PT1421956E - Processo para a ligação por passos de polietileno glicol ( peg ) a um polipéptido - Google Patents

Processo para a ligação por passos de polietileno glicol ( peg ) a um polipéptido Download PDF

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PT1421956E
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conjugate
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PT04003053T
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Milton Harris
Nabil El Tayar
Michael J Roberts
Wayne Sawlivich
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Serono Lab
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Description

1
DESCRIÇÃO
"PROCESSO PARA A LIGAÇÃO POR PASSOS DE POLIETILENO GLICOL (PEG) A DM POLIPÉPTIDO"
ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com um método para a ligação por passos de duas ou mais unidades de PEG a um polipéptido.
Também são descritos conjugados de poliol-IFN-β em que uma unidade poliol está covalentemente ligada à Cis17 e o processo para a sua produção especifica assim como a sua utilização em terapia, prognóstico ou diagnóstico de infecções bacterianas, infecções virais, doenças autoimunes e doenças inflamatórias.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 interferão do fibroblasto humano (IFN-β) tem actividade antiviral e também pode estimular células assassinas naturais contra células neoplásicas. É um polipéptido com cerca de 20.000 Da induzido por virus e ARN de cadeia dupla. A partir da sequência de nucleótidos do gene para o interferão do fibroblasto, clonado por tecnologia de ADN recombinante, Derynk et al. (Nature, 285:542-547, 1980) deduziram a sequência completa de aminoácidos da proteína. Ela tem um comprimento de 166 aminoácidos. 2
Shepard et al. (Nature, 294:563-565, 1981) descreveram uma mutação na base 842 (Cis - Tir na posição 141) que anulou a sua actividade antiviral, e um clone variante clone com uma delecção dos nucleótidos 1119-1121.
Mark et al. (Proc, Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81 (18):5662-5666, 1984) inseriram uma mutação artificial substituindo a base 469 (T) por (A) provocando uma troca de aminoácido de Cis - Ser na posição 17. 0 lFN-β resultante foi descrito como sendo tão activo como o IFN-β 'nativo' e estável na armazenagem a longo prazo (-70 °C). A ligação covalente do polímero hidrófilo polietileno glicol, (PEG), também conhecido como óxido de polietileno, (PEO), a moléculas tem aplicações importantes em biotecnologia e medicina. Na sua forma mais comum, o PEG é um polímero linear possuindo grupos hidroxilo em cada extremidade:
H0-CH2-CH20 (CH2CH2O) nCH2CH2-OH
Esta fórmula pode ser representada abreviadamente como HO-PEG-OH, onde se pretende que -PEG- represente a cadeia principal do polimero sem os grupos terminais: "-PEG-" Significa "-CH2CH20 (CH2CH20) nCH2CH2- 0 PEG é habitualmente utilizado como metoxi-PEG-OH, (m-PEG), no qual uma extremidade é o grupo metoxilo relativamente inerte, enquanto a outra extremidade é um grupo hidroxilo que é submetido a modificação quimica. 3
CH30- (CH2CH2O) n-CH2CH2-OH
Os PEG ramificados também são de uso corrente. Os PEG ramificados podem ser representados como R(-PEG-OH)m no qual R representa uma unidade essencial central tal como pentaeritritol ou glicerol, e m representa o número de ramificações. O número de ramificações (m) pode variar desde três até cem ou mais. Os grupos hidroxilo são submetidos a modificação quimica.
Outra forma ramificada, tal como a descrita no pedido de patente PCT WO 96/21469, tem uma única extremidade que é submetida a modificação química. Este tipo de PEG pode ser representado como (CH3O-PEG-)PR-X, de acordo com o que p é igual a 2 ou 3, R representa um núcleo central tal como lisina ou glicerol, e X representa um grupo funcional tal como carboxilo que é submetido a activação química. Ainda uma outra forma ramificada, o "PEG pendente", possui grupos reactivos, tais como carboxilo, ao longo da cadeia principal de PEG preferivelmente às extremidades das cadeias de PEG.
Além destas formas de PEG, o polímero também pode ser preparado com ligações fracas ou degradáveis na cadeia principal. Por exemplo, Harris mostrou no Pedido de Patente U.S. 06/026 716 que o PEG pode ser preparado com ligações éster na cadeia principal polimérica que são submetidas a hidrólise. Esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos de peso molecular mais baixo, segundo o esquema reaccional: -PEG-CO2-PEG- + H20 -> -PEG-CO2H + HO-PEG- 4
De acordo com a presente invenção, o termo polietileno glicol ou PEG destina-se a incluir todos os derivados descritos acima.
Os copolimeros de óxido de etileno e óxido de propileno estão relacionados de muito perto com o PEG na sua quimica e podem ser utilizados no lugar de PEG em muitas das suas aplicações. Eles têm a fórmula geral seguinte: HO-CH2CHRO (CH2CHRO) nCH2CHR-OH em que R é H ou CH3. 0 PEG é um polímero útil possuindo a propriedade de solubilidade elevada em água assim como de solubilidade elevada em muitos solventes orgânicos. 0 PEG também é não tóxico e não imunogénico. Quando 0 PEG é quimicamente ligado (PEGilação) a um composto insolúvel em água, o conjugado resultante é geralmente solúvel em água, assim como solúvel em muitos solventes orgânicos.
Os conjugados de PEG-proteína estão a ser presentemente utilizados em terapias de substituição de proteínas e para outras utilizações terapêuticas. Por exemplo, a adenosina-desaminase PEGilada (ADAGEN®) está a ser utilizada para tratar a doença de imunodeficiência combinada grave (SCIDS), a L-asparaginase PEGilada (ONCAPSPAR®) está a ser utilizada para tratar leucemia linfoblástica (ALL) e interferão-α PEGilado (INTRON(R) A) 5 encontra-se nos Estudos de Fase III para tratar a hepatite C.
Para uma revisão geral de conjugados de PEG-proteína com eficácia clinica ver N.L. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218, 1994.
Foi desenvolvida uma variedade de métodos para introduzir grupos PEG em proteínas.
Por exemplo, Goodson R. j. et al., Bio/Technology, Vol. 8, N° 4, 1 de Abril de 1990, páginas 343-346, descrevem a PEGilação dirigida de interleucina-2 recombinante no seu sítio de glicosilação.
Além disso, a WO 98/32466 A relaciona-se com um processo para PEGilação covalente directa de um substrato, compreendendo a reacção de um PEG halogenado com o substrato em que o halogéneo do PEG halogenado actua como um grupo de saída na reacção de PEGilação.
Além do mais, a WO 97/11957 A descreve conjugados de um polipéptido e de um polímero biocompatível, em particular do factor VIII, com uma elevada actividade específica utilizando monometoxi-óxido de polialquileno como o polímero biocompatível; e EP 0 690 127 A relaciona-se com um polipéptido MGDF mono-pegilado. A ligação de PEG a grupos reactivos presentes na proteína é tipicamente efectuada utilizando derivados de PEG electrofilicamente activados. A ligação de PEG aos grupos a- e ε-amino presentes nos resíduos de lisina e na 6 extremidade N resulta num conjugado consistindo de uma mistura de produtos.
Duma maneira geral, estes conjugados consistem de uma população das várias molécula de PEG ligadas por molécula de proteína ("PEGímeros") que vão desde zero até ao número de grupos amino na proteína. Para uma molécula de proteína que seja modificada com um único grupo, a unidade PEG pode estar ligada em vários sítios amina diferentes.
Este tipo de PEGilação não específica resultou num número de conjugados que se tornaram praticamente inactivos. A redução da actividade é tipicamente provocada blindando o domínio de ligação activo da proteína como é o caso com muitas citocinas e anticorpos. Por exemplo, Katre et al. nas Patente U.S. 4 766 106 e Patente U.S. 4 917 888 descrevem a PEGilação de IFN-β e IL-2 com um grande excesso de glutarato de metoxi-polietileno glicolil-N-succinimidilo e succinato de metoxi-polietileno glicolil-N-succinimidilo. Ambas as proteínas foram produzidas em células hospedeiras microbianas, as quais permitiram a mutação específica da cisteína livre numa serina. A mutação foi necessária na expressão microbiana de IFN-β para facilitar o enrolamento da proteína. Em particular, o IFN-β utilizado nestas experiências é o produto comercial Betaseron®, no qual o resíduo de Cis17 está substituído por uma serina. Além disso, a ausência de glicosilação reduz a sua solubilidade em solução aquosa. A PEGilação não específica resultou num aumento da solubilidade, mas um problema principal foi o nível de actividade e rendimento reduzidos. 7 0 Pedido de Patente Europeu EP 593 868, intitulado PEG-Interferon Conjugates, descreve a preparação de conjugados de PEG-IFN-α. No entanto, a reacção de PEGilação não é regioespecífica e, por conseguinte, obtém-se uma mistura de isómeros posicionais de conjugados de PEG-IFN-α (ver também Monkarsh et al., ACS Symp. Ser., 680:207-216, 1997).
Kinstler et al. no Pedido de Patente Europeu EP 6 75 201 demonstrou a modificação selectiva do resíduo N-terminal do factor de crescimento e desenvolvimento de megacariócitos (MGDF) com mPEG-propionaldeido. Isto permitiu uma PEGilação e farmacocinética reprodutíveis de lote para lote. Gilbert et al. na Patente U.S. 5 711 944 demonstraram que se podia produzir a PEGilação de IFN-a com um nivel óptimo de actividade. Neste caso foi necessário um passo de purificação laborioso para se obter o conjugado óptimo. A maioria das citocinas, bem como de outras proteínas, não possui um sítio de ligação específico do PEG e, para além dos exemplos mencionados acima, é muito provável que alguns dos isómeros produzidos através da reacção de sejam parcial ou totalmente inactivos, originando desse modo uma perda de actividade da mistura final. A mono-PEGilação regioespecífica é deste modo um objectivo desejado na preparação de tais conjugados de proteínas.
Woghiren et al. em Bioconjugate Chem., 4(5) :314-318, 1993, sintetizaram um derivado de PEG selectivo para tiol 8 para o efeito de PEGilação regioespecífica. Foi demonstrado que um derivado de tiol protegido estável do PEG na forma de um grupo reactivo de dissulfureto de parapiridilo conjuga especificamente com a cisteina livre na proteina, papaina. A ligação de dissulfureto estabelecida de novo entre a papaina e o PEG podia ser quebrada em condições de redução suaves para regenerar a proteína nativa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para a ligação por passos de unidades PEG em série a um polipéptido, compreendendo os passos de: fazer reagir um polipéptido com uma unidade PEG heterobifuncional ou homobifuncional possuindo um peso molecular na gama de 100 até 5.000 daltons e possuindo a fórmula seguinte: W-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH2-X, em que W e x são grupos que reagem independentemente com um grupo funcional amina, sulfidrilo, carboxilo ou hidroxilo para ligar a unidade de PEG de baixo peso molecular ao polipéptido; e fazer reagir a unidade de PEG de baixo peso molecular ligada ao polipéptido com uma unidade de PEG monofuncional ou bifuncional possuindo um peso molecular na gama de 100 daltons até 200 quilodaltons para ligar a unidade de PEG monofuncional ou bifuncional a uma extremidade livre da unidade de PEG de baixo peso molecular e formar um conjugado PEG-polipéptido.
Também são descritos conjugados de poliol-lFN-β, e em particular conjugados PEG-IFN-β, em que está covalentemente 9 ligada uma unidade poliol à Cis17. A conjugação específica é obtida através da reacção do agente poliol reactivo ao tiol com o resíduo de Cis17 no IFN-β. Espera-se que tais conjugados apresentem uma maior eficácia in vivo. 0 objectivo é obter uma maior solubilidade a pH neutro, uma maior estabilidade (menor degradação), menor imunogenicidade e nenhuma perda de actividade relativamente ao IFN-β 'nativo'. Os resultados de uma tal conjugação diminuiriam o número de doses para um dado efeito, simplificaria e estabilizaria a formulação de uma composição farmacêutica, e aumentaria possivelmente a eficácia a longo prazo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o gráfico de Electroforese Capilar (CE) do conjugado PEG-IFN-β antes da purificação.
As Figuras 2A-2C mostram a purificação do conjugado PEG-IFN-β realizada por cromatografia de exclusão molecular (Superose 12): Fig. 2A - primeiro passo; Fig. 2B - segundo passo; Fig. 2C - terceiro passo. A Figura 3 mostra a cromatografia em SDS-PAGE do conjugado PEG-IFN-β purificado do terceiro passo de cromatografia. As pistas 1 e 4 são padrões de peso molecular de proteína, pista 2 é o IFN-β "nativo" e a pista 3 é o conjugado de PEG-IFN-β. A Figura 4 expõe o gráfico de Electroforese Capilar (CE) do conjugado de PEG-IFN-β purificado no qual o IFN-β é PEGilado com mPEG-OPSS5k. A Figura 5 expõe o espectro de MS de MALDI do conjugado de PEG-IFN-β purificado. 10 A Figura 6 mostra uma comparação entre a actividade anti-viral do IFN-β "nativo" e do conjugado PEG-IFN-β. Incubou-se células WISH com as concentrações indicadas de amostras de IFN-β durante 24 horas antes do desafio com uma dose citopática do virus da estomatite vesicular. O efeito citopático foi determinado após mais 48 horas por conversão de mtt. A Figura 7 mostra o perfil de ligação de IFN-β e PEG-IFN em células Daudi. A Figura 8 mostra o perfil farmacocinético de IFN-β e PEG-IFN em ratinhos após administração intravenosa. As linhas a tracejado indicam o LOQ do ensaio para cada curva de calibração. A Figura 9 mostra os perfis farmacocinéticos dos IFN-β e PEG-IFN em ratinhos após administração subcutânea. As linhas a tracejado indicam o LOQ do ensaio para cada curva de calibração.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na descoberta de que a ligação de uma unidade poliol, mais especificamente uma unidade de PEG, ao resíduo Cis17 do IFN-β humano aumenta (ou pelo menos retém e não resulta numa diminuição) inesperadamente a actividade biológica do IFN-β relativamente à do interferão-β humano nativo. Assim, não só o IFN-β com uma unidade poliol ligada ao resíduo Cis17 exibe a mesma ou uma maior actividade biológica IFN-β, como este conjugado poliol-IFN-β também proporciona as propriedades desejadas conferidas pela unidade poliol, tal como aumento da solubilidade. 11 "IFN-β", como aqui utilizado, significa interferão do fibroblasto humano, como obtido por isolamento a partir de fluidos biológicos ou como obtido por técnicas de ADN recombinante a partir de células hospedeiras procariotas ou eucariotas, bem como os seus sais, derivados funcionais, precursores e fracções activas, desde que elas possuam o residuo de cisteina que surge na posição 17 na forma natural. A unidade poliol no conjugado poliol-IFN-β pode ser qualquer poli(óxido de alquileno) mono- ou bifuncional solúvel em água possuindo uma cadeia linear ou ramificada. Tipicamente, o poliol é um poli(alquileno glicol) tal como poli(etileno glicol) (PEG). No entanto, os especialistas na técnica reconhecerão que pode ser adequadamente utilizados outros polióis, tais como, por exemplo poli(propileno glicol) e copolimeros de polietileno glicol e poli (propileno glicol).
Como aqui utilizado, o termo "unidade de PEG" pretende incluir, mas não se limita a PEG linear e ramificado, metoxi-PEG, PEG degradável hidrolitica e enzimaticamente, PEG pendente, dendrimero de PEG, copolimeros de PEG e um ou mais polióis, e copolimeros de PEG e PLGA (poli (ácido láctico/glicólico)). A definição "sais" como aqui utilizada refere-se tanto a sais dos grupos carboxilo como a sais das funções amino do composto que pode ser obtido através de métodos conhecidos. Os sais dos grupos carboxilo incluem sais inorgânicos como, por exemplo, sais de sódio, potássio, 12 cálcio e sais com bases orgânicas como as preparadas com uma amina como trietanolamina, arginina ou lisina. Os sais dos grupos amino incluem, por exemplo, sais com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico e com ácidos orgânicos como ácido acético. A definição "derivados funcionais" como aqui utilizada refere-se a derivados que podem ser preparados a partir de grupos funcionais presentes nas cadeias laterais das unidades aminoácido ou nos grupos N- ou C-terminais segundo métodos conhecidos e que estão incluídos na presente invenção quando eles são farmaceuticamente aceitáveis, isto é, quando eles não destroem a actividade da proteína ou não confiram toxicidade às formulações farmacêuticas que os contêm. Tais derivados incluem, por exemplo, ésteres ou amidas alifáticas de grupos carboxilo e derivados N-acilo de grupos amino livres ou derivados O-acilo de grupos hidroxilo livres e são preparados com grupos acilo como, por exemplo, grupos alcanoílo ou aroílo.
Os "precursores" são compostos que são convertidos em IFN-β no organismo humano ou animal.
Por "fracções activas" da proteína, a presente invenção refere-se a qualquer fragmento ou precursor da cadeia polipeptídica do próprio composto, sozinho ou em combinação com moléculas ou resíduos relacionados ligados a ele, por exemplo, resíduos de açúcares ou fosfatos, ou agregados da molécula de polipéptido quando tais fragmentos ou precursores apresentam a mesma actividade do IFN-β como medicamento. 13
Um conjugado PEG-polipéptido pode ser preparado por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. De acordo com uma forma de realização da invenção, o IFN-β é feito reagir com o agente de PEGilação num solvente adequado e o conjugado desejado é isolado e purificado, por exemplo, aplicando um ou mais métodos cromatográficos. "Método cromatográfico" significa qualquer técnica que é utilizada para separar os componentes de uma mistura através da sua aplicação num suporte (fase estacionária) através da qual passa um solvente (fase móvel). Os princípios de separação da cromatográfia baseiam-se na natureza fisica diferente das fases estacionária e móvel.
Alguns tipos particulares de métodos cromatográficos, que são bem conhecidos na literatura, incluem: cromatográfia liquida, liquida de alta pressão, permuta iónica, absorção, afinidade, partição, hidrófoba, fase inversa, filtração de gel, ultrafiltração ou camada fina. 0 "agente de PEGilação reactivo com tiol", como utilizado neste pedido, significa qualquer derivado PEG que seja capaz de reagir com o grupo tiol do resíduo cisteína. Ele pode ser, por exemplo, PEG contendo um grupo funcional tal como dissulfureto de ortopiridilo, vinilsulfona, maleimida, iodoacetimida e outros. Segundo uma forma de realização preferida da presente invenção, o agente de PEGilação reactivo com tiol é o derivado dissulfureto de ortopiridilo (OPSS) do PEG. 0 agente de PEGilação é utilizado na sua forma mono-metoxilada onde está disponível apenas uma extremidade para conjugação ou numa forma bifuncional onde ambos os 14 terminais estão disponíveis para conjugação, tal como por exemplo na formação de um conjugado com dois IFN-β covalentemente ligados a uma única unidade PEG. Ele tem preferencialmente um peso molecular entre 500 e 100.000.
Um esquema reaccional típico para a preparação dos conjugados da invenção é apresentado abaixo:
Frotaina-S-H + mPBG-S-H + HOCH2CHrS-S-CH2CH3OH A segunda linha do esquema acima descreve um método para quebrar a ligação PEG-proteína. O derivado mPEG-OPSS é extremamente selectivo para grupos sulfidrilo livres e reage rapidamente em condições de pH ácido nas quais o IFN-β é estável. A selectividade elevada pode ser demonstrada a partir da redução do conjugado à forma nativa de IFN-β e PEG.
Foi demonstrado que a ligação dissulfureto que é produzida entre as unidades proteína e PEG é estável em circulação, mas que pode ser reduzida depois de entrar no ambiente celular. Por conseguinte, espera-se que este conjugado, o qual não entra na célula, seja estável em circulação até ser eliminado.
Assinale-se que a reacção acima é regioespecífica porque os outros dois resíduos de Cis que surgem nas posições 31 e 141 na forma natural do IFN-β humano não 15 reagem com o agente de PEGilação reactivo com tiol uma vez que eles formam uma ponte de dissulfureto. A presente invenção é dirigida para um método para ligação por passos de duas ou mais unidades PEG a um polipéptido. Este método baseia-se no conhecimento que um PEG activado de baixo peso molecular reage de um modo mais completo com um sitio reaccional estereoquimicamente impedido numa proteína do que o faz um PEG activado de peso molecular elevado. A modificação de proteínas terapêuticas dispendiosas com PEG tem de ser economicamente eficiente para que seja viável a produção do conjugado de PEG. Além disso, para reduzir a filtração glomerular e optimizar as propriedades farmacológicas do conjugado PEG-proteína, o conjugado deveria ter um tamanho efectivo equivalente ao da proteína com um peso molecular de 70 kDa. Isto significa que para uma modificação regioespecífica na qual se liga um PEG, é preferencialmente fixado um derivado de PEG possuindo um peso molecular superior a 20 kDa. Se o sítio de modificação for estereoquimicamente impedido, o grupo reactivo numa unidade de PEG grande pode ter dificuldades em atingir o sítio de modificação e levar, deste modo, a rendimentos baixos. Um método preferido para PEGilar um polipéptido de acordo com a presente invenção aumenta o rendimento de PEGilação regioespecífica ligando primeiramente uma unidade de PEG hetero- ou homobifuncional pequena que, devido ao seu tamanho relativamente pequeno, possa reagir com sítios estereoquimicamente impedidos. A ligação subsequente de um derivado de PEG de peso molecular elevado ao PEG pequeno resulta num rendimento elevado da proteína PEGilada desejada. 16 0 método para a ligação por passos de duas ou mais unidades de PEG em série a um polipéptido segundo a presente invenção inclui ligar em primeiro lugar uma unidade PEG heterobifuncional ou homobifuncional de baixo peso molecular ao polipéptido e depois ligar uma unidade de PEG monofuncional ou bifuncional à extremidade livre da unidade de PEG de baixo peso molecular que está ligada ao polipéptido. Após a ligação por passos de duas ou mais unidades de PEG em série a um polipéptido, polipéptido esses que é preferencialmente o IFN-β e onde a Cis17, localizada num sitio estereoquimicamente impedido, é o sitio preferido de ligação do PEG, o conjugado de PEG-polipéptido pode ser purificado utilizando uma ou mais das técnicas de purificação tais como cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase inversa. A unidade de PEG de baixo peso molecular tem a fórmula: W-CH2CH20 (CH2CH20) nCH2CH2-X, em que W e X são grupos que reagem independentemente com um grupo funcional amina, sulfidrilo, carboxilo ou hidroxilo para fixar a unidade de PEG de baixo peso molecular ao polipéptido. W e X are, de um modo preferido, independentemente seleccionados de dissulfureto de ortopiridilo, maleimidas, vinilsulfonas, iodoacetamidas, aminas, tióis, carboxilos, ésteres activos, carbonatos de benzotriazole, carbonatos de p-nitrofenol, isocianatos e biotina. A unidade de PEG de baixo peso molecular tem um 17 peso molecular na gama desde cerca de 100 até 5.000 daltons. A unidade de peg monofuncional ou bifuncional para ligação à extremidade livre de um PEG de baixo peso molecular que está ligado ao polipéptido tem um peso molecular na gama de cerca de 100 daltons até 200 kDa e é preferencialmente um metoxi-PEG, PEG ramificado, PEG degradável hidrolitica ou enzimaticamente, PEG pendente ou dendrimero de PEG. Além disso o PEG monofuncional ou bifuncional tem a fórmula: Y-CH2CH20(CH2CH2O)nCH2CH2-Z, em que Y é reactivo para um grupo terminal na extremidade livre da unidade de PEG de baixo peso molecular que está ligada ao polipéptido e Z é -OCH3 ou um grupo reactivo para formar um conjugado bifuncional. O conjugado de PEG-polipéptido produzido pelo método acima para ligação por passos de duas ou mais unidades PEG pode ser utilizado para produzir um medicamento ou composição farmacêutica para tratar doenças ou distúrbios para os quais os polipéptidos são eficazes como uma substância activa.
Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar os conjugados numa forma substancialmente purificada para que sejam adequados para utilização em composições farmacêuticas, como substância activa para o tratamento, diagnóstico ou prognóstico de infecções bacterianas e 18 virais, bem como de doenças autoimunes, inflamatórias e tumores.
Exemplos das doenças supramencionadas incluem: choque séptico, SIDA, artrite reumatóide, lúpus eritematoso e esclerose múltipla.
Outras formas de realização e vantagens da invenção tornar-se-ão evidentes na descrição que se segue.
Embora não faça parte da invenção, é ainda descrita a administração de uma quantidade farmacologicamente activa dos conjugados da invenção a indivíduos em risco de desenvolver uma das doenças descritas acima ou a indivíduos que já apresentam essas patologias.
Pode utilizar-se qualquer via de administração compatível com a substância activa. É preferida a administração parentérica tal como a injecção subcutânea, intramuscular ou intravenosa. A dose de substância activa a ser administrada depende da prescrição médica de acordo com a idade, peso e resposta individual do doente. A dosagem pode ser entre 10 μρ e 1 mg diários para um peso corporal médio de 75 kg, e a dose diária preferida é entre 20 μρ e 200 μρ. A composição farmacêutica para administração parentérica pode ser preparada numa forma injectável compreendendo a substância activa e um veículo adequado. Os veículos para administração parentérica são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, água, soro fisiológico, 19 solução de Ringer e/ou dextrose. 0 veículo pode conter pequenas quantidades de excipientes para manter a estabilidade e isotonicidade da preparação farmacêutica. A preparação das soluções pode ser realizada de acordo com as modalidades correntes. A presente invenção foi descrita por referência a formas de realização específicas, mas o conteúdo da descrição compreende todas as modificações e substituições que possam ser conseguidas por um especialista na técnica sem que se prolongue para além do significado e objectivo das reivindicações. A invenção será agora descrita por meio dos Exemplos que se seguem. EXEMPLO 1: Preparação do Conjugado de PEG-IFN-β (exemplo comparativo)
Modificação de IFN-β com mPEGsk-OPSS
Utilizou-se IFN-β humano recombinante, estável a uma concentração de 0,37 mg/ml em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 3,6, para a preparação de um conjugado de PEG-IFN-β. Adicionou-se aproximadamente 1,0 ml de ureia 6 M a 2 ml de IFN-β a uma concentração de 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 x 1~8 moles) . Adicionou-se mPEG5k-OPSS num excesso molar de 50 moles para uma mole de IFN-β e deixou-se os dois reagir num frasquinho de polipropileno durante 2 horas a 37 °C ou 1 hora a 50 °C. Analisou-se a mistura reaccional por Electroforese Capilar (CE) para determinar a extensão de 20 formação do conjugado de PEG-lFN-β pela reacção de PEGilação antes de qualquer modificação (Fig. 1). Um rendimento típico para esta reacção é 50% de PEG-IFN-β. Filtrou-se os produtos reaccionais a partir da mistura reaccional com um filtro de seringa de 0,22 mm e transferiu-se então a solução filtrada para uma coluna de exclusão molecular (Superose 12 ou Superdex 75, Pharmacia) e eluiu-se com tampão de fosfato de sódio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. A Fig. 2A mostra o perfil de eluição da purificação do conjugado de PEG-IFN-β numa coluna de cromatografia de exclusão molecular Superose 12. Recolheu-se os picos e analisou-se por SDS-PAGE (Fig. 3) . Combinou-se as fracções contendo o conjugado de PEG-IFN-β e transferiu-se novamente o concentrado para a mesma coluna de exclusão molecular para se purificar ainda mais o conjugado de PEG-IFN-β devido à proximidade do pico do IFN-β "nativo" (Fig. 2B) . Repetiu-se este procedimento (terceiro passo) para garantir pureza (Fig. 2C) . As Fig. 4 e Fig. 5 mostram o gráfico de Electroforese Capilar e o espectro de MALDI MS, respectivamente, do conjugado de PEG-IFN-β purificado.
Modificação de lFN-β com mPEG3ok-OPSS O IFN-β humano recombinante proporcionado é estável em solução a 0,36 mg/ml em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 3,6. Adicionou-se aproximadamente 36 mg de mPEG30k-OPSS em 3 ml de H20 desionizada a 3 ml de IFN-β a 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4,9-χ10~8 moles) e deixou-se os dois reagir num frasquinho de polipropileno durante 2 horas a 50 °C. Analisou-se a mistura reaccional por electroforese capilar 21 para determinar o grau de modificação. Os rendimentos típicos para esta reacção são <30%. Carregou-se então a solução numa coluna de exclusão molecular (Superose 12, Pharmacia) e eluiu-se com tampão de fosfato de sódio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. Recolheu-se os picos e analisou-se com SDS-PAGE para os respectivos conteúdos. EXEMPLO 2: Actividade Biológica do Conjugado de PEG-IFN-β (exemplo comparativo)
Para se avaliar os efeitos da PEGilação na actividade antiviral do IFN-β humano recombinante, pré-incubou-se células amnióticas WISH humanas quer com IFN-β preparado de fresco (mesmo lote que o utilizado para PEGilação) ou conjugado de PEG-IFN-β. A actividade antiviral mediada por IFN-β, como medida pelo ensaio de citopatologia WISH-VSV, foi determinada segundo um bioensaio antiviral WISH desenvolvido com base no protocolo de Novick et al., J. Immunol., 129:2244-2247 (1982). Os materiais utilizados neste ensaio WISH são os seguintes: Células WISH (ATCC CCL 25)
Culturas-mães do Virus Da estomatite Vesicular (ATCC V-520-001-522), conservadas a -70 °C IFN-β, recombinante humano; InterPharm Laboratories LTD (tipo 32.075, Lote # 205035), 82 χ 106 IU/ml, actividade especifica: 222 χ 106 iu/mg
Conjugado de PEG-IFN-β como preparado no Exemplo 1 e mantido em PBS, pH 7,4
Meio de crescimento de WISH (mem com teor elevado de glucose com sais de Earls + 10% de FBS + 1,0% de L-glutamina + Penicilina/Estreptomicina (100 U/ml, 100 pg/ml) 22
Meio de ensaio de WISH (MEM com teor elevado de glucose com sais de Earls + 5% de FBS + 1,0% de L-glutamina + Penicilina/Estreptomicina (100 U/ml, 100 μg/ml) MTT a 5 mg/ml em PBS, conservado a menos 70 °C. O protocolo para o ensaio com WISH é como se segue:
Diluir as amostras de lFN-β a 2x a concentração inicial em meio de ensaio de WISH.
Preparar diluições triplicadas de amostras de lFN-β em meio de ensaio de WISH em placas de 96 poços de fundo plano para que cada poço possua 50 μΐ de amostra diluida de IFN-β (alguns poços de controlo receberam apenas 50 μΐ de meio de ensaio de WISH).
Colher as células WISH na fase de crescimento com solução de tripsina/EDTA, lavar em meio de ensaio de WISH e fazer até uma concentração final de 0,8 χ 106 células/ml.
Adicionar 50 μΐ da suspensão de células WISH (4 χ 104 células por poço) a cada poço. A concentração final de IFN-β expostos às células é agora de IX.
Após incubação durante 24 horas numa incubadora de C02 a 5% humidificado, adiciona-se 50 μΐ de uma diluição 1:10 (em meio de ensaio de WISH) de cultura-mãe de VSV (uma dose predeterminada como originando a lise de 100 porcento das células WISH em 48 horas) a todos os poços excepto aos poços de controlo sem virus (estes receberam um volume igual apenas de meio de ensaio). 23
Após mais 48 horas, adiciona-se 25 μΐ de solução de MTT a todos os poços, após o que as placas são incubadas durante mais 2 horas numa incubadora. 0 conteúdo dos poços é eliminado por inversão das placas e adiciona-se 200 μΐ de etanol a 100% aos poços.
Após 1 hora, lê-se as placas a 595 nm utilizando o pacote de software Soft max Pro e o sistema espectrofotómetro Spectramax (Molecular Devices).
Quadro 1. Actividade Antiviral de Amostras de IFN-beta PEGilada e submetida a falsa PEGilação
Amostra de IFN-beta* EC50** Conjugado de PEG-IFN-β 3,9 +/- 0,6 pg/ml IFN-β 16,4 +/- 1,0 pg/ml * Concentrações de IFN-β nas amostras determinadas por análise de aminoácidos. ** EC50 (+/- D.P.) foi determinada pelo programa de software Microcal Origin 4.1
Como se demonstra na Fig. 6 e Quadro 1 acima, o conjugado PEG-lFN-β manteve um nível de actividade antiviral superior ao do lote preparado de fresco de IFN-β parental. A observação de que o conjugado de PEG-lFN-β tem uma bioactividade aproximadamente 4χ superior do que a do IFN-β preparado de fresco também pode ser uma consequência da maior estabilidade do conjugado de PEG-IFN-β por comparação com o IFN-β "nativo" após adição do meio de ensaio de células de WISH. 24 EXEMPLO 3: Ensaios In Vitro da Actividade Relativa de Amostras de PEG-IFN (exemplo comparativo) A bioactividade relativa de PEG[30 kD]-IFN-β e PEG[2 X 20 kD]-IFN-β foi determinada pelo ensaio de WISH utilizando o protocolo corrente descrito no Exemplo 2 (Quadro 2) . Realizou-se três ensaios independentes por três indivíduos diferentes em alturas separadas.
Quadro 2. Actividade antiviral relativa do PEG-IFN-β
Actividade Relativa do estudos) Interferão* (de três Amostra Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Média (D.P.) PEG[30 kD]- 3,2 x 3,1 x 1,8 x 3,0 x (0,78) IFN-β superior superior superior superior PEG[2 X 20 4,2 x 1,3 x 0,85 x 2,1 x (1,8) kD]-IFN-β superior superior superior superior * Dose EC5o comparada com IFN-β padrão incluído em cada ensaio. ** Comparação com base na concentração de IFN-β de 330 pg/ml. As concentrações de PEG[30 kD]-IFN-β (5,41 pg/ml) e PEG[2 x 20 kD]-IFN-β (6,86 pg/ml) foram determinadas por AAA. A ligação de PEG-IFN-β ao seu receptor em células foi 125 avaliada na presença de uma quantidade fixa de I-IFN- 25 a2a. lFN-a2a foi marcado radioactivamente com 125I utilizando o método de cloramina T. 0 IFNa2a ligado a 125I foi separado do iodo livre passando os reagentes através de uma coluna de Sephadex G25 e combinando as fracções que contém a proteina (Pharmacia). Quantificou-se o 125I-IFN-a2a por um ensaio ELISA IFN-a2a (Biosource, EUA) e determinou-se a actividade especifica. Colheu-se células Daudi na fase de crescimento exponencial e incubou-se 2 χ 106 células com 125I-IFN-a2a 0,5 nM durante 3 horas à temperatura ambiente na presença de várias concentrações de PEG-lFN-β ou IFN-a2a diluido num tampão de ensaio que é o RPMI 1640 contendo 2% de soro fetal bovino fetal e 0,1% de azida de sódio. No final da incubação, centrifugou-se as células através de uma camada de óleo de ftalato e contou-se a radioactividade ligada à célula no contador gama. Além disso, a ligação de PEG [30kD]-IFN~P e PEG[2 x 20kD]-IFN-P ao receptor foram muito semelhantes ou próximas da actividade de ligação do lFN-β como se mostra na Fig. 7.
Além disso, determinou-se a actividade relativa num ensaio de antiproliferação em células Daudi (linfoma de células B humano) (Quadro 3) . Todos os IFNs foram preparados a uma concentração 2x de 200 ng/ml. Diluiu-se as amostras três vezes ao longo do comprimento da placa a um volume final de 100 μΐ. Adicionou-se 1 χ 105 células/poço (100 μΐ) a cada poço e incubou-se durante um total de 72 horas a 37 °C numa incubadora de CO2 humidificado. Após 48 horas, adicionou-se timidina tritiada (3H) a 1 μϋί/ρορο em 20 μΐ. No final das 72 horas de incubação, colheu-se as placas com o Colector de Placas Tomtek. Os resultados apresentados no Quadro 3 indicam que não ocorre qualquer 26 perda detectável na actividade do IFN em resultado da PEGilação. Na realidade, determinou-se que a actividade era algo superior à do IFN-β livre. Isto pode ser devido à formação de agregados inactivos no IFN livre ou a diferenças nos métodos de quantificação (análise de aminoácidos para amostras de PEG-IFN e RP-HPLC para o IFN- β)·
Quadro 3. Ensaio de Antiproliferação de Daudi
Dose IC50* Aumento vs IFN IFN-β (Placa 1) 1153,1 - PEG[30kD]-IFN (71 A) 695,6 1, 6x IFN-β (Placa 2) 1005,8 - PEG[40kD]-IFN (71 B) 629,4 1, 7x * pg/ml EXEMPLO 4: Estudos Farmacocinéticos em Ratinhos (exemplo comparativo)
Administração Intravenosa
Injectou-se ratinhos com 100 ng de IFN-β, PEG[30kD]-IFN-β ou PEG[2 x 20 kD]-IFN-β e colheu-se sangue aos tempos indicados dai em diante. Determinou-se as concentrações de IFN-β no soro por ELISA especifico para IFN-β (Toray Industries) e os resultados são mostrados na Fig. 8. Separou-se vinte e oito ratinhos fêmea da estirpe B6D2F1 (6-8 semanas) (aproximadamente 20g cada) em quatro grupos como se segue: Grupo 1 continha nove ratinhos injectados com um único "bolus" 200 μΐ de 500 ng/ml de IFN-β humano (dose final de 100 ng/ratinho); Grupo 2 (nove ratinhos) 27 recebeu 200 μΐ de uma massa equivalente de PEG30kD-lFN-P; Grupo 3 recebeu 200 μΐ de uma massa equivalente de PEG(2 x 20 kD)-IFN-β ; e Grupo 4 é um grupo de três ratinhos não injectados que serviram de controlo negativo. Colheu-se amostras de sangue (aproximadamente 200 μΐ/amostra) aos nove tempos indicados por ruptura do plexo venoso retroorbital com um tubo capilar. Deixou-se coagular amostras de sangue durante 1 h à temperatura ambiente, levantou-se a orla e microcentrifugou-se. Os soros retirados destas foram conservados a -70 °C até se colherem todas as amostras. Os soros foram pesquisados para a presença de IFN-β humano bioactivo utilizando o ensaio de Toray. Os resultados indicam que a área sob a curva (AUC) está acentuadamente aumentada nas amostras PEG-IFN contra o IFN-β livre e nas amostras de PEG-IFN contra o IFN-β livre e que o PEG[2 x 20 kD]-IFN-β é superior ao PEG[30 kD]-IFN-β
Administração subcutânea
Injectou-se subcutaneamente ratinhos com IFN-β e PEG-IFN (100 ng/ratinhos) . A Figura 9 demonstra que a área total sob a curva (AUC) é dramaticamente aumentada para as amostras de PEG-IFN relativamente ao IFN-β livre. Os estudos farmacocinéticos são coerentes com as amostras de PEG-IFN terem uma semivida mais longa e uma maior AUC.
Exemplo 5: Ligação da Unidade de PEG de Baixo Peso Molecular ao Polipéptido
Marcação de interferão-beta com OPSS-PEG2k-Hidrazida 28 28 Ο
Proteina-SH +
OÍI V Protèina-S-S-PEGjjc-C^Mí-HH^ ~S-S-PEG3l--C-NH"NH-> „
0 interferão-β humano recombinante foi proporcionado em solução a 0,33 mg/ml em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 3,8. Adicionou-se aproximadamente 3,6 mg (40 moles de excesso por mole de proteína) do reagente PEG heterobifuncional, OPSS-PEG2k-hidrazida, em 2 ml de água desionizada a 3 ml de lFN-β a 0,33 mg/ml (0,99 mg) e deixou-se reagir os dois num frasquinho de polipropileno durante 1 hora a 45 °C. Analisou-se então a mistura reaccional por electroforese capilar para determinar o grau de modificação. Os rendimentos típicos variam desde 90-97% dependendo da pureza do interferão β e reagente PEG.
Carregou-se em seguida a solução numa coluna de exclusão molecular (Superdex 75, Pharmacia) e eluiu-se com tampão de fosfato de sódio 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. Recolheu-se os picos e analisou-se por SDS-PAGE. Combinou-se conjuntamente as fracções de interferão-β monoPEGilado e utilizou-se então num outro passo de modificação com PEG de elevado peso molecular.
H—^
Marcação de Interferão-β com (OPSS) 2-PEG3400 Proteina«$H ·*
S-S~PEG;Mt}o~S*S 29 Ο interferão-β humano recombinante foi proporcionado em solução a 0,33 mg/ml em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 3,8. Adicionou-se aproximadamente 6,1 mg (40 moles de excesso por mole de proteina) do reagente PEG homobifuncional, (OPSS) 2-PEG3400/ em 2 ml de água desionizada a 3 ml de interferão-β a 0,33 mg/ml (0,99 mg) e deixou-se os dois reagir num frasquinho de polipropileno durante 2 horas a 50 °C. Seguiu-se a reacção com SDS-PAGE não redutora e analisou-se a mistura reaccional final por electroforese capilar para determinar o grau de modificação. As modificações tipicas para esta reacção com interferão-β foram >95%. Carregou-se então a solução numa coluna de exclusão molecular (Superdex 75, Pharmacia) e eluiu-se com tampão de fosfato de sódio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. Colheu-se os picos e analisou-se por SDS-PAGE para o seu conteúdo. Combinou-se as fracções de interferão-β monoPEGilado. EXEMPLO 6: Ligação da Segunda Unidade de PEG ao Polipéptido de PEGilação de Baixo Peso Molecular
Modificação de IFN-S-S-PEG2k~Hidrazida com mPEG30k~Aldeído (ALD)
Proteina* S.S-?ECi{c~C~KH-m í.....S Pro t.eina»S.S*FBG^~C’NH*K'isCH*mPEG30t;
O
mPEG30JrCH,CH2CH 30 Às fracções combinadas de IFN-S-S-PEG2k-Hidrazida do Exemplo 5 adicionou-se mPEG30k-ALD num excesso de 20 moles relativamente à proteína. Realizou-se a reacção à temperatura ambiente (25 °C) durante 4 horas e adicionou-se uma amostra a uma coluna de exclusão molecular (Superose 6, Pharmacia) para determinar o rendimento de modificação. O rendimento de modificação desta reacção foi tipicamente >80% dependendo da pureza do reagente PEG e das condições reaccionais.
Tendo-se descrito agora completamente esta invenção, os especialista na técnica entenderão que se poderá fazer o mesmo com uma gama lata de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem que se saia do espirito e âmbito da invenção e sem experimentação excessiva.
Embora esta invenção tenha sido descrita relativamente a formas de realização especificas da mesma, entender-se-á que ela é capaz de outras modificações. Este pedido pretende cobrir quaisquer variações, utilizações ou adaptações das invenções segundo, em geral, os princípios da invenção e incluindo as modificações da presente descrição que caiam dentro da prática conhecida ou corrente dentro da técnica à qual pertence a invenção e como se pode aplicar às características essenciais atrás descritas como se segue no âmbito das reivindicações apensas.
Todas as referências aqui citadas, incluindo os artigos ou resumos científicos, pedidos de patente U.S. ou doutro país publicados ou não publicados, patentes U.S. ou doutro país concedidas ou quaisquer outras referências, são aqui totalmente incorporadas por referência, incluindo 31 todos os dados, quadros, figuras e textos apresentados nas referências citadas. Adicionalmente, os conteúdos totais das referências citadas dentro das referências aqui citadas também são aqui totalmente incorporados por referência. A referência a passos de métodos conhecidos, passos de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é, seja de que forma for, um reconhecimento de que qualquer aspecto, descrição ou forma de realização da presente invenção é descrito, ensinado ou sugerido na técnica relevante.
Lisboa, 28 de Junho de 2007

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a ligação por passos de unidades de polietileno glicol (PEG) em série a um polipéptido, compreendendo os passos de: Fazer reagir um polipéptido com uma unidade de PEG heterobifuncional ou homobifuncional possuindo um peso molecular na gama de 100 até 5.000 daltons e possuindo a fórmula seguinte: W-CH2CH20 (CH2CH20)nCH2CH2-X, em que W e X são grupos que reagem independentemente com um grupo funcional amina, sulfidrilo, carboxilo ou hidroxilo para fixar a unidade de PEG de baixo peso molecular ao polipéptido; e fazer reagir a unidade de PEG de baixo peso molecular ligada ao polipéptido com uma unidade de PEG monofuncional ou bifuncional possuindo um peso molecular na gama de 100 daltons até 200 quilodaltons para ligar a unidade de PEG monofuncional ou bifuncional à extremidade livre da unidade de PEG de baixo peso molecular e formar um conjugado de PEG-polipéptido.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a unidade de PEG monofuncional ou bifuncional tem a fórmula seguinte: Y-CH2CH20(CH2CH20)mCH2-Z, em que Y é reactivo para um grupo terminal na extremidade livre da unidade de PEG de baixo peso molecular ligada ao polipéptido e Z é -OCH3 ou um 2 grupo reactivo com X para formar um conjugado bifuncional.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a unidade de PEG monofuncional ou bifuncional é metoxi-PEG, PEG ramificado, PEG degradável hidrolitica ou enzimaticamente, PEG pendente ou dendrimero de PEG.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que W e -X são independentemente seleccionados do grupo consistindo de dissulfureto de ortopiridilo, maleimidas, vinilsulfonas, iodoacetamidas, hidrazidas, aldeídos, ésteres de succinimidilo, epóxidos, aminas, tióis, carboxilos, ésteres activos, carbonatos de benzotriazole, carbonatos de p-nitrofenol, isocianatos e biotina.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a unidade de PEG de baixo peso molecular e/ou a unidade de PEG monofuncional ou bifuncional é um copolímero de polietileno glicol.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o copolímero de polietileno glicol é seleccionado do grupo consistindo de copolímeros de polietileno glicol/polipropileno glicol e copolímeros de polietileno glicol/poli(ácido láctico/glicólico).
7. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda um passo de purificação do conjugado PEG-polipéptido após a ligação por passos das duas unidades de PEG em série a um polipéptido. 3
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido passo de purificação compreende uma ou mais técnicas de purificação seleccionadas do grupo consistindo de cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase inversa.
9. Método de acordo com as reivindicações 1 a 8, em que o polipéptido é o interferão-β. Lisboa, 28 de Junho de 2007
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