza, například ve formě prostředku AdagenR se užívá k léčení závažných kombinovaných onemocnění s imunodeficiencí, jako SCIDS, polyethylenglykolovaná L-aspargináza, například OncapsparR se užívá k léčení akutní lymfoblastické leukemie ALL a polyethylenglykolovaný interferon-alfa, například Intron(R) A se v současné době nachází ve stadiu klinických zkoušek fáze III pro léčení hepatiti30 dy C.
Shrnutí poznatků v konjugátech PEG a proteinech s klinickým účinkem je možno nalézt v publikaci N. L. Bumham, Am. J. Hosp. Pharm. 15, 210-218, 1994.
Pro polyethylenglykolaci proteinů byla vyvinuta řada postupů. Vazba PEG na reaktivní skupiny proteinu je možno typicky uskutečnit s využitím elektrofilně aktivovaných derivátů PEG. Vazba PEG na alfa- a epsilon-aminoskupiny lysinových zbytků a N-zakončení má za následek vznik konjugátu, tvořeného směsí produktů.
Obvykle je takový konjugát tvořen skupinou několika molekul PEG, vázaných na molekulu proteinu, směs může obsahovat proteiny, zcela prosté PEG až proteiny, v nichž je PEG vázán na každou aminoskupinu. V molekule proteinu s jednoduchou modifikací může být PEG vázán na zbytky aminokyseliny v různých polohách.
Tímto typem nespecifické polyethylenglykolace vzniká řada konjugátů, které jsou téměř neaktivní. Snížení aktivity je obvykle vyvoláno zastíněním aktivní vazné domény bílkovině, k tomu dochází například v případě řady cytokinů a protilátek. Například v publikaci Katre a další, US 4 766 106 a US 4 917 888 se popisuje polyethylenglykolace IFN-beta a IL-2 při použití velkého přebytku methoxypolyethylenglykolyl-N-succinimidylglutarátu a methoxypolyethylenglykolyl50 N-succinimidylsukcinátu. Obě bílkoviny byly produkovány v mikrobiálních hostitelských buňkách, což umožnilo specifické mutace volného cysteinu na serin. Tato mutace byla potřebná pro mikrobiální expresi IFN-beta. IFN-beta, použitý při těchto pokusech byl běžně dodávaný BetaseronR, v němž byl zbytek cysteinu v poloze 17 nahrazen zbytkem šeřinu. Nepřítomnost glykosylace snížila rozpustnost této látky ve vodném roztoku. Při nespecifické polyethylenglykolaci
-2CZ 298597 B6 sice došlo ke zvýšení rozpustnosti, hlavní problém však spočíval ve snížené účinnosti a v nízkém výtěžku.
V evropském patentovém spisu EP 593 868, který se týká konjugátu PEG a interferonu, se popi5 suje příprava konjugátů typu PEG-IFN-alfa. Avšak polyethylenglykolace je v tomto případě nespecifická, takže vzniká směs polohových izomerů těchto konjugátů, podobná situace je popsána také v publikaci Monkarsh a další, ACS Symp. Ser., 680, 207-216, 1997.
V EP 675 201 (Kinstler a další) se popisuje selektivní modifikace N-terminálního zbytku faktoru ío pro růst a vývoj megakaryocytů, MGDF při použití mPEG-propionaldehydu. Tímto způsobem bylo možno dosáhnout reprodukovatelné polyethylenglykolace a farmakokinetiky v každé další šarži. V US 5 711 944 (Gilbert a další) se prokazuje, že je možno dosáhnout polyethylenglykolace IFN-alfa s optimální úrovní účinnosti. V tomto případě však bylo zapotřebí provést pracné čištění pro získání optimálního konjugátu.
Většina cytokinů i dalších bílkovin nemá specifické místo pro spojení s PEG a je tedy pravděpodobné, že vždy budou vznikat různé izomery, které budou zčásti nebo zcela neúčinné, takže dojde ke ztrátě účinnosti celé výsledné směsi.
Bylo by tedy zapotřebí dosáhnout monopolyethylenglykolace bílkovin, která by byla specifická pro určité místo proteinu a tímto způsobem připravit účinné konjugáty.
V publikaci Woghiren a další, Biokonjugate Chem., 4(5): 314-318, 1993 se popisuje syntéza thiolselektivního PEG derivátu pro tento způsob polyethylenglykolace, specifické pro určité místo v proteinu. Bylo prokázáno, že stálý derivát PEG s thiolovou ochrannou skupinou ve formě p-pyridyldisulfidové reaktivní skupiny se specificky váže na volné cysteinové zbytky v proteinu papainu. Nově vytvořená disulfidová vazba mezi papainem a PEG může být rozštěpena za mírných redukčních podmínek, čímž se regeneruje přírodní protein.
Dokument WO 87/00 056 popisuje „selektivně konjugované“ proteiny, avšak polohy připojení PEG jsou zcela nejasné. Patentový spis US 5 206 344 popisuje vazbu PERG na mutein skupiny IL-2, nejde však o selektivní polyethylenglykolaci. Dokument US 5 166 322 popisuje varianty IL-3 a jejich reakce s deriváty PEG. Opět však nejde o selektivní konjugaci.
Podle WO 97/11 957 je možno zlepšit účinnost polypeptidu in vivo tvorbu konjugátu s biologickým polymerem včetně PEG. Specifická účinnost je však nižší než účinnost původního proteinu. Konečně EP 690 127 popisuje modifikované faktory růstu a vývoje megakaryocytů MGDF včetně modifikace PEG. Polymer je vázán na N-terminální zakončení, jde pouze o molekuly MGDF s koncovým místem modifikace.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří způsob postupné vazby polyethylenglykolových skupin PEG na polypep45 tid, postup spočívá v tom, že se nechá reagovat polypeptid s heterobifunkční nebo homobifunkční skupinou PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000, obecného vzorce
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, kde W a X jsou skupiny, nezávisle reagující s aminoskupinou, sulfhydrylovou, karboxylovou nebo hydroxylovou funkční skupinou za vazby skupiny PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000 na polypeptid, načež se nechá reagovat skupina PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000, vázaná na polypeptid, s monofunkční nebo bifunkční skupinou PEG s molekulovou hmotností 100 až 200 000 pro vazbu této monofunkční nebo bifunkční skupiny PEG na volné zakončení skupiny PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000 za vzniku konjugátu typu PEG-polypeptid.
-3CZ 298597 B6
Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněn graf konjugátu PEG a IFN-beta před čištěním při použití kapilární elektroforézy CE.
io Na obr. 2A až 2C je znázorněno čištění uvedeného konjugátu chromatografií na prostředku Superose 12, obr. 2A znázorňuje situaci po prvním průchodu, obr. 2B situaci po druhém průchodu a obr. 2C situaci po třetím průchodu.
Na obr. 3 je znázorněna chromatografíe čištěného konjugátu PEG-IFN-beta po třetím průchodu chromatografickým sloupcem pomocí SDS-PAGE. Dráhy 1 a 4 jsou standardy pro molekulovou hmotnost proteinu, dráha 2 je dráha pro přírodní IFN-beta a v dráze 3 se nachází konjugát PEG-IFN-beta.
Na obr. 4 je uveden graf čištěného konjugátu PEG-IFN-beta, v němž byl IFN-beta polyethylen20 glykolován při použití mPEG-OPSS5k, při použití kapilární elektroforézy CE.
Na obr. 5 je znázorněno spektrum čištěného konjugátu při provádění spektrometrie (Maldi).
Na obr. 6 je znázorněno srovnání mezi protivínovým účinkem nativního IFN-beta a konjugátu
PEG-IFN-beta. Buňky WISH byly inkubovány s uvedenými koncentracemi vzorku IFN-beta 24 hodin před uvedením do styku s cytopathickou dávkou viru vesiculámí stomatitidy. Cytopatický účinek byl stanoven po dalších 48 hodinách přeměnou MTT.
Na obr. 7 je znázorněn profil vazby IFN-beta a PEG-IFN při použití buněk Daudi.
Na obr. 8 je znázorněn farmakokinetický profil IFN-beta a PEG-IFN u myší po nitrožilním podání. Přerušovaná čára znamená zkoušku LOQ pro každou standardní křivku.
Na obr. 9 je znázorněn farmakokinetický profil IFN-beta a PEG-IFN u myší při podkožním podání. Přerušovaná čára znázorňuje zkoušku FOQ pro každou standardní křivku.
Vynález je založen na zjištění, že při napojení polyolové skupiny, zvláště PEG skupiny na Cys17 lidského IFN-beta neočekávaně dochází ke zvýšení biologicky účinného IFN-beta ve srovnání s přírodním lidským interferonem-beta nebo alespoň nedochází ke snížení účinnosti.
To znamená, že při uvedené konjugaci má výsledný konjugát stejnou nebo zvýšenou biologickou účinnost ve srovnání s původním IFN-beta a současně má jiné žádoucí vlastnosti polyolu, například zvýšenou rozpustnost.
Pod pojmem „IFN-beta“ se v průběhu přihlášky rozumí interferon z lidských fibroblastů, který se získává izolací z biologických tekutin nebo rekombinantní technikou s použitím DNA z prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk a také soli tohoto interferonu, jeho funkční deriváty, prekurzory a účinné frakce za předpokladu, že tyto látky obsahují cysteinový zbytek, který se v přírodní formě nachází v poloze 17.
Polyolová skupina v konjugátu polyolu a IFN-beta podle vynálezu může být jakákoliv ve vodě rozpustná mono- nebo bifunkční polyalkylenoxidová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Typicky je použitím polyolem polyalkylenglykol, jako polyethylenglykol PEG. Je zřejmé, že je možno použít i jiné polyoly, jako polypropylenglykol a také kopolymery polyethylenglyko55 lu a polypropylenglykolu.
-4CZ 298597 B6
V průběhu přihlášky se pod pojmem „skupina PEG“ rozumí lineární i rozvětvený PEG, methoxy PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelný PEG, PEG s reaktivními skupinami v průběhu řetězce, dendrimer PEG, kopolymery PEG s jedním nebo větším počtem dalších polyolů a také kopolymery PEG a PLGA, to znamená kyselinou polymléčnou a polyglykolovou.
Pod pojmem „soli“ se v průběhu přihlášky rozumí soli, vytvořené na karboxylové skupině a také soli, vytvořené na aminoskupině. Tyto soli je možno připravit známým způsobem. Soli na karboxylové skupině zahrnují anorganické soli, jako soli sodné, draselné a vápenaté a také soli s orga10 nickými bázemi, například s aminy, jako triethanolaminem, argininem nebo lysinem. Soli na aminoskupině zahrnují například soli s anorganickými kyselinami, jako kyselinou chlorovodíkovou a soli s organickými kyselinami, jako kyselinou octovou.
Pod pojmem „funkční deriváty“ se v průběhu přihlášky rozumí deriváty, které je možno připravit z funkčních skupin na postranních řetězcích aminokyselin nebo na terminálních N- nebo C-koncových skupinách pomocí známých postupů a do rozsahu vynálezu spadají tyto funkční deriváty v případě, že jsou farmaceuticky přijatelné, to znamená, že nenarušují účinnost proteinu a nejsou toxické. Takovými deriváty jsou například estery nebo alifatické amidy karboxylových skupin aN-acylové deriváty volných aminoskupin nebo O-acylové deriváty volných hydroxylových skupin, vytvořené na acylových skupinách, například na alkanoylových nebo aroylových skupinách.
Pod pojmem „prekurzory“ se rozumí sloučeniny, které je možno převést nebo které jsou převáděny na IFN-beta v lidském nebo živočišném organismu.
„Aktivní frakce“ proteinu jsou podle vynálezu takové fragmenty nebo prekurzory polypeptidového řetězce, které jako takové nebo v kombinaci s příbuznými molekulami mají stejnou účinnost jako IFN-beta. Molekuly, použití pro kombinaci mohou být například zbytky cukrů nebo fosfátů nebo může jít o agregáty polypeptidových molekul.
Konjugáty podle vynálezu je možno připravit známými postupy. Podle jednoho z možných provedení vynálezu se IFN-beta nechá reagovat s polyethylenglykolačním činidlem ve vhodném rozpouštědle a požadovaný konjugát se izoluje a čistí, například chromatografickými postupy.
Chromatografickým postupem je jakýkoliv postup, který se užívá k oddělení složek směsi nanesením této směsi na nosič nebo stacionární fázi, kterou protéká jako mobilní fáze rozpouštědlo. Dělicí principy chromatografie jsou založeny na odlišné fyzikální povaze stacionární a mobilní fáze.
Některé specifické typy chromatografických postupů, které jsou dobře známé z literatury zahrnují kapalinovou chromatografii, vysokotlakou chromatografií, chromatografií na iontoměniči, absorpční chromatografií, chromatografii afinitní, hydrofobní, dělicí, chromatografií v reverzní fázi, filtraci na gelu, ultrafiltraci nebo chromatografii na tenké vrstvě.
Pod pojmem „thiolreaktivní polyethylenglykolační činidlo“ se v průběhu přihlášky rozumí jakýkoliv derivát PEG, schopný reagovat sthiolovou skupinou cysteinového zbytku. Může jíž například o PEG, obsahující funkční skupinu ze skupiny orthopyridyldisulfidová skupina, vinylsulfonová, maleimidová, jodacetimidová skupina podobné skupiny. Podle výhodného provedení vynálezu je polyethylenglykolačním činidlem derivát orthopyridyl disulfidu OPSS s PEG.
Polyethylenglykolační činidlo se užívá ve své monomethoxylové formě, v níž je pro konjugaci k dispozici pouze jedno zakončení nebo v bifunkční formě, kde se konjugace mohou účastnit obě zakončení, může například dojít ke tvorbě konjugátu s dvěma molekulami IFN-beta, kovalentně vázanými na jedinou skupinu PEG. Molekulová hmotnost je s výhodou v rozmezí 500 až
1 00 0 00.
-5 CZ 298597 B6
Konjugace podle vynálezu typicky probíhá podle následujícího reakčního schématu:
pH<7
Protein-SH -ř mPEG-S-S-1^ /-mPEG-S-S-Protein s' ř-meníiptoethanol
Protein-S-H 4- mPEG-S-H + HOCH2CH2-S-S-CH2CK2OH
Ve druhém řádku svrchu uvedeného schématu se uvádí postup pro rozštěpení vazby mezi PEG a proteinem. Derivát mPEG-OPSS je vysoce selektivní pro volné sulfhydrylové skupiny a rychle reaguje při kyselém pH, při němž je IFN-beta stálý. Vysokou selektivnost je možno prokázat při přeměně konjugátu na nativní formu IFN-beta a PEG.
Bylo prokázáno, že disulfidová vazba, která vzniká mezi proteinem a skupinami PEG je stálá v krevním oběhu, může však být rozrušena v po vstupu do buňky. Předpokládá se proto, že tento konjugát, který do buněk nevstupuje bude v oběhu stálý až do svého vyloučení ledvinami.
Je nutno uvést, že svrchu uvedená reakce je specifická pro určité místo, vzhledem k tomu, že ostatní dva cysteinové zbytky, které se nacházejí v polohách 31 a 141 přírodního lidského IFN15 beta, nemohou reagovat s použitím polyethylenglykolačním činidlem vzhledem k tomu, že již jsou součástí disulfidových můstků.
Vynález se rovněž týká způsobu postupné vazby dvou nebo většího počtu skupin PEG na polypeptid. Tento postup je založen na zjištění, že aktivovaný PEG s nižší molekulovou hmotností reaguje úplněji než PEG s vyšší molekulovou hmotností se stericky bráněným reakčním místem na proteinu. Je nutno zajistit, aby nákladné proteiny, užívané k léčebným účelům byly použity ke tvorbě konjugátu s PEG tak, aby se výsledek vyplatil. Mimo to pro snížení glomerulámí filtrace a pro optimalizaci farmakologických vlastností výsledného konjugátu PEG a proteinu by měl mít konjugát vhodný rozměr, ekvivalentní proteinu s molekulovou hmotností 70 000. To znamená, že v případě, že se bude vázat pouze jedna skupina PEG, užije se s výhodou derivát PEG s molekulovou hmotností vyšší než 20 000. V případě, že v místě modifikace existuje sterická zábrana, může reaktivní skupina velké skupiny PEG obtížně dosahovat do místa modifikace a výsledky reakce budou neuspokojivé, zejména bude dosaženo nízkých výtěžků. Výhodný způsob polyethylenglykolace polypeptidu podle vynálezu zvyšuje výtěžek polyethylenglykolace, specifické pro určitou polohu tak, že se nejprve naváže malá heterobifunkční nebo homobifunkční skupina PEG, která vzhledem ke svému poměrně malému rozměru může reagovat i v místech se sterickou zábranou. Pak se na tyto malé skupiny mohou navázat velké molekuly derivátů PEG, čímž je možno dosáhnout vysokého výtěžku požadovaného polyethylenglykolovaného proteinu.
Způsob postupného navázání dvou nebo většího počtu skupin PEG na polypeptid podle vynálezu zahrnuje postup, při němž se nejprve naváže na polypeptid heterobifunkční nebo homobifunkční skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností a pak se naváže monofunkční nebo bifunkční skupina PEG na volné zakončení této skupiny, která již je vázána na polypeptid. Tímto způsoben je postupně možno navázat na polypeptid dvě nebo větší počet skupin PEG. Polypeptidem je s výhodou IFN-beta, výhodným místem pro vazbu je Cys17, uložený v místě se sterickou zábranou. Výsledný konjugát je možno čistit při použití jednoho nebo většího počtu čisticích postupů, jako jsou chromatografíe na iontoměniči, chromatografíe na gelu s vyloučením molekul s určitou molekulovou hmotností, hydrofobní interakční chromatografíe, afinitní chromatografíe a chromatografie v reverzní fázi.
-6CZ 298597 B6
Skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností může být vyjádřena obecným vzorcem
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, kde W a X jsou skupiny, které nezávisle reagují s aminoskupinou, sulfhydrylovou skupinou, karboxylovou skupinou nebo hydroxylovou funkční skupino, čímž dochází k vazbě skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid. W a X se s výhodou nezávisle volí ze skupiny orthopyridyldisulfid, maleimidy, vinylsulfony, iodacedamidy, aminy, thioly, karboxylové skupiny, aktivní esteiy, benzotriazoluhličitany, p-nitrofenolkarbonáty, izokyanáty a biotin. Skupiny
PEG s nízkou molekulovou hmotností mají s výhodou molekulovou hmotnost v rozmezí 100 až 5000.
Monofunkční a bifunkční skupiny PEG pro vazbu na volné zakončení skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností, které jsou již vázány na polypeptid, mají s výhodou molekulovou hmot15 nost v rozmezí 100 až 200 000, s výhodou jde o methoxy PEG, rozvětvené typy PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelné skupiny PEG, skupiny PEG s reaktivními skupinami v průběhu řetězce je možno vyjádřit obecným vzorcem
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z kde Y je skupina, reaktivní vzhledem ke koncové skupině volného zakončení skupiny PEG s molekulovou hmotností 100 až 5 000, vázané na polypeptid a Z znamená skupinu -OCH3 nebo skupinu, reaktivní se skupinou X za vzniku bifunkčního konjugátu.
Konjugát PEG a polypeptidu, získaný svrchu uvedeným způsobem postupné vazby dvou nebo většího počtu skupin PEG může být použit při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch, při nichž se jako účinná látka při léčení používá polypeptid.
Součást podstaty vynálezu tvoří také konjugáty v čištěné formě, které jsou vhodné pro použití jako součást farmaceutického prostředku, jako účinná složka pro léčení některých chorob, k diagnostice bakteriálních a virových infekcí a také autoimunitních onemocnění, zánětlivých chorob a nádorů. Farmaceutický prostředek tohoto typu rovněž tvoří součást podstaty vynálezu.
Jako příklady svrchu uvedených chorob lze uvést zejména septický šok, AIDS, reumatoidní arthritis, lupus erythematosus a roztroušenou sklerózu.
Konjugáty, připravené způsobem podle vynálezu, je tedy možno podávat ve farmaceuticky účinném množství nemocným, kteří jsou ohroženy některými ze svrchu uvedených onemocnění vyskytlo.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu je možno podávat jakýmkoliv způsobem, který je kompatibilní s účinnou složkou tohoto prostředku. Výhodné je parenterální podání, například podání podkožní, nitrosvalové nebo nitrožilní. Dávka účinné látky závisí na různých faktorech, zejména na věku, hmotnosti a celkovém stavu nemocného a vždy ji určí ošetřující lékař.
Předpokládá se dávka v rozmezí 10 mikrogramů až 1 mg denně pro nemocného s hmotností 75 kg, výhodná denní dávka se bude pohybovat v rozmezí 20 až 200 mikrogramů.
Farmaceutický prostředek pro parenterální podání může být připraven v injekční formě, která obsahuje účinnou složku a vhodné nosné prostředí. Tato prostředí jsou v oboru známá, jde např.
o vodu, fyziologický roztok chloridu sodného, Ringerův roztok a/nebo roztok dextrózy. Nosné prostředí může obsahovat malá množství pomocných látek k udržení stálosti a osmotického tlaku farmaceutického prostředku. Tyto lékové formy se připravují obvyklým způsobem.
-7 CZ 298597 B6
Vynález byl svrchu popsán v souvislosti s několika specifickými provedeními, je však zřejmé, že vynález zahrnuje také různé modifikace a obvyklé změny postupů, které by mohl provést každý odborník.
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava konjugátu PEG-IFN-beta
Modifikace IFN-beta s použitím mPEG5k-OPSS
Pro přípravu konjugátu PEG-IFN-beta byl užit rekombinantní lidský IFN-beta, stálý při koncentraci 0,37 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,6. Postup se provádí tak, že se přibližně 1,0 ml 6M roztoku močoviny přidá ke 2 ml IFN-beta v koncentraci 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 χ 10’8 mol). Pak se přidá mPEG5k-OPSS v molámím přebytu 50 mol najeden mol IFN-beta a reakce se nechá probíhat v polypropylenové lahvičce 2 hodiny při teplotě 37 °C nebo 1 hodinu při teplotě 50 °C. Reakční směs se analyzuje pomocí kapilární elektroforézy CE ke zjištění rozsahu tvorby konjugátu PEG-IFN-beta před jakýkoliv čištěním, jak je znázorněno na obr.
1. Typický výtěžek této reakce je 50% PEG-IFN-beta. Reakční produkty se z reakční směsi odfiltrují při použití filtru ve formě injekční stříkačky s průměrem 0,22 m a zfiltrovaný roztok se pak nanese na sloupec pro oddělení látek od určité molekulové hmotnosti, náplň sloupce tvoří Superose 12 nebo Superdex 75 (Pharmacia), jako eluční činidlo se užije pufr s obsahem 50 mM fosfátu sodného a 150 mM NaCl o pH 7,0. Na obr. 2A je znázorněn profil eluce při čištění uvedeného konjugátu na sloupci s obsahem prostředku Superose 12. Materiál s obsahem požadovaného konjugátu byl analyzován pomocí SDS-PAGE, jak je znázorněno na obr. 3. Frakce, obsahující uvedený konjugát byly spojeny a koncentrát byl znovu nanesen na obdobný sloupec k dalšímu čištění konjugátu vzhledem k velké blízkosti frakci s obsahem nativního IFN-beta, jak je znázorněno na obr. 2B. Tento postup byl ještě po třetí opakován k zajištění dostatečné čistoty, jak je znázorněno na obr. 2C. Na obr. 4 a 5 jsou pak znázorněny výsledky kapilární elektroforézy a hmotové spektrum (Maldi) čištěného konjugátu PEG-IFN-beta.
Modifikace IFN-beta s použitím mPEG30K-OPSS
Rekombinantní lidský IFN-beta byl připraven jako stálá látka v roztoku při koncentraci 0,36 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,6. Postup byl prováděn tak, že se přibližně 36 mg mPEG30K-OPSS ve 3 ml deionizované vody přidá ke 3 ml IFN-beta s koncentrací 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4,9 χ 10'8 mol) a reakce probíhala v polypropylenové lahvičce 2 hodiny při teplotě 50 °C. Pak byla reakční směs analyzována na rozsah modifikace pomocí kapilární elek45 troforézy. Typický výtěžek této reakce je nižší než 30 %. Roztok pak byl nanesen na sloupec s obsahem prostředku Superose 12 (Pharmacia), jako eluční činidlo byl užit pufr s obsahem 5 mM fosfátu sodného a 150 mM NaCl o pH 7,0. Frakce s obsahem konjugátu byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE.
-8CZ 298597 B6
Příklad 2
Biologická účinnost konjugátu
Aby bylo možno stanovit účinky polyethylenglykolace na protivirovou účinnost lidského rekombinantního IFN-beta, byly lidské amniotické buňky WISH předem inkubovány s čerstvě připraveným IFN-beta ze stejné šarže, která byla užita pro polyethylenglykolaci s konjugátem PEG-IFN-beta. Protivirová účinnost byla měřena cytopathickou zkouškou WISH-VSV a byla stanovena na základě antivirového biologického účinku způsobem podle publikace Novick ío a další, J. Immunol., 129: 2244-2247, 1982. Při této zkoušce byly užity následující materiály:
- buňky WISH ATCC CCL 25,
- zásobní virus vesikulámí stomatitidy, ATCC V-520-001-522, skladovaný při -70 °C,
- lidský rekombinantní IFN-beta (InterPharm Laboratories LTD, 32, typu 075, šarže 205035) v množství 28 x 106 IU/ml, specifická účinnost 222 x 106 IU/mg,
- konjugát PEG-IFN-beta, připravený podle příkladu 1, uložený v PBS o pH 7,4,
- růstové prostředí WISH (prostředí MEM s vysokým obsahem glukózy a Earlovou směsí solí + 10 % FBS + 1,0 % L-glutaminu + penicilin/streptomycin (100 j./ml, 100 mikrogramů/ml),
- prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH (prostředí MEM s vysokým obsahem glu25 kozy a Earlovou směsí solí + 5 % FBS + 1,0 % L-glutaminu + penicilin/streptomycin (100 j./ml,
100 mikrogramů/ml),
- MTT v koncentraci 5 mg/ml v PBS, skladování při -70 °C.
Zkouška byla provedena následujícím způsobem.
Vzorky IFN-beta byly zředěny na dvojnásobnou výchozí koncentraci v prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH.
Vytvoří se trojnásobné zředění vzorků IFN-beta v prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH na plotně s 96 plochými vyhloubeními, takže každé vyhloubení obsahuje 50 μΐ zředěného vzorku IFN-beta, do kontrolních vyhloubení se uloží pouze 50 μΐ prostředí.
Buňky WISH se v růstové log fázi oddělí roztokem trypsinu a EDTA, promyjí se prostředím k provedení zkoušky a upraví na konečnou koncentraci 0,8 x 106 buněk/ml.
Do každého vyhloubení se přidá 50 μΐ suspenze buněk WISH, to znamená 4 x 104 buněk najedno vyhloubení. Konečná koncentrace IFN-beta, jíž jsou vystaveny buňky, je nyní předem určená koncentrace.
Po inkubaci 24 hodin v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého v inkubátoru s vysokým obsahem vlhkosti se přidá do každého vyhloubení 50 μΐ zásobního VSV v ředění 1:10 v prostředí k provedení zkoušky, jde o předem určenou dávku, která rozruší 100 % buněk WISH v průběhu 48 hodin, materiál se nepřidává do kontrolních vyhloubení bez viru, do nichž se přidá pouze stejný objem prostředí pro provedení zkoušky.
Po dalších 48 hodinách se do všech vyhloubení přidá 25 μΐ roztoku MTT, načež se buňky inkubují ještě 2 hodiny v inkubátoru.
-9CZ 298597 B6
Pak se obsah vyhloubení odstraní převrácením plotny a do každého vyhloubení se uloží 200 μΐ 100% ethanolu.
Po 1 hodině se plotny odečítají při vlnové délce 595 nm při použití systému Soft max Pro 5 (software) a spektrofotometru Spectramax (Molecular Devices).
Tabulka 1. Protivirová účinnost polyethylenglykolového vzorku IFN-beta a vzorku se simulovanou polyethylenglykolací.
| Vzorek IFN-beta* | ec50** |
| Konjugát PEG-IFN-beta | 3,9 + 0,7 pg/ml |
| IFN-beta | 16,4 + 1,0 pg/ml |
* Koncentrace zásobního roztoku ve vzorcích IFN-beta byla stanovena analýzou aminokyselin ** EC50 (± směrodatná odchylka, S.D.) byla stanovena pomocí softwaru Microcal Origin 4.1.
Jak je shrnuto na obr. 6 a v tabulce 1, udržuje si konjugát PEG-IFN-beta úroveň protivirové účinnosti, která je vyšší než protivirová účinnost čerstvě připravené původního IFN-beta. Pozorování, že získaný konjugátu má přibližně 4krát vyšší biologickou účinnost než čerstvě připravený IFN-beta, může také být důsledkem zvýšené stálosti konjugátu ve srovnání s přírodním IFN20 beta po přidání těchto látek do prostředí k provedení zkoušek s buňkami WISH.
Příklad 3
Zkoušky in vivo na relativní účinnost vzorků PEG-IFN
Relativní biologická účinnost PEG-IFN-beta s molekulovou hmotností PET 30 000 byla stanovena s použitím buněk WISH podle příkladu 2, získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 2. Byly provedeny 3 nezávislé zkoušky třemi odlišnými pracovníky v odlišných časech.
Tabulka 2. Relativní protivirová účinnost PEG-IFN-beta
| Relativní účinnost (3 zkoušky) | Interferonu* | |||
| Vzorek | Zkouška 1 | Zkouška | 2 Zkouška 3 | Průměr (S.D.) |
| PEG(30000)- | 3,2krát | 3,Ikrát | 1,8krát | 3,0x(0,78) |
| IFN-beta | vyšší | vyšší | vyšší | vyšší |
| PEG(2x20000)- | 4,2krát | 1,3krát | 0,85krát | 2,lx(l,8) |
| IFN-beta | vyšší | vyšší | vyšší | vyšší |
EC50 ve srovnání se standardem IFN-beta pro každou zkoušku ** Srovnání je založeno na koncentraci IFN-beta 330 pg/ml.
-10CZ 298597 B6
Pomocí AAA byly stanoveny zásobní koncentrace pro PEG (30 000)-IFN-beta 5,41 pg/ml a pro PEG (2x20 000)-IFN-beta 6,86 pg/ml.
Vazba PEG-IFN-beta na buněčné receptory byla vyhodnocena v přítomnosti předem určeného množství 125I-IFN-alfa2a. IFN-alfa2a byl radioaktivně značen 125I při použití chloraminu T. Značený interferon byl oddělen od volného jodu průchodem reakčních složek sloupcem s obsahem prostředku Sephadex G25 s následným spojením frakcí, obsahující bílkovinu (Pharmacia). Množství značeného interferonu bylo stanoveno kvantitativně zkouškám EFISA (Biosource, ío USA) a byla stanovena specifická aktivita. Buňky Daudi byly vypěstovány a sklizeny v exponenciální fázi a 2 x 106 buněk bylo inkubováno 3 hodiny s 0,5 mM 125I-IFN-alfa2a při teplotě místnosti v přítomnosti různých koncentrací PEG-IFN-beta nebo IFN-alfa2a v pufru k provedení zkoušky, jde o prostředí RPMI 1640, obsahující 2 % fetálního telecího séra a 0,1 % azidu sodíku. Na konci inkubace byl buněčný materiál odstředěn přes vrstvu ftalátového oleje a radioaktivita, vázaná na buněčný materiál byla stanovena počítačem gamma-záření. Vazba PEG (30 000)IFN-beta a PEG (2x20 000)-IFN-beta na receptor byla velmi podobná vazbě IFN-beta, jak je znázorněno na obr. 7.
Mimo to byla stanovena relativní účinnost na buňkách Daudi (buňky lidského lymfomu B) při zkoušce na zástavu proliferace, jak je uvedeno v tabulce 3. Všechny typy interferonu byly rozpouštěny ve dvojnásobné koncentraci 200 ng/ml. Vzorky byly 3krát zředěny v průběhu délky plotny v konečném objemu 100 μΐ. Do každého vyhloubení bylo uloženo 1 x 105 buněk v objemu 100 μΐ a buňky byly inkubovány v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou celkem 72 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti oxidu uhličitého. Po 48 hodinách byl přidán do vyhloubení triciovaný 3H-thymidin v množství 1 pCi/vyhloubení v objemu 20 μΐ. Na konci inkubace, trvající 72 hodin byl obsah ploten odebrán při použití zařízení Tomtek Plate Harvester. Výsledky, shrnuté v tabulce 3, prokazují, že po polyethylenglykolaci nedošlo k žádné prokazatelné ztrátě účinnosti IFN. Ve skutečnosti byla účinnost konjugátu o něco vyšší než účinnost volného IFN-beta. Toto pozorování může být způsobeno tvorbou neúčinných agregátů ve volném IFN nebo také rozdílem v použitých metodách (analýza aminokyselin pro vzorky PEG-IFN a HPLC v reverzní fázi pro IFN-beta).
Tabulka 3: Zkouška na inhibici proliferace, buňky Daudi
| Dávka IC50* | Vzestup proti IFN | |
| IFN-beta (plotna 1) | 1153,1 | - |
| PEG(30000) -IFN(71 A) | 695,6 | 1,6x |
| IFN-beta (plotna 2) | 1005,8 | - |
| PEG{40000)-IFN (71 B) | 629,4 | l,7x |
Pg/1
- 11 CZ 298597 B6
Příklad 4
Farmakokinetické zkoušky na myších
Nitrožilní podání
Myším bylo podáno 100 ng IFN-beta PEG (3000)-IFN-beta nebo PEG (2x20000)-IFN-beta a krev byla odebírána v předem určených časových intervalech. Pak byly stanoveny koncentrace IFN-beta v krevním séru specifickou zkouškou AFIAS (Toray Industries), výsledky jsou uvedeío ny na obr. 8. Pokus byl prováděn tak, že 28 myších samic kmene B6D2F1 ve stáří 6 až 8 týdnů s hmotností přibližně 20 g bylo rozděleno do 4 skupin následujícím způsobem: skupina 1 obsahovala 9 myší, jimž bylo jednorázově podáno 200 μΐ materiálu s obsahem 500 ng/ml lidského
IFN-beta, konečná dávka byla lOOng/myš. Skupina 2 obsahovala rovněž 9 myší, jimž bylo podáno v objemu 200 μΐ ekvivalentní množství PEG (30000)-IFN-beta. Skupině 3 bylo podáno
200 μΐ ekvivalentního množství PEG(2x20000)-IFN-beta, skupina 4 obsahovala 3 myši jako negativní kontroly. Krevní vzorky v množství přibližně 200 μΐ, byly odebírány v 9 předem určených časových intervalech z retroorbitální žilní pleteně pomocí kapiláry. Krevní vzorky se v průběhu 1 hodiny při teplotě místnosti srazily a pak byly odstředěny v mikroodstředivce. Sérum bylo uloženo při teplotě -70 °C až do zpracování všech vzorků. Pak byla séra podrobena zkouš20 kám na přítomnosti biologicky účinného lidského IFN-beta svrchu uvedenou zkouškou (Toray Industries). Výsledky prokazují, že plocha pod křivkou, AUC je značně zvětšena u vzorků s obsahem PEG-IFN ve srovnání se vzorky s obsahem volného IFN-beta, takže vzorky PEGIFN mají zřejmě vyšší účinnost ve srovnání s volným IFN-beta, mimo to je výsledek pro PEG (2x20000) - IFN-beta vyšší ve srovnání s výsledkem pro PEG (30000) - IFN-beta.
Podkožní podání
Myším byl podkožně podán IFN-beta a PEG-IFN v dávce 100 mg/myš. Na obr. 9 je znázorněno, že celková plocha pod křivkou AUC je podstatně zvětšena pro vzorky PEG-IFN ve srovnání se vzorky, které obsahovaly volný IFN-beta. Farmakokinetické zkoušky jsou v souladu s těmito poznatky, vzorky s obsahem PEG-IFN mají delší biologický poločas a zvýšenou AUC.
Příklad 5
Vazba skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid Vazba interferonu-beta na OPSS-PEG2k-hydrazid
O „ . II
Frotem-S-S-PEGiK-C-NH-NHí
Rekombinantní lidský interferon-beta se připraví v roztoku v koncentraci 0,33 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,8. Pak se přibližně 3,6 mg (přebytek 40 ml na 1 mol bílkoviny) heterobifunkčního reakčního činidla pro zavedení PEG, OPSS-PEG2k-hydrazidu ve 2 ml deionizované vody přidá ke 2 ml IFN-beta s koncentrací 0,33 mg/ml (celkem 0,99 mg) a reakce se nechá probíhat v polypropylenové nádobce 1 hodinu při teplotě 45 °C. Pak se reakční směs analyzuje kapilární elektroforézou ke stanovení rozsahu modifikace. Typické výtěžky se pohybují v rozmezí 90 až 97 % v závislosti na čistotě interferonu B a reakčního činidla pro zavedení PEG. Pak byl roztok nanesen na sloupec, naplněný materiálem Superdex 75 (Pharmacia), k eluci byl užit pufr s 5 mM fosfátem sodným a 150 mM chloridem sodným o pH 7,0. Frakce s obsahem
-12CZ 298597 B6 požadovaného materiálu byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE. Frakce s obsahem monopolyethylenglykolovaného interferonu-beta byly spojeny a užity v dalším stupni pro modifikaci PEG s vysokou molekulovou hmotností.
Vazba interferonu-beta na (OPSS)2-PEG34oo
Rekombinantní lidský interferon-beta byl připraven v koncentraci 0,33 mg/ml v 50 mM pufru s acetátem sodným o pH 3,8. Pak bylo přibližně 6,1 mg (přebytek 40 mol na 1 mol bílkoviny) homobifunkčního reakčního činidla pro zavedení PEG, (OPSS)2-PEG34oo ve 2 ml deionizované vody přidáno ke 3 ml interferonu-beta s koncentrací 0,33 mg/ml (celkové množství 0,99 mg), reakce probíhala 2 hodiny v polypropylenové nádobce při teplotě 50 °C. Reakce byla sledována za neredukujících podmínek na SDS-PAGE, výsledná reakční směs byla analyzována kapilární elektroforézou ke stanovení rozsahu modifikace. Typická modifikace při této reakci s interferonem-beta byla více než 95 %. Výsledný roztok byl nanesen na sloupec s náplní Superdex 75 (Pharmacia), k eluci byl užit pufr s 50 mM fosfátem sodným a 150 mM chloridem sodným opH 7,0. Příslušné frakce byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE, frakce, obsahující monopolyethylenglykolovaný interferon-beta byly spojeny.
Příklad 6
Vazba druhé skupiny PEG na polyethylenglykolovaný polypeptid s obsahem PEG s nízkou molekulovou hmotností
Modifikace IFN-S-S-PEG2k-hydrazidu působením mPEG30k-aldehydu, ALD í
Protew-S-S-PEGjfc—C^NH-NHT
O + r—\ - - i!
0 1-1/ rrotea-S-S-PSG^-C-NH-NCK-niPEGjoK ii mPEGioK^CHjCHjCH
Ke spojeným frakcím IFN-S-S-PEG2k-hydrazidu z příkladu 5 se přidá mPEG3ok-ALD v přebytku 20 ml na 1 mol proteinu. Reakce probíhala při teplotě místnosti 25 °C celkem 4 hodiny, vzorek reakční směsi se pak uloží na vrchol sloupce s náplní Superose 6 (Pharmacia) ke stanovení výtěžku modifikace. Tento výtěžek při uvedené reakci je typicky vyšší než 80 % v závislosti na čistotě reakčního činidla pro zavedení PEG a na reakčních podmínkách.
Vynález byl popsán na základě svých některých provedení, je však zřejmé, že by bylo možno zvolit ještě širokou škálu ekvivalentních parametrů, jako je koncentrace a další reakční podmín35 ky, které by rovněž spadaly do rozsahu vynálezu.
Bylo by však možno uskutečnit ještě řadu dalších modifikací. Vynález proto zahrnuje jakékoliv variace, použití nebo změny, které jsou založeny na principech vynálezu a u nichž jde pouze o běžné úpravy, které může uskutečnit běžný odborník.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob postupné vazby polyethylenglykolových skupin PEG na polypeptid, vyzn ač u5 jící se t í m , že se nechá reagovat polypeptid a heterobifunkční nebo homobifunkční skupinou PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000, obecného vzorceW-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, ío kde W a X jsou skupiny, nezávisle reagující s aminoskupinou, sulfhydrylovou, karboxylovou nebo hydroxylovou funkční skupinou za vazby skupiny PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000 na polypeptid, načež se nechá reagovat skupinou PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000, vázaná na polypeptid, s monofunkční nebo bifunkční skupinou PEG s molekulovou hmotností 100 až 200 000 pro vazbu této monofunkční nebo bifunkční skupiny PEG na volné zakon15 čení skupiny PEG s molekulovou hmotností 100 až 5 000 za vzniku konjugátu typu PEG-polypeptid.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se užije monofunkční nebo bifunkční skupina PEG obecného vzorceY-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z kde Y je skupina, reaktivní vzhledem ke koncové skupině volného zakončení skupiny PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000, vázané na polypeptid a Z znamená skupinu -OCH3 nebo25 skupinu, reaktivní se skupinou X za vzniku bifunkčního konjugátu.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako monofunkční nebo bifunkční skupina PEG užije methoxy PEG, rozvětvená PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelná PEG, PEG s funkčními skupinami podél řetězce nebo dendrimer PEG.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se W a X v obecném vzorci definovaném v nároku 1 nezávisle volí ze skupiny orthopyridyldisulfid, maleimidy, vinylsulfony, jodacetamidy, hydrazidy, aldehydy, sukcinimidylestery, epoxidy, aminy, thioly, karboxylové skupiny, aktivní estery, benzotriazolkarbonáty, p-nitrofenolkarbonáty, izokyanáty a biotin.
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako skupina PEG s molekulovou hmotností 100 až 5000 a/nebo monofunkční nebo bifunkční skupina PEG užije kopolymer polyethylenglykolu.40
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se použije kopolymer polyethylenglykolu volí ze skupiny kopolymerů polyethylenglykolu a polypropylenglykolu a kopolymerů polyethylenglykolu a kyseliny polymléčné/polyglykolové.
- 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se po postupné vazbě dvou45 skupin PEG za sebou na polypeptid konjugát PEG a polypeptidu dále čistí.
- 8. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se tím, že čištění zahrnuje jeden nebo větší počet čisticích postupů, které se volí ze skupiny chromatografie na iontoměniči, chromatografie na gelu s vyloučením látek od určité molekulové hmotnosti, chromatografie s hydrofobní inter50 akcí, afínitní chromatografie a chromatografie v reverzní fázi.
- 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se jako polypeptid užije interferon-beta.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8333998P | 1998-04-28 | 1998-04-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ298597B6 true CZ298597B6 (cs) | 2007-11-21 |
Family
ID=22177687
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20050048A CZ298597B6 (cs) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid |
| CZ20003995A CZ298579B6 (cs) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | Konjugát polyolu a interferonu-beta |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20003995A CZ298579B6 (cs) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | Konjugát polyolu a interferonu-beta |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6638500B1 (cs) |
| EP (2) | EP1075281B1 (cs) |
| JP (2) | JP4574007B2 (cs) |
| KR (1) | KR100622796B1 (cs) |
| CN (2) | CN1187094C (cs) |
| AR (1) | AR020070A1 (cs) |
| AT (2) | ATE275422T1 (cs) |
| AU (1) | AU762621B2 (cs) |
| BG (2) | BG65046B1 (cs) |
| BR (1) | BR9910023A (cs) |
| CA (2) | CA2565375A1 (cs) |
| CY (1) | CY1108022T1 (cs) |
| CZ (2) | CZ298597B6 (cs) |
| DE (2) | DE69920002T2 (cs) |
| DK (2) | DK1421956T3 (cs) |
| EA (2) | EA200300382A1 (cs) |
| EE (1) | EE05214B1 (cs) |
| ES (2) | ES2285286T3 (cs) |
| HK (2) | HK1038194A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0300548A3 (cs) |
| IL (1) | IL139286A (cs) |
| NO (2) | NO329749B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ507456A (cs) |
| PL (2) | PL196533B1 (cs) |
| PT (2) | PT1421956E (cs) |
| SI (2) | SI1421956T1 (cs) |
| SK (2) | SK286654B6 (cs) |
| TR (2) | TR200003161T2 (cs) |
| TW (2) | TWI266800B (cs) |
| UA (2) | UA79430C2 (cs) |
| WO (1) | WO1999055377A2 (cs) |
Families Citing this family (79)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| US7220717B2 (en) | 1997-08-14 | 2007-05-22 | Yeda Research And Development Company Ltd. | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use |
| US7704944B2 (en) | 1997-08-14 | 2010-04-27 | Yeda Research And Development Company Ltd. | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis |
| IL121860A0 (en) | 1997-08-14 | 1998-02-22 | Yeda Res & Dev | Interleukin-18 binding proteins their preparation and use |
| EP2599503B1 (en) | 1998-10-16 | 2017-05-17 | Biogen MA Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof |
| IL142350A0 (en) * | 1998-10-16 | 2002-03-10 | Biogen Inc | Interferon-beta fusion proteins and pharmaceutical compositions containing the same |
| US7238368B2 (en) * | 1999-04-23 | 2007-07-03 | Alza Corporation | Releasable linkage and compositions containing same |
| EP1880736A1 (en) * | 1999-04-23 | 2008-01-23 | Alza Corporation | Releasable linkage and composition containing same |
| US7303760B2 (en) * | 1999-04-23 | 2007-12-04 | Alza Corporation | Method for treating multi-drug resistant tumors |
| US7431921B2 (en) | 2000-04-14 | 2008-10-07 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules |
| US6531122B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
| US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
| TR200101086A3 (cs) * | 1999-10-15 | 2001-08-21 | ||
| JP4593048B2 (ja) | 1999-12-24 | 2010-12-08 | 協和発酵キリン株式会社 | 分岐型ポリアルキレングリコール類 |
| AR027509A1 (es) | 2000-01-10 | 2003-04-02 | Maxygen Aps | Conjugados g-csf |
| AU783512B2 (en) | 2000-02-11 | 2005-11-03 | Bayer Healthcare Llc | Factor VII or VIIa-like molecules |
| DE60236796D1 (de) | 2001-01-30 | 2010-08-05 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Verzweigte polyalkylenglykole |
| EP1234583A1 (en) | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| MXPA03007619A (es) | 2001-02-27 | 2003-12-04 | Maxygen Aps | Nuevas moleculas similares a interferon beta. |
| JP4444652B2 (ja) | 2001-07-11 | 2010-03-31 | マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド | Ｇ−ｃｓｆ結合体 |
| CA2473526C (en) | 2002-01-18 | 2013-10-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Polyalkylene polymer compounds and uses thereof |
| TWI334785B (en) | 2002-06-03 | 2010-12-21 | Serono Lab | Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race |
| WO2004020468A2 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
| US8129330B2 (en) * | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
| GEP20084486B (en) * | 2002-12-26 | 2008-09-25 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency |
| JP2006519170A (ja) * | 2002-12-26 | 2006-08-24 | マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ポリペプチドホルモン、およびレセプター結合活性が保存されたそのアンタゴニストのポリマー結合体 |
| WO2004083361A2 (en) | 2003-03-20 | 2004-09-30 | Maxygen Holdings Ltd. | FVII OR FVIIa VARIANTS |
| TWI272948B (en) | 2003-05-01 | 2007-02-11 | Ares Trading Sa | HSA-free stabilized interferon liquid formulations |
| GB0316294D0 (en) * | 2003-07-11 | 2003-08-13 | Polytherics Ltd | Conjugated biological molecules and their preparation |
| EP2633866A3 (en) | 2003-10-17 | 2013-12-18 | Novo Nordisk A/S | Combination therapy |
| US8906676B2 (en) * | 2004-02-02 | 2014-12-09 | Ambrx, Inc. | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
| AU2008201682B2 (en) * | 2004-02-02 | 2011-02-24 | Ambrx, Inc. | Modified human interferon polypeptides and their uses |
| EP1586334A1 (en) * | 2004-04-15 | 2005-10-19 | TRASTEC scpa | G-CSF conjugates with peg |
| CA2566364A1 (en) | 2004-05-17 | 2005-11-24 | Ares Trading S.A. | Hydrogel interferon formulations |
| WO2005117949A1 (en) | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Ares Trading S.A. | Stabilized interferon liquid formulations |
| ATE543506T1 (de) | 2004-06-01 | 2012-02-15 | Ares Trading Sa | Methode zur stabilisierung von proteinen |
| TW200633718A (en) * | 2004-12-16 | 2006-10-01 | Applied Research Systems | Treatment of hepatitis c in the asian population |
| ES2357089T5 (es) * | 2004-12-21 | 2014-02-24 | Nektar Therapeutics | Reactivos de tiol polimérico estabilizados |
| CN103520735B (zh) | 2004-12-22 | 2015-11-25 | Ambrx公司 | 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方 |
| MX2007007591A (es) | 2004-12-22 | 2007-07-25 | Ambrx Inc | Metodos para expresion y purificacion de hormona de crecimiento humano recombinante. |
| JP2008525473A (ja) | 2004-12-22 | 2008-07-17 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト成長ホルモン |
| EP1893632B1 (en) | 2005-06-17 | 2015-08-12 | Novo Nordisk Health Care AG | Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine |
| WO2007019331A2 (en) * | 2005-08-04 | 2007-02-15 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of a g-csf moiety and a polymer |
| RS57549B1 (sr) | 2005-08-26 | 2018-10-31 | Ares Trading Sa | Proces za pripremu glikoziliranog interferona beta |
| AU2006286489B2 (en) | 2005-09-01 | 2012-08-09 | Ares Trading S.A. | Treatment of optic neuritis |
| US20070238656A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-11 | Eastman Kodak Company | Functionalized poly(ethylene glycol) |
| EP2444499A3 (en) * | 2006-05-02 | 2012-05-09 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| US20080096819A1 (en) * | 2006-05-02 | 2008-04-24 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| MX2008014685A (es) | 2006-05-24 | 2008-11-27 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Analogos de factor ix con semivida prolongada in vivo. |
| US9925151B2 (en) | 2006-05-24 | 2018-03-27 | Merck Serono Sa | Cladribine regimen for treating multiple sclerosis |
| AU2008247815B2 (en) * | 2007-05-02 | 2012-09-06 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| CA2707840A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| JP5563475B2 (ja) | 2007-12-20 | 2014-07-30 | メルク セローノ ソシエテ アノニム | Ｐｅｇインターフェロン−ベータ製剤 |
| CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
| CN101525381B (zh) * | 2008-03-04 | 2012-04-18 | 北京百川飞虹生物科技有限公司 | 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达 |
| US20100112660A1 (en) * | 2008-05-30 | 2010-05-06 | Barofold, Inc. | Method for Derivatization of Proteins Using Hydrostatic Pressure |
| US20110124614A1 (en) * | 2008-10-25 | 2011-05-26 | Halina Offner | Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders |
| DE102009032179A1 (de) * | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Biogenerix Ag | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
| ES2365343B1 (es) | 2009-11-19 | 2012-07-10 | Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii | Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial. |
| CN102770449B (zh) | 2010-02-16 | 2016-02-24 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 具有降低的vwf结合的因子viii分子 |
| WO2011123813A2 (en) | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Amunix Operating Inc. | Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same |
| AR080993A1 (es) | 2010-04-02 | 2012-05-30 | Hanmi Holdings Co Ltd | Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina |
| EP2569331A1 (en) | 2010-05-10 | 2013-03-20 | Perseid Therapeutics LLC | Polypeptide inhibitors of vla4 |
| JP2013532176A (ja) | 2010-07-15 | 2013-08-15 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 安定化させた第ｖｉｉｉ因子バリアント |
| EP2616486B1 (en) | 2010-09-15 | 2019-01-02 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Factor viii variants having a decreased cellular uptake |
| KR101451357B1 (ko) * | 2011-02-18 | 2014-10-15 | 주식회사 스템디알 | Ｓｉｒｔ１ 발현 유도 물질을 포함하는 패혈증 또는 패혈증 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물 |
| CN103930440A (zh) | 2011-07-01 | 2014-07-16 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 松弛素融合多肽及其用途 |
| CA2850469C (en) * | 2011-10-01 | 2020-07-07 | Glytech, Inc. | Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same |
| CA2865578C (en) | 2012-02-27 | 2023-01-17 | Amunix Operating Inc. | Xten conjugate compositions and methods of making same |
| EP2821079A4 (en) | 2012-02-29 | 2016-05-04 | Toray Industries | MEANS FOR SUPPRESSING BODY CAVITIES |
| BR112015024423B1 (pt) | 2013-03-29 | 2023-04-25 | Glytech, Inc | Polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon ?, composição farmacêutica e uso de um polipeptídeo glicosilado |
| US11759500B2 (en) | 2014-07-24 | 2023-09-19 | Abion Inc. | PEGylated interferon-beta variant |
| WO2016013697A1 (ko) * | 2014-07-24 | 2016-01-28 | 에이비온 주식회사 | 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체 |
| LT3183264T (lt) | 2014-08-19 | 2021-01-11 | Biogen Ma Inc. | Pegilinimo būdas |
| WO2016179007A1 (en) | 2015-05-01 | 2016-11-10 | Allysta Pharmaceuticals, Inc. | Adiponectin peptidomimetics for treating ocular disorders |
| RS60943B1 (sr) * | 2015-06-19 | 2020-11-30 | Eisai R&D Man Co Ltd | Cis80 konjugovani imunoglobulini |
| CN118064414A (zh) * | 2017-04-17 | 2024-05-24 | 科罗拉多州立大学董事会法人团体 | 治疗同型半胱氨酸尿症的酶替代疗法优化 |
| BR112021012472A2 (pt) | 2019-01-28 | 2021-11-30 | Toray Industries | Forma modificada por polietileno glicol de um fator de crescimento de hepatócito ou um fragmento ativo do mesmo, e, medicamento |
| JPWO2020158690A1 (ja) | 2019-01-28 | 2021-12-16 | 東レ株式会社 | 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997011957A1 (en) * | 1995-09-29 | 1997-04-03 | Pharmacia & Upjohn Ab | Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5206344A (en) * | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
| EP0229108B1 (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-27 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US5208344A (en) * | 1987-07-31 | 1993-05-04 | American Home Products Corporation | Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents |
| US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
| US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| NZ276943A (en) | 1993-11-10 | 1998-02-26 | Schering Corp Substituted For | Alpha-interferon conjugated to a non-antigenic polymer (preferably a polyalkylene oxide) and its preparation |
| EP0755263A4 (en) | 1994-03-31 | 2005-02-09 | Amgen Inc | COMPOUNDS AND METHODS FOR STIMULATING MEGAKARYOCYTE GROWTH AND THEIR DIFFERENTIATION |
| CA2190502A1 (en) * | 1994-05-18 | 1995-11-23 | Robert M. Platz | Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| TW517067B (en) * | 1996-05-31 | 2003-01-11 | Hoffmann La Roche | Interferon conjugates |
| US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
| KR0176625B1 (ko) | 1996-11-05 | 1999-04-01 | 삼성전자주식회사 | 적외선 물체검출장치 |
| JP2001508783A (ja) * | 1997-01-29 | 2001-07-03 | ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー | Ｐｅｇ化法 |
| ES2297889T3 (es) * | 1997-07-14 | 2008-05-01 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas. |
| US6307024B1 (en) * | 1999-03-09 | 2001-10-23 | Zymogenetics, Inc. | Cytokine zalpha11 Ligand |
| US6531122B1 (en) * | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
-
1999
- 1999-04-28 CZ CZ20050048A patent/CZ298597B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 SK SK66-2007A patent/SK286654B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 AT AT99920094T patent/ATE275422T1/de active
- 1999-04-28 PT PT04003053T patent/PT1421956E/pt unknown
- 1999-04-28 EA EA200300382A patent/EA200300382A1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 DE DE69920002T patent/DE69920002T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 EP EP99920094A patent/EP1075281B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 PL PL378728A patent/PL196533B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 PL PL344490A patent/PL193352B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 JP JP2000545574A patent/JP4574007B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 EE EEP200000614A patent/EE05214B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 AU AU37674/99A patent/AU762621B2/en not_active Ceased
- 1999-04-28 SI SI9930974T patent/SI1421956T1/sl unknown
- 1999-04-28 TR TR2000/03161T patent/TR200003161T2/xx unknown
- 1999-04-28 NZ NZ507456A patent/NZ507456A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 PT PT99920094T patent/PT1075281E/pt unknown
- 1999-04-28 WO PCT/US1999/009161 patent/WO1999055377A2/en active IP Right Grant
- 1999-04-28 EP EP04003053A patent/EP1421956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 SI SI9930662T patent/SI1075281T1/xx unknown
- 1999-04-28 KR KR1020007011587A patent/KR100622796B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 UA UA20031212655A patent/UA79430C2/uk unknown
- 1999-04-28 AT AT04003053T patent/ATE365563T1/de active
- 1999-04-28 CN CNB998054968A patent/CN1187094C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-28 DK DK04003053T patent/DK1421956T3/da active
- 1999-04-28 TR TR2001/01751T patent/TR200101751T2/xx unknown
- 1999-04-28 SK SK1622-2000A patent/SK286217B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 ES ES04003053T patent/ES2285286T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 HU HU0300548A patent/HUP0300548A3/hu unknown
- 1999-04-28 ES ES99920094T patent/ES2224649T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 CA CA002565375A patent/CA2565375A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-28 IL IL13928699A patent/IL139286A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 CZ CZ20003995A patent/CZ298579B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 CN CNB2004100898478A patent/CN100335503C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-28 DK DK99920094T patent/DK1075281T3/da active
- 1999-04-28 EA EA200001111A patent/EA003789B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 UA UA2000116719A patent/UA66857C2/uk unknown
- 1999-04-28 DE DE69936409T patent/DE69936409T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 CA CA002330451A patent/CA2330451A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-28 BR BR9910023-1A patent/BR9910023A/pt active Search and Examination
- 1999-04-29 AR ARP990101987A patent/AR020070A1/es active IP Right Grant
- 1999-07-26 TW TW093123043A patent/TWI266800B/zh active
- 1999-07-26 TW TW088112596A patent/TWI232882B/zh active
-
2000
- 2000-10-17 BG BG109291A patent/BG65046B1/bg unknown
- 2000-10-17 BG BG104871A patent/BG64694B1/bg unknown
- 2000-10-23 NO NO20005337A patent/NO329749B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-10-30 US US09/698,133 patent/US6638500B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-12-24 HK HK01109037A patent/HK1038194A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-08-28 US US10/649,609 patent/US7357925B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-11-17 HK HK05110273A patent/HK1076115A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-02-13 US US11/674,476 patent/US7700314B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-07-19 CY CY20071100966T patent/CY1108022T1/el unknown
-
2010
- 2010-03-09 NO NO20100324A patent/NO332224B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-04-26 JP JP2010100840A patent/JP2010184929A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997011957A1 (en) * | 1995-09-29 | 1997-04-03 | Pharmacia & Upjohn Ab | Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GOODSON R J ET AL "SITE-DIRECTED PEGYLATION OF RECOMBINANT INTERLEUKIN-2 AT ITS GLYCOSYLATION SITE" BIO/TECHNOLOGY VOL 8 NO 4 01.04.1990 P 343-346 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ298597B6 (cs) | Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid | |
| KR100254097B1 (ko) | 인터페론결합체 | |
| HUT75533A (en) | Improved interferon polymer conjugates | |
| US9840546B2 (en) | Double-stranded polyethylene glycol modified growth hormone, preparation method and application thereof | |
| CN105085658A (zh) | 一种白细胞介素29突变体及聚乙二醇衍生物 | |
| MXPA00010223A (en) | Polyol-ifn-beta conjugates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130428 |