JP2002512983A - ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＰＥＧ部分がヒトＩＦＮ−βのＣｙｓ¹⁷に共有結合したＰＥＧ−ＩＦＮβ複合体が、チオール反応性ペグ化試薬を用いた特異的ペグ化の方法により製造される。感染、腫瘍および自己免疫疾患および炎症性疾患を治療するための薬剤組成物および方法も提供される。本発明は、さらに、ポリペプチド、より特定すればＩＦＮ−βに、連続したＰＥＧ部分を段階的に連結する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願に対するクロスリファレンス 本出願は、引用によりその全内容を編入する米国仮出願番号６０／０８３，３
３９からの３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。

【０００２】 発明の分野 本発明は、ポリオール−ＩＦＮ−β複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）に関し、
ポリオールユニットがＣｙｓ¹⁷に共有結合している。本発明のさらなる目的は、
それらの部位特異的生産のためのプロセス並びに細菌感染、ウイルス感染、自己
免疫疾患および炎症性疾患の治療、予防または診断におけるそれらの使用である
。本発明は、さらに、ポリペプチドへの２または複数のＰＥＧ部分（ｍｏｉｅｔ
ｉｅｓ）の段階的連結方法に関する。

【０００３】 発明の背景 ヒト繊維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）は抗ウイルス活性を有し、且
つ新生物細胞に対してナチュラルキラー細胞を刺激することもできる。それは、
ウイルスおよび二本鎖ＲＮＡｓにより誘導される約２０，０００Ｄａのポリペプ
チドである。組換えＤＮＡ技術によりクローン化された、繊維芽細胞インターフ
ェロン遺伝子のヌクレオチド配列から、Ｄｅｒｙｎｋら（Ｎａｔｕｒｅ，２８５
：５４２−５４７，１９８０）は該蛋白質の完全アミノ酸配列を推定した。それ
は１６６アミノ酸長である。

【０００４】 Ｓｈｅｐａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ，２９４：５６３−５６５，１９８１）は、
その抗ウイルス活性を破壊する塩基８４２における変異（１４１位においてＣｙ
ｓ→Ｔｙｒ）、およびヌクレオチド１１１９−１１２１の欠損を伴う変異クロー
ンを記載した。

【０００５】 Ｍａｒｋら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１（
１８）：５６６２−５６６６、１９８４）は、塩基４６９（Ｔ）を（Ａ）に代え
て１７位においてＣｙｓ→Ｓｅｒへのアミノ酸スイッチを生じさせることにより
、人工的変異を挿入した。その結果のＩＦＮ−βは「天然」ＩＦＮ−βとして活
性であり、且つ長期保存（−７０℃）の間、安定であったと報告された。

【０００６】 ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）としても知られている、親水性ポリマーのポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子に対する共有結合は、バイオテクノロジ
ーおよび医薬における重要な応用を有する。そのもっとも共通の形態において、
ＰＥＧは各末端にヒドロキシル基を有する直鎖状ポリマー：

【０００７】

【化３】

【０００８】 である。 この式は、簡単にＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表すことができ、式中、−ＰＥＧ
−は末端基を有さないポリマーバックボーンを表すことを意味し、「−ＰＥＧ−
」は、

【０００９】

【化４】

【００１０】 を意味する。 ＰＥＧはメトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ（ｍ−ＰＥＧ）として共通に使用され、一方
の末端は相対的に不活性なメトキシ基であり、他方の末端は化学修飾に供するヒ
ドロキシル基である。

【００１１】

【化５】

【００１２】 分枝ＰＥＧｓも共通に使用される。分枝ＰＥＧｓはＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）_mと
して表され、式中、Ｒは中心のコア部分、例えばペンタエリスリトールまたはグ
リセロールを表し、そしてｍは分枝の腕の数を表す。分枝の腕の数（ｍ）は３か
ら１００またはそれ以上の範囲でありうる。ヒドロキシル基は化学修飾に供され
る。

【００１３】 他の分枝形態、例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ ９６／２１４６９に記載された形
態は、化学修飾に供される単一の末端を有する。この種のＰＥＧは（ＣＨ₃Ｏ−
ＰＥＧ−）ｐＲ−Ｘとして表され、式中、ｐは２または３に等しく、Ｒは中心コ
ア、例えばリジンまたはグリセロールを表し、そしてＸは官能基、例えば化学修
飾に供されるカルボキシルを表す。さらに別の分枝形態、「ペンダントＰＥＧ」
は、反応性基、例えばカルボキシルを、ＰＥＧ鎖の末端よりむしろＰＥＧバック
ボーンに沿って有する。

【００１４】 ＰＥＧのこれらの形態に加えて、バックボーン中の弱いかまたは分解可能な結
合を伴ってポリマーを製造することもできる。例えば、Ｈａｒｒｉｓは、米国特
許出願０６／０２６，７１６において、加水分解に供されるポリマーバックボー
ン中のエステル結合を伴うＰＥＧが製造できることを示した。この加水分解は、
反応スキム：

【００１５】

【化６】

【００１６】 に従い、ポリマーの分割をもたらして、低分子量の断片にする。 本発明によれば、用語ポリエチレングリコールまたはＰＥＧは上記誘導体全て
を含むことを意図する。

【００１７】 エチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーはそれらの化学において
ＰＥＧと密接に関連しており、それらはその多くの応用においてＰＥＧに代えて
使用できる。それらは以下の一般式：

【００１８】

【化７】

【００１９】 を有し、式中、ＲはＨまたはＣＨ₃である。 ＰＥＧは高い水溶性並びに多くの有機溶媒中での高い溶解性を有する有用なポ
リマーである。ＰＥＧは無毒であり且つ非免疫原性である。ＰＥＧを化学的に水
溶性化合物に連結する場合（ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ））、その結果の複
合体は一般に水溶性であり並びに多くの有機溶媒に溶解性である。

【００２０】 ＰＥＧ−蛋白質複合体は現在蛋白質置換治療においておよび他の治療用途のた
めに使用されつつある。例えば、ペグ化アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＧＥＮ
）は重篤な複合性免疫不全疾患（ＳＣＩＤＳ）の治療に使用されつつあり、ペグ
化Ｌ−アスパラギナーゼ（ＯＮＣＡＰＳＰＡＲ）は急性リンパ芽球性白血病（Ａ
ＬＬ）の治療に使用されつつあり、そしてペグ化インターフェロン−α（ＩＮＴ
ＲＯＮ（Ｒ）Ａ）はＣ型肝炎治療のためのＩＩＩ期のトライアルにおいて使用さ
れる。

【００２１】 臨床上の効能を有するＰＥＧ−蛋白質複合体の一般的な総説に関しては、Ｎ．
Ｌ．Ｂｕｒｎｈａｍ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．，１５：２１０−２１
８，１９９４を参照されたい。

【００２２】 蛋白質をペグ化するための様々な方法が開発されてきた。蛋白質上に見いださ
れた反応性基へのＰＥＧの結合は、典型的には、求電子的活性化ＰＥＧ誘導体を
利用して行われる。リジン残基およびＮ−末端上に見いだされたα−およびε−
アミノ基へのＰＥＧの連結は、生成物の混合物からなる複合体をもたらす。

【００２３】 一般に、そのような複合体は、蛋白質分子あたり連結されたいくつかのＰＥＧ
分子の集団からなり（「ＰＥＧマー（ＰＥＧｍｅｒｓ）」）、０から蛋白質中の
アミノ基の数までの範囲に及ぶ。一カ所修飾された蛋白質分子に関しては、ＰＥ
Ｇユニットを多くの異なるアミン部位に連結してよい。

【００２４】 この種の非特異的ペグ化は、ほとんど不活性になる多くの複合体をもたらした
。活性の低下は、多くのサイトカインおよび抗体の場合のように、蛋白質の活性
な結合ドメインを遮蔽することにより引き起こされるのが典型的である。例えば
、Ｋａｔｒｅらは米国特許４，７６６，１０６および米国特許４，９１７，８８
８において、大過剰のメトキシ−ポリエチレングリコールＮ−サクシニミジルグ
ルタレートおよびメトキシ−ポリエチレングリコールＮ−サクシニミジルスクシ
ネートによるＩＦＮ−βおよびＩＬ−２のペグ化を記載する。両蛋白質は微生物
宿主細胞中で生産され、遊離システインからセリンへの部位特異的変異を可能に
した。該変異は蛋白質フォールディングを促進するためにＩＦＮ−βの微生物発
現において必要であった。特に、この実験において使用されたＩＦＮ−βは市販
製品Ｂｅｔａｓｅｒｏｎであり、Ｃｙｓ¹⁷残基がセリンに置換されている。さら
に、グリコシレーションの不在はその水溶液中での溶解性を低下させた。非特異
的ペグ化は増大した溶解性をもたらしたが、主要な問題は活性および収量のレベ
ルの低下であった。

【００２５】 「ＰＥＧ−インターフェロン複合体」と題された欧州特許出願ＥＰ ５９３
８６８は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α複合体の製造を記載する。しかしながら、ペグ化
反応は部位特異的ではなく、よってＰＥＧ−ＩＦＮ−α複合体の位置的アイソマ
ーの混合物が得られる（Ｍｏｎｋａｒｓｈら、ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，６
８０：２０７−２１６，１９９７を参照されたい）。

【００２６】 Ｋｉｎｓｔｌｅｒらは、欧州特許出願ＥＰ ６７５ ２０１において、巨核球
の成長および発生因子（ＭＧＤＦ）のＮ末端残基の、ｍＰＥＧ−プロピオンアル
デヒドを用いた選択的修飾を例示した。これは、ロットごとの再生可能なペグ化
および薬物速度論を可能にした。Ｇｉｌｂｅｒｔらは、米国特許５，７１１，９
４４において、ＩＦＮ−αの最適レベルの活性を伴うペグ化が生じ得たことを例
示した。この例においては、最適な複合体を得るために、ほねをおる精製工程が
必要であった。

【００２７】 大多数のサイトカイン、並びに他の蛋白質は、特定のＰＥＧ連結部位を所有せ
ず、そして上記の例とは異なり、ペグ化反応を通して生じたアイソマーのいくつ
かが一部または全体に不活性である可能性が極めて高く、即ち、最終混合物の活
性の損失を引き起こす。

【００２８】 部位特異的モノ−ペグ化は、即ち、そのような蛋白質複合体の製造における所
望の到達点である。 Ｗｏｇｈｉｒｅｎらは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４（５）：
３１４−３１８，１９９３において、そのような部位特異的ペグ化のためのチオ
ール−選択的ＰＥＧ誘導体を合成した。オルトピリジルジスルフィド反応性基の
形態の安定なチオール−保護されたＰＥＧ誘導体が、蛋白質パパイン中の遊離シ
ステインに特異的に複合したことを示した。パパインとＰＥＧの間に新たに形成
されたジスルフィド結合は、マイルドな還元条件下において分割されることによ
り天然蛋白質を再生できた。

【００２９】 本明細書中のあらゆる書類の引用文献は、そのような書類が関係のある先行技
術であるとの承認としては意図されず、あるいは本出願のあらゆる請求項の特許
性に対しての材料であると考えられる。あらゆる書類の内容または日付に関する
あらゆる陳述は出願時における出願人にとって利用可能な情報に基づき、そして
そのような陳述の正確さに関する承認を構成しない。

【００３０】 発明の概要 本発明においては、ポリオール−ＩＦＮ−β複合体、および特にＰＥＧ−ＩＦ
Ｎ−β複合体が提供され、ポリオールユニットはＣｙｓ¹⁷に共有結合される。特
定の複合はチオール反応性ポリオール薬剤をＩＦＮ−β中のＣｙｓ¹⁷残基に反応
させることにより得られる。そのような複合体はインビボにおける増加した効能
を示すことが予測される。この目的は、中性ｐＨにおける増加した溶解性、増加
した安定性（低下した凝集性）、低下した免疫原性、および「天然」ＩＦＮ−β
に関する活性の不損失を得ることである。そのような複合の結果は、意図された
効果のための投薬数を減少させ、薬剤組成物の製剤化を単純化および安定化させ
、そしておそらくは長期間の効果を増加させるはずである。

【００３１】 本発明は、さらに、一連のＰＥＧ部分のポリペプチドに対しての段階的な連結
のための方法を提供する。 発明の詳細な説明 本発明は、ポリオール部分、より特定すればＰＥＧ部分のヒトＩＦＮ−βのＣ
ｙｓ¹⁷残基への連結が、天然ヒトインターフェロン−βのよりもＩＦＮ−βの生
物活性を予想以上に増加させた（または少なくとも保持し、そして低下はさせな
かった）との発見に基づく。即ち、Ｃｙｓ¹⁷残基に連結したポリオール部分を有
するＩＦＮ−βが同じかまたは増大したＩＦＮ−β生物活性を呈するばかりでな
く、このポリオール−ＩＦＮ−β複合体はポリオール部分により授けられた所望
の特性、例えば増大した溶解性も提供する。

【００３２】 本明細書で使用される「ＩＦＮ−β」は、生物学上の流体からの単離により得
られるか、または原核または真核宿主細胞からＤＮＡ組換え技術により得られる
ヒト繊維芽細胞インターフェロン並びに天然に生じる形態において１７位に出現
するシステイン残基を含む限り、その塩、機能的誘導体、前駆体および活性画分
を意味する。

【００３３】 本発明によるポリオール−ＩＦＮ−β複合体中のポリオール部分は、直鎖また
は分枝鎖を有するあらゆる水溶性の単官能性または二官能性ポリ（アルキレンオ
キシド）でありうる。典型的には、上記ポリオールはポリ（アルキレングリコー
ル）、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかしながら、当
業者は、他のポリオール、例えばポリ（プロピレングリコール）およびポリエチ
レングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーが適切に使用されうる
ことを認識することになる。

【００３４】 本明細書にて使用するとおり、用語「ＰＥＧ部分（ｍｏｉｅｔｙ）」は、限定
されないが、直鎖または分枝ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、加水分解によるかまたは
酵素により分解可能なＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ、枝状ＰＥＧ、ＰＥＧと一つま
たは複数のポリオールのコポリマー、およびＰＥＧとＰＬＧＡ（ポリ（乳酸／グ
リコール酸））のコポリマーを含むことを意図する。

【００３５】 本明細書にて使用される定義「塩」は、公知の方法を通して得ることができる
化合物のカルボキシル基の塩とアミノ官能基の塩の両方を意味する。カルボキシ
ル基の塩は、無機塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム塩および有機塩
基の塩、例えばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジンのようなアミン
を用いて形成されるものを含む。アミノ基の塩は、例えば塩酸のような無機酸お
よび酢酸のような有機酸との塩を含む。

【００３６】 本明細書において使用される定義「官能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）誘導体」
は、アミノ酸部分の側鎖上または末端のＮ−またはＣ−基上に存在する官能基か
ら公知の方法に従って製造することができる誘導体を意味し、そしてそれらが薬
学上受容可能である場合、即ち、それらが蛋白質の活性を破壊しないかまたはそ
れらを含む薬剤組成物に毒性を付与しない場合に、本発明に包含される。そのよ
うな誘導体は、例えば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミドおよび遊
離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を
含み、そしてアルカノイル−またはアロイル−基のようなアシル−基で形成され
る。

【００３７】 「前駆体」は、ヒトまたは動物の体内でＩＦＮ−βに変換される化合物である
。 蛋白質の「活性画分」として、本発明は、単独でまたは関連分子あるいはそれ
に結合した残基、例えば糖またはリン酸の残基との組み合わせにおける、化合物
自体のポリペプチド鎖のあらゆる断片または前駆体、あるいはそのような断片ま
たは前駆体が医薬としてＩＦＮ−βと同じ活性を示す場合には該ポリペプチド分
子の集合体を意味する。

【００３８】 本発明の複合体は当業界のあらゆる手法を用いて製造することができる。本発
明の態様によれば、ＩＦＮ−βを適切な溶剤中でペグ化試薬と反応させ、そして
所望の複合体を単離し、そして例えば一つまたは複数のクロマトグラフィー法を
適用することにより精製する。

【００３９】 「クロマトグラフィー法」は、溶剤（移動相）が流れて通る支持体（定常相）
の上にそれらが適用されることにより、混合物の成分を分離するために使用され
るあらゆる技術を意味する。クロマトグラフィーの分離の原理は定常相と移動相
の物理的性質の違いに基づく。

【００４０】 いくつかの特定の種類のクロマトグラフィー法は文献においてよく知られてお
り、液体、高圧液体、イオン交換、吸着、親和性、分配、疎水性、逆相、ゲル濾
過、限外濾過または薄相クロマトグラフィーを含む。

【００４１】 本出願において使用される「チオール−反応性ペグ化試薬」は、システイン残
基のチオール基と反応可能なあらゆるペグ化試薬を意味する。それは、官能基、
例えばオルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド、ヨードア
セトアミドおよびその他を含むＰＥＧでありうる。本発明の好ましい態様によれ
ば、チオール反応性ペグ化試薬は、ＰＥＧのオルトピリジルジスルフィド（ＯＰ
ＳＳ）誘導体である。

【００４２】 ペグ化試薬は、一方の末端のみが複合に利用可能である、そのモノ−メトキシ
ル化形態、または両末端が複合に利用可能な二官能価の形態において、例えば単
一のＰＥＧ部分に共有結合した２つのＩＦＮ−βで複合体を形成することにおい
て、使用される。それは、５００から１００，０００の間の分子量を有すること
が好ましい。

【００４３】 本発明の複合体の製造のための典型的な反応スキムを以下に示す。

【００４４】

【化８】

【００４５】 上記スキムの第２の行は、ＰＥＧ−蛋白質結合を分解する方法を公表する。ｍ
ＰＥＧ−ＯＰＳＳ誘導体は、遊離のスルフィドリル基に関して高度に選択的であ
り、そしてＩＦＮ−βが安定な酸性ｐＨ条件下で迅速に反応する。高い選択性は
、複合体の、天然形態のＩＦＮ−βおよびＰＥＧへの変形（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ
）から証明することができる。

【００４６】 蛋白質とＰＥＧ部分の間に生じたジスルフィド結合は循環（ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ）においては安定であることが示されたが、細胞環境内に入る際に還元さ
れうる。よって、細胞内に入らないこの複合体は消えるまで循環内で安定である
ことが期待される。

【００４７】 天然に生じる形態のヒトＩＦＮ−β中の３１および１４１位に出現する他の２
つのＣｙｓ残基はジスルフィドブリッジを形成するため、チオール−反応性ペグ
化試薬と反応しないので、上記の反応は部位特異的であることに注目するべきで
ある。

【００４８】 本発明は、２つまたは複数のＰＥＧ部分をポリペプチドに段階的に連結する方
法にも向けられる。この方法は、低分子量活性化ＰＥＧが高分子量活性化ＰＥＧ
よりも蛋白質上の立体障害反応部位と、より競合的に反応するとの認識に基づく
。高価な治療用蛋白質のＰＥＧ−修飾は、ＰＥＧ複合体の製造を実用的にするた
めにはコスト上効果的にちがいない。さらに、糸球体濾過を減じてＰＥＧ−蛋白
質複合体の薬学上の特性を最適化するためには、複合体は７０ｋＤａの分子量を
有する蛋白質と均等な効果的サイズを有するべきである。これは、一つのＰＥＧ
が連結される場合の部位特異的修飾に関して、２０ｋＤａよりも大きい分子量を
有するＰＥＧ誘導体が好ましく連結されることを意味する。修飾の部位が立体的
に混雑している（ｃｒｏｗｄｅｄ）なら、大きなＰＥＧ部分上の反応基は、修飾
部位に到達する困難を有するかもしれず、即ち、低収量をもたらすことになる。
本発明によりポリペプチドをペグ化する好ましい方法は、その相対的に小さなサ
イズのために立体的に混雑した部位と反応できる小さなヘテロまたはホモの二官
能性ＰＥＧ部分を最初に連結することにより、部位特異的ペグ化の収量を増加さ
せる。高分子量ＰＥＧ誘導体の小さいＰＥＧへの続く連結は、所望のペグ化蛋白
質の高い収量をもたらす。

【００４９】 本発明による２つまたは複数の連続したＰＥＧ部分のポリペプチドへの段階的
連結方法は、低分子量のヘテロ二官能性またはホモ二官能性ＰＥＧ部分を最初に
ポリペプチドに連結して、次に該ポリペプチドに連結した低分子量ＰＥＧ部分の
遊離末端に単官能性または二官能性ＰＥＧ部分を連結することを含む。好ましく
は、ＩＦＮ−βであって立体的に混雑している部位に位置するＣｙｓ¹⁷がＰＥＧ
連結の好ましい部位であるポリペプチドへの、２つまたは複数の連続したＰＥＧ
部分の段階的連結の次に、該ＰＥＧ−ポリペプチド複合体を一つまたは複数の精
製技術、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー
、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、および逆相
クロマトグラフィーを用いて精製することができる。

【００５０】 低分子量ＰＥＧ部分は式：

【００５１】

【化９】

【００５２】 を有し、式中、ＷおよびＸはアミン、スルフィドリル、カルボキシルまたはヒド
ロキシル官能基と個別に反応することにより低分子量ＰＥＧ部分をポリペプチド
に連結する基である。ＷおよびＸは、好ましくは、オルトピリジルジスルフィド
、マレイミド類、ビニルスルフォン類、ヨードアセトアミド類、アミン類、チオ
ール類、カルボキシル類、活性エステル類、ベンゾトリアゾールカーボネート類
、ｐ−ニトロフェノールカーボネート類、イソシアネート類、およびビオチンか
らなる群から選択される。低分子量ＰＥＧ部分は、好ましくは、約１００から５
，０００ドルトンの範囲の分子量を有する。

【００５３】 ポリペプチドに連結する低分子量ＰＥＧの遊離末端への連結のための単官能性
または二官能性ＰＥＧ部分は、好ましくは、約１００ドルトンから２００ｋＤａ
の範囲の分子量を有し、そして好ましくはメトキシＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、加水分
解あるいは酵素により分解可能なＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ、または枝状ＰＥＧ
である。単官能性または二官能性ＰＥＧは、さらに、式：

【００５４】

【化１０】

【００５５】 を有し、式中、Ｙはポリペプチドに連結する低分子量ＰＥＧ部分の遊離末端上の
末端基に反応し、そしてＺは−ＯＣＨ₃であるかまたは反応性の基であることに
より二官能性複合体を形成する。

【００５６】 ２つまたは複数のＰＥＧ部分の段階的連結のための上記方法により生成された
ＰＥＧ−蛋白質複合体は、ポリペプチドが活性成分として有効な疾患または障害
を治療するための医薬または薬剤組成物を製造するのに使用することができる。

【００５７】 本発明の別の目的は、細菌またはウイルスの感染並びに自己免疫疾患、炎症性
疾患および腫瘍の治療、診断または予後のための活性成分として、実質的に精製
された形態の上記複合体を、薬剤組成物中の使用のために適切なものとするため
に提供することである。そのような薬剤組成物は本発明のさらなる目的を代表す
る。

【００５８】 上記疾患の非限定例は、敗血症ショック、ＡＩＤＳ、リウマチ様関節炎、エリ
テマトーデス、および多発性硬化症を含む。 本発明のさらなる態様および利点は以下の記載において明らかとなる。

【００５９】 本発明の一つの態様は、上記の疾患の一つを発症する危険のある対象またはそ
のような病理を既に示す対象への、薬学上活性量の本発明の複合体の投与である
。

【００６０】 即効性の（ａｃｔｉｖｅ）法則に匹敵するあらゆる投与経路を使用することが
できる。非経口投与、例えば皮下、筋肉内または静脈内注射が好ましい。投与さ
れる活性成分の投薬量は、患者の年齢、体重および個々の応答性による医薬処方
の基礎に依存する。

【００６１】 投薬量は７５ｋｇの平均体重に関して日に１０μｇと１ｍｇの間であることが
でき、好ましくは１日の投薬量は２０μｇと２００μｇの間である。 非経口投与のための薬剤組成物は、即効性の法則および適切な媒体を含む注射
可能な形態で製造することができる。非経口投与のための媒体は当業界において
公知であり、例えば、水、塩溶液、リンゲル液および／またはデキストロースを
含む。媒体が少量の賦形剤を含むことにより、薬剤調製物の安定性および等張性
を保持することができる。溶液の製造は通常の条件に従い実施することができる
。

【００６２】 本発明は特定の態様を参照して記載されてきたが、記載の内容は請求の範囲の
意味および目的を超えて拡張することなしに当業者によりもたらされることが可
能な全ての修飾および置換を含む。

【００６３】 本発明は、以下の実施例により今記載されるが、実施例は何れの意味において
も本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例１：ＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の製造 ｍＰＥＧ_5k−ＯＰＳＳによるＩＦＮ−βの修飾 ５０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ３．６中の０．３７ｍｇ／ｍｌの
濃度において安定な組換えヒトＩＦＮ−βをＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の製造に
用いた。約１．０ｍｌの６Ｍ尿素を０．３７ｍｇ／ｍｌの濃度（０．７４ｍｇ，
３．７Ｘ１０^-8ｍｏｌｅｓ）で２ｍｌのＩＦＮ−βに加えた。ｍＰＥＧ_5k−ＯＰ
ＳＳをＩＦＮ−β１モルに対して５０モルのモル過剰にて加え、そして両者をポ
リプロピレンバイアル中で３７℃において２時間または５０℃において１時間の
何れかにおいて反応させた。反応混合物は毛細管電気泳動（ＣＥ）を用いて分析
することにより、あらゆる精製前のペグ化反応によるＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体
形成の程度を測定した（図１）。この反応の典型的な収量は５０％ ＰＥＧ−Ｉ
ＦＮ−βである。反応生成物を０．２２ｍｍシリンジフィルターにより反応混合
物から濾過して、そして濾過された溶液を次にサイズ排除カラムに負荷して（Ｓ
ｕｐｅｒｏｓｅ１２またはＳｕｐｅｒｄｅｘ７５の何れか、ファルマシア）、５
０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０バッファーを用い
て溶出した。図２ＡはＳｕｐｅｒｏｓｅ１２サイズ排除クロマトグラフィーカラ
ム上のＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の精製からの溶出プロフィールを示す。ピーク
を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３）。ＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合
体を含む画分を一緒に保存して、濃縮物を次に再び同じサイズ排除カラムに負荷
することにより、「天然」ＩＦＮ−βピークの近接性により、さらにＰＥＧ−Ｉ
ＦＮ−β複合体を精製した（図２Ｂ）。この手法を繰り返すことにより（３回通
過）、精製度を確実にした（図２Ｃ）。図４および図５は、精製されたＰＥＧ−
ＩＦＮ−β複合体の、それぞれ毛細管電気泳動グラフおよびＭＡＬＤＩ ＭＳス
ペクトルを示す。ｍＰＥＧ_30k−ＯＰＳＳによるＩＦＮ−βの修飾 ５０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ３．６中の０．３６ｍｇ／ｍｌの
濃度において安定な組換えヒトＩＦＮ−βが提供された。３ｍｌの脱イオン水中
の約３６ｍｇのｍＰＥＧ_30k−ＯＰＳＳを３ｍｌのＩＦＮ−βに０．３６ｍｇ／
ｍｌにて加え（１．０８ｍｇ，４．９Ｘ１０^-8ｍｏｌｅｓ）、そして両者をポリ
プロピレンバイアル中で３７℃にて２時間において反応させた。反応混合物は修
飾の程度に関して毛細管電気泳動を用いて分析された。この反応の典型的な収量
は＜３０％である。該溶液は次にサイズ排除カラムに負荷して（Ｓｕｐｅｒｏｓ
ｅ１２、ファルマシア）、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，
ｐＨ７．０バッファーを用いて溶出した。ピークを回収して、その内容物に関し
てＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。実施例２：ＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の生物活性 ヒト組換えＩＦＮ−βの抗ウイルス活性に対するペグ化の効果を評価するため
に、ヒトＷＩＳＨ羊膜細胞を、新たに調製したＩＦＮ−β（ペグ化のために使用
したのと同じロット）またはＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体とプレインキュベートし
た。ＷＩＳＨ−ＶＳＶ細胞変性性アッセイにより測定されたＩＦＮ−β−媒介抗
ウイルス活性を、Ｎｏｖｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２２４４−
２２４７（１９８２）のプロトコルに基づいて開発された抗ウイルスＷＩＳＨバ
イオアッセイにより測定した。このＷＩＳＨアッセイにおいて使用された材料は
以下のとおりである： ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２５） −７０℃に保存された、水泡性口内炎ウイルスストック（ＡＴＣＣ Ｖ−５２
０−００１−５２２） ＩＦＮ−β、ヒト組換え体、ＩｎｔｅｒＰｈａｒｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ ＬＴＤ（３２，０７５−タイプ、バッチ＃２０５０３５）、８２ ｘ １０ ⁶ ＩＵ／ｍｌ，比活性：２２２ ｘ １０⁶ＩＵ／ｍｇ 実施例１において製造されたとおりのｐＢＳ，ｐＨ７．４中で保持されたＰＥ
Ｇ−ＩＦＮ−β複合体 ＷＩＳＨ生育媒体（ＭＥＭ高グルコース並びにイーグル塩＋１０％ ＦＢＳ＋
１．０％ Ｌ−グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ
，１００μｇ／ｍｌ） ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌにてマイナス７０℃にて保存されたＭＴＴ。

【００６４】 ＷＩＳＨアッセイのためのプロトコルは以下のとおりである： ＩＦＮ−βサンプルをＷＩＳＨアッセイ媒体で２Ｘ出発濃度に希釈する。 平底９６−ウエルプレート中のＷＩＳＨアッセイ媒体中のＩＦＮ−βサンプル
の３倍希釈を行い、各ウエルは５０μｌの希釈されたＩＦＮ−βサンプルを含む
（いくつかの対照ウエルは５０μｌのＷＩＳＨアッセイ媒体のみを含む）。

【００６５】 トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で対数増殖相のＷＩＳＨ細胞を採集し、ＷＩＳＨア
ッセイ媒体中で洗浄し、そして０．８ ｘ １０⁶細胞／ｍｌの最終濃度にする
。

【００６６】 ５０μｌのＷＩＳＨ細胞懸濁液（ウエルあたり４ ｘ １０⁴細胞）を各ウエ
ルに加える。細胞に暴露されるＩＦＮ−βの最終濃度は今１Ｘである。 ５％ＣＯ₂湿性インキュベーター中で２４時間インキュベート後に、ＶＳＶス
トックの１：１０希釈液（ＷＩＳＨアッセイ媒体中）５０μｌ（４８時間以内に
１００パーセントのＷＩＳＨ細胞を溶解することが予め測定された投薬量）を全
てのウエルに加えるが、但しウイルスを含まない対照ウエルは除く（これらは等
量のアッセイ媒体のみを受容する）。追加の４８時間後に、２５μｌのＭＴＴ溶
液を全てのウエルに加え、その後、プレートをインキュベーター中でさらに２時
間インキュベートする。

【００６７】 ウエルの含有物はプレートの倒置により除去し、そして２００μｌの１００％
エタノールをウエルに加える。 １時間後に、プレートはＳｏｆｔ ｍａｘ ＰｒｏソフトウエアおよびＳｐｅ
ｃｔｒａｍａｘ分光光度計システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を
用いて５９５ｎｍにおいて読む。

【００６８】

【表１】

【００６９】 図６および上記表１において例示したとおり、ＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体は、
ＩＦＮ−βの新たに調製された親ロットのレベルより優れた抗ウイルス活性レベ
ルを保持した。ＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体が新たに調製されたＩＦＮ−βよりも
約４倍高い生物活性を有するとの観察も、ＷＩＳＨ細胞アッセイ媒体の追加後の
「天然」ＩＦＮ−βに関してのＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の増大した安定性の結
果であるかもしれない。実施例３：ＰＥＧ−ＩＦＮサンプルの相対活性のインビトロアッセイ ＰＥＧ［３０ｋＤ］−ＩＦＮ−βおよびＰＥＧ［２Ｘ２０ｋＤ］−ＩＦＮ−β
の相対的生物活性を、実施例２に記載した標準プロトコルを用いたＷＩＳＨアッ
セイにより測定した（表２）。３つの個別のアッセイを、別々の時間に３人の別
の人により実施した。

【００７０】

【表２】

【００７１】 ＰＥＧ−ＩＦＮ−βの細胞上のその受容体への結合を、固定された量の¹²⁵Ｉ
−ＩＦＮ−α２ａの存在下で評価した。ＩＦＮ−α２ａはクロラミンＴ法を用い
て¹²⁵Ｉで放射性標識した。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムに反応物を通し、そ
して蛋白質を含む画分を保存することにより（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、¹²⁵Ｉ結
合ＩＦＮα２ａを遊離ヨウ素から分離した。¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２ａをＩＦＮ−
α２ａ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，米国）により定量して、比
活性を測定した。対数成長相で成長するＤａｕｄｉ細胞を採集して、２Ｘ１０⁶
細胞を０．５ｎＭの¹²⁵Ｉ−ＩＦＮ−α２ａと共に３時間室温において、２％胎
仔ウシ血清および０．１％アジ化ナトリウムを含むＲＰＭＩ１６４０であるアッ
セイバッファーで希釈した、異なる濃度のＰＥＧ−ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−α
２ａ存在下でインキュベートした。インキュベーションの終わりに、フタレート
オイルの層に細胞を回転して通過させ、そして細胞結合放射活性をガンマカウン
ターにより計数した。さらに、ＰＥＧ［３０ｋＤ］−ＩＦＮ−βおよびＰＥＧ［
２ｘ２０ｋＤ］−ＩＦＮ−βの受容体への結合は、図７に示すとおり、ＩＦＮ−
βの結合活性に極めて類似または近似していた。

【００７２】 さらに、Ｄａｕｄｉ細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）抗−増殖アッセイにおいて相
対活性を測定した（表３）。全てのＩＦＮｓは２００ｎｇ／ｍｌの２ｘ濃度にお
いて作成した。サンプルは、１００ｕｌの最終体積にてプレートの長さに沿って
３倍希釈した。１ｘ１０⁵細胞／ウエル（１００μｌｓ）を各ウエルに加えて、
ＣＯ₂湿性インキュベーター中で３７℃において全部で７２時間インキュベート
した。４８時間後に、トリチウム（³Ｈ）チミジンを１μＣｉ／ウエルにて２０
ｕｌで加えた。７２時間のインキュベート後に、Ｔｏｍｔｅｋ Ｐｌａｔｅ Ｈ
ａｒｖｅｓｔｅｒを用いてプレートを回収した。表３に示す結果は、ペグ化によ
る検出可能なＩＦＮ活性の損失は観察されなかったことを示す。事実、活性は遊
離ＩＦＮ−βよりもいくらか高かったことがわかった。これは、遊離ＩＦＮ中の
不活性凝集物の形成によるかまたは定量方法の違いによるかもしれない（ＰＥＧ
−ＩＦＮに関してはアミノ酸分析で、ＩＦＮ−βに関してはＲＰ−ＨＰＬＣ）。

【００７３】

【表３】

【００７４】実施例４：マウス静脈内投与における薬物速度論研究 静脈内投与 マウスに１００ｎｇのＰＥＧ［３０ｋＤ］−ＩＦＮ−βまたはＰＥＧ［２Ｘ２
０ｋＤ］−ＩＦＮ−βを注射して、以後に示された時間において採血した。ＩＦ
Ｎ−βの血清濃度は、ＩＦＮ−β特異的ＥＬＩＳＡ（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉｅｓ）により決定し、結果を図８に示す。２８匹のメスＢ６Ｄ２Ｆ１株マウ
ス（６−８週齢）（各約２０ｇ）を以下の４群に分けた：グループ１は５００ｎ
ｇ／ｍｌのヒトＩＦＮ−βの２００ｕｌの単一巨丸剤を注射した９匹のマウスを
含んだ（最終投薬量は１００ｎｇ／マウス）；グループ２（９匹のマウス）は等
量のＰＥＧ３０ｋＤ−ＩＦＮ−βを２００ｕｌ受けた；グループ３は等量のＰＥ
Ｇ（２Ｘ２０ｋＤ）−ＩＦＮ−βを２００ｕｌ受けた；そしてグループ４は陰性
対照として機能する３匹の未注射マウスのグループである。血液サンプル（約２
００ｕｌ／サンプル）を、９回の示された時間において毛細管チューブを伴うレ
トロ眼窩静脈叢の破壊により回収した。血液サンプルは１時間室温においてクロ
ット形成させて、リム化してミクロ遠心分離した。そこから取り出した血清は、
全部のサンプルが回収されるまで−７０℃において保存した。血清は、Ｔｏｒａ
ｙアッセイを用いて生物学上活性なヒトＩＦＮ−βの存在に関してアッセイした
。結果は、曲線下のエリア（ＡＵＣ）がＰＥＧ−ＩＦＮサンプル対遊離ＩＦＮ−
ベータにおいて顕著に増強されること、およびＰＥＧ−ＩＦＮサンプル対遊離Ｉ
ＦＮ−ベータおよびＰＥＧ［２Ｘ２０ｋＤ］−ＩＦＮ−βがＰＥＧ［３０ｋＤ］
−ＩＦＮ−βよりも優れていることを示唆する。皮下投与 マウスにＩＦＮ−βおよびＰＥＧ−ＩＦＮ（１００ｎｇ／マウス）を皮下注射
した。図９は、曲線下のエリア（ＡＵＣ）の全部は、遊離ＩＦＮ−βに比してＰ
ＥＧ−ＩＦＮサンプルに関して劇的に増強されることを示す。薬物速度論の研究
は、より長い寿命および増加したＡＵＣを有するＰＥＧ−ＩＦＮサンプルと一致
する。実施例５：低分子量ＰＥＧ部分のポリペプチドへの連結 ＯＲＳＳ−ＰＥＧ_2k−ヒドラジドによるインターフェロン−ベータのタッギング

【００７５】

【化１１】

【００７６】 組換えヒトインターフェロン−βを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ３
．８中で０．３３ｍｇ／ｍｌにて溶液中に用意した。約３．６ｍｇ（蛋白質のモ
ルに対して４０モル過剰）のヘテロ二官能性ＰＥＧ試薬、ＯＲＳＳ−ＰＥＧ_2k−
ヒドラジドを含む２ｍｌの脱イオン水を３ｍｌの０．３３ｍｇ／ｍｌ（０．９９
ｍｇ）ＩＦＮ−βに加え、そして２つをポリプロピレンバイアル中で１時間４５
℃において反応させた。反応混合物を次に毛細管電気泳動により分析することに
より、修飾の範囲を測定した。典型的な収量は９０−９７％の範囲であり、イン
ターフェロンβとＰＥＧ試薬の精製度に依存した。次に、溶液をサイズ排除カラ
ム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷して、５ｍＭリン酸ナ
トリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０バッファーで溶出した。ピークを
回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。モノペグ化インターフェロン−β画
分を一緒に保存して、高分子量ＰＥＧを用いたさらなる修飾工程において用いた
。（ＯＰＳＳ）₂−ＰＥＧ₃₄₀₀によるインターフェロン−βのタッギング

【００７７】

【化１２】

【００７８】 組換えヒトインターフェロン−βを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ３
．８中で０．３３ｍｇ／ｍｌにて溶液中に用意した。約６．１ｍｇ（蛋白質のモ
ルに対して４０モル過剰）のホモ二官能性ＰＥＧ試薬、（ＯＲＳＳ）₂−ＰＥＧ_{3 400} を含む２ｍｌの脱イオン水を３ｍｌの０．３３ｍｇ／ｍｌ（０．９９ｍｇ）
ＩＦＮ−βに加え、そして２つをポリプロピレンバイアル中で２時間５０℃にお
いて反応させた。反応を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて監視して、最終反応混合物
を毛細管電気泳動により分析することにより、修飾の範囲を測定した。インター
フェロン−βを用いたこの反応の典型的な修飾は＞９５％であった。次に、溶液
をサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷して
、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０バッファーで
溶出した。ピークを回収して、それらの含有物に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した。モノペグ化インターフェロン−β画分を混合した。実施例６：低分子量ペグ化ポリペプチドへの第２ＰＥＧ部分の連結 ｍＰＥＧ_30k−アルデヒドによるＩＦＮ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ_2k−ヒドラジドの修飾

【００７９】

【化１３】

【００８０】 実施例５のＩＦＮ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ_2k−ヒドラジドの混合した画分に、蛋白質
に対して２０倍過剰のｍＰＥＧ_30k−ＡＬＤを加えた。反応は室温において（２
５℃）４時間実施し、そしてサンプルをサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６
，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加えることにより、修飾収量を測定した。この反応の
修飾の収量は典型的には＞８０％であり、ＰＥＧ試薬の精製度と反応条件に依存
した。

【００８１】 この発明を今完全に記載するため、発明の精神および範囲から逸脱することな
く且つ過度な実験を要することなく、広範囲の均等なパラメーター、濃度、およ
び条件内で同等のことが実施できることは、当業者により認識されることになる
。

【００８２】 本発明は特定の態様に関連して記載されてきたが、さらに修飾可能であること
は認識されることになる。本出願は、一般に本発明の原理に従う本発明のあらゆ
るバリエーション、使用または適合を包含するように意図され、そしてそのよう
な本発明からの逸脱を本発明の属する業界の範囲で公知または慣習のしきたりの
範囲内とし、請求の範囲に従う前記の本質的特徴に適用してよいものとしてよい
。

【００８３】 定期刊行物またはアブストラクト、公表されたかまたは未公表の米国または外
国の特許出願、発行されたＵ．Ｓ．または外国の特許、またはあらゆる他の文献
を含む、本明細書に引用された全ての文献は引用により本明細書に全てが編入さ
れ、引用された文献に表示された全てのデータ、表、図面、およびテキストを含
む。

【００８４】 公知の方法の工程、慣用の方法の工程、公知の方法または慣用の方法に対する
言及は、本発明のあらゆる側面、記載または態様が関連分野において開示される
か、教示されるか、または示唆される承認ではけっしてない。

【００８５】 特定の態様の前記記載は、当業者の知識を適用することにより（本明細書にて
引用した文献の内容を含む）、他の者が、過度な実験なしに、本発明の一般的概
念から逸脱することなしに様々な応用のためにそのような特定の態様を容易に修
飾および／または適合することができる発明の一般的性質をそうして完全に明ら
かにすることになる。よって、そのような適合および修飾は、本明細書に提示さ
れる教示およびガイダンスに基づき、開示された態様の均等の意味および範囲内
であると意図される。本明細書の語法および用語法は記載の目的のためであって
限定の目的のためではなく、本発明の語法および用語法は本明細書に提示の教示
およびガイダンスの見地から、当業者の知識と組み合わせて当業者により理解さ
れるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、精製前のＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の毛細管電気泳動（ＣＥ）グラフ
を示す。

【図２】 図２Ａ−Ｃは、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２）によ
り実施されたＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体の精製を示し：図２Ａは１回目の通過；
図２Ｂは２回目の通過；図２Ｃは３回目の通過である。

【図３】 図３は、クロマトグラフィーの３回目の通過からの、精製されたＰＥＧ−ＩＦ
Ｎ−β複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーを示す。レーン１および４
は蛋白質分子量標準物であり、レーン２は「天然」ＩＦＮ−βであり、そしてレ
ーン３はＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体である。

【図４】 図４は、ＩＦＮ−βがｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ_5kでペグ化された、精製ＰＥＧ−Ｉ
ＦＮ−βの毛細管電気泳動（ＣＥ）グラフを報告する。

【図５】 図５は、精製されたＰＥＧ−ＩＦＮ−β複合体のＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトラ
ムを報告する。

【図６】 図６は、「天然」ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性とＰＥＧ−Ｉ−β複合体の抗ウ
イルス活性の比較を示す。細胞変性投薬量の水泡性口内炎ウイルスによるチャレ
ンジの前に、ＷＩＳＨ細胞を示された濃度のＩ−べサンプルと共に２４時間イン
キュベートした。細胞変性効果はＭＴＴ変換による追加の４８時間後に測定され
た。

【図７】 図７は、Ｄａｕｄｉ細胞中におけるＩＦＮ−βとＰＥＧ−ＩＦＮの結合プロフ
ィールを示す。

【図８】 図８は、静脈内投与後のマウスにおけるＩＦＮ−βおよびＰＥＧ−ＩＦＮの薬
物速度論プロフィールを示す。点線は各標準曲線に関するアッセイＬＯＱを示す
。

【図９】 図９は、皮下投与後のマウスにおけるＩＦＮ−βおよびＰＥＧ−ＩＦＮの薬物
速度論プロフィールを示す。点線は各標準曲線に関するアッセイＬＯＱを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｈ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ロバーツ，マイケル・ジェイ アメリカ合衆国アラバマ州35758，マジソ ン，ケイン・ブルック・コート 104 (72)発明者 ハリス，ミルトン アメリカ合衆国アラバマ州35801，ハンツ ビル，ハイランド・プラザ 3119 (72)発明者 ソウリビッチ，ウェイン アメリカ合衆国マサチューセッツ州01887， ウィルミントン，モース・アベニュー 24 Ｆターム(参考） 4C076 AA12 BB13 BB15 BB16 CC29 EE23Q FF31 FF63 4C084 AA03 BA42 BA44 DA23 MA05 NA03 NA05 NA12 ZB072 ZB112 ZB262 ZB322

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトインターフェロン−βのＣｙｓ¹⁷に共有結合したポリオー
   ル部分を有する、ポリオール−インターフェロン−β複合体。
2. 【請求項２】 ポリオール部分がポリアルキレングリコール部分である、請求
   項１記載のポリオール−インターフェロン−β複合体。
3. 【請求項３】 ポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール（Ｐ
   ＥＧ）部分である、請求項２記載のポリオール−インターフェロン−β複合体。
4. 【請求項４】 ポリオール−インターフェロン−β複合体が天然ヒトインター
   フェロン−βと同じかまたは高いインターフェロン−β活性を有する、請求項１
   乃至３の何れか１項記載のポリオール−インターフェロン−β複合体
5. 【請求項５】 工程： ヒトインターフェロン−βのＣｙｓ¹⁷に部位特異的かつ共有結合によりポリオ
   ール部分を連結するためのポリオール−反応性試薬をインターフェロン−βと反
   応させ；そして ポリオール−インターフェロン−β複合体を回収すること からなる、請求項１記載のポリオール−インターフェロン−β複合体を製造する
   ための方法。
6. 【請求項６】 ポリオール−反応性試薬がチオール−反応性ペグ化試薬である
   、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 チオール−反応性ポリオール試薬がモノ−メトキシ化されてい
   る、請求項５または６記載の方法。
8. 【請求項８】 チオール−反応性ポリオール試薬が二官能性である、請求項５
   または６記載の方法。
9. 【請求項９】 チオール反応性ポリオール試薬が、オルトピリジルジスルフィ
   ド、ビニルスルフォン、マレイミド、およびヨードアセトアミドからなる群から
   選択される、請求項５または６記載の方法。
10. 【請求項１０】 チオール反応性ポリオール試薬が、モノメトキシ化されたポ
    リオールのオルトピリジルジスルフィド誘導体である、請求項５または６記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 インターフェロン−βの安定な酸性ｐＨにて反応工程を実施
    する、請求項５記載の方法。
12. 【請求項１２】 活性成分としての請求項１乃至３の何れか１項記載のポリオ
    ール−インターフェロン−β複合体、および薬学上受容可能なキャリアー、賦形
    剤または補助薬剤を含む、薬剤組成物。
13. 【請求項１３】 有効量の請求項１２記載の薬剤組成物を必要とする対象に投
    与することからなる、感染、腫瘍および自己免疫および炎症性疾患を治療するた
    めの方法。
14. 【請求項１４】 工程： 以下の式： 【化１】 を有する低分子量のヘテロ官能性またはホモ官能性ＰＥＧ部分をポリペプチドと
    反応させるが、式中、ＷおよびＸはアミン、スルフィドリル、カルボキシルまた
    はヒドロキシル官能基と個別に反応して低分子量ＰＥＧ部分をポリペプチドに連
    結する基であり、 ポリペプチドに連結した低分子量ＰＥＧ部分を単官能性または二官能性ＰＥＧ
    部分と反応させることにより、単官能性または二官能性ＰＥＧ部分を低分子量Ｐ
    ＥＧ部分の遊離末端に連結してＰＥＧ−ポリペプチド複合体を形成すること からなる、ポリペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を連続して段
    階的に連結する方法。
15. 【請求項１５】 単官能性または二官能性ＰＥＧ部分が以下の式： 【化２】 を有し、式中、Ｙはポリペプチドに連結する低分子量ＰＥＧ部分の遊離末端上の
    末端基に反応し、そしてＺは−ＯＣＨ₃であるかまたは反応性の基であることに
    より二官能性複合体を形成する、請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 単官能性または二官能性ＰＥＧ部分がメトキシＰＥＧ、分枝
    ＰＥＧ、加水分解または酵素により分解可能なＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ、また
    は枝状ＰＥＧである、請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 ＷおよびＸが、オルトピリジルジスルフィド、マレイミド類
    、ビニルスルフォン類、ヨードアセトアミド類、ヒドラジド類、サクシニミジル
    エステル類、エポキシド類、アミン類、チオール類、カルボキシル類、活性エス
    テル類、ベンゾトリアゾールカーボネート類、ｐ−ニトロフェノールカーボネー
    ト類、イソシアネート類、およびビオチンからなる群から選択される、請求項１
    ４記載の方法。
18. 【請求項１８】 低分子量ＰＥＧ部分が約１００から５，０００ドルトンの範
    囲の分子量を有する、請求項１４記載の方法。
19. 【請求項１９】 単官能性または二官能性ＰＥＧ部分が約１００ドルトンから
    ２００キロドルトンの範囲の部分を有する、請求項１４記載の方法。
20. 【請求項２０】 低分子量ＰＥＧ部分および／または単官能性または二官能性
    ＰＥＧ部分がポリエチレングリコールのコポリマーである、請求項１４記載の方
    法。
21. 【請求項２１】 ポリエチレングリコールのコポリマーがポリエチレングリコ
    ール／ポリプロピレングリコールコポリマーおよびポリエチレングリコール／ポ
    リ（乳酸／グリコール酸）コポリマーからなる群から選択される、請求項２０記
    載の方法。
22. 【請求項２２】 ポリペプチドに２つのＰＥＧ部分を連続して段階的に連結し
    た後に、ＰＥＧ−ポリペプチド複合体を精製する工程をさらに含む、請求項１４
    記載の方法。
23. 【請求項２３】 精製工程が、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除ク
    ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフ
    ィー、および逆相クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２２記
    載の方法。
24. 【請求項２４】 ポリペプチドがインターフェロン−βである、請求項１４乃
    至２３の何れか１項記載の方法。
25. 【請求項２５】 請求項１４乃至２３の何れか１項記載の方法により製造され
    たＰＥＧ−ポリペプチド複合体の医薬としての使用。