ES2331004T3

ES2331004T3 - Moleculas biologicas conjugadas y su preparacion.

Info

Publication number: ES2331004T3
Application number: ES04743335T
Authority: ES
Inventors: Antony Robert Godwin; Elisa Pedone; Ji-Won Choi; Sunil Shaunak; Stephen James Brocchini
Original assignee: Polytherics Ltd
Current assignee: Abzena UK Ltd
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2004-07-12
Publication date: 2009-12-18
Anticipated expiration: 2024-07-12
Also published as: EP2277550A1; CN101792525A; EP1648518B1; JP4958549B2; AU2010257308A1; JP2012021003A; US20090298154A1; WO2005007197A3; PL1648518T3; EP2133099A3; CN101792525B; EP1648518A2; EP2277550B1; US7595292B2; KR20060054286A; EP2253330A3; US8816051B2; DE602004022824D1; JP5349552B2; AU2004257448A1

Abstract

Un compuesto de la fórmula general **(Ver fórmula)** en la que uno de X y X'' representa un homopolímero o copolímero seleccionado entre el grupo constituido por polialquilenglicoles, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polioxazolinas, poli(alcoholes de vinilo), poliacrilamidas, polimetacrilamidas, copolímeros de HPMA, poliésteres, poliacetales, poli(orto ésteres), policarbonatos, poliiminocarbonatos, copolímeros de divinil éter-anhídrido maleico o estireno-anhídrido maleico, polisacáridos, o poli(ácidos glutámicos), estando opcionalmente derivatizado o funcionalizado cualquiera de los mencionados homopolímeros o copolímeros; y el otro representa un átomo de hidrógeno; cada Q representa independientemente un grupo conector; W representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-, o un grupo obtenido por reducción de un grupo de los mencionados; o, si X'' representa un polímero, X-Q-W- juntos representan un grupo ciano; Z representa una proteína que está unida a A y B por dos grupos tiol que se han obtenido de un puente disulfuro en la proteína; A es una cadena alquileno o alquenileno C1-5 y B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4.

Description

Moléculas biológicas conjugadas y su preparación.

Esta invención se refiere a moléculas biológicas conjugadas y a su preparación a partir de nuevos derivados químicamente funcionalizados de polímeros tales como polietilenglicol.

Muchas moléculas terapéuticamente activas no tienen las propiedades requeridas para lograr eficacia en el uso médico clínico. Por ejemplo, se están descubriendo ahora y produciendo por la industria farmacéutica y por ingeniería genética proteínas y polipéptidos terapéuticamente activos. Aunque en la actualidad se comercializan en los Estados Unidos como mínimo 80 medicinas basadas en proteínas y hay como mínimo 350 medicinas más basadas en proteínas sometidas a ensayos clínicos (Harris J., Chess R: Effect of Pegylation on Pharmaceuticals, Nature Review Drug Discovery, 2003, 2, 214-221), la mayoría de las proteínas naturales no permiten hacer medicinas porque, después de administración a pacientes, hay varios inconvenientes inherentes entre los que están incluidos: las proteínas son digeridas por muchas endopeptidasas y exopeptidasas presentes en la sangre o en tejidos, (2) muchas proteínas son inmunógenas en cierta cuantía y (3) las proteínas pueden ser rápidamente excretadas por ultrafiltración en el riñón. Entre otras moléculas usadas como agentes terapéuticos activos en medicinas que son sistémicamente tóxicas o carecen de biodisponibilidad y propiedades farmacocinética óptimas están incluidas moléculas de bajo peso molecular de las que una dosis eficaz está limitada por la toxicidad. Tales moléculas se usan rutinariamente para tratar la inflamación y afecciones debidas a neoplasias malignas, infección y enfermedad autoinmune.

Se usan polímeros sintéticos solubles en agua, en particular polialquilenglicoles, para conjugar moléculas terapéuticamente activas tales como proteínas. Estos conjugados terapéuticos han demostrado que alteran favorablemente la farmacocinética por prolongar el tiempo de circulación y disminuir la velocidad de depuración, disminuir la toxicidad sistémica y, en varios casos, presentar una eficacia clínica acrecentada. Este procedimiento de conjugar covalentemente polietilenglicol, PEG, a proteínas, se conoce comúnmente como "PEGilación", y se han examinado muchos polímeros diferentes como polímeros de conjugación.

Muchos reactivos polímeros para conjugación comprenden funcionalidad química de conjugación que es hidrolíticamente inestable. Son ejemplos de reactivos polímeros hidrolíticamente inestables de conjugación, ésteres activos que incluyen, por ejemplo, carbonatos de polióxido de alquileno-N-succinimida (Zalipsky, patente U.S. nº. 5.122.614). Estos reactivos tienen semividas relativamente cortas en medio acuoso, que incluye sangre o plasma. Esto da por resultado la necesidad de añadir excesos estequiométricos grandes del reactivo de conjugación del polímero. La estabilidad hidrolítica del reactivo es importante porque el requerimiento de añadir excesos estequiométricos para la conjugación de proteínas requiere un esfuerzo y un coste significativos para purificar el conjugado de polímero-proteína de la mezcla de reacción. Además, estos reactivos hidrolíticamente inestables tienden a reaccionar preferiblemente con la funcionalidad química amina de la proteína, en particular con la amina \varepsilon de los restos de lisina. Puesto que la mayoría de las proteínas de interés tienen más de un resto de lisina y, frecuentemente, muchos restos de lisina, la conjugación tiende a ser inespecífica en cuanto a que se produce en muchos sitios del resto en la proteína. Es posible purificar la mezcla de reacción de conjugación para aislar proteínas conjugadas a una molécula de polímero, aunque no es posible aislar a un coste razonable conjugados de polímero-proteína de los que la totalidad están conjugados al mismo grupo amina en la proteína. Frecuentemente, la conjugación no específica da por resultado una función proteínica empeorada. Por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con unión de poli(óxido de etileno) al azar mediante restos de lisina dan por resultado anticuerpos modificados (o fragmentos de anticuerpo modificados) capaces de unirse a antígeno diana con afinidad, avidez o especifidad reducida. Además, los reactivos de conjugación de amina específicos para polímeros requieren una condiciones de conjugación que deben seleccionarse para asegurar que las aminas de la proteína no sean protonadas. Estas condiciones requieren un medio con un pH moderadamente alto (8-10), que permite que los restos amina sean lo suficientemente reactivos para reaccionar con el reactivo de conjugación del polímero. Frecuentemente, las condiciones de un pH alto son perjudiciales para la proteína, causando cambios estructurales y desnaturalización. Esto procesos dan por resultado un empeoramiento de la función proteínica. Los reactivos específicos para la conjugación de polímeros a amina tienden a unirse a sitios accesibles de amina de la proteína. Estos reactivos se pueden llamar reactivos cinéticos. Son lábiles y reaccionan con la mayor parte de los sitios nucleófilos amino evaluables de la proteína. Los reactivos que conjugan polímeros específicos a amina que se conjugan por acilación de amina dan por resultado la pérdida de carga positiva en el grupo amina del resto de aminoácido de la proteína que normalmente estaría presente en condiciones fisiológicas para la proteína no conjugada. Estos rasgos de los reactivos de conjugación de polímeros específica a amina frecuentemente dan por resultado un empeoramiento de la función de la proteína. Otros grupos funcionales de conjugación incorporados en polímeros para conjugación a proteínas y que son aminaespecíficos y que con frecuencia son hidrolíticamente lábiles incluyen los isocianatos (documento WO 94/04193) y los carbonatos (documento WO 90/13540).

Es particularmente relevante para una eficacia optimizada y para asegurar la consistencia de dosis a dosis, cuidar de que el número de moléculas de polímero conjugadas por proteína sea el mismo y que cada molécula de polímero esté específicamente conjugada covalentemente al mismo resto de aminoácido en cada molécula de proteína. La conjugación no específica en sitios a lo largo de una molécula de proteína da por resultado una distribución de productos de conjugación y, frecuentemente, proteína no conjugada, obteniéndose una mezcla compleja que es difícil, laboriosa y cara de purificar.

\newpage

Se han desarrollado reactivos de conjugación de polímeros específica a tiol para proteínas con el fin tratar las limitaciones a la propensión de los reactivos de conjugación a experimentar hidrólisis que sea competitiva con la conjugación a la proteína, la conjugación no específica de polímero en diferentes restos de aminoácido de la proteína y la necesidad de condiciones de pH alto en la reacción de conjugación. Los reactivos de conjugación específica de polímeros a tiol se pueden utilizar a valores del pH próximos a la neutralidad a los que los restos funcionales amina de los restos de aminoácidos de la proteína se protonan y no pueden así competir eficazmente en la reacción de conjugación con el reactivo de conjugación del polímero. Los reactivos de conjugación específica de polímeros a tiol y que son relativamente más estables hidrolíticamente que los reactivos específicos a amina antes mencionados se pueden utilizar en un exceso estequiométrico menor, reduciendo así el coste durante la purificación del conjugado polímero-proteína. Entre los restos funcionales de conjugación que son ampliamente selectivos para grupos tiol están incluidos yodoacetamida, maleiimida (documento WO 92/16221), vinilsulfona (documentos WO 95/13312 y WO 95/34326), vinilpiridinas (documento WO 88/05433) y ésteres acrilato y metacrilato (documento WO 99/01469). Estos restos selectivos de conjugación de tiol dan un enlace individual de conjugación tioéter entre el polímero. El documento WO 99/01469 da a conocer un reactivo para proteínas de PEGilación que tiene un término ramificado y grupos reactivos proximales. La mayoría de las proteínas no tienen sulfhidrales libres porque estos sulfhidrales experimentan reacciones de transposición y desbarajuste con los puentes disulfuro dentro de la proteína dando por resultado una función proteínica empeorada. Para proteínas que tienen sulfhidrales libres, con frecuencia estos sulfhidrales son críticos para la función proteínica. Típicamente, en una proteína, el número de restos sulfhidrales es inferior al número de restos amina (por ejemplo, lisina o histadina). Puesto que la conjugación a una proteína puede hacerse que sea específica a grupos tiol y puesto que las proteínas típicamente no tienen grupos tiol libres, hay ejemplos de modificación específica del sitio de la proteína por mutagénesis para introducir sitios de tiol para la unión de PEG. Pero tales modificaciones aumentan los costes significativamente. El sulfhidral libre introducido puede tener limitaciones similares a las mencionadas antes en la proteína diseñada por ingeniería para arrastre y dimerización de la proteína. También el proceso de mutagénesis y producción de la proteína modificada de fuentes bacterianas frecuentemente causa que los sulfhidrales libres se unan en un enlace disulfuro con glutationa, por ejemplo. La interleuquina 2, por ejemplo, ha sido modificada por mutagénesis para reemplazar un resto de treonina por una cisteína para tener una unión específica al sitio de unión de PEG (Goodson RJ, Katre NV; Bio/Technology (1990) 8, 343-346).

Se sabe en la técnica que los parámetros de conjugación han de casar óptimamente con la molécula terapéuticamente activa de interés en términos de morfología del polímero, características del peso molecular, funcionalidad química. Aunque el conjugado de polímero-proteína puede presentar muchas propiedades favorables y necesarias para un uso seguro, médicamente eficaz, el efecto de la conjugación de polímero sobre la actividad y la estabilidad de la proteína es de vital importancia para el comportamiento. Las variables de conjugación relacionadas con el sitio y la cantidad de conjugación y las características del polímero se deben correlacionar óptimamente con las propiedades biológicas y fisicoquímicas.

Los inventores han encontrado ahora una serie de nuevos reactivos que se pueden usar para conjugar con ambos átomos de azufre de un enlace disulfuro en una proteína para obtener nuevos conjugados tioéter. La invención en su primer aspecto considera la conjugación de los dos átomos de azufre que forman puentes disulfuro naturales en proteínas nativas. Se encuentran enlaces disulfuro en proteínas médicamente relevantes, específicamente, proteínas secretoras, proteínas lisosomales, y los dominios exoplásmicos de proteínas de membrana. La tecnología proporciona ventajas claras sobre técnicas conocidas para conjugar polímeros a proteínas.

Consecuentemente, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula general I según se define en la reivindicación 1.

Un polímero X o X' puede ser, por ejemplo, un polialquilenglicol, una polivinilpirrolidona, un poliacrilato, por ejemplo, poliacriloilmorfolina, una polioxazolina, un poli(alcohol vinílico), una poliacrilamida o polimetilacrilamida, por ejemplo, policarboximetilacrilamida, o un copolímero de HPMA. Además, X o X' pueden ser un polímero que es susceptible de degradación enzimática o hidrolítica. Entre tales polímeros están incluidos, por ejemplo, poliésteres, poliacetales, poli(orto ésteres), policarbonatos y poli(iminocarbonatos). Un polímero X o X' puede ser un homopolímero, un copolímero al azar o un copolímero definido estructuralmente tal como un copolímero de bloque. Por ejemplo, X o X' pueden ser un copolímero de bloque derivado de dos o más óxidos de alquileno, o de poli(óxido de alquileno) y cualquiera de un poliéster, poliacetal o r poli(orto-éster). Entre los polímeros polifuncionales que se pueden usar están incluidos copolímeros de divinil éter-anhídrido maleico, y estireno-anhídrido maleico. También se pueden usar polímeros naturales, por ejemplo, polisacáridos tales como quitina, dextrano, dextrina, quitosano, almidón, celulosa, glicógeno, poli(ácido siálico), y derivados de ellos. También se pueden usar polímeros tales como ácido glutámico, como también polímeros híbridos derivados de monómeros naturales tales como sacáridos o aminoácidos y monómeros sintéticos tales como óxido de etileno o ácido metacrílico.

Si el copolímero es un polialquilenglicol, es preferible que éste contenga unidades C_{2} y/o C_{3}, y especialmente es un polietilenglicol. Un polímero,en particular un polialquilenglicol, pude contener una cadena individual lineal, o puede tener una morfología ramificada compuesta por muchas cadenas, pequeñas o grandes. Los denominados Pluronics son una clase importante de polímeros de bloque de PEG. Éstos son derivados de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno. Se pueden usar polialquilenglicoles sustituidos, por ejemplo, metoxipolietilenglicol. En una realización preferente de la invención, se inicia un polietilenglicol de cadena individual por un grupo adecuado, por ejemplo, un grupo alcoxi, por ejemplo metoxi, ariloxi, carboxi o hidroxilo, y se conecta en el otro extremo de la cadena al grupo conector Q.

El polímero X o X' opcionalmente se puede derivatizar o funcionalizar de cualquier manera que se desee. Por ejemplo, los polímeros con dos o más restos químicos para conjugación que son objeto de esta invención se pueden usar para crear conjugados de dos o más moléculas bioactivas unidas. Los grupos reactivos se pueden unir en el grupo terminal o final del polímero, o a lo largo de la cadena del polímero mediante conectores pendientes; en tal caso, el polímero es, por ejemplo, una poliacrilamida, polimetacrilamida, un poliacriato, polimetacrilato, o un copolímero de anhídrido maleico. Los conjugados multímeros que contienen más de una molécula biológica, típicamente un polipéptido biológicamente activo o fármaco, pueden dar por resultado beneficios sinérgicos y aditivos. Si se desea, se puede acoplar el polímero a un soporte sólido usando procedimientos convencionales.

El peso molecular óptimo del polímero dependerá, obviamente, de la aplicación prevista. Preferiblemente, el peso molecular numérico medio está en el intervalo de 500 g/mol a aproximadamente 75.000 g/mol. Cuando se pretende que el compuesto de la fórmula general I abandone la circulación y penetre en el tejido, por ejemplo, para uso en el tratamiento de una inflamación causada por una neoplasia maligna, infección o enfermedad autoinmune, o por trauma, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular más bajo, en el intervalo de 2000-30.000 g/mol. Para aplicaciones en las que se quiere que el compuesto de fórmula general I permanezca en circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular más alto, por ejemplo en el intervalo de 20.000-75.000 g/mol.

El polímero a usar se debe seleccionar de manera que el conjugado sea soluble en el medio disolvente para el uso previsto. Para aplicaciones biológicas, en particular para aplicaciones diagnósticas y aplicaciones terapéuticas para administración terapéutica a un paciente, el conjugado será soluble en el medio acuoso. Para conjugados destinados para uso en tales aplicaciones puede ser necesario que el conjugado sea soluble en uno de los medios, acuoso u orgánico, o en ambos. El polímero no debe perjudicar la función de la(s) molécula(s) biológica(s).

Un grupo conector Q puede ser, por ejemplo, un enlace directo, un grupo alquileno (preferiblemente un grupo alquileno C_{1-10}) o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, cualquiera de los cuales puede estar terminado o interrumpido por uno o varios átomos de oxígeno, átomos de azufre, grupos -NR (en los que R tiene el significado que se da más adelante), grupos ceto, grupos -O-CO- y/o grupos -CO-O-. Entre los grupos arilo adecuados están incluidos los grupos fenilo y naftilo, mientras que entre los grupos heteroarilo están incluidos piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina. La unión al polímero puede ser a través de un enlace hidrolíticamente lábil o un enlace no lábil.

Entre los sustituyentes que pueden estar presentes en un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido están incluidos, por ejemplo, uno o varios de sustituyentes, iguales o diferentes, seleccionados entre -CN, -NO_{2}, -CO_{2}, -COH, -CH_{2}OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO_{2}O, -SR, -SOR, -SO_{2}R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO_{2}R, -NR'CO_{2}R, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -N^{+}R_{3}, -N^{+}H_{3}, -N^{+}HR_{2}, -N^{+}H_{2}R, halógeno, por ejemplo flúor o cloro, -C\equivCR, -C=CR_{2} y -C=CHR, en los que cada R o R' representa un átomo de hidrógeno, o un grupo alquilo (preferiblemente alquilo C_{1-6}), o arilo (preferiblemente fenilo). Es especialmente preferida la presencia de sustituyentes aceptores de electrones.

W representa un grupo ceto o aldehído CO, un grupo éster -O-CO-, o un grupo sulfona -SO_{2}-, o un grupo obtenido por reducción de uno de tales grupos, por ejemplo un grupo CH.OH, un grupo éter CH.OR, un grupo éster CH.O.C(O)R, un grupo amina CH.NH_{2}, CH.NHR o CH.NR_{2}, o una amida CH.NHC(O)R o CH.N(C(O)R)_{2}. Si X' representa un polímero, X-Q-W juntos puede ser un grupo ciano.

Z deriva de una proteína. La proteína puede ser, por ejemplo, un polipéptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima, una citocina, quimiocina o un receptor. También se pueden usar polipéptidos constreñidos o cíclicos que usualmente se ciclan a través de un puente disulfuro, y epitopos. Más adelante se da una lista de ejemplos específicos de moléculas biológicas adecuadas. Se pueden generar dos grupos tiol por reducción de un puente disulfuro natural o diseñado por ingeniería (cisteína). Los grupos amina pueden ser, por ejemplo, restos de lisina.

La invención proporciona también un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula general I, de acuerdo con la reivindicación 7.

El grupo saliente L, o cada uno de ellos, puede representar, por ejemplo, -SR, SO_{2}R, -OSO_{2}R, -N^{+}R_{3}, -N^{+}HR_{2}, -N^{+}H_{2}R, halógeno o -O\diameter, en los que R tiene el significado dado antes y \diameter representa un grupo arilo sustituido, especialmente arilo que contiene como mínimo un sustituyente aceptor de electrones, por ejemplo, -CN, -NO_{2}, -CO_{2}R, -COH, -CH_{2}OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO_{2}R, -SR, -SOR, -SO_{2}R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO_{2}R, -NR'CO_{2}R,
-NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -N^{+}R_{3}, -N^{+}HR_{2}, -N^{+}H_{2}R, halógeno, especialmente cloro o, especialmente flúor, -C\equivCR, -C=CR_{2} y -C=CHR, en los que cada R y R' tienen el significado dado antes.

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Entre las estructuras típicas en las que W' y X juntos forman un anillo está incluida

1

en la que n es un número entero de 1 a 4 y

2

El procedimiento de acuerdo con la invención se realiza adecuadamente por reducción de un enlace disulfuro derivado de dos aminoácidos de cisteína de la proteína in situ, haciendo reaccionar seguidamente el producto reducido con el compuesto de fórmula (II) o (III). Los disulfuros se pueden reducir, por ejemplo, con ditiotreitiol, mercaptoetanol o tris-carboxietilfosfina usando procedimientos convencionales. El procedimiento se puede realizar en un disolvente o mezcla de disolventes en el que son solubles todos los reactantes. Se puede dejar que la proteína reaccione directamente con el compuesto de fórmula general II o III en un medio de reacción acuoso. Este medio de reacción se puede tamponar dependiendo de los requerimientos de pH del nucleófilo. Generalmente, el pH óptimo para la reacción es de entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8, por ejemplo de 7,4, preferiblemente de aproximadamente 6,0-6,5. Generalmente, las temperaturas de reacción entre 3 y 37ºC son adecuadas: las proteínas y otras moléculas biológicas se pueden descomponer o desnaturalizar con perjuicio de la función si la reacción de conjugación se efectúa a una temperatura a la que pueden producirse estos procesos. Las reacciones efectuadas en medio orgánico (por ejemplo, THF, acetato de etilo, acetona) típicamente se realizan a temperaturas hasta como máximo la ambiente, por ejemplo, a temperaturas por debajo de 0ºC.

Una proteína puede contener un puente disulfuro o una multiplicidad de puentes disulfuro. La reducción para que resulten restos sulfhidral libres se puede realizar para reducir un puente disulfuro o una multiplicidad de puentes disulfuro en una proteína. Dependiendo de la cuantía de la reducción de disulfuros y la estequiometría del reactivo polímero de conjugación que se usa, es posible conjugar una molécula o una multiplicidad de moléculas de polímero a la proteína.

Si se desea, se pueden usar agentes reductores inmovilizados para reducir menos de la totalidad de disulfuros, como también se puede reducir usando condiciones de reacción diferentes o añadiendo desnaturalizantes.

Un puente disulfuro puede ser intracatenario o intercatenario.

La proteína se puede conjugar efectivamente con los reactivos de la presente invención usando un equivalente estequiométrico o un ligero exceso de reactivo, a diferencia de muchos reactivos de la técnica anterior. Sin embargo, puesto que los reactivos de la presente invención no experimentan reacciones competitivas con el medio usado para solvatar proteínas, es posible llevar a cabo la reacción de conjugación con una estequiometría de reactivo en exceso. El reactivo en exceso puede eliminarse fácilmente por cromatografía de intercambio iónico durante la purificación rutinaria de proteínas.

Los compuestos de las fórmulas (II) y (III) definidos en la reivindicación 7 son nuevos y, consecuentemente, la invención proporciona además estos compuestos en sí. Estos nuevos reactivos proporcionan una ruptura en la tecnología de conjugados, comprendiendo el resto funcional químico en el polímero un resto funcionalizado cruzado, latentemente conjugado por cruce, de bisalquilación, que es selectivo para dos tioles derivados de un enlace disulfuro natural en proteínas.

El producto inmediato del procedimiento de acuerdo con la invención es un compuesto de la fórmula general I en la que W es un grupo aceptor de electrones. Tales compuestos son útiles en sí; porque el procedimiento de la invención es reversible en condiciones adecuadas; adicionalmente los compuestos de la fórmula (I) en la que W es un resto aceptor de electrones son útiles en aplicaciones en las que se requiere la liberación de la proteína libre, por ejemplo, en aplicaciones clínicas directas. Sin embargo, un resto W aceptor de electrones puede ser reducido, resultando un resto que impide la liberación de la proteína y tales compuestos serán también útiles en muchas aplicaciones clínicas, industriales y diagnósticas.

Así por ejemplo, un resto W que contiene un grupo ceto puede reducirse a un resto W que contiene un grupo CH(OH); se puede obtener un grupo éter CH.OR por reacción de un grupo hidroxi con un agente de eterificación; se puede obtener un grupo éster CH.O.C(O)R por reacción de un grupo hidroxi con un agente de acilación; se puede obtener un grupo amina CH.NH_{2}, CH.NHR o CH.NR_{2} a partir de una cetona o un aldehído por aminación reductora; o se puede formar una amida CH.NHC(O)R o CHN(C(O)R)_{2} por acilación de una amina. Un grupo X-Q-W que es un grupo ciano se puede reducir a un grupo amina.

Un compuesto de la fórmula general (II) en la que X representa un polímero se puede preparar haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula general

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en la que Q', W, A, B y L tienen el significado dado antes, con un polímero de la fórmula general

(VII)X-V

en la que X representa un polímero; siendo Q' y V grupos seleccionados de manera que los compuestos de fórmula (VI) y (VII) reaccionarán juntos dando el compuesto deseado de fórmula (II). Alternativamente, un compuesto de la fórmula

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4

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se puede hacer reaccionar con un polímero de la fórmula general

(IX)X-Q'

Se puede preparar un compuesto de la fórmula general (III) por eliminación mediada por una base de un grupo saliente L de un compuesto de la fórmula general (II).

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Los compuestos de la fórmula general I pueden incluir un agente de obtención de imágenes, por ejemplo, un radionucleótido, para poder seguir un compuesto in vivo. El radionucleótido o el agente de obtención de imágenes I se puede unir a través del grupo W para que resulten, por ejemplo, compuestos del tipo

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que se pueden preparar, por ejemplo, a partir de reactivos del tipo

6

por ejemplo

7

Los compuestos de la fórmula general I tienen varias aplicaciones. Se pueden usar, por ejemplo, para aplicación clínica directa a un paciente y, consecuentemente, la presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula general I junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además un compuesto de la fórmula I para uso como medicamento y un procedimiento para tratar un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de fórmula I o una composición de acuerdo con la invención. Eligiendo adecuadamente la proteína, se puede obtener cualquier efecto farmacéutico deseado, por ejemplo, tratamiento de un trauma, reemplazo de enzimas, eliminación de toxinas, antiinflamatorio, antiinfeccioso, inmunomodulador, vacunación o anticanceroso.

Los compuestos de la fórmula general I se pueden usar también en aplicaciones no clínicas. Por ejemplo, muchos compuestos fisiológicamente activos tales como enzimas son capaces de catalizar reacciones en disolventes orgánicos y los compuestos de fórmula general I se pueden usar en tales aplicaciones. Además, se pueden usar compuestos de la fórmula general I como herramientas diagnósticas.

Seguidamente se dan algunas proteínas específicas que pueden tener utilidad en la presente invención dependiendo de la aplicación deseada. Las enzimas incluyen enzimas específicas para carbohidratos, enzimas proteolíticas y similares. Las enzimas de interés, tanto para aplicaciones industriales (basadas en reacciones orgánicas) como biológicas en general y aplicaciones terapéuticas en particular incluyen las oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas consideradas desveladas en el documento US 4.179.337. Entre las enzimas específicas de interés están incluidas asparaginasa, arginasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, catalasa, quimotripsina, lipasa, uricasa, bilirrubinaoxidasa, glucosaoxidasa, glucoronidasa, galatosidasa, gluco-cerbrosidasa, glucoronidasa, glutaminasa.

Entre las proteínas usadas en compuestos de la fórmula general I de la presente invención están incluidos, por ejemplo, factor 8, insulina, ACTH, glucagén, somatostatina, somatotropinas, limosina, hormona paratiroide, hormonas pigmentarias, somatomedinas, eritropoyetina, hormona luteinizante, factores de liberación hipotalámica, hormonas antidiuréticas, prolactina, interleuquinas, interferones, factores estimulantes de colonias, hemoglobina, citoquinas, anticuerpos, corionicgonadotropina, hormona foliculoestimulante, hormona estimulante del tiroides y activante de tejido plasminógeno.

Ciertas de las proteínas anteriores, tales como interleuquinas, interferones y factores estimulantes de colonias, existen también en forma no glicosilada, usualmente resultado de la preparación por técnicas de proteínas recombinantes. Las versiones no glicosiladas se pueden usar en la presente invención.

Por ejemplo, para interferones, la invención permite la preparación de conjugados en los que la actividad fisiológica se retiene en comparación con Interferones no conjugados. Este muy sorprendente resultado no es posible usando técnicas de conjugación conocidas.

Otras proteínas de interés son proteínas alergenas descritas por Dreborg y otros, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6.315.365, como que tienen una alergenia reducida cuando se conjugan con un polímero tal como poli(óxido de alquileno) y que consecuentemente son adecuadas para uso como inductores de tolerancia. Entre los alergenos descritos están el antígeno de ambrosia E, el veneno de abeja obrera, el alergeno de ácaro y similares.

Son de interés glicopolipéptidos tales como inmunoglobulinas, ovalbumina, glucocerebrosidasa, lectinas, activante de tejido plaminógeno e interleuquinas glicosiladas, interferones y factores estimulantes de colonias, como lo son inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de ellas.

Son de interés particular anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se usan en medicina clínica a fines diagnósticos y terapéuticos. El anticuerpo se puede usar solo o se puede conjugar covalentemente ("cargar") con otro átomo o molécula tal como un radioisótopo a un fármaco citotóxico/antiinfeccioso. Para la vacunación se pueden usar epitopos para producir un conjugado de polímero inmunógeno/proteína.

Un rasgo clave del procedimiento de la invención es que un grupo saliente \alpha-metileno y un doble enlace se conjugan por cruce con una función aceptora de electrones que actúa como un resto activante de Michael. Si el grupo saliente es propenso a la eliminación en el reactivo crucifuncional más bien que a dirigir el desplazamiento y el grupo aceptor de electrones es un resto activante adecuado para la reacción de Michael, la reacción intramolecular secuencial de bisalquilación puede ocurrir por las reacciones consecutivas de Michael y retro Michael según se describe en J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 3098-3110 y J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 5211-5212). El grupo aceptor de electrones y el grupo saliente se seleccionan óptimamente de forma que la bisalquilación se pueda producir por las reacciones secuenciales de Michael y retro Míchael.

También es posible preparar agentes de alquilación crucifuncionales con múltiples enlaces adicionales conjugados al doble enlace o entre el grupo saliente y el grupo aceptor de electrones según se describe en J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 5211-5212.

Dado que los reactivos de alquilación crucifuncionalizados del tipo mencionado antes experimentan una alquilación que es controlada por equilibrios Michael-retro Michael y dado que es posible reducir parcialmente un número, desde uno a más de uno, de enlaces disulfuro en una proteína de modo controlado reteniendo sustancialmente la estructura terciaria, es posible conseguir que la bisalquilación ocurra a través de los dos sulfhidrales de cisteínas de un enlace disulfuro dado. Tal secuencia de reacciones da por resultado la condensación del puente disulfuro con el reactivo de bisalquilación.

Los enlaces tiol éter formados después de la conjugación para que resulte un compuesto de fórmula I son, generalmente, hidrolíticamente estables en solución acuosa. Los reactivos en sí son también hidrolíticamente estables. En este contexto, se considera que un compuesto es hidrolíticamente estable si no experimenta una degradación sustancial a pH fisiológico y una temperatura de hasta 45ºC. Se considera que una degradación de menos de 50% en estas condiciones en un período de 8 horas es no sustancial.

Se apreciará que la invención permite la producción de reactivos de polímeros que poseen funcionalidad de bisalquilacion crucifuncionalizada en cualquiera de los terminales o en cadenas pendientes a lo largo de la cadena principal de un polímero.

Entre algunos ejemplos de nuevos conjugados de acuerdo con la invención están incluidos los siguientes:

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y

9

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Entre algunos ejemplos de nuevos reactivos de acuerdo con la invención están incluidos los siguientes

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Los Ejemplos siguientes ilustran la invención. Las Figuras 1 a 5 muestran los resultados del Ejemplo 7.

Ejemplo 1 Síntesis de un reactivo de conjugación de polímero Hidrocloruro de p-nitro-3-piperidinopropriofenona: C_{14}H_{19}ClN_{2}O_{3}

Un matraz de fondo redondo de una boca, de 200 ml, se cargó con p-nitroacetofenona (16,5 g), paraformaldehído (4,5 g), hidrocloruro de piperidina (12,1 g), etanol absoluto (100 ml) y una barra de agitación magnética. A la mezcla heterogénea sometida a agitación se añadió ácido clorhídrico (al 37% en agua, 1 ml) y la solución se calentó a reflujo bajo nitrógeno. Después de un tiempo de 1-2 horas se añadió más paraformaldehído (3,0 g). La solución se mantuvo a reflujo durante aproximadamente 18 h, tiempo durante el cual se añadió más paraformaldehído (3,0 g). Después de dejar que la solución se enfriara, sedimentó un sólido cristalino que no se disolvería después de reflujo. Se aisló el sólido por filtración y se recristalizó usando metanol muy caliente, obteniéndose cristales amarillos grandes (10,9 g). RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 1,34-1,50 (m, 1H), 1,64-1,79 (m, 2H), 1,79-1,94 (m, 4H), 2,89-3,05 (m, 2H), 3,41 (q, 2H), 3,51-3,54 (m, 2H), 3,82 (t, 2H), 8,26 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,41 (s, 1H),8,44 (s, 1H).

3-(2-hidroxietiltiol)-p-nitropropiofenona

Una solución en agitación de hidrocloruro de p-nitro-3-piperidinopropiofenona (30 g, 0,1 mol) y mercaptoetanol (0,5 g, 0,12 mol) en etanol al 95% (200 ml) se calentó lentamente hasta homogeneidad. Se añadió piperidina (1,0 mol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 h. Después de enfriar, se rotoevaporó la mayor parte del disolvente, se añadió acetato de etilo (200 ml) y se separó el sólido por filtración. La solución de acetato de etilo se sometió a extracción secuencialmente con solución acuosa al 10% de HCl, solución de NaHCO_{3} al 5% y salmuera y luego se secó sobre Na_{2}SO_{4}; luego se evaporó el acetato de etilo, resultando un aceite que cristalizó, obteniéndose 23,2 g del producto deseado que se cristalizó en acetato de etilo-etil éter.

2,2-bis(p-toliltiolmetil)-p-nitroacetofenona: C_{24}H_{23}NO_{2}S_{2}

En un matraz de fondo redondo de 100 ml, de una boca, se añadió hidrocloruro de p-nitropiperidinopropiofenona (10,0 g), 4-metilbencenotiol (8,2 g), formaldehído (solución acuosa al 37% p/p, 10 ml, exceso), metanol (40 ml) y una barra de agitación magnética. La mezcla heterogénea en agitación se calentó hasta que se formó una solución homogénea amarilla (un par de minutos a 50-60ºC). Se añadieron luego 5 gotas de piperidina y la solución de reacción se calentó a reflujo. En 15 min la mezcla de reacción se hizo heterogénea debido a la presencia de algún sólido blanco/amarillo y, al cabo de 2 h, este sólido presentaba un color naranja fuerte. Al cabo de este tiempo se paró el reflujo y se dejó que la mezcla de reacción se enfriara durante la noche a temperatura ambiente. Luego se calentó nuevamente a reflujo la mezcla de reacción con más formaldehído (solución acuosa al 37% p/p, 10 ml, exceso). Después de tener en reflujo durante aproximadamente 30 min, era visible un aceite de color naranja y no se veía sólido alguno. El aceite sedimentó en el fondo del matraz cuando se paró la agitación. Después de otras 7 horas de reflujo, se dejó que la mezcla se enfriara durante la noche, lo que dio por resultado la cristalización del aceite sedimentado. Se aisló el sólido cristalino y se purificó por recristalización en metanol muy caliente habiendo añadido varias gotas de acetona, obteniéndose cristales amarillos (10,0 g). RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 2,31 (s, 6H), 3,31-3,33 (m, 4H), 3,97 (quintete, 1H), 7,14 (q, 8H), 7,80 (d, 2H), 8,24 (d, 2H).

2,2-bis(p-tolilsulfonlmetil)-p-nitroacetofenona: C_{24}H_{23}NO_{7}S_{2}

En un matraz de fondo redondo de 250 ml se agitó una suspensión de 2,2-bis(p-toliltiolmetil)-p-nitroacetofenona (2,5 g) y oxona (18,4 g) en metanol:agua 1:1 (100 ml) durante 16 h. Esto dio una suspensión de un sólido blanco a la que se añadió cloroformo (100 ml) y la fase orgánica resultante se aisló usando un embudo separador, dejando una suspensión de un sólido blanco dentro de la fase acuosa. A la fase acuosa se añadió más agua hasta que se formó una solución homogénea, que luego se lavó nuevamente con cloroformo (100 ml). Se combinaron las fases orgánicas, la combinación se lavó con salmuera (50 ml x 2), se secó con sulfato magnésico y se eliminó el disolvente, obteniéndose un producto sólido en bruto blancuzco después de secar en vacío (2,5 g). El producto se recristalizó en acetona, obteniéndose cristales blancos. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 3,43-3,62 (m, 4H), 4,44 (quintete, 1H), 7,35 (d, 4H), 7,68 (d, 4H), 7,88 (d, 2H), 8,22 (d, 2H). Análisis calculado para C_{24}H_{23}NO_{7}S_{2} (hallado): C 57,47 (57,27); H 4,62 (4,74); N 2,79 (2,58). MS (FAB) m/z 502 ([M+1]^{+}).

2-(2-hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4-pentadienofenona

Un matraz de fondo redondo secado a la llama, purgado con argón y provisto de termómetro y embudo de adición, se cargó con 3-(2-hidroxietiltiol)-p-nitropropiofenona (0,5 g, 2,0 mmol) y tetrahidrofurano anhidro (50,0 ml). Se agitó la solución y se enfrió en baño de hielo seco-acetona, luego se añadió con jeringa TiCl_{4} (0,23 ml, 2,1 mmol). Se retiró el baño de hielo y se dejó que la solución se calentara a temperatura ambiente, luego se enfrió a -40ºC y se añadió con jeringa diisopropiletilamina (1,1 ml). Se quitó el baño de enfriamiento y se dejó que la mezcla se calentara a entre -15ºC y 0ºC, adquiriendo color rojo. Luego la mezcla de reacción se calentó a 25ºC en un tiempo de 3-5 min y se añadió una solución de acroleína (0,14 g,2,1 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (20 ml), añadiéndolo a gotas en el embudo de adición en un período de 30-40 min. La reacción exotérmica causó que la temperatura de la mezcla de reacción subiera a 30-40ºC y la solución se agitó 20 min más después de la adición del aldehído antes de añadir acetato de etilo (75 ml). Se usó cromatografía en capa fina para confirmar la desaparición de la 3-(2-hidroxietiltiol)-p-nitropropiofenona de partida y la formación de la deseada 2-(2-hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4-penta-dienofenona (R_{f} -0,38-0,45). Se pudo observar el producto minoritario (isómero E) a R_{f} más bajo, en el intervalo de 0,29-0,34. La mezcla de reacción en acetato de etilo se sometió a extracción con HCl acuoso al 10% y salmuera. Se combinaron las capas acuosas y la combinación se sometió a extracción dos veces con acetato de etilo y todas las fracciones de acetato de etilo se lavaron dos veces con HCl acuoso al 10%, NaHCO_{3} acuoso al 5% y salmuera, luego se secaron sobre Na_{2}SO_{4} sólido. El acetato de etilo se rotoevaporó, obteniéndose la 2-(2-hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4-pentadienofenona en bruto como un aceite que se oxidó inmediatamente como para la síntesis de 2,2-bis(p-tolilsulfonlmetil)-p-nitroacetofenona, resultando la 2-(2-hidroxietilsulfonilmetil)-p-nitro-2(Z), 4-pentadienofenona como un sólido que se purificó por cromatografía en columna o se recristalizó en acetato de etilo o metanol y luego se unió covalentemente a polietilenglicol terminado en amino como se ha descrito en otro lugar en esta memoria.

La secuencia de reacciones anterior se realizó con muchos aldehídos, entre los que están incluidos acetaldehído, metacroleína, etacroleína, butiraldehído, crotonaldehído, 2,4-pentadienilo, sorbaldehído, tolualdehído, cinamaldehído, metilcinamaldehído, clorocinamaldehído, 5-fenil-2,4-pentadienal y 7-fenil-2,4,6-heptatrienal. Esta secuencia de reacciones se realizó con muchos cetoderivatizados, incluidos 3-(p-toliltiometil)-m-nitroacetofenona, 3-(2-hidroxi-etiltio)-m-nitropropriofenona, 3-(etiltiometil)-m-nitropropiofenona, 3-(dimetilamino-etltio)-m-nitropropiofenona, 3-(2-hidroxietiltio)-3-fenilpropriofenona, 3(2-hidroxi-etiltiol)-5-fenil-4(E)-pentenofenona, 3(etiltiometil-o-nitropropiofenona, 3(etiltio)-propiofenona, 3(2-hidroxietilsulfonil)propiofenona, 2-(3-(2-hidroxietiltio)-1-propenil)-m-2(E)-4-pentadienofenona. Esta secuencia de reacciones se realizó también con cetoderivatizados alifáticos, incluidos 4-(etiltio)-2-butanona, 4-(p-toliltio)-2-butanona, 4-(4-nitrofeniltio)-2-butanona, 4-(2-hidroxietiltio)-2-butanona y metil-3-(2-hidroxietiltio)-propanoato. Los productos finales de las reacciones antes mencionadas para estos precursores se pueden unir covalentemente a polietilenglicol como se ha descrito en otro lugar en esta memoria.

Hidrocloruro de 2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]-p-aminoacetofenona C_{24}H_{26}ClNO_{5}S_{2}

Se cargó un matraz de fondo redondo de 100 ml con 2,2-bis(p-tolilsulfonlmetil)-p-nitroacetofenona (2 g), etanol (25 ml), ácido clorhídrico (al 37% en peso en agua, 8 ml) y una barra de agitación magnética. A la mezcla heterogénea resultante se añadió luego cloruro de estaño(II) dihidratado y la mezcla se calentó a 45ºC en baño de aceite durante 2 h. A la solución homogénea amarilla que se formó se añadió luego agua hasta que se observó que podía haber precipitación si se añadía más agua. Se dejó enfriar la solución homogénea a temperatura ambiente, resultando un compuesto amarillo que precipitó/cristalizó, que se aisló por filtración en vacío. El producto aislado se mezcló luego con una mezcla caliente de acetona y metanol (aprox. 90:10 v/v). Se aisló por filtración en vacío un sólido insoluble y se secó a peso constante en horno de vacío (1,4 g). RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 2,50 (s, 6H), 3,57-3,73 (solapamiento m's, 5H), 6,27 (s, 2H), 6,39 (d, 2H), 6,96 (d, 2H), 7,47 (d, 4H), 7,55 (d,4H).

Acoplamiento de 2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metal]-p-aminoacetofenona a \alpha-metoxi-\omega-aminopolietilenglicol

Un matraz de fondo redondo de 100 ml, de una boca, equipado con un embudo de adición y un conducto para nitrógeno se cargó con trifosgeno (23 mg), hidrocloruro de 2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]-p-aminoacetofenona (125 mg), tolueno anhidro (2,5 ml) y una barra de agitación magnética bajo atmósfera de nitrógeno. El embudo de adición se cargó separadamente con trietilamina anhidra (68 \mul) y tolueno anhidro (2,5 ml). Se puso un baño de acetona/hielo seco bajo el matraz de fondo redondo y se dejó que se enfriara el contenido. Luego se añadió a gotas la solución de trietilamina a la solución de trifosgeno agitando durante 5-10 min. Se dejó que el matraz y el baño de hielo seco se calentaran a temperatura ambiente, lo que tardó varias horas en hacerlo y, una vez que estaba a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se dejó en reposo durante aproximadamente 2 h bajo atmósfera de nitrógeno. A la mezcla de reacción a temperatura ambiente se añadió luego a gotas una solución de O-(2-aminoetil)-O'-metilpolietilenglicol 2.000 (490 mg) y trietilamia anhidra (68 \mul) en tolueno anhidro. La mezcla resultante se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche (aprox. 20 h en total). Luego se abrió la mezcla de reacción a la atmósfera y se filtró por gravedad a través de una jeringa desechable de 5 ml con un trozo de lana de algodón no absorbente para que actuara de filtro. El eluyente homogéneo se pasó a un embudo separador de 100 ml y luego se lavó dos veces con agua desionizada (30 ml y luego 10 ml). Se combinaron las fases acuosas y luego la combinación se lavó con dietiléter (aprox. 25 ml). La fase acuosa se liofilizó, obteniéndose un producto sólido blancuzco (160 mg). Se encontró producto también en las fases de dietiléter y tolueno. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,5 (s), 3,39 (s), 3,41-3,53 (solapamiento m's), 3,53-3,76 (m), 3,82 (t), 4,17 (quintete), 7,35-7,39 (m, 1,39), 7,46 (d), 7,68 (d).

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Ejemplo 2 Síntesis de reactivo de conjugación de polímero Hidrocloruro de p-carboxi-3-piperidinopropriofenona

Un matraz de fondo redondo de 250 ml, de una boca, se cargó con ácido p-acetilbenzoico (10 g) e hidrocloruro de piperidina (7,4 g), 100 ml de etanol absoluto y una barra de agitación magnética. A la mezcla heterogénea en agitación se añadió ácido clorhídrico concentrado (1 ml) y la solución se calentó luego a reflujo bajo nitrógeno. Al matraz se añadió paraformaldehído (3,7 g) y se continuó el reflujo durante aproximadamente 1,5 horas. Se formó una solución homogénes a la que se añadió más paraformaldehído (3,7 g). Se continuó calentando durante aproximadamente 6 horas, tiempo durante el cual se añadió más formaldehído (3,7 g). Se dejó enfriar a temperatura ambiente la solución de reacción y se dejó durante una semana. Se aisló por filtración de la mezcla de reacción enfriada un sólido blanco. Después de disolverlo en metanol muy caliente se intentó cristalizar el sólido. Se aisló por filtración un producto insoluble (1,96 g) y del filtrado cristalizó un segundo producto (0,88 g). Ambos producto aparecían como idénticos por análisis de espectroscopia de infrarrojos y cromatografía de capa después de secar en vacío, por lo que se combinaron para usarlos en posteriores reacciones. ATR-FT-IR 1704, 1691, 1235, 760.

Ácido 4-[2,2-bis[(p-toliltio)metil]acetil]benzoico: C_{25}H_{24}O_{3}S_{2}

A un matraz de fondo redondo de 50 ml,. de una boca, se añadió hidrocloruro de p-carboxi-3-piperidinopropriofenona (2,5 g), 4-metilbencenotiol (2,1 g), formaldehído (al 37% p/p, solución acuosa, 2,5 ml), etanol (10 ml), una barra de agitación magnética y piperidina (aprox. 10 gotas). Luego se acopló al matraz un condensador y la solución de reacción se calentó a reflujo. Luego se añadió metanol (5 ml). Después de aproximadamente 2 horas, se añadió más formaldehído (2,5 ml) y se calentó durante otras 2 horas. Luego se dejó enfriar el matraz a temperatura ambiente y después se diluyó la solución de reacción con dietil éter (aprox. 150 ml). La fase orgánica resultante se lavó luego con agua (acidificada con ácido clorhídrico 1 N a pH 2-3, 50 ml x 2), agua (50 ml) y salmuera (75 ml) y seguidamente se secó sobre sulfato magnésico. La filtración seguida de la eliminación de volátiles en un evaporador rotatorio dio un residuo sólido. El sólido se disolvió en un volumen mínimo de una mezcla predominantemente de metanol y acetona calentando. La solución homogénea se puso luego en un congelador durante la noche, obteniéndose cristales blancuzcos que se aislaron por filtración en vacío, se lavaron con acetona fresca y luego se secaron a peso constante en horno de vacío (2,5 g). RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,38 (s, 6H), 3,16-3,31 (m, 4H), 3,85 (quintete, 1H), 7,15 (d, 4H), 7,18 (d, 4H), 7,64 (d, 2H), 8,07 (d, 2H). Análisis calculado para C_{25}H_{24}O_{3}S_{2} (hallado): C 68,78 (68,84), H 5,54 (5,77).

Ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico: C_{25}H_{24}O_{7}S_{2}

Un matraz de fondo redondo de 250 ml se cargó con una suspensión de ácido 4-[2,2-bis[(p-toliltio)metil]acetil]benzoico (2 g) y oxona (16,9 g) y se agitó en metanol:agua 1:1 v/v (100 ml) durante 16 h. Resultó una suspensión de un sólido blanco a la que se añadió cloroformo (100 ml) y la fase orgánica resultante se aisló usando un embudo separador, quedando una suspensión de un sólido blanco con la fase acuosa. A la fase acuosa heterogénea se añadió más agua hasta homogeneidad (aprox. 170 ml) y luego la fase acuosa se lavó con cloroformo (75 ml). Se combinaron las fases orgánicas, la combinación se lavó con agua (50 ml x 2, acidificada con unas pocas gotas de ácido clorhídrico 1N) y salmuera (50 ml). La fase orgánica se secó con sulfato magnésico, se filtró y se eliminó el disolvente usando un evaporador rotatorio, obteniéndose un producto sólido blancuzco en bruto (2,2 g). La purificación (de un 1 g de producto) se realizó por recristalización en acetato de etilo muy caliente, acetona y hexano, obteniéndose 0,6 g de producto. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,51 (s, 6H), 3,49-3,72 (m, 4H), 4,44 (quintete, 1H), 7,40 (d, 4H), 7,37-7,78 (m, 6H), 8,13 (d, 2H). Análisis calculado para C_{25}H_{24}O_{7}S_{2} (hallado): C 59,98 (59,88), H 4,38 (4,76).

Acoplamiento de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico a \alpha-metoxi-\omega-amino PEG (2000 g/mol)

Un matraz con llave de 50 ml, de una boca, se cargó con ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico (100 mg) y una barra de agitación magnética. El matraz se selló y se aplicó un vacío fuerte durante aproximadamente 15 min. Se introdujo en el matraz atmósfera de argón y se añadió con jeringa cloruro de tionilo (1 ml) mientras que se agitaba. La mezcla resultante se calentó a 50ºC durante 2 h. Se eliminaron en vacío los líquidos volátiles, obteniéndose una espuma amarilla. Se introdujo nuevamente atmósfera de argón en el matraz y se añadió con jeringa diclorometano anhidro (5 ml), obteniéndose una solución homogénea. Nuevamente se eliminaron en vacío los líquidos volátiles. Se repitió el proceso de adición/eliminación de disolvente hasta que quedó un residuo blanco. Al matraz con llave se añadió nuevamente diclorometano anhidro (5 ml) para formar una solución homogénea. Separadamente, en un matraz de fondo redondo de 25 ml, provisto de diafragma y con barra de agitación magnética se disolvieron O-(2-aminoetil)-O'-metilpoli(etilenglicol) (2.000 g/mol) (0,2 g) y trietilamina anhidra (30 \mul) en diclorometano anhidro (5 ml) bajo atmósfera de argón. La solución de reacción con ácido bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico fue inyectada en el matraz que contenía la solución de polietilenglicol gota a gota, produciéndose inmediatamente el desprendimiento de un gas blanco. La solución resultante se dejó en agitación durante la noche a temperatura ambiente y luego se añadió más trietilamina (28 \mul). Al cabo de 1 hora la solución de reacción se añadió a gotas mediante una pipeta de vidrio a dietil éter sometido a una rápida agitación. Para conseguir la precipitación fue necesario añadir hexano a la solución de dietil éter y poner el matraz en baño de hielo. El precipitado obtenido se aisló por centrifugación y se secó en horno de vacío a peso constante, obteniéndose un producto sólido blancuzco (230 mg). Se logró una pureza mayor por precipitación disolviendo primeramente el producto en diclorometano y añadiendo la solución a una solución enfriada de dietil éter. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,51 (s), 3,40 (s), 3,60-3,75 (m), 3,84 (t), 4,36 (quintuplete), 7,39 (d), 7,68 (d), 7,71 (d), 7,85 (d).

Acoplamiento de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico a \alpha-metoxi-\omega-amino PEG (20.000 g/mol)

Un matraz con llave de 50 ml, de una boca, se cargó con ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico (100 mg) y una barra de agitación magnética. El matraz se selló y se aplicó vacío fuerte durante aproximadamente 15 min. Se introdujo en el matraz atmósfera de argón y se añadió con jeringa cloruro de tionilo (1 ml) mientras que se agitaba. La mezcla resultante se calentó a 50ºC durante 2 h. Se eliminaron en vacío los líquidos volátiles, obteniéndose una espuma amarilla. Se introdujo nuevamente atmósfera de argón en el matraz y se añadió con jeringa diclorometano anhidro (5 ml), obteniéndose una solución homogénea. Nuevamente se eliminaron en vacío los líquidos volátiles. Se repitió el proceso de adición/eliminación de disolvente hasta que quedó un residuo blanco. Finalmente, al matraz se añadió diclorometano anhidro (5 ml) bajo argón para formar una solución homogénea.

En un matraz con llave de 50 ml distinto se disolvió O-(2-aminoetil)-O'-metilpoli(etilenglicol) (20.000 g/mol) (0,5 g) en 4 ml de tolueno anhidro en atmósfera de argón y luego la solución se evaporó a sequedad en vacío. El residuo blanco obtenido se mantuvo en vacío durante 3 h y luego se disolvió en diclorometano anhidro (5 ml) en atmósfera de argón.

La solución de reacción de ácido bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico se añadió lentamente a gotas a la solución de polietilenglicol, que estaba en agitación y enfriada en baño de hielo. Finalizada la adición completa, se añadieron a gotas a la solución resultante 40 \mul de trietilamina seca. Cuando se había añadido la trietilamina, se dejó la solución resultante en agitación durante la noche y que se calentara a la temperatura ambiente.

La solución de reacción se filtró luego a través de un filtro de 0,45 \mum y se eliminaron los líquidos volátiles del eluyente, obteniéndose un residuo ligeramente amarillo/naranja que se redisolvió en acetona caliente (10 ml). El matraz que contenía la solución homogénea resultante se puso en un baño de hielo-agua y se agitó hasta que se produjo precipitación. El precipitado blanco se aisló en un embudo de vidrio sinterizado nº. 3 y se lavó con acetona fresca enfriada (aprox. 30 ml). El sólido aislado se dejó secar en vacío, obteniéndose 0,4 g de sólido blanco. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,42 (s), 3,31 (s), 3,40-3,75 (m), 4,27 (m), 7,30 (d), 7,59 (d), 7,63 (d), 7,75 (d).

El reactivo de conjugación \alpha-metoxi-\omega-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]-benzamida polietilenglicol (20.00 g/mol) (0,4 g) se disolvió en 10 ml de una mezcla de acetonitrilo-agua (24:1, v/v, 2 mg de hidroquinona) purgada con argón y la solución se filtró a través de un filtro PP de 0,45 \mum. El eluyente se puso bajo argón en un matraz de fondo redondo y se añadió trietilamina (50 \mul) mientras que se agitaba. El matraz se puso luego en un baño de aceite a 30ºC durante 20 h mientras que se agitaba y al cabo de este tiempo el matraz se enfrió a temperatura ambiente y los líquidos volátiles se eliminaron en vacío. El residuo obtenido se disolvió en acetona caliente (10 ml) y, una vez que la solución se hizo homogénea, se puso en baño de hielo-agua, después de lo cual se produjo precipitación mientras que se agitaba la solución. El precipitado blanco se aisló en un embudo de vidrio sinterizado nº. 3 y se lavó con acetona fresca enfriada (aprox. 30 ml). Se dejó secar en vacío el sólido aislado, obteniéndose 0,3 g de un sólido blanco. RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta 2,35 (s), 3,31(s), 3,39-3,78 (m), 4.28 (s), 5,84 (s), 6,22 (s), 7,26 (d), 7,65 (d), 7,72 (d), 7,81 (d).

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Ejemplo 3 Reacción de 4-metilbencenotiol y \alpha-metoxi-\omega-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]-benzamida polietilenglicol

El reactivo que conjuga al polímero, \alpha-metoxi-\omega-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]-benzamida polietilenglicol (2.000 g/mol) (30 mg, 12,1 \mumol, 1 equiv), y 4-metilbencenotiol (3 mg, 24,2 mmol, 2 equiv) se disolvieron en cloroformo deuteriado (aprox. 0,75 ml). A la solución homogénea se añadió luego trietilamina (1,7 \mul, 12,1 \mumol, 1 equiv). Se agitó la mezcla de reacción y se obtuvo un espectro de RMN H. El espectro obtenido confirmó que se había efectuado la adición de 4-metilbencenotiol al reactivo de conjugación al polímero. Se realizó una reacción similar con propanotriol.

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Ejemplo 4 Conjugación de polímero a ribonucleasa A

Se añadieron a un tubo de centrifugadora de 15 ml que contenía ribonucleasa A (30 mg) 3 ml de una solución acuosa 8 M de urea y seguidamente 60 \mul de 2-mercaptoetanol. Se ajustó a 8 el pH de la solución resultante usando solución acuosa de metilamina al 10%. Luego se burbujeó nitrógeno a través de la solución durante aproximadamente 30 min. Mientras que se continuaba burbujeando nitrógeno, se calentó el tubo a 37ºC durante 5 h. La mezcla de reacción se enfrió luego en baño de hielo-agua salada y a la solución de reacción se añadieron 10 ml de una solución enfriada, purgada con argón, de HCl 1N:etanol absoluto (1:39 v/v). Se produjo precipitación y el precipitado se aisló por centrifugación y luego se lavó tres veces con más porciones de 10 ml de la mezcla de HCl:etanol absoluto y dos veces con dietil éter enfriado, purgado con nitrógeno (2 x 10 ml). Después de cada lavado, el precipitado se aisló por centrifugación. El precipitado lavado se disolvió luego en agua desionizada purgada con nitrógeno y se liofilizó, obteniéndose un sólido seco. Se confirmó la reducción parcial de ribonucleasa A y se cuantificó usando el Ensayo de Ellman, que dio 5,9 tioles libres por molécula de proteína.

En un eppendorf, la ribonucleasa A parcialmente reducida (10,9 mg) se disolvió en solución de amoniaco pH 8 (500 \mul) purgada con argón. En un eppendorf separado se disolvió también en solución de amoniaco (250 \mul) el reactivo de conjugación a polímero, \alpha-metoxi-\omega-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida derivada de polietilenglicol (2000 g/mol) (5 mg) y la solución resultante se añadió a la solución de ribonucleasa A. El eppendorf con PEG se lavó con 250 \mul de solución recientemente preparada de amoniaco y ésta se añadió también al eppendorf de reacción principal. Luego se cerró bajo argón el eppendorf de reacción principal y se calentó a 37ºC durante aproximadamente 24 h, luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. Luego se analizó la solución de reacción enfriada por dodecilsulfato sódico-electroforesis de gel de poliacrilamida- (SDS-PAGE). El experimento de SDS-PAGE era consistente con la reacción de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzoico pegilado.

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Ejemplo 5 Conjugación de polímero a fragmento Fab de anticuerpo IgG de ratón

A 240 \mul de una solución de 0,4 mg/ml de fragmentos Fab de anticuerpo IgG de ratón (catálogo de Abcam nº. AB6668) en tampón de fosfato sódicon 0,02 M, pH 6, purgada con argón, que contenía cloruro sódico 0,15 M y EDTA 0,005 M se añadieron 4 \mul de una solución acuosa 1 mM de dihidrocloruro de selenocisteína purgada con argón y seguidamente 12 \mul de una solución acuosa purgada con argón de hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a temperatura ambiente. La solución resultante se agitó por rotación inmediatamente durante varios segundos y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 6 min. Se separaron para posteriores análisis dos muestras de la solución que contenía fragmentos Fab y la solución restante se dejó en reposo en baño de hielo-agua durante 4 min. A la solución de Fab se añadió inmediatamente una solución enfriada en baño de hielo-agua de \alpha-metoxi-\omega-4[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzamida derivada de polietilenglicol (20.000 g/mol) (1,6 \mul, 50 mg/ml, tampón de fosfato sódico 0,02 M purgado con argón, pH 6, que contenía cloruro sódico 0,15 M, EDTA 0,005 M e hidroquinona 0,23 mM); la solución se agitó por rotación durante varios segundos y luego se volvió a poner en el baño de hielo-agua. Cada dos minutos se añadieron de manera análoga 1,6 \mul de la solución del reactivo de conjugación hasta añadir 6,4 \mul en total. Terminada la adición total, la solución se puso en una nevera (<5ºC) durante 2 horas. Se tomó luego una muestra de la mezcla de reacción para análisis por SDS PAGE.

La mezcla de reacción se analizó por SEC-HPLC (inyección de 100 \mul, columna de 12-24 ml superpuesta, Amersham biosciences; eluyente fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,15 M; pH 7,0; elución isocrática durante 100 min a un caudal de 0,25 ml/min; detección por luz UV, 210 nm), presentándose el conjugado de Fab-polietilenglicol, que no estaba presente en la mezcla de reacción idéntica. Las fracciones aisladas por SEC-cromatografía HPLC se analizaron por SDS-PAGE y se observó el conjugado de mono-polietilenglicol.

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Ejemplo 6 Conjugación de polímero a asparaginasa

Una muestra de 100 \mul de una solución de 5 mg/ml de asparaginasa a pH 6,5 (Sigma) se diluyó con 900 \mul de tampón de fosfato 20 mM (pH 6 y que también contenía NaCl 0,15 M y EDTA 5 mM). Luego se añadió DL-ditioreitol (DTT, 15,4 mg) y la solución resultante se dejó en reposo a temperatura ambiente. Después de 2 horas en reposo, la solución se purificó en una columna PD-10 (Sephadex®G-25M, Pharmacia Biotech) que se había equilibrado con tampón de fosfato 20 mM (pH 6 y que también contenía NaCl 0,15 M y EDTA 5 mM). La columna es eluyó con porciones de 1 ml de tampón recientemente preparado. Mediante espectroscopía de UV a 280 nm se identificaron dos fracciones que contenían proteína reducida. Estas fracciones se concentraron usando dispositivos centrífugos de filtración (MWCO 3.000; Microcon) a un volumen de aproximadamente 270 \mul y luego se diluyeron a 1 ml con tampón de fosfato fresco, pH 6 (que adicionalmente contenía hidroquinona 0,23 mM). Para análisis posterior por SDS PAGE se tomaron dos muestras de 5 \mul. Separadamente, en el mismo tampón de fosfato se preparó una solución de 50 mg/ml de la solución del reactivo para conjugación de \alpha-metoxi-\omega-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzamida derivada de polietilenglicol (20.000 g/mol) y se puso en un baño de hielo-agua junto con la solución de proteína durante 5 min. A la solución de proteína se añadieron luego 58 \mul de solución del reactivo de conjugación y, después de varios minutos de agitación por rotación, la solución de reacción se puso en una nevera (<5ºC). Se realizó también una reacción de control en las mismas condiciones y a la misma escala pero usando asparaginasa no reducida. Se confirmó por SDS PAGE (4-12% de gel bis-Tris con tinción coloidal azul) una conjugación con éxito de polietilenglicol a asparaginasa, realizada con muestras tomadas de la solución de reacción después de 2 horas. No se observó por SDS PAGE banda de conjugación para una muestra tomada de una reacción de control en la que no se dejó que la asparaginasa reaccionara con DTT.

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Ejemplo 7 Conjugación de polímero a interferón

Una solución de 100 \mul de interferón \alpha-2b (Santha Biotechnics) (1 mg/ml) diluida con 150 \mul de una solución tampón (fosfato sódico 0,02 M; NaCl 0,15 M; EDTA 0,005 M; pH 6,0 en agua desionizada purgada con argón) se redujo parcialmente añadiendo selenocistamina (1 mM en agua desionizada purgada con argón, 2 equiv) y TCEP (1 mM en agua desionizada purgada con argón, 5 equiv). La solución de proteína se enfrió a 4ºC. Se disolvió el reactivo de conjugación \alpha-metoxi-\omega-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil]acetil]benzamida derivada de polietilen-glicol (20.000 g/mol) en la misma solución tampón, se enfrió a 4ºC y se añadieron 10 \mul a la solución de proteína. La mezcla de reacción se agitó por rotación y se incubó a 4ºC durante 2 h. Los componentes no iónicos de la mezcla de reacción se eliminaron por cromatografía de intercambio catiónico (columna Hitrap SP FF1 de 1 ml, Amersham biosciences) usando dos tampones: (A) acetato sódico 25 mM, pH 4,0 y (B) acetato sódico 25 mM más NaCl 0,7 M, pH 4,0. La columna se lavó (1 ml/min) con tampón (A) (5,0 ml), luego con tampón (B) (5,0 ml) y luego se equilibró con 10 ml de tampón (A). Se cargó el conjugado en la columna (200 \mul) y seguidamente con el tampón (A) (500 ml) y se recogió una fracción de carga (0,5 ml). La columna es lavó con 5 ml de tampón A y se recogieron fracciones. La muestra se eluyó de la columna con el tampón (B) (10 ml) y se recogieron fracciones. Se usó espectroscopia (UV, 280 nm) para determinar las fracciones que contenían proteína y estas fracciones se purificaron luego en fracciones separadas por cromatografía de exclusión de tamaños (inyecciones de 100 \mul, columna superose 12-24 ml, Amersham biosciences; eluyente fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,15 NaCl, pH 7,0; elución isocrática durante 100 min a un caudal de 0,25 ml/min; detección por UV, 210 nm). Estas condiciones de purificación dieron una resolución de la linea de base para la separación del conjugado de polietilenglicol-interferón de interferón nativo. La reacción de conjugación y la purificación del conjugado de polietilenglicol fueron confirmadas por SDS-PAGE; gel bis-tris al 12% (SilverQuest Silver Staining; Colloidal Blue Staining y ácido perclórico 0,1 M/5% de BaCl_{2} y tinción con I_{2} 0,1 M). No se observó conjugación cuando una solución de 40 \mul de interferón (1 mg/ml) en 60 \mul de fosfato sódico 0,02 M, NaCl 0,15 M, EDTA 0,005 M, pH 6,0, en agua purgada con argón, se mezcló con el reactivo de conjugación \alpha-metoxi-\omega-4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)metil-acetil]-benzamida derivada de polietilenglicol (20.000 g/mol), se disolvió en la solución tampón (50 mg/ml) se enfrió a 4ºC y se añadieron 16 \mul a la solución de proteína. La mezcla de reacción se agitó en un Vortex y se incubó a 4ºC durante 2 h.

La concentración de cada fracción purificada del conjugado de polietilenglicol-interferón se determinó mediante inmunoensayo de enzimas. Se utilizó el mismo ensayo para determinar la concentración del interferón nativo que se conjugó y una muestra de interferón patrón internacional NIBSC (RU). En la Figura 1 se muestra la curva patrón reproducible y precisa obtenida para todas las formas del interferón antes mencionado. Se cultivaron células A549 (fibroblasto de pulmón humano) a 15.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos. A las células por triplicado se añadieron separadamente interferón de NIBSC (RU), el interferón nativo que se conjugó y el conjugado de polietilenglicol interferón y la placa se incubó a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 24 h. Al día siguiente se preparó una solución de trabajo de EMCV (virus de encefalomiocarditis) en DMEM/2% de FCS de virus de acopio almacenado a menos 80ºC. Se eliminó el medio que contenía el interferón o el conjugado de polietilenglicol interferón y se reemplazó con medio que contenía EMCV. La placa de cultivo de tejidos se incubó luego durante 1 h a 37ºC y después se eliminó el virus. Se añadieron 100 microlitros del medio DMEM/10% de FCS y la placa se incubó a 27ºC durante 16-24 horas. Después de 16 horas, se empezó a leer la placa con regularidad para ver cuándo empezaba la muerte de células. Luego se aspiró el medio y las células se lavaron con 100 \mul de solución de tampón de fosfato. A esto siguió la adición de 50 \mul de solución de violeta de metilo [esto es, violeta de metilo (4% de formaldehído, 0,05% de violeta de metilo 2B (Sigma- Aldrich)] durante 30 min a temperatura ambiente. Luego se lavó la placa con 100 \mul de agua y se secó al aire. Se determinó la absorbancia espectrofotométrica a 570 nm usando un lector de placas. La Figura 2 confirma que el interferón usado para la conjugación tenía una actividad equivalente a la del interferón patrón internacional NIBSC (RU). La Figura 3 confirma que el interferón nativo usado para la conjugación mantenía una actividad biológica equivalente después de ser sometido a todos los procesos químicos y de purificación excepto la exposición con el reactivo de conjugación de polietilenglicol. La Figura 4 confirma que el interferón nativo usado para la conjugación y el conjugado de polietilenglicol interferón purificado mantenían una actividad biológica equivalente.

Se determinó la inducción de la 2'5'-sintetasa oligoadenilada (2'5'-OAS) y ARNm de proteínaquinasa R(PRKR) por interferón \alpha 2b Se evaluaron el conjugado polietilenglicol-interferón purificado y una muestra del interferón \alpha 2b. Se incubaron 2 millones de células MOLT 4/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos con 5000 pg de cada muestra de interferón midiendo según un inmunoensayo de 24 h a 37ºC. Se extrajo el ARN total (kit de aislamiento de ARN II, Macheray-Nagel) y se sometieron 200 ng a transcripción inversa en un volumen final de 20 \mul (Sigma, kit de transcripción inversa AMV). Se diluyeron las muestras 1 a 4 en agua y se amplificaron 2 \mul de cada muestra en una mezcla de cuantificación de RCP en tiempo real (Sigma SybGreen ReadyMix). Los cebadores usados fueron:

2'5'-OAS directo: GGC TAT AAA CCT AAC CCC CAA ATC

2'5'-OAS inverso: AGC TTC CCA AGC TTC TTC TTA CAA

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PKR directo: ACT CTT TAG TGA CCA GCA CAC TCG

PRKR inverso: TTT AAA ATC CAT GCC AAA CCT CTT

Para una amplificación de 2',5'-OAS, a la activación de la enzima a 94ºC durante 5 min siguieron 48 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 5 s, condensación a 60ºC durante 2 s y extensión a 72ºC durante 8 s. Para la amplificación de PRKR, las muestras se activaron a 94ºC durante 5 min y se sometieron a 48 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 5 s, condensación a 59ºC durante 2 s y extensión a 72ºC durante 8 s. Al final de las amplificaciones se hizo un análisis de la curva de fusión de los productos. La cuantificación de los niveles inducidos de ARNm se hizo en relación a las células de control no tratadas usando la fórmula siguiente:

Aumento relativo = 2^{-(Ct \ de \ la \ muestra \ - \ Ct \ de \ control)}

en la que Ct es el valor umbral de entrecruzamiento.

La Figura 5, en la que la Figura 5(a) muestra el análisis cuantitativo en tiempo real por TR-RCP (dos etapas) de genes de 2'5'-sintetasa oligoadenilada (2'5'-OAS) inducible por interferon, y la Figura 5(b) muestra el análisis cuantitativo en tiempo real por TR-RCP (dos etapas) del gen de proteína quinasa R (PRKR) inducible por interferón. Los resultados confirman que el conjugado polietilenglicol-interferón-\alpha2b estimulaba la síntesis de 2'5'-sintetasa oligoadenilada (2'5'-OAS) y ANRm de proteínaquinasa (PRKR) a niveles que eran similares a los del interferón-\alpha2b nativo no pegilado.

Claims

1. Un compuesto de la fórmula general

11

en la que uno de X y X' representa un homopolímero o copolímero seleccionado entre el grupo constituido por polialquilenglicoles, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polioxazolinas, poli(alcoholes de vinilo), poliacrilamidas, polimetacrilamidas, copolímeros de HPMA, poliésteres, poliacetales, poli(orto ésteres), policarbonatos, poliiminocarbonatos, copolímeros de divinil éter-anhídrido maleico o estireno-anhídrido maleico, polisacáridos, o poli(ácidos glutámicos), estando opcionalmente derivatizado o funcionalizado cualquiera de los mencionados homopolímeros o copolímeros; y el otro representa un átomo de hidrógeno;

cada Q representa independientemente un grupo conector;

W representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO_{2}-, o un grupo obtenido por reducción de un grupo de los mencionados; o, si X' representa un polímero, X-Q-W- juntos representan un grupo ciano;

Z representa una proteína que está unida a A y B por dos grupos tiol que se han obtenido de un puente disulfuro en la proteína;

A es una cadena alquileno o alquenileno C_{1-5} y

B es un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C_{1-4}.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que el polímero es un polietilenglicol.

3. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que cada grupo conector Q representa independientemente un enlace directo, un grupo alquileno, o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, cualquiera de loa cuales puede estar terminado o interrumpido por uno o varios átomos de oxígeno, átomos de azufre, grupos -NR en los que R representa un grupo alquilo o arilo, grupos ceto, grupos -O-CO- y/o grupos -CO-O-.

4. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína es un polipéptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima, una citocina, una quimiocina o un receptor.

5. Un compuesto según la reivindicación 4, en el que la proteína es una enzi9ma, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, o un interferón

6. Un compuesto según la reivindicación 5, en el que la proteína es un interferón.

7. Un procedimiento para la preparación de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende reducir un puente disulfuro en una proteína y hacer reaccionar el producto resultante con (i) un compuesto de la fórmula general

12

cada Q representa independientemente un grupo conector;

W' representa un grupo ceto CO, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO_{2}-; o, si X' representa un polímero, X-Q-W- juntos representan un grupo ciano;

A representa una cadena alquileno o alquenileno C_{1-5} y

B representa un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C_{1-4}; y

cada L representa independientemente un grupo saliente;

o (ii) un compuesto de la fórmula general

13

en la que X, X', Q, W', A y L tienen los significados dados para la fórmula general II y m representa un número entero de 1 a 4.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que el grupo saliente L o cada uno de los grupos salientes L representa -SR, -SO_{2}R, -OSO_{2}R, -N^{+}R^{3}, -N^{+}HR_{2}, -N^{+}H_{2}R, halógeno o -O\diameter, en los que R representa un grupo alquilo o arilo y \diameter representa un grupo arilo sustituido que contiene como mínimo un sustituyente aceptor de electrones.

9. Un compuesto de la fórmula general

14

en la que uno de X y X' representa un homopolímero o copolímero seleccionado entre el grupo constituido por polialquilenglicoles, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polioxazolinas, poli(alcoholes de vinilo), poliacrilamidas, polimetacrilamidas, copolímeros de HPMA, poliésteres, poliacetales, poli(orto ésteres), policarbonatos, poliiminocarbonatos, copolímeros de divinil éter-anhídrido maleico o estireno-anhídrido maleico, polisacáridos, o poli(ácidos glutámicos), estando opcionalmente derivatizado o funcionalizado cualquiera de los mencionados homopolímeros o copolímeros, y el otro representa un átomo de hidrógeno;

cada Q representa independientemente un grupo conector;

A representa una cadena alquileno o alquenileno C_{1-5} y

B representa un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C_{1-4}; y

cada L representa independientemente un grupo saliente;.

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10. Un compuesto de la fórmula general

15

en la que uno de X y X' representa un homopolímero o copolímero seleccionado entre el grupo constituido por polialquilenglicoles, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polioxazolinas, poli(alcoholes de vinilo), póliacrilamidas, polimetacrilamidas, copolímeros de HPMA, poliésteres, poliacetales, poli(orto ésteres), policarbonatos, poliiminocarbonatos, copolímeros de divinil éter-anhídrido maleico o estireno-anhídrido maleico, polisacáridos, o poli(ácidos glutámicos), estando opcionalmente derivatizado o funcionalizado cualquiera de los mencionados homopolímeros o copolímeros; y el otro representa un átomo de hidrógeno;

cada Q representa independientemente un grupo conector;

A representa una cadena alquileno o alquenileno C_{1-5}; m representa un número entero de 1 a 4 y

L representa un grupo saliente;.

11. Un compuesto según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el grupo saliente L o cada uno de los grupos salientes L representa -SR, -SO_{2}R, -OSO_{2}R, -N^{+}R^{3}, -N^{+}HR_{2}, -N^{+}H_{2}R, halógeno o -O\diameter, en los que R representa un grupo alquilo o arilo y \diameter representa un grupo arilo sustituido que contiene como mínimo un sustituyente aceptor de electrones.

12. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto fisiológicamente tolerable según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como medicamento.