NO329749B1 - Polyol-interferon-ß-konjugat, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk blanding derav og anvendelse derav for fremstilling av medikamenter. - Google Patents

Polyol-interferon-ß-konjugat, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk blanding derav og anvendelse derav for fremstilling av medikamenter. Download PDF

Info

Publication number
NO329749B1
NO329749B1 NO20005337A NO20005337A NO329749B1 NO 329749 B1 NO329749 B1 NO 329749B1 NO 20005337 A NO20005337 A NO 20005337A NO 20005337 A NO20005337 A NO 20005337A NO 329749 B1 NO329749 B1 NO 329749B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
polyol
peg
interferon
ifn
conjugate
Prior art date
Application number
NO20005337A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20005337D0 (no
NO20005337L (no
Inventor
Milton J Harris
Nabil El Tayar
Michael J Roberts
Wayne Sawlivich
Original Assignee
Merck Serono Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Serono Sa filed Critical Merck Serono Sa
Publication of NO20005337D0 publication Critical patent/NO20005337D0/no
Publication of NO20005337L publication Critical patent/NO20005337L/no
Publication of NO329749B1 publication Critical patent/NO329749B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Description

Oppfinnelsen angår polyol-interferon-P-konjugater hvor en polyolenhet er kovalent bundet til Cys<17>. Ytterligere hensikter med den foreliggende oppfinnelsen er fremgangsmåte for deres fremstilling, farmasøytisk blanding derav samt deres anvendelse i fremstilling av medikamenter til behandling av infeksjoner, tumorer og autoimmun- og betennelsessykdommer.
Human fibroblast interferon (IFN-P) har antivirusaktivitet og kan også stimulere naturlige drepeceller mot neoplastiske celler. Det er et polypeptid på ca. 20000 Da indusert av vimser og dobbel-strengede RNAer. Fra nukleotidsekvensen til genet for fibroblast interferon, klonet ved rekombinant DNA-teknologi, utledet Derynk et al. ( Nature, 285:542-547, 1980) den fullstendige aminosyresekvensen av proteinet. Den er 166 aminosyrer lang.
Shepard et al. ( Nature, 294:563-565, 1981) beskrev en mutasjon av base 842 (Cys -» Tyr ved posisjon 141) som opphevet dens antivirusaktivitet, og en variant kloner ved at nukleotider 1119-1121 er utelatt.
Mark et al. ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 81(18):5662-5666, 1984) innsatte en kunstig mutasjon ved å erstatte base 469 (T) med (A), noe som førte til at en aminosyre går fra Cys -> Ser ved posisjon 17. Den resulterende IFN-P ble rapportert å være så aktiv som den "naturlige" IFN-p og stabil under langtidslagring (-70°C).
Kovalent festing av den hydrofile polymer-polyetylenglykol (PEG), også kjent som polyetylenoksid, (PEO), til molekyler har viktige applikasjoner i bioteknologi og medisin. I dens mest vanlige form er PEG en lineær polymer som har hydroksylgrupper ved hver ende:
Denne formelen kan kort være representert som HO-PEG-OH, hvor det er ment at
-PEG- representerer den polymer ryggkjeden uten endegruppene:
PEG er vanlig anvendt som metoksy-PEG-OH, (m-PEG), hvor én ende er den relativt inerte metoksygruppen, mens den andre enden er en hydroksylgruppe som er utsatt for kjemisk modifisering.
Forgrenede PEGer er også i vanlig bruk. De forgrenede PEGer kan være representert som R(-PEG-OH)mhvor R representerer en sentral kjerneandel slik som pentaerytritol eller glyserol, og m representerer antallet forgreningsarmer. Antallet forgreningsarmer (m) kan være fra tre til hundre eller flere. Hydroksylgruppene er utsatt for kjemisk modifisering.
En annen forgrenet form, slik som den beskrevet i WO 96/21469, har en enkelt ende som er utsatt for kjemisk modifisering. Denne type PEG kan være representert som (CH30-PEG-)PR-X, hvor p er lik 2 eller 3, R representerer en sentralkjerne slik som lysin eller glyserol, og X representerer en funksjonell gruppe slik som karboksyl som er utsatt for kjemisk aktivering. Enda en forgrenet form "den pendante PEG", har reaktive grupper, slik som hydroksyl, langs PEG-ryggkjeden istedenfor ved enden av PEG-kjedene.
I tillegg til disse former av PEG kan polymeren også fremstilles med svake eller degraderbare koplinger i ryggkjeden. F.eks. har Harris vist i US patentsøknad 06/026 716 at PEG kan fremstilles med esterkoplinger i polymerryggkjeden som er utsatt for hydrolyse. Denne hydrolysen resulterer i kløyving av polymeren til fragmenter av lavere molekylvekt, i henhold til reaksjonsraten:
Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er uttrykket polyetylenglykol eller PEG ment å omfatte alle de ovennevnte derivater.
Kjemien til kopolymerene av etylenoksid og propylenoksid er nært relatert til PEG, og de kan anvendes istedenfor PEG i mange av dens applikasjoner. De har den følgende generelle formelen:
hvor R er H eller CH3.
PEG er en nyttig polymer som har egenskapen av høy vannoppløselighet samt høy oppløselighet i mange organiske løsningsmidler. PEG er også ikke-toksisk og ikke-immunogene. Når PEG er kjemisk festet (PEGylering) til en vannuløselig forbindelse, er det resulterende konjugatet generelt vannløselig, samt løselig i mange organiske løsningsmidler.
PEG-proteinkonjugater er for tiden anvendt i proteinfornyelsesterapier og for andre terapeutiske anvendelser. F.eks. er PEGylerte adenosindeaminase (ADAGEN<®>) anvendt for å behandle alvorlig kombinert immunomangelsykdom (SCIDS), PEGylert L-asparaginase (ONCAPSPAR<®>) anvendes for å behandle akutt lymfoblastisk leukemi (ALL), og PEGylert interferon-a (INTRON(R) A) er i fase III-forsøk for behandling av hepatitt C.
For en generell gjennomgåelse av PEG-proteinkonjugater med klinisk virkning vises det til N.L. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm..15:210-218, 1994.
En rekke metoder er blitt utviklet for å PEGylere proteiner. Festing av PEG til reaktive grupper funnet på proteinet utføres typisk ved anvendelse av elektrofilisk aktiverte PEG-derivater. Festing av PEG til a- og e-aminogrupper funnet på lysinrester og N-enden resulterer i et konjugat bestående av en blanding av produkter.
Generelt består slike konjugater av en populasjon av flere PEG-molekyler festet pr. proteinmolekyl ("PEGmerer") som er i området fra null til antallet av aminogrupper i proteinet. For et proteinmolekyl som er blitt noe modifisert, kan PEG-enheten være festet ved en rekke forskjellige aminsteder.
Denne type av ikke-spesifikk PEGylering har resultert i en rekke konjugater som blir nesten inaktiv. Reduksjon av aktivitet er typisk bevirket ved skjerming av proteinets aktive bindingsdomene som er tilfelle med mange cytokiner og antistoffer. F.eks. beskriver Katre et al. i US patent 4 766 106 og US patent 4 917 888 PEGyleringen av IFN-(3 og IL-2 med et stort overskudd av metoksy-polyetylenglykol N-sukkinimidylglutarat og metoksy-polyetylenglykolol N-sukkinimidylsukkinat. Begge proteiner ble produsert i mikrobielle vertsceller, som muliggjorde den arealbegrensede mutasjonen av det fri cysteinet til et serin. Mutasjonen var nødvendig i mikrobiell ekspresjon av IFN-P for å lette protein-sammenlegging. Særlig er IFN-P anvendt i disse forsøkene det kommersielle produktet Betaseron<®>, hvor Cys<17->rest er erstattet med et serin. I tillegg reduserte fraværet av glykosylering dens løselighet i vandig løsning. Arealbegrense PEGylering resulterte i øket løselighet, men et hovedproblem var det reduserte nivået av aktivitet og utbytte.
EP 593 868 med tittel PEG-interferonkonjugat, beskriver fremstillingen av PEG-IFN-a-konjugater. Imidlertid er PEGylasjonsreaksjonen ikke arealbegrenset, og derfor oppnås en blanding av posisjonelle isomerer av PEG-IFN-a-konjugater (jfr. også Monkarsh et al., ACS Svmp. Ser.. 680:207-216, 1997).
Kinstler et al. i EP 675 201 demonstrerte den selektive modifiseringen av den N-enderesten av megakaryocyttvekst og utviklingsfaktor (MGDF) med mPEG-propionaldehyd. Dette førte til den reproduserbare PEGylasjonen og farmako-kinetikker fra mengde til mengde. Gilbert et al. i US patent 5 711 944 demonstrerte at PEGylasjon av IFN-a med et optimalt aktivitetsnivå kunne produseres. I dette tilfellet var et omstendelig rensetrinn nødvendig for å oppnå det optimale konjugatet.
Størstedelen av cytokiner, samt andre proteiner, innehar ikke en spesifikk PEG-festesete og, bortsett fra eksemplene nevnt ovenfor, er det svært sannsynlig at noen av isomerene produsert ved PEGylasjonsreaksjonen er delvis eller totalt inaktiv, som således fører til et tap med hensyn på aktivitet for sluttblandingen.
Arealbegrenset mono-PEGylasjon er således et ønsket mål ved fremstillingen av slike proteinkonjugater.
Woghiren et al. i Bioconjugate Chem.. 4(5):314-318, 1993, syntetiserte et tiol-selektiv PEG-derivat for en slik arealbegrenset PEGylasjon. Et stabilt tiol-beskyttet PEG-derivat i formen av en parapyridyldisulfidreaktiv gruppe ble vist å spesifikt konjugere til det fri cysteinet i proteinet, papain. Den nylig dannede disulfidbindingen mellom papain og PEG kunne kløyves under milde reduksjonsbetingelser for å regenerere det native proteinet.
Angivelse av ethvert dokument her er ikke ment som en innrømmelse av at slike dokumenter er aktuelle innen teknikkens stand, eller ansett å være materiale vedrørende patenterbarheten til ethvert krav i den foreliggende fremstillingen. Enhver uttalelse hva angår innhold eller en dato for et hvilket som helst dokument er basert på informasjon tilgjengelig for søkerne ved tiden for innleveringen og er ikke en innrømmelse av hva angår det korrekte med en slik uttalelse.
I den foreliggende oppfinnelsen er polyol-IFN-(3-konjugater, og spesielt PEG-IFN-P-konjugater, tilveiebrakt hvor en polyolenhet er kovalent bundet til Cys<17>. Den spesifikke konjugasjonen oppnås ved å la et tiol-reaktivt polyolmiddel reagere medCys1<7->resten i IFN-p. Slike konjugater er forventet å vise økt effektivitet in vivo. Hensikten er å oppnå økt løselighet ved nøytral pH, økt stabilitet (senket aggregasjon), senket immunogenisitet, og ingen tap av aktivitet med hensyn på «nativ» IFN-p. Resultatene av slik konjugasjon vil senke antallet av doser for en tilsiktet effekt, forenkle og stabilisere formuleringen av en farmasøytisk blanding, og eventuelt øke langtidsvirkningen. Fig. 1 viser den kapillære elektroforese (CE) kurven av PEG-IFN-p-konjugatet før rensing. Fig. 2A-2C viser rensingen av PEG-IFN-P-konjugatet utført ved størrelses-eksklusjonskromatografi (Superose 12): Fig. 2A - første gjennomløp; Fig. 2B - andre gjennomløp; Fig. 2C - tredje gjennomløp. Fig. 3 viser SDS-PAGE-kromatografien av renset PEG-IFN-P-konjugat fra det tredje kromatografigjennomløpet. Felter 1 og 4 er proteinmolekylvektbestanddeler, felt 2 er «nativ» IFN-p, og felt 3 er PEG-IFN-p-konjugat. Fig. 4 rapporterer den kapillære elektroforese (CE) kurven av renset PEG-IFN-P-konjugat hvor IFN-P er PEGylert med mPEG-OPSS5k.
Fig. 5 rapporterer MALDI MS spektrumet av renset PEG-IFN-P-konjugat.
Fig. 6 viser en sammenligning mellom antivirusaktiviteten av «nativ» IFN-P og av PEG-IFN-p-konjugat. WISH-celler ble inkubert med indikerte konsentrasjoner av IFN-p-prøver i 24 timer før de ble utfordret med cytopatisk dose av vesikular stomotitisvirus. Den cytopatiske effekten ble bestemt etter ytterligere 48 timer ved MTT-konversjon.
Fig. 7 viser bindingsprofilen av IFN-P og PEG-IFN i Daudi-celler.
Fig. 8 viser den farmokinetiske profilen av IFN-P og PEG-IFN i mus etterfølgende intravenøs administrering. De prikkede linjene indikerer assay-LOQ for hver standardkurve. Fig. 9 viser den farmokinetiske profilen av IFN-P og PEG-IFN i mus etterfølgende subkutan administrering. De prikkede linjene indikerer assay-LOQ for hver standardkurve.
Den foreliggende oppfinnelsen er basert på oppdagelsen at festingen av en polyolandel, nærmere spesifikt en PEG-andel, til Cys<17->resten av human IFN-P uventet økte (eller minst beholdt og resulterte ikke i en senkning) den IFN-p-biologiske aktiviteten fra det for nativ human interferon-p. Således utviser ikke bare IFN-P med en polyolandel festet til Cys<17->resten den samme eller økte IFN-p-biologiske aktiviteten men dette polyol-IFN-P-konjugatet gir også de ønskede egenskapene sammenlignet med polyolandelen, slik som økt løselighet.
«IFN-p», som anvendt her, betyr human fibroblastinterferon, som oppnådd ved isolasjon fra geologiske fluider eller som oppnådd ved DNA-rekombinante teknikker fra prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller samt deres salter, funksjonelle derivater, forløpere med aktive fraksjoner, forutsatt at de inneholder cysteinresten som fremkommer ved posisjon 17 i den naturlig forekommende formen.
Polyolandelen i polyol-IFN-p-konjugatet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan være ethvert vannløselig mono- eller bifunksjonelt poly(alkylenoksid) som har en lineær eller forgrenet kjede. Typisk er polyolet et poly(alkylenglykol) slik som poly(etylenglykol) (PEG). Imidlertid vil fagfolk erkjenne at andre polyoler, slik som f.eks. poly(propylenglykol) og kopolymerer av polyetylenglykol og polypropylenglykol, kan velegnet til formålet anvendes.
Som anvendt her er uttrykket "PEG-andel" ment å omfatte, men er ikke begrenset til, lineær og forgrenet PEG, metoksy PEG, hydrolytisk eller enzymatisk degraderbar PEG, pendant PEG, dendrimer PEG, kopolymerer av PEG og én eller flere polyoler, og kopolymerer av PEG og PLGA (poly(melkesyre/glykolsyre)).
Definisjonen "salter" som anvendt her refererer både til saltene av karboksylgruppene og til saltene av aminofunksjonene av forbindelsen som er oppnåelig ved kjente metoder. Saltene av karboksylgruppene omfatter uorganiske salter som f.eks. natrium-, kalium- og kalsiumsalter og salter med organiske baser som de dannet med et amin som trietanolamin, argin eller lysin. Saltene av aminogruppene omfatter f.eks. salter med uorganiske syrer som saltsyre og med organiske syrer som eddiksyre.
Definisjonen "funksjonelle derivater" som anvendt her refererer til derivater som kan fremstilles fra de funksjonelle gruppene tilstede på de laterale kjedene av aminosyreandelene eller på de terminale N- eller C-gruppene i henhold til kjente metoder og er inkludert i den foreliggende oppfinnelsen når de er farmasøytisk akseptable, dvs. når de ikke kan ødelegge proteinaktiviteten eller ikke gir toksisitet til de farmasøytiske blandingene inneholdende dem. Slike derivater omfatter f.eks. estere eller alifatiske amider av karboksylgruppene og N-acylderivater av fri aminogrupper eller O-acylderivater av fri hydroksylgrupper og er dannet med acylgrupper som f.eks. alkanoyl- eller aroylgrupper.
"Forløperne" er forbindelser som er omdannet til IFN-P i menneske- eller dyrekroppen.
Som "aktive fraksjoner" av proteinet refererer den foreliggende oppfinnelsen til ethvert fragment eller enhver forløper av polypeptidkjeden i selve forbindelsen, alene eller i kombinasjon med relaterte molekyler og rester bundet i den, f.eks. rester av sukre eller fosfater, eller aggregater av polypeptidmolekylet når slike fragmenter eller forløpere viser den samme aktiviteten av IFN-P som medikament.
Konjugatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles ved enhver av metodene kjent på området. Ifølge en utførelse av oppfinnelsen reageres IFN-P med det PEGylerende midlet i et passende løsningsmiddel og det ønskede konjugatet isoleres og renses f.eks. ved å anvende én eller flere kromatografiske metoder.
"Kromatografisk metode" betyr enhver teknikk som er anvendt for å separere komponentene av en blanding ved deres applikasjon på en bærer (stasjonær fase) hvorigjennom et løsningsmiddel (mobil fase) strømmer. Separasjonsprinsippene i kromatografien er basert på den forskjellige fysikalske beskaffenheten til stasjonær og mobil fase.
Noen spesielle typer kromatografiske metoder, som er velkjent innen litteraturen, omfatter: væske, høytrykksvæske, ioneutvekslings, absorpsjons, affinitets, partisjons, hydrofobisk, reversert fase, gelfilterering, ultrafiltrering eller tynnlags-kromatografi.
"Det tiol-reaktive PEGylerende midlet" som anvendt i den foreliggende fremstillingen, betyr ethvert PEG-derivat som er i stand til å reagere med tiolgruppen av cysteinresten. Det kan f.eks. være PEG inneholdende en funksjonell
gruppe slik som ortopyridyldisulfid, vinylsulfon, maleimid, iodacetimid, og andre. Ifølge en foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelsen er det tiol-reaktive PEGylerende midlet ortopyridyldisulfid (OPSS) derivatet av PEG.
Det PEGylerende midlet er anvendt i dens mono-metoksylerte form hvor bare én ende er tilgjengelig for konjugasjon, eller i en bifunksjonell form hvor begge endene er tilgjengelige for konjugasjon, slik som f.eks. i dannelse av et konjugat med to IFN-P kovalent festet til en enkelt PEG-andel. Det har fortrinnsvis en molekylvekt på 500-100000.
En typisk reaksjonsrute for fremstillingen av konjugatene ifølge oppfinnelsen er presentert under:
Den andre linjen av ruten ovenfor rapporterer en metode for kløyving av PEG-proteinkjeden. mPEG-OPSS-derivatet er svært selektivt for fri sulfhydrylgrupper og reagerer raskt under sure pH-betingelser hvor IFN-P er stabilt. Den høye selektiviteten kan demonstreres fra reduksjonen av konjugatet til den native formen av IFN-p og PEG.
Disulfidbindingen som produseres mellom proteinene og PEG-andelene er blitt vist å være stabil i sirkulasjonen, men den kan reduseres ved at den går inn i cellemiljøet. Derfor er det forventet at dette konjugatet, som ikke går inn i cellen, vil være stabil i sirkulasjonen inntil den er klarert.
Det skal bemerkes at den ovennevnte reaksjonen er arealbegrenset fordi de to andre Cys-restene som fremkommer ved posisjonene 31 og 141 i den naturlig forekommende formen av human IFN-P ikke reagerer med det tiol-reaktive PEGylerende midlet siden de danner en disulfidbro.
En fremgangsmåte for den trinnvise festingen av to eller flere PEG-andeler til et polypeptid kan også benyttes. En slik fremgangsmåte er basert på erkjennelsen at en aktivert PEG med lav molekylvekt reagerer mer fullstendig med et sterisk hindret reaksjonssete på et protein enn et aktivert PEG med høy molekylvekt. PEG-modifisering av dyre terapeutiske proteiner må være kostnadseffektive for produksjonen av PEG-konjugatet skal være praktisk. I tillegg, for å redusere glomerular filtrasjon og optimalisere de farmakologiske egenskapene av PEG- proteinkonjugatet, bør konjugatet ha en effektiv størrelse ekvivalent med det for et protein med en molekylvekt på 70 kDa. Dette betyr at for en arealbegrenset modifisering hvor 1 PEG vil være festet, er et PEG-derivat som har en molekylvekt på større enn 20 kDa fortrinnsvis festet. Hvis stedet for modifisering er sterisk overfylt, kan den reaktive gruppen på den store PEG-andelen ha vanskeligheter med å nå modifiseringsstedet og vil således føre til lavere utbytter. En metode for PEGylering av et polypeptid øker utbyttet av arealbegrenset PEGylering ved først å feste en liten hetero eller homo bifunksjonell PEG-andel at, på grunn av dens relativt mindre størrelse, kan reagere med sterisk overfylte seter. Etterfølgende festing av et PEG-derivat med høy molekylvekt til det lille PEG resulterer i høyt utbytte av det ønskede PEGylerte proteinet.
Metoden for trinnvis festing av to eller flere PEG-andeler i serie til et polypeptid omfatter festing av en lavmolekylvekt heterobifunksjonell eller homobifunksjonell PEG-andel først til polypeptidet og deretter festing av en monofunksjonell eller bifunksjonell PEG-andel til den fri enden av lavmolekylvekt PEG-andelen som er festet til polypeptidet. Etterfølgende den trinnvise festing av to eller flere PEG-andeler i serie til et polypeptid, hvis polypeptid er fortrinnsvis IFN-p og hvorCys1<7>, lokalisert i et sterisk overfylt sete, er det foretrukne setet for PEG-festing, kan PEG-polypeptidkonjugatet renses ved anvendelse av én eller flere av renseteknikkene slik som ioneutbyttekromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi, affinitetskromatografi, og reversibel fasekromatografi.
Lavmolekylvekt PEG-andelen har formelen:
hvor W og X er grupper som uavhengig reagerer med et amin, sulfhydryl, karboksyl eller hydroksylfunksjonell gruppe for å feste lavmolekylvekt PEG-andelen til polypeptidet. W og X er fortrinnsvis uavhengig valgt fra ortopyridyldisulfid, maleimider, vinylsulfoner, iodacetamider, aminer, tioler, karboksyler, aktive estere, benzotriazolkarbonater, p-nitrofenolkarbonater, isocyanater og biotin. Lavmolekylvekt PEG-andelen har fortrinnsvis en molekylvekt i området på 100-5000 dalton.
Den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen for festing til den fri enden av et lavmolekylvekt PEG som er festet til polypeptidet har fortrinnsvis en molekylvekt i området på 100-200 kDa og er fortrinnsvis en metoksy PEG, forgrenet PEG, hydrolytisk eller enzymatisk degraderbar PEG, pendant PEG, eller dendrimer PEG. Det monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG har videre formelen:
hvor Y er reaktiv til en terminal gruppe på den fri enden av lavmolekylvekt PEG-
andelen som er festet til polypeptidet og Z er -OCH3eller en gruppe reaktiv med for dannelse av et bifunksjonelt konjugat.
PEG-polypeptidkonjugatet produsert ved den ovennevnte metoden for trinnvis festing av to eller flere PEG-andeler kan anvendes for å produsere et medikament eller farmasøytisk blanding for behandling av sykdommer eller forstyrrelser hvor polypeptidene er effektive som en aktiv bestanddel.
En annen hensikt med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe konjugatene i stort sett renset form for at de skal være egnet til bruk i farmasøytiske blandinger, som aktiv bestanddel for behandlingen, diagnose eller prognose av bakterielle infeksjoner og virusinfeksjoner samt autoimmune sykdommer, betennelsessykdommer og tumorer. Slike farmasøytiske blandinger representerer en ytterligere hensikt med den foreliggende oppfinnelsen.
Ikke-begrensende eksempler på de ovennevnte sykdommene omfatter: septisk sjokk, AIDS, reumatoid artritt, lupus erytematøs og multippel sklerose.
Ytterligere utførelser og fordeler med oppfinnelsen vil fremkomme i den følgende beskrivelsen.
Administreringen av en farmakologisk aktiv mengde av konjugatene ifølge oppfinnelsen til subjekter med risiko for å utvikle én av sykdommene rapportert ovenfor eller til subjekter som allerede viser slike patologier kan utføres.
Enhver administreringsrute som er kompatibel med det aktive prinsippet kan anvendes. Parenteral administrasjon, slik som subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon er foretrukket. Dosen av den aktive bestanddelen som administreres avhenger av basisen av de medisinske reseptene ifølge alder, vekt og enkeltvis respons for pasienten.
Dosen kan være mellom 10 (ig og 1 mg daglig for en gjennomsnittlig kroppsvekt på 75 kg og den foretrukne daglige dosen er mellom 20 u.g og 200 u.g.
Den farmasøytiske blandingen for parenteral administrering kan fremstilles i en injiserbar form omfattende det aktive prinsippet og en egnet bærer. Bærere for den parenterale administreringen er velkjent på området og omfatter, f.eks. vann, saltholdig løsning, Ringer-løsning og/eller dekstrose. Bæreren kan inneholde små mengder av tilsetninger for å opprettholde stabiliteten og isotonisiteten av den farmasøytiske fremstillingen. Fremstillingen av løsningene kan utføres i henhold til de ordinære modalitetene.
Foreliggende oppfinnelse gjelder således polyol-interferon-P-konjugat som er kjennetegnet ved at den har en polyolandel som er kovalent bundet til Cys17 av human interferon-p.
Oppfinnelsen gjelder også en fremgangsmåte for fremstilling av polyol-interferon-P-konjugatet ifølge oppfinnelsen, der fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den innbefatter trinnene: reagere interferon-P med et tiol-reaktivt polyolmiddel for setespesifikt og
-kovalent å feste en polyolandel til Cys<17>av human interferon-p for å fremstille et polyol-interferon-P-konjugat; og
utvinne det produserte polyol-interferon-P-konjugatet.
Foreliggende oppfinnelse er også rettet på farmasøytiske blandinger som innbefatter et polyol-interferon-P-konjugat ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at den er en aktiv bestanddel, og en farmasøytisk akseptabel bærer, et tilsetningsstoff eller et hjelpemiddel.
I tillegg gjelder foreliggende oppfinnelse anvendelse av et polyol-interferon-P-konjugat ifølge oppfinnelsen, for fremstilling av et medikament til behandling av infeksjoner, tumorer og autoimmun- og betennelsessykdommer.
Den foreliggende oppfinnelsen er blitt beskrevet under henvisning til de spesifikke utførelsesformene, men innholdet i beskrivelsen omfatter alle modifiseringer og substitusjoner som kan gjøres av en fagmann på området uten å gå utover meningen og hensikten med det som er angitt i kravene.
Oppfinnelsen vil nå beskrives ved hjelp av følgende eksempler, som ikke skal anses for å være begrensende på noen som helst måte.
EKSEMPEL 1: Fremstilling av PEG- IFN- B- koniugat
Modifisering av IFN- B med mPEGsj r- OPSS
Rekombinant human IFN-P, stabil ved en konsentrasjon på 0,37 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 3,6, ble anvendt for fremstillingen av et PEG-IFN-P-konjugat. Omtrent 1,0 ml 6 M urea ble tilsatt 2 ml av IFN-p ved en konsentrasjon på 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 x IO"<8>mol). mPEG5k-OPSS ble tilsatt i molart overskudd av 50 mol til 1 mol av IFN-P og de to ble reagert i en polypropylenampulle for enten 2 timer ved 37°C eller 1 time ved 50°C. Reaksjonsblandingen ble analysert med kapillær elektroforese (CE) kurve for å bestemme graden av PEG-IFN-P-konjugatdannelse ved PEGylasjonsreaksjonen før noen rensing (fig. 1). Et typisk utbytte for denne reaksjonen er 50 % PEG-IFN-p. Reaksjonsproduktene ble filtrert fra reaksjonsblandingen med et 0,22 mm sprøytefilter og den filtrerte løsningen ble så ført oppå en størrelseseksklusjonskolonne (enten Superose 12 eller Superdex 75, Pharmacia) og vasket ut med 50 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Fig. 2A viser elusjonsprofilen fra rensingen av PEG-IFN-P-konjugatet og en Superose 12 størrelseseksklusjonskromatografikolonne. Toppene ble samlet og analysert med SDS-PAGE (fig. 3). Fraksjonene inneholdende PEG-IFN- p-konjugatet ble slått sammen og konsentrat ble så på nytt ført til den samme størrelseseksklusjonskolonnen for ytterligere å rense PEG-IFN-P-konjugatet på grunn av nærheten av "den native" IFN-P-toppen (fig. 2B). Denne prosedyren ble gjentatt (tredje gjennomløp) for å forsikre seg om renhet (fig. 2C). Fig. 4 og fig. 5 viser den kapillære elektroforesekurven og MALDI MS-spektrumet, henholdsvis, for det rensede PEG-IFN-P-konjugatet.
Modifisering av IFN- B med mPEG^- OPSS
Rekombinant human IFN-P ble tilveiebragt i løsning ved 0,36 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 3,6. Omtrent 36 mg mPEG30k-OPSS i 3 ml avionisert H2O ble tilsatt 3 ml IFN-p ved 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4.9 x 10"" mol) og de to ble reagert i en polypropylenampulle i 2 timer ved 50°C. Reaksjonsblandingen ble analysert med kapillær elektroforese for modifisering. Typiske utbytter for denne reaksjonen er < 30 %. Løsningen ble så ført oppå en størrelseseksklusjonskolonne (Superose 12, Pharmacia) og vasket ut med 50 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Toppene ble samlet og analysert med SDS-PAGE med hensyn på deres innhold.
EKSEMPEL 2: Biologisk aktivitet av PEG- IFN- B- konjugatet
For å fastslå effektene av PEGylering på anti-virusaktiviteten av human rekombinant IFN-p, ble humane WISH amniotiske celler preinkubert med enten nylig fremstilt IFN-P (samme mengde som anvendt for PEGylering) eller PEG-IFN-P-konjugat. Den IFN-P formidlede anti-virusaktiviteten, som målt ved WISH-VSV cytopatisitetsassay, ble bestemt ifølge et anti-virus WISH bioforsøk utviklet basert på protokollen til Novick et al., J- Immunol.. 129:2244-2247 (1982). De anvendte materialene i dette WISH-assayet er som følger:
WISH-celler (ATCC CCL 25)
Vesikulære Stomatitisvirus-beholdninger (ATCC C-520-001-522), lagret ved -70°C
IFN-P-human rekombinant, InterPharm Laboratories LTD (32, 075-type, Batch # 205035), 82 x IO<6>IU/ml, spesifikk aktivitet: 222 x IO<6>IU/mg PET-IFN-P-konjugat som fremtilt i eksempel 1 og opprettholdt i PBS, pH 7,4
WISH vekstmedium (MEM høy glykose med Earls salter + 10 % FBS + 1,0 % L-glutamin + penicillin/streptomycin (100 U/ml, 100 ug/ml)
WISH-assaymedium (MEM høy glykose med Earls salter + 5 % FBS + 1,0 % L-glutamin + penicillin/streptomycin (100 U/ml, 100 u,g/ml)
MTT ved 5 mg/ml i PBS, lagret ved -70°C. Protokollen for WISH-assayet er som følger:
- Fortynn IFN-p-prøvene til 2X startkonsentrasjonen i WISH-assaymediumet.
- Lag trippelfortynnede løsninger av IFN-P-prøver i WISH-assaymedium i flatbunnet 96-brønnplate slik at hver brønn inneholder 50 ul av fortynnet IFN-P-prøve (noen kontrollbrønner mottar 50 ul av bare WISH-assaymedium). - Høst loggvekstfase WISH-celler med trypsin/EDTA-løsning, vask i WISH-assaymedium, og bring det til en sluttkonsentrasjon på 0,8 x IO6 celler/ml. - Tilsett 50 (il av WISH-cellesuspensjon (4 x IO4 celler pr. brønn) til hver brønn. Sluttkonsentrasjon av IFN-P eksponert for cellene er nå IX. - Etter inkubering i 24 timer i en 5 % C02-humidifisert inkubator, tilsettes 50 ul av en 1:10 fortynning (i WISH-assaymedium) av VSV-beholdning (en dose forhånds-bestemt til «lyse» 100 % av WISH-celler i løpet av 48 timer) til alle brønner unntatt for ikke-viruskontrollbrønnene (disse mottar samme volum av bare assaymedium). - Etter ytterligere 48 timer tilsettes 25 ul av MTT-løsning til alle brønner, hvoretter plater inkuberes i ytterligere 2 timer i en inkubator. - Innholdene av brønnene fjernes ved plateinversjon, og 200 ul av 100 % etanol tilsettes brønnene. - Etter 1 time avleses platene ved 595 nm ved anvendelse av Soft max Pro programpakke og Spectramax spektrofotometersystem (Molecular Devices).
Som vist i fig. 6 og tabell 1 holdt PEG-IFN-p-konjugatet et nivå av anti-virus aktivitet som er overlegen det for den nylig fremstilte parentale mengden av IFN-p. Observasjonen at PEG-IFN-p-konjugatet har omtrent fire ganger høyere bioaktivitet enn det for nylig fremstilt IFN-P kan også være en konsekvens av den økte stabiliteten av PEG-IFN-B-konjugatet med hensyn på det "native" IFN-P etter tilsetting av WISH-celleassaymedium.
EKSEMPEL 3: In vitro forsøk av den relative aktiviteten av PEG- IFN- prøver Relativ bioaktivitet av PEG[30 kD]-IFN-p og PEG[2 x 20 kD]-IFN-p ble bestemt ved WISH-forsøk ved anvendelse av standardprotokollen beskrevet i eksempel 2 (tabell 2). Tre uavhengige forsøk ble utført av tre forskjellige personer ved forskjellige tider.
Bindingen av PEG-IFN-P til dens reseptor på celler ble evaluert i nærværet av en bestemt mengde av<125>I-IF<N->a2a. IFN-a2a ble radiomerket med<125>I ved anvendelse av kloramin-T-metoden. I-bundet-IFNa2a ble fjernet fra fritt iod ved å føre reaktantene gjennom en Sephadex G25 kolonne og sammenslåing av de proteininneholdende fraksjonene (Pharmacia).<125>I-IFN-oc2a ble kvantifisert ved et IFN-a2a ELISA-forsøk (Biosource, USA) og den spesifikke aktiviteten ble bestemt. Daudi-celler dyrket i den eksponensielle vekstfasen ble høstet og 2 x IO<6>celler ble inkubert med 0,5 nM I-IFN-oc2a i 3 timer ved romtemperatur i nærværet av forskjellige konsentrasjoner av PEG-IFN-p eller IFN-a2a fortynnet i en forsøksbuffer som er RPMI 1640 inneholdende 2 % fosterbovinserum og 0,1 % natriumazid. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene spunnet gjennom et lag av ftalatolje og den cellebundne radioaktiviteten ble talt på gamma-telleren. Videre var bindingen av PEG[30 kD]-IFN-P og PEG[2 x 20 kD]-IFN-p til reseptoren svært lik eller nær bindingsaktiviteten av IFN-P som vist i fig. 7.
I tillegg ble relativ aktivitet bestemt i en Daudi-celle (human B cellelymfoma) anti-proliferasjonsforsøk (tabell 3). Alle IFNer ble laget ved en 2x konsentrasjon av 200 ng/ml. Prøver ble trippelfortynnet ned platens lengde ved et sluttvolum på 100 ul. 1 x IO<5>celler/brønn (100 uls) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i totalt 72 timer ved 37°C i C02-humidifisert inkubator. Etter 48 timer ble tritiatisert (<3>H) tymidin tilsatt ved 1 u.Ci/brønn i 20 ul. Ved slutten av 72 timers inkubering ble platen høstet med Tomtek Plate Harvester. Resultatene vist i tabell 3 viser at ikke noe detekterbart tap av IFN-aktivitet ble observert fra PEGylering. Faktisk ble aktiviteten funnet å være noe høyere enn fri IFN-p. Dette kan skyldes dannelsen av inaktive aggregater i det fri IFN eller til forskjellene i kvantiseringsmetoder (aminosyreanalyse for PEG-IFN-prøver og RP-HPLC for IFN-P).
EKSEMPEL 4: Farmakokinetikkstudier i mus
Intravenøs administrering
Mus ble injisert med 100 ng av IFN-p, PEG[30 kD]-IFN-p eller PEG[2 X 20 kD]-IFN-P og blod ble fjernet ved angitte tider deretter. Serumkonsentrasjoner av IFN-P ble bestemt ved IFN-P-spesifikk ELIAS (Toray Industries) og resultatene er vist i fig. 8. 28 hunndyr B6D2F1 stammemus (6-8 uker) (omtrent 20 g hver) ble separert i fire grupper som følger: gruppe 1 inneholdt ni mus injisert med en 200 ul enkel pille på 500 ng/ml human IFN-P (sluttdose på 100 ng/mus); gruppe 2 (ni mus) mottok 200 ul av en ekvivalent masse av PEG30kD-IFN-P; gruppe 3 mottok 200 ul av en ekvivalent masse av PEG (2 x 20 kD)-IFN-p; og gruppe 4 er en gruppe av tre uinjiserte mus som fungerer som en negativ kontroll. Blodprøver (omtrent 200 ul/prøve) ble oppsamlet ved ni angitte tider ved avbrytelse av den retro-orbitale venøse pleksus med et kapillært rør. Blodprøver ble satt til å klumpe i 1 time ved romtemperatur, kantet og mikrosentrifugert. Sera fjernet derfra ble lagret ved -70°C inntil alle prøver var oppsamlet. Sera ble undersøkt for nærværet av bioaktiv human IFN-P ved anvendelse av Toray-inspeksjonen. Resultatene indikerte at området under kurven (AUC) er økt i betydelig grad i PEG-IFN-prøvene i forhold til fri IFN-p og at PEG-IFN-prøvene i forhold til fri IFN-p og at PEG[2 x 20 kD]-IFN-p er mye bedre enn PEG[30 kD]-IFN-p.
Subkutan administrering
Mus ble injisert subkutant med IFN-P og PEG-IFN (100 ng/mus). Fig. 9 viser at det totale området under kurven (AUC) økes dramatisk for PEG-IFN-prøvene sammenlignet med fri IFN-B. De farmakokinetiske studiene er sammenfallende med PEG-IFN-prøvene som har en lengre halveringstid og økt AUC.
EKSEMPEL 5: Festing av lavmolekylvektPEG- andel til polypeptid
Merking av interferon-beta med OPSS-PEG2k-hydrazid
Rekombinant human interferon-P ble ført i løsning ved 0,33 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer (pH 3,8). Omtrent 3,6 mg (40 mol overskudd til mol protein) av den heterobifunksjonelle PEG-reagensen, OPSS-PEG2k-hydrazid, i 2 ml avionisert vann ble tilsatt til 3 ml av IFN-P med 0,33 mg/ml (0,99 mg) og de to ble reagert i en polypropylenampulle i 1 time ved 45°C. Reaksjonsblandingen ble deretter analysert med kapillær elektroforese for å bestemme modifiseringsgraden. Typiske utbytter var i området på 90-97 % som var avhengig av renheten av interferon-P og PEG-reagensen. Løsningen ble deretter ført oppå en størrelses-eksklusjonskolonne (Superdex 75, Pharmacia) og vasket ut med 5 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Toppene ble samlet opp og analysert med SDS-PAGE. De monoPEGylerte interferon-P-fraksjonene ble slått sammen og deretter anvendt i et ytterligere modifiseringstrinn med høymolekylvekt PEG.
Merking av interferon- p med ( OPSSVPEG^ nn
Rekombinant human interferon-P ble ført i løsning ved 0,33 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 3,8. Omtrent 6,1 mg (40 mol overskudd til mol protein) av den homobifunksjonelle PEG-reagensen, (OPSS)2-PEG34oo, i 2 ml avionisert vann ble tilsatt 3 ml av interferon-p ved 0,33 mg/ml (0,99 mg) og de to ble reagert i en polypropylenampulle i 2 timer ved 50°C. Reaksjonen ble styrt med ikke-reduserende SDS-PAGE og sluttreaksjonsblandingen ble analysert med kapillær elektroforese for å bestemme graden av modifisering. Typiske modifiseringer for denne reaksjonen med interferon-p var > 95 %. Løsningen ble så ført oppå en størrelseseksklusjonsblander (Superdex 75, Pharmacia) og vasket ut med 50 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Toppene ble oppsamlet og analysert med SDS-PAGE med hensyn på deres innhold. De monoPEGylerte interferon-P-fraksj onene ble kombinert.
EKSEMPEL 6: Festing av andre PEG- andel til lavmolekylvekt PEGvlerings-polvpeptid
Modifisering av IFN- S- S- PEGTy- hvdrazid med mPEG^- aldehvd ( ALP )
Til de kombinerte fraksjonene av IFN-S-S-PEG2k-hydrazid i eksempel 5 ble tilsatt mPEG30k-ALD i et 20 mol overskudd til protein. Reaksjonen ble utført ved romtemperatur (25°C) i 4 timer og en prøve ble tilsatt til en størrelseseksklusjons-kolonne (Superose 6, Pharmacia) for å bestemme modifiseringsutbyttet. Modifiseringsutbyttet for denne reaksjonen var typisk > 80 % avhengig av renheten til PEG-reagensen og reaksjonsbetingelsene.
Ved at man nå fullstendig har beskrevet oppfinnelsen vil det nå erkjennes at for fagfolk på området kan det samme utføres innenfor et stort område av ekvivalente parametre, konsentrasjoner, og betingelser uten at å avvike fra rammen av oppfinnelsen og uten upassende eksperimentering.
Mens denne oppfinnelsen er blitt beskrevet i forbindelse med spesifikke utførelser derav, skal det forstås at den kan ytterligere modifiseres. Denne fremstillingen er ment å dekke enhver variasjon, anvendelse, eller tilpasning av oppfinnelsen etterfølgende, generelt, prinsippene for oppfinnelsen og omfattende slike avvik fra den foreliggende fremstillingen som er kjent innenfor vanlig praksis innen området som gjelder for oppfinnelsen og som kan gjelde for vesentlige trekk som her er fremsatt i patentkravene.
Alle referanser som her er angitt, omfattende journalartikler eller sammendrag, publisert eller upublisert US eller utenlandske patentsøknader, meddelte US eller utenlandske patenter, eller enhver annen referanse, er fullstendig innarbeidet ved referanse her, omfattende alle data, tabeller, figurer, og tekst presentert i de anførte referansene. Videre er alt innholdet av de anførte referansene innenfor referansene anført her også fullstendig innarbeidet ved referanse.
Referanse til kjente metodetrinn, konvensjonelle metodetrinn, kjente metoder eller konvensjonelle metoder er ikke på noen som helst måte en innrømmelse av at noe aspekt, beskrivelse eller utførelse av den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet, undervist eller foreslått i den relevante teknikken.
Den foregående beskrivelsen av de spesifikke utførelsene vil så fullstendig åpenbare den generelle beskaffenheten av oppfinnelsen som andre kan, ved å anvende kunnskap innenfor fagområdet (omfattende innholdene av de anførte referansene her), lett modifisere og/eller tilpasse for forskjellige applikasjoner slik som spesifikke utførelser, uten utilbørlig eksperimentering, uten å avvike fra det generelle konseptet for den foreliggende oppfinnelsen. Slike tilpasninger og modifikasjoner er derfor ment å være innenfor rammen av ekvivalentene til de beskrevne utførelsene, basert på den lære og retningslinjen som er presentert her. Det skal også forstås at fraseologien eller terminologien her er for det formål å beskrive og ikke begrense, slik at terminologien eller fraseologien for den foreliggende fremstillingen skal tolkes slik av en fagmann i lys av den lære og retningslinjene presentert her, i kombinasjon med kunnskapen til en fagmann på området.

Claims (12)

1. Polyol-interferon-p-konjugat, karakterisert vedat den har en polyolandel som er kovalent bundet til Cys<17>av human interferon-B.
2. Polyol-interferon-B-konjugat som angitt i krav 1, karakterisert vedat polyolandelen er en polyalkylenglykolandel.
3. Polyol-interferon-P-konjugat som angitt i krav 2, karakterisert vedat polyalkylenglykolandelen er en polyetylenglykol (PEG) andel.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av polyol-interferon-P-konjugatet som angitt i krav 1, karakterisert vedat den innbefatter trinnene: reagere interferon-P med et tiol-reaktivt polyolmiddel for setespesifikt og -kovalent å feste en polyolandel til Cys<17>av human interferon-P for å fremstille et polyol-interferon-P-konjugat; og utvinne det produserte polyol-interferon-P-konjugatet.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert vedat det tiol-reaktive polyolmidlet er et tiol-reaktivt PEGyleringsmiddel.
6. Fremgangsmåte som angitt i enten krav 4 eller krav 5,karakterisert vedat det tiol-reaktive polyolmidlet er mono-metoksylert.
7. Fremgangsmåte som angitt i enten krav 4 eller 5, karakterisert vedat det tiol-reaktive polyolmidlet er bifunksjonelt.
8. Fremgangsmåte som angitt i enten krav 4 eller 5, karakterisert vedat det diol-reaktive polyolmidlet er et polyolderivat som har en funksjonell gruppe valgt fra gruppen bestående av ortopyridyldisulfid, vinylsulfon, maleimid og iodacetimid.
9. Fremgangsmåte som angitt i enten krav 4 eller 5, karakterisert vedat det tiol-reaktive polyolmidlet er et ortopyridyldisulfidderivat av et mono-metoksylert polyol.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert vedat reaksjonstrinnet utføres ved en sur pH hvor interferon-P er stabil.
11. Farmasøytisk blanding som innbefatter et polyol-interferon-P-konjugat som angitt i hvilke som helst av kravene 1-3, karakterisert vedat den er en aktiv bestanddel, og en farmasøytisk akseptabel bærer, et tilsetningsstoff eller et hjelpemiddel.
12. Anvendelse av et polyol-interferon-P-konjugat som angitt i hvilke som helst av kravene 1-3, for fremstilling av et medikament til behandling av infeksjoner, tumorer og autoimmun- og betennelsessykdommer.
NO20005337A 1998-04-28 2000-10-23 Polyol-interferon-ß-konjugat, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk blanding derav og anvendelse derav for fremstilling av medikamenter. NO329749B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28
PCT/US1999/009161 WO1999055377A2 (en) 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-ifn-beta conjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20005337D0 NO20005337D0 (no) 2000-10-23
NO20005337L NO20005337L (no) 2000-12-28
NO329749B1 true NO329749B1 (no) 2010-12-13

Family

ID=22177687

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20005337A NO329749B1 (no) 1998-04-28 2000-10-23 Polyol-interferon-ß-konjugat, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk blanding derav og anvendelse derav for fremstilling av medikamenter.
NO20100324A NO332224B1 (no) 1998-04-28 2010-03-09 Fremgangsmate for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20100324A NO332224B1 (no) 1998-04-28 2010-03-09 Fremgangsmate for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid

Country Status (31)

Country Link
US (3) US6638500B1 (no)
EP (2) EP1421956B1 (no)
JP (2) JP4574007B2 (no)
KR (1) KR100622796B1 (no)
CN (2) CN1187094C (no)
AR (1) AR020070A1 (no)
AT (2) ATE365563T1 (no)
AU (1) AU762621B2 (no)
BG (2) BG65046B1 (no)
BR (1) BR9910023A (no)
CA (2) CA2330451A1 (no)
CY (1) CY1108022T1 (no)
CZ (2) CZ298579B6 (no)
DE (2) DE69920002T2 (no)
DK (2) DK1075281T3 (no)
EA (2) EA200300382A1 (no)
EE (1) EE05214B1 (no)
ES (2) ES2285286T3 (no)
HK (2) HK1038194A1 (no)
HU (1) HUP0300548A3 (no)
IL (1) IL139286A (no)
NO (2) NO329749B1 (no)
NZ (1) NZ507456A (no)
PL (2) PL193352B1 (no)
PT (2) PT1421956E (no)
SI (2) SI1421956T1 (no)
SK (2) SK286217B6 (no)
TR (2) TR200003161T2 (no)
TW (2) TWI266800B (no)
UA (2) UA66857C2 (no)
WO (1) WO1999055377A2 (no)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
ES2265693T3 (es) * 1998-10-16 2007-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Proteinas de fusion con interferon-beta y usos.
ES2630278T3 (es) * 1998-10-16 2017-08-21 Biogen Ma Inc. Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
CN1244376C (zh) * 1999-04-23 2006-03-08 阿尔萨公司 可释放的键和含有该键的组合物
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
TR200101086A3 (no) * 1999-10-15 2001-08-21
JP4593048B2 (ja) 1999-12-24 2010-12-08 協和発酵キリン株式会社 分岐型ポリアルキレングリコール類
ES2327606T3 (es) 2000-01-10 2009-11-02 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de g-csf.
DE60138364D1 (de) 2000-02-11 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
CA2436623C (en) 2001-01-30 2011-08-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Branched polyalkylene glycols
EP1234583A1 (en) 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
YU48703A (sh) 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
NZ530545A (en) 2001-07-11 2006-10-27 Maxygen Holdings Ltd Specific conjugates comprising a polypeptide exhibiting G-CSF activity and a non-polypeptide moiety
EA009783B1 (ru) 2002-01-18 2008-04-28 Байоджен Айдек Ма Инк. Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
PL219741B1 (pl) 2002-12-26 2015-07-31 Mountain View Pharmaceuticals Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanie
TWI364295B (en) 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
AU2004221761B2 (en) 2003-03-20 2010-01-07 Bayer Healthcare Llc FVII or FVIIa variants
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
JP2007538048A (ja) 2004-05-17 2007-12-27 アレス トレーディング ソシエテ アノニム ヒドロゲル・インターフェロン製剤
WO2005117948A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Ares Trading S.A. Method of stabilizing proteins
US7731948B2 (en) 2004-06-01 2010-06-08 Ares Trading S.A. Stabilized interferon liquid formulations
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
US7851565B2 (en) 2004-12-21 2010-12-14 Nektar Therapeutics Stabilized polymeric thiol reagents
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
NZ555386A (en) 2004-12-22 2011-01-28 Ambrx Inc Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
JP2009503111A (ja) * 2005-08-04 2009-01-29 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション Ｇ−ｃｓｆ部分および重合体の複合体
LT1917276T (lt) 2005-08-26 2018-05-25 Ares Trading S.A. Glikozilinto interferono beta gavimo būdas
JP2009507003A (ja) 2005-09-01 2009-02-19 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 視神経炎の治療
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2395099A3 (en) * 2006-05-02 2012-05-16 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
MX2008014971A (es) 2006-05-24 2008-12-05 Serono Lab Regimen de cladribine para tratar esclerosis multiple.
EP2213733A3 (en) 2006-05-24 2010-12-29 Novo Nordisk Health Care AG Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
WO2008137471A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
KR20100099298A (ko) 2007-12-20 2010-09-10 메르크 세로노 에스. 에이. Ｐｅｇ­인터페론­베타 제형
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
WO2009155102A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Barofold, Inc. Method for derivatization of proteins using hydrostatic pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
WO2011101242A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
EP2593130A2 (en) 2010-07-15 2013-05-22 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
EP3466968A1 (en) 2010-09-15 2019-04-10 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Factor viii variants having a decreased cellular uptake
JP2014506889A (ja) * 2011-02-18 2014-03-20 ステムディーアール インク． Ｓｉｒｔ１発現誘導物質を含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用組成物
CA2840552A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
SG10201602076QA (en) * 2011-10-01 2016-04-28 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
WO2013130684A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Amunix Operating Inc. Xten-folate conjugate compositions and methods of making same
CN104136038A (zh) 2012-02-29 2014-11-05 东丽株式会社 体腔积液抑制剂
CN104334574B (zh) 2013-03-29 2020-01-14 株式会社糖锁工学研究所 附加唾液酸化糖链的多肽
US11759500B2 (en) 2014-07-24 2023-09-19 Abion Inc. PEGylated interferon-beta variant
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
MX2017002140A (es) 2014-08-19 2017-08-21 Biogen Ma Inc Metodo de pegilacion.
EP4014985A1 (en) 2015-05-01 2022-06-22 Allysta Pharmaceuticals, Inc. Adiponectin peptidomimetics for treating ocular disorders
MD3310816T2 (ro) * 2015-06-19 2021-01-31 Eisai R&D Man Co Ltd Imunoglobuline conjugate Cys80
JP7146897B2 (ja) * 2017-04-17 2022-10-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト ホモシスチン尿症の治療のための酵素補充療法の最適化
WO2020158690A1 (ja) 2019-01-28 2020-08-06 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
WO2020158691A1 (ja) 2019-01-28 2020-08-06 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2524586B2 (ja) * 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
PT730470E (pt) 1993-11-10 2002-08-30 Enzon Inc Conjugados melhorados de interferao-polimero
US5766581A (en) 1994-03-31 1998-06-16 Amgen Inc. Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation
AU696387B2 (en) * 1994-05-18 1998-09-10 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
ATE200030T1 (de) * 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
NZ502375A (en) * 1997-07-14 2001-11-30 Bolder Biotechnology Inc The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
AU762621B2 (en) 2003-07-03
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
CZ298579B6 (cs) 2007-11-14
PL344490A1 (en) 2001-11-05
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
SK286217B6 (sk) 2008-05-06
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
AR020070A1 (es) 2002-04-10
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
UA66857C2 (uk) 2004-06-15
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
PL196533B1 (pl) 2008-01-31
CN100335503C (zh) 2007-09-05
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
PT1421956E (pt) 2007-07-13
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
CN1637020A (zh) 2005-07-13
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
PT1075281E (pt) 2004-11-30
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
US7700314B2 (en) 2010-04-20
US7357925B2 (en) 2008-04-15
AU3767499A (en) 1999-11-16
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
BR9910023A (pt) 2000-12-26
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
HK1076115A1 (en) 2006-01-06
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
CN1302209A (zh) 2001-07-04
US6638500B1 (en) 2003-10-28
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
NO20100324L (no) 2000-12-28
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
TWI232882B (en) 2005-05-21
CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
BG64694B1 (bg) 2005-12-30
BG104871A (en) 2001-07-31
IL139286A0 (en) 2001-11-25
EE200000614A (et) 2002-04-15
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
HK1038194A1 (en) 2002-03-08
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
NO20005337L (no) 2000-12-28
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
BG109291A (en) 2006-04-28
EA003789B1 (ru) 2003-10-30
NZ507456A (en) 2003-10-31
TWI266800B (en) 2006-11-21
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
NO332224B1 (no) 2012-07-30
CN1187094C (zh) 2005-02-02
IL139286A (en) 2005-12-18
UA79430C2 (en) 2007-06-25
SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
SK286654B6 (sk) 2009-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO329749B1 (no) Polyol-interferon-ß-konjugat, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk blanding derav og anvendelse derav for fremstilling av medikamenter.
US5951974A (en) Interferon polymer conjugates
JP5563475B2 (ja) Ｐｅｇインターフェロン−ベータ製剤
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
CREP Change of representative

Representative=s name: ONSAGERS AS, POSTBOKS 6963 ST OLAVS PLASS, 0130 OS

MM1K Lapsed by not paying the annual fees