JP2012021003A - 複合生物学的分子及びそれらの調製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;Qは、連結基を表し;Wは、電子求引部分を表し;Z1及びZ2の各々は、生物学的分子に由来する基を表し、A及びBに2つの求核部分を介して連結される生物学的分子に由来する基を表し;Aは、C1−5アルキレン又はアルケニレン鎖であり;Bは、結合又はC1−4アルキレン又はアルケニレン鎖である、一般式(I)の新規な生物学的活性化合物が、適当なポリマーを適当な生物学的活性分子に求核基を介して結合することにより、処方される。
【選択図】図4
Description
214−221)、最もネイティブなタンパク質は、患者への投与の際に、以下を含む幾つかの固有の欠点が存在するので、良い薬剤にならない:(1)タンパク質は、血液又は組織中に存在する多くのエンド−及びエキソペプチダーゼによって消化される、(2)多くのタンパク質は、幾らか免疫原性がある、並びに(3)タンパク質は、腎臓の限外濾過(kidney ultrafiltration)によって速やかに排泄され得る。全身毒性をもつか、又は、最適なバイオアベイラビリティー及び薬物動態学(pharmacokinetics)を欠如している、薬剤における活性な治療剤として使用される他の分子は、毒性により有効量が制限される低分子量分子を含む。このような分子は、悪性腫瘍による炎症及び状態、感染、及び自己免疫疾患を処置するためにルーチンに使用される。水溶性合成ポリマー(特に、ポリアルキレングリコール)が、タンパク質のような治療的に活性な分子を複合体化するために使用される。これらの治療的複合体は、循環時間(circulation time)を延長しクリアランス率を低下させることにより、薬物動態学を好都合に変え、全身毒性を低減し、そしていくらかの場合に、高められた臨床的効能を現すことが示されてきた。ポリエチレングリコール(PEG)を共有結合的に複合体化するこのプロセスは、「ペギレーション(PEGylation)」としてよく知られているが、多くの異なるポリマーが、複合体化ポリマーとして試験されてきた。
的複合体化は、しばしば、低下したタンパク質機能をもたらす。例えば、リシン残基を介してランダムポリ(アルキレンオキシド)アタッチメント(attachment)を有する抗体及び抗体フラグメントは、低下した親和性、アビディティー(avidity)又は特異性で標的抗原に結合することができる改変された抗体(又は改変された抗体フラグメント)を生じる。さらに、アミン特異的ポリマー複合体化試薬は、タンパク質上のアミンがプロトン化されないことを確実にするよう選択されなければならない複合体化反応条件を必要とする。これらの条件は、適度に高いpH媒体(media)(8−10)を必要とし、これは、アミン部分を、ポリマー複合体化試薬との反応に十分なほど反応性にする。高いpH条件は、しばしば、タンパク質に有害であり、構造変化及び変性をもたらす。これらのプロセスは、結果的に、タンパク質機能の低下をもたらす。アミン特異的ポリマー複合体化試薬は、タンパク質の接近可能なアミン部位に結合する傾向がある。これらの試薬は、キネティック試薬(kinetic reagents)と称され得る。それらは、不安定であり、タンパク質上の最も評価可能なアミノ求核部位との反応を受ける。アミンアシル化によって複合体化するアミン特異的ポリマー複合体化試薬は、結果的に、未複合体化タンパク質のための生理学的条件下において通常存在するタンパク質上のアミノ酸残基のアミン基上の正電荷の喪失をもたらす。アミン特異的ポリマー複合体化試薬のこれらの特徴は、しばしば、タンパク質の機能の部分的な低下をもたらす。タンパク質への複合体化のためにポリマーに組み込まれ、及び、アミン特異的であり且つしばしば加水分解的に不安定である他の複合体化官能基は、イソシアネート(WO94/04193)及びカーボネート(WO90/13540)を含む。
さないため、PEG結合(PEG attachment)のためのチオール部位を導入する突然変異誘発によるタンパク質の部位特異的改変(site−specific modification)の例が存在する。しかしながら、このような改変は、コストをかなり高くする。導入された遊離スルフヒドラルは、タンパク質スクランブリング及びタンパク質二量化のため操作された(engineered)タンパク質において、前述したような同様の制限を有し得る。また、突然変異誘発のプロセス及び細菌源からの改変タンパク質の生産は、しばしば、遊離スルフヒドラルを、例えば、グルタチオンとジスルヒド結合において結合させる。インターロイキン2は、例えば、PEGの部位特異的結合を可能にするようスレオニン残基をシステインにより置換する突然変異誘発により、改変された(Goodson RJ, Katre NV; Bio/Technology (1990)8, 343−346)。
X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;
各Qは、独立して、連結基を表し;
Wは、電子求引部分、又は、電子求引部分の還元によって調製可能な部分を表し;
或いは、X’がポリマーを表す場合、X−Q−W−は、一緒になって、電子求引基を表し得;さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成してもよく;
Z1及びZ2の各々は、独立して、生物学的分子に由来する基を表し、その各々は、
A及びBに求核部分を介して連結され;或いは、Z1及びZ2は、一緒になって、A及びBに2つの求核部分を介して連結される生物学的分子に由来する単一の基を表し;
Aは、C1−5アルキレン又はアルケニレン鎖であり;且つ、
Bは、結合又はC1−4アルキレンもしくはアルケニレン鎖である。
合物が循環を離れ且つ組織に浸透することを目的とする場合、例えば、悪性腫瘍、感染又は自己免疫疾患によって或いは外傷によって引き起こされる炎症の治療における使用のためには、2000〜30,000g/モルの範囲にある低分子量ポリマーの使用が有利であり得る。一般式Iの化合物が循環に残ることを目的とする用途のためには、より高分子量のポリマー(例えば、20,000〜75,000g/モルの範囲にある)の使用が有利であり得る。
びプリンが挙げられる。ポリマーへの連結は、加水分解的に不安定な結合又は不安定でない(non−labile)結合によるものであり得る。
(i)下記一般式の化合物
X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;
Qは、連結基を表し;
W’は、電子求引基(例えば、ケト基、エステル基−O−CO−又はスルホン基−SO2−)を表し; 或いは、X’がポリマーを表す場合、X−Q−W’は、一緒になって、電子求引基を表してもよく;
Aは、C1−5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;
Bは、結合又はC1−4アルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして、
各Lは、独立して、脱離基を表す)、
或いは(ii)下記一般式の化合物
X、X’、Q、W’、A及びLは、一般式IIについて与えられる意味を有し、さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成し得、mは、整数1〜4を表す)
のいずれかを、下記一般式の化合物
Z(Nu)2 (IV)
(ここで、Zは、上記で与えられる意味を有し、各Nuは独立して求核基(例えば、チオール又はアミン基)を表す)
と反応させることを包含する。
れ得る。使用されるポリマー複合体化試薬の化学量論およびジスルフィド還元の程度に応じて、1又は複数のポリマー分子をタンパク質に複合体化することが可能である。ジスルフィドの総数よりも少なく還元することが望ましい場合には、異なる反応条件又は変性剤の添加を用いて部分還元を可能にするような、固定化還元剤が使用され得る。
薬は、タンパク質を溶媒和するために使用される水性媒体と拮抗的反応を呈さないので、過剰な化学量論の試薬と複合体化反応を行うことも可能である。過剰試薬は、タンパク質のルーチンな精製のあいだに、イオン交換クロマトグラフィーよって容易に除去することができる。
下記一般式のポリマー:
と反応させることによって調製され得る。
、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセルブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルタミナーゼが挙げられる。
ジン、エリスロポエチン、黄体化ホルモン、視床下部性放出因子(hypothalamic releasingfactors)、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン及び組織プラスミノーゲンアクチベータが挙げられる。
は、既知の複合体化技術を用いた場合、可能ではなかった。
ときに低減されたアレルゲン性を有し、結果的に寛容誘発因子としての使用に適していると開示されるアレルゲンタンパク質である。アレルゲンの中には、ブタクサ(Ragweed)
抗原E、蜜蜂毒、ダニアレルゲンなどが開示されている。
化剤を、二重結合と共役する更なる多重結合を用いて、或いは、脱離基と電子吸引基との間に調製することもできる。
ィド結合を部分的に還元することが可能であるため、所定のジスルフィド結合のシステインからの2個のスルフヒドラル(sulfhydral)を交差してビスアルキル化を起こさせることが可能である。このような一連の反応は、ビスアルキル化試薬を用いたジスルフィド架橋の再アニーリングをもたらす。
p−ニトロ−3−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド:C14H19ClN2O3
一口250ml丸底フラスコに、p−ニトロアセトフェノン(16.5g)、パラホルムアルデヒド(4.5g)、ピペリジンヒドロクロライド(12.1g)、無水エタノール(100mL)及び磁気撹拌バーを添加した。この攪拌された不均質混合物に、塩酸(水中37wt%、1mL)を添加し、その溶液を加熱し、窒素下において還流させた。1−2h後、さらなるパラホルムアルデヒド(3.0g)を添加した。この溶液を約18h還流させ、その間さらなるパラホルムアルデヒドを添加した(3.0g)。この反応溶液を冷却させた後、さらなる還流の際に溶解しないであろう結晶性の固体を沈殿させた(settled)。その固体を濾過により分離し、非常に熱いメタノールを用いて再結晶化し、大きな黄色結晶を得た(10.9g)。
p−ニトロ−3−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド(30g、0.1mol)及びメルカプトエタノール(9.5g、0.12mol)の95%エタノール(200ml)攪拌溶液を、均質になるまでゆっくり加熱した。ピペリシン(1.0ml)を添加し、その反応混合物を加熱し、2h還流させた。冷却後、溶媒の大部分を回転蒸発させ、エチルアセテート(200ml)を添加し、固体を濾過した。エチルアセテート溶液を、10%HCl水溶液、5%NaHCO3及びブラインで連続的に抽出し、次いでNa2SO4上で乾燥させ、次にエチルアセテートを留去してオイルとし、これは結晶化して23.2gの所望の産物を得、これはエチルアセテート−エチルエーテル中で再結晶化された。
100ml一口丸底フラスコに、p−ニトロ−3−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド(10.0g)、4−メチルベンゼンチオール(8.2g)、ホルムアルデヒド(37%w/w 水溶液、10ml、過剰)、メタノール(40ml)及び磁気攪拌バーを添加した。この攪拌された不均質混合物を、黄色の均質溶液が形成されるまで加熱した(2〜3分、50〜60℃にて)。次いで5滴のピペリシンを添加し、反応溶液を加熱して還流させた。15分以内に、反応物は、幾らかの白/黄色固体の存在に起因して不均質になり、2時間後この固体は濃いオレンジ色を呈した。その後還流を停止し、反応物を一晩室温まで冷却した。次いで反応混合物を更なるホルムアルデヒド(37%w/w 水溶液、10ml、過剰)と共に還流下で再び加熱した。約30分間の還流後、オレンジ色のオイルが見え、固体が無くなった。攪拌を停止すると、オイルはフラスコの底に沈んだ。さらに7hの還流の後、混合物を一晩冷却した結果、沈んだオイルが結晶化した。添加
された数滴のアセトンを含む非常に熱いメタノールから、再結晶化によって結晶化固体を単離及び精製し、黄色結晶を得た(10.0g)。
250ml丸底フラスコ中で、1:1 メタノール:水(100ml)中の2−2−ビス(p−トリルチオールメチル)−p−ニトロアセトフェノン(2.5g)及びオキソン(Oxone)(18.4g)の懸濁液を16h攪拌した。これは白色固体の懸濁液を与え、これにクロロホルム(100ml)を添加し、得られた有機相を分液漏斗を用いて分離し、水相中に白色固体の懸濁液を残した。均質な溶液が形成するまで、更なる水を水相に添加し、次いでクロロホルム(100ml)で再び洗浄した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し(50ml×2)、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去し、真空中で乾燥させた後、オフホワイト色の粗製固体生成物を得た(2.5g)。生成物をアセトンから再結晶化し、白色結晶を得た。
アルゴンでパージし且つサーモメーター及び滴下漏斗を取り付けた火炎乾燥丸底フラスコに、3−(2−ヒドロキシエチルチオール)−p−ニトロプロピオフェノン(0.5g、2.0mmol)及び無水テトラヒドロフラン(50.0ml)を添加した。溶液を攪拌し、ドライアイス−アセトン浴により冷却し、次いでTiCl4(0.23ml、2.1mmol)をシリンジにより添加した。氷浴を取り外し、次いで溶液を周囲温度まで温め、次に溶液を−40℃まで冷却し、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.1ml)をシリンジにより添加した。冷却浴を取り外し、反応混合物を−15℃〜0℃まで温めたところ、赤色に変化した。次いで、反応混合物を3〜5分間かけて25℃まで温め、アクロレイン(0.14g、2.1mmol)の無水テトラヒドロフラン(20ml)溶液を滴下漏斗により30〜40分間かけて添加した。この発熱反応が反応混合物の温度を30〜40℃まで上昇させ、この溶液を、アルデヒドの添加後であってエチルアセテート(75ml)の添加前に更に20分間攪拌した。薄層クロマトグラフィーを用いて、出発3−2−ヒドロキシエチルチオール)−p−ニトロプロピオフェノンの消失及び所望の2−(2−ヒドロキシエチルチオメチル)−p−ニトロ−2(Z),4ペンタジエノフェノン(Rf〜0.38−0.45)の形成を確認した。少量の産物(E−アイソマー)を0.29−0.34の範囲において低いRf値で観察することができた。エチルアセテート反応混合物を、10%水性HCl及びブラインで抽出した。水相を合わせ、エチルアセテートで2回抽出し、全てのエチルアセテートフラクションを合わせ、次いで10%水性HCl
、5%水性NaHCO3及びブラインで2回洗浄し、次いで固体Na2SO4上で乾燥させた。エチルアセテートを回転蒸発させ、オイルとして、粗製2−(2−ヒドロキシエチルチオメチル)−p−ニトロ−2(Z),4ペンタ−ジエノフェノンを得、2,2−ビス[(p−トリルスルホニルメチル)]−p−ニトロアセトフェノンの合成に関して、これは直ぐに酸化され、固体として、2−(2−ヒドロキシエチルスルホニルメチル)−p−ニトロ−2(Z),4−ペンタジエノフェノン(これは、カラムクロマトグラフィー又はエチルアセテートもしくはメタノール中での再結晶により精製され、次に本明細書の他の箇所に記載されるように、アミノ末端化されたポリ(エチレングリコール)に共有結合された。
ール、ソルブアルデヒド、トルアルデヒド、シンナムアルデヒド、メチル−シンナムアルデヒド、クロロ−シンナムアルデヒド、5−フェニル−2,4ペンタジエナール及び7−フェニル−2,4,6−ヘプタトリエナールを含む、多くのアルデヒドを用いて行われた。この一連の反応は、3−(p−トリルチオメチル)−m−ニトロアセトフェノン、3−(2−ヒドロキシエチルチオ)−m−ニトロプロピオフェノン、3−(エチルチオメチル)−m−ニトロプロピオフェノン、3−(ジメチルアミノエチルチオ)−m−ニトロプロピオフェノン、3−(2−ヒドロキシエチルチオ)−3−フェニルプロピオフェノン、3(2−ヒドロキシエチルチオール)−5−フェニル−4(E)−ペンテノフェノン、3(エチルチオメチル−o−ニトロプロピオフェノン、3−(エチルチオ)−プロピオフェノン、3−(2−ヒドロキシエチルスルホニル)プロピオフェノン、2−(3−(2−ヒドロキシエチルチオ)−1−プロペニル)−m−2(E)−4−ペンタジエノフェノンを含む、多くのアリールケト誘導体を用いて行われた。この一連の反応は、また、4−(エチルチオ)−2−ブタノン、4−(−p−トリルチオ)−2−ブタノン、4−(4−ニトロフェニルチオ)−2−ブタノン、4−(2−ヒドロキシエチルチオ)−2−ブタノン、及びメチル−3−(2−ヒドロキシエチルチオール)−プロパノエートを含む脂肪族ケト誘導体を用いて行われた。これらの前駆体に対する前述した反応の最終産物は、本明細書の他の箇所に記載されるように、ポリ(エチレングリコール)に共有結合され得る。
100ml丸底フラスコに2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]−p−ニトロアセトフェノン(2g)、エタノール(25mL)、塩酸(水中37wt.%、8mL)及び磁気攪拌バーを添加した。得られた不均質な混合物に、次いで、塩化スズ(II)二水和物を添加し、その混合物をオイルバス中で45℃にて2h加熱した。次いで、これ以上の水を添加したら沈殿が起こり得るとみられる点まで形成されていた均質な黄色水溶液に、水を添加した。その均質な溶液を室温まで冷却し、結果的に結晶化/沈殿している黄色化合物を得、これを真空下において濾過により分離した。次いで、分離した産物を、アセトン及びメタノール(約90:10v/v)の加熱した混合物と混合した。不溶性の固体を、真空下の濾過によって分離し、真空オーブンにおいて恒量まで乾燥させた(1.4g)。
滴下漏斗及び窒素ラインを取り付けた一口100mL丸底フラスコに、窒素雰囲気下でトリホスゲン(23mg)、2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]−p−アミノアセトフェノンヒドロクロライド(125mg)、無水トルエン(2.5mL)及び磁気攪拌バーを加えた。滴下漏斗を、別々に無水トリエチルアミン(68μL)及び無水トルエン(2.5mL)で満たした。丸底フラスコの下にアセトン/ドライアイス浴を設置し、内容物を冷却した。次いで、5−10分かけて攪拌しながらトリエチルアミン溶液をトリホスゲン溶液に滴下した。フラスコ及びドライアイス浴を数時間かけて室温まで温め、室温になったら、なお窒素雰囲気下において反応混合物を更に約2h攪拌した。次いで、O−(2−アミノエチル)−O’−メチルポリ(エチレングリコール)2,000(490mg)及び無水トリエチルアミン(68μL)の無水トルエン溶液を、室温にて反応混合物に滴下した。得られた混合物を、室温にて一晩攪拌した(合計約20h)。次いで、反応混合物を雰囲気に対して開放し、フィルターとして機能するような非吸水性のコットンウール片を用いて、5mLディスポーザブルシリンジを通して重力下で濾過した。均質な溶離液を100mL分液漏斗に移し、次いで脱イオン水(30mL及び次に10mL)で二回洗浄した。水相を合わせて、次いでジエチルエーテル(約25mL)で洗浄した。次いで、水相を凍結乾燥し、オフホワイト色の固体産物(160mg)を得た。産物はジエチルエーテル及びトルエン相においても見られた。
ポリマー複合体化試薬の合成
p−カルボキシ−3−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド
250mL一口丸底フラスコにp−アセチル安息香酸(10g)及びピペリシンヒドロクロライド(7.4g)、100mLの無水エタノール及び磁気攪拌バーを加えた。攪拌された不均質混合物に、濃塩酸(1mL)を添加し、次いでその溶液を窒素下において加熱し、還流させた。パラホルムアルデヒド(3.7g)をフラスコに添加し、次いで約1.5h還流を続けた。均質溶液が形成され、これにさらにパラホルムアルデヒド(3.7g)を添加した。加熱を約6h続け、その間さらにパラホルムアルデヒドを添加した(3.7g)。この反応溶液を室温まで冷却し、1週間放置した。冷却した反応混合物の濾過により、白色固体を分離した。非常に熱いメタノール中で溶解した後、その固体を結晶化することを試みた。不溶性産物(1.96g)を濾過により分離し、第二産物(second product)(0.88g)を濾液から結晶化した。両方の産物は、赤外線分光法及び真空中で乾燥させた後の薄層クロマトグラフィー分析により同一であるようであったので、それらを合わせて続く反応に使用した。ATR−FT−IR 1704,1691,1235,760。
50mL一口丸底フラスコにp−カルボキシ−3−ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド(2.5g)、4−メチルベンゼンチオール(2.1g)、ホルムアルデヒド(37% w/w 水溶液、2.5mL)、エタノール(10mL)、磁気攪拌バー及びピペリシン(約10滴)を添加した。次いで冷却器をフラスコに取り付け、反応溶液を加
熱し、還流させた。次いでメタノール(5mL)を添加した。約2h後、更なるホルムアルデヒド(2.5mL)を添加し、さらに2h加熱を続けた。次に反応フラスコを室温まで冷却し、そこで反応溶液をジエチルエーテル(約150mL)で希釈した。次いで、生じた有機相を水(1N 塩酸を用いてpH 2−3に酸性化した;50mLx2)、水(50mL)及びブライン(75mL)で洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過後、回転エバポレーターで揮発性物質を除去し、固体残渣を得た。その固体を、加熱しながら、主にメタノール及びアセトンの最少容量の混合液中に溶解した。次いで、均質な溶液を一晩フリーザー中に置いてオフホワイト色の結晶を得、これを、真空下での濾過によって分離し、フレッシュなアセトンで洗浄し、次に真空オーブン中で恒量になるまで乾燥した(2.5g)。
250mL丸底フラスコ中で4−[2,2−ビス[(p−トリルチオ)メチル]アセチル]安息香酸(2g)及びオキソン(16.9g)の1:1 v/v メタノール: 水(100mL)懸濁液を16h攪拌した。これにより白色固体懸濁液が得られ、それにクロロホルム(100mL)を添加し、生じた有機相を分液漏斗を用いて分離し、水相を有する白色固体懸濁液を放置した。不均質な水相に、更なる水を均質になるまで添加し(約170mL)、次いで、水相をクロロホルム(75mL)で洗浄した。有機相を合わせ、水(50mLx2、数滴の1N塩酸で酸性化された)及びブライン(50mL)で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして回転エバポレーターを用いて溶媒を取り除き、オフホワイト色の粗製固体産物(2.2g)を得た。非常に熱いエチルアセテート、アセトン及びヘキサンからの再結晶化により、(産物中の1gについて)更なる精製を行い、0.6gの産物を得た:
一口50mLシュレンクフラスコに4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)−メチル]アセチル]安息香酸(100mg)及び磁気攪拌バーを加えた。フラスコを密閉し、強いバキューム(vacuum)を約15分間適用した。アルゴン雰囲気をフラスコ中に導入し、攪拌しながらシリンジによりチオニルクロライド(1mL)を添加した。生じた混合物を50℃にて2h加熱した。次に揮発性液体を真空中で取り除き、黄色のフォームを得た。アルゴン雰囲気をフラスコ中に再び導入し、無水ジクロロメタン(5mL)をシリンジにより添加し、均質な溶液を得た。次いで揮発性液体を真空中で再び取り除い
た。溶媒添加/除去工程を、白色残渣が残るまで繰り返した。無水ジクロロメタン(5mL)を再びシュレンクフラスコに添加し、均質な溶液を形成させた。セプタム及び磁気攪拌バーを備えた25mL丸底フラスコ中で、別々に、O−(2−アミノエチル)−O’−メチルポリ(エチレングリコール)(2,000g/mol)(0.2g)及び無水トリエチルアミン(30μL)をアルゴン雰囲気下において無水ジクロロメタン(5mL)中に溶解した。ビス[(p−トリルスルホニル)−メチル]アセチル]安息香酸を含む反応溶液を、ポリ(エチレングリコール)溶液を含むフラスコ中に一滴ずつ(dropwise fashion)注入すると、すぐに白色気体の発生が起こった。生じた溶液を室温にて一晩中攪拌し、そこでさらなるトリエチルアミン(28μL)を添加した。さらに1h後、反応溶液を、ガラスピペットを通じて素早く攪拌されているジエチルエーテル中に滴下した。沈殿を達成するためには、ジエチルエーテル溶液にヘキサンを添加し、氷浴中でフラスコを静置させることが必要であった。得られた沈殿物を遠心によって分離し、さらに真空オーブン中で恒量になるまで乾燥させ、オフホワイト固体産物(230mg)を得た。更なる精製は、第一に産物をジクロロメタン中に溶解すること及び冷却した攪拌ジエチルエーテル溶液に添加することによる沈殿によって達成された。
一口50mLシュレンクフラスコに4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)−メチル]アセチル]安息香酸(100mg)及び磁気攪拌バーを加えた。フラスコを密閉し、強いバキュームを約15分間適用した。アルゴン雰囲気をフラスコ中に導入し、攪拌しながらシリンジによりチオニルクロライド(1mL)を添加した。生じた混合物を50℃にて2h加熱した。フラスコを室温まで冷却した後、揮発性液体を真空中で取り除き、黄色のフォームを得た。アルゴン雰囲気をフラスコ中に再び導入し、無水ジクロロメタン(5mL)をシリンジにより添加し、均質な溶液を得た。次いで揮発性液体を真空中で再び取り除いた。溶媒添加−除去工程を、白色残渣が残るまで繰り返した。最後に、無水ジクロロメタン(5mL)をアルゴン下でフラスコに添加し、均質な溶液を形成させた。
じた。白色沈殿物を、no.3焼結ガラス漏斗で分離し、冷却したフレッシュなアセトン(約30mL)で洗浄した。分離した固体を真空中で乾燥させ、0.4gの白色固体を得た。
ポリマー複合体化試薬、α−メトキシ−ω−4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]アセチル]ベンズアミド ポリ(エチレングリコール)(2000g/mol)(30mg,12.1μmol,1eq.)及び4−メチルベンゼンチオール(3mg,24.2mmol,2eq.)を重水素化されたクロロホルム(約0.75mL)中に溶解した。次いで、均質な溶液にトリエチルアミン(1.7μL,12.1μmol,1eq.)を添加した。反応混合物を攪拌し、H−NMRスペクトルを得た。得られたスペクトルから、4−メチルベンゼンチオールのポリマー複合体化試薬への付加が起こっていることが確認された。同様の反応が、プロパントリオールを用いて行われた。
15mL遠心チューブ中のリボヌクレアーゼA(30mg)に3mLの8M尿素水溶液、次いで2−メルカプトエタノール(60μL)を添加した。得られた溶液のpHを、10%メチルアミン水溶液でpH8.5に調整した。次いで、反応溶液を約30分間窒素でバブリングした。窒素でのパージングをしつつ、チューブを37℃で5h加熱した。次いで、反応混合物を氷塩水浴中で冷却し、1N HCl:無水エタノール(1:39v/v)の10mLのアルゴンパージされた冷却溶液を反応溶液に添加した。沈殿が生じ、沈殿物を遠心により分離し、次いでさらに10mL分のHCl:無水エタノール混合物で三回
洗浄し、窒素パージされた冷却ジエチルエーテル(2x10mL)で二回洗浄した。各洗浄の後、沈殿物を遠心により分離した。次いで、洗浄した沈殿物を窒素パージされた脱イオン水に溶解し、凍結乾燥し、乾燥固体を得た。リボヌクレアーゼAの部分的還元が確認され、Ellman’s Testを用いて定量した(これにより、タンパク質1分子当たり5.9の遊離チオールが与えられた)。
0.15M 塩化ナトリウム及び0.005M EDTAを含有するアルゴンパージされた0.02Mリン酸ナトリウムpH6緩衝液中のマウスIgG抗体Fabフラグメント(Abcam Cat. No. AB6668)(0.4mg/mL溶液、240μL)に、室温で、1mMセレノシスタミンジヒドロクロライドのアルゴンパージされた水溶液(4μL)を添加し、続いてトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロライド(TCEP)のアルゴンパージされた水溶液(12μl)を添加した。得られた溶液を直ぐに数秒間ボルテックスし、次いで室温で6min静置した。還元されたFabフラグメントを含有する溶液の2個の5μlサンプルを、更なる分析のために取っておき、残りの溶液を氷水浴中で4min静置した。ポリ(エチレングリコール)(20,000g/mol)(1.6μL、50mg/ml、0.15M塩化ナトリウム、0.005M EDTA及び0.23mMヒドロキノンを含有するアルゴンパージされた0.02Mリン酸ナトリウムpH6緩衝液)から誘導されたα−メトキシ−ω−4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]アセチル]ベンズアミドの氷水浴冷却された溶液を、直ぐにFab溶液に添加し;その溶液を数秒間ボルテックスし、次いで氷水浴中に戻した。さらに1.6μLの複合体化試薬溶液を、全部で6.4μLを添加するまで、2分おきに類似の様式で添加した。全て添加した後、反応溶液を冷蔵庫(<5℃)内に2h置いた。次いで反応溶液のサンプルを、SDS PAGEによる分析のために取っておいた。
ml column, Amersham biosciences; 溶離剤: 20mM Naホスフェート, 0.15M NaCl pH7.0; 0.25ml/minのフローで100分の定組成溶離; UV検出,210nm)により分析したところ、同じコントロールの反応混合物中には存在していなかったFab−ポリ(エチレングリコール)複合体が示された。SEC−HPLCクロマトグラフィーから分離された画分をSDS−PAGEにより分析し、モノポリ(エチレングリコール)複合体が観察された。
pH6.5のアスパラギナーゼ(Sigma)の5mg/ml溶液の100μlサンプ
ルを、900μlの20mMリン酸緩衝液(pH6、0.15M NaCl及び5mM EDTAを含む)で希釈した。次いでDL−ジチオレイトール(DTT、15.4mg)を添加し、得られた溶液を室温にて放置した。2h放置した後、その溶液を、20mMリン酸緩衝液(pH6、0.15M NaCl及び5mM EDTAを含む)で平衡化したPD−10カラム(Sephadex(登録商標)G−25M、Pharmacia Biotech)で精製した。カラムを1ml分のフレッシュな緩衝液で溶出した。還元されたタンパク質を含有する2の画分を、280nmにおけるUV分光法を用いて同定した。これらの画分を遠心濾過装置(MWCO 3,000;Microcon)を用いて約270μlの体積まで濃縮し、次いで、フレッシュなpH6のリン酸緩衝液(更に、0.23mMのヒドロキノンを含有する)で1mlまで希釈した。2個の5μlサンプルをSDS PAGEによる後の分析のために取っておいた。別に、ポリ(エチレングリコール)(20,000g/mol)から誘導されたα−メトキシ−ω−4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]アセチル]ベンズアミドの複合体化試薬溶液の50mg/ml溶液を同じリン酸緩衝液で調製し、5分間タンパク質溶液と共に氷水浴中に置いた。次いで該タンパク質溶液に58μlの複合体化試薬溶液を添加し、数秒間のボルテックス後、反応溶液を冷蔵庫(<5℃)に置いた。コントロール反応は、また、同じ条件下及びスケールにおいて行ったが、還元されていないアスパラギナーゼを用いた。成功したポリ(エチレングリコール)のアスパラギナーゼへの複合体化は、2h後反応溶液から採ったサンプルを用いて行ったSDS PAGE(コロイドブルー染色を用いる4−12%Bis−Tris Gel)により確認された。アスパラギナーゼをDTTと反応させなかったコントロール反応液から採ったサンプルについては、SDS PAGEによって、複合体化バンドが観察されなかった。
150μlの緩衝液(リン酸ナトリウム0.02M;NaCl 0.15M;EDTA
0.005M;アルゴンパージされた脱イオン水中pH6.0)で希釈された100μlインターフェロンα−2b(Shantha Biotechnics)(1mg/ml)の溶液を、セレノシスタミン(アルゴンパージされた脱イオン水中1mM、2当量)及びTCEP(アルゴンパージされた脱イオン水中1mM、5当量)の添加によって、部分的に還元した。タンパク質溶液を4℃まで冷却した。ポリ(エチレングリコール)(20,000g/mol)から誘導された複合体化試薬α−メトキシ−ω−4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]アセチル]ベンズアミドを緩衝液(50mg/ml)に溶解し、4℃に冷却し、16μlをタンパク質溶液に添加した。反応混合物をボルテックスし、4℃にて2hインキュベートした。反応混合物の非イオン性成分を、カチオン交換クロマトグラフィー(Hitrap SP FF 1ml colum, Amersham biosciences)によって、以下の2つの緩衝液を使用して除去した:(A)25mM Naアセテート pH4.0及び(B)25mM Naアセテート+0.7M NaCl pH4.0。カラムを緩衝液A(5.0ml)、次いで緩衝液B(5.0ml)で洗浄し(1ml/min)、次いで10mlの緩衝液A(10ml)で平衡化した。複合体をカラムにロードし(200μl)、次いで緩衝液A(500μl)とローディング画分(0.5ml)を回収した。カラムを5mlの緩衝液Aで洗浄し、画分を回収した。サンプルを緩衝液B(10ml)でカラムから溶出し、画分を回収した。分光法(UV、280nm)を用いてタンパク質を含む画分を決定し、次いでこれらの画分を、サイズ排除クロマトグラフィー(100μl注入, superose 12−24 ml column, Amersham biosciences; 溶離剤:
20mM Naホスフェート, 0.15M NaCl pH7.0; 0.25ml/minのフローで100分間の定組成溶離; UV検出,210nm)により、分離された画分に精製した。これらの精製条件から、ネイティブなインターフェロンからのポリ(エチレングリコール)インターフェロン複合体の分離のためのベースライン分解能(r
esolution)が得られた。ポリ(エチレングリコール)複合体の複合体化反応及び精製は、SDS−PAGEによって確認された;12%Bis−Trisゲル(SilverQuest Silver Staining; Colloidal Blue
Staining及び過塩素酸0.1M/ BaCl2 5%及びI2 0.1M 染色)。60μlのリン酸ナトリウム0.02M(NaCl 0.15M、EDTA 0.005M、アルゴンパージされた水中でpH6.0)中のインターフェロン(1mg/ml)溶液(40μl)を、ポリ(エチレングリコール)(20,000g/mol)から誘導された複合体化試薬α−メトキシ−ω−4−[2,2−ビス[(p−トリルスルホニル)メチル]アセチル]ベンズアミドと混合し、緩衝液(50mg/ml)中に溶解し、4℃まで冷却し、16μlをタンパク質溶液に添加した場合には、複合体が観察されなった。この反応混合物をボルテックスし、4℃で2hでインキュベートした。
各サンプルを20μLのreal−time PCR quantitation mix (Sigma SybrGreen ReadyMix)中で増幅させた。
相対増加量=2−(Ctサンプル−Ctコントロール)
ここで、Ctは閾値交差値(threshold cross-over value)である。
図5、図5(a)は、インターフェロンで誘導可能な2’5’−オリゴアデニレートシンテターゼ(2’,5’−OAS)遺伝子のリアルタイム定量的RT−PCR(2段階)分析を示し、図5(b)は、インターフェロンで誘導可能なプロテインキナーゼR(PRKR)遺伝子のリアルタイム定量的RT−PCR(2段階)分析を示す。結果から、ポリ(エチレングリコール)インターフェロン−α2b複合体が、ネイティブなペギレーションされていないインターフェロン−α 2bと同様のレベルにまで、2’5’−オリゴアデニレートシンテターゼ(2’,5’−OAS)及びプロテインキナーゼR(PRKR)mRNA合成を刺激していることが確認される。
Claims (14)
- 一般式
X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;
各Qは、独立して、連結基を表し;
Wは、電子求引部分、又は、電子求引部分の還元によって調製可能な部分を表し;
或いは、X’がポリマーを表す場合、X−Q−W−は、一緒になって、電子求引基を表し得;さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成してもよく;
Z1及びZ2の各々は、独立して、生物学的分子に由来する基を表し、その各々は、A及びBに求核部分を介して連結され;或いは、Z1及びZ2は、一緒になって、A及びBに2つの求核部分を介して連結される生物学的分子に由来する単一の基を表し;
Aは、C1−5アルキレン又はアルケニレン鎖であり;且つ、
Bは、結合又はC1−4アルキレンもしくはアルケニレン鎖である、
の化合物。 - ポリマーX又はX’が、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド、HPMAコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)、ポリカーボネート、ポリ(イミノカーボネート)、ポリアミド、ジビニルエーテル−無水マレイン酸又はスチレン−無水マレイン酸のコポリマー、ポリサッカライド、或いは、ポリグルタミン酸である、請求項1に記載の化合物。
- ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項2に記載の化合物。
- 各連結基Qは、独立して、直接結合、アルキレン基、又は、必要に応じて置換されたアリールもしくはヘテロアリール基(そのいずれかが、1又はそれ以上の酸素原子、硫黄原子、−NR基(ここで、Rは、アルキル又はアリール基を表す)、ケト基、−O−CO−基及び/又は−CO−O−基により終結又は中断されてもよい)を表す、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。
- Wは、ケト又はアルデヒド基CO、エステル基−O−CO−又はスルホン基−SO2−、又は、このような基の還元により得られる基を表し、或いは、X−Q−W−は、一緒になって、シアノ基を表す、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- Z1及びZ2は、一緒になって、単一の生物学的分子を表す、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
- Z1及びZ2の各々、或いは、Z1及びZ2が一緒になってタンパク質を表す、請求項1〜5のいずれかに記載の化合物。
- 該又は各タンパク質が、チオール基を介してA及びBに連結している請求項7に記載の化合物。
- 前記チオール基が、ジスルフィド架橋の部分還元によって生成されたものである、請求項8に記載の化合物。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物の調製方法であって、
(i)下記一般式の化合物
X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;
Qは、連結基を表し;
W’は、電子求引基(例えば、ケト基、エステル基−O−CO−又はスルホン基−SO2−)を表し; 或いは、X’がポリマーを表す場合、X−Q−W’は、一緒になって、電子求引基を表してもよく;
Aは、C1−5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;
Bは、結合又はC1−4アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し、そして、
各Lは、独立して、脱離基を表す)、
或いは(ii)下記一般式の化合物
X、X’、Q、W’、A及びLは、一般式IIについて与えられる意味を有し、さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成し、mは、整数1〜4を表す)
のいずれかを、一般式Z1Nu又はZ2Nuの化合物、或いは、式Z(Nu)2の化合物(ここで、Zは生物学的分子を表し、各Nuは独立して求核基を表す)と反応させることを包含する、方法。 - 該又は各脱離基Lは、−SR、−SO2R、−OSO2R−、−N+R3、−N+HR2、−N+H2R、ハロゲン、又は−OΦ(ここで、Rは、アルキル又はアリール基を表し、Φは、少なくとも1の電子吸引置換基を含む置換アリール基を表す)を表す、請求項10に記載の方法。
- 請求項10又は請求項11のいずれかに記載される、一般式II又はIIIの化合物。
- 薬学的に許容される担体とともに、請求項1〜9のいずれか1項に記載される生理学的に
許容される化合物を含有する、薬学的組成物。 - 薬剤としての使用のための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物。
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