KR20090039666A - 도메인 항체 구조체 - Google Patents

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안소니 제라드 도일
벤자민 피. 울벤
이안 엠. 톰린슨
제니퍼 에이. 리
필립 안소니 제닝스
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아라나 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체로서, (a) 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체(dAb); (b) 변형된 힌지 영역의 서열; 및 (c) 잔기 20개 이하로 구성된, 절단형 CH1 도메인을 갖는 인간 또는 영장류의 중쇄 불변부 서열을 포함하며, 상기 변형된 힌지 영역의 서열이 항체의 중쇄와 경쇄 간에 이황화 결합의 형성을 정상적으로 조장하는 하나 이상의 시스테인 잔기의 결손 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 도메인 항체 구조체를 제공한다.

Description

도메인 항체 구조체{DOMAIN ANTIBODY CONSTRUCT}
본 발명은 인간 치료에 유용한 도메인 항체 구조체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체 및 TNF-α 활성이 특징인 장애의 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 알파(TNF-α)는 쇼크를 매개하며, 패혈증, 감염, 자가면역 질환, 예컨대 류마티즈 관절염, 크론씨 질환, 궤양성 결장염 및 그외 장 증상, 건선, 독성 쇼크, 이식 거부 반응 및 이식 편대 숙주 질환 등의 다양한 인간 질병과 장애의 병태 생리학과 관련있는 사이토카인이다. TNF-α는 주로 활성화된 대식 세포와 T 림프구에서 생산되지만, 급성 염증 반응시에는 호중구, 내피세포, 케라토사이트 및 섬유모세포에서도 생산된다.
TNF-α는 염증에서의 역할로 인해, 염증성 장애의 증상을 줄이기 위한 시도에 있어서 중요한 저해 타겟으로 등장하였다. 질병의 임상 치료를 목적으로 TNF-α를 저해하기 위하여, 특히 가용성 TNF-α 수용체 및 TNF-α에 특이적인 항체를 사용하는 방법 등의 다양한 방법들이 개발되고 있다.
도메인 항체
도메인 항체(dAb)는 항체의 최소 기능성 결합 단위로, 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변부에 해당된다. 도메인 항체는 약 13 kDa 또는 전체 항체 크기의 십분의 일 미만의 분자량을 가지고 있다.
통상적인 항체와는 대조적으로, 도메인 항체는 세균 효모 및 포유류 시스템에서 잘 발현된다. 이것의 작은 크기로 인해 산물 g 당 몰 수가 높아, 1 mg 투여 당 효능이 현저하게 증가한다. 또한, 도메인 항체는 2개 이상의 dAb가 2개 이상의 개별 분자 표적에 결합하는 다중 표적화 dAb-함유 분자와 같은 치료 제품을 만들기 위한 빌딩 블럭으로서 사용될 수 있으며, 또는 dAb는 폐나 경구 투여용으로 제작된 구조체에 혼입될 수 있다.
현재, 본 발명자들은 절단형(truncated) CH1 도메인을 포함하는 불변부에 연결된 면역글로불린 가변성 도메인을 포함하는 신규한 도메인 항체 구조체를 고안하고 있다. 불변부의 포함이 전형적으로 짧은 dAb의 생체내 반감기를 연장하는데 도움이 될 것으로 생각한다.
신세계 영장류( New World primate ) 면역글로불린
진화적으로 관계가 먼 영장류, 예컨대 신세계 영장류(New World primate)는, 인간 항체와 유사한 항체를 가질 만큼 인간과 충분히 유사하여, 이러한 영장류-유래 항체가 인간에게 투입되었을 때, 숙주에서 항-항체 면역 반응이 발생되지 않는다. 신세계 영장류(infraorder- Platyrrhini)는 일반적으로 2개의 과, 즉 칼리트리시다에 (Callithricidae ) 및 세비다에 (Cebidae )로 나누어지는 적어도 53 종으로 구성된다. 칼리트리시다에는 마모셋 (marmoset) 및 타마린 (tamarin)으로 구성된다. 세비다에는 다람쥐 원숭이 (squirrel monkey), 티티 원숭이 (titi monkey), 거미 원숭이 (spider monkey), 털 원숭이 (woolly monkey), 흰목꼬리감기 원숭이 (capuchin), 밤 원숭이 또는 올빼미 원숭이 (night or owl monkey) 및 고함 원숭이 (howler monkey)를 포함한다.
선행 연구들에서, 작은 무늬 마모셋(Callithrix jacchus marmoset)에서 발현된 면역글로불린 중쇄 레퍼토리가 특정화되었다(von Budingen H-C et al., Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Collithrix jacchus. lmmunogenetics 2001; 53:557-563). 인간 IGHV 카운터파트와 서열 유사성이 높은 6개의 IGHV 서브그룹도 동정되었다. 프레임워크 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining region)에 비해 더욱 보존적이며, 최고 가변도(variability)는 CDR3에 위치되어 있었다. 작은 무늬 마모셋과 인간 IGHV 서열 간의 유사성 수준은 구세계 영장류와 인간 간의 유사성 보다 낮았다.
발명의 개요
제1 측면에서, 본 발명은
(a) 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체(dAb);
(b) 변형된 힌지 영역의 서열; 및
(c) 잔기 20개 이하, 더 바람직하기로는 10개 이하, 보다 더 바람직하기로는 5개 이하, 더 더욱 바람직하기로는 1개로 구성된, 절단형 CH1 도메인을 갖는 인간 또는 영장류의 중쇄 불변부 서열을 포함하며,
상기 변형된 힌지 영역의 서열이 정상적으로 항체의 중쇄와 경쇄 사이에 이황화 결합 형성을 조장하는 시스테인 잔기의 결손 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는, 항체 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체를 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 도메인 항체 구조체를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체를 코딩하는 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자가 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 60% 이상, 바람직하기로는 80% 이상, 더 바람직하기로는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열, 가장 바람직하기로는 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열을 포함한다.
제4 측면에서, 본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는, 도메인 항체 구조체를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 서열번호 50 또는 51에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 고엄격 조건하에서 혼성하는, 핵산 서열을 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 유효량의 도메인 항체 구조체와, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
제6 측면에서. 본 발명은 인간 TNF-α를 검출하기 위한 진단 적용에 있어서의 본 발명의 제1 측면에 따른 도메인 항체 구조체의 용도를 제공한다.
제7 측면에서 본 발명은 본 발명의 제5 측면에 따른 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 개체에서 인간 TNF-α 활성을 특징으로 하는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 인간 TNF-α에 결합하며, 인간에게 투여하였을 때 낮은 면역원성을 보일 것으로 생각되는, 도메인 항체 구조체를 만들었다. 상기 도메인 항체 구조체는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변성 도메인에 해당되는 부분(즉, 도메인 항체(dAb)), 힌지 영역, 및 항체 중쇄의, 절단형 CH1 도메인을 가지고 있는 불변부에 해당되는 부분을 포함한다.
불변부의 포함은 dAb의 생체내 반감기를 길게 할 뿐만 아니라 항-TNF 항체의 항-염증 기전의 구성 요소로 생각되는 작동자 기능을 제공할 것으로 생각된다.
제1 측면에서, 본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체를 제공하며, 상기 구조체는,
(a) 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체(dAb);
(b) 변형된 힌지 영역의 서열; 및
(c) 잔기 20개 이하, 더 바람직하기로는 10개 이하, 보다 더 바람직하기로는 5개 이하, 더 더욱 바람직하기로는 1개로 구성된, 절단형 CH1 도메인을 갖는 인간 또는 영장류의 중쇄 불변부 서열을 포함하며,
상기 변형된 힌지 영역의 서열은 정상적으로 항체의 중쇄와 경쇄 사이에 이황화 결합 형성을 조장하는 시스테인 잔기의 결손 또는 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
바람직한 예에서, CH1 도메인과 힌지 영역의 서열은 XEPKSZDKTHTCPPCPA이며, X는 발린, 루신 또는 이소루신이고, Z는 생략되거나 시스테인 이외의 아미노산이다. 바람직하기로는 X는 발린이고, Z는 세린이다.
본 발명의 바람직한 예에서, dAb는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변성 도메인을 포함하며, 상기 가변성 도메인은 신세계 영장류로부터 유래된 서열을 가진 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 상기 CDR은 YAATKLQS (서열번호 1), YEASSLQS (서열번호 2), YEASKLQS (서열번호 3) 및 YSASNLET (서열번호 4)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예로는, 상기 CDR은 CDR2이다.
바람직한 예에서, dAb는 하기 서열들 중에서 선택된 서열을 갖는다:
Figure 112008062085610-PCT00001
(화합물 145; 서열번호 7)
Figure 112008062085610-PCT00002
(화합물 123; 서열번호 8)
Figure 112008062085610-PCT00003
(화합물 100; 서열번호 9)
Figure 112008062085610-PCT00004
(화합물 196; 서열번호 10)
Figure 112008062085610-PCT00005
(화합물 134; 서열번호 52)
Figure 112008062085610-PCT00006
(화합물 137; 서열번호 53)
Figure 112008062085610-PCT00007
(화합물 121; 서열번호 54); 및
이들 서열들 중 어느 하나와 95% 이상, 더 바람직하기로는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열.
다른 바람직한 예로, 상기 불변부 영역은 하기 서열을 함께 가지고 있는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다:
Figure 112008062085610-PCT00008
(서열번호 63); 또는
상기 서열과 60% 이상, 바람직하기로는 80% 이상, 더 바람직하기로는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열.
다른 바람직한 예에서, 도메인 항체 구조체는 서열번호 11에 기재된 서열과 60% 이상, 바람직하기로는 80% 이상, 더 바람직하기로는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열, 가장 바람직하기로는 서열번호 11에 기재된 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "에 결합하는"이라는 용어는, 예컨대 BIAcore™ 표면 플라즈몬 공명 시스템과 BIAcore™ 동력학 평가 소프트웨어(예, 버전 2.1)을 이용한 표면 플라스몬 공명 분석으로 측정했을 때, 면역글로불린 가변성 영역에 의해서 항원에 해리 상수(Kd) 1 μM 이하로 결합함을 의미한다. 특이적 결합의 상호작용에 대한 친화성 또는 해리 상수(Kd)는 바람직하기로는 약 500 nM 또는 그 미만이고, 더 바람직하기로는 약 300 nM 또는 그 미만이고, 바람직하기로는 적어도 300 nM 내지 50 pM, 200 nM 내지 50 pM이며, 더 바람직하기로는 적어도 100 nM 내지 50 pM, 75 nM 내지 50 pM, 10 nM 내지 50 pM이다. 본 명세서에 사용된 "dAb"라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 하나의 가변성 도메인(VH 또는 VL) 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명의 다른 바람직한 예에서, 도메인 항체 구조체는 동형이량체 또는 본 발명에 따른 다른 도메인 항체 구조체와 함께 이형이량체를 형성한다. 이량체와는 항원 결합 강도를 증가시킬 수 있으며, 결합 세기는 다중 결합 부위의 총 결합 친화성과 관련있다. 이량체 형성을 촉진시키기 위해, 도메인 항체 구조체의 힌지 영역은 하나 이상의, 바람직하기로는 2개 이상의 시스테인 잔기를 포함한다.
특히 바람직한 본 발명의 예에서, 도메인 항체 구조체는 동일한 도메인 항체 구조체와 동형이량체를 형성한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는 이량체의 도메인 항체 구조체를 제공하며, 상기 이량체는 본 발명에 따른 도메인 항체 구조체 2개로 이루어진다.
바람직하게는 이량체 도메인 항체 구조체는 동형이량체이고, 특히 바람직하기로는 동형이량체를 구성하는 도메인 항체 구조체는 서열번호 11에 기재된 서열과 60% 이상, 바람직하기로는 80% 이상, 더 바람직하기로는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열, 가장 바람직하기로는 서열번호 11에 기재된 서열을 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 도메인 항체 구조체를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 60% 이상, 바람직하기로는 80% 이상, 더 바람직하기로는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열, 가장 바람직하기로는 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열을 포함한다.
제4 측면에서, 본 발명은 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 서열번호 50 또는 51에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 고엄격 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다.
2개의 폴리펩타이드 서열이 동일성% 제한에 포함되는지 여부를 결정하기 위해, 당업자는 병렬 비교 또는 서열의 다중 정렬을 수행할 필요가 있음을 알 것이다. 이러한 비교 또는 정렬에서, 차이는 정렬을 수행하기 위해 사용된 알고리즘에 따라, 비-동일한 잔기의 위치에서 나타날 것이다. 본 발명에서, 2개 이상의 아미노산 서열 간의 '동일성%' 또는 '유사성'에 대한 언급은 당업자에게 공지된 임의의 표준 알고리즘을 이용하여 결정되는, 동일한 및 유사한 잔기 각각의 수를 언급하기 위해 취해질 것이다. 예컨대, 아미노산 서열 동일성 또는 유사성은 GAP 프로그램을 이용하여 계산하거나, 및/또는 미국 위스콘신 메디슨 유니버서티 리서치 파크에 소재한 컴퓨터 제네틱스 그룹 인코포레이티드 사의 PILEUP 프로그램(Devereaux el at, 1984)을 이용하여 정렬할 수 있다. GAP 프로그램은 동일한/유사한 잔기의 수를 최대화하고 정렬에서 서열 갭의 갯수와 길이를 최소화하기 위해 Needleman 및 Wunsch (1970)의 알고리즘을 이용한다. 다른 예로, 또는 부가적인 예로, 3종 이상의 아미노산 서열을 비교할 때에는, Thompson et al. (1994)의 Clustal W 프로그램을 사용한다.
2개 이상의 뉴클레오타이드 서열이 이들 % 제한에 포함되는지 여부를 결정하기 위해, 당업자는 병렬 비교 또는 서열의 다중 정렬을 수행할 필요가 있음을 알 것이다. 이러한 비교 또는 정렬에서, 차이는 정렬을 수행하기 위해 사용되는 알고리즘에 의해, 비-동일한 잔기의 위치에서 나타날 것이다. 본 발명에서, 2개 이상의 아미노산 서열 간의 동일성%에 대한 언급은 당업자에게 공지된 임의의 표준 알고리즘을 이용하여 결정되는, 상기 서열들간의 동일한 잔기의 수를 언급하기 위해 취해질 것이다. 예컨대, 뉴클레오타이드 서열을 정렬하고, BESTFIT 프로그램이나 그외 미국 위스콘신 메디슨 유니버서티 리서치 파크에 소재한 컴퓨터 제네틱스 그룹 인코포레이티드 사의 적절한 프로그램을 이용하여 동일성을 계산할 수 있다(Devereaux et al, Nucl. Acids Res., 12:387-395, 1984).
고엄격성은 바람직하기로는 65℃ 및 0.1x SSC(1x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3사이트레이트 pH7.0)의 조건하에서의 혼성화를 포함한다.
일 예에서, 본 발명은 또한 예컨대 중쇄 및 경쇄 가변성 영역 유전자 계열에 특이적인 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해, 신세계 영장류의 림프구로부터 추출된 핵산으로부터, 신세계 영장류의 면역글로불린 가변성 영역 유전자를 증폭시키는 방법을 기초로 한다. 예컨대, 중쇄 및 경쇄 유전자의 가변성 도메인(각각 VH 및 VL) 범위에 대한 정보를 이용하여, 주어진 항원에 결합하는 것으로 공지된 항체를 코딩하는 클로닝된 중쇄 또는 경쇄 코딩 서열로부터, 가변성 도메인을 증폭시키는 PCR 프라이머를 제작할 수 있다. 이어, 본 발명의 도메인 항체 구조체를 제조하기 위해, 증폭된 가변성 영역을 적합한 발현 벡터에 단독으로 또는 본 발명의 인간 또는 영장류 불변부 서열에 대한 다른 폴리펩타이드 서열과 융합한 형태로 삽입한다. 적합한 발현 벡터는 당업자들에게 자명할 것이다.
VH, VL 및 불변부 도메인의 레퍼토리는 면역글로불린 서열의 자연적으로 이루어지는 레퍼토리이거나 또는 합성 레퍼토리일 수 있다. 자연적으로 이루어지는 레퍼토리는, 예컨대 하나 이상의 영장류로부터 수득한 면역글로불린 발현 세포로부터 형성되는 것이다. 이러한 레퍼토리는 나이브(naive), 즉, 신생 면역글로불린 발현 세포로부터 형성되거나, 또는 재정렬, 즉, 성체 영장류의 B 세포로부터 형성될 수 있다. 필요하다면, 향상된 결합 특징을 가진 변이체를 생산 및 선별하기 위해, 천연 레퍼토리로부터 동정된 클론 또는 표적 항원에 결합하는 임의 레퍼토리에 돌연변이를 유발시키고, 추가적으로 스크리닝한다.
하나의 면역글로불린 가변성 도메인의 합성 레퍼토리는 다양성을 클로닝된 가변성 도메인에 인위적으로 부여함으로써, 만든다.
VH 및 VL 도메인의 레퍼토리는 예컨대 파지 디스플레이에 의해 원하는 결합 특이성 및 기능적 형태로 스크리닝할 수 있다. 박테리오파지 디스플레이 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리의 구축 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 파지 디스플레이 기법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 방법과 화합물의 예, 그리고 이러한 산물의 친화성 성숙(affinity maturing)의 예는, 예컨대 Barbas et al.(1991) PNAS 88:7978-7982; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624:628; Dower et al. PCT. 91/17271, 미국 특허 5,427,908, 미국 특허 5,580,717 및 EP 527,839; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373:1377; Garrard et al. PCT WO 92/09690; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725:734; Griffiths et al. 미국 특허 5,885,793 및 EP 589,877; Hawkins et al. (1992) J MoI Biol 226:889-896; Hay et al. (1992) Hum Autibod Hybridomas 3:81-85; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Husc et al. (1989) Science 246:1275-1281; Knappik et a (2000) J Mol Biol 296:57-86; Knappik et al. PCT WO 97/08320; Ladner et al. 미국 특허 5,223,409, 5,403,484, 5,571,698, 5,837,500 및 EP 436,597; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; McCafferty et al. PCT. WO 92/01047, 미국 특허 5,969,108 및 EP 589,877; Salfeld et al. PCT WO 97/29131, 미국 가출원 60/126,603; 및 Winter el al. PCT WO 92/20791 및 EP 368,684에서 찾을 수 있다.
VH 및 VL 도메인의 레퍼토리를 발현하는 재조합 라이브러리는 미생물, 예컨대 효모나 박테리아의 표면상에 발현시킬 수 있다(PCT 공개공보 WO 99/36569 및 98/49286 참조).
본 발명의 도메인 항체 구조체는, 진핵생물의 발현 시스템, 예컨대 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포 뿐만 아니라 진균 및 바이러스에 코딩된 발현 시스템을 포함한 재조합 수단에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 도메인 항체 구조체를 S 항체를 코딩하는 핵산을 이용하여 제조ㅎ하여, 식물 일부 또는 그로부터 배양된 세포에서 그러한 구조체를 생산하는, 형질전환 식물 및 배양된 식물 세포(예, 담배 및 옥수수가 있으나, 이로 한정되지 않음)를 제공할 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 담배 잎을 이용하여 예컨대 유도성 프로모터를 이용하여 재조합 단백질을 다량 제공하는데 성공하였다(예, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118, 1999 및 이에 인용된 참조문헌을 참조함). 또한, 형질전환 옥수수를 이용하여, 상업적인 생산 수준으로, 다른 재조합 시스템에서 생산된 것 또는 천연원으로부터 정제된 것과 등가의 생물학적 활성을 가진, 포유류 단백질을 생산하였다(예, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 1999 및 이에 인용된 참조문헌을 참조함). 또한, 단쇄 항체(scFv's)와 같은 항체 단편을 포함한 항체를, 항체를 담배 종자 및 감자 덩이 줄기 등의, 형질전환 식물로부터 다량 생산하였다(예, Conrad el al,. Plant Mol. Biol. 38: 101 - 109 1998 및 이에 인용된 참조문헌을 참조함). 따라서, 본 발명의 도메인 항체 구조체는 또한 공지된 방법에 따라 형질전환 식물을 이용하여 생산할 수 있다(또한, 예로, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99 - 108 October, 1999: Ma & Hein., Trends Biotechnol. 13:522-7 1995; Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 1995; Whitelam et al, Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 1994; 및 이에 인용된 참조문헌을 참조하며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명의 도메인 항체는 천연에서 정제한 산물, 화학 합성 공정의 산물, 및 예컨대 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포 등의 진핵 생물 숙주로부터 재조합 기법에 의해 생산한 산물을 포함한다. 재조합 생산 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체 구조체는 당화 또는 비당화될 수 있으며, 당화되는 것이 바람직하다. 이러한 방법은 수많은 표준 실험 매뉴얼, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989, Sections 17.37-17.42; Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1987-1993, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 및 20, Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y. 1997-2001, Protein Science, Chapters 12-14에 기재되어 있으며, 이들은 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
하나의 발현 시스템에서, 재조합 펩타이드/단백질 라이브러리는 리보좀 상에 표시된다(예, Roberts, RW and Szostak, J.W.1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12297-123202 및 PCT 공개공보 WO98/31700). 따라서, 다른 예는 (예컨대, 바람직하기로는 이로 한정되지 않지만, 면역화된 세포로부터 만들어진 항체들 또는 유도체들의) DNA 라이브러리의 제조와 시험관내 전사, 단백질 및 "면역화된" mRNA가 리보좀 상에 머무르게 하는 라이브러리의 번역, (예컨대, RSP에 대한 결합에 의한) 친화성 선별, mRNA 분리, 역 번역 및 (예컨대, 중합효소 연쇄 반응이나 관련 기술에 의한) 후속적인 증폭을 포함한다. 친화성 성숙을 위해 필요에 따라, 본 시스템에 체세포 돌연변이를 도입하거나, 또는 당업계에 공지된 다른 친화성 성숙 방법에 의해 추가적인 선택 및 증폭 과정과 커플링시킬 수 있다.
다른 예는 본 발명의 도메인 항체 제조에 에멀젼 구획화(compartmentalization) 기술의 적용을 고찰한다. 에멀젼 구획화에서, 시험관내 및 광학 분류 방법은 에멀젼 중의 오일 액적(droplet)내 수상에서의 번역된 단백질 및 이의 뉴클레오타이드 코딩 서열의 공동-구획화와 조합된다(PCT 공개공보 WO99026711 및 WO0040712 참조).
CDR 서열은 수종의 소스, 예컨대 데이타베이스, 예로 국립 생물공학 정보센터의 단백질 및 뉴클레오타이드 데이타베이스(The National Centre for Biotechnology Information protein and nucleotide database) www.ncbi.nlm.gov, 면역학적 관심 단백질 서열의 카바트 데이타베이스(The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest) www.kabatdatabase.com, 또는 IMGT 데이타베이스 www.imgt.cines.fr로부터 입수할 수 있다. 또한, CDR 영역은 VH 및 VL 도메인의 레퍼토리로부터 예측할 수 있다(예, Kabat EA and Wu TT. Attempts to locate complementarity determining residues in ihc variable positions of light and heavy chains. Ann, NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971)). CDR 서열은 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다.
치환 CDR을 가변성 도메인 서열에 그래프트할 수 있는 방법은 여러가지가 있으며, 이러한 방법들은 당업자들에게 익숙할 것이다. 바람직한 본 발명의 방법은 프라이머에 의한 돌연변이 유발을 통해, 가변부 도메인(또는 dAb)내의 CDR2를 치환하는 것을 포함한다. 이 방법은, 시험관내에서 DNA 합성을 개시하기 위한 프라이머로 제공되는 표적 영역에 원하는 돌연변이를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 어닐링시키는 단계, DNA 중합효소에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드를 연장시켜 원하는 돌연변이가 있는 이중 가닥 DNA를 만드는 단계, 및 이 서열을 적합한 발현 벡터에 삽입 및 클로닝하는 단계로 구성된다.
본 발명의 바람직한 예에서, 신세계 영장류 CDR 서열은 인간에서 낮은 면역원성(immiinogenicity)의 가변부 서열에 그래프트된다.
"낮은 면역원성"이라는 용어는, 도메인 항체 구조체 또는 그것의 항원-결합 부분이, 치료학적 효과를 달성하기 위한 충분한 시간 동안에 도메인 항체 구조체의 지속적인 투여 효과를 낮추기에 충분한 정도로, 인간에서 항체 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다.
바람직하기로는, 신세계 영장류 CDR에 그래프트된 가변부 서열은 도 1의 "dAb 어셉터 서열"(화합물 128)이다. dAb 어셉터 서열은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 구성된다:
Figure 112008062085610-PCT00009
(서열번호 5)
이 서열은 서열번호 6에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다:
Figure 112008062085610-PCT00010
(서열번호 6)
본 발명의 바람직한 일 예에서, 마모셋 신세계 영장류 CDR 서열 YSASNLET (서열번호 4)는 가변부 dAb 어셉터 서열에 그래프트되어, 상기 dAb 어셉터 서열의 CDR2 서열(YSASELQS; 서열번호 55)를 치환함으로써, 다시 dAb가 제조된다(화합물 145):
화합물 145
Figure 112008062085610-PCT00011
(서열번호 7)
따라서, 바람직한 일 예에서, 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체의 dAb는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 범위내에서, 도메인 항체 구조체의 가변부 서열(dAb)은 이의 항원 결합 특징을 향상시키기 위해 친화성 성숙을 더욱 수행할 수 있다. 이때, CDR1, CDR3 또는 도메인 항체 구조체의 프레임워크내 특정 아미노산 잔기의 변형이 필요할 수도 있다.
예컨대, 서열번호 7은 재료 및 방법에 기재한 바와 같이 친화도가 성숙되었으며, TNF-α 결합성에 대해 평가되었다. 추가적인 바람직한 예에서, 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체의 가변부(dAb)는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함한다. 이들은 각각 화합물 123 및 100으로 명시되며, 각 서열은 하기에 나타낸다:
화합물 123
Figure 112008062085610-PCT00012
(서열번호 8)
화합물 100
Figure 112008062085610-PCT00013
(서열번호 9)
특히 바람직한 예에서, 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체의 가변부(dAb)는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 이는 화합물 196으로 명시되며, 그 서열은 하기에 나타낸다:
화합물 196
Figure 112008062085610-PCT00014
(서열번호 10)
당업자는, 도메인 항체 구조체의 불변부 서열이 인간 또는 영장류 서열로부터 유래될 수 있음을 당업자들이 인지할 것이다. 영장류 서열은 신세계 영장류 또는 구세계 영장류 서열일 수 있다. 적합한 구세계 영장류로는 침팬지 또는 그외 사람과 유인원(hominid ape), 예컨대 고릴라 또는 오랑우탄을 포함하며, 이들은 인간과의 밀접한 계통 발생적인 근접성으로 인해 인간 불변부 서열과 높은 수준의 상동성을 공유하고 있다. 바람직하기로는, 불변부는 인간 항체 서열로부터 유래된다. 이러한 서열의 예는 국립 생물공학 정보 단백질 및 뉴클레오타이드 데이타베이스 www.ncbi.nlm.nih.gov 및 면역학적 관심 단백질 서열의 카바트 데이타베이스(The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest) www.kabatdatabase.com, 또는 IMGT 데이타베이스 www.imgt.cines.fr로부터 찾아 볼 수 있다.
본 발명의 도메인 항체 구조체를 제작함에 있어, 본 발명자들은 불변부(Fc) 영역의 절단형 CH1 도메인을 만들었다. 힌지 영역 주변 도메인 항체 구조체에 유연성을 제공하기 위해, CH1 도메인의 최소 갯수를 잔기를 유지시킨다. 바람직하기로는 CH1 도메인의 C-말단 아미노산 서열 적어도 20개, 더 바람직하기로는 적어도 10개, 보다 더 바람직하기로는 적어도 5개, 더 더욱 바람직하기로는 한개의 아미노산 잔기가 유지된다.
따라서, 바람직한 예에서, 도메인 항체 구조체는 도 2에 도식적으로 예시된 바와 같이 dAb-C 말단 CH1 도메인 잔기-힌지 영역-CH2 도메인-CH3 도메인을 포함하는 포맷을 갖는다.
특히 바람직한 예로, 도메인 항체 구조체는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가진다. 이는 화합물 170으로 명기된다.
화합물 170
Figure 112008062085610-PCT00015
(서열번호 11)
자연적으로 형성된 면역글로불린의 힌지 영역은 중쇄의 CH1 도메인과 경쇄의 불변 도메인 간에 이황화 결합 형성을 용이하게 하는 시스테인(C) 측쇄를 포함한다. 구조체는 오진 하나의 가변성 도메인을 포함하고 따라서 반응가능성이 있는 쌍을 이루지 못한 시스테인 잔기를 남기기 때문에, 시스테인 잔기는 이황화 결합 형성을 방지하는 아미노산 잔기로 치환된다. 쌍을 이루지 못한 시스테인을 가진 경우의 가능성 있는 결과는 구조체의 응집 및 미스폴딩으로 인한 단백질 발현 감소를 포함할 수 있다.
임의의 항체 클래스로부터 유래된 임의의 힌지 영역 서열은 본 발명에 사용하는데 적합한 것으로 이해된다. 그러나, 힌지 영역은 항체 서브클래스 IgG1으로부터 유래되는 것이 바람직하다. 바람직하기로는, 힌지 영역은 IgG1의 힌지 영역의 천연 서열을 기본으로 하며, 서열 EPKS S DKTHTCPPCPA(서열번호 12)를 포함한다. 상기 서열에서, 정상적으로 5번 위치에서 형성되는 Cys는 밑줄친 진한 Ser 잔기로 치환된다.
바람직하기로는, CH1 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 IgG1으로부터 유래된다. 더 바람직하기로는, CH1 잔기는 발린(V) 잔기 또는 루신(L)이나 이소루신(I)와 같은 보존적인 아미노산 치환이다. 이 잔기는 힌지 영역에 바로 인접하여 위치되며, 힌지 영역 주변 구조체의 유연성을 증가시키는 것을 보조한다.
CH2 및 CH3 도메인의 서열은 바람직하기로는 스위스프로트 에티아베이스 등재 번호(Swissprot database accession number) PO1857로부터 유래된다.
Figure 112008062085610-PCT00016
(서열번호 63).
도메인 항체 구조체는 유도체화되거나 또는 다른 기능성 분자에 연결될 수 있다. 예컨대, 도메인 항체 구조체는 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유결합에 의한 조합, 또는 다른 항체, 검출가능한 물질, 세포독성 물질, 제약학적 물질 및/또는 항체 또는 항체-결합 부분과 다른 분자(예컨대, 스트렙타미딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 텍)의 조합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드 등의 하나 이상의 다른 분자 실체에 기능적으로 연결될 수 있다.
도메인 항체 구조체를 유도체화시킬 수 있는 유용한 검출가능한 물질로는 형광 화합물이 있다. 예시적인 형광 검출가능한 물질로는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등이 있다. 또한, 도메인 항체 구조체를 알칼리 포스파타제 포르세라디쉬 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등의 검출가능한 효소로 유도체화할 수 있다. 도메인 항체 구조체를 검출가능한 효소를 이용하여 유도체화 하였을 때, 효소에 의해 이용되어 검출가능한 반응 산물을 만드는 추가적인 반응제를 부가함으로써, 검출한다. 또한, 도메인 항체 구조체를 바이오틴으로 유도체화할 수 있으며, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 도메인 항체 구조체는 생체내 활성(예, 결합 친화성)을 감소없이 반감기 증대 및 분해에 대한 내성을 제공하는, 하나 이상의 분자에 연결될 수 있다. 상기 분자는 항원 결합 부위를 간섭/구조적으로 방해하지 않도록, 링커를 통해 도메인 항체 구조체에 연결될 수 있다. 이러한 부가 분자로는 예컨대 미국 특허 출원 20050271663에 기재된 내인성 분자에 대한 dAb를 포함한다. 전형적으로 이러한 부가 분자는 생체내에서 자연적으로 형성되며 내인성 기전에 의해 분해 또는 제거에 내성을 보이는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 단편이다. 반감기를 증대시키는 분자는 하기 군으로부터 선택할 수 있다:
(a) 세포외 기질 유래 단백질, 예컨대 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 파이브로넥틴;
(b) 혈액에서 발견되는 단백질, 예컨대 피브린 알파-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 파이브리노겐 A, 파이브리노겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈, 단백질, 유비퀴틴, 유테로글로불린, B-2 마이크로글로불린, 플라스미노겐, 라이소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티트립신 및 췌장 킵신 저해제;
(c) 면역 혈청 단백질, 예컨대, IgE, IgG, IgM;
(d) 수송 단백질, 예컨대 레티놀 결합 단백질, 알파-1-마이크로글로불린;
(e) 데펜신(defensin), 예컨대, 베타-데펜신 1, 호중구 데펜신 1, 2 및 3;
(f) 혈액-뇌 장벽이나 신경 조직에서 발견되는 단백질, 예, 멜라노코르틴 수용체, 마이엘린, 아스코르베이트 수송체;
(g) 트랜스페린 수용체 특이적인 리간드-신경의약 제제 융합 단백질(US5977307 참조); 뇌 모세혈관 내피세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자1(IGF 1) 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 2(IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체;
(h) 신장에 국소 존재하는 단백질, 예컨대, 폴리시스테인, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 수송체 K1, 헤이만의 항원(Heymann's antigen);
(i) 간에 국소 존재하는 단백질, 예컨대 알코올 데하이드로게나제, G250;
(j) 혈액 응고 인자 X;
(k) α-1 안티트립신;
(l) HKF lα;
(m) 폐에 국소 존재하는 단백질, 예, 분비 성분(secretory component)(IgA 결합);
(n) 심장에 국소 존재하는 단백질, 예, HSP 27;
(o) 피부에 국소 존재하는 단백질, 예, 케라틴;
(p) 골 형성 단백질(BMP) 등의 골 특이 단백질, 예, BMP-2, -4, -5, - 6, -7 (또한, 골 형성 단백질(osteogenic protein)(OP-1)이라고도 함) 및 -8 (OP-2);
(q) 종양 특이 단백질, 예, 인간 트로포블라스트 항원, 헤르셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신, 예컨대 카텝신 B(간과 비장에서 발견됨);
(r) 질병 특이 단백질, 예, 활성화된 T 세포에서만 발현되는 항원; LAG-3(림프구 활성화 유전자); 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 리간드(OPGL), Kong YY et al., Nature 402, 304- 309, 1999 참조; OX40(활성화된 T 세포에서 발현되는 TNF 수용체 계열의 일원 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-1(HTLV-1)-생산 세포에서 특이적으로 상향-조절되는 것으로 알려져 있는 오직 공동-자극성 T 세포 분자, Pankow R et al., J. Immunol. 2000 Jul;165(l):263-70 참조; CG6512 초파리, 인간 파라플레긴(paraplegin), 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤라인 ftsH 등의 (관절염/종양과 관련있는) 메탈로프로테아제; 산성 섬유모세포 성장 인자(FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF-2), 혈관 내피세포 성장 인자/혈관 투과성 인자(VEGF/VPF), 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파), 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 안지오게닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 유래 내피세포 성장 인자(PD-ECGF), 태반 성장 인자(PIGF), 미드킨(midkine) 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF), 프랙탈카인(fractalkine) 등의 신생혈관 성장 인자;
(s) 스트레스 단백질(열 충격 단백질); 및
(t) Fc 수송에 관여하는 단백질.
또한, 본 발명은 PEG화되지 않은 항체 폴리펩타이드에 비해 활성(예, 결합 친화성)이 감소되지 않으면서, 반감기 증가 및 분해 내성을 제공하는 PEG화된 도메인 항체 구조체까지 확장된다.
도메인 항체 구조체를 반감기 증가 및 분해 내성 특징을 획득하는데 유용한 폴리머 분자 (바람직하기로는 PEG)에 당업계에 공지된 방법을 이용하여 연결할 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 폴리머 모이어티는 합성 또는 천연적으로 형성될 수 있으며, 선형 또는 분지형 체인, 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 폴리머, 또는 분지형 또는 비분지형의 호모- 또는 헤테로-다당류 등의 다당류를 포함하나, 이들로 한정되진 않는다. 본 발명에 이용할 수 있는 합성 폴리머의 바람직한 예로는, 선형 또는 분지형의 체인 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) 또는 폴리(비닐 알코올) 및 이들의 유도체나 치환된 형태를 포함한다. 도메인 항체 구조체의 연결에 있어 특히 바람직한 치환된 폴리머로 메톡시(폴리에틸렌 글리콜) 등의 치환된 PEG를 포함한다. PEG와 함께 또는 PEG 대신 본 발명에 이용할 수 있는 천연 폴리머 모이어티로는 락토스, 아밀로스, 덱스트란 또는 글리코겐 뿐만 아니라 당업자들이 인지하고 있는 이들의 유도체를 포함한다.
본 발명에 사용가능한 폴리머(PEG) 분자는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 도메인 항체 구조체에 부착시킬 수 있다. PEG 또는 그외 폴리머 모이어티를 본 발명의 도메인 항체 구조체에 부착하는 첫번째 단계는, PEG 폴리머의 하이드록시 말단기를 친전자체-함유성 관능기로 치환하는 것이다. 특히, PEG 폴리머는 도메인 항체 구조체 단량체 또는 다중체에 존재하는 시스테인 또는 라이신 잔기 중 어느 하나에 부착된다. 시스테인 및 라이신 잔기는 천연적으로 형성된 것일 수 있으며, 또는 도메인 항체 구조체 분자에 조작될 수 있다.
임의의 수많은 방법에 의해 본 발명의 도메인 항체 구조체의 페길화(pegylation)를 달성할 수 있다(예, Kozlowski-A & Harris JM (2001) Journal of Controlled Release 72:217). PEG는 직접 또는 매개 링커(intervening linker)에 의해 도메인 항체 구조체에 부착될 수 있다. 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 부착하기 위한 링커레스 시스템(linkerless system)은 Delgado et al. (1992), Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304; Francis el al., (1998), Intern. J. Hematol. 68: 1-18; US 4,002,531; US 5,349,052; WO 95/06058; 및 WO 98/32466에 기술되어 있으며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포한된다.
매개 링커를 사용하지 않고 폴리에틸렌 글리콜을 직접 단백질의 아미노산 잔기에 부착하기 위한 한가지 시스템은, 트레실클로라이드를 이용하여 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(MPEG)의 변형에 의해 제조된 트레실화된(tresylated) MPEG를 사용한다. 트레실화된 MPEG와 아미노산 잔기의 반응 이후에, 폴리에틸렌 글리콜을 아민기에 직접 부착한다. 따라서, 본 발명은 2,2,2-트리플루오레오탄 설포닐 기를 가진 폴리에틸렌 글리콜 분자와 본 발명의 단백질의 반응에 의해 제조된, 단백질-폴리에틸렌 글리콜 접합체를 포함한다.
또한, 폴레에틸렌 글리콜을 여러가지 매개 링커를 이용하여 단백질에 부착시킬 수 있다. 예로, US 5,612,460에는 폴리에틸렌 글리콜을 단백질에 연결하기 위한 우레탄 링커가 언급되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜이 링커에 의해 단백질에 부착된 단백질-폴리에틸렌 글리콜 접합체는 또한 MPEG-숙신이미딜숙시네이트, 1,1'-카보닐디이미다졸을 이용하여 활성화된 MPEG, MPEG-2,4,5-트리클로로페닐카르보네이트, MPEG-p-니트로페놀카보네이트, 및 다양한 MPEG-숙시네이트 유도체 등의 화합물과 단백질의 반응에 의해 만들 수 있다. 다수의 추가적인 폴리에틸렌 글리콜 유도체들과 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 부착시키기 위한 반응 화학 방법들은 WO 98/32466에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 특히 바람직한 예에서, 도메인 항체 구조체는 라이신 잔기를 통해 폴리에틸렌 글리콜에 직접 커플링된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 예에서, 도메인 항체 구조체는 시스테인 잔기를 통해 PEG에 직접 커플링된다. 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기가 서열내에 기존재할 수 있으며, 예컨대 도메인 항체 구조체의 C-말단에 시스테인 잔기 삽입에 의해, 첨가될 수 있다. 다른 예로, 도메인 항체 구조체에 PEG의 부착은 US20060210526에 언급된 바와 같이 이황화 결합을 이룬 시스테인을 통해 이루어질 수 있다.
폴리머 분자의 다른 유도체화된 형태로는, 예컨대 전술한 도메인 항체 구조체의 아미노산 잔기와의 상호작용을 허용하는, 그것에 존재하는 추가적인 모이어티 또는 반응성기를 가진 유도체를 포함한다. 이러한 유도체로는 N-하이드록실숙신이미드(NHS) 활성 에스테르, 숙신이미딜 프로피오네이트 폴리머 및 말레이미드, 비닐 설폰 및 티올 등의 설프하이드릴-선택적 반응 물질이 있다. PEG 폴리머는 선형 분자일 수 있으며, 또는 다수의 PEG 모이어티가 하나의 폴리머에 존재하는 분지형 분자일 수 있다.
반응성기(예, MAL, NHS, SPA, VS, 또는 티올)을 직접 PEG 폴리머에 부착하거나, 또는 링커 분자를 통해 PEG에 부착시킬 수 있다.
본 발명에 사용가능한 폴리머의 크기는 500 Da - 60 kDa 범위, 예컨대, 1000 Da - 60 kDa, 10 kDa - 60 kPa, 20 kDa - 60 kDa, 30 kDa - 60 kDa, 40 kDa - 60 kDa, 및 최대 50 kDa - 60 kDa일 수 있다. 본 발명에 사용되는 폴리머, 특히 PEG는 직쇄 폴리머이거나, 또는 분지 형태를 가질 수도 있다.
다른 예에서, 제1 측면에 따른 도메인 항체 구조체는, 예컨대 이형이량체, 동형이량체, 이형삼량체, 동형삼량체, 이형사량체, 동형사량체, 또는 그 이상의 이형- 또는 동형다량체로 다량체화될 수 있다. 다량체화는 항원 결합 강도를 증가시킬 수 있는데, 결합 강도는 다중 결합 부위의 결합 친화성 총 합과 관련있다.
제5 측면에서, 본 발명은 제1 측면에 따른 도메인 항체 구조체의 유혀량과 제약학적으로 허용가능한 담체나 희석제를 포함하는, 제약학적 조성물을 제공한다.
"제약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 적합한, 임의의, 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 한가지 이상의 물, 염수, 포스페이트 완충화된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 다른 많은 경우들에서, 등장제, 예컨대 당, 만니톨, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드 등의 폴리알코올이 조성물에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 제약학적으로 허용가능한 물질은 습윤제, 유화제, 보존제 또는 완충제 등의 미량의 보조 물질이다.
조성물은 액체, 반고체 또는 고체 투여 형태 등의 다양한 형태, 예컨대, 액체 용액(예, 흡입 용액, 주사 용액 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제일 수 있다. 바람직하기로는, 조성물은 면역화하기 위한 주사 용액 형태이다. 투여는 정맥내, 동맥내, 피하내, 복막내 또는 근육내일 수 있다.
치료 조성물은 일반적으로 취급 및 보관 조건하에서 멸균된 상태이고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 약물 고농축에 적합한 그외 정렬된 구조(ordered structure)로 제형화될 수 있다. 멸균 주사 용액은 상기에 나열한 성분들 중 한가지나 이들 성분들의 조합과 함께, 활성 화합물을 적정 용매 중에 필요한 함량으로 혼입하고, 여과 멸균함으로써, 제조할 수 있다.
또한, 조성물은 멸균 주사 용액을 제조하기 위한 멸균 분말로 제형화할 수 있다.
특정 예에서, 활성 화합물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템 등의, 조절된 방출 제형과 같이, 화합물이 신속하게 방출이 되지 않도록 하는 담체를 이용하여 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수화물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르(polyorthoester) 및 폴리락트산과 같은 혼용가능한 폴리머를 사용할 수 있다.
또한, 조성물은 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 이러한 예로, 도메인 항체 구조체를 경질 또는 연질 셸 젤라틴 캡슐에 봉입하거나, 정제로 압축하거나 또는 개체의 식이에 직접 혼입할 수 있다.
폐, 직장, 경피, 척수강내(intrathecal) 및 안내 투여가 가능한 제형은 당업자들에게 익숙할 것이다.
또한, 보충적인 활성 화합물을 조성물에 혼입시킬 수 있다. 도메인 항체 구조체를 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대 가용성 TNF-α 수용체나 인간 TNF-α 생성을 저해하는 화학제, 또는 사이토카인이나 세포 표면 분자와 같은 다른 표적에 결합하는 항체와 함께, 공동-제형화하거나 및/또는 공동-투여할 수 있다. 다른 예로, 단백질 A, C, G 또는 L 등의 가용성 면역화학제와 공동-투여할 수 있다.
유효량은 본 발명의 도메인 항체 구조체의 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량을 포함할 수 있다. 치료학적 유효량은 원하는 치료 결과를 달성하기 위한, 필수 기간 동안에 투여량으로서 유효한 양을 의미한다. 예방학적 유효량은 원하는 예방 결과를 달성하기 위한, 필수 기간 동안에 투여량으로서 유효한 양을 의미한다. 예방학적 투여량은 질병 초기 단계나 그 전에 개체에게 투여되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 보다 적을 수 있다.
제6 측면에서, 본 발명은 인간 TNF-α를 검출하기 위한 진단 활용에서의 본 발명의 제1 측면에 따른 도메인 항체 구조체의 용도를 제공한다.
예컨대, 본 발명에 따른 항-인간 TNF-α 도메인 항체 구조체를 사용하여 예컨대 혈청 또는 혈장과 같은 생체 시료에서 효소 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(RIA) 또는 면역조직화학과 같은 통상적인 면역분석을 이용하여 인간 TNF-α를 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 항-인간 TNF-α 도메인 항체 구조체는, 검출가능한 물질로 표지된 재조합 인간 TNF-α 표준물질과 비표지된 항-인간 TNF-α 항체를 이용한 경쟁 면역 분석에 의해 생체 체액에서 분석할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항-인간 TNF-α 도메인 항체 구조체를 사용하여 인간을 제외한 다른 종, 예컨대 시노폴구스(cynomolgus), 침팬지, 마모셋, 레수스(rhesus) 등의 인간 이외의 영장류와 개, 랫, 마우스, 토끼, 개, 돼지 및 소 등의 그외 종들로부터 TNF-α를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항-인간 TNF-α 도메인 항체 구조체는 TNF-α 활성 저해를 원하는 세포 배양물 적용에 사용할 수 있다.
제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 제약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 개체에서 인간 TNF-α 활성이 특징인 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
인간 TNF-α 활성이 특징인 장애는, 장애를 겪고 있는 개체에서의 TNF-α의 존재가 장애 악화에 기여하는 인자나 장애의 병리생리에 원인인 것으로 확인되거나 또는 의심되는 질병 및 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하기로는, 인간 TNF-α 활성이 특징인 장애는 염증; 염증성 질환; 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 그람 음성 패혈증 및 독성 쇼크 증후군과 같은 패혈증; 류마티스 관절염, 소아 관절염, 류마티스 척추염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 골관절염, 통풍성 관절염(gouty arthritis), 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역성 당뇨병, 자가면역성 포도막염, 건선, 유천포창(pemphigoid) 및 신장 증후군과 같은 자가면역 질환; 황반 변성, 포도막염, 베체트병 등의 눈의 염증 증상; 감염으로 인한 열 및 근통과 감염에 이차적인 악액질과 같은 감염성 질환; 이식 편대 숙주 질환; 종양 증식 또는 전이, 혈액 종양; 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 쇼크 폐, 만성 폐 염증성 질환, 폐의 유육종증, 폐 섬유증 및 규폐증과 같은 폐 장애; 크론 질환 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 장애; 심장 장애, 울혈성 심장 기능 부전; 베그너 질환, 거대세포 동맥염 등의 혈관 장애; 염증성 골 장애, 중추 신경계 장애, 예컨대 알츠하이머 질환; 좌골 신경통과 같은 말초 신경계 장애; 간염; 응고 장애(coagulation disturbance); 화상; 재관류 손상; 자궁내막증; 켈로이드 형성; 및 반흔 조직 형성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히 바람직한 예에서, 인간 TNF-α 활성이 특징인 장애는 노인성 황반 변성이다. TNF-α는 VEGF 생성을 자극하고 눈에서 신혈형성(neovascularisation)을 촉진시키는데 관여하므로(Oh-H et al., 1999 Investigative Ophthalmology & Visual Science 40:1891-98), 따라서 본 명세서에 언급된 도메인 항체 구조체와 같은 TNF-α 활성의 저해제는 노인성 황반 변성 등의 신생혈관-관련 눈 장애의 치료에 사용가능할 것이다.
명세서 전반에 "포함한다"라는 용어 또는 이의 "포함한다" 또는 "포함하는" 등의 변형 용어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함함을 암시하는 것으로 이해될 것이며, 어떠한 다른 요소 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아니다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 원용으로서 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 법령, 재료, 장치, 논문 등에 관한 모든 논의는 단지 본 발명에 대한 정황을 제공하기 위한 것이다. 임의의 또는 모든 상기 내용이 선행 기술 기반의 일부를 이루거나 오스트레일리아나 다른 곳에서 본 출원의 각 청구항이 우선일 전에 본 발명과 관련된 분야에서 일반적인 공유 기술이었음을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
도 1은 어셉터 dAb의 아미노산(서열번호 5) 및 뉴클레오타이드 서열(서열번호 6)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 도메인 항체 구조체의 바람직한 구조예를 단량체(A) 및 이량체(B)로 나타낸 것이다.
도 3은 마모셋 원숭이의 11가지 Vk 유전자 세그먼트와 올빼미 원숭이의 6가지 Vk 유전자 세그먼트의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 어셉터 dAb 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열(양 가닥)을 나타낸 것이다. CDR2를 포함한 영역을 자르는 KpnI 및 San DI의 제한효소 절단 부위가 도에 표시되어 있다. 적출되는 CDR2 잔기는 밑줄로 표시되어 있다.
도 5는 뮤라인 L929 세포 생존성 분석에서 TNF-α 매개 세포독성을 중화하는 화합물 170(서열번호 11)의 능력을 나타낸 것이다.
도 6은 인간 p55 또는 p75 TNF 수용체와 TNF-α의 상호 작용을 방지하는 화 합물 170(서열번호 11)의 능력을 나타낸 것이다.
도 7은 트랜스멤브레인 TNF-α 발현성 NSO 27D4 세포(검정선)의 화합물 170(서열번호 11) 염색을 나타낸 것으로, 관련없는 특이 이소타입-매치된 대조군(회색 부분) 보다 높은 형광 강도를 보인다.
도 8은 ELISA에서 TNF-α에 대한 결합성으로 유지하고 있는 박테리아 발현 시스템에서 생산된 화합물 170(서열번호 11)을 나타낸 것이다.
도 9는 TNF-매개 뮤라인 관절염 모델에서의 화합물 170(서열번호 11)의 효능을 특이 대조군 인간 IgG1에 상대적으로 나타낸 것이다. 일주일 간격으로 마우스를 측정하고(관절염 스코어)(A) 및 무게를 측정하였다(B).
도 10은 화합물 112(서열 59) 및 화합물 170(서열번호 11)의 단백질 발현에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 리드 세포주의 4 x 10 L 발효물로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170(서열번호 11)의 비-환원성 SDS PAGE 분석 결과이다: 레인 1 = 분석간 대조군; 레인 2 = 분자량 마커; 레인 3 = 블랭크; 레인 4 = 10 L 발효물 ID(run 1)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170(서열번호 11); 레인 5 = 10 L 발효물 ID(run 2)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170; 레인 6 = 10 L 발효물 ID(run 3)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170; 레인 = 10 L 발효물 ID(run 4)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170.
도 12는 리드 세포주의 4 x 10 L 발효물로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170(서열번호 11)의 환원성 SDS PAGE 분석 결과이다: 레인 1 = 분석간 대조군; 레인 2 = 분자량 마커; 레인 3 = 블랭크; 레인 4 = 10 L 발효물 ID(run 1)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170(서열번호 11); 레인 5 = 10 L 발효물 ID(run 2)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170; 레인 6 = 10 L 발효물 ID(run 3)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170; 레인 = 10 L 발효물 ID(run 4)로부터 단백질 A로 정제한 화합물 170.
본 발명의 특징으로 더욱 명확히 이해할 수 있도록, 바람직한 형태를 하기의 비제한적인 실시예를 들어 설명한다.
실시예 1 재료 및 방법
신시계 영장류의 V L 유전자 분리
마모셋(속: Callithrix, 종: 미확인) 및 올빼미 원숭이(Aotus trivirgatus)의 게놈 DNA를 ECACC(European Collection of Cell Cultures)로부터 각각 카탈로그 번호 85011419 및 90110510으로 입수하였다. 마모셋 DNA는 세포주 B95-8로부터 유래된 것이고 올빼미 원숭이 DNA는 세포주 OMK 637-69로부터 유래된 것이다.
인간 VK 리더 서열과 재조합 신호 서열(RSS)을 근간으로 한 축중 프라이머(Degenerate primer)는 Walter and Tomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996)으로부터 유래된 것이었다. 생식세포 VK DNA 증폭에 사용한 프라이머는 하기와 같다:
프라이머 VK1BL
AATCKCAGGTKCCAGATG (서열번호 13)
프라임 VK1BL35a
GTTYRGGTKKGTAACACT (서열번호 14)
프라이머 VK1BL35b
ATGMCTTGTWACACTGTG (서열번호 15)
게놈 PCR (30회 사이클)을 텍 중합효소와 프라이머 쌍 VK1BL x VK1 BL35a 또는 VK1BL x VK1BL35b 중 어느 하나를 이용하여 수행하였다. 클로닝한 서열과 사용한 2개의 프라이머 세트 간에 중첩이 있었다.
게놈 PCR 산물을 인비트로젠사의 TOPO TA 클로닝 키트(Cat No K4500-01)에 클로닝하고, M13 정방향 및 pUC 역방향 프라이머를 이용하여 서열분석하였다. 서열을 역방향 및 정방향으로 확인하였다. 주요 서열에 PCR 실수가 발생되지 않았는지를 더욱 검증하기 위해, PCR과 클로닝 과정을 마모셋 서열에 대해 2회 반복하였다. 뉴클레오타이드(서열번호 16-26 및 서열번호 38-43) 및 아미노산(서열번호 27-37 및 서열번호 44-49)을 도 3에 나타내었다. 마모셋 서열 1, 2 및 3을 검증하였다. 서열 4, 5, 6, 7 및 8은 단지 처음 PCR에서만 확인되었다. 서열 9, 10 및 11은 반복(즉, 2차) PCR 및 클로닝에서만 확인되었다.
올리고 합성과 어셉터 서열로의 클로닝
도 3에 나타낸 아미노산 서열들에서, 4개의 CDR 서열, 즉 올빼미 원숭이 서열 1(서열번호 44)로부터 유래된 YAATKLQS (서열번호 1), 올빼미 원숭이 서열 2(서 열번호 45)로부터 유래된 YEASSLQS (서열번호 2), 마모셋 서열 1(서열번호 27)로부터 유래된 YEASKLQS(서열번호 3), 및 마모셋 서열 2(서열번호 28)로부터 유래된 YSASNLET(서열번호 4)를 선택하였다. 올빼미 원숭이 서열 5, YYASSLQS(서열번호 56)이 GI6176295 아오투스 난시이내(Aotus nancyinaae)(Ma's night monkey) cDNA 서열과 동일한 것으로 확인되었으며, 나머지 서열은 모두 고유 서열이었다.
발현 벡터(도만티스사의 벡터)내 어셉터 가변부(항-TNF 도메인 항체) 서열을 KpnI 및 SanDI으로 연속 절단(25㎕)하여, 제한효소 절단 맵, 도 4에 표시되어 있는 바와 같이 대부분의 FR2 및 CDR2를 적출하였다. 이어, 벡터를 겔에서 정제하여, 적출된 야생형 FR2 및 CDR2 서열을 취하였다.
올리고 쌍(도 3에 나타낸 각각 500 pmol)을 5분간 95 ℃, 그리고 65 ℃에서 5분간 인큐베이션한 다음, 핫 블럭 상에서 온도를 서서히 실온이 되게 두어, 올리고 어닐링을 수행하였다. 클레나우 반응을 dNTP 존재하에 수행하는 동안에 중첩이 채워졌다. 표준 방법을 이용하여, 합성한 이중가닥 DNA(올리고 어닐링 및 말단 충진(filling)를 어셉터 가변부 서열에 분자 클로닝하였다.
친화성 성숙
서열번호 7의 서열에서 하나의 아미노산 잔기에 변화를 준 14개의 각각의 라이브러리를 구축함으로써, 마모셋 CR-그래프트된 dAb 화합물 145(서열번호 7)의 친화성 성숙을 수행하였다. 선정한 잔기는 하기에 음영으로 나타낸다.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR
선정은 성숙형 인간 Ig 레퍼토리에 변화를 주는 것으로 알려져 있는 CDR1 및 CDR3의 잔기와, 관련 dAb에 돌연변이를 유발한 후 기능적 단백질을 생산하는 것으로 관찰된 프레임워크 잔기를 기초로 하였다. 선정된 잔기 각각에서, 상보적인 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 쌍을 NKK 축중(degeneracy)이 있도록 설계하고, 2번의 초기 PCR 반응을 각각 단일 돌연변이성 프라이머 및 측면 프라이머로 수행하였다. 완료한 후, 2가지 PCR 산물을 어닐링시키고, 측면 프라이머만 이용하여 증폭시켰다(PCR의 중첩 연장에 의한 스플라이싱; Lowman H. L. & Clackson T. (eds), Phage Display: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK). 클론은 먼저 고상 TNF를 이용한 ELIZA에 의해 스크리닝하고, 양성 클론을 서열분석하였다. dAb 단백질은 최상의 클론들로부터 정제하고, 수용체 결합 분석 및 L929 세포독성 분석에서 효능을 평가하였다. 화합물 100(서열번호 9) 및 123(서열번호 8)이 모 dAb, 화합물 145(서열번호 7)에 비해 향상된 TNF-중화력을 가진 것으로 확인되었다.
화합물 100 및 123의 친화성-강화 치환(affinity-enhancing substitution)을 조합 실시하여, L929 세포독성 분석에서 더욱 향상된 효능을 가진 항-TNF dAb(화합물 196; 서열번호 10)를 수득하였다.
세포 배양
CHOK1의 현탁 변이체인 CHOK1SV 세포(Lonza Biologies, UK)를 6 mM L-글루타민이 첨가된 CD CHO 배지(Invitrogen CaI Nos. 10743-029 및 25030-081)에서 대수 배양기로 유지시켰다. 배양물은 36.5℃, 10% CO2에서 140 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하였다. 형질전환하기 24시간 전에 세포 수와 생활성을, 적혈구 측정기(hemocytometer)에서 트립판 블루 배제(trypan blue exclusion)(Sigma Cat No. T8154)로 분석하였다. 살아있는 세포 8 x 106개를 5분간 200 xg로 펠렛화하여, 열에 의해 불활성하고 투석한 10% 소태아 혈청(Invitrogcn Cat No. 26400-044)과 6 mM의 L-글루타민이 첨가된 CM25 배지(Lonza Biologies, UK) 8 ml에 재현탁하였다. 세포를 24웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕씩 접종하여, 36.5℃, 10% CO2에서 인큐베이션하였다.
형질전환하기 3시간 전에, 배지를 열에 의해 불활성하고 투석한 10% 소태아 혈청과 6 mM의 L-글루타민이 첨가된 CM25 배지 500 ㎕로 교체하였다.
발현 벡터
화합물 112(서열번호 50) 및 화합물 170(서열번호 51)의 유전자 서열을, 포유류 세포 발현에 맞게 최적화하여, 합성하였다.
화합물 112
Figure 112008062085610-PCT00017
(서열번호 50)
화합물 170
Figure 112008062085610-PCT00018
(서열번호 51)
각 서열을 HindIII 부위, Kozak 서열(GCCACC; 서열번호 57) 및 인간 IgG 카파 리더 서열(아미노산 서열 MSVPTQVLGLLLLWLTDARC; 서열번호 58)을 5' 말단에 측면으로 위치시켰다. 3' 말단에 정지 코돈 2개와 EcoRI 부위를 각 서열에 추가하였다. 이후, 합성 유전자를 pCRScript 벡터(Stratagene)에 클로닝하고, 적합한 제한효소 완충액(각각 Roche Diagnostics Cat Nos. 10656313001, 10703737001 및 11417967001 ) 중에 HindIII/EcoRI에 의해 절단하여 분리시켰다. GS 발현 벡터 pEE12.4(Lonza Biologies, UK)도 동일하게 절단하고, 소의 장내 알칼리 포스파타제(Roche Diagnostics Cat No. 10713023001)를 이용하여 탈인산화하였다. 각 유전자를 준비한 pEE12.4 벡본에 Promega (Cat No. M8221) 사의 LigaFast 신속 DNA 라 이게이션 시스템을 이용하여 삽입하였다. 이후 삽입 산물을 One Shot Top 10 화학적인 컴피턴프 세포(Invlrogen Cat No. C4040-03)에 형질전환하고, 표준 기법에 의해 양성 콜로니를 동정하였다. 제조된 벡터(pEE12.4-PNO621 및 pEE12.4-PNO521-S114C) 다량을 QlAfilter 미디프랩 컬럼(QIAgcn Cat No. 12243)을 이용하여 밤새 배양한 배양물의 미디프랩에 의해 준비하였다. 3 M 소듐 아세테이트(pH 5.2) (각각 Sigma Cat No. B7023 및 S2889) 1/10 부피량을 이용하여, 100% 에탄올 중에 20 ㎕을 침강시켜, 형질전환용 벡터를 준비하였다. 70% 에탄올로 헹군 다음, 벡터를 0.5 ㎍/㎕의 작업 농도로 T.E. pH 8,0 (Sigma Cat No. T9285) 40 ㎕에 재현탁하였다.
형질전환
각 형질전환을 위해, 리포펙타민 2000 2 ㎕을 96웰 플레이트의 웰에 있는 50 ㎕의 Optimem I 배지(In vitrogen Cat Nos. 11668-027 및 31985-062)에 첨가하였다. 2번째 웰에, 4.6 ㎕의 발현 벡터(0.8 ㎕)를 50 ㎕의 Optimem I 백지에 첨가하였다. 실온에서 5분간 인큐베이션한 다음, 웰 2개의 내용물을 서로 혼합하고 20분간 인큐베이션하였다. 2번째 인큐베이션 후에, 전체 형질전환 혼합물을 CHOK1SV 세포가 있는 24웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 세포를 72시간 이상 인큐베이션하고, 상층액을 회수하였다. 상층액을 5분간 4,000 xg로 원심분리하여, 세포 파편물을 펠렛화하고, 화합물 112(서열번호 59) 및 화합물 170(서열번호 11)의 발현을 TNF ELISA로 분석할때까지 -20 ℃에 보관하였다.
화합물 112
Figure 112008062085610-PCT00019
(서열번호 59)
TNF ELISA
마이크로타이터 플레이트(예, Sarstedt 82.9923-148)를 카보네이트/바이카보네이트 코팅 완충제 pH 9.6, 100 ㎕/웰 중에서, 인간 재조합 TNF-α(Peprotech Cat # 300-01 A) 용액 1 ㎍/ml로 코팅하였다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 플레이트를 0.05% 트윈 20이 첨가된 PBS(0.01 M, pH 7.2)로 3번 헹구고, PBS로 3번 헹구었다. 200 ㎕ 블록킹 완충제(1% BSA(소 혈청 알부민[Sigma Cat # A-9647}이 첨가된 PBS)를 각 웰에 첨가하여, 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기와 같이 헹구고, 샘플 또는 항체 희석제(1% BSA 및 0.05% 트윈 20이 첨가된 PBS)에 희석한 화합물 170 100 ㎕을 각 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 25 ℃에서 인큐베이션한 다음, 플레이트를 상기와 같이 헹구고, 2차 항체(페록시다제-접합된 염소 항-인간 면역글로불린, Zymed, Cat # 81-7120)를 항체 희석제 중의 1:1000 희석으로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 헹구고, 100 ㎕의 ABTS 기질(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈-티아졸린-6-설폰산)디암모늄염, Sigma Cat # A-1888, 0.03% H2O2가 첨가된 시트레이트 완충액 pH 4.4 중의 0.5 mg/mL)을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 30분간 기질을 발색시킨 다음, 405 nm(기준 620 nm)에서 흡광도를 판독하였다. 샘플 농도를 표준 곡선으로 결정하고, 발현된 화합물 112의 평균 농도에 상대적으로 표시하였다.
결과
절단형 C H 1 의 함유
절단형 CH1의 도메인 항체 구조체내의 포함으로 인해, 가변성 도메인과 힌지 사이에 정션이 생기며, 절단형 CH1이 없는 정션(83.3%; 벡터 NTI(Invitrogen) 상의 갭 오프닝 패널티 1에서의 Align X)에 비해 기존 IgG1 CH1-힌지 정션(91.7%)에 더 높은 상보성을 가진다. 증강된 상보성은 인간 환자가 면역학적으로 허용적인, 다라서 면역원성 가능성이 감소된, 기존의 면역글로불린 펩타이드 서열에 대해 증가된 유사성을 나타낼 것이 틀림없다.
서열:
화합물 170 가변부-절단형 CH1-힌지 정션: TKVELKRVEPKS
IgG1 CH1-힌지 정션(NCBI accession AAG00909): TKVDKRVEPKS
화합물 170 가변부-힌지 정션(절단형 CH1 없음): TKVEIKREPKS
CH1 서열을 음영으로 표시하였다.
NCBI 단백질 데이타베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) AAG00909에서 수득한 CH1 도메인(서열번호 60):
1 stkgpsvfpl apsskstsgg taalgclvkd yfpepvtvsw nsgaltsgvh tfpavlqssg
61 lyslssvvtv pssslgtqty icnvnhkpsn tkvdkrvepk scdkthtcpp cpapellggp
121 svflfppkpk dtlmisrtpe vtcvvvdvsh edpevkfnwy vdgvevhnak tkpreeqyns
181 tyrvvsvltv lhqdwlngke ykckvsnkal papiektisk akgqprepqv ytlppsreem
241 tknqvsltcl vkgfypsdia vewesngqpe nnykttppvl dsdgsfflys kltvdksrwq
301 qgnvfscsvm healhnhytq kslslspgk
CH1-힌지 정션은 밑줄로 표시하였다.
TNF-α -유도성 세포독성의 중화
도메인 항체 구조체 화합물 170(서열번호 11)이 TNF-α-매개 세포독성을 중화하는 능력을 뮤라인 L929 세포 생활성 분석을 이용하여 분석하였다. 10% 소 태아 혈청이 첨가된 RPMI 배지(RPMI-FBS) 중의 화합물 170 연속 희석물을 바닥이 평편한 96웰 플레이트에 50 ㎕로 준비하였다. 이들 각 웰에 50 ㎕의 재조합 인간 TNF-α(Strathmann Biotec, Hamburg, Germany)를 360 pg/mL로 첨가한 다음, 40 ㎍/mL로 액티노마이신 D 50 ㎕ 및 25 ㎕ 중에 2.5 x 1O4 L929 세포를 넣었고, 이들 모두 RPMI-FBS 중에 준비하였다. 대조군은 TNF(100% 생활성 검출용)와 세포(0% 생활성)가 무첨가되며, TNF-α 표준 곡선은 2 pg/mL - 4200 pg/mL 범위이다. 배양 플레이트를 5% 이산화탄소 대기, 37 ℃에서 20시간 인큐베이션한 다음, 25 ㎕의 3- (4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS)/펜아진 에토설페이트(PES)(Promega CellTiter 96 AQueous One, Madison USA)를 첨가한 후 3시간 더 인큐베이션하였다. 기준 파장 630 nm에 대해 492 nm에서의 흡광도를 검정하고, 3배수 테스트 웰로부터 계산한 평균값을 이용하여 생활성 곡선을 그렸다. 화합물 170의 TNF-α-중화력은, 화합물 170의 농도 증가에 따른 세포 생활성 증가로 나타났다(도 6).
인간 p55 및 p75 TNF 수용체에 TNF-α 결합성의 중화
도메인 항체 구조체 화합물 170(서열번호 11)이 인간 p55 및 p75 TNF 수용체에 TNF-α 결합을 저해하는 능력을, 수용체 결합 분석에 의해 평가하였다. 인간 p55(RnD systems, Cat No; 372-R1) 또는 p75(R.1D systems, Cat No: 762- R2)를, 밤새 4 ℃에서 인큐베이션하여, 카보네이트 코딩 완충액 pH 9.2 중에 0.1 ㎍/mL로 Maxisorb 플레이트(Nunc) 상에 코딩하였다 100 ㎍/mL에서 3.15 ng/mL로 화합물 170의 연속 절반-로그 희석(및 화합물 170이 없는 '블랭크' 대조군)을 항체 희석액(PBS pH 7.2, 0.05% Tween-20, 1 % BSA) 중에 준비하고, 항제 희석액 중의 동량의 인간 TNF-α 60 ng/mL와 혼합하였다. PN0621과 TNF-α가 함유되지 않은 블랭크도 준비하여 백그라운드 결합을 측정하였다. 모든 혼합물은 실온에서 서서히 혼합하면서 정확하게 1시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션하는 동안, 코팅된 플레이트를 PBS, 0.05% Tween-20으로 3번 헹구고, 다시 PBS로 3회 헹구었다. 이후, 플레이트는 200 ㎕/웰의 PBS, 1 % BSA로 실온에서 45분간 블록킹하였다. 플레이트를 헹군 후, 화합물 170 및 TNF-α 혼합물 100 ㎕를 테스트하는 화합물 170의 각각의 농 도 당 삼배수의 웰에 넣고, 모든 대조군에도 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 헹군 다음, 바이오틴화한 항-인간 TNF-α 항체(RnD Systems, Cat No: BAF210)를 항체 희석액 중에 0.6 ㎍/mL로 각 웰에 첨가하여, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이를 헹군 다음, 스트렙타비딘-HRP 접합체(Zymed, Cat No: 43-4323)을 항체 희석액 중에 1:2000로 첨가하여 45분간 실온에서 인큐베이션하였다. TMB 기질(Invitragen, Cat No: 00-2023)을 이용한 가시화를 수행하고, 4분 후 1 M HCl로 정지시켰다. 620 nm 기준 파장을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 분석을 삼배수의 평균 흡광도를 계산하여 수행하였다. 비-특이적 결합(TNF-α 무 함유)의 평균을 각 흡광값에서 제하였다.
상기 결과는 도 7에 나타내었으며, 이는 화합물 170이 TNF-α와 인간 p55 또는 p75 TNF 수용체와의 상호작용을 방지함을 나타낸다.
세포 결합된 TNF-α 의 결합성
세포에 결합된(트랜스멤브레인) TNF-α에 대한 결합성 분석을, TNF-α를 절단할 수 없어 세포막에 조합된 상태로 남게 되는, TACE 절단부가 없는 인간 TNF-α 단백질을 코딩하는 유전자로 안정적으로 형질전환된, NSO 세포주인 27D4를 이용하여 수행하였다. 다른 뮤라인 골수종(SP2/0)를 근간으로한 유사한 세포주가 개시되어 있다(Scallon et al., (1995) Cytokine 7 251-259).
샘플당 5 x 105개의 살아있는 27D4 세포에 대해 유세포 분석을 수행하였으며, 모든 단계는 4 ℃ 또는 얼음위에서 수행하였다. 세포 펠렛을, 2% FBS를 포함 하고 있는 PBS 중의 테스트(화합물 170; 서열번호 11) 또는 무관련-특이성 이소타입-매칭 대조군(Sigma, Cat No: 15154) 100 ㎍/mL에 재현탁하여, 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 1000 xg에서 10분간 원심분리한 다음 PBS/2% FBS에 세포 펠렛을 현탁하는 과정을 2회로 세포 헹굼 과정을 수행하였다. 2번째 원심분리 단계 후, 세포 펠렛은 100 ㎕의 이차항체 접합체(항-인간 Fc FITC 접합체, Sigma, Cat. No: F9512)에 재현탁하고, 30분간 인큐베이션하였다. 이후, 전술한 바와 같이 샘플을 2회 헹군 다음, 세포 펠렛을 500 ㎕의 PBS/2% FBS 및 5 ㎍/mL 프로피듐 요오드화물(Sigma, Cat no: P4864)에 재현탁하였다. 세포의 형광 염색을 Beckman Coulter Cell Lab Quanta 유세포 측정기로 분석하고, 데이타를 WinMDI을 이용하여 처리하였다.
그 결과는 도 8에 나타내었으며, 트랜스멤브레인 TNF-α-발현성 NSO 27D4 세포의 화합물 170 염색(검정으로 칠해진 선)이 무관련-특이성 이소타입-매칭 대조군(회색 칠해진 부분) 보다 형광 강도가 더 높음을 나타낸다.
화합물 170- 고발현성 세포주의 제조
화합물 170(서열번호 11)을 발현하는 CHOK1SV의 안정적인 세포주를, 배료 및 방법에 언급한 발현 벡터를 이용하여 제조하였다. 간단하게는, 대수 성장기의 1 x 107 세포를 선형화된 플라스미드 DNA 40 ug 존재하에 글루타민-free CDCHO 단백질-free 배지 중에서 전기충격을 가하였다. 형질전환 24시간 후, 50 uM 메티오닌 설폭시민(Sigma)의 선별압을 적용하고, 내성인 세포를 96웰 플레이트에서 콜로니를 형성하도록 두었다. 컴플루언스에 이르렀을 때, 하나의 콜로니를 24웰 플레이트, T25 및 T75에 차례로 옮겼다. T75 플라스크에서 컨플루언트가 되면, 세포주를 E125 에를렌메이어 플라스크에서 배양하여, 6회의 서브배양에 거쳐 현탁 배양에 적응시켰다. 현탁 배양에 적응되면, 세포주를 92.5% CDCHO 배지 : 7.5% DMSO의 동결 혼합물로 냉동보존하였다.
세포주를 여러가지 웰과 플라스크 크기를 통해 증폭시키면서, 세포주의 다음 단계로의 진행과 병행하여 생산성 평가를 수행하였다. 따라서, 24웰 플레이트와 E125 에를렌메이어 플라스크 단계에서의 생산성 평가를 수행하였다. 각 경우에서, 세포를 14일간 배양하고, 상층액을 실시예 1에 언급된 TNF ELISA 방법에 의해 화합물 170의 수준을 평가하였다. 세포주를 생산성에 따라 등급화하고, Lonza Biologies사의 피드-배치 생산성 평가(proprietary fed-batch productivity assessment)로 평가하기 위해 최고 높은 10개를 선별하였다. 수득되는 생산성은 700 mg/L 내지 3371 mg/L이었다. 10 L 실험 규모의 발효기에서 실험하기 위한 것으로, 생산성이 2724 mg/L인 리드 세포주를 선택하였다.
리드 세포주와 단백질-free CDCHO 배지를 이용한 프로프라이어터리 제네릭 피드 배치 프로세스(proprietary generic fed batch process)로, 각 4개의 10 L의 실험실 규모의 발효기를 15일간 운용하였다. 4개의 발효기에서 수득되는 평균 생산성은 4851 mg/L이었으며, 최대 생산성은 4925 mg/L이었다(비-클론 세포의 15일 발현에 대해 기존에 Lonza Biologies 사가 보고한 최대 생산성은 3560 mg/L이었음). 사용된 10 L의 실험실 규모의 발효기는, 최대 2000 L까지의 보다 큰 규모의 발효기에서 나타나는 발현 조건을 모방하도록 설계되어, 리드 세포주는 상업적인 규 모로의 제조에 적합할 것으로 예상된다. 실제, 유사한 발현 수준이 200 L 발효기에서 관찰되었다.
화합물 170(서열번호 70)을 발현하는 리드 세포주의 4 x 10 L 발효로부터 수확한 산물을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 환원 및 비환원 조건하에서 SDS PAGE에 의해 분석하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 화합물 170은 약 90 kDa의 단량체로서 발현되었다. 이 단량체는 SDS PAGE를 환원성 조건에서 수행한 도 12에서 나타난, 약 40 kDa의 서브유닛 2개로 이루어져 있다. SDS PAGE는 단백질의 정확한 크기를 파악하는데 적합하지 않으므로, 화합물 170 단량체에 대한 추가적인 분석을 수행하였다. ESI-MS(electronspray ionisation mass spectrometry)에 의해, 화합물 170 단량체가 78.739 kDa인 것으로 측정되었다. 이는, 각각이 바이-안테너 코어 푸코실화된 글리칸 당 구조(bi-antennary core fucosylated glycan sugar strcuture)를 또한 가지고 있는, 서브유닛 2개의 예상 분자량(2 x 38.058 = 76.116 kDa)과 일치한다.
인간 이외의 영장류에서의 긴 혈청 반감기
화합물 170(서열번호 11)을 시노몰구스 원숭이에게 0.5, 5 및 50 mg/kg으로 피하 투여하고, 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 24 시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 10일 및 14일째에 혈액 샘플을 취하였다. 화합물 170 농도의 정량하기 위한 이들 샘플의 분석을 실시예 1에 언급된 항-TNF ELISA 방법으로 실시하였다. 이들 샘플에서 화합물 170 농도를 분석함으로써, 소거 반감기를 결정하였다. 0.5 mg/Kg에서, 소거 반감기는 110.5 + 13.9 시간으로 계산되었다. 5 mg/Kg 및 50 mg/Kg에서 의 소거 반감기는 각각 110.9 + 10.4 및 103.5 + 11.5 시간으로 계산되었다.
화합물 170을 정맥내 경로로 50 mg/Kg을 투여하였을 때, 혈액 샘플을 10분, 30분, 60분, 4시간, 24시간, 2일, 4일, 7일, 10일 및 14일째에 취하였다. 이들 샘플에서 화합물 170의 농도 정량을 실시예 1에 언급된 항-TNF ELISA 방법으로 수행하였다. 이들 샘플에서 화합물 170의 농도를 분석함으로써, 소거 반감기를 결정하였다. 50 mg/Kg으로 정맥내 투여한 후, 소거 반감기는 109.6 + 10.7 시간으로 계산되었다.
우호적인 안전성 프로파일( Favorable Safety Profile )
GMP 규정에 따라 제조한 화합물 170(서열번호 11)에 대한 동물 안정성 및 독성 실험을 수행하였다.
단회 투여 안전성
화합물 170을 0.5, 5 및 50 mg/kg으로 여러가지 원숭이에게 피하 또는 정맥내 투여 경로로 1회 투여하였을 때, 화합물 170 처리와 관련있는 영향은 나타나지 않았다. 이러한 실험에서, 다양한 장기를 현미경 검사하였지만, 영향력은 관찰되지 않았다.
투여량 증가 및 반복 투약시의 안전성
1회 투여량을 0.5 mg/kg에서 시작하여 최대 50 mg/kg으로 증가시키면서 시노몰구스 원숭이에게 7일마다 피하 또는 정맥내로 투여하였다. 동물을 다양한 범위의 생리적 및 행태적 파라미터, 예컨대 혈액학, 임삭 화학, 체중, 장기 무게 및 부검 후 육안 검시 등으로 평가하였다. 이러한 조사들에서 화합물 170 처리와 관련 된 부작용은 나타나지 않았다. 투여량 증가 단계 실험을 종결한 후, 피하를 통해 투여량을 증가시키면서 투여한 이들 동물에게, 4주간 더 50 mg/kg의 투여량을 4번 더 투여하였다. 다양한 파라미터에서 화합물 170 처리와 관련있는 효과는 관찰되지 않았다.
심혈관 안전성
화합물 170 50 mg/kg의 심혈관 안전성을 방사성-텔레미터 모니터가 장착된 시노몰구스 원숭이에서 조사하였다. 상기 모니터는 의식있는 원숭이로부터 직접 호흡 및 심혈관 파라미터를 기록한다. 화합물 170을 투여한 후, 처리와 관련있는 임상적인 나쁜 결과는 나타나지 않았다.
박테리아 발현
전술한 실시예에서 화합물 170(서열번호 11)은 포유류 발현 시스템에서 생산되었다. 또한, 기능적인 화합물 170을 박테리아 발현 시스템을 이용하여 생산하였다.
신호 서열이 없는 화합물 170의 아미노산 서열을 역-번역하고, E. coli 발현용으로 GeneQptimizer™으로 최적화한 다음, GeneArt GmbH 사에서 신규 합성하였다. 합성한 유전자를 pBAD gIII/His-테깅 발현 벡터(Invitrogen)에 NcoI 및 HindIII 제한효소 부위(Roche)를 통해 서브클로닝하여, 박테리아 발현용 벡터를 만들었다. 이 벡터를 열 충격 방법에 의해 TOP10 세포(Invitrogen)에 형질전환시키고, 하나의 콜로니로 글리세롤 스톡을 만들었다. 유도 조건은 0.002% 아라비노스(Sigma; 최종 농도)이고, 유도 기간은 4시간이다. pBAD 박테리아 발현 시스템 매뉴얼(Invitrogen)에 상세하게 기재된 바와 같이, 삼투압 충격 방법으로 화합물 170 단백질 샘플을 제조하였다. BCA 분석(Pierce)을 이용하여, 샘플의 총 단백질 농도를 결정하였다. 박테리아에서 발현된 화합물 170을, 실시예 1에 언급된 ELISA로 TNF-α 결합성에 대해 조사하였다.
도 9는, 박테리아 시스템에서 생산된 화합물 170이 ELISA 분석에서 TNF-α 결합성을 유지하고 있음을 나타낸 것이다.
화합물 170의 박테리아 발현용 DNA 서열은 다음과 같다:
(서열번호 61)
서열번호 61에 의해 코딩된 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure 112008062085610-PCT00021
(서열번호 62)
인간 TNF-α-매개 뮤라인 관절염 모델에서의 화합물 170의 생체내 효능
인간 TNF 형질전환 마우스 주인 Tg197은 탈조절된 TNF 발현을 보이며, 만성 염증성 다발성 관절염(Keffer, J. et. al. (1991) Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO Journal 10:4025-31)으로 발전된다. 화합물 170(서열번호 11) 투여시 이들 마우스에서의 관절염 발생과 이와 관련된 체중 감소가 방지되었다(도 10A & B). 8 마리의 이형접합체 Tg197(각각 수컷 4마리와 암컷 4마리를 포함함)로 구성된 그룹에, 화합물 170 및 무관련 특이성 대조군 인간 IgG1(palivizumab (Synagis®), MedImmune/Abbott)을 PBS 중에 10 mg/kg으로 매주 2번씩 복막내 주사하였다. 처리는 마우스가 3주령이 되었을 때 개시하였다. 주 간격으로, 마우스의 체중을 재고, 육안으로 발목 형태(부기, 염좌 및 운동성 정도)에 따라 점수(관절염 점수)를 매겼다.
화합물 112에서 114번 위치에서의 Cys 의 치환으로 단백질 발현이 증가된다
화합물 112(서열번호 59)는 화합물 170에서 114번 위치의 세린 잔기 대신 시스테인 잔기가 있는, 화합물 170(서열번호 11)의 변형체이다. 단백질 발현에 있어 세린의 시스테인 114으로의 치환 효과를, 화합물 170과 비교 평가하였다. 화합물 112 및 170에 대한 유전자 구조체로 형질전환된 숙주 세포 다수 배양물들을 재료 및 방법에 기재된 고상 TNF를 이용한 ELISA로 분석하였다. 그 결과는 도 11에 나타낸다.
당업자는, 구체적인 구현예에서 나타낸 바와 같이 본 발명은 넓게 기재된 본 발명의 사상 또는 범위를 이탈하지 않으면서 여러가지 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 구현예들은 모든 측면에서 한정적이 아닌 예시적인 적으로 간주되어야 한다.
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Claims (60)

  1. 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체로서,
    (a) 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체(dAb);
    (b) 변형된 힌지 영역의 서열; 및
    (c) 잔기 20개 이하로 구성된, 절단형(truncated) CH1 도메인을 갖는 인간 또는 영장류의 중쇄 불변부 서열을 포함하며,
    상기 변형된 힌지 영역의 서열이 항체의 중쇄와 경쇄 간에 이황화 결합의 형성을 정상적으로 조장하는 하나 이상의 시스테인 잔기의 결손 또는 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 도메인 항체 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 절단형 CH1 도메인을 갖는 인간 또는 영장류의 중쇄 불변부 서열이 10개 이하의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 절단형 CH1 도메인을 갖는 인간 또는 영장류의 중쇄 불변부 서열이 5개 이하의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 절단형 CH1 도메인을 갖는 인간 또는 영장류의 중쇄 불변부 서열이 1개 이하의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 CH1 도메인과 힌지 영역의 서열이 XEPKSZDKTHTCPPCPA(서열번호 64)이고, X는 발린, 루신 또는 이소루신이고, Z는 생략되거나 시스테인을 제외한 다른 아미노산인 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  6. 제5항에 있어서, X가 발린이고, Z가 세린인 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 dAb가 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변성 도메인을 포함하고,
    상기 가변성 도메인이 신세계 영장류로부터 유래된 서열을 갖는 하나 이상의 상보성 결정부(CDR)를 포함하며,
    상기 CDR이 YAATKLQS(서열번호 1), YEASSLQS(서열번호 2), YEASKLQS(서열번호 3) 및 YSASNLET(서열번호 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CDR이 CDR2인 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 도메인 항체가 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체:
    Figure 112008062085610-PCT00049
    (서열번호 7)
    Figure 112008062085610-PCT00050
    (서열번호 8)
    Figure 112008062085610-PCT00051
    (서열번호 9)
    Figure 112008062085610-PCT00052
    (서열번호 10)
    Figure 112008062085610-PCT00053
    (서열번호 52)
    Figure 112008062085610-PCT00054
    (서열번호 53)
    Figure 112008062085610-PCT00055
    (서열번호 54); 및
    이들 서열들 중 어느 하나와 95% 이상 동일한 서열.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 항체의 중쇄와 경쇄 간에 이황화 결합의 형성을 정상적으로 조장하는 힌지 영역내 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 힌지 영역이 서열 EPKSSDKTHTCPPCPA(서열번호 12)를 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 불변부 영역이 서열번호 63에 기재된 서열과 60% 이상 동일한 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 도메인이 서열번호 63에 기재된 서열과 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 도메인이 서열번호 63에 기재된 서열과 90% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 도메인이 서열번호 63에 기재된 서열과 95% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 도메인이 서열번호 63에 기재된 서열과 96% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 도메인이 서열번호 63에 기재된 서열과 97% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 도메인이 서열번호 63에 기재된 서열과 98% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 CH2 및 CH3 도메인이 서열번호 63에 기재된 서열과 99% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서, CDR1, CDR3 또는 하나 이상의 프레임워크(framework) 영역이 항원 결합성이 개선되도록 변형된 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 60% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 90% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 95% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 96% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 97% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 98% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 99% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  29. 제28항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 11에 기재된 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서, 상기 도메인 항체가 인간에 대해 낮은 면역원성(immunogenicity)을 보이는 것을 특징으로 하는 도메인 항체 구조체.
  31. 인간 TNF-α에 결합하며, 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 도메인 항 체 구조체 2개로 이루어진, 이량체성 도메인 항체 구조체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 이량체성 도메인 항체 구조체가 동형이량체인 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  36. 제35항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  37. 제36항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 96% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 97% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  40. 제39항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  41. 제40항에 있어서, 상기 동형이량체를 이루는 도메인 항체가 서열번호 11에 기재된 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이량체성 도메인 항체 구조체.
  42. 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 도메인 항체 구조체를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  43. 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자로서,
    상기 핵산 서열이 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체를 코딩하며, 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 60% 이상 동일한 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  44. 제43항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  45. 제44항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 90% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  46. 제45항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 95% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  47. 제46항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 96% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  48. 제47항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 97% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  49. 제48항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 98% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  50. 제49항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 99% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  51. 제50항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  52. 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자로서,
    상기 핵산 서열이 인간 TNF-α에 결합하는 도메인 항체 구조체를 코딩하며, 서열번호 50 또는 51에 기재된 서열과 고엄격 조건하에서 혼성화하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  53. 제1항 내지 제30항 중 어느 한항에 따른 유효량의 도메인 항체 구조체 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
  54. 제31항 내지 제41항 중 어느 한항에 따른 유효량의 이량체성 도메인 항체 구조체 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
  55. 샘플을 제1항 내지 제41항 중 어느 한항에 따른 유효량의 도메인 항체 구조체와 접촉시키는 단계, 및 결합된 도메인 항체 구조체의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 인간 TNF-α를 검출하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 샘플이 생체 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 개체에게 제55항 또는 제56항에 따른 제약학적 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 개체에서 인간 TNF-α 활성이 특징인 장애를 치료하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 인간 TNF-α 활성이 특징인 장애는 염증; 염증성 질환; 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 그람 음성 패혈증 및 독성 쇼크 증후군과 같은 패혈증; 류마티스 관절염, 소아 관절염, 류마티스 척추염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 골관절염, 통풍성 관절염(gouty arthritis), 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역성 당뇨병, 자가면역성 포도막염, 건선, 유천포창(pemphigoid) 및 신장 증후군과 같은 자가면역 질환; 황반 변성, 포도막염, 베체트병 등의 눈의 염증 증상; 감 염으로 인한 열 및 근통과 감염에 이차적인 악액질과 같은 감염성 질환; 이식 편대 숙주 질환; 종양 증식 또는 전이, 혈액 종양; 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 쇼크 폐, 만성 폐 염증성 질환, 폐의 유육종증, 폐 섬유증 및 규폐증과 같은 폐 장애; 크론 질환 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 장애; 심장 장애, 울혈성 심장 기능 부전; 베그너 질환, 거대세포 동맥염과 같은 혈관 장애; 염증성 골 장애, 알츠하이머 질환과 같은 중추 신경계 장애; 좌골 신경통과 같은 말초 신경계 장애; 간염; 응고 장애(coagulation disturbance); 화상; 재관류 손상; 자궁내막증; 켈로이드 형성; 및 반흔 조직 형성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 인간 TNF-α 활성이 특징인 장애는 신생혈관-관련 눈 장애인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 신생혈관-관련 눈 장애는 노인성 황반 변성인 것을 특징으로 하는 방법.
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