JP2016520595A - 抗ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ１０二重ターゲット抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＩｇＧフォーマット基盤のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体に関し、具体的に、ＣＸＣＬ１０特異的抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するｓｃＦｖをＴＮＦ−α特異的抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端に結合された形態の抗体は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０の両方に効果的に結合する二重特異性抗体であることを確認することによって、上記抗体は、ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ１０を認識することができる二重ターゲット抗体として有用に使用されることができる。本発明の組成物は、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）及びＣＸＣＬ１０（Ｃ−Ｘ−Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １０）の両方に効果的に結合するＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体を含む。本発明の二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０単一ターゲット抗体と比べて優れたＴＮＦ−α抑制能及び破骨細胞分化抑制能を有する。本発明の組成物は、免疫疾患の予防または治療に利用されることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）及びＣＸＣＬ１０（Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １０）に特異的に結合するＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体及びその用途に関する。

（関連特許出願）
本特許出願は、２０１３年５月２２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１３−００５７４７５号及び第１０−２０１３−００５７７６２号に対して優先権を主張し、上記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。

一般的に、抗体は、分子量が大きい重鎖（重鎖）と分子量が小さい軽鎖（軽鎖）のポリペプチドが二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で連結され、離型二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成し、２つの離型二量体がさらに二硫化結合で連結され、４量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を形成する。重鎖を作るポリペプチドは、４個の領域（ｄｏｍａｉｎ）よりなり、Ｎ−末端から可変領域、不変領域１、不変領域２及び不変領域３で構成されており、軽鎖を作るポリペプチドは、２個の領域（ｄｏｍａｉｎ）よりなり、Ｎ−末端から可変領域、不変領域で構成されている。このうち、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域の結合体が１個の抗原と結合する。

細胞を標識する化学的標識因子である抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）とこれに対する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）との反応は、高度の特異性を示す。抗体と相互作用する抗原部位を抗原決定基またはエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）と言い、抗原決定基と抗体の抗原結合部位である可変領域が特異的に結合する。したがって、抗原結合部位は、ただ１個の抗原決定基と結合し得るので、多数の抗体は、それそれ、特定の決定基を有する抗原に対する特有の免疫性を提供することができる。

抗体は、血中での安定性が高くて、抗原性が低いため、医薬品として注目されている。そのうち、２種類の抗原を認識することができる二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）がある。二重特異性抗体は、大きく、２種類に区分することができる。一番目は、再組み換えＤＮＡ技術によって抗体を変形させて、２個の異なる抗原と結合し得る抗原結合部位を有するようにする場合であって、この場合は、１個の結合部位は、或る抗原に対して特異的であり、第２の結合部位は、他の抗原に対して特異的な抗体であって、同時に２個の抗原と結合し得る（Ｂｅｃｋ Ａｅｔ．ａｌ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０；３４５−３５２、２０１０）。二番目の種類の二重特異性抗体は、最近に開発された抗体であり、１個の抗原結合部位を有する正常な抗体であって、２個の異なる抗原と結合し得る能力を有する抗体であり、ツー−イン−ワン（ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ）抗体と呼ぶ（Ｂｏｓｔｒｏｍ、Ｊｅｔ．ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３、１６１０−１６１４、２００９）。このようなツー−イン−ワン抗体は、１個の抗原結合部位を有するため、２個の抗原と結合するよりは、一度に１個の抗原と結合することはできるが、異なる２個の抗原に結合し得る能力を有している抗体である。ツー−イン−ワン抗体は、既存の開発に成功した典型的な抗体の形態を有しているため、開発に非常に有利である。

このような二重特異性抗体は、特定の毒性細胞及び標的細胞に結合して作用することができるので、標的特異性が高い長所を有する。

１９９０年代後半から新たに開発された抗リュウマチ薬剤は、リュウマチ関節炎の病態生理に対する理解が深くなるに伴い、最も標的になる物質を遮断して疾患を調節しようとする標的治療（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）の概念が提示された。結局、特定疾患で標的になる物質を捜し出し、この標的を遮断できる物質をデザインして作り出した（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｒｕｇ）生物学的製剤が開発されて使用されることによって、リュウマチ関節炎の治療において大きい変化をもたらすうになったものである。このような製剤には、代表的に、ＴＮＦ−α遮断剤（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ａｄａｌｉｍｕｍａｂなど）、再組み換えｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１受容体拮抗剤であるａｎａｋｉｎｒａとともに、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ａｂａｔａｃｅｐｔ）、Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）などがあり、実際に臨床に使用されているか、または試験中にある。

ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）に対する研究は、既に１００余年前から腫瘍及び敗血症患者を対象として始まった。ＴＮＦ−αは、マクロファージ、ＢとＴリンパ球を含む免疫細胞と非免疫細胞、及び多様な腫瘍細胞によって生成され、正常な生理的炎症反応と後天性及び先天性免疫に重要な役目を担当している。しかし、リュウマチ関節炎のような炎症性疾患においてＴＮＦ−αが不適切に多く生産される場合、免疫体系の多様な細胞を活性化させて、細胞毒性効果を誘発し、炎症、組織破壊、及び臓器損傷などの反応が現われる。ＴＮＦ−αの主要生物学的作用は、第一に、多様な形態の細胞で成長、分化、代謝を調節し；第二に、脂肪分解を刺激し、脂肪細胞に存在する脂質蛋白脂質分解酵素（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ）活性を抑制し、肝内の脂肪形成（ｈｅｐａｔｉｃ ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）を刺激して悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）を誘発し；及び第三に、細胞自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導する。ＴＮＦ−αは、遊離型（ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）で存在したり、細胞膜に結合された形態（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍ）で存在したりする。２つの形態のＴＮＦ−αは、非常に強く細胞の炎症反応を誘発し、組織内の疾病状態を促進させる。細胞膜に結合されたＴＮＦ−αは、細胞対細胞接触を通じて細胞毒性と炎症効果を示し、ＴＮＦ−α転換酵素（ＴＡＣＥ）によって細胞膜から遊離型で脱離し、細胞の外に存在するようになる。ＴＮＦ−αは、血中で２つの受容体、すなわちＴＮＦ ｔｙｐｅ Ｉ受容体（ｐ５５）またはＴＮＦ ｔｙｐｅ II受容体（ｐ７５）と結合して、生物学的活性を示す。臨床的に見れば、過剰生産されたＴＮＦ−αは、リュウマチ関節炎患者のマクロファージを刺激して炎症反応を増幅させる炎症性媒介物質を生産し、血管内皮細胞で付着分子を発現するようにして、さらに多い炎症細胞を炎症が起きた部位に集めることができ、線維芽細胞が蛋白分解酵素を生産するようにして、軟骨、骨、及び靭帯に損傷を与えて、疾病を悪化させる。

ＴＮＦ−α抑制剤は、１９９８年１１月ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔが米国食品医薬品安全庁からリュウマチ関節炎の治療剤として最初に承認され、商用化されて販売され始めた後、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ及びａｄａｌｉｍｕｍａｂなどが市販されており、既存薬物の効果と副作用を改善した新しい薬物が開発されている。患者個人別に見れば、ＴＮＦ−α抑制剤に対する治療反応は、疾病の活性度とこれに相当する構造的損傷、疾病による生活の質に対する影響、疾病によって発生した症状と徵候が患者個人によって異なるので、多様に現われる。また、薬物に対する感受性、効果の発現様相、または副作用も多様に現われる。多様な種類のＴＮＦ−α抑制剤の間にも、それぞれの構成物質、具体的な作用機作、薬理機作、及び生物学的薬剤学的性質（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）などが異なる。ＴＮＦ−α抑制剤の効能を立証する動物実験には、ヒトＴＮＦ−αトランスゼニック（Ｔｇ）マウスを使用し、Ｔｇ１９７マウスは、４〜５週齢の時期にリュウマチ関節炎と類似な関節炎が発生し、９〜１０週齢から下肢関節の顕著な運動範囲の制限が観察される。

ＣＸＣＬ１０（Ｃ−Ｘ−Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １０）は、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）とも呼ばれ、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）によって誘導される１０ｋＤａのケモカインである。ＣＸＣＬ１０は、走化活性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有し、細胞分裂活性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）にも関与するものと知られている。これは、ＩＦＮ−γに反応して内皮細胞、単核球、線維芽細胞及び角質形成細胞を含めた多様な細胞によって分泌され、また、ヒト皮膚での遅延性過敏反応（ｄｅｌａｙｅｄ ｔｙｐｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、ＤＴＨ）において真皮大食細胞及び内皮細胞に存在するものと明らかにされた。また、元々ＩＦＮ−γによる誘導のみならず、樹枝状細胞でＩＦＮ−αによって誘導されることができ、ＩＦＮ−γ、ウイルス及びリポポリサッカライドのような刺激によって中枢神経系細胞で誘導されることができる。

ＣＸＣＬ１０の受容体は、７個の膜透過性（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）受容体であるＣＸＣＲ３と明なかにされている。ＣＸＣＲ３は、活性化されたＴリンパ球と単球、滑膜細胞、内皮細胞、ＮＫ細胞、好酸球で発現される。ＣＸＣＲ３の２つの異なるリガンドであるＭＩＧ（ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ、ＩＦＮ−γ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＩ−ＴＡＣ（ＩＦＮ−γ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ａｌｐｈａ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ１）も、ＣＸＣＲ３と結合するものと知られている。ＣＸＣＬ１０のＣＸＣＲ３への結合は、活性化されたＴ細胞と活性化されたＮＫ細胞でカルシウム移動（ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）及び走化性を媒介する。胸腺内でＣＸＣＬ１０は、ＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞及びＮＫ−タイプ細胞に対する化学誘引物質（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）であると明らかにされた。

ＣＸＣＬ１０またはその受容体であるＣＸＣＲ３は、多発性硬化症、リュウマチ関節炎、潰よう性大腸炎、肝炎、炎症性筋炎、脊髄損傷、全身性紅斑性ループス、移植拒否、ショグレン症候群を含めた多様な他の炎症性及び自家免疫疾患で同定される。しかし、このようなＣＸＣＬ１０がこのような疾患でｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ以外に炎症反応や免疫反応に具体的にどのように作用するか、治療ターゲットとしてどんな重要性を有するかについては、まだ具体的に知られたところがない。

多数の炎症媒介物質が病因に寄与する自家免疫疾患の治療に単一抗原を標的とする単一クローン抗体治療より、１種類の抗体で多数の標的を中和すれば、より効果的な治療剤として作用することができる。２つの異なる抗体を組み合わせて作った抗体で２つの標的を認知しようとする努力は、既に多数の研究者によって報告されたことがある。最近研究によれば（Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９）、ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（ＨＥＲ２）を認知する抗体の軽鎖ＣＤＲｓを変異させた抗体ライブラリで血管内皮細胞成長である人（ＶＥＧＦ）を同時に中和する抗体をスクリーニングするのに成功した。上記抗体は、１つの疾患の病因に寄与する２つの媒介物質をすべて認知する（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）二重抗体であって、特に、正常ＩｇＧと構造が同一であり、薬物動力学特性が予測可能であり、２価または１価（ｂｉ−ｏｒ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）抗体をすべて作ることができるという長所がある。

本明細書の全体にわたって、多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

本発明者は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に特異的に結合する二重特異的抗体を開発するために努力した結果、ＣＸＣＬ１０特異的抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するｓｃＦｖをＴＮＦ−α特異的抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端に結合された形態の抗体を製造し、上記抗体は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に二重特異的に結合することを確認し、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に特異的に結合するＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体がＴＮＦ−α抑制能及び破骨細胞分化抑制能を有することを実験的に糾明することによって、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）及びＣＸＣＬ１０（Ｃ−Ｘ−Ｃ ｍｏｔｉｆｃｈｅ ｍｏｋｉｎｅ １０）に特異的に結合するＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体を提供することにある。

本発明の他の目的は、ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体を含む免疫疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明及び請求範囲によってさらに明確になる。

本発明の一様態によれば、本発明は、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）に特異的に結合する第１抗原結合部位と、ＣＸＣＬ１０（Ｃ−Ｘ−Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １０）に特異的に結合する第２抗原結合部位とを含み、
ここで、上記配列番号１のアミノ酸を含む重鎖相補性決定領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈｉａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＣＤＲ）１、配列番号２のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号５のアミノ酸を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈｉａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＬＣＤＲ）１、配列番号６のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備え、
上記第２抗原結合部位は、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２５よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２６よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２３及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号１３、配列番号２９、配列番号３３及び配列番号３７よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４、配列番号３０、配列番号３４及び配列番号３８よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号１５、配列番号３１、配列番号３５及び配列番号３９よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備える、
ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体を提供する。

本発明者は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に特異的に結合する二重特異的抗体を開発するために努力した結果、ＣＸＣＬ１０特異的抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するｓｃＦｖをＴＮＦ−α特異的抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端に結合された形態の抗体を製造し、上記抗体は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に二重特異的に結合することを確認し、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に特異的に結合するＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体がＴＮＦ−α抑制能及び破骨細胞分化抑制能を有することを実験的に糾明した。

本発明で利用される抗体は、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）及びＣＸＣＬ１０（Ｃ−Ｘ−Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １０）に特異的に結合するＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体である。

本発明の一具現例によれば、本発明の抗体は、ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。

本明細書で用語「ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、重鎖及び軽鎖の可変及び不変領域の配列がヒトから由来した抗体を意味し、下記の実施例に記載されたように、本発明者らは、遺伝的再組み換え技術と細胞工学技術を利用してＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲットヒト抗体を製造した。ヒト抗体は、非−ヒト及びキメラ抗体より長所を有する：ヒト抗体のイフェックタ部分は、ヒト免疫系の他の部分とさらに良好に相互作用し（例えば、相補性−依存細胞毒性（ＣＤＣ）または抗体−依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって効率的に標的細胞が破壊される）、ヒト免疫系がヒト抗体を外部物質として認識しないため、このような生体内に流入された抗体に対する免疫反応が、全体外来非−ヒト抗体または部分外来キメラ抗体などに比べて小さい。また、注射された非−ヒト抗体は、ヒト抗体の半減期よりヒト循環系で非常に短い半減期を有することが報告された。反対に、生体内に流入されたヒト抗体は、自然発生ヒト抗体と実質的に同一の半減期を有するので、投与される服用量と回数を低減することができ、一層有用である。

本明細書で用語「可変領域」は、抗原と特異的に結合する機能を行いながら、配列上の多くの変異を示す抗体分子の部分を意味し、可変領域には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。上記ＣＤＲの間には、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）部分が存在し、ＣＤＲ環を支持する役目をする。

本明細書で用語「相補性決定領域」は、抗原の認識に関与する環状の部位であって、この部位の配列が変わることによって、抗体の抗原に対する特異性が決定される。

本明細書で用語「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」は、ファージの外壁（ｃｏａｔ）にｓｃＦｖを発現（ｄｉｓｐｌａｙ）するファージライブラリから、標的分子（抗原、酵素、細胞表面レセプターなど）と結合する性質を有するｓｃＦｖを表面に発現しているファージのみを選別する過程を言う。

具体的に、上記二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−αに特異的に結合する第１抗原結合部位、及びＣＸＣＬ１０に特異的に結合する第２抗原結合部位を含み、
上記第１抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列で構成された重鎖相補性決定領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈｉａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＣＤＲ）１、配列番号２のアミノ酸配列で構成されたＨＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列で構成されたＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、
配列番号５のアミノ酸配列で構成された軽鎖相補性決定領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈｉａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＬＣＤＲ）１、配列番号６のアミノ酸配列で構成されたＬＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列で構成されたＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備え、
上記第２抗原結合部位は、配列番号９、１７、２１及び２５よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０、１８、２２及び２６よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号１１、１９、２３及び２７よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、
配列番号１３、２９、３３及び３７よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４、３０、３４及び３８よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号１５、３１、３５及び３９よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備える軽鎖またはその断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。

また、上記第２抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号１１のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号１３のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号１５のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることができる。

上記第２抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号２９のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号３１のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることができる。

上記第２抗原結合部位は、配列番号２１のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号２３のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号３３のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号３５のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることができる。

上記第２抗原結合部位は、配列番号２５のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号３７のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号３９のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることができる。

上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体の第１抗原結合部位は、配列番号４のアミノ酸を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることが好ましいがこれに限定されない。

上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体の第２抗原結合部位は、配列番号１２、２０、２４及び２８のアミノ酸を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１６、３２、３６及び４０のアミノ酸を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることが好ましいが、これに限定されない。

上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−αに特異的に結合する第１全長抗体の重鎖及び軽鎖と；ＣＸＣＬ１０に特異的に結合する第２抗体の可変断片と；を含み、上記第１全長抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端が連結されていることを特徴とし、具体的にＴＮＦ−αに特異的に結合する第１全長抗体の重鎖及び軽鎖と；及びＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、第２抗体の重鎖領域及び軽鎖領域を含む断片を含み、上記第１全長抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端に第２抗体の断片が連結されていることを含む（図１参照）。

上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体の断片は、単一鎖可変分節（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）であることが好ましいが、これに限定されない。

上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体は、抗体−抗体または抗体−断片間の連結は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結されることが好ましいが、これに限定されない。

本発明の具体的な実施例で、本発明者らは、ヒトＣＸＣＬ１０の遺伝子をクローニングしてＣＸＣＬ１０抗原タンパク質を製造し（図２参照）、これをライブラリファージに反応させて、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合するｓｃＦｖ−ファージを収得し、これを大腸菌に増幅させるパンニング過程を行った。このように３次パンニングを行ったファージのＣＸＣＬ１０に対するコロニー力価が５．６７×１０^８と増幅されることを確認した（表１参照）。

また、本発明者らは、上記結合能が大きい３次パンニングした多クローンファージ抗体群から単一クローンファージ抗体を選別し（図３参照）、そのＥＬＩＳＡ分析を行い、単一クローンファージ抗体をさらに選別した（表２参照）。このように選別した単一クローンファージを分類及び検査するために、フィンガープリンティング及び配列分析を行い（図４参照）、これを通じて、選別された４種類の単一クローン抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ領域のパターン及びポリペプチド配列を確認した（表５及び表６参照）。

また、本発明者らは、上記選別した４種類の単一クローンファージのうち１０Ｅを全体形態のＩｇＧに転換して、重鎖及び軽鎖をそれぞれベクターに挿入し、これを宿主細胞に共同感染させて形質転換体を製造し、これを通じて、全体形態の抗体を製作し、ＣＸＣＬ１０抗原に対する結合親和度を測定した結果、７×１０^−１２Ｍの値を確認することができた（表８参照）。

また、本発明者らは、上記選別された１０Ｅ遺伝子を抗−ＴＮＦ−α単一抗体であるヒュミラのプラスミドにクローニングして、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に二重特異的な抗体であるＨｕＥ１０−１０１を製造した（図１参照）。このように製作された抗体の分子量は、約１８７ｋＤａであることを確認し（図６参照）、ＥＬＩＳＡ分析を通じてＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に対する結合力が以前の先行研究を通じて製造されたＨｕＥ１０−１００と類似な程度であることを確認した（図７参照）。さらに、ＬＡＬ ｔｅｓｔを通じて製造されたＨｕＥ１０−１０１抗体の細胞毒性が０．１ ＥＵ／ｍｌ以下であることを確認した（図８参照）。

また、本発明者らは、上記製造したＨｕＥ１０−１０１のＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０の試験管内の抑制能を評価した。具体的に、ＴＮＦ−α受容基を有するＷＥＨＩ１６４細胞を使用してＨｕＥ１０−１０１抗体がＨｕｍｉｒａに比べて向上した抑制能を有することを確認し（図４１及び図４２参照）、細胞の走化能及び破骨細胞の分化が減少することから、ＣＸＣＬ１０抑制能を有することを確認した（図４３参照）。

したがって、本発明のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ１０二重特異性抗体は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０に同時に強い抗原結合能を有することを確認した。

本発明の他の様態によれば、本発明は、第１抗原結合部位をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び第２抗原結合部位をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが宿主細胞に共同形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）された形質転換体を提供する。

本発明の抗体を暗号化するポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因してまたは上記抗体を発現させようとする生物で選好されるコドンを考慮して、コーディング領域から発現される抗体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形がなされ、コーディング領域を除いた部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変形または修飾がなされ、そのような変形遺伝子も本発明の範囲に含まれることを当業者なら容易に理解することができる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、これと同等な活性を有するタンパク質をコーディングする限り、１つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組合によって変異されることができ、これらも本発明の範囲に含まれる。このようなポリヌクレオチドの配列は、単鎖また二重鎖であることができ、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であることができる。

上記発現ベクターの製作時には、上記抗体を生産しようとする宿主細胞の種類によってプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、終決者（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、インハンサー（ｉｎｈａｎｃｅｒ）などのような発現調節配列、膜標的化または分泌のための配列などを適切に選択し、目的によって多様に組み合わせることができる。

本発明の発現ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。適合な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終決コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサーのような発現調節エレメント以外にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的によって多様に製造されることができる。発現ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であることができる。上記シグナル配列には、宿主がエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）菌の場合には、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌の場合には、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母（ｙｅａｓｔ）の場合には、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列などが、宿主が動物細胞の場合には、インスリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを利用することができるが、これに制限されない。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができ、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。

本発明の他の様態によれば、本発明は、（ａ）上記形質転換体を培養する段階と；２）上記段階で培養された培養液から上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体を精製する段階と；を含むＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ１０二重ターゲット抗体の製造方法を提供する。

本発明による上記発現ベクターを適切な宿主細胞、例えば、大腸菌または酵母細胞などに形質転換させた後、形質転換された宿主細胞を培養することによって、本発明による抗体を大量生産することができる。宿主細胞の種類による適切な培養方法及び培地条件などは、当該分野の通常の技術者に知られた公知技術から当業者が容易に選択することができる。上記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような原核生物であることができる。また、サカロマイセスセルビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞から由来する真核細胞であることができる。さらに好ましくは、上記動物細胞は、自家または同種異系動物細胞であることができる。自家または同種異系動物細胞に導入して製造された形質転換体は、個体に投与されて癌を治療する細胞治療などに利用されることがある。上記宿主細胞への発現ベクター導入方法は、当業者に公知されたいずれの方法を使用してもよい。

本発明の他の様態によれば、本発明は、上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体の薬剤学的有効量と；（ｂ）薬剤学的に許容される担体と；を含む免疫疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−α抑制能及び破骨細胞分化抑制能を示すので、抗体単独または通常の薬剤学的に許容される担体とともに免疫疾患に対する予防及び治療用薬剤学的組成物に使用可能である。

本発明の組成物は、免疫反応によって媒介される組織または器官の移植片拒否（ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）を防止するための免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）として有用に使用されることができる。移植片拒否とは、移植片（移植される生体の一部であって、細胞、組織または臓器）の供与者と受容者間の遺伝的背景が異なっていて、（１）供与者の移植片由来免疫細胞が受容者を外部物質として認識して攻撃することによって誘発される疾患（すなわち、移植片対宿主疾患）と、（２）受容者が供与者の移植片を外部物質として認識して攻撃することによって誘発される疾患（すなわち、移植片拒絶反応）とを含む。拒否反応を起こす移植された組織及び器官の例としては、心臓、腎臓、肝、骨髄（ｍｅｄｕｌｌａ ｏｓｓｉｕｍ）、皮膚、角膜、肺、膵腸、小腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｕｍ ｔｅｎｕｅ）、四肢（ｌｉｍｂ）、筋肉、神経（ｎｅｒｖｕｓ）、十二指腸、小腸（ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ）、インスリンを分泌する膵腸細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ）などだけでなく、骨髄移植によって発生する移植片−対−宿主疾患が挙げられる。

また、本発明の組成物は、自家免疫疾患の治療及び予防にも応用されることができる。
自家免疫疾患というのは、免疫細胞が自分と外部物質を区別せずに、自分を攻撃して発生する疾病を総称する疾患である。自家免疫疾患の例としては、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、Ｅ−高免疫グロブリン血症症候群 （ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ）、橋本甲状腺炎（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、硬皮症（Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、全身性進行性硬皮症（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、第１型糖尿（ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、ぶどう膜炎（ｕｖｅｉｔｉｓ）、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、白斑症（Ｖｉｔｉｌｌｉｇｏ）、グッドパスチャー症候群（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｅｔ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、ぶどう膜炎（Ｕｖｅｉｔｉｓ）、血小板減少性紫斑病（Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、尋常性天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、小児糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、自己免疫溶血性貧血（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ａｎｅｍｉａ）、クリオグロブリン血（Ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、全身性紅斑性狼瘡（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）などがある。

また、本発明の組成物は、炎症性及び過増殖性皮膚疾患及び免疫媒介疾患の皮膚発現の治療及び予防にも使用されることができる。これら疾患は、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹性皮膚炎（ｅｃｚｅｍａｔｏｕｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓｅｓ）、脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｏｅｉｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、扁平苔癬（ｌｉｃｈｅｎ ｐｌａｎｕｓ）、天疱瘡（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）、類天疱瘡（Ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、表皮水疱症（ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ）、じんましん（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、血管性浮腫（ａｎｇｉｏｅｄｅｍａｓ）、血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）、紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａｓ）、皮膚好酸球増加症（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａｓ）、紅斑性狼瘡（Ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、全身性紅斑性狼瘡（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）、痤瘡（ａｃｎｅ）及び円形脱毛症（Ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）を含む。

また、本発明の組成物は、眼疾患（ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）または多様な自家免疫性疾患の治療または予防に使用されることができる。これら疾患の例は、角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、春季結膜炎（ｖｅｒｎａｌ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、角膜炎（ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、ヘルペス性角膜炎（ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、角膜上皮栄養不良（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｓ ｃｏｒｎｅａｅ）、角膜白斑（ｃｏｒｎｅａｌ ｌｅｕｋｏｍａ）、眼天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）、モーレン潰瘍 （Ｍｏｏｒｅｎ’ｓ ｕｌｃｅｒ）、強膜炎（Ｓｃｌｅｒｉｔｉｓ）、グレーブス眼症（Ｇｒａｖｅｓ’ ｏｐｔｈａｌｍｏｐａｔｈｙ）、フォークト・小柳・原田病（Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、類肉腫症（ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、多発性骨髄証（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）を含む。

また、本発明の組成物は、慢性閉塞性呼吸器疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＯＰＤ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）（例えば、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息及びほこり喘息）、特に慢性または固執的喘息（例えば、末期喘息及び気管支過敏性）、気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、アレルギー性鼻炎のような閉塞性気道疾患の治療及び予防にも使用されることができる。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）に詳しく記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時に、タンパク質またはペプチドは、消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されることができる。

本発明の薬剤学的組成物の適合な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常、熟練された医者は、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書で用語「薬剤学的有効量」は、免疫疾患を予防または治療するのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することによって単位容量形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造されることができる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であってもよく、エキス剤、散剤、座剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の抗体組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与されることができる。

抗体は、抗体−治療剤結合体の形態で生体内に投入し、免疫疾患の治療に利用することができる。治療剤は、化学治療剤、放射性核腫、免疫治療剤、サイトキン、ケモキン、毒素、生物作用剤及び酵素阻害物質などを含む。抗生剤を抗体に結合させる方法は、例えば、文献Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｅｓ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ、（１９７９）；Ａｒｎｏｎｅｔａｌ．、 Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、７５：２３６（１９８０）；及びＭｏｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｓ．、６２：４７（１９８２））に記載されている。

本発明の抗体または抗体断片とカップリングさせるのに好ましい薬品は、抗細菌、駆虫、抗真菌及び関連薬剤であり、例えばスルホンアミド、ペニシリン及びセファロスポリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ピペラジン、クロロキン、ジアミノピラジン、メトロニアジド、イソニアジド、リファンピン 、ストレプトマイシン、スルホン、エリスロマイシン、ポリミキシン、ナイスタチン、アムホテリシン、５−フルオロサイトシン、５−ヨード−２’−デオキシウリジン、１−アダマンタアミン、アデニンアラビノサイド、アマニチン、リババリン及びアジドチミジン（ＡＺＴ）であり、好ましくは、リババリンである。薬剤を特異的標的部位に標的化するのに好適なさまざまな条件は、例えば文献Ｔｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、１９−３０（１９８２）に報告されている。有効な治療剤を微生物抗原に対して製造された非常に特異性がある抗体を使用して感染病巣に直接タゲッティングして感染菌を選択的に殺すことによって、薬品に耐性がある感染を治療するときに発生する多くの問題点を解決することができる。また、病巣にタゲッティングされた薬品は、感染部位では高い濃度で薬効を上昇させることができる。

上記抗体−治療剤結合体において治療剤として利用され得る免疫調節剤は、リンフォカイン及びサイトカインを含むが、これに限定されない。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明の二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０の両方に効果的に結合する二重特異性抗体なので、ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ１０を認識することができる二重ターゲット抗体として有用に使用されることができる。
（ｂ）本発明の組成物は、ＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０の両方に効果的に結合するＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体を含む。
（ｃ）本発明の二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０単一ターゲット抗体と比べて優れたＴＮＦ−α抑制能及び破骨細胞分化抑制能を有する。
（ｄ）本発明の組成物は、免疫疾患の予防または治療に利用されることができる。

図１は、ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ１０二重特異的抗体の製造模式図である。 図２は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィーを利用して精製したヒトＣＸＣＬ１０タンパク質の確認した結果である。 図３は、各パンニング後のファージプールを利用したヒトＣＸＣＬ１０−Ｈｉｓのポリ−ファージ（ｐｏｌｙ−ｐｈａｇｅ）ＥＬＩＳＡ分析結果である。 図４は、ヒトＣＸＣＬ１０のｓｃＦｖモノファージ（ｍｏｎｏ−ｐｈａｇｅ）クローン（ｃｌｏｎｅ）のＢｓｔＮＩフィンガープリント（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）結果である。ｓｃＦｖ挿入体は、個別コロニーから増幅し、増幅された産物は、ＢｓｔＮＩで制限して、８％ポリアクリルアミドゲルで分析した。青い文字で表示されたクローンは、異なるグループを示す。 図５は、ＨｕＥ１０−１０１二重抗体の培養期間別の発現率を評価した結果である。 図６は、精製されたＨｕＥ１０−１０１二重抗体の純度分析結果である。 図７は、ＨｕＥ１０−１０１二重抗体の抗原に対する結合力を測定したグラフである。 図８は、精製されたＨｕＥ１０−１０１二重抗体の細胞毒性を調査した結果である。 図９は、生産細胞株構築のためのＨｕＥ１０−１０１発現ベクターのマップである。 図１０は、形質感染条件によるＨｕＥ１０−１０１発現量を調査した結果である。 図１１は、ＤＨＦＲを利用して選別したコロニーのイメージである。 図１２は、ＤＨＦＲを利用して選別した単一クローンでＨｕＥ１０−１０１発現をドットブロッティングを実施して確認した結果である。 図１３は、ＥＬＩＳＡ方法でＤＨＦＲを利用して選別した単一クローンの相対的な発現量を比較した結果である。 図１４は、図１３の結果で相対的に高いＥＬＩＳＡスコアによって選別された２９個のクローンを示したグラフである。 図１５は、９６ウェルから最終６ウェルに移したクローンのＨｕＥ１０−１０１発現率を示した結果である。 図１６は、１００ｎＭＭＴＸが含まれた培地で成長する予備細胞株に対する顕微鏡写真である。 図１７は、１００ｎＭＭＴＸで発現率が高い３個のクローンに対するＨｕＥ１０−１０１発現量測定結果である。 図１８は、培養安定性を確認した結果である。 図１９は、ＨｕＥ１０−１０１のＮ−末端アミノ酸配列を確認した結果である。 図２０は、ＨｕＥ１０−１０１のペプチドマッピング結果である。 図２１は、ＨｕＥ１０−１０１の構造的特性糾明のためにトリプシン処理後、ＬＣ‐ＭＳペプチドマッピング分析法を利用して理論的アミノ酸配列の同質性を確認した結果である。 図２２は、ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）を利用してＨｕＥ１０−１０１タンパク質の２次構造を予測した結果である。 図２３は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６を用いたＨｕｍｉｒａとＨｕＥ１０−１０１のＴＮＦ−α及びＣＸＣＬ１０との結合力を評価した結果である。 図２４は、ＥＬＩＳＡを基盤としたＫＤ値を測定し、結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を確認した結果である。 図２５は、ヒュミラ、ヒュミラ複製抗体、ＨｕＥ１０−１０１、ＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１及びＨｕＩＬ２１Ｒ−１００の抗ＴＮＦ−α抑制能評価結果である。 図２６は、ＣＸＣＬ１０に対するＨｕＥ１０−１０１の走化能評価結果を示したグラフである。ＮＣ：陰性対照群、ＰＣ：陽性対照群（左側：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、右側：ＰＢＭＣ）ＮＣ：ｎｅｇａｔｉｖｅｃ ｏｎｔｒｏｌ、ＰＣ：ｐｏｓｉｔｉｖ ｅｃｏｎｔｒｏｌ（左：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌ、右：ＰＢＭＣ） 図２７は、共同培養システムを導入した破骨細胞分化実験条件を示した模式図である。 図２８は、ＴＲＡＰ染色を用いた破骨細胞分化確認した結果である。 図２９は、抗−ＴＮＦ−α及び抗−ＣＸＣＬ１０による破骨細胞分化の抑制効果を測定した結果である（ＴＲＡＰ陽性多核細胞計数結果）。 ＣＤ４＋細胞のＲＡＮＫＬ誘導条件：ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１０、ＴＮＦ−α＋ＣＸＣＬ１０刺激 図３０は、生産細胞株で生産した抗体の効能を評価するためにＴＮＦ−α中和能評価を進行した結果である。 図３１は、ヒュミラとヒュミラ複製抗体を濃度別に投与した後、関節炎誘発点数を測定した結果である。 図３２は、ヒュミラとヒュミラ複製抗体を濃度別に投与した後、体重変化を測定した結果である。 図３３は、ＨｕＩＬ２１−１０１を濃度別に投与した後、関節炎誘発点数を測定した結果である。 図３４は、ＨｕＩＬ２１−１０１を濃度別に投与した後、体重変化を測定した結果である。 図３５は、ＨｕＥ１０−１０１を濃度別に投与した後、関節炎誘発点数を測定した結果である。 図３６は、ＨｕＥ１０−１０１を濃度別に投与した後、体重変化を測定した結果である。 図３７は、ＨｕＥ１０−１０１を濃度別に投与した後、組織学的点数を測定した結果である。 図３８は、関節炎誘発点数と組織学的点数の比較結果である。 図３９は、生産細胞株で生産したＨｕＥ１０−１０１を濃度別に投与した後、関節炎誘発（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）点数結果である。 図４０は、生産細胞株で生産したＨｕＥ１０−１０１を濃度別に投与した後、体重変化を測定した結果である。 図４１は、実験が終わったＴｇ１９７マウス組織を得て病理学的変化を観察した結果である。 図４２は、生産細胞株で生産したＨｕＥ１０−１０１を濃度別に投与した後、組織学的点数を測定した結果である。 図４３は、生産細胞株で生産したＨｕＥ１０−１０１を関節炎誘発点数と組織学的点数の比較結果した結果である。 図４４は、Ｋ／ＢｘＮ血清トランスファー関節炎マウスモデルの関節炎誘発点数を測定した結果である。 図４５は、Ｋ／ＢｘＮ血清トランスファー関節炎マウスモデルの浮腫変化を測定した結果である。 図４６は、Ｋ／ＢｘＮ血清トランスファー関節炎マウスモデルの浮腫変化を撮影した結果である。 図４７は、Ｋ／ＢｘＮ血清トランスファー関節炎マウスモデルのｍｉｃｒｏ ＣＴを利用して骨を確認した結果である。 図４８は、Ｋ／ＢｘＮ血清トランスファー関節炎マウスモデルの組織病理学的病変を確認した結果である。 図４９は、ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルでＨｕＥ１０−１０１の破骨細胞分化能評価に対する模式図である。 図５０は、ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルでＨｕＥ１０−１０１の破骨細胞分化能を評価した結果である。 図５１は、ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルで生産細胞株で生産したＨｕＥ１０−１０１の破骨細胞分化能を評価した結果である。 図５２は、ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルで生産細胞株で生産したＨｕＥ１０−１０１の破骨細胞分化能を定量分析した結果である。 図５３は、コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルでＨｕＥ１０−１０１の効能評価に対する模式図である。 図５４は、重複されない３人の３２種組織を利用してＨｕＥ１０−１０１の交差反応を確認した結果である。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界において通常の知識を有する者に自明だろう。

（実施例）
実施例１：ヒトＣＸＣＬ１０抗原タンパク質の製造
ヒトＣＸＣＬ１０に対する単一クローン抗体を製作するために、ヒトＣＸＣＬ１０タンパク質を発現及び精製した。具体的に、ヒトＣＸＣＬ１０を増幅するために脾臓、胎盤、肝及び腎臓ｃＤＮＡライブラリミックスを鋳型としてｐＥＴ２２ｂベクターに挿入した。ｐＥＴ２２ｂ−ヒトＣＸＣＬ１０プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、収得した形質転換体は、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレートに接種し、一晩中培養後、３７℃で振盪培養した。

その後、ＯＤ６００値が０．５５になれば、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ濃度で添加し、一晩中培養した後、６，５００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、上澄み液を収得した。収得した上澄み液を濃縮し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを入れて反応させた後、アガロースビーズをカラムに充填した後に、溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）した。濃縮後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、コマシエ（ｃｏｏｍａｓｓｉａｅ）で染色した。タンパク質の発現程度を比較するために、ＢＳＡ（Ｂｏｖａｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を標準定量タンパク質として一緒に使用した。その結果、図２に示したように、約１５ｋＤａのサイズのヒトＣＸＣＬ１０タンパク質が発現されたことを確認した。

実施例２：単一クローン抗体の製造
２−１．パンニング過程
パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）は、ファージの外壁（ｃｏａｔ）にペプチドを発現（ｄｉｓｐｌａｙ）するファージライブラリから、標的分子（抗体、酵素、細胞表面レセプターなど）と結合する性質を有するペプチドを表面に発現しているファージのみを選別する過程を称える。ＣＸＣＬ１０の単一クローン抗体を製造するためのファージ抗体群を製造するために、ファージパンニングを行った。上記実施例１で収得した精製されたヒトＣＸＣＬ１０抗原１００μｇをＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂチューブ（Ｎｕｎｃ ４７０３１９）に２ｍｌのコーティング緩衝溶液（Ｎａ_２ＣＯ_３（ｓｉｇｍａ、Ｓ７７９５）１．５９ｇ、ＮａＨＣＯ_３（ｓｉｇｍａ、Ｓ８８７５）２．９３ｇ、ＮａＮ_３（ｓｉｇｍａ、Ｓ２００２）０．２ｇで４℃で１６時間程度回転器（ｒｏｔａｔｏｒ）でコーティングした後、室温で２時間ＰＢＳにとかして４％スキムミルク（（ＢＤ、２３２１００）−１Ｘ ＰＢＳで４％）を使用して免疫チューブで遮断した。上記免疫チューブにライブラリファージ２ｍｌを添加し、室温で２時間反応させ、ＰＢＳＴ（０．０５％）で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージのみを１００ｍＭ ＴＥＡ（ＳｉｇｍａＴ−０８８６）で溶出し、溶出されたファージを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、２００２４９）に感染させて増幅した。一番目のパンニングで増幅されたファージをＰＢＳＴ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｓｉｇｍａ、Ｓ７９５３−５ｋｇ）８ｇ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７９０７−ｄｉｂａｓｉｃ）１．１５ｇ、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｓｉｇｍａ、Ｓ−５６５５−５００ｇ：ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）０．２ｇ、２．７ｍＭ ＫＣｌ（ｓｉｇｍａ ｐ９５４１）０．２ｇ、ツイン２０（ｓｉｇｍａ、ｐ１３７９）０．５５％）洗浄段階で回数を増やして（２次：１３番、３次：２３番）、同一の方法で２次及び３次パンニングを行った。その結果、下記表１に示したように、３次で抗原に対するファージのコロニー力価（ｔｉｔｅｒ）が１００倍以上増幅されることを確認した（表１）。

２−２．ファージ抗体スクリーニング
１次から３次までパンニングして冷凍しておいた細胞貯蔵物（ｓｔｏｃｋ）を５ｍｌの２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２培地にＯＤ６００値が０．１となるように入れた後、３７℃で２〜３時間（ＯＤ６００＝０．５〜０．７）培養した。培養した細胞貯蔵物にＭ１ヘルパーファージを感染させ、２×ＹＴＣＭＫ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。上記培養した細胞を４５００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離した後、上澄み液（１次〜３次パンニングｐｏｌｙ ｓｃＦｖ−ファージ）を新しいチューブに移した。９６ウェル免疫プレート（ＮＵＮＣ ４３９４５４）に２種類の抗原（ＣＸＣＬ１０、ａ−ｍｙｃ）をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間程度コーティング緩衝溶液で処理してコーティングし、ＰＢＳにとかしたスキームミルク（４％）を使用して各ウェルを遮断した。各ウェルごとにＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗浄した後、１次、２次、３次パンニングポリｓｃＦＶ−ファージを各ウェルに１００μｌずつ入れ、常温で２時間反応させた。反応後、さらに各ウェルごとにＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌを使用して４回洗浄し、二次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ２７−９４２１−０１）を１：２０００で希釈し、室温で１時間反応させた。反応後にＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗浄し、ＯＰＤ精製（Ｓｉｇｍａ、８７８７−ＴＡＢ）をＰＣ緩衝溶液（Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７・Ｈ_２Ｏ（ｓｉｇｍａ、Ｃ０７０６）５．１ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｓｉｇｍａ、Ｓ７９０７）７．３ｇ）にとかした基質溶液を作って、ウェル当たり１００μｌずつ入れて、１０分間発色させた後、４９０ｎｍで吸光度をＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ、米国）で測定した。

その結果、図３に示されたように、抗原に対する結合能が２つの抗原に対して３次ｐｏｌｙｓｃＦＶ−ファージで増強（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）されることをＥＬＩＳＡを通じて確認した（図３）。

２−３．単一クローンファージ選別
上記実施例２−２で製造した結合能が大きい多クーロンファージ抗体群（３次パンニング）で得たコロニー２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２培地１ｍｌが含まれた９６−ｄｅｅｐウェルプレート（バイオニア、９００３０）に分注し、３７℃で１６時間培養した。培養した細胞のＯＤ６００値が０．１となるように、１００〜２００μｌを取って１ｍｌの２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２培地に希釈した後、９６−ｄｅｅｐウェルプレートに分注し、３７℃でＯＤ６００値が０．５〜０．７となるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージを、ＭＯＩ値が１：２０になるように感染させた後、２×ＹＴＣＭＫ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を４、５００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離した後、上澄み液を取って、４％ＰＥＧ６，０００と３％ＮａＣｌを添加し、十分にとかして、氷で１時間反応させた。反応後、８，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離した後、ペレットにＰＢＳを添加してとかした後、１２，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離して、上澄み液を取って、新しいチューブに移し、３次パンニングして得た単一クローンｓｃＦｖ−ファージを４℃で保管した。

２−４．単一クローンファージ抗体群のＥＬＩＳＡ分析
９６ウェル免疫プレートにＣＸＣＬ１０及びａ−ｍｙｃの２つの抗原をウェル当たり１００ｎｇずつ入れ、４℃で１６時間コーティング緩衝溶液にコーティングした後、ＰＢＳにとかしたスキムミルク（４％）を使用して各ウェルを遮断した。各ウェルごとにＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌを使用して洗浄した後、３次パンニングして得た単一クローンｓｃＦｖ−ファージ（各１００ｓｃＦｖ−ファージ）を各ウェルに１００μｌずつ入れ、常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとにＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌを使用して４回洗浄した後、２次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗浄した後、発色し、吸光度４９０ｎｍで測定した。

その結果、表２に示されたように、それぞれの抗原に対する結合能が強い単一ファージクローンは、ヒトＣＸＣＬ１０−Ｈｉｓに対して総５９個の単一ファージクローンを収得した（表２）。

実施例３：選別した単一クローンファージ分類及び検査
３−１．フィンガープリンティングによる検証
上記実施例２を通じて選別された１０個の単一クローン細胞をフィンガープリンティングで検証するために、選別した単一クローン細胞それぞれ１μｌとＴａｑＤＮＡ重合酵素（ゼンダックス５Ｕ／μｌ）０．２μｌ、５０ｐ／μｌの正方向プライマー（ｐｅｌＢ５）（配列番号４１：５’−ＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧ−３’）及び逆方向プライマー（ｃｌａ３）（配列番号４２：５’−ＣＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣ−３’）それぞれ０．２μｌ、１０Ｘ緩衝溶液３μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ０．６μｌ、蒸留水２４．８μｌを混合し、下記表３のＰＣＲプログラムの条件でコロニーＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行った。

上記で収得したコロニーＰＣＲ産物は、１％アガロース（Ｓｅａｋｅｍ ＬＥ、ＣＡＭＥＲＥＳ５０００４）で確認し、ＢｓｔＮＩ（Ｒｏｃｈｅ１１２８８０７５００１、１０Ｕ／μｌ）０．２μｌを加えて、３７℃で２〜３時間下記［表４］の反応条件で反応させた。

その結果、ＢｓｔＮＩによって切断された上記単一クローンファージ抗体の断片を８％ＤＮＡポリアクリルアマイドゲル（３０％ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、１６１−０１５６）２．６６ｍｌ、１０×ＴＢＥ １ｍｌ、蒸留水６．２７ｍｌ、１０％ ＡＰＳ（ｓｉｇｍａ、Ａ３６７８）７０μｌ、ＴＥＭＥＤ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、１６１−０８０１）７μｌ）で確認し、図３に示したように、単一クローンファージ抗体の多様性を確認した（図４）。

３−２．配列分析による検証
上記実施例３−１でフィンガープリンティングで確認された単一ファージクローンそれぞれの配列を分析するために、単一クローン細胞を２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２培地（５ｍｌ）に３７℃で１６時間培養した。培養した単一細胞からＤＮＡ精製キット（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ、５１１２）を利用してＤＮＡを収得した後、ｐｅｌＢ５プライマー（配列番号４３：５’−ＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧ−３’）を利用した配列分析（ソルゼント、韓国）を依頼し、上記選別された抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ領域を確認した。分析された配列を通じてこれら抗体と生殖細胞系列（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ）抗体群の類似性をＮＣＢＩのＩｇ ＢＬＡＳＴプログラム（／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を利用してそれぞれのヒト抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３で使用されているポリペプチドを分析した。

その結果、表５に示したように、４種のｈｕｍａｎ ＣＸＣＬ１０に特異的なファージ抗体を得、これらのアミノ酸配列は、表６に示した。

実施例４：全体ＩｇＧ変換及び分析
４−１．全体形態（Ｗｈｏｌｅ ｆｏｒｍ）ＩｇＧ変換
上記実施例３−２の４種の単一クローンファージのうち抗体をｓｃＦｖからＩｇＧに切り替えるために、重鎖の場合、単一クローンＤＮＡ １μｌ、重鎖正方向プライマー及び重鎖逆方向プライマーそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μｌ、１０Ｘバッファー５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ１μｌ、ｐｆｕ ＤＮＡ重合酵素（ソルゼント、２．５Ｕ／μｌ）及び０．５μｌ蒸留水を混合して、コロニーＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行った。また、軽鎖の場合も、下記軽鎖正方向及び逆方向プライマーを使用して同一の方法でコロニーＰＣＲを行った。４種の単一クローンファージをｓｃＦｖからＩｇＧに変換するために使用したプライマーは、表７に示した。

その後、ＰＣＲに収得した重鎖遺伝子をＤＮＡ−ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製して、ｐＮＡＴＡＢ Ｈベクター１μｌ（１０ｎｇ）、重鎖（１００〜２００ｎｇ）１５μｌ、１０Ｘバッファー２μｌ、連結酵素（１Ｕ／μｌ）１μｌ、蒸留水を混合し、室温で１〜２時間放置し、ベクターと連結した。上記重鎖遺伝子を連結したｐＮＡＴＡＢ Ｈベクターを形質転換用細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ）とともに氷に３０分間放置した後、４２℃で９０秒間熱衝撃を与えて、形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、さらに氷で５分間放置した後、ＬＢ培地１ｍｌを注入し、１時間３７℃で培養した。その後、アンピシリンが含まれたＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で１６時間培養した。培養後、生成された単一コロニーをアンピシリンが含まれたＬＢ液体培地５ｍｌに接種し、３７℃で１６時間培養した。上記培養液からＤＮＡ−ｐｒｅｐキット（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ）を利用してＤＮＡを抽出した。また、軽鎖は、ｐＮＡＴＡＢ Ｌベクターを使用して上記のような方法でＤＮＡを抽出した。

４−２．抗−ＣＸＣＬ１０抗体の精製及び抗原結合親和度測定
抽出した全体形態抗体ＤＮＡは、２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＰＥＩ ４０μｇ、ＤＮＡ １０μｇ及び軽鎖ＤＮＡ １０μｇを入れて共同形質感染をした。形質感染後、得た２日目から８日目までの上澄み液を収得し、タンパク質Ａビーズを利用して精製をし、精製されたヒトＣＸＣＬ１０抗体の抗原に対する結合力を測定するために、ＥＬＩＳＡを行った。

具体的にＥＬＩＳＡは、９６ウェル免疫プレートに再組み換えヒトＣＸＣＬ１０タンパク質をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コーティング緩衝溶液でコーティングした後、ＰＢＳにとかしたスキムミルク（４％）を使用して各ウェルを遮断した。各ウェルごとにＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌを加えて洗浄した後、単一クローン抗体を５０ｎＭから１／２ずつ順次に希釈して、抗原がコーティングされたプレートに１００μｌずつ入れ、常温で２時間反応させた。さらに、各ウェルごとにＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌを加えて、３回洗浄した後、二次抗体である抗−ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：４０００で希釈して、室温で５０分間反応させた。ＰＢＳ−ツイン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗浄した後、ＯＰＤ錠剤をＰＣ緩衝溶液に入れた気質溶液を、ウェル当たり１００μｌずつ入れて、５分間発色させて、吸光度４９０ｎｍで分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定し、上記ＥＬＩＳＡ結果は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．４ソフトウェア（ＣＡ９２０３７：Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して分析した。

その結果、表８に示されたように、精製された抗−ＣＸＣＬ１０抗体の抗原に対する結合力（ＫＤ）に優れていることを確認した（表８）。

実施例５：ＣＸＣＬ１０及びＴＮＦ−α二重−特異的抗体の製造
５−１．二重特異的抗体ＨｕＥ１０−１０１の製造及び精製
抗−ヒトＣＸＣＬ１０単一抗体及びブロックバスター抗−ＴＮＦ−α単一抗体であるヒュミラ（ｈｕｍｉｒａ）を融合した二重特異的抗体を製作するために、上記実施例３で製造した抗−ヒトＣＸＣＬ１０単一クローン抗体のうちＥ１０のＳｃＦｖをｐＮＡＴＡＢＨ：：ヒュミラの３’末端にクローニングし、これをＨｕＥ１０−１０１と命名した。

抗−ＴＮＦ−α抗体であるヒュミラは、重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：４）及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：８）に基づいて遺伝子合成を通じて製造した。その後、ｈｕｍｉｒａの重鎖領域を含むベクターでヒュミラの重鎖及び可変領域３’−末端にＥ１０ ｓｃＦｖを連結するためにＰＣＲを行い、これを通じて、２つの断片を連結して１つのＤＮＡ断片に作って、これをさらにｐＮＡＴＡＢＨベクターに挿入し、ＨｕＥ１０−１０１を発現するためのｐＮＡＴＡＢＨ：：Ｈｕｍｉｒａ／Ｅ１０ＳｃＦｖベクターを製造した。その後、ＨＥＫ ２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にｐＮＡＴＡＢＨ：：Ｈｕｍｉｒａ／Ｅ１０ＳｃＦｖ及びｐＮＡＴＡＢＨ：：Ｈｕｍｉｒａを３：７の比率で共同形質感染した。形質感染後に得た２日目から８日目までの２日間隔で上澄み液を４回収得し、抗体の発現量をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した後（図５）、タンパク質Ａビーズを利用して精製した。ウェスタンブロッティングは、細胞培養液を２日間隔で収集し、１ｍｌチューブにそれぞれ入れた後、細胞を除去するために、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、得た上澄み液をタンパク質サンプルバッファー２５μｌとそれぞれの上澄み液１２５μｌをそれぞれの１ｍｌチューブに入れ、５分間沸かした。１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに４０μｌずつローディングした後、電気泳動した後、メンブレインにトランスファーした。メンブレインを４％スキームミルクで１時間程度ブロッキングした後、２次抗体である抗−Ｆｃ−ＨＲＰを１／４０００で添加した後、常温で４時間程度揺らした。１ｘＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ溶液１ｍｌをメンブレインに散布した後、暗室でＸ−レイフィルムで感光させて結果を得た。

その結果、図５に示したように、ＨｕＥ１０−１０１抗体の発現を確認し、最終精製された抗体の回収率は、７ｍｇ／Ｌであって、一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現を用いた方法では、多くの量が発現されることを確認した（図６）。

また、精製した抗原のＱＣ分析のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｎｃ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０ ｋｉｔ（５０６７−１５１７）チップを利用してゲル−類似イメージと絶対定量（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）を確認した。分析は、減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）と非−減少（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件でそれぞれ行い、対照群としてヒュミラを一緒に分析した。

その結果、図６に示したように、ヒュミラは、還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件で重鎖と軽鎖の分子量が５０と２５ｋＤａで現われ、ＨｕＥ１０−１０１の重鎖と軽鎖の分子量は、それぞれ８３と２５ｋＤａで現われ、ヒュミラの重鎖領域にＥ１０のＳｃＦｖが融合され、分子量が増加することを確認した。非−還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件でＨｕＥ１０−１０１の分子量は、約１８７ｋＤａであることを確認した（図６）。

５−２．二重特異的抗体ＨｕＥ１０−１０１のＣＸＣＬ１０及びＴＮＦ−αに対する結合力の調査
二重特異的抗体ＨｕＥ１０−１０１のＣＸＣＬ１０またはＴＮＦ−αに対する特異的な結合力を確認するために、上記実施例４−２と同一の方法でＥＬＩＳＡ分析を行った。ＨｕＥ１０−１０１の結合力の水準を比較するために、ＨｕＥ１０−１００抗体と同一の方法で分析して比較した。一方、上記ＨｕＥ１０−１００抗体は、ヒュミラ重鎖の可変領域Ｎ−末端にＥ１０ｓｃＦｖを連結させて製作し、ＨｕＥ１０−１０１のようなＴＮＦ−αとＣＸＣＬ１０に対する二重抗体であるが、ＨｕＥ１０−１０１に比べて発現量が極めて少ないという短所がある。

その結果、図７に示されたように、ＣＸＣＬ１０に対する結合力は、ＨｕＥ１０−１００及びＨｕＥ１０−１０１の２つの抗体でそれぞれ３．０×１０^−１１Ｍ（Ｒ２＝０．９９）及び４．７×１０^−１０Ｍ（Ｒ２＝０．９９）を示すことを確認し、ＴＮＦ−αに対する結合力は、それぞれ、４．１×１０^−１１Ｍ（Ｒ２＝０．９８９）と３．５×１０^−１１Ｍ（Ｒ２＝０．９９）であって、類似の結合力程度を有することを確認した（図７）。

５−３．二重特異的抗体ＨｕＥ１０−１０１の細胞毒性の調査
二重特異的抗体ＨｕＥ１０−１０１の動物実験のために細胞毒性を調査した。ＨｕＥ１０−１０１は、６０．２８ｍｇを生産して調査し、対照群としてヒュミラを４３．６８ｍｇ生産して行った。

ＨｕＥ１０−１０１を精製した後、精製された抗体の細菌内毒素（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）を測定するために、Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬ（ｃａｔ＃Ｃ００３１、ＣＡＰＥ ＣＯＤ）を利用した。対照群として使用される基準毒素（ＣＳＥ、ｃｏｎｔｒｏｌスタンダード細菌内毒素；ｃａｔ＃Ｅ０００５、ＣＡＰＥ ＣＯＤ）を１ＥＵ／ｍｌから２倍ずつ希釈して、最小濃度が０．０３１２５ ＥＵ／ｍｌとなるように準備した。陰性対照群としてＬＲＷ（ＬＡＬ ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｔｅｒ、ｃａｔ＃ＷＰ１００１、ＣＡＰＥ ＣＯＤ）１００μｌにＬＡＬ １００μｌを入れ、陽性対照群として０．１２５ＥＵ／ｍｌ濃度の基準毒素（ＣＳＥ）１００μｌにＬＡＬ １００μｌを交ぜて実験に使用した。分析のためにＬＲＷで５０μｇ／ｍｌの一定濃度となるように希釈した試料１００μｌにＬＡＬ １００μｌを準備した。さらに、試料の干渉確認のために、生成物質陽性対照群実験を行い、上記希釈した試料５０μｌに０．１２５ ＥＵ／ｍｌ基準毒素（ＣＳＥ）５０μｌとＬＡＬ １００μｌを入れて準備した。ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定するとき、プロトコル化したファイル（Ｃｈｒｏｍｏ ＬＡＬ ｓｅｔｔｉｎｇ．ｐｄａ）を利用して基準値を決定した。プレートは、３７℃に１０分間予熱して準備した後、実験を始めた。ＬＡＬを処理すると同時に、プロトコル化したファイルを始めてＯＤを測定した。スタンダード曲線のＸ軸は、Ｌｏｇ ＥＵ／ｍｌ、Ｙ軸は、Ｌｏｇ Ｏｎ ｓｅｔｔｉｍｅで作成され、試料の細胞内毒性数値は、測定したＯＤをソフトウェア上で自動に計算し、ＥＵ／ｍｌで表示した。スタンダード曲線のＲ２値が０．９８以上になる場合に、測定値に対する信頼性を認定した。

その結果、図８に示されたように、ＨｕＥ１０−１０１及びヒュミラの耐毒素レベルを調べるためにＬＡＬテストを行った結果、ＨｕＥ１０−１０１及びヒュミラのＬＡＬ値は、いずれも０．１ＥＵ／ｍｌ以下であることを確認した（図８）。

実施例６：ＨｕＥ１０−１０１生産細胞株確立
６−１．細胞株用ＨｕＥ１０−１０１発現ベクター製造
ＨｕＥ１０−１０１抗体のＨｕＥ１０−１０１抗体重鎖と軽鎖の発現のためのプラスミドは、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＯｐｔｉＶｅｃシステムを使用した。ｐＯｐｔｉＶｅｃシステムの長所としては、関心遺伝子と選択マーカーであるＤＨＦＲが同一転写体上に存在し、遺伝子増幅が容易であるという点である。ＨｕＥ１０−１０１−ＨｃとＨｕＥ１０−１０１−Ｌｃは、いずれもｐＯｐｔｉｖｅｃベクターにサブクローニングされ、形質感染時にＤＮＡ線形化に使用された酵素位置は、アンピシリン遺伝子内部のＰｖｕＩを利用した。プラスミドマップは、図９の通りである。形質感染試薬としてリポフェクタミン２０００を使用し、ＤＮＡ：リポフェクタミン２０００＝１：１、１．５、２の比率で使用した。

６−２．ＣＨＯ ＤＧ４４維持
発現宿主として使用されたＣＨＯ ＤＧ４４細胞は、ＭＥＭ−アルファ（ｗ／）＋１０％ＦＢＳ＋ＡＡ培地を使用して培養した。細胞パッシング（ｐａｓｓｉｎｇ）時に約１−２ｘ１０^６細胞／ウェルを０．２５％トリプシンを使用して床から引き離した後、１／３を２ｍｌの培地が含まれた新しいウェルにトランスファーした。細胞株の開発は、９６ウェル及び６ウェルプレート水準で進行した。

６−３．形質感染
形質感染の前日に４ｘ１０^５細胞を６ウェルプレートに分注した後、約１６時間培養器で培養した。形質感染の当日の細胞状態を観察し、形質感染に適合するかを確認した後、ＭＥＭ−アルファ（ｗ／）（−ＦＢＳ、−ＡＡ）培地で２回洗浄した。１ｍｌのＭＥＭ−アルファ（ｗ／）（−ＦＢＳ、−ＡＡ）培地を添加後、約１時間培養器で培養した。形質感染に必要なＤＮＡは、線形化したＨｕＥ１０−１０１−ＨｃとＨｕＥ１０−１０１−Ｌｃを使用し、２μｇ（Ｈｃ：１μｇ＋Ｌｃ：１μｇ）とリポフェクタミン２０００ ４μｌをＭＥＭ−アルファ（ｗ／）（−ＦＢＳ、−ＡＡ）１００μｌに混合後、常温で約３０分間反応させた（ＤＮＡ：リポフェクタミン２０００＝１：１、１．５、２）の３種類の比率で使用した。上記例示は、１：２の比率である。混合液をウェルに落とす方式で形質感染し、６時間後、ＭＥＭ−アルファ（ｗ／）＋１０％ＦＢＳ＋ＡＡ培地に交換した。形質感染は、いずれも２倍数で進行した。

形質感染が良好に行われたかを確認するために、ウェスタンブロッティングを実施した。形質感染後、２〜３日後に、６ウェルに細胞が一杯になったとき、培地を収得し、ウェスタンブロッティングを行った。１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを利用し、培地は、３０μｌローディングした。ＤＮＡ：リポフェクタミン２０００＝１：２の条件で形質感染が最も良好に行われたことを確認した（図１０）。

６−４．単一コールローン選別
約２日後、形質感染されたＤＧ４４の１６個の９６ウェルプレートで単一クローン選別を進行した。トリプシンで細胞をすべて引き離した後、カウンティングして、１ウェル当たり２００細胞ずつとなるように分注した。この際、ＤＨＦＲによる選別のためにＭＥＭ−アルファ（ｗ／ｏ）＋１０％ ｄＦＢＳ＋ＡＡ培地を使用した。２週後、コロニー生成有無を観察し、培地を収得し、ＥＬＩＳＡを通じてＨｕ１０Ｅ−１０１の発現程度を確認し、高い発現率を有する２９個のクローンを選別した。

図１１は、９６ウェルプレートに形成されたコロニーを撮影した顕微鏡写真である。ＤＨＦＲによる選別のためにＭＥＭ−アルファ（ｗ／ｏ）＋１０％ ｄＦＢＳ＋ＡＡ ２００μｌに２００細胞／ウェルとなるように敷設すれば、形質感染された細胞は、選別培地で成長するようになり、コロニーを形成するようになる。

図１２は、図１１のコロニーの発現確認のためにドットブロッティングを実施した結果である。培地は、３０μｌを使用し、抗−Ｆｃ−ＨＲＰで探知した。オレンジ色の丸のように、発現率の高いクローンは、さらに濃いブロットを有することを確認することができた。

図１３は、単一クローン選別した１６プレートのうち３個のプレートでＥＬＩＳＡ方法で相対的な発現量を比較したものである。抗−Ｆａｂ抗体を１００ｎｇ／ウェルにコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに２時間５％スキムミルクを含むＰＢＳを利用してブロッキングした。その後、コロニーを選別した培地を収得し、１００μｌ添加した。２時間常温で反応後、０．０５％ ＰＢＳＴ ２００μｌで３回洗浄した後、抗−Ｆｃ−ＨＲＰを１：５，０００で１００μｌ １時間反応させた後、ＯＰＤを利用して探知した。紫色で表示したクローンが選別された発現率が相対的に高いクローンである。

ＥＬＩＳＡ定量したもののうち発現が高くて、単一コロニーを形成したものを１プレート当たり２〜３個ずつ選別した。図１４の赤色点線は、平均値を表現したものであり、赤色の星で表示したものが選択したコロニーである。

１６個のプレートのうちＥＬＩＳＡを通じて発現が高い２９個のコロニーを選別し、９６ウェルから４８ウェル、２４ウェル、６ウェルの順に細胞を増幅した。最終６ウェルから５ｘ１０^５細胞／ウェルに分注した後、２日後に細胞が一杯になったとき、培地を収得し、ＥＬＩＳＡを通じて定量した。図１５で赤色で表示されたクローンは、６ウェルでも発現量が維持され、１００ｎＭ ＭＴＸで遺伝子増幅過程を進行した。

６−５．遺伝子増幅
ＨｕＥ１０−１０１抗体発現の増幅のためにＭＴＸをＭＥＭ−アルファ（ｗ／ｏ）＋１０％ｄＦＢＳ＋ＡＡ培地に添加して使用した。初期開始濃度は、１００ｎＭから適応を誘導した。上記で選別したＨｕＥ１０−１０１ ２９個のクローンをウェル当たり５ｘ１０^５細胞で分注した。２日周期で新しい培地に交換しながら、コロニー形成を観察し、細胞が一杯になれば、さらに新しい細胞に５ｘ１０^５細胞で分けた。３回パッシングした後、ＥＬＩＳＡを通じて発現率を確認した。１００ｎＭ完了したクローンのうち発現の高いクローンは、１μＭで遺伝子増幅をした。

図１６は、初めに５ｘ１０^５細胞で分注した後、１週間後にコロニーが形成されたことを示す顕微鏡写真である。２日ごとに培地を交換しながらコロニーが形成されたことを確認し、６ウェルに一杯になれば、トリプシンで細胞を剥がして、新しいプレートに分けた。このような方法で、３回パッシングした後、ＥＬＩＳＡを通じて定量した。

６−６．１００ｎＭで選別された予備細胞株のＨｕＥ１０−１０１発現率
ＨｕＥ１０−１０１抗体の定量は各ステップ別に適応された細胞を５ｘ１０^５細胞／Ｔ−２５フラスコ／５ｍｌに６日間培養する方式で実施した。１００ｎＭに適応された細胞でバッチ（ｂａｔｃｈ）を実施した。ＥＬＩＳＡ方法を使用して定量した。

１００ｎＭで遺伝子増幅は、クローン別に適応速度が全部異なるため、最も速く成長する３個のクローンからＴ−２５フラスコに５ｘ１０^５で分注し、６日後に培地を収得し、ＥＬＩＳＡで定量した。ＥＬＩＳＡは、上記で説明したものと同じ方法を利用した。その結果、Ｓ１７クローンが４０ｍｇ／Ｌと最も高い発現率を示すものと確認された。したがって、このＳ１７クローンは、１μＭ ＭＴＸで遺伝子増幅を誘導した（図１７）。

６−７．単一細胞株でのタンパク質発現量確認
２種の細胞群（Ｈｕｍｉｒａ ＣＸＣＬ１０ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｓ７ ３μＭ、Ｈｕｍｉｒａ ＣＸＣＬ１０ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｓ７ ４μＭ）を利用して限界希釈法によって単一細胞株分離を行った。単一細胞株を確保するために、１細胞／ウェルで９６ウェルプレートにシーディングして、群集を形成した単一細胞由来の細胞株を獲得した。獲得した単一細胞株のタンパク質発現量は、２４ウェルプレートで４日間培養した培養液を利用してＥＬＩＳＡに分析し、下記の総２０個の単一細胞株を選別して、１２５ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋで浮遊培養適応を行った（表９）。

選別された２０個の細胞株は、浮遊細胞に適応後、５ｘ細胞／ｍＬとなるように化学組成培地に十分に分散して接種し、３４℃、５％ＣＯ_２培養器で撹拌速度１４０±１０ｒｐｍで６日間流加式培養し、発現量を分析した（表１０）。

６−８．抗体生産細胞株の発現安定性
発現量の分析結果を通じて発現量が約５０μｇ／ｍＬ以上を示す１０個の細胞株を選別して、長期継代培養中に発現安定性を確認するための培養を行った。浮遊培養適応後、凍結保管された細胞を化学組成培地に解凍した後、１２５ｍＬ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋで３日間隔で９０日間継代培養した。継代ごとに培養液の一部を収穫し、凍結保管し、ＥＬＩＳＡによる発現量分析結果に基づいて安定性を分析し、生産性が高くて、継代培養安定性が８０％以上維持される細胞株を工程開発のための細胞株として選別した。分析結果に基づいてＳ７（４μＭ）−３細胞株を最終選別し、Ｓ７（４μＭ）−３細胞株の３０継代までの培養安定性を培養初期（４−９継代）と２６〜３０継代での平均発現量を比較分析した結果、継代培養安定性が９５％以上維持されることを確認した。したがって、Ｓ７（４μＭ）−３細胞株を工程開発及び１０ｇ生産のために生産用細胞株として使用した（図１８）。

実施例７：抗体の物理化学的特性分析
７−１．抗体の構造または構成成分に関する分析
７−１−１．Ｎ−末端アミノ酸配列確認
Ｎ−末端アミノ酸配列分析は、抗体タンパク質の重鎖と軽鎖に分けて分析した。
通常の抗体タンパク質のＮ−末端配列の一番目アミノ酸であるグルタミンよりなる場合、グルタミンアミノ酸がピロリドンカルボン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ）に変形された形態で存在する場合が高い。しかし、ＨｕＥ１０−１０１の重鎖と軽鎖は、いずれも、グルタミンでなく、グルタミン酸とアスパルト酸よりなるので、特異的変形が発生する可能性が非常に低い。

分析結果、重鎖のＮ−末端配列は、１６個のアミノ酸配列を確認し、軽鎖は、１８個のアミノ酸配列を確認した。確認されたアミノ酸配列は、理論的なアミノ酸配列と同一であった。
ＨｕＥ１０−１０１試料をＴＣＡで沈積して貯蔵バッファーを除去し、５Ｍウレアを処理して変性させた。トリプシンを処理して抗体をペプチド断辺に切断させた後、ＰＮＧａｓｅ−Ｆを入れて脱グリコシル化させた。最後に、ＤＴＴを入れて二硫化結合を除去した後、ＬＣ−ＭＳでペプチド分析実験を行った。抗体タンパク質のＮ−末端配列は、タンパク質の発現過程で他の部分のアミノ酸に比べてＰＴＭ（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が発生する可能性が高くて、抗体タンパク質の活性度とその他免疫拒否反応にも関連されることができる。ＨｕＥ１０−１０１は、構造的に重鎖と軽鎖とに分けられていて、本実験では、重鎖のＮ−末端と軽鎖のＮ−末端をそれぞれＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法によって最終シーケンシングした。Ｎ−末端分析のためにトリプシンを使用してそれぞれの重鎖Ｎ−末端分析と軽鎖Ｎ−末端分析を行った。

トリプシンによって切断された抗体由来ペプチドは、ＬＣ−ＭＳペプチドマッピングとＬＣ−ＭＳ／ＭＳシーケンシング分析方法を行い、ここで、それぞれの理論的ペプチド分子量を計算して、Ｎ−末端ペプチドを把握した（図１９ａ）。

同一条件のＬＣ−ＭＳをまず行い、当該ペプチドの維持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）時間を確認し、同じＬＣ条件を使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ペプチドシーケンシングを行った。Ｎ−末端シーケンシング結果、図１９ａと図１９ｃは、それぞれ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法によるＨｕＥ１０−１０１の重鎖と軽鎖のＮ−末端シーケンシング結果である。結果から分かるように、ＨｕＥ１０−１０１タンパク質の重鎖及び軽鎖のＮ−末端配列は、理論的ＨｕＥ１０−１０１タンパク質のＮ−末端配列と同一のペプチド分子量とシーケンシングされ、重鎖のＮ−末端配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲであり、軽鎖のＮ−末端配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ確認された（図１９）。

表１１は、Ｎ−末端配列の理論的分子量とＬＣ−ＭＳで確認された分子量、ｍｓ／ｍｓシーケンシングを通じて確認されたＮ−末端配列を整理したものである。通常のタンパク質のＮ−末端の変形形態であるピロリドンカルボン酸形態と切断、脱アミド化、酸化のような変形は、ＨｕＥ１０−１０１タンパク質では確認されなかった（表１１）。

以上の結果から、ＨｕＥ１０−１０１ Ｎ−末端配列確認試験を通じて重鎖のＮ−末端配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲ確認され、軽鎖のＮ−末端配列は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ確認され、特異的変形は確認されなかった。

７−１−２．ペプチド分析
ＨｕＥ１０−１０１の構造的特性糾明のために、プロテアーゼ（トリプシン）処理後、ＬＣ‐ＭＳペプチドマッピング分析法を利用して理論的アミノ酸配列の同質性を確認した。

理論的タンパク質アミノ酸予想配列と９８％以上の同一の配列で確認され、一部のアミノ酸で化学結合による変形が発生したが、これは、実験及び分析過程で出ることができる量において非常に少ないものであった。

ＨｕＥ１０−１０１試料をＴＣＡで沈積して保存バッファーを除去し、５Ｍウレアを処理して変性させた。その後、トリプシンを処理して抗体をペプチド断辺に切断させた後、ＰＮＧａｓｅ−Ｆを入れて脱グリコシル化させた。最後に、ＤＴＴを入れて二硫化結合を除去した後、ＬＣ−ＭＳでペプチド分析実験を行った。

ＨｕＥ１０−１０１の全体分子量は、約１９０ＫＤａの巨大タンパク質であって、重鎖と軽鎖でそれぞれ構成されている。全体アミノ酸は、９１９個で構成され、重鎖は７０５個、軽鎖は２１４個で構成される（配列リスト第５９配列及び第６０配列）。通常の抗体タンパク質は、１５０ｋＤａ分子量であるが、ＨｕＥ１０−１０１タンパク質は、重鎖のＣ−末端４５１リシン後に重鎖の可変配列がさらに結合された。

ＨｕＥ１０−１０１タンパク質の重鎖／軽鎖の構造的特性分析のために、ＨｕＥ１０−１０１タンパク質配列をプロテアーゼによって切断された理論的ペプチド分子量と実際ＨｕＥ１０−１０１タンパク質のＬＣ‐ＭＳクロマトグラムプロファイルから出たペプチドピークがアサンされたペプチド分子量を基準として当該ペプチドの質量の一致度で分析した。図２０は、分析試料ＨｕＥ１０−１０１のペプチドマッピング分析結果であって、ＨｕＥ１０−１０１抗体から由来するトリプティクペプチドの溶出されるＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。
ＨｕＥ１０−１０１タンパク質由来ペプチドの個数が多いため、図２０ａ及び図２０ｂにそれぞれ溶出される時間に分けてペプチドピークのアサイン結果を示した。

理論的なＨｕＥ１０−１０１抗体タンパク質の重鎖と軽鎖配列のトリプティクペプチド分子量とＬＣ−ＭＳクロマトグラムで検出されたペプチドの分子量とシーケンシング結果を整理したものである。トリプシンを利用したペプチドマッピング分析で１．９％の抗体タンパク質の配列を確認しなかった。これは、タンパク質をプロテアーゼで切断する場合に、切断されたペプチドのサイズが非常に小さいか、特定ペプチドのシグナルが非常に弱く検出されるからである。また、抗体タンパク質に予測不可能なＰＴＭ（ｐｏｓｔ‐ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されている場合、質量値のみを基準として確認することはできない。このような予測不可能なペプチドは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでペプチドシーケンシングをして最終確認した。表１６と表１７で理論的なトリプティクペプチドの分子量より差異を示すペプチドを確認することができ、重鎖で７個、軽鎖で３個の変形ペプチドを確認した。表１２と表１３の変形されたペプチドの同定は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを進行して、最終ｄｅ ｎｏｖｏシーケンシングを通じて配列内の変化を確認した。上記結果から、重鎖と軽鎖は、共通的にアスパラギンアミノ酸に脱アミン化形態と一部化合物の結合形態も確認された。

図２０でＬＣ−ＭＳ／ＭＳｄｅ ｎｏｖｏシーケンシングした結果のように、ペプチドに化合物の結合が確認された。図２０ａで、ＨＴ２４（ｍ）（ｄｅ）ペプチドは、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫのペプチドでＮ−末端に４３Ｄａに該当する化合物が結合されており、３１９番アスパラギンアミノ酸が脱アミン化で変形されていた。図２０ｂのＬＴ１３（ｍ）ペプチドは、理論的分子量に比べて４３Ｄａが増加した化学結合ペプチドと確認された。ペプチドペブピングテーブルで確認された残りの変形されたペプチドは、上記のようなＬＣ−ＭＳ／ＭＳペプチドシーケンシング方法で最終確認した（図２１）。

したがって、全体アミノ酸（重鎖と軽鎖）９１９個のうち９０２個のアミノ酸がＨｕＥ１０−１０１タンパク質の重鎖／軽鎖のアミノ酸と一致することを確認した。最終分析後、全体配列カバレッジは、９８．１％と確認された。

以上の結果から、ＨｕＥ１０−１０１に対するペプチドマッピング分析を通じてアミノ酸中心構造で９８．１％同一の構造を有し、一部に限って化学結合されたペプチドとアスパラギンアミノ酸に弱く脱アミン化されたことを確認した。

７−２−１．ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分析
本実験は、ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）を利用して試料の２次構造を予測しようとした。ＣＤ分析して得たＦａｒ−ＵＶデータをＪＡＳＣＯ社の２次構造予測プログラムを利用して２次構造予測を行った（図２２）。

図２２から分かるように、３００−２００ｎｍのｆａｒ−ＵＶ分析結果、ＨｕＥ１０−１０１試料は、ベータ７７．９％、ターン２２．１％の比率で存在することを確認した。

７−２−２．ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析
ＨｕＥ１０−１０１の抗原に対する結合力分析のために、ＳＰＲ装備中の１つであるバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社のＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６を利用した。抗原であるＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０を別にコーティングして、抗体の結合力を分析した結果、ＨｕＥ１０−１０１は、ＴＮＦ−αに対しては、０．１９５ｎＭ、ＣＸＣＬ１０に対しては、３．５４ｎＭの結合力を示した。対照群として使用したＨｕｍｉｒａの場合は、ＴＮＦ−αのみに対して０．１１６ｎＭの結合力を示すだけで、ＣＸＣＬ１０に対しては予想どおり結合しなかった。

ＸＰＲ ＧＬＣチップ２個のチャンネルに１００ｎＭのＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０をそれぞれコーティングし、抗体を流す方式で結合力評価を行った。測定のためにＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ ３６にＧＬＣチップを５０％グリセロールを使用して初期化させた後、２５℃条件でランニングバッファーＰＢＳＴ（１０ｍＭ Ｎａ−ホスフェート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を流して、ｃｈｉｐを安定化させた。ＧＬＣ ５個チャンネルに０．０４Ｍ Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）と０．００１Ｍ ｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）を１：１比率で３０μｌ／分の流速で２２０μｌの量を流して、チャンネルを活性化させた。引き続いて、１００ｎＭのＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０は、ｐＨ５．５アセテートバッファーを使用して３０μｌ／分の速度でコーティングした。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で活性化されたチップを不活性化させた。固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）レベルが８００ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔｓ）であることを確認した。ＰＢＳ／Ｔで基準を定めた後、ＨｕＥ１０−１０１またはＨｕｍｉｒａ抗体を５ｎＭから１／２ずつ希釈した５個の一連の濃度を作って、コーティングされた所に流すことによってＫＤ値を求めた。

ＸＰＲ ＧＬＣチップに１００ｎＭのＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０をコーティングし、ＨｕｍｉｒａまたはＨｕＥ１０−１０１を５ｎＭから１／２ずつ希釈して５個の濃度を流した結果、図２３のようなセンソグラムを得た。

図２３から分かるように、Ｈｕｍｉｒａは、抗原であるＴＮＦ−αには良好に結合するが、ＣＸＣＬ１０には全然付着しない結果を示した一方で、ＨｕＥ１０−１０１は、ＴＮＦ−αだけだけでなく、ＣＸＣＬ１０にも良好に付着する二重抗体であることを再確認した。

表１４は、図２３のセンソグラムから得られた各抗原に対する抗体のＫＤ値の測定結果である。ｋａは、結合定数を示し、ｋｄは、解離定数、そしてＫＤは、解離定数であって、ｋｄ値をｋａで分けて得られた値である。Ｈｕｍｉｒａは、抗原であるＴＮＦ−αとの結合力だけが測定され、ＫＤは、０．１１６ｎＭと現われた。これとは異なって、二重抗体であるＨｕＥ１０−１０１は、ＴＮＦ−αの結合力はＨｕｍｉｒａと類似な０．１９５ｎＭを示し、そして、ＣＸＣＬ１０に対しては、これよりは多少弱い３．５４ｎＭのＫＤを示した。ＣＸＣＬ１０に対するＫＤの低い理由は、図２３と表１４の結果を総合して見れば、ｋｄがＴＮＦ−αとのそれに比べて多少低いことが原因であると認められる。

７−３．免疫化学的分析
７−３−１．ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
ＨｕＥ１０−１０１の抗原に対する免疫化学的分析のためにＥＬＩＳＡを行った。抗原であるＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０をそれぞれ別にコーティングして抗体の結合力を分析した結果、ＨｕＥ１０−１０１は、ＴＮＦ−αに対しては０．４９５ｎＭ、ＣＸＣＬ１０に対しては１．９ｎＭの結合力を示した。対照群として使用したＨｕｍｉｒａの場合は、ＴＮＦ−αのみに対して０．５ｎＭの結合力を示すだけで、ＣＸＣＬ１０に対しては予想どおり結合しなかった。

９６ウェルの免疫プレートに抗原であるＴＮＦ−αまたはＣＸＣＬ１０を１００ｎｇ／ウェルずつ入れて、４℃で一晩中コーティングした。５％スキムミルク２００μｌ／ウェルを入れ、２時間常温で培養した。その後、ＨｕＥ１０−１０１とＨｕｍｉｒａをそれぞれ５０ｎＭから１／２ずつ段階希釈して、１００μｌ／ウェルを入れ、２時間常温で培養した。２時間後、０．０５％ ＰＢＳＴ ２００μｌ／ウェルで３回洗浄した。そして、抗−ヒトＦＣ−ＨＲＰ（ｉｎ ｇｏａｔ）を１：１０００で１％スキムミルクＰＢＳに作った後、１００μｌ／ウェルを入れて１時間常温で培養した。その後、１時間後、０．０５％ ＰＢＳＴ ２００μｌ／ウェルで３回洗浄した。ＯＰＤ溶液を製造した後、１００μｌ／ウェルに入れた後、発色になれば、停止バッファーで反応を中止した後、４９２ｎｍ波長で測定した。

ＥＬＩＳＡを基盤とするＫＤ値を測定した結果、次のような結合親和度を確認した。測定値に対する信頼性を示すＲ２値が０．９７以上であって、すべての実験に対する信頼性が高いことを示した。結果から、ＨｕＥ１０−１０１は、ＴＮＦ−αとＣＸＣＬ１０の両方に良好に結合する二重特異性（ｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体であることが確認された（図２３）。ＨｕＥ１０−測定された抗原結合力は、それぞれ４．５Ｘ１０^−１０Ｍ（０．４５ｎＭ）と１．９Ｘ１０^−９Ｍ（１．９ｎＭ）であることを確認した。一方、対照群であるＨｕｍｉｒａは、予想したとおり、ＴＮＦ−αには良好に結合したが、ＣＸＣＬ１０には全然結合しないことを確認した（図２４）。それに対する結合親和度は、１．５Ｘ１０^−１０Ｍ（０．１５ｎＭ）であって、ＨｕＥ１０−１０１と誤差範囲内で類似していた（表１５）。

実施例８：候補抗体の生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効能評価
８−１．ＴＮＦ−α抑制能評価
候補抗体のＴＮＦ−α抑制能を確認するために、ＴＮＦ−α受容体を有しているＷＥＨＩ１６４細胞を利用した抗−ＴＮＦ−α抑制能評価技法を確立した。
対照抗体としては、ヒュミラ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、候補抗体としては、ヒュミラ複製抗体（課題で開発したものである）、ＨｕＥ１０−１０１を使用した。それぞれの抗体濃度を１／２段階希釈した後、ｈＴＮＦ−αを添加して細胞培養した後ＭＴＴ（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）を添加して、５％ＣＯ_２、３７℃培養器で培養した後、細胞を溶解させた後、５９５ｎｍの波長で吸光度を測定した（図２５）。

分析結果、ヒュミラ複製抗体、ＨｕＥ１０−１０１、ＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１、ＨｕＩＬ２１Ｒ−１００（課題で開発したものである）で陽性対照群であるヒュミラより低い濃度でＴＮＦ−α抑制能があることが観察された。このような結果から、ＴＮＦ−αに対する候補抗体の抑制能がヒュミラに比べて向上することを確認した（図２５）。

８−２．ＣＸＣＬ１０抑制能評価
候補抗体の効能検証のために、トランスウェルシステムを利用した細胞走化能（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）実験技法を確立した。本発明者らが先行研究を通じてＣＸＣＬ１０によってＴ細胞の走化能が増加されると明らかにした結果に基づいて、ＣＸＣＬ１０によって増加した細胞走化能に抗−ＣＸＣＬ１０抗体であるＨｕＥ１０−１０１を処理したときの走化能の変化を観察した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を５．０μｍポアサイズ細胞培養トランスウェルに４時間培養し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の移動を確認した。実験群には、ＨｕＥ１０−１０１を５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌの濃度で上部と下部チャンバに処理し、ＣＸＣＬ１０によって増加する走化能条件を作るために、下部チャンバには、ｈＣＸＣＬ１０をさらに処理した。陽性対照群には、下部チャンバのみにｈＣＸＣＬ１０を単独で入れて、ＣＸＣＬ１０によって走化能が増加するかを確認した。その結果、陽性対照群（ＰＣ）より実験群での細胞移動が効果的に減少することを確認した（図２６）。

既存の破骨細胞分化実験では、Ｍ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬを直接添加して、大食細胞を破骨細胞に分化させる。しかし、ＣＸＣＬ１０刺激によってＣＤ４＋細胞から放出されるＲＡＮＫＬの量による破骨細胞分化の程度を分析するために、本発明者らは、ＣＤ４＋／ＣＤ１４＋同時培養システムを導入し、破骨細胞分化を誘導する実験条件を確立した（図２７）。

破骨細胞への分化抑制能を確認するために、血液で破骨細胞前駆細胞（ＣＤ１４＋）とＣＤ４＋細胞を分離した後、２つの細胞を同時培養システムを利用して破骨細胞分化を誘導し、ＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色を施行し、顕微鏡観察した（図２８）。

ＨｕＥ１０−１０１による破骨細胞分化抑制能を確認した結果、ヒュミラを使用した対照群（Ｇ−Ｉ）に比べて、ＴＮＦ−αとＣＸＣＬ１０刺激をそれぞれ単独で処理した群とＴＮＦ−αとＣＸＣＬ１０を一緒に刺激した同時培養システムで破骨細胞分化が濃度依存的ではないが、減少することを確認した（図２９）。

８−４．抗体のＴＮＦ−α中和能評価
生産細胞株で生産した抗体の効能を評価するために、２次年度に確立したＴＮＦ−α中和能評価を進行した。本実験には、ＴＮＦ−α受容体を有しているＷＥＨＩ１６４細胞を利用した。対照抗体としては、ｈｕｍｉｒａ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、実験群は、ＨｕＥ１０−１０１を使用した。それぞれの抗体濃度を１／２段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した後、再組み換えヒトＴＮＦ−αを添加して細胞培養した後、ＭＴＴ（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）を添加し、５％ＣＯ_２、３７℃培養器で培養した後、細胞を溶解させた後、５９５ｎｍの波長で吸光度を測定し、ＥＣ５０値を分析した。

分析結果、ＨｕＥ１０−１０１処理群において対照群であるｈｕｍｉｒａ®処理群より低い濃度でＴＮＦ−α中和能があることが最終確認した。また、２次年度に使用された抗体を比較したとき、新たに開発した生産細胞株で生産した抗体でのＴＮＦ−α中和能が向上することを確認した（図３０）。

実施例９：抗体の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）効能評価
９−１．ヒト化ＴＮＦマウスで二重抗体の効能評価
９−１−１．ヒト化ＴＮＦ形質転換マウス
１９９１年Ｋｅｆｆｅｒなどが確立したＴＮＦ形質転換マウスモデルは、ＴＮＦを抑制する役目をするＴＮＦ３’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）がないように操作して、ヒトＴＮＦ移植遺伝子をマウスに導入した。これにより、ＴＮＦの発現を増大させることによって、自発的に関節炎が誘導されるようにした。このような方法で誘導された関節炎は、リュウマチ関節炎と同様に、病理学的に滑膜の肥厚、関節腔内への炎症細胞の浸潤、パンヌス形成と軟骨と骨の破壊を示した。

ＴＮＦ形質転換マウスモデルは、ＴＮＦによって誘導される関節炎の発病機作の確認を通じてＴＮＦが関節炎の発病に重要な役目をすることを証明することができるきっかけを設けた。現在ＴＮＦと関連した治療剤の効能を評価するのにＴＮＦ形質転換マウスモデルが有用に活用されている。
したがって、本発明者らは、ＴＮＦに対する二重抗体の効能評価のために、ＴＮＦ形質転換マウスモデルを利用した。ＴＮＦ形質転換マウスモデルを利用した二重抗体効能評価は、ギリシア所在のＣＲＯ専門機関に依頼して進行した。効能評価に利用された系統は、Ｔｇ１９７であり、米国食品医薬局（ＦＤＡ）で勧告したリュウマチ関節炎に対するヒト抗体評価モデルのうち１つである。現在市販中のＴＮＦ−α拮抗剤であるＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ®）開発においてＴｇ１９７系統を利用した。

Ｔｇ１９７系統であるＴＮＦ形質転換マウスモデルの関節炎進行は、性別間に臨床的差異が現われず、疾病が進行されるにつれて、一般マウスと比較するとき、体重減少を示すことが特徴である。Ｔｇ１９７系統の組織を病理学的に分析して見れば、リュウマチ関節炎と非常に同様に炎症性浸潤、滑膜の肥厚、軟骨破壊、骨の浸食などを観察することができる。

Ｔｇ１９７系統のＴＮＦ形質転換マウスモデルは、実験開始３週目から病変が発生する。病変初期の３週目から６週目までのモデルは、予防効果を調べるために使用され、６週目から９週目までは、治療効果を調べるのに主に利用される。したがって、本実験の目的である二重抗体の効能を評価のために、評価期間は、３週目から９週目まで進行した。臨床的評価は、評価期間中の関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）と体重の変化測定を通じて進行された。

また、実験終了後には、組織病理学的評価を通じて関節炎の病変程度を評価した。リュウマチ性関節炎の組織病理学的特徴としては、関節滑膜細胞の過増殖とこれを原因とする軟骨組織の破壊が代表的な特徴である。マウス膝組織を分離してホルマリンに固定し、石灰質除去段階を経てパラフィンでブロックを製作し、マイクロトームを利用して４μｍの組織切片を製作した。Ｈ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色して、滑膜組織の炎症度（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、骨浸食程度（ｂｏｎｅ ｅｒｏｓｉｏｎ）、軟骨細胞破壊程度（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄａｍａｇｅ）、そして免疫細胞の浸潤（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などを調査した。この際、評価は、どんなサンプルであるか分からないように、ブラインドテストで進行した。組織病理学的評価（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）は、次の表を基準として評価した。

９−１−２．ヒト化ＴＮＦ形質転換マウスを利用した候補抗体の効能評価結果
既存に商用化されて広く使用されるヒュミラ１０ｍｇ／ｋｇと本発明者が開発したヒュミラ複製抗体を２ｍｇ、１０ｍｇ／ｋｇ容量でマウスに投与した後、、臨床的変化観察及び評価した。ヒュミラとヒュミラ複製抗体の関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）を測定した結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で１．４８であり、対照群であるヒュミラが１０ｍｇ／ｋｇの濃度であるとき、０．２２であった。ヒュミラ複製抗体の濃度がそれぞれ２ｍｇ、１０ｍｇ／ｋｇであるとき、０．６６、０．５２の数値を示した（図３１）。ＴＮＦ形質転換マウスモデルは、疾病が進行するにつれて、臨床的に相当な体重減少を示すことが特徴である。体重変化測定は、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）の測定日程と同一に進行した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群で１５．２６ｇであり、対照群であるヒュミラが１０ｍｇ／ｋｇの濃度であるとき、２０．２３ｇであった。ヒュミラ複製抗体の濃度がそれぞれ２ｍｇ、１０ｍｇ／ｋｇであるとき、１８．３ｇ、２０．５８ｇの数値を示した（図３２）。ヒュミラ複製抗体の臨床的評価結果対照群であるヒュミラと同様に、ヒュミラ複製抗体の濃度が増加するほど関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が減少し、明らかな体重増加を示した。
ＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１の効能評価のために、対照群としてヒュミラを使用し、実験群であるＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１をそれぞれ１ｍｇ、３ｍｇ、１０ｍｇ／ｋｇの容量でマウスに投与した後、臨床的変化観察及び評価した。ＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１の関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）を測定した結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群であるヒト対照群ＩｇＧで１．２７であり、対照群であるヒュミラが１０ｍｇ／ｋｇの濃度であるとき、０．２０であった。実験群であるＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１の濃度がそれぞれ１ｍｇ、３ｍｇ、１０ｍｇ／ｋｇであるとき、０．８９、０．７３、０．８８の数値を示した（図３３）。体重変化を測定した結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で１５．４ｇであり、対照群であるヒュミラの濃度が１０ｍｇ／ｋｇであるときは、２０．９ｇであった。実験群であるＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１の濃度がそれぞれ１ｍｇ、３ｍｇ、１０ｍｇ／ｋｇであるとき、１５．１ｇ、１６．０ｇ、１６．５ｇを示した（図３４）。

ＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１の臨床的評価結果、対照群であるヒュミラに比べてＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１の関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が有意に減少せず、明らかな体重増加を示さなかった。ＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１の先行結果とＴＮＦ形質転換マウスモデルを用いた効能評価結果に基づいてＨｕＩＬ２１Ｒ−１０１は、最終候補抗体群から除いた。

９−１−３．ヒト化ＴＮＦ形質転換マウスを利用した二重抗体の効能評価結果
対照群としてＨｕｍｉｒａ®を使用し、実験群であるＨｕＥ１０−１０１をそれぞれ６．９ｍｇ、１３．８ｍｇ／ｋｇの容量で対照群と質量対比同量でマウスに投与した後、、臨床的変化観察及び評価した。ＨｕＥ１０−１０１の関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）を測定した結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群であるＨｕｍａｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧで１．６５であり、対照群であるＨｕｍｉｒａ®が１０ｍｇ／ｋｇの濃度であるとき、０．０６であった。実験群であるＨｕＥ１０−１０１の濃度がそれぞれ６．９ｍｇ、１３．８ｍｇ／ｋｇであるとき、０．４１、０．０７の数値を示した（図３５）。

ＴＮＦ形質転換マウスモデルは、疾病が進行するにつれて、臨床的に相当な体重減少を示すことが特徴である。体重変化測定は、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）の測定日程と同一に進行した。その結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で１８．９２ｇであり、対照群であるＨｕｍｉｒａ®の濃度が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、２３．３８ｇであった。実験群であるＨｕＥ１０−１０１の濃度がそれぞれ６．９ｍｇ、１３．８ｍｇ／ｋｇであるとき、２１．０８ｇ、２２．８０ｇを示した（図３６）。

ＨｕＥ１０−１０１の臨床的評価結果、対照群であるヒュミラ複製抗体と同様に、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が減少し、ＨｕＥ１０−１０１の濃度が増加することにつれて、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が減少する結果を得ることができた。また、体重変化を測定した結果、病変が進行されるにつれて減少した体重が、ヒュミラ複製抗体群と同様に、ＨｕＥ１０−１０１の投与濃度が増加するほど体重が増加することを観察した。

組織病理学的評価結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で３．７５であり、対照群であるＨｕｍｉｒａ®の濃度が１０ｍｇ／ｋｇであるとき、０．７５であった。実験群であるＨｕＥ１０−１０１の濃度がそれぞれ６．９ｍｇ、１３．８ｍｇ／ｋｇであるとき、１．８４、０．７５の数値を示した。薬物投与前、３週齢マウスは、１．３３の数値を示した。ＨｕＥ１０−１０１とＨｕｍｉｒａの組織病理学的評価結果、同等な効果を示すことを確認することができた（図３７）。

ＨｕＥ１０−１０１の組織病理学的評価と関節炎誘発点数結果を比較分析した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群は、それぞれ３．７５、１．６５、Ｈｕｍｉｒａ®群は、それぞれ０．７５、０．０６、ＨｕＥ１０−１０１を６．９ｍｇ／ｋｇの濃度で処理した群は、それぞれ１．８４、０．４１、ＨｕＥ１０−１０１を１３．８ｍｇ／ｋｇの濃度で処理した群は、それぞれ０．７５、０．０７．薬物投与前、３週齢マウスは、それぞれ１．３３、０の数値を示した。ＨｕＥ１０−１０１とＨｕｍｉｒａを治療剤として使用した場合、組織病理学的評価と関節炎誘発点数結果を比較したとき、２つの薬物が同等な治療効果を示すことを確認することができた（図３８）。

ＨｕＥ１０−１０１の臨床的評価結果、対照群であるＨｕｍｉｒａ®に比べて関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が有意に減少しなかったが、ＨｕＥ１０−１０１の濃度が増加するにつれて、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が減少する結果を得ることができた。

また、体重変化を測定した結果、病変が進行されるにつれて減少した体重が、Ｈｕｍｉｒａ群と同様に、ＨｕＥ１０−１０１の投与濃度が増加するほど体重が増加することを観察した。

９−１−４．ヒト化ＴＮＦ形質転換マウスを利用した生産細胞株で生産した二重抗体の効能評価結果
生産細胞株から生産した抗体の効能評価を確認するために、ＴＮＦ形質転換マウスモデルを利用した効能評価をさらに進行した。

再試行した実験条件の対照群としてｈｕｍｉｒａ®を使用し、実験群であるＨｕＥ１０−１０１は、１３．８ｍｇ／ｋｇの容量で一週間に２回及び３回投与する群に分けた。３．５週目から９．５週目までの体重変化と関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｓｃｏｒｅ）を測定した。その結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群は、１．４３、Ｈｕｍｉｒａ®群は、０．３４、ＨｕＥ１０−１０１をｈｕｍｉｒａ®と同等な回数で投与した群は、０．２８、ＨｕＥ１０−１０１を１週間に３回投与した群は、０．１９の数値を示した（図３９）。

体重変化測定は、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）の測定日程と同様に進行した。その結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で１５．８７ｇであり、Ｈｕｍｉｒａ®投与群は、２０．５０ｇであった。ｈｕｍｉｒａ®と同等な回数で投与した群は、１９．２１ｇ、１週間に３回投与した群は、２０．５８ｇを示した（図４０）。

ＨｕＥ１０−１０１のＨｕｍｉｒａ®群に比べて関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が有意に減少し、ＨｕＥ１０−１０１の濃度が増加するにつれて、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）が減少した。体重変化を測定した結果、病変が進行されるにつれて減少した体重が、Ｈｕｍｉｒａ群と同様に、ＨｕＥ１０−１０１の投与濃度が増加するほど体重が増加することを観察した（図４２）。

ＨｕＥ１０−１０１の組織病理学的評価結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で３．５３であり、Ｈｕｍｉｒａ®投与群は１．２２であった。ｈｕｍｉｒａ®と同等な回数で投与した群は、１．４４、１週間に３回投与した群は、０．７２の数値を示した。薬物投与前、３．５週齢マウスは、１．４４の数値を示した。ＨｕＥ１０−１０１とＨｕｍｉｒａ®の組織病理学的評価結果、ＨｕＥ１０−１０１を１週間に３回投与した群の組織病理学的評価数値が低く測定され、Ｈｕｍｉｒａ®より効果が良いを確認することができた（図４１、図４２）。

ＨｕＥ１０−１０１の組織病理学的評価と関節炎誘発点数結果を比較分析した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群は、それぞれ３．５３、１．４３５、Ｈｕｍｉｒａ®群は、それぞれ１．２２、０．３４、ＨｕＥ１０−１０１をｈｕｍｉｒａ®と同等な回数で投与した群は、それぞれ１．４４、０．２８、ＨｕＥ１０−１０１を１週間に３回投与した群は、それぞれ０．７２、０．１９．薬物投与前、３週齢マウスは、それぞれ１．４４、０．０６の数値を示した（図４３）。

ＨｕＥ１０−１０１とＨｕｍｉｒａ®を治療剤として使用したとき、組織病理学的評価と関節炎誘発点数結果を比較したとき、２つの薬物が同等以上の治療効果を示すことを確認することができた。

その後、マウス血清でサイトカインを測定し、組織を得て病理学的変化観察と統計学的分析も進行中にある。

９−２．Ｋ／ＢｘＮ血清を利用したマウスモデルで二重抗体の効能評価
９−２−１．Ｋ／ＢｘＮ自発性関節炎動物モデル（Ｋ／ＢｘＮ ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ）
関節炎（Ｋ／ＢｘＮ ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）マウスモデルは、ＢｅｎｏｉｓｔとＭａｔｈｉｓなどが確立し、Ｃ５７ＢＬ／６背景下のＫＲＮ ＴＣＲ形質転換マウスをＮＯＤ（ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウスと交配して得たモデルである。ＫＲＮＴＣＲ形質転換発病機作は、ＫＲＮ ＴＣＲがリボ核酸分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）だけでなく、グルコース６リン酸塩異性化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ６ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ＧＰＩ）２８２−２９４を認知するように抗原特異性を替えてＢ細胞によって生成される抗−ＧＰＩ抗体が関節炎の発生に核心的な役目をするようにしたものである。このモデルは、生後４週頃になれば、自然に関節炎がかかるようになって、Ｋ／ＢｘＮ自発性関節炎と命名され、関節炎の症状は、リュウマチ関節炎と類似な様相を示す。

Ｋ／ＢｘＮマウスの関節を病理学的に観察して見れば、リュウマチ関節炎患者とコラーゲン誘導関節炎モデルで現われる白血球浸潤、滑膜細胞の増殖、パンヌス形成、滑膜炎、骨と軟骨の破壊などの臨床的所見が観察され、免疫学的所見として、Ｂ細胞の多クローン活性、高ガンマグロブリン血症、自家抗体の生成などの特徴を示す。但し、リュウマチ関節炎の１つの指標として見なされるリュウマチ因子が現われないという点が、リュウマチ関節炎の症状と異なる点である。

本発明者らは、Ｋ／ＢｘＮ自発性関節炎マウスで採取された血清を投与すれば、関節炎を比較的容易に誘発させることができるという点と、実験期間が２週以内と短いという点に着目し、リュウマチ関節炎（Ｋ／ＢｘＮ ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）モデルを導入した。

９−２−２．Ｋ／ＢｘＮ自発性関節炎マウスモデルを利用した効能評価結果
実験に利用されたＫ／ＢｘＮ自発性関節炎マウスは、８週齢以上を利用し、採取された血清１５０μｌを６週齢以上のマウスにそれぞれｄａｙ ０、ｄａｙ ２に２回腹腔内に投与し、関節炎を誘導した。ｄａｙ １、ｄａｙ ３には、ＨｕＥ１０−１０１を投与した。

臨床的評価は、関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）と浮腫増加率評価を通じて確認した。Ｋ／ＢｘＮマウスの血清最終投与日以後、翌日から関節炎が誘発し、全体的に関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）と浮腫増加率は、最後の血清投与日から約８〜９日目に最高潮に至ってから、徐々に減少する様相を示した。

関節炎マウスモデルを通じて得た関節炎誘発点数結果、陰性対照群であるＫ／ＢｘＮ血清を投与しない群で０、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で７．８７、対照群であるヒュミラ複製抗体１０ｍｇ／ｋｇ濃度では、５．８３を示した。また、実験群であるＨｕＥ１０−１０１の１０ｍｇ／ｋｇ濃度であるとき、４の数値を示した（図４４）。浮腫増加率の評価結果、陰性対照群であるＫ／ＢｘＮ血清を投与しない群で３．８３、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で２３．３４、対照群であるヒュミラ複製抗体１０ｍｇ／ｋｇ濃度では、１６．５８を示した。実験群であるＨｕＥ１０−１０１の１０ｍｇ／ｋｇ濃度であるとき、１３．６７の数値を示した（図４５）。Ｋ／ＢｘＮ血清を利用したマウスモデルを利用したＨｕＥ１０−１０１の臨床的評価結果、対照群であるヒュミラ複製抗体より関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）と浮腫増加率が減少することを観察した（図４６）。

また、実験が終わったＫ／ＢｘＮ血清トランスファー関節炎マウスモデルの骨関節の状態を分析するために、マウス下肢の関節をマイクロＣＴ（ＮａｎｏＦｏｃｕｓＲａｙ）装備で分析した。その結果、関節炎を誘導したＶｅｈｉｃｌｅ群は、関節の形態が不規則に変わり、骨の破壊がかなり進行されていることが分かった。これに比べて、対照群であるｈｕｍｉｒａ複製抗体処理群、実験群であるＨｕＥ１０−１０１処理した群は、骨の破壊がｖｅｈｉｃｌｅに比べて著しく減少したことを確認した。特に実験群は、陰性対照群であるＫ／ＢｘＮ血清を投与しない群と同様に、骨の破壊がほとんど観察されなかった（図４７）。

形態学的な変化が組織病理学的変化でも観察されるかを確認するために、実験が終わったＫ／ＢｘＮ血清トランスファー関節炎マウスモデルの組織を得て、組織病理学的分析を進行した。Ｈ＆Ｅで組織を染色して確認した結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、関節周囲の浮腫と多形白血球、リンパ球などの浸潤が顕著に現われ、滑膜の炎症、肥厚、関節面の軟骨損失を観察することができた。一方、ｈｕｍｉｒａ複製抗体処理群、ＨｕＥ１０−１０１処理した群では、関節の炎症反応、軟骨の破壊が顕著に抑制された。Ｈ＆Ｅで染色した写真を分析し、滑膜組織の炎症度（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、骨浸食程度（ｂｏｎｅ ｅｒｏｓｉｏｎ）、軟骨細胞破壊程度（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄａｍａｇｅ）。免疫細胞の浸潤（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をそれぞれ分析した。その結果、滑膜組織の炎症度（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、骨浸食程度（ｂｏｎｅ ｅｒｏｓｉｏｎ）、軟骨細胞破壊程度（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄａｍａｇｅ）、免疫細胞の浸潤（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の４種がいずれもＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて減少する様相を示し、対照群であるｈｕｍｉｒａを処理した群よりＨｕＥ１０−１０１を処理した群において統計的に有意に減少することを確認した（図４８）。

９−３．ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルを利用した二重抗体の効能評価
９−３−１．ＬＰＳ−誘導頭蓋骨骨吸収（ＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｌｖａｒｉａｌ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）
１９９５年Ｎｉｓｈｉｈａｒａなどが確立した動物モデルで炎症性骨破壊の病因因子であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を利用して炎症性骨消失を誘導する方法である。

ＬＰＳによる骨損失の増加は、機作に対して詳らかに明らかにされていないが、造骨細胞でＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ４）を用いたＭｙＤ８８（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ８８）を活性化させ、骨吸収に関与する信号伝達物質であるＩＬ−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＧＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）、ＮＯ（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）などの分泌を促進して、造骨細胞でＲＡＮＫＬの発現を促進し、破骨細胞の分化を誘導するものと報告されている。

ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルの最大の長所は、関節炎マウスモデル（Ｋ／ＢｘＮ ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ）と同様に、比較的短期間内にモデル構築が可能であるという点である。ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルは、ＬＰＳをマウス頭蓋骨に単回投与して炎症を誘導する。その後、５日間毎日ＨｕＥ１０−１０１を頭蓋骨に投与する（図４９）。ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失可否は、マイクロＣＴ撮影を用いた頭蓋骨分析を通じて確認した。その結果、ＬＰＳを投与して骨消失を誘導したＶｅｈｉｃｌｅ群と対照群であるｈｕｍｉｒａ複製抗体処理群、実験群であるＨｕＥ１０−１０１処理した群、陰性対照群である（ｎｏｒｍａｌ）ＬＰＳを投与しない群医頭蓋骨消失くらいを確認した。その結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で頭蓋骨消失が著しく現われることを確認した。また、ｈｕｍｉｒａ複製抗体処理群と実験群であるＨｕＥ１０−１０１を処理した群では頭蓋骨消失がＶｅｈｉｃｌｅに比べて著しくガムソドエムを確認した。結論的に、ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルを利用してＨｕＥ１０−１０１の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での破骨細胞分化能を評価した結果、ＨｕＥ１０−１０１がｈｕｍｉｒａに比べて破骨細胞分化を効果的に抑制することを確認することができた（図５０）。

生産細胞株から生産した抗体の効能評価を確認するために、ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルを利用した効能評価をさらに進行した。

その結果、ＬＰＳで骨消失を誘導し、抗体組成バッファーだけを入れたＶｅｈｉｃｌｅ群と対照群であるｈｕｍｉｒａ®処理群、ＨｕＥ１０−１０１処理した群、ＬＰＳを投与しない陰性対照群である（ｎｏｒｍａｌ）群の頭蓋骨消失程度を確認した。その結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群で頭蓋骨消失が増加することを確認した。ｈｕｍｉｒａ処理群とＨｕＥ１０−１０１を処理した群においてＶｅｈｉｃｌｅに比べて頭蓋骨の消失が著しく減少することを確認した（図５１）。

頭蓋骨の消失に対する綿密な分析のために、骨消失面積をイメージ分析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて確認した。その結果、陰性対照群に比べてＶｅｈｉｃｌｅ群は、２．３５倍程度骨消失が増加し、一方、ｈｕｍｉｒａ®を処理した群は、陰性対照群に比べて２．１５倍程度骨消失を示し、ｖｅｈｉｃｌｅに比べて０．９倍であった。ＨｕＥ１０−１０１は、陰性対照群に比べて１．２倍（Ｐ ｖａｌｕｅ：０．０４２８）程度骨消失を示し、ｖｅｈｉｃｌｅに比べて０．５倍であり、４８．７９％程度減少することを確認した（図５２）。

ＬＰＳで誘導された炎症性骨消失マウスモデルを利用して生産細胞株から生産したＨｕＥ１０−１０１の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での破骨細胞分化能を評価した結果、先行研究の結果と同様に、ＨｕＥ１０−１０１がｈｕｍｉｒａ®に比べて破骨細胞分化を効果的に抑制することを確認することができた。

９−５．コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルで二重抗体の効能評価
１９７７年にＴｒｅｎｔｈａｍなどによって確立されたコラーゲン誘導性関節炎は、現在最も広く使用されているリュウマチ関節炎の代表的な自家免疫性関節炎モデルである。リュウマチ関節炎患者の血清でコラーゲンに対する抗体が発見され、関節に存在するタイプIIコラーゲンが自家抗原として作用することができるという点に着目した。

コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルの特徴は、臨床的な所見が人のリュウマチ関節炎と全般的に類似しているという点である。類似性を有するものは、クラスII ＭＨＣハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）との連関性、自家抗原に特異的なＴ、Ｂ細胞反応による適応免疫を反映する発病機作、関節組織破壊に自家抗体と補体係の関与、滑膜細胞の増殖とリンパ球の浸潤及びパンヌス形成などがある。

本発明者らは、先行研究を通じてリュウマチ関節炎の動物モデルであるコラーゲン誘導性関節炎でＣＸＣＬ１０が増加するという結果を確認したことがある。また、ＣＸＣＬ１０抑制抗体によるコラーゲン誘導関節炎の症状抑制実験を通じてＣＸＣＬ１０がリュウマチ関節炎による骨吸収及び破骨細胞分化促進因子に関与することを糾明した。

コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルは、４℃下で酢酸（０．０５〜０．１Ｍ）で牛型（ｂｏｖｉｎｅ−ｔｙｐｅ）IIコラーゲン（２、４ｍｇ／ｍＬ）を溶解し、同等な量のフロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）で懸濁した。懸濁物質０．１ｍＬを雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（５−９週齢）のしっぽ基底部に皮下投与（ｆｉｒｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、３週後に懸濁物質（０．１〜０．２ｍｌ）をしっぽ基底部に追加（ｂｏｏｓｔｅｒ ｏｒ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に皮下投与した（図５３）。

コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルの臨床的評価は、ＴＮＦ形質転換マウスモデルを利用した効能評価と同一基準で関節炎誘発点数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）で評価し、追加に病理学的検査及び免疫染色、炎症性サイトカインなどの測定を並行して評価する予定である。

実施例１０：抗体の交差反応性試験
抗体医薬品は、標的細胞以外のヒト細胞や組織に同一であるか、関連された抗原決定部位が発現された場合、組織に抗体が結合してもよい。

交差反応性または非標的組織に対する結合可否を糾明するために、常時ヒト組織に対する交差反応性研究を非臨床段階で行わなければならないと、単クローン抗体医薬品の評価ガイド（ＫＦＤＡ、２００５）に明示されていて、抗体医薬品の組織交差反応試験（ＫＦＤＡ、２０１３）ガイドラインを参考して交差反応性試験を進行した。免疫組織化学染色法でＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを利用し、重複されない３人の３２種の組織を利用して交差反応を確認した。その結果、ＨｕＥ１０−１０１が他の組織に非特異的に結合しないことを確認することができた（図５４）。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者においてこのような具体的な技術は、ただ好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義される。

Claims (19)

1. ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）に特異的に結合する第１抗原結合部位、及びＣＸＣＬ１０（Ｃ−Ｘ−Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ １０）に特異的に結合する第２抗原結合部位を含み、
   上記第１抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸を含む重鎖相補性決定領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈｉａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＨＣＤＲ）１、配列番号２のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号５のアミノ酸を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈｉａｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＬＣＤＲ）１、配列番号６のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備え、
   上記第２抗原結合部位は、配列番号９、配列番号１７、配列番号２１及び配列番号２５よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２及び配列番号２６よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２３及び配列番号２７よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号１３、配列番号２９、配列番号３３及び配列番号３７よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４、配列番号３０、配列番号３４及び配列番号３８よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号１５、配列番号３１、配列番号３５及び配列番号３９よりなる群から選択されるアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えるＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
2. 上記第１抗原結合部位は、配列番号４のアミノ酸を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
3. 上記第１抗原結合部位は配列番号８のアミノ酸を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
4. 上記第２抗原結合部位は、配列番号１２のアミノ酸を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
5. 上記第２抗原結合部位は、配列番号１６のアミノ酸を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
6. 上記第２抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号１１のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号１３のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号１５のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
7. 上記第２抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号２９のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号３０のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号３１のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
8. 上記第２抗原結合部位は、配列番号２１のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号２３のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号３３のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号３５のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
9. 上記第２抗原結合部位は、配列番号２５のアミノ酸を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７のアミノ酸を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を備え、配列番号３７のアミノ酸を含むＬＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸を含むＬＣＤＲ２、配列番号３９のアミノ酸を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
10. 上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−αに特異的に結合する第１全長抗体の重鎖及び軽鎖と；ＣＸＣＬ１０に特異的に結合する第２全長抗体の重鎖及び軽鎖と；を含み、上記第１全長抗体及び第２全長抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端が互いに連結されていることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
11. 上記ＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体は、ＴＮＦ−αに特異的に結合する第１全長抗体の重鎖及び軽鎖；及びＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、第２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２全長抗体の断片を含み、上記第１全長抗体の重鎖不変領域Ｃ−末端に第２抗体の断片が連結されていることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
12. 上記抗体の断片は、単一鎖可変分節（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）であることを特徴とする請求項１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
13. 抗体−抗体または抗体−断片間の連結は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結されることを特徴とする請求項１０または１１に記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体。
14. 請求項１に記載の第１抗原結合部位をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び第２抗原結合部位をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを共同形質感染（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させる形質転換体。
15. 次の段階を含むＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ１０二重ターゲット抗体の製造方法：
    （ａ）請求項１４に記載の形質転換体を培養する段階；及び
    （ｂ）上記段階（ａ）で培養された培養液から請求項１に記載の抗体を精製する段階。
16. （ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む免疫疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
17. 上記免疫疾患は、自家免疫疾患、炎症性疾患、細胞、組織または器官の移植拒否（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）であることを特徴とする請求項１６に記載の免疫疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
18. 上記自家免疫疾患または炎症性疾患は、リューマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、慢性閉塞性気管支疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）及び湿疹（ｅｃｚｅｍａ）から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の免疫疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
19. 有効成分として請求項１〜１３のいずれかに記載のＴＮＦ−α／ＣＸＣＬ−１０二重ターゲット抗体を含む組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む免疫疾患の予防または治療方法。