CN107667113B - 通过c端改造的半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体 - Google Patents

通过c端改造的半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体 Download PDF

Info

Publication number
CN107667113B
CN107667113B CN201680020654.8A CN201680020654A CN107667113B CN 107667113 B CN107667113 B CN 107667113B CN 201680020654 A CN201680020654 A CN 201680020654A CN 107667113 B CN107667113 B CN 107667113B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
dimer
drug
isvd
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680020654.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107667113A (zh
Inventor
卡罗·布东
丹尼尔·詹森
彼得·卡斯特尔
彼得·肖特
弗朗西斯·德康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ablynx NV
Original Assignee
Ablynx NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ablynx NV filed Critical Ablynx NV
Publication of CN107667113A publication Critical patent/CN107667113A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107667113B publication Critical patent/CN107667113B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A61K51/103—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants against receptors for growth factors or receptors for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及包含第一多肽和第二多肽的二聚体，其中所述第一和第二多肽中的每一个包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸，其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一多肽的半胱氨酸部分和所述第二多肽的半胱氨酸部分之间的二硫键共价连接，其中在多种测定中该二聚体优于基准构建体，例如同源多价和多特异性构建体。本发明提供用于制备本发明的二聚体的方法。

Description

通过C端改造的半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体
发明领域
本发明涉及一种包含第一多肽和第二多肽的二聚体，其中所述第一和第二多肽中的每一个包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸，其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一多肽的半胱氨酸部分和所述第二多肽的半胱氨酸部分之间的二硫键共价连接，其中在多种测定中该二聚体优于基准构建体，例如同源多价和多特异性构建体。本发明提供了用于制备本发明的二聚体的方法。本发明还提供了可变结构域(如在本文中定义的)和可通过本发明的方法获得的包含一个或多个可变结构域的多肽(也被称为“本发明的多肽”)，以及包含与一个或多个基团、残基或部分偶联的这样的可变结构域和/或多肽的化合物(也被称为“本发明的化合物”)。
本发明还涉及编码这样的可变结构域和/或多肽的核酸；涉及包含这样的核酸和/或表达或能够表达这样的可变结构域和/或多肽的宿主细胞；涉及包含这样的可变结构域和/或多肽、化合物、核酸和/或宿主细胞的组合物，并且具体涉及药物组合物；并且涉及这样的可变结构域、多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物尤其用于标记、预防、治疗或诊断目的的用途。
本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将根据在本文中的进一步描述变得清楚。
背景
已经有多于20种单克隆抗体(mAb)批准用于治疗，并且更多处于临床开发中，这类分子已经成为用于多种疾病的确定的治疗方式(Reichert(2011)MAbs 3:76-99；Nelson等人，(2010)Nat Rev Drug Discov 9:767-74)。然而，复杂疾病如癌症或炎性病症通常性质上是多因素的，涉及大量的介导疾病的配体和受体，以及信号级联之间的串扰(crosstalk)。多个靶标或在一个靶标上的多个位点的阻断应当引起提高的治疗功效。常规单克隆抗体治疗的引起显著抗肿瘤活性的有限的能力已经导致了双特异性物质(可以同时结合两种不同抗原抗体)的开发(Kontermann(2012)mAbs 4:182-197)。在过去十年期间，利用双特异性抗体的双重靶向已经作为组合疗法或使用混合物的备选方案出现。利用双特异性抗体的双重靶向的概念是基于利用一种药物的多个调节疾病的分子的靶向。从技术和调节的观点来看，这使得开发较不复杂，因为制造、临床前和临床测试被简化为单一的双特异性分子(Kontermann(2012)见上文)。利用单一双重靶向药物的治疗，而不是组合，对于患者来说应当也是较不复杂的。
双特异性抗体可以通过生物化学或基因手段产生。重组技术已经制备了大范围的双特异性抗体，在最近二十年中产生了45种形式(Byrne等人(2013)TrendsBiotechnol.31,621-32)。虽然有这么多的拓扑结构，该方法不适用于每种蛋白质组合。蛋白质通过它们的N或C端的融合通常造成生物活性的降低或损失并且由于折叠和加工中的复杂情况可以观察到变化的表达产率(Schmidt(2009)Curr.Opin.Drug DiscoveryDev.12,284-295；Baggio等人(2004)Diabetes 53,2492-2500；Chames和Baty(2009)mAbs1,539-47)。
产生双特异性治疗剂的备选方法是同或杂双官能偶联剂(Doppalapudi等人(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107:22611-6)。迄今为止，这是制备这样的缀合物的较不成功的方法。在该区域中采用的化学技术中的根本缺陷是它们对修饰赖氨酸残基的依赖性。每个常规抗体存在平均100个赖氨酸残基，并且它们的分布在抗体或其片段如Fab、Fc和免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)区域的整个表面拓扑结构中是均匀的。因此，利用赖氨酸残基的缀合技术将会与抗体分子的基本上所有区域随机交联，得到具有不可预测的性质的产物的高度不均匀的混合物。
通过插入允许化学接头的位点特异性引入的非天然氨基酸，提供了克服这种问题的策略。然而，对非天然氨基酸的替换通常是不完全的，并且由于人工氨基酸在所需的高浓度下的细胞毒性，表达产率通常是低的。
通过其中在抗体中的所需位点引入单一亲核性半胱氨酸残基的定点诱变(site-directed mutagenesis)，提供了克服关于随机交联的问题的另一种方法。半胱氨酸残基在蛋白质中具有低的天然丰度，但是通常发现在分子内二硫键中结合，提供了结构和功能完整性，因此在抗体和抗体片段中缺少游离半胱氨酸残基(Fodje和Al-Karadaghi(2002)Protein Eng.Des.Sel.15,353-358)。分子内交联相对于分子间交联的控制利用这些试剂非常难实现。可以通过反应参数如蛋白质/试剂比率、pH、离子强度等的适当选择实现一些控制，但是结果仍然不令人满意。
WO2004/03019假设，通过例如提供各自在结构域的C末端具有半胱氨酸的dAb(半胱氨酸是结合在一起的二硫化物)，利用使用2,2’-二硫代二吡啶(2,2’-DTDP)和还原的单体的化学偶联过程，可变结构域可以连接在一起以形成多价配体。然而，2,2’-DTDP是刺激性的，限制了其实际应用。此外，因为2,2’-DTDP还是使Ca2+从细胞中移动的反应性二硫化物，其应用被进一步限制。WO2004/03019不仅未提及这种方法是否是实际上可行的，尤其是在不使分子内巯基键扰乱并且重排的情况下，而且考虑到2,2’-DTDP的性质，需要采取费力的测量以将这种试剂完全移除。
Baker等人(2014,Bioconjugate Chem.,DOI:10.1021/bc5002467)描述了使用合成的双-二溴马来酰亚胺交联剂的通过抗体片段二硫键的还原和桥连的双特异性抗体构建体。
Carlsson等人(1978Biochem J.173:723-737)提出了使用正琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯的蛋白质的巯基化过程，得到可逆的蛋白质-蛋白质缀合。然而该过程需要广泛纯化。此外，当遵循方案(Carlsson等人，1978)时，已经报道了降低的活性。Carlsson等人(1978)未提及该过程是否可以用于抗体或其片段。
通常，通过引入半胱氨酸残基的分子间交联是被限制的，因为半胱氨酸诱变通常导致降低的表达产率和不希望的性质如对不需要的二聚化的易感性、混合的二硫化物形成或二硫化物错配(disulfide scrambling)(Schmiedl等人(2000)J.Immunol.Methods 242,101-14；Junutula等人(2008)Nat.Biotechnol.26,925-32；Albrecht等人(2004)Bioconjugate Chem.15,16-26)。
Graziano和Guptill讨论了用于通过使用在F(ab’)2片段的重链内二硫键的还原时产生的游离巯基构建Fab’×Fab’化学连接的双特异性物质的方法。然而，必须选择条件以使得在没有重-轻链二硫键的大范围还原的情况下实现重链间二硫化物的有效还原。应指出的是，使用邻亚苯基二马来酰亚胺(o-PDM)方法形成的双特异性物质可以比由Ellman试剂(5,5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)或DTNB)产生的那些更稳定，但是更难将o-PDM产生的双特异性物质纯化至生物化学均匀。o-PDM方法的另一个显著的缺点是需要在抗体分子中具有奇数个重链间二硫键以被马来酰亚胺化(Graziano和Guptill(2004)第5章，双特异性抗体的化学制备(Chemical Production of Bispecific Antibodies)，第71-85页，来自：分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)第283卷：生物缀合方案：策略和方法(Bioconjugation Protocols:Strategies and Methods)；编辑:C.M.
Figure BDA0001427334130000041
Figure BDA0001427334130000042
Humana Press Inc.,Totowa,NJ)。这阻止了其在人-人双特异性物质的构建中的应用。
因此，在提供用于生成二聚体的有效和/或适合的方法方面仍然存在问题。
改进治疗、尤其是癌症治疗的另外的策略是使用抗体药物缀合物(ADC)。尽管目前在临床试验中存在超过50种不同的ADC，其中的多种是活性的，在开发、纯化ADC以及预防其毒性方面仍然存在大范围的问题。首先，几乎没有对物理化学性质，如归因于每个抗体缀合的药物的数量的ADC的异质性、PK/生物分布、有效负荷(payload)和递送载体的控制。例如，许多药物通过赖氨酸与抗体缀合。如上所述，因为赖氨酸散布在整个抗体上，这出现了难以控制的药物与抗体的比率。此外，这种偶联还干扰了利用赖氨酸偶联的双特异性概念。此外，在癌症治疗中使用的大多数药物是非常疏水的，引起ADC部分的不可预测并且大多不利的聚集、PK和生物分布特征。对于小抗体片段来说，这尤其是正确的。常规抗体具有约150kD的尺寸，而药物平均具有约1kD的尺寸。因此，抗体:药物的尺寸比是约150:1。与常规抗体形成巨大反差的是，抗体片段，如ISVD具有仅约15kD的尺寸。因此，ISVD:药物的尺寸比仅为15:1，即与常规抗体相比小10倍。因此，药物的疏水性特征对缀合的抗体片段的物理化学性质具有不成比例地较大的影响。实际上，关于缀合的抗体片段的主要问题是聚集(Feng等人，2014Biomedicines 2:1-13)。分析进一步表明，IgG尺寸的大分子构建体展现出在全身清除率和血管外渗之间的有利平衡，得到最大的肿瘤吸收(Dane Wittrup等人，2012Methods Enzym.503第10章，pp255-268)。这些困难实际上将缀合药物的使用限于较小的抗体片段。
WO2005/007197描述了用于使用具有与来源于蛋白质中二硫键的两个硫原子缀合而得到硫醚缀合物的能力的缀合剂将聚合物与蛋白质缀合的方法。在这种方法中，二硫键被还原以产生两个游离半胱氨酸残基并且之后使用与聚合物共价连接的桥连试剂重新形成。然而，不推荐这种方法用于缀合抗体，因为抗体分子中大量的链内二硫键导致二硫键错配(scrambling)。
WO2013/190292似乎克服了WO2005/007197的关于抗体的缺陷并且描述了用于通过在来源于这些抗体的铰链区中单一重链间二硫键的两个半胱氨酸残基之间形成桥的缀合试剂将聚合物缀合的方法。WO2013/190292未提及不位于在铰链区的缀合半胱氨酸残基。实际上，WO2013/190292未提及缺乏铰链区的免疫球蛋白单可变结构域。
连同HER-2、HER-3、和HER-4一起，表皮生长因子受体(EGFR；也被称为HER-1)是HER激酶家族的成员。EGFR在多种人肿瘤中被过度表达，包括非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、结肠直肠癌、食道癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、和卵巢癌。EGFR的活化引起可以导致细胞分裂、增加的运动性、血管发生和降低的细胞凋亡的信号传导。这些作用通过一系列复杂的信号传导机制介导，如促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路的结合。
EGFR还涉及多种其他疾病，如炎性关节炎和肺中黏液的分泌过多。
EGFR靶向抗体如IMC-C225(Erbitux,Imclone)、EMD72000(Merck Darmstadt)、ABX-EGF(Abgenix)、h-R3(theraCIM,YM Biosciences)和Humax-EGFR(Genmab)中的许多作为防止配体与受体的结合的抗体分离。然而，这些抗体或现有的可用药物均不完全有效用于癌症的治疗，并且大多数被严重的毒性限制。
因此，在本领域中针对提供用于将药物与二聚体缀合的有效和/或适合的方法仍然存在问题。
发明概述
本发明的目的是克服或改善现有技术的缺点中的至少一个，或提供有用的备选方案。
考虑到它们的模块性，免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)并且尤其是纳米抗体特别适用于结合至多价构建体中。生成多价构建体的方便且优选的方式是借助编码ISVD的个体核酸通过酰胺键的遗传融合，其中编码ISVD的核苷酸序列通过其3’末端核酸与另一个编码ISVD的核苷酸序列的5’末端核酸偶联，如果需要，则通过多种长度的(核酸)接头偶联。因此，ISVD通过酰胺键并且可能通过肽接头偶联。
ISVD包含在半胱氨酸之间的分子内二硫键从而保持该部分的完整性和功能性。已经广泛证实，在编码ISVD的核苷酸序列的遗传融合之后，在翻译时，在个体ISVD中，形成典型(也被称为分子内)二硫键的固有性质不受影响。
考虑到遗传融合的容易程度和多功能性，ISVD的化学缀合不是优选的方法，尤其是因为其需要在预定位点选择性地偶联ISVD而不阻碍分子内二硫键和/或使用非自体、潜在有害组分的费力的方法。
本发明提供了方便的方法，其中促进了经由两个多肽之间的二硫键的分子间二聚化，而基本上没有任何异常扰乱或涉及ISVD的分子内二硫键。该方法利用引入在还包含ISVD的多肽的C端延伸中的半胱氨酸。
本发明还提供了用于制备本发明的二聚体的方法。尤其是，本发明涉及一种用于制备(多肽-)二聚体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(i)提供第一多肽，其中所述第一多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；
(ii)提供第二多肽，其中所述第二多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；和
(iii)任选通过加入氧化性铜离子(Cu2+)，并且优选在pH 6.5至pH 7.5将在所述第一多肽的C端延伸的所述半胱氨酸部分的巯基部分和在所述第二多肽的C端延伸的所述半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸；并且所述胱氨酸是在所述二聚体中存在的唯一的分子间二硫键；由此制备所述二聚体。
优选地，将所述二聚体的所述(C端)胱氨酸还原的步骤在其中所述第一多肽和/或所述第二多肽的分子内二硫键保持被氧化的条件下进行。换句话说，维持了ISVD的完整性。所述方法任选还包括将所述二聚体的所述(位于C端的)胱氨酸还原的步骤。
进一步意外地发现，本发明的二聚体优于基准构建体，例如同源多价和多特异性构建体。基准构建体由与本发明的二聚体相同的多肽组成，但是基准构建体通过编码这些多肽的核酸的遗传融合产生，因此第一多肽通过在N端至C端方向上的酰胺键与第二多肽偶联。尤其是，本发明的二聚体可以与具有比基准、例如同源二价构建体好的亲和力(适宜地作为KD值(实际或表观)、KA值(实际或表观)、kon速率和/或koff速率)的靶标结合。另一方面，即使当含有两个结合ISVD的白蛋白时，本发明的二聚体也显示出与仅含有一个结合ISVD的白蛋白的基准相似的生物分布特征。
此外，本发明的二聚体意外地显示出与基准构建体相比改善的内在化(internalization)，尤其是在具有低靶标表达的细胞上。因为内在化对于良好的功效来说是关键的，改善的内在化可能会得到更好的功效。此外，改善的内在化可以降低副作用，如毒性，因为需要较少的药物并且较少的药物将会与脱离。在具有低靶标表达的细胞上的二聚体的内在化可以扩大可进行治疗的肿瘤的范围并且降低形成耐药性的机会。另一方面，本发明的二聚体显示出与基准构建体相似的、有利的生物分布特征。
因此，本发明涉及一种二聚体，所述二聚体包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸；其中所述第二多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分和所述第二多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分之间的二硫键共价连接。
因此，本发明涉及一种(多肽)二聚体，所述二聚体包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽通过位于C端的二硫键共价连接。
发明人进一步观察到，本发明的二聚体具有出乎意料的有利的结合和功能特征。这些特征还保持长的时间段，而没有效力的任何明显的或实质的损失。这使得二聚体可用于储存和运输。因此，本发明进一步涉及用于储存包含反应性半胱氨酸部分的多肽的方法，所述方法至少包括将所述反应性半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸，从而使所述反应性半胱氨酸部分临时失活的步骤，其中所述多肽还包含(内部)胱氨酸键。
本发明的发明人假设，二聚体可以特别适合作为用于瞬时使用的集合体(pool)，如，例如使用C端半胱氨酸例如通过马来酰亚胺化学性质的官能团的偶联。开发了使用温和还原条件的方案，其中将二聚体的分子间二硫桥还原以活化成分多肽的巯基。优化的条件引起二硫化物的还原，在不使内部典型ISVD二硫键还原的情况下形成二聚体。因此，本发明涉及一种用于生成包含反应性半胱氨酸部分的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(i)提供通过通过胱氨酸键二聚化的多肽；
(ii)将所述胱氨酸键还原；
由此生成包含反应性半胱氨酸部分的多肽。优选地，所述胱氨酸键位于所述多肽的C端末端。优选地，选择所述步骤(ii)的还原条件以使得不还原内部胱氨酸键。
此外，本发明还提供了用于以非常可控的药物与抗体的比率(DAR)和超过95％的纯度将有效负荷与本发明的多肽和/或二聚体缀合的方法。完全意外地，将多肽与有效负荷缀合(DAR＝1)对生物分布特征没有影响。此外，这些缀合的多肽证实了体外细胞毒性和肿瘤生长的体内抑制。因此，本发明提供了用于使用本发明的多肽和/或二聚体治疗受试者的方法。
尤其是，本发明涉及用于制备二聚体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(i)提供第一多肽，其中所述第一多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；
(ii)提供第二多肽，其中所述第二多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；和
(iii)通过任选加入氧化性铜离子(Cu2+)，并且优选在pH 6.5至pH 7.5将在所述第一多肽的C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分和在所述第二多肽的C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸；
(iv)任选使所述二硫化物衍生物胱氨酸与在来源于所述胱氨酸的两个半胱氨酸残基之间形成桥的缀合剂反应，其中所述缀合剂包含式(I)的官能团
Figure BDA0001427334130000091
其中W表示吸电子基团；A表示C1-5亚烷基或亚烯基链；B表示键或C1-4亚烷基或亚烯基链；并且每个L独立地表示离去基团；其特征在于维持了所述ISVD的完整性。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述缀合剂包含式(la)的官能团：
Figure BDA0001427334130000092
其中Q表示连接基团并且D表示诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物，或者用于诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的结合剂，例如，接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述缀合剂包含式(lb)的官能团，其中W表示氰基：
Figure BDA0001427334130000101
其中Q表示连接基团并且D表示诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物，或者用于诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的结合剂，例如，接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中缀合剂包含式(II)、(III)或(IV)的官能团：
Figure BDA0001427334130000102
其中X和X’中的一个表示聚合物并且另一个表示氢原子；
Q表示连接基团；
W表示吸电子基团；或者，如果X’表示聚合物，则X-Q-W可以共同表示吸电子基团；
A表示C1-5亚烷基或亚烯基链；
B表示键或C1-4亚烷基或亚烯基链；并且
每个L独立地表示离去基团；
Figure BDA0001427334130000103
其中X、X’、Q、W、A和L具有对于通式II所给出的含义，并且此外，如果X表示聚合物，则X’和吸电子基团W连同之间的原子一起可以形成环，并且m表示1、2、3或4的整数；或
X-Q-W-CR1R1’-CR2.L.L’(IV)
其中X、Q和W具有对于通式II所给出的含义，并且
R1表示氢原子或C1-4烷基，R1’表示氢原子，并且L和L’中的每一个独立地表示离去基团；或
R1表示氢原子或C1-4烷基，L表示离去基团，并且
R1和L’共同表示键；或
R1和L共同表示键并且R1和L’共同表示键；并且
R表示氢原子或C1-4烷基。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述药物选自由下列各项组成的组：细胞生长抑制剂、细胞毒性剂、化疗剂、生长抑制试剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物、或动物来源的酶活性毒素或其片段)、毒素部分、和放射性同位素。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述药物是MMAE。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述结合剂是用于诊断、治疗或标记试剂的接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽还包含马来酰亚胺-val-cit-MMAE。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述接头是不可裂解接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述接头是可裂解接头，例如包含用于细胞酶(例如，细胞酯酶、细胞蛋白酶如组织蛋白酶B)的切割位点的可pH裂解接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述药物与二聚体的比率(DAR)是1。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中例如通过质谱法确定的，所述第一多肽和所述第二多肽的至少80％，如85％、90％、95％、99％或甚至更多，如100％是二聚化的。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，所述方法还包括优选通过尺寸排阻色谱将所述二聚体纯化的步骤。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽是相同的。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不同的。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含含有优选在C末端的半胱氨酸部分的50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸残基的C端延伸。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的用于制备二聚体的方法，其中所述C端延伸与所述多肽中位于最C端的ISVD的C端末端遗传融合。
尤其是，本发明涉及一种二聚体，所述二聚体包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸；其中所述第二多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽通过在所述第一多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)的硫醚键和所述第二多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)的硫醚键共价连接，并且化合物是根据式(V)或式(VI)
Figure BDA0001427334130000121
其中
“-C-”表示在本发明的多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分；
“-C”表示在本发明的多肽的C端延伸的C末端的半胱氨酸部分；
R1表示C1-4烷基；并且D表示诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物，或者用于诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的结合剂，例如，接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述药物选自由下列各项组成的组：细胞生长抑制剂、细胞毒性剂、化疗剂、生长抑制试剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物、或动物来源的酶活性毒素或其片段)、毒素部分、和放射性同位素。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述药物是MMAE。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，所述二聚体包含马来酰亚胺-val-cit-MMAE。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述结合剂是用于诊断、治疗或标记试剂的接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述接头是不可裂解接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述接头是可裂解接头，例如包含用于细胞酶(例如，细胞酯酶、细胞蛋白酶如组织蛋白酶B)的切割位点的可pH裂解接头。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述药物与二聚体的比率(DAR)是1。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中如通过竞争FACS测定的，所述二聚体以至多100nM，如50nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM，优选甚至至多2nM，如1nM的IC50与靶标结合。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中优选如通过竞争FACS测定的，所述二聚体以比基准的IC50好至少10％，如20％、30％、50％、80％、90％、或甚至100％的IC50与靶标结合。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中优选如通过竞争FACS测定的，所述二聚体以比基准的IC50好至少2倍，如3倍或4倍、和甚至5倍或10倍的IC50与靶标结合。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含含有优选在C末端的半胱氨酸部分的50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸残基的C端延伸。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述C端延伸由GlyGlyGlyCys(SEQ ID NO:4)、GlyGlyCys(SEQ ID NO:3)、GlyCys(SEQ ID NO:2)或Cys(SEQID NO:1)组成。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述C端延伸选自由SEQ IDNO:1-15组成的组。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和所述第二多肽是相同的。
尤其是，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不同的。
尤其是，本发明涉及用于治疗癌症的如在本文中所描述的二聚体，其中所述二聚体内在化。
尤其是，本发明涉及用于制造药物的如在本文中所描述的二聚体，所述药物用于治疗癌症，其中所述二聚体内在化。
附图说明
图1所使用的各种构建体的示意图。
图2竞争结合FACS。
图3在HER14细胞上的EGF介导的EGFR磷酸化的阻断(0.5mM EGF)。
图4C端GGC延伸的多肽的二硫化物二聚体的还原的示意图。
图5还原的半胱氨酸延伸的多肽的SEC特征。蛋白标记物的MW由虚线(―‐―)表示，并且是670kDa、158kDa、44kDa、17kDa和1.35kDa。mAU是在280nm的毫吸光度单位。
图6马来酰亚胺-val-cit-MMAE。
图7T0238-00001-mc-val-cit-PAB-MMAE(ABL100-NC003-1)的SDS-PAGE分析。1)Novex标记物；2)T0238-00001二聚体；3)还原的T0238-00001(10mM DTT，2-8℃，O/N)；4)ABL100-NC003-1粗缀合混合物；5)ABL100-NC003-1。
图8还原的T023800001-A(氧化的)T023800001-A(还原的)和T0238-00001-mc-val-cit-PAB-MMAE的叠加的疏水相互作用谱图。
图9多肽-MMAE缀合物的体外细胞杀伤：作为标准化细胞指数(CI)的波动测量的不同浓度的未缀合的和缀合的纳米抗体对MDA-MB-468细胞的增殖的影响的阻抗滴定监测(impedimetric monitoring)。对于数据分析来说，箭头表示纳米抗体施用的时间点(即，接种之后20h)并且虚线表示终点(即，接种后116h)。选取从在不存在纳米抗体的情况下的细胞生长中获得的细胞指数作为控制。
图10未缀合的和MMAE缀合的多肽的剂量依赖性作用。
图11多肽-MMAE缀合物的体内功效。
图12ThioBridgeTM技术的原理。
图13与纳米抗体二聚体的有效负荷结合的ThioBridgeTM技术。
图14用于产生双特异性ThioBridgeTM二聚体的方案(方案1)。
图15使用ThioBridgeTM的双特异性Nb-药物缀合物的产生(方案2)。
图16在调整的ThioBridgeTM方案中使用保护基团的双特异性Nb-药物缀合物的产生(方案3)。
图17使用NCS-Bz-Df和89Zr的Nb的修饰和放射性标记。
图18 3种多肽的平均％ID/g。
图19内在化的多肽和构建体的剂量-响应曲线。
发明详述
在整个说明书中的现有技术的任何讨论决不应被认为是承认这样的现有技术是广泛已知的或构成本领域中一般常识的一部分。
除非另外指出或限定，所有使用的术语具有它们的在本领域中对技术人员来说将会是清楚的通常含义。例如，参考了标准手册，如Sambrook等人，“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)”(第2版)，第1-3卷，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)；F.Ausubel等人编，“分子生物学中的当前方案(Current protocols in molecular biology)”，Green Publishing and WileyInterscience,纽约(1987)；Lewin，“基因II(Genes II)”，John Wiley&Sons，纽约，N.Y.,(1985)；Old等人，“基因操作原理：基因工程导言(Principles of Gene Manipulation:AnIntroduction to Genetic Engineering)”，第2版，加州大学出版社，伯克利，CA(1981)；Roitt等人，“免疫学(Immunology)”(第6版)，Mosby/Elsevier,Edinburgh(2001)；Roitt等人，Roitt基础免疫学(Roitt’s Essential Immunology)，第10版，Blackwell Publishing,UK(2001)；和Janeway等人，“免疫学(Immunobiology)”(第6版)，Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及在本文中引用的一般背景技术。
除非另外指出，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作都可以并且已经以本身已知的方式进行，这对技术人员来说将会是清楚的。例如，再次参考了标准手册和在本文中提及的一般背景技术并且参考了在其中引用的另外的参考文献；并且例如参考了以下综述：Presta 2006(Adv.Drug Deliv.Rev.58(5-6):640-56)，Levin和Weiss 2006(Mol.Biosyst.2(1):49-57)，Irving等人，2001(J.Immunol.Methods 248(1-2):31-45)，Schmitz等人，2000(Placenta 21Suppl.A:S106-12)，Gonzales等人，2005(Tumour Biol.26(1):31-43)，它们描述了用于蛋白质工程的技术，如用于提高蛋白质如免疫球蛋白的特异性和其他所需性质的亲和力成熟和其他技术。
认为核酸序列或氨基酸序列是“(处于)基本上分离的(形式)”——例如，与其从中获得的反应介质或培养介质相比――此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。尤其是，当它已被纯化至少2倍，尤其是至少10倍，更尤其是至少100倍，并且多至1000倍或更高时，认为核酸序列或氨基酸序列是“基本上分离的”。如使用适合的技术确定的，如适合的色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，“处于基本上分离的形式”的核酸序列或氨基酸序列优选是基本上均匀的。
除非上下文另外清楚地需要，在整个描述和权利要求中，词语“包含”、“包括”等应被解释为与排他的或穷尽的含义相对的包含性的含义；即“包括但不限于”的含义。
例如，当将核苷酸序列、氨基酸序列或多肽被描述为分别“包含”另一种核苷酸序列、氨基酸序列或多肽或被描述为“基本上由”另一种核苷酸序列、氨基酸序列或多肽“组成”时，这可以意指后面的核苷酸序列氨基酸序列或多肽已经分别结合至首先提及的核苷酸序列、氨基酸序列或多肽中，但是更通常地，这通常意指首先提及的核苷酸序列、氨基酸序列或多肽在其序列内分别包含分别具有与后面的序列相同的核苷酸序列或氨基酸序列的一段核苷酸或氨基酸残基，而无论首先提及的序列实际上是如何产生或获得的(例如，其可以借助在本文中所述的任何适合的方法)。通过非限制性实例的方式，当本发明的多肽被描述为包含免疫球蛋白单可变结构域时，这可以意指所述免疫球蛋白单可变结构域序列已经结合至本发明的多肽的序列中，但是更通常地，这通常意指本发明的多肽在其序列内含有免疫球蛋白单可变结构域的序列，而无论本发明的所述多肽是如何产生或获得的。此外，当核酸或核苷酸序列被描述为包含另一种核苷酸序列时，首先提及的核酸或核苷酸序列优选为使得当将其表达至表达产物(例如，多肽)中时，由后面的核苷酸序列编码的氨基酸序列构成所述表达产物的一部分(换句话说，后面的核苷酸序列在与首先提及的、较大的核酸或核苷酸序列相同的阅读框中)。
“基本上由……组成”或“基本由……组成”等意指在本文中使用的多肽与本发明的多肽完全相同或者对应于具有在免疫球蛋白单可变结构域的氨基端末端、羧基端末端、或氨基端末端和羧基端末端二者添加的有限数量的氨基酸残基如1-20个氨基酸残基、例如1-10个氨基酸残基并且优选1-6个氨基酸残基如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基的本发明的多肽。
对于特异性抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质(或对于其至少一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和力和/或具有特异性的氨基酸序列(如本发明的免疫球蛋白单可变结构域、抗体、多肽，或通常抗原结合蛋白或多肽或其片段)被描述为“针对(against)”或“针对(directed against)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常以KD或解离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表示为结合常数KA，其等于1/KD并且具有(摩尔/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子之间的相互作用的稳定性将会主要以它们的相互作用的KD值表示；对技术人员来说清楚的是，考虑到关系KA＝1/KD的关系，通过其KD值指定的分子相互作用的强度也可以用于计算相应的KA值。KD值表征还在热力学含义上表征分子相互作用的强度，因为其凭借DG＝RT.ln(KD)(等同于DG＝-RT.ln(KA))与结合的自由能变化(DG)有关，其中R等于气体常数，T等于绝对温度并且ln表示自然对数。
被认为有意义(例如，特异性)的生物相互作用的KD通常在10-12M(0.001nM)至10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD还可以表示为由koff表示的配合物的解离速率常数与由kon表示的其结合速率的比率(因此KD＝koff/kon并且KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位符号)。结合速率kon具有单位M-1s-1。结合速率可以在102M-1s-1至约107M-1s-1之间变化，接近生物分子相互作用的扩散限制的结合速率常数。解离速率凭借关系t1/2＝ln(2)/koff与所给出的分子相互作用的半衰期有关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有数天的t1/2的不可逆配合物)至1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
抗原结合蛋白如ISVD与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何适合的本身已知的方式确定，包括例如，Scatchard分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和其在本领域中本身已知的不同变体；以及在本文中提及的其他技术。
两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技术进行测量，例如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(参见例如Ober等人，2001,Intern.Immunology 13:1551-1559)，其中一个分子被固定在生物传感器芯片上并且另一个分子在流动状态下通过被固定的分子，得到kon、koff的测量值并且因此得到KD(或KA)值。例如，这可以使用公知的
Figure BDA0001427334130000181
仪器(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)进行。动力学排除测定
Figure BDA0001427334130000182
(Drake等人，2004,Analytical Biochemistry 328:35-43)在不标记结合配偶体(binding partner)的情况下测量溶液中的结合事件，并且基于对配合物的解离进行动力学排除。
Figure BDA0001427334130000183
免疫测定系统提供了用于自动化生物分析和快速样品转变的平台(Fraley等人，2013,Bioanalysis 5:1765-74)。
对技术人员来说还将会清楚的是，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的固有结合亲和力(例如，通过与一个分子涂布在生物传感器上有关的人工行为)，则测量的KD可以相当于表观KD。此外，如果一个分子含有一个以上针对其他分子的识别位点，则可以测量表观KD。在这样的情况中，测量的亲和力可能会受两个分子的相互作用的抗体亲抗原性的影响。如对技术人员来说将会清楚的，并且如在WO 08/020079的第53-56页描述的，解离常数可以是实际或表观解离常数。用于确定解离常数的方法对技术人员来说将会是清楚的，并且例如，包括在WO 08/020079的第53-56页提及的技术。
术语“特异性”具有在WO 08/020079的第53-56页第n)段中赋予其的含义；并且如在其中提及的，是指特定的抗原结合分子或抗原结合蛋白(如本发明的二聚体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数量。抗原结合蛋白的特异性可以基于亲和力和/或抗体亲抗原性确定，如在WO 08/020079(通过引用结合在本文中)的第53-56页描述的，其还描述了用于测量抗原结合分子(如本发明的多肽或ISVD)和相关抗原之间的结合的一些优选的技术。通常，抗原结合蛋白(如本发明的免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)将会以10-5至10-12摩尔/升以下、并且优选10-7至1012摩尔/升以下并且更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即以105至1012升/摩尔以上，并且优选107至1012升/摩尔以上并且更优选108至1012升/摩尔的结合常数(KA))与它们的抗原结合。通常认为任何大于10-4摩尔/升的KD值(或任何低于104升/摩尔的KA值)表示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白单可变结构域将会以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM如小于500pM的亲和力与所需抗原结合。
可以用于评估亲和力的另一种方法是Friguet等人，1985(J.Immunol.Methods77:305-19)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定)过程。这种方法建立了溶液相结合平衡测量并且避免了与一个分子在载体如塑料上的吸附有关的可能的人工行为。
然而，KD的准确测量可能会是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观KD值以评估两个分子的结合强度。应该指出的是，只要所有测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，可以使用表观KD测量作为真实KD的近似值，并且因此在本文中，应当以同等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
最后，应当指出的是，在许多情况中，有经验的科学家可以判断是否方便测定相对于一些参考分子的结合亲和力。例如，为了评估分子A和分子B之间的结合强度，可以例如使用参考分子C，其已知与B结合并且用荧光团或发色团基团或其它化学部分适当地标记，如用于在ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中进行容易的检测的生物素或其他形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的发色团，用于链霉抗生物素蛋白(streptavidin)介导的ELISA检测的生物素)。通常，参考分子C保持在固定浓度，且A的浓度对于给定浓度或量的B来说是变化的。结果获得相应于A的浓度的IC50值，在缺乏A的条件下测量的C的信号在该A的浓度条件下减半。如果KD ref，参考分子的KD是已知的，而且参考分子的总浓度cref也是已知的，则可以根据下式获得相互作用A-B的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KD ref)。注意，如果cref<<KD ref，则KD≈IC50。如果对于所比较的结合物来说，IC50的测量以一致的方式(例如保持cref固定)进行，则可以通过IC50评价分子相互作用的强度或稳定性，并且将这种测量判定为等同于在整个本文中的KD或表观KD。
半最大抑制浓度(IC50)是化合物在抑制生物或生物化学功能方面的有效性(例如药理学作用)的量度。这种定量的量度表示将给定的生物过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体、趋化性、间变(anaplasia)、转移、侵入等)抑制一半需要多少ISVD(例如，纳米抗体)(抑制剂)。换句话说，它是物质的半最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC或IC50)。可以通过构建剂量-响应曲线并且检验不同浓度的拮抗剂如本发明的ISVD(例如，纳米抗体)对反转激动剂活性的影响来确定药物的IC50。可以通过确定抑制激动剂的最大生物应答的一半所需的浓度来计算给定的拮抗剂如本发明的ISV(例如，纳米抗体)的IC50值。
术语半最大效应浓度(EC50)是指在指定暴露时间之后诱导在基线和最大值之间一半处的响应的化合物的浓度。在本文的上下文中，使用其作为多肽的、ISVD的(例如，纳米抗体的)效力的量度。分级剂量响应曲线的EC50表示其中观察到其最大作用的50％的化合物的浓度。浓度优选以摩尔单位表示。
在生物系统中，配体浓度的小变化通常引起响应的快速变化，遵循S型函数。在增加配体浓度的情况下响应的增加开始变慢的拐点是EC50。这可以通过对最佳拟合线求导来数学确定。在多数情况中，依赖于图表进行估算是方便的。在实施例部分中提供EC50的情况中，设计实验以尽可能准确地反映KD。换句话说，之后可以认为EC50值是KD值。术语“平均KD”涉及在至少1个，但是优选多于1个，如至少2个实验中得到的平均KD值。术语“平均”是指数学术语“平均”(数据的总和除以数据中的项数)。
其还与作为化合物的抑制(50％抑制)的量度的IC50有关。对于竞争结合测定和功能性拮抗剂测定来说，IC50是剂量-响应曲线的最常用的概要量度。对于激动剂/刺激剂测定来说，最常用的概要量度是EC50。
抑制剂常数Ki是抑制剂有多强效的指征；它是产生半最大抑制所需的浓度。可以通过使用Cheng-Prusoff方程计算绝对抑制常数Ki：
Figure BDA0001427334130000211
其中[L]是配体的固定浓度。
如在本文中所使用的术语“遗传融合”是指例如编码ISVD的个体核酸通过酰胺键的偶联，其中编码ISVD的核苷酸序列通过其3’末端核酸通过磷酸二酯键与另一个编码ISVD的核苷酸序列的5’末端核酸偶联，如果适合，则通过多种长度的(核酸)接头偶联，例如，编码ISVD的核苷酸序列通过其3’末端核酸通过磷酸二酯键与接头序列的5’末端核酸偶联，所述接头序列通过其3’末端核酸通过磷酸二酯键与另一个编码ISVD的核苷酸序列的5’末端核酸偶联(即，ISVD和任选的接头是遗传融合的)。遗传融合可以根据标准重组DNA方案(见上文)或者根据在例如Garaicoechea等人(2008、J Virol.82：9753-9764)的实例部分中描述的进行。
根据上下文，氨基酸序列被解释为意指单一氨基酸或两个以上氨基酸的无分支序列。核苷酸序列被解释为意指3个以上核苷酸的无分支序列。
氨基酸是通常发现于自然存在的蛋白质中的那些L氨基酸并且在以下表1中列出。该定义不意欲包括含有D-氨基酸的那些氨基酸序列。含有翻译后修饰的氨基酸的任何氨基酸序列均可以被描述为首先使用在以下表中所示的符号翻译并且具有修饰位置的氨基酸序列；例如，羟基化或糖基化，但是这些修饰不应在氨基酸序列中明确示出。该定义包括可以被表示为通过键、交联和端帽、非肽键等修饰的序列的任何肽或蛋白质。
表1：常见氨基酸
Figure BDA0001427334130000221
术语“蛋白质”、“肽”、“蛋白质/肽”和“多肽”在整个本公开中可互换使用并且各自具有用于本公开的目的的相同的含义。每个术语是指由两个以上氨基酸的直链制成的有机化合物。化合物可以具有十个以上氨基酸；二十五个以上氨基酸；五十个以上氨基酸；一百个以上氨基酸、两百个以上氨基酸、和甚至三百个以上氨基酸。技术人员将会理解：尽管不存在区分多肽和蛋白质的本领域公认的氨基酸数量的截点，多肽通常包含比蛋白质少的氨基酸；可以通过化学合成或重组方法制备多肽；并且通常通过如在本领域中已知的重组方法在体外或体内制备蛋白质。
为了促进对本发明的理解，将会提供与本发明结合使用的术语的简要讨论。习惯上，多肽的一级结构的酰胺键按照其中多肽的胺末端(N末端)总是在左边而酸末端(C末端)在右边的书写氨基酸的顺序。
本发明的多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸。以其最简单的形式，本发明的多肽由一个ISVD和随后的(与其结合或缀合的)半胱氨酸组成。
C端延伸存在于最后一个(位于最C端)的ISVD的最后一个氨基酸残基(通常为丝氨酸残基)的C端，并且包含半胱氨酸残基。优选地，本发明的半胱氨酸部分存在于或者位于C端延伸的C末端。
在本发明的上下文中，C端延伸由至少一个氨基酸、即半胱氨酸部分组成，或者由包含存在于或位于C端延伸的C末端的至少一个半胱氨酸残基的至少两个氨基酸残基至最多50个氨基酸残基的氨基酸序列组成。C端延伸优选由2至40个之间的氨基酸残基，如2至30个之间的氨基酸残基，如，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸残基组成。例如，C端延伸可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基组成，其中位于C末端的氨基酸是半胱氨酸部分，如，例如C端延伸仅由半胱氨酸残基组成；例如，C端延伸可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基以及随后的半胱氨酸部分组成；例如，C端延伸可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个甘氨酸残基以及随后的半胱氨酸部分组成；例如，C端延伸可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个丙氨酸残基以及随后的半胱氨酸部分组成。应该理解的是，多肽的C端延伸优选仅包含一个半胱氨酸部分。
在另一个方面中，半胱氨酸残基存在于或位于与C端末端(C末端)不同的C端延伸中的位点。例如，半胱氨酸残基存在于或位于C端延伸的最后一个氨基酸残基之前(上游)的氨基酸残基(即，本发明的多肽的倒数第二个氨基酸残基)处或C端延伸的最后两个氨基酸残基之前(上游)的氨基酸残基(即，本发明的多肽的倒数第三个氨基酸残基)处。例如，C端延伸可以由其分别第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七个氨基酸残基(即本发明的多肽的倒数第二个氨基酸残基)是半胱氨酸的2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基(如，例如，甘氨酸或丙氨酸)组成；或者C端延伸可以由其分别第一、第二、第三、第四、第五、或第六个氨基酸残基(即本发明的多肽的倒数第三个氨基酸残基)是半胱氨酸的3、4、5、6、7或8个氨基酸残基(如，例如，甘氨酸或丙氨酸)组成。
C端延伸的优选实例在表2中给出。
表2：C端延伸
SEQ ID NO 氨基酸序列 SEQ ID NO 氨基酸序列
1 C 82 CA
2 GC 83 GCA
3 GGC 84 GGCA
4 GGGC 85 GGGCA
5 GGGGC 86 GGGGCA
6 AC 87 ACA
7 AAC 88 AACA
8 AAAC 89 AAACA
9 AAAAC 90 AAAACA
10 CG 91 CGA
11 GCG 92 GCGA
12 GGCG 93 GGCGA
13 GGGCG 94 GGGCGA
14 GGGGCG 95 GGGGCGA
15 GGGGCGGGG 96 GGGGCGGGGA
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含含有半胱氨酸部分(优选仅一个半胱氨酸部分)的50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸残基的C端延伸。半胱氨酸部分优选位于C末端。在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述C端延伸由GlyGlyGlyCys(SEQ ID NO:4)、GlyGlyCys(SEQ ID NO:3)、GlyCys(SEQ ID NO:2)或Cys(SEQ ID NO:1)组成。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含含有优选在C末端的半胱氨酸部分(优选仅一个半胱氨酸部分)和丙氨酸部分的50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸残基的C端延伸。在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述C端延伸由GlyGlyGlyCysAla(SEQ ID NO:85)、GlyGlyCysAla(SEQ ID NO:84)、GlyCysAla(SEQ ID NO:83)或CysAla(SEQID NO:82)组成。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述多肽包含选自由SEQ ID NO:1-15和82-96组成的组中、优选选自SEQ ID NO:1-15的C端延伸。
C端延伸可以通过本领域技术人员已知的任何适合的技术与ISVD偶联，如，例如通过上文针对遗传融合描述的重组DNA技术。
本发明的多肽可以包含多于1个ISVD，如2、3、4或甚至更多个ISVD。因此，本发明涉及包含至少两个ISVD的本发明的多肽。此外，本发明涉及如在本文中所描述的包含第一多肽和第二多肽的二聚体，其中所述第一多肽包含至少两个ISVD和/或所述第二多肽包含至少两个ISVD。
在本发明的多肽中包含的ISVD可以是相同的或不同的。在一个实施方案中，ISVD可以结合相同的靶标，无论ISVD是相同的还是不同的。因此，本发明涉及分别包含相同的ISVD、结合相同靶标的ISVD、和/或含有相同的CDR1、CDR2和CDR3的ISVD的本发明的多肽。在一个实施方案中，ISVD可以结合不同的靶标。在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的包含第一多肽和第二多肽的二聚体，其中所述第一多肽的所述至少两个ISVD是相同的和/或所述第二多肽的至少两个ISVD是相同的。
在本发明的多肽中，无论是否包含在本发明的二聚体中，可以直接连接或通过接头连接ISVD。
相对亲和力可以取决于ISVD在多肽中的位置。应该理解的是，可以根据本领域技术人员的需要选择ISVD在本发明的多肽中的顺序(取向)。个体ISVD的顺序以及多肽是否包含接头是设计选择的问题。与其他取向相比，一些取向(有或没有接头)可以提供优选的结合特征。另外，第一ISVD(例如，ISVD 1)和第二ISVD(例如，ISVD 2)在本发明的多肽中的顺序可以是(从N末端到C末端)：(i)ISVD 1(例如，纳米抗体1)-[接头]-ISVD 2(例如，纳米抗体2)；或(ii)ISVD 2(例如，纳米抗体2)-[接头]-ISVD 1(例如，纳米抗体1)；(其中接头是任选的)。所有取向均包括在本发明中。含有提供所需结合特征的ISVD取向的多肽可以容易地通过常规筛选来鉴定，例如，如在实施例部分中例示的。
在本发明的多肽中，两个以上ISVD如纳米抗体可以直接彼此连接(例如，如在WO99/23221中描述的)和/或可以通过一个或多个适合的接头彼此连接，或它们的任何组合。用于本发明的多肽的适合的接头对技术人员来说将会是清楚的，并且通常可以是在本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头。优选地，所述接头适合在构成预期用于药物用途的蛋白质或多肽中使用。
一些特别优选的接头包括在本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的接头。这些包括在以上引用的出版物中提及的接头，以及例如在本领域中用于构建双抗体或scFv片段的接头(然而，就此而言，应指出的是，在双抗体中和在scFv片段中，尽管所使用的接头序列应当具有允许相关的VH和VL结构域在一起形成完整抗原结合位点的长度、柔性程度和其他性质，而对在本发明的多肽中使用的接头的长度或柔性没有特别的限制，因为每个ISVD如纳米抗体其本身形成完整抗原结合位点)。
例如，接头可以是适合的氨基酸或氨基酸序列，并且尤其是1至50个之间，优选1至30个之间，如1至10个之间的氨基酸残基的氨基酸序列。这样的氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如类型(glyxsery)z的，如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如在WO 99/42077中描述的，和在本文中提及的Ablynx的申请中描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头(参见例如WO 06/040153和WO 06/122825)，以及铰链状区域，如自然存在的重链抗体或相似序列的铰链区域(如在WO 94/04678中描述的)。在表3中描述了优选的接头。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述接头选自由SEQ ID NO:16-26组成的组。
包括在本发明的范围内的是，所使用的一个或多个接头的长度、柔性程度和/或其他性质(尽管不是至关重要，因为其通常针对在scFv片段中使用的接头)可能对本发明的最终的多肽和/或二聚体的性质具有一些影响，包括但不限于对趋化因子(chemokine)或对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或抗体亲抗原性。基于在本文中的公开内容，任选在一些有限的常规实验之后，技术人员将能够确定用于在本发明的特异性多肽和/或二聚体中使用的一种或多种最佳接头。
当在本发明的多肽中使用两个以上接头时，这些接头可以是相同的或不同的。同样地，基于在本文中的公开内容，任选在一些有限的常规实验之后，技术人员将能够确定用于在本发明的特异性多肽中使用的最佳接头。
在本发明的多肽中，ISVD可以在N端延伸之前。在本发明的上下文中，N端延伸由至少一个氨基酸残基至最多40个氨基酸残基(优选2至30个之间的氨基酸残基，如2至20个之间的氨基酸残基，如，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基)的氨基酸序列组成。N端延伸存在于本发明的多肽中的第一(即位于最N端的)ISVD的第一(即位于最N端的，通常根据Kabat编号表示为氨基酸1)氨基酸残基的N端。因此，本发明涉及包含N端延伸的第一多肽和/或第二多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽的所述至少两个ISVD是相同的和/或所述第二多肽的至少两个ISVD是相同的。
在一个实施方案中，二聚体的本发明的第一多肽和本发明的第二多肽是不同的。
在一个实施方案中，制备二聚体的本发明的第一多肽和本发明的第二多肽是相同的。因此，本发明的第一多肽和本发明的第二多肽是相同的。
表3：本发明的一些接头序列
Figure BDA0001427334130000271
Figure BDA0001427334130000281
如下文进一步阐述的，ISVD可以来源于VHH、VH或VL结构域，然而，选择ISVD以使得它们在本发明的多肽中或在本发明的二聚体中不形成VH和VL结构域的互补对。所述纳米抗体、VHH和人源化VHH的不寻常之处在于它们来源于不具有轻链的天然骆驼科动物(camelid)抗体，并且事实上这些结构域不能与骆驼科动物轻链结合形成互补的VHH和VL对。因此，本发明的二聚体和多肽不包含互补的ISVD和/或形成互补的ISVD对，如，例如互补的VH/VL对。
单价多肽包含仅一个结合单元(如，例如，免疫球蛋白单可变结构域)或者基本上由其组成。包含两个以上结合单元(如，例如，免疫球蛋白单可变结构域)的多肽在本文中还将会被称为“多价”多肽，并且在这样的多肽中存在的结合单元/免疫球蛋白单可变结构域在本文中还将会被称为“多价形式”的。例如，“二价”多肽可以包含任选通过一个接头序列连接的两个免疫球蛋白单可变结构域，而“三价”多肽可以包含任选通过两个接头序列连接的三个免疫球蛋白单可变结构域；而“四价”多肽可以包含任选通过三个接头序列连接的四个免疫球蛋白单可变结构域，等等。
在多价多肽中，两个以上免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的，并且可以针对相同的抗原或抗原决定簇(例如针对相同的一个或多个部分或一个或多个表位或者针对不同的部分或表位)或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或者它们的任何适合的组合。含有其中至少一个结合单元针对第一靶标的第一抗原并且至少一个结合单元针对第二靶标(例如，不同于第一靶标)的抗原的至少两个结合单元(如，例如，免疫球蛋白单可变结构域)的多肽还将会被称为“多特异性”多肽，并且在这样的多肽中存在的结合单元(如，例如，免疫球蛋白单可变结构域)在本文中还将会被称为“多特异性形式”的。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包含针对第一靶标的第一抗原的至少一个免疫球蛋白单可变结构域和针对第二抗原(即，不同于所述第一靶标的第一抗原)的至少一个另外的免疫球蛋白单可变结构域等的多肽。
“多互补位多肽”，如，例如，“双互补位多肽”或“三互补位多肽”，包含各自具有不同互补位的两个以上结合单元或者基本上由其组成。在另外的方面中，本发明的多肽是多互补位多肽(在本文中也被称为“本发明的一个或多个多互补位多肽”)，如，例如“本发明的一个或多个双互补位多肽”或“本发明的一个或多个三互补位多肽”。如在本文中所使用的术语“多互补位”(抗原)结合分子或“多互补位”多肽应当意指包含至少两个(即，两个以上)免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对第一靶标并且“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对相同的第一靶标，其中所述“第一”和“第二”免疫球蛋白单可变结构域具有不同的互补位。因此，多互补位多肽包含针对第一靶标的两个以上免疫球蛋白单可变结构域或者由其组成，其中至少一个“第一”免疫球蛋白单可变结构域针对在所述第一靶标上的第一表位并且至少一个“第二”免疫球蛋白单可变结构域针对不同于在所述第一靶标上的第一表位的在所述第一靶标上的第二表位。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽选自下列各项的组：单价多肽、二价多肽、多价多肽、单特异性多肽、双特异性多肽和多特异性多肽。
如在本文中所使用的，本发明的“靶标”是ISVD可以与其结合的任何适合的抗原(例如，任何目标靶标)。例如，本发明的ISVD可以结合或针对靶标(如，例如受体酪氨酸激酶(RTK)或G蛋白偶联受体(GPCR)(例如，参与恶性病的))的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(如果适用)。本发明的靶标可以是在细胞表面上的例如已知参与恶性病的任何靶标，如细胞受体，如，例如，受体酪氨酸激酶(RTK)和RTK介导的信号转导通路组分，其参与肿瘤发生、维持、血管发生、和血管增殖。已经鉴别了约20种不同的RTK类型，其中最广泛研究的是：1.I型RTK(EGF受体家族)(ErbB家族)、2.II型RTK(胰岛素受体家族)、3.III型RTK(PDGF受体家族)、4.IV型RTK(FGF受体家族)、5.V型RTK(VEGF受体家族)、6.VI型RTK(HGF受体家族)、7.VII型RTK(Trk受体家族)、8.VIII型RTK(Eph受体家族)、9.IX型RTK(AXL受体家族)、10.X型RTK(LTK受体家族)、11.XI型RTK(TIE受体家族)、12.XII型RTK(ROR受体家族)、13.XIII型RTK(DDR受体家族)、14.XIV型RTK(RET受体家族)、15.XV型RTK(KLG受体家族)、16.XVI型RTK(RYK受体家族)、17.XVII型RTK(MuSK受体家族)。尤其是，靶标如表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、c-Met、HER3、丛蛋白、整联蛋白、CD44、RON和在参与通路如雷帕霉素(mTOR)通路的Ras/Raf/丝裂原活化的蛋白(MAP)-激酶和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt/哺乳动物靶标的受体上是优选的。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一靶标和所述第二靶标独立地选自由下列各项组成的组：GPCR、受体酪氨酸激酶、DDR1、盘菌素I(CD167a抗原)、DDR2、ErbB-1、C-erbB-2、FGFR-1、FGFR-3、CD135抗原、CD 117抗原、蛋白酪氨酸激酶-1、c-Met、CD148抗原、C-ret、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、CD202b抗原、Trk-A、Trk-B、Trk-C、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Notch受体1-4、FAS受体、DR5、DR4、CD47、CX3CR1、CXCR-3、CXCR-4、CXCR-7、趋化因子结合蛋白2、和CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11；MART-1、癌胚抗原(“CEA”)、gp100、MAGE-1、HER-2、和LewisY抗原、CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3、CD25、TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、GD2、GD3、CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD45、CD52、和CD147；生长因子受体，包括ErbB3和ErbB4；和细胞因子受体，包括白细胞介素-2受体γ链(CD132抗原)；白细胞介素-10受体α链(IL-10R-A)；白细胞介素-10受体β链(IL-10R-B)；白细胞介素-12受体β-1链(IL-12R-β1)；白细胞介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)；白细胞介素-13受体α-1链(IL-13R-α-1)(CD213al抗原)；白细胞介素-13受体α-2链(白细胞介素-13结合蛋白)；白细胞介素-17受体(IL-17受体)；白细胞介素-17B受体(IL-17B受体)；白细胞介素21受体前体(IL-21R)；白细胞介素-1受体，I型(IL-1R-1)(CD121a)；白细胞介素-1受体，II型(IL-1R-β)(CDw121b)；白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白(IL-1ra)；白细胞介素-2受体α链(CD25抗原)；白细胞介素-2受体β链(CD122抗原)；白细胞介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原)。
示例性的分子靶标(例如，抗原)包括CD蛋白如CD2、CD3、CD4、CD8、CD11、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD34、CD40、CD52；ErbB受体家族成员如EGF受体(EGFR、HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)或HER4(ErbB4)受体；巨噬细胞受体如CRIg；肿瘤坏死因子如TNFa或TRAIL/Apo-2；细胞粘附分子如LFA-1、Mad、p150、p95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和ανβ3整联蛋白(包括其a或β亚基)；生长因子和受体如EGF、FGFR(例如，FGFR3)和VEGF；IgE；细胞因子如IL1；细胞因子受体如IL2受体；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C；神经菌毛素(neutropilin)；肝配蛋白(ephrin)和受体；导蛋白(netrin)和受体；slit和受体；趋化因子和趋化因子受体如CCL5、CCR4、CCR5；淀粉样蛋白β；补体因子，如补体因子D；脂蛋白，如氧化LDL(oxLDL)；淋巴细胞毒素，如淋巴细胞毒素α(LTa)。其他分子靶标包括Tweak、B7RP-1、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、骨硬化蛋白(sclerostin)、c-kit、Tie-2、c-fms、和抗M1。
在优选的实施方案中，ISVD中的至少一个与表皮生长因子受体(EGFR)，优选人EGFR或由通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/uniprot/P00533)提供的P00533-1、P00533-2、P00533-3或P00533-4代表的其任何同种型，甚至更优选由SEQ ID NO:61表示的hEGFR结合。
Figure BDA0001427334130000321
在一个实施方案中，本发明的多肽选自SEQ ID NO:27-31和62-81。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含与CD4、CD123、IL23、CXCR4、IL12Rb1、IL12Rb2或CEACAM5结合的ISVD中的至少一个，优选所述ISVD独立地选自SEQ ID NO:97-110(参见表6)。
还预期的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域、多肽和/或二聚体通常将会与其靶标的所有自然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段结合。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽的所述ISVD结合第一靶标和/或所述第二多肽的所述ISVD结合第二靶标。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽结合第一靶标：
-具有至多100nM，如50nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM，优选甚至至多2nM，如1nM的IC50，通过竞争FACS测定；
-具有10-5至10-12摩尔/升以下，并且优选10-7至10-12摩尔/升以下并且更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)；
-具有在102M-1s-1至约107M-1s-1之间，优选103M-1s-1至107M-1s-1之间，更优选104M-1s-1至107M-1s-1之间，如105M-1s-1至107M-1s-1之间的结合速率(kon速率)；和/或
-具有在1s-1至10-6s-1之间，优选10-2s-1至10-6s-1之间，更优选10-3s-1至10-6s-1之间，如10-4s-1至10-6s-1之间的解离速率(koff速率)。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第二多肽结合第二靶标：
-具有至多100nM，如50nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM，优选甚至至多2nM，如1nM的IC50，通过竞争FACS测定；
-具有10-5至10-12摩尔/升以下，并且优选10-7至10-12摩尔/升以下并且更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)；
-具有在102M-1s-1至约107M-1s-1之间，优选103M-1s-1至107M-1s-1之间，更优选104M-1s-1至107M-1s-1之间，如105M-1s-1至107M-1s-1之间的结合速率(kon速率)；和/或
-具有在1s-1至10-6s-1之间，优选10-2s-1至10-6s-1之间，更优选10-3s-1至10-6s-1之间，如10-4s-1至10-6s-1之间的解离速率(koff速率)。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一靶标和所述第二靶标是不同的。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一靶标和所述第二靶标是相同的。
除非另外指出，无论在本文中用于指代重链抗体或指代常规4-链抗体，术语“免疫球蛋白序列”均用作通用术语，包括全尺寸抗体，其单独的链，以及其所有部分、结构域或片段(分别包括但不限于抗原结合结构域或片段如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，如在本文中所使用的术语“序列”(例如在如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”的术语中)通常应被理解为包括相关氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列二者，除非上下文需要更有限制性的解释。
可以使用免疫球蛋白单可变结构域作为用于制备含有可以充当结合单元(即，针对相同靶标的相同或不同表位和/或针对一个或多个不同靶标)的一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域的多肽的“结合单元”、“结合结构域”或“构建单元”(这些术语可互换使用)。
可与“单可变结构域”(“SVD”)互换使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”(“ISVD”)定义了其中抗原结合位点存在于单一免疫球蛋白结构域上并且由单一免疫球蛋白结构域形成的分子。这使得免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或它们的片段不同，其中两个免疫球蛋白结构域可变结构域，尤其是两个可变结构域，相互作用以形成抗原结合位点。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用以形成抗原结合位点。在这种情况中，VH和VL二者的互补决定区(CDR)将会有利于抗原结合位点，即在抗原结合位点形成中将会涉及总计6个CDR。
相比之下，免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单一VH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不多于三个CDR形成。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”和“单可变结构域”因此不包括需要至少两个可变结构域相互作用以形成抗原结合位点的常规免疫球蛋白或它们的片段。然而，这些术语包括其中通过单可变结构域形成抗原结合位点的常规免疫球蛋白的片段。
通常，单可变结构域将会是基本上由4个构架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成的氨基酸序列。这样的单可变结构域和片段是最优选的，从而它们包含免疫球蛋白折叠或者能够在适合条件下形成免疫球蛋白折叠。因此，单可变结构域可以例如包含轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其适合的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其适合的片段；只要其能够形成单一抗原结合单元(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，以使得单一抗原结合单元不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元，例如对于在例如常规抗体和scFv片段中存在的、需要例如通过VH/VL相互作用而与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合结构域的可变结构域来说是这样的情况)。
在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或重链可变结构域序列(例如，VH序列)；更具体地，免疫球蛋白单可变结构域可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。
例如，单可变结构域或免疫球蛋白单可变结构域(或适合用作免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸)可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的氨基酸)、“dAb”或dAb(或适合用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如在本文中定义的，并且包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或它们中任一种的任何适合的片段。
对于(单)结构域抗体的概括描述，还参考在本文中引用的现有技术以及参考EP0368684。用于术语“dAb”，例如参考Ward等人，1989(Nature 341:544-546)，参考Holt等人，2003(Trends Biotechnol.21:484-490)；以及参考例如WO 04/068820、WO 06/030220、WO06/003388、WO 06/059108、WO 07/049017、WO 07/085815和Domantis Ltd.的其他公布的专利申请。还应当指出，尽管因为它们不是哺乳动物来源的而在本发明上下文中较不优选，单可变结构域可以来源于鲨鱼的某些种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。
尤其是，免疫球蛋白单可变结构域可以是
Figure BDA0001427334130000351
(如在本文中定义的)或其适合的片段。[注释：
Figure BDA0001427334130000352
和
Figure BDA0001427334130000353
是埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的注册商标]对于纳米抗体的概括描述参考以下的进一步描述，以及参考在本文中引用的现有技术，如，例如，在WO 08/020079(第16页)中描述的。
对于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans 2001(分子生物技术中的综述(Reviews in Molecular Biotechnology)74:277-302)的综述文章，以及参考作为一般背景技术提及的以下专利申请：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituutvoor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司的WO 03/050531；加拿大国立研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO 03/025020；以及埃博灵克斯股份有限公司的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825和埃博灵克斯股份有限公司的另外的公布的专利申请。还参考在这些申请中提及的另外的现有技术，并且尤其参考在国际申请WO 06/040153的第41-43页提及的参考文献清单，该清单和参考文献通过引用结合在本文中。如在这些参考文献中描述的，纳米抗体(尤其是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)的特征可以尤其在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。可以例如在WO 08/101985和WO 08/142164中找到纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例)和增加纳米抗体半衰期的不同修饰和它们的制备。
因此，在本发明的意义中，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括来源于非人来源、优选骆驼科动物、优选骆驼科动物重链抗体的多肽。如之前描述的，它们可以是人源化的。此外，该术语包括来源于非骆驼科动物来源例如小鼠或人的已经“骆驼源化”的多肽，例如在Davies和Riechmann 1994(FEBS 339:285-290)、1995(Biotechnol.13:475-479)、1996(Prot.Eng.9:531-537)和Riechmann和Muyldermans 1999(J.Immunol.Methods 231:25-38)中描述的。
术语“免疫球蛋白单可变结构域”包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物免疫球蛋白序列。其还包括完全人的、人源化的或嵌合的免疫球蛋白序列。例如，它包括骆驼科动物免疫球蛋白序列和人源化骆驼科动物免疫球蛋白序列，或骆驼源化免疫球蛋白单可变结构域，例如由Ward等人，1989描述的骆驼源化dAb(参见例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann 1994、1995和1996)和骆驼源化VH。
同样地，这样的免疫球蛋白单可变结构域可以以任何适合的方式来源于任何适合的来源，并且例如可以是自然存在的VHH序列(即，来自适合的骆驼科动物物种)或合成或半合成氨基酸序列，包括但不限于部分或完全“人源化”的VHH、“骆驼源化”的免疫球蛋白序列(并且尤其是骆驼源化VH)，以及通过以下技术获得的纳米抗体和/或VHH：如亲和力成熟(例如，从合成的、随机的或自然存在的免疫球蛋白序列如VHH序列开始)、CDR移植、镶盖术(veneering)、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR装配、和技术人员公知的用于改造免疫球蛋白序列的类似技术；或前述中任一项的任何适合的组合。
免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列和结构可以被认为——然而不限于——由四个构架区或“FR”组成，其在本领域中和在本文中分别被称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；以及“构架区4”或“FR4”；所述构架区被三个互补决定区或“CDR”隔开，其在本领域中分别被称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；以及“互补决定区3”或“CDR3”。
因此，通常，可以将ISVD定义为具有以下(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3。尤其是，纳米抗体可以是具有以下(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中标志残基中的一个或多个是如在本文中引用的参考文献中或在表B-2中进一步限定的。
表B-2：纳米抗体中的标志残基
Figure BDA0001427334130000371
Figure BDA0001427334130000381
Figure BDA0001427334130000391
因此，在另一个优选的、但非限制性的方面中，可以将本发明的纳米抗体定义为具有以下(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中：(i)在根据Kabat编号的11、37、44、45、47、83、84、103、104和108位的氨基酸残基中的一个或多个选自在表B-2中提及的标志残基；并且其中：(ii)CDR1、CDR2和CDR3是如在本文中定义的。
在优选的但非限制性的方面中，本发明涉及ISVD(如纳米抗体)，其针对靶标如，例如，EGFR，其由4个构架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
(a)SEQ ID NO:47和55的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:47和55的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO:47和55的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
(d)SEQ ID NO:49和57的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO:49和57的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO:49和57的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
(g)SEQ ID NO:51和59的氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO:51和59的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(i)与SEQ ID NO:51和59的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或这样的氨基酸序列的任何适合的片段。
在优选的但非限制性的方面中，本发明涉及ISVD(如纳米抗体)，其针对靶标如，例如，EGFR，其由4个构架区(分别为FR1至FR4)和3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中：
-FR1选自由下列各项组成的组：
(i)SEQ ID NO:46和54的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:46和54的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(iii)与SEQ ID NO:46和54的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR1选自由下列各项组成的组：
(a)SEQ ID NO:47和55的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:47和55的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO:47和55的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-FR2选自由下列各项组成的组：
(iv)SEQ ID NO:48和56的氨基酸序列；
(v)与SEQ ID NO:48和56的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(vi)与SEQ ID NO:48和56的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
(d)SEQ ID NO:49和57的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO:49和57的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO:49和57的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-FR3选自由下列各项组成的组：
(vii)SEQ ID NO:50和58的氨基酸序列；
(viii)与SEQ ID NO:50和58的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(ix)与SEQ ID NO:50和58的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
(g)SEQ ID NO:51和59的氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO:51和59的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(i)与SEQ ID NO:51和59的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-FR4选自由下列各项组成的组：
(x)SEQ ID NO:52和60的氨基酸序列；
(xi)与SEQ ID NO:52和60的氨基酸序列中的至少一个具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(xii)与SEQ ID NO:52和60的氨基酸序列中的至少一个具有3、2、或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或这样的氨基酸序列的任何适合的片段。
优选地，ISVD选自由SEQ ID NO:45和53组成的组。
在免疫球蛋白单可变结构域中的氨基酸残基的总数量可以在110-120的范围内，优选为112-115，并且最优选113。
如在WO 08/020079(通过引用结合在本文中)的第58和59页的q)段中进一步描述的，根据由Kabat等人给出的针对VH结构域的通用编号(“Kabat编号”)(“免疫学目标蛋白序列(Sequence of proteins of immunological interest)”,美国公众健康服务中心(USPublic Health Services),NIH Bethesda,MD,公布号91)对免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基进行编号，如在Riechmann和Muyldermans 2000(J.Immunol.Methods 240:185-195；参见例如该出版物的图2)的文章中应用于骆驼科动物的VHH结构域的，并且相应地，免疫球蛋白单可变结构域的FR1包含在1-30位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR1包含在31-35位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR2包含在36-49位的氨基酸，免疫球蛋白单可变结构域的CDR2包含在50-65位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR3包含在66-94位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR3包含在95-102位的氨基酸残基，并且免疫球蛋白单可变结构域的FR4包含在103-113位的氨基酸残基。
基于在本文中以及在WO 08/020079中、在WO 06/040153中和在另外的关于免疫球蛋白单可变结构域的在其中引用的参考文献中给出的免疫球蛋白单可变结构域序列的实例，将会清楚的是，氨基酸残基的精确数量还将会取决于在免疫球蛋白单可变结构域中存在的特定CDR的长度。就CDR而言，如在本领域中公知的，存在多种定义并且描述VH或VHH片段的CDR的习惯，如Kabat定义(其基于序列可变性并且是最常用的)和Chothia定义(其基于结构环区域的位置)。例如，参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/。对于本说明书和权利要求的目的来说，即使也可以提及根据Kabat的CDR，最优选基于Abm定义(其基于OxfordMolecular的AbM抗体建模软件)来定义CDR，因为认为这是在Kabat和Chothia定义之间的最佳折衷。再次参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/)。
在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTVSS，即109、110、111、112和113位中的每一个。本发明还包括在109、110、111或112位终止的ISVD。在本发明的一个方面中，FR4以C端氨基酸序列VTVS(109-112位)终止，FR4以C端氨基酸序列VTV(109-111位)终止，FR4以C端氨基酸序列VT(109-110位)终止，或者FR4以C端氨基酸V(109位)终止。C端延伸可以存在于最后一个(位于最C端)的ISVD的FR4的最后一个氨基酸残基例如V109、T110、V111、S112或S113的C端，其中本发明的半胱氨酸部分优选存在于或者位于C端延伸的C末端。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTVSS并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTVSSC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTVS并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTVSC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VTV并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTVC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸序列VT并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VTC终止)。在一个实施方案中，FR4包含C端氨基酸V并且C端延伸是半胱氨酸(例如，本发明的多肽以VC终止)。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中ISVD是轻链可变结构域序列(VL)，是重链可变结构域序列(VH)，来源于常规四链抗体或来源于重链抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述ISVD中的每一个独立地选自由下列各项组成的组：单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb、适合用作dAb的氨基酸序列、纳米抗体、VHH、人源化VHH、和骆驼源化VH。优选地，ISVD包含100至140个之间的氨基酸，如110-130个之间的氨基酸。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述ISVD中的每一个独立地选自由纳米抗体、VHH、人源化VHH、和骆驼源化VH组成的组，包含105至125个之间的氨基酸，如优选110-120个之间的氨基酸，如110、111，如110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个氨基酸，最优选113个氨基酸。
本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述ISVD中的每一个独立地选自由纳米抗体、VHH、人源化VHH、和骆驼源化VH组成的组，在根据Kabat编号的105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118 119或120位氨基酸，优选在113位氨基酸终止。
本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述ISVD中的每一个独立地选自由下列各项组成的组：单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb、适合用作dAb的氨基酸序列和骆驼源化VH，其中所述单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb、适合用作dAb的氨基酸序列和骆驼源化VH来源于VH。
本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb、适合用作dAb的氨基酸序列和骆驼源化VH包含110-130个氨基酸，优选115-127个氨基酸，如115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126或127个氨基酸，最优选123个氨基酸。优选地，其中所述单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb、适合用作dAb的氨基酸序列和骆驼源化VH在根据Kabat编号的氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130处，优选在氨基酸123处终止。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述ISVD中的每一个独立地选自由下列各项组成的组：单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb和适合用作dAb的氨基酸序列，其中所述单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb或适合用作dAb的氨基酸序列来源于VL。优选地，其中所述单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb和适合用作dAb的氨基酸序列包含100-120个氨基酸，优选105-115个氨基酸，如100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个氨基酸，最优选108个氨基酸。优选地，其中所述单一结构域抗体、结构域抗体、适合用作单一结构域抗体的氨基酸序列、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、dAb和适合用作dAb的氨基酸序列，在根据Kabat编号的氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120处，优选在氨基酸108处终止。
在本发明的具体的方面中，本发明的多肽或二聚体可以具有与本发明的相应多肽或二聚体相比增加的半衰期。基于在本文中的进一步的公开内容，这样的多肽或二聚体的一些优选的、但是非限制性的实例对技术人员来说将会变得清楚，并且例如包含已经被化学修饰以增加其半衰期(例如，借助聚乙二醇化)的本发明的多肽；包含用于与血清蛋白(如血清白蛋白)结合的至少一个另外的结合位点的本发明的多肽；或包含与增加本发明的多肽的半衰期的至少一个部分连接的至少一个本发明的多肽的本发明的多肽。
根据本发明的具体的、优选的但非限制性的方面，除了针对靶细胞上的表位的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域之外，本发明的多肽还可以含有针对人血清白蛋白的至少一个免疫球蛋白单可变结构域。这些针对人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域可以是通常如在本文中引用的埃博灵克斯股份有限公司的申请中描述的(参见例如WO 04/062551)。提供增加的半衰期并且可以在本发明的多肽中使用的一些特别优选的ISVD，如纳米抗体包括在WO 06/122787(参见表II和III)中公开的ISVD，例如纳米抗体ALB-1至ALB-10(其中ALB-8(WO 06/122787中的SEQ ID NO:62)是特别优选的)，以及WO 2012/175400中公开的ISVD，例如纳米抗体(WO 2012/175400的SEQ ID NO:1-11)和在题目为“改进的免疫球蛋白单可变结构域(Improved immunoglobulin single variable domains)”的共同待审美国临时申请号62/047,560(提交日期：2014年9月8日；受让人：埃博灵克斯股份有限公司)中公开的具有SEQ ID NO:109的ISVD，例如纳米抗体。
在另外的方面中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元(如在本文中进一步限定的)，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元增加二聚体的半衰期(与缺少所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元的二聚体相比)。优选地，增加二聚体的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元是增加二聚体的半衰期的ISVD。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中增加二聚体的半衰期的所述ISVD结合血清白蛋白，优选人血清白蛋白，或血清免疫球蛋白，优选人IgG。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其具有比不具有增加二聚体的半衰期的所述ISVD的相应二聚体的半衰期大至少1.5倍，优选至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或多于20倍的血清半衰期。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其具有与增加二聚体的半衰期的相应的所述ISVD相比增加多于1小时，优选多于2小时，更优选多于6小时，如多于12小时、或甚至多于24、48或72小时的血清半衰期。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其具有的在人中的血清半衰期为至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，再更优选至少72小时以上；例如，至少5天(如约5至10天)，优选至少9天(如约9至14天)，更优选至少约10天(如约10至15天)，或至少约11天(如约11至16天)，更优选至少约12天(如约12至18天以上)，或多于14天(如约14至19天)。
在本发明的特别优选的但非限制性的方面中，本发明提供包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的本发明的多肽；并且其还包含如在本文中所描述的一个或多个(优选一个)血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域，例如选自SEQ ID NO:32-44的例如Alb11、Alb23、Alb129、Alb132、Alb8、Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG(参见表10)的血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域。
表10：结合ISVD序列的血清白蛋白(“ID”是指如在本文中所使用的SEQ ID NO)
Figure BDA0001427334130000471
ISVD，如纳米抗体，包含高度保守的内部(也被称为典型或分子内)二硫键。移除这些特定的内部二硫键损害ISVD的活性。
本发明的发明人意外地观察到，将位于本发明的第一多肽的C端延伸中、优选在C末端处的未配对的半胱氨酸残基(缩写为Cys、cys或C；2-氨基3-巯基丙酸；其为具有化学式HO2CCH(NH2)CH2SH的α氨基酸)的巯基部分(-SH)和位于本发明的第二多肽的C端延伸中、优选在C末端处的未配对的半胱氨酸部分的巯基部分氧化得到了二硫化物衍生物胱氨酸，由此制备二聚体，但是其中分子内巯基部分不发生反应。换句话说，如在实施例部分中证实的，在没有异常或使分子内巯基团重新氧化的情况下，位于C端的半胱氨酸的巯基被特异性氧化以形成分子间键，从而维持ISVD的完整性。通过化学缀合进行多肽向二聚体中的偶联，其中在两个多肽中的每一个中的C端延伸中的半胱氨酸的巯基部分被氧化为二硫化物衍生物胱氨酸。优选地，所述胱氨酸(例如，二硫桥)在二聚体中存在的唯一的链间二硫键，例如
Figure BDA0001427334130000481
其中
Figure BDA0001427334130000482
表示二硫化物衍生物胱氨酸；
-[Cys-S]和-[AAx]-[Cys-S]-[AAy]表示包含所述多肽的半胱氨酸的C端延伸；
“AA”表示如在本文中定义的任何氨基酸；
前缀“N”表示多肽的N末端；
后缀“C”表示多肽的C末端；
下标“x”、“y”、“p”和“q”表示数量，其独立地选自在0-50的范围内，如在1-40的范围内，或在2-30的范围内的整数，如，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。例如，如果“x”、“y”、“p”和“q”全部是0，则C端延伸仅为半胱氨酸；并且如果“y”和“q”二者是0但是“x”和“p”不是0，则C端延伸的C末端是半胱氨酸。
本发明涉及一种用于制备(多肽-)二聚体的方法，所述方法至少包括以下步骤：(i)提供第一多肽，其中所述第一多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；(ii)提供第二多肽，其中所述第二多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；和(iii)将在所述第一多肽的C端延伸、优选在C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分和在所述第二多肽的C端延伸、优选在C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸；由此制备所述二聚体；并且所述二硫化物衍生物胱氨酸是在二聚体中存在的唯一的分子间二硫键。
例如，在毕赤酵母生长过的培养基中，可以通过化学缀合进行多肽向二聚体中的偶联，其中在接近中性pH，如，例如在pH 6.5至pH 7.5之间，例如pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4和pH 7.5，将在所述两个多肽中的每一个中的C端延伸中的半胱氨酸(优选位于C端)通过它们的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸。
在一个实施方案中，通过添加例如CuSO4的形式的氧化性铜离子(Cu2+)来优化氧化过程。观察到，在铜处理几乎100％的位于C端的巯基部分被氧化。因此，本发明涉及如在本文中所描述的方法，其中所述第一和/或所述第二多肽的至少80％，如85％、90％、95％、99％或甚至多于99％如100％是二聚化的。可以通过任何适合的方法确定氧化程度，但是优选通过质谱法确定。
本发明进一步涉及如在本文中所描述的方法，其中所述第一多肽包含至少两个ISVD和/或所述第二多肽包含至少两个ISVD。
本发明进一步涉及如在本文中所描述的方法，其中所述第一多肽的所述至少两个ISVD是相同的和/或所述第二多肽的至少两个ISVD是相同的。
本发明进一步涉及如在本文中所描述的方法，其中所述第一多肽和所述第二多肽是相同或不同的。
如在本文中所使用的，术语“双特异性二聚体”是指其中独立于第一和第二多肽的价(例如，单价、二价或多价)或特异性(例如，单特异性、双特异性或多特异性)二聚体的第一多肽与二聚体的第二多肽不同的二聚体。应该理解的是，二聚体可以包含两个相同的、但双特异性的多肽(其在本文中将会被认为是“单特异性二聚体”)。
提供了用于生成双特异性二聚体的方法，例如二聚体的第一多肽与第二多肽不同。在第一实施方案中，用两种不同载体转化宿主菌株，例如毕赤酵母(Pichia)菌株，其中第一载体编码第一多肽并且第二载体编码第二多肽。备选地，使用一种载体，但是载体包含编码第一多肽的第一基因和编码第二多肽的第二基因。备选地，使用各自表达一种或另一种多肽的两种宿主细胞，如，例如在第一宿主细胞(例如，毕赤酵母)中表达编码第一多肽的第一载体，并且在第二宿主细胞(例如，也是毕赤酵母)中表达编码第二多肽的第二载体。
例如，在毕赤酵母生长过的培养基中，可以通过化学缀合进行多肽向双特异性二聚体中的偶联，其中在接近中性pH，如，例如在pH 6.5至pH 7.5之间，例如pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4和pH 7.5，将在所述两个多肽中的每一个中的C端延伸中的半胱氨酸(优选位于C端)通过它们的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于制备双特异性二聚体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(i)提供第一多肽，其中所述第一多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；
(ii)提供第二多肽，其中所述第二多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；
其中所述第一多肽与所述第二多肽不同；和
(iii)通过任选加入氧化性铜离子(Cu2+)，并且优选在pH 6.5至pH 7.5将在所述第一多肽的C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分和在所述第二多肽的C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸；由此制备所述二聚体。
优选地，维持所述ISVD的完整性并且所述胱氨酸是在所述二聚体中存在的唯一的分子间二硫键。
如在本文中所使用的术语“完整性”是指维持ISVD的结构、稳定性和/或功能，如，例如维持连接免疫球蛋白结构域的两层反向平行β片结构并且结合其同源抗原的适当的分子内二硫键。优选地，保持了在氨基酸位置22和92(根据Kabat)之间的二硫键(胱氨酸)，并且如果存在的话，保持了在CDR1和CDR3之间的额外的二硫键。
本发明涉及如在本文中所提供的方法，其中在两种不同的载体上存在编码第一多肽的基因和编码第二多肽的基因。优选地，在一个宿主细胞例如毕赤酵母中存在所述载体。备选地，所述多肽由位于一个载体上的不同基因编码。
本发明的载体可以是任何适合的载体，如，例如质粒、黏粒、YAC、病毒载体或转座子。尤其是，载体可以是表达载体，即可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适合的宿主细胞、宿主生物和/或表达系统中)。
本发明的载体可以用于转化宿主细胞或宿主生物，即用于表达和/或制备本发明的多肽。适合的宿主或宿主细胞对技术人员来说将会是清楚的，并且可以是例如任何适合的真菌、原核或真核细胞或细胞系或任何适合的真菌、原核或(非人)真核生物，例如：
-细菌菌株，包括但不限于革兰氏阴性菌株，如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以及革兰氏阳性菌株，如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；粪壳属(Sordaria)，例如大孢粪壳(Sordaria macrospora)；曲霉菌(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或其它丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或Pichia methanolica；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；Arxula，例如Arxula adeninivorans；耶氏酵母属(Yarrowia)，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；
-两栖动物细胞或细胞系，如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，如来源于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者来源于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞(例如CHO-K1细胞)、BHK-细胞，以及人细胞或细胞系，如HeLa、COS、Caki、NIH3T3和HEK293H细胞；
以及本身已知的用于表达和制备抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和scFv片段)的所有宿主细胞或(非人)宿主，这对技术人员来说将会是清楚的。还参考在上文中引用的一般背景技术，以及参考例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人(Res Immunol.149:589-99,1998)；Riechmann和Muyldermans(1999)，见上文；van der Linden(J.Biotechnol.80:261-70,2000)；Joosten等人(Microb.Cell Fact.2:1,2003)；Joosten等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.66:384-92,2005)；和在本文中引用的另外的参考文献。
在本说明书中，基因被定义为合成功能性多肽所需的全部核酸序列。因此，基因包括比编码多肽的氨基酸序列多的核苷酸(编码区)而且还包括合成特定RNA转录本所需的全部DNA序列。优选地，步骤(iii)在毕赤酵母生长过的培养基中进行。
用于处理核酸如，例如相对于编码ISVD的核酸对核酸进行添加、插入、突变、替换、或缺失的方法是对本领域技术人员来说公知的。参考标准手册，见上文。
本发明的发明人提供了用于制备双特异性二聚体的进一步优化的方案，其中有效率超过50％，如60％、70％、80％或甚至大于90％，如≥95％。这通过将第一反应性多肽与(固体)载体结合并且使第二反应性多肽流经与载体结合的第一多肽来实现。任何未反应的第二多肽均可以再生(还原)并且再次流经与载体结合的第一多肽。可以重复这个步骤直到所有的第一和/或第二多肽发生反应。
在步骤1中，将第一多肽还原以获得单体材料，优选100％单体材料。在本文中给出了用于还原典型多肽溶液的通用条件。
在步骤2中，在缓冲液中的第一多肽在还原条件下与载体结合。载体优选为色谱树脂。优选地，载体仅结合第一多肽，而不结合第二多肽。为了避免可能的第一多肽的同二聚体的形成，在固定时，第一多肽可以以低密度固定至载体。可以通过将载体使用非最佳结合条件(例如，对典型亲和树脂来说过高的流量)或借助通过膨胀床色谱加载来实现这样的个体第一多肽的空间分隔。用于将在载体上的个体多肽空间分隔的方法和条件属于一般常识或者可以通过本领域技术人员利用常规实验实现。在优选的实施方案中，载体仅结合第一多肽，而不结合第二多肽。例如，如果第一多肽(并且优选不是第二多肽)与蛋白A结合，则可以使用载体如蛋白A。备选地，在第一多肽和第二多肽二者均与载体结合的情况中，在固定第一多肽之后，在施加第二多肽之前，用虚拟多肽(dummy polypeptide)如非半胱氨酸延伸的纳米抗体使载体饱和。
在步骤3中，将也处于还原形式的过量的第二多肽(参见以上)施加在缓冲液中并且经过柱循环(任选在略微氧化性的条件下)。使第二多肽经过载体直到被固定的第一多肽通过二硫键与第二多肽完全配合(缀合)。优选地，随后测量第二多肽的浓度降低以匹配饱和的第一多肽群。如对本领域技术人员来说公知的，如果需要，针对这个步骤，优化条件以限制第二多肽的单特异性二聚体的形成的量。不与载体结合的第二多肽群可以被回收并且在将来的偶联反应中使用，如，例如再次被还原并且施加至具有第一多肽的柱，直到第一多肽饱和。
在步骤4中，如本领域技术人员公知的，通过针对所使用的载体的典型洗脱条件从载体中回收双特异性二聚体(例如，针对蛋白A的酸性条件)。
在本文的上下文中，术语“固定”是指通过与固体结构例如载体连接其在空间中的运动完全受限或者受限于有限的小区域的分子。通常，术语固定是指限制运动或使得不能运动的动作，例如使运动延缓。可以通过任何适合的方法固定本发明的二聚体，如，例如通过吸附、共价结合、捕获(entrapment)、封装(encapsulation)和(可逆的)交联，优选共价结合，更优选借助亲和力。可以使用用于固定的任何适合的载体。本领域技术人员将会理解，载体的适用性取决于固定的方法。例如，用于共价结合的载体是琼脂糖、纤维素、交联葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺凝胶、和多孔二氧化硅凝胶。优选的载体是蛋白A树脂。
适合的缓冲液可以包括，但不限于，乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、羧酸盐缓冲液和/或Tris缓冲液。
还原和氧化条件是在本领域内公知的。参考实施例部分、说明书，并且参考例如标准化学手册，如现代化学原理(Principles of Modern Chemistry)(2011，Oxtoby、Gillisand Campion，第7版)。优选的还原条件在1-15mM，如2-12mM、4-11mM、5-10mM、优选10mM DTT中在至多10mg/ml多肽的浓度下，在室温下进行最少1h(至最多8h)或者在4℃下过夜，从而保持典型的-S-S-仍然被氧化。优选的氧化条件在0.1-10mM、0.5-5mM、优选1mM CuSO4中进行1-4h，优选在室温下2h，或者通过使用方便的氧化还原对(redox-couple)，其可以由本领域技术人员容易地确定。
因此，本发明涉及一种用于制备双特异性二聚体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
1.提供第一多肽，其中所述第一多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；
2.将所述第一多肽还原；
3.将步骤2的被还原的第一多肽在还原条件下与载体结合；
4.提供第二多肽，其中所述第二多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)；
-包含优选在C末端的半胱氨酸部分的C端延伸；
其中所述第一多肽与所述第二多肽不同；
5.将所述第二多肽还原；
6.任选在略微氧化性的条件下，将步骤5的被还原的第二多肽施加至步骤3的与载体结合的被还原的第一多肽，将优选在所述第一多肽的C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分和优选在所述第二多肽的C末端的所述半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸；由此制备所述双特异性二聚体；任选直到全部第一多肽通过二硫键与第二多肽完全缀合；
7.任选地根据步骤5和6将未缀合的第二多肽回收、还原并且再次施加；
8.将双特异性二聚体从载体中洗脱。
本发明进一步涉及如在本文中所描述的任何方法，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含N端延伸。
本发明进一步涉及如在本文中所描述的方法，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含含有优选在C末端的半胱氨酸部分的50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸残基的C端延伸。
本发明进一步涉及如在本文中所描述的方法，其中所述C端延伸选自由SEQ IDNO:1-15组成的组，优选地，所述C端延伸由GlyGlyGlyCys(SEQ ID NO:4)、GlyGlyCys(SEQID NO:3)、GlyCys(SEQ ID NO:2)或Cys(SEQ ID NO:1)组成。
本发明进一步涉及如在本文中所描述的方法，其中所述C端延伸与所述多肽中位于最C端的ISVD的C端末端遗传融合。
在另外的实施方案中，将二聚体纯化至均匀。可以通过在本领域中已知的任何适合的技术完成纯化，如色谱，优选尺寸排阻色谱，本领域技术人员对其是完全知晓的。因此，本发明涉及如在本文中所描述的方法，所述方法还包括任选通过尺寸排阻色谱将所述二聚体纯化的步骤。因此，本发明涉及如在本文中所描述的方法，其中所述二聚体被纯化为至少90％纯度以上，例如95％纯度以上，如97％、98％、99％或甚至100％。可以通过在本领域中已知的任何适合的方法确定纯度，并且优选通过质谱法确定。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过如上所述方法制备的二聚体。
本发明的发明人意外地观察到，不仅保持了在二聚体中的多肽的结合和其他功能性特征，如效力，而且与相应的基准相比其甚至还被改善。
在不受任何理论约束的情况下，假设与相应的基准装配(assemblation)相比，ISVD的互补位可以处于用于对这种二聚体装配的抗原识别更“有利”的位置。
如在本文中所使用的，使用“基准”作为用于评价分子的性能如一个或多个功能性特征(如，例如，在本文中所描述的亲和力、功效、和效力)的参考点。特定的二聚体将会确定某个基准的适当性(appropriateness)，这可以由本领域技术人员容易地评估。优选地，基准将会由与二聚体的ISVD的数量和/或身份相同的数量和/或相同的ISVD组成。优选地，基准包含由二聚体组成的相同多肽，但是在该基准中，如在本文中所描述的，这些多肽通过遗传融合而不是化学缀合形成(参见例如，实施例部分)。二聚体与单独组成二聚体的一个或两个多肽之间的比较已经提供了大量关于二聚体性能的信息。
本发明的二聚体包含含有至少一个ISVD的第一多肽和含有至少一个ISVD的第二多肽。可以将两个多肽一起作为整体来确定二聚体的亲和力，或者可以通过确定单独构成二聚体的每个多肽的亲和力来确定二聚体的亲和力。换句话说，在后一种情况中，独立于归因于其他多肽的抗体亲抗原性作用，确定多肽的亲和力。
如在本文中所使用的，术语“效力”是试剂如二聚体、基准、多肽、ISVD或纳米抗体、其生物活性的量度。试剂的效力可以通过在本领域中已知的任何适合的方法确定，如，例如在实施例部分中描述的。基于细胞培养的效力测定通常是用于确定生物活性的优选的形式，因为它们测量由试剂诱发的生理反应并且可以在相对短的时间段内产生结果。基于产物的作用机制，可以使用基于各种类型的细胞的测定，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、报告基因测定、细胞表面受体结合测定和对功能上必需的蛋白或其他信号分子(如磷酸化蛋白、酶、细胞因子、cAMP等)的诱导/抑制进行测量的测定，其全部是在本领域内公知的。来自基于细胞的细胞基于效力的结果可以表示为如通过将本发明的二聚体与针对相应的基准获得的响应进行比较(参考实施例部分)而确定的“相对效力”。
当针对化合物例如本发明的二聚体获得的响应比由参考化合物例如在给定的测定中的相应基准得到的响应好(例如，功能上好)至少1.5倍，如2倍，但是优选至少3倍，如至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍，并且再更优选甚至至少100倍、或更多倍时，化合物例如本发明的二聚体被描述为比基准例如参考化合物，如包含相应多肽的构建体更有效力。
根据所涉及的具体疾病或病症，可以使用任何适合的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型、或它们的任何组合来测试本发明的二聚体、免疫球蛋白单可变结构域和多肽以及包含它们的组合物的功效或效力。适合的测定和动物模型对技术人员来说将会是清楚的，并且例如包括配体置换测定(例如，Burgess等人，Cancer Res2006 66:1721-9)，二聚化测定(例如，WO2009/007427A2,Goetsch,2009)，信号传导测定(例如，Burgess等人，Mol Cancer Ther 9:400-9)，增殖/存活测定(例如，Pacchiana等人，JBiol Chem 2010Sep M110.134031)，细胞粘附测定(例如，Holt等人，Haematologica 200590:479-88)和迁移测定(例如，Kong-Beltran等人，Cancer Cell 6:75-84)，内皮细胞出芽测定(例如，Wang等人，J Immunol.2009；183:3204-11)，和体内异种移植模型(例如，Jin等人，Cancer Res.2008 68:4360-8)，以及在以下实验部分中和在本文中引用的现有技术中使用的测定和动物模型。表示所述第一靶标的体外抑制的方式是通过IC50。
尤其是，本发明的二聚体以比基准好的亲和力(适宜地作为KD值(实际或表观)、KA值(实际或表观)、kon速率和/或koff速率测量)结合靶标。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的包含多肽的二聚体，其中所述二聚体以比基准的IC50好或高至少10％，如20％、30％、50％、80％、90％、或甚至100％的IC50与靶标结合，例如，如在配体竞争测定、竞争FACS、功能性细胞测定，如配体诱导的趋化性的抑制、
Figure BDA0001427334130000581
测定等中确定的，优选通过竞争FACS。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的包含多肽的二聚体，其中所述二聚体以比基准的IC50好至少1.5倍，如2倍、3倍或4倍、和甚至5倍或10倍的IC50与靶标结合，例如，如在配体竞争测定、竞争FACS、功能性细胞测定，如配体诱导的趋化性的抑制、
Figure BDA0001427334130000582
测定等中确定的，优选通过竞争FACS。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的包含多肽的二聚体，其具有在200nM至0.01nM之间的IC50，如0.01、0.05、0.1、0.15、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nM，例如在配体竞争测定、竞争FACS、功能性细胞测定，如配体诱导的趋化性的抑制、
Figure BDA0001427334130000583
测定等中确定的。
运输、制造、储存和交付过程可能会对多肽施加多种应力，如化学和物理应力。在储存过程中，可能发生如，例如脱酰胺、外消旋化、水解、氧化、异构化、β消除或二硫键交换的化学修饰。物理应力可能导致变性和去折叠、聚集、微粒形成、沉淀、乳浊(opalescence)或吸附。已知这些应力可能会影响蛋白治疗剂例如抗体治疗剂的物理化学完整性。
如上文指出的，发明人观察到，本发明的二聚体具有出乎意料的有利的结合和功能特征。这些特征还保持长的时间段，而没有效力的任何明显的或实质的损失。这使得二聚体可用于储存和运输。本发明提供了稳定的本发明的二聚体。“稳定”通常意指经过长时间段例如1个月至36个月的储存，即使暴露于一种或多种化学或物理应力如高温(等于或高于+25℃)或物理应力如振荡或搅拌，二聚体也不遭受明显的物理或化学变化，尤其是氧化。更具体地，“稳定”意指在各种条件(如限定的)下经过长时间段(如限定的)的储存，仅有限地形成一种或多种降解产物，例如本发明的二聚体的低分子量(LMW)衍生物(例如，多肽)；和/或例如由二聚体的聚集形成的高分子量(HMW)衍生物(寡聚物或聚合物)。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中在-20℃、+4℃、室温例如+20℃下或甚至在+25℃下，所述二聚体稳定至少2个月，如4个月、6个月、12个月或甚至更长，如18个月、24个月或36个月，其中所述稳定性特征在于有限地形成或不形成LMW和/或HMW，例如小于10％，如小于5％、小于2％或甚至不可检测的LMW和/或HMW。
可以用于评估蛋白质的稳定性的一般技术包括静态光散射、切向流过滤、傅里叶变换红外光谱法、圆二色谱(circular dichroism)、脲诱导的蛋白质去折叠、固有色氨酸荧光和/或1-苯胺-β8-萘磺酸蛋白质结合。这些技术也适用于本发明的二聚体。此外，在储存过程中和/或在如在本文中定义的一种或多种应力的影响下，本发明的二聚体显示出很少或无效力/生物活性的损失。
因此，本发明涉及用于储存包含反应性半胱氨酸部分的多肽的方法，所述方法至少包括将所述反应性半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸，从而使所述反应性半胱氨酸部分临时失活的步骤，其中所述多肽还包含(内部)胱氨酸键。
尽管本发明的二聚体具有有利的功能特性，本发明的发明人假设，二聚体可以特别适合作为用于瞬时使用的集合体，如，例如使用C端半胱氨酸例如通过马来酰亚胺化学性质的官能团的偶联。开发了使用温和还原条件的方案，其中将二聚体的分子间二硫桥还原以活化成分多肽的巯基。优化的条件引起二硫化物的还原，在不使内部典型ISVD二硫键还原的情况下形成二聚体。
优选的还原剂是基于酸的还原剂如草酸(C2H2O4)、甲酸(HCOOH)、抗坏血酸(C6H8O6)、亚磷酸，或β-巯基乙醇、氢化铝锂(LiAlH4)、初生态(原子)氢、钠汞齐、二硼烷、硼氢化钠(NaBH4)、含有Sn2+离子的化合物如氯化锡(II)、亚硫酸盐化合物、肼、锌汞齐(Zn(Hg))、二异丁基氢化铝(DIBAL-H)、Lindlar催化剂、亚磷酸盐、次磷酸盐、含有Fe2+的化合物如硫酸铁(II)、一氧化碳(CO)、碳(C)、二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦HCl(TCEP)，优选DTT和TCEP。
还原剂的优选的最终浓度在50mM至1mM之间，如40mM至2mM之间，30mM至5mM以及20mM至7.5mM之间，优选10mM。
确定的是，在4℃下用10mM DTT过夜处理(或在室温下在至少2h期间)非常适用于将浓度至多10mg/ml的ISVD的分子间二硫键还原，但是却不影响内部典型二硫键。可以优选使用DTT或TCEP进行还原。不同于TCEP，优选移除DTT以创造最佳的偶联条件。通过尺寸排阻色谱(SEC)，可以将单体多肽与未未还原的二聚体和DTT分离。
可以通过在本领域中已知的任何方式监测还原的程度，如，例如在非还原条件下通过SEC或SDS-PAGE。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的方法，所述方法还包括优选在其中所述第一多肽和/或所述第二多肽的内部二硫键保持被氧化的条件下将所述二聚体的所述(C端)胱氨酸还原的步骤。
因此，本发明涉及一种用于生成包含反应性半胱氨酸部分的多肽的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(i)提供根据本发明的多肽，其通过胱氨酸二聚化(在两个半胱氨酸之间的二硫键；SS-键或二硫桥)；
(ii)将所述胱氨酸还原；
由此生成包含反应性半胱氨酸部分的多肽；优选地，所述胱氨酸键位于所述多肽的C端末端。优选地，选择所述步骤(ii)的还原条件以使得不还原内部(典型)胱氨酸键。
在二聚体还原之后，被还原的单体多肽优选立刻使用，例如在0.5h内，但是优选在10分钟内以用于缀合，或者冷冻以防止重新氧化，尽管不能通过冷冻完全防止重新氧化。实验证据表明，被还原的本发明的单体多肽在4℃下在D-PBS中稳定至多24h。
在一个实施方案中，本发明的二聚体和成分多肽包含一个或多个官能团、残基或部分。优选地，所述一个或多个官能团、残基或部分选自诊断、治疗和标记试剂的组，优选为药物。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。例如，官能团、残基或部分可以与在多肽的C末端的半胱氨酸残基的(反应性)巯基部分偶联或连接和/或官能团、残基或部分可以与本发明的多肽的N末端偶联或连接。在一个实施方案中，本发明的二聚体的一个或两个N末端包含官能团、残基或部分。
这样的基团、残基或部分的实例和可以用于连接这样的基团、残基或部分的方法和技术以及这样的基团、残基或部分的潜在使用和优点对技术人员来说将会是清楚的。在并非限制的情况下，用于抗体修饰的巯基反应性基团包括马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、乙酰卤基团或二硫吡啶基团。尽管在更高的pH值下存在与胺基团的反应性，马来酰亚胺在中性pH下选择性地与半胱氨酸反应。生成稳定的硫醚键。
一个或多个官能团、残基或部分可以与本发明的二聚体和/或多肽连接，这为本发明的二聚体和/或多肽赋予一种或多种所需的性质或功能。这样的官能团、残基或部分的实例对技术人员来说将会是清楚的。例如，这样的一种或多种官能团、残基或部分可以增加本发明的二聚体和/或多肽的半衰期、溶解度和/或吸收，这样的一种或多种官能团、残基或部分可以降低本发明的二聚体和/或多肽的免疫原性和/或毒性，这样的一种或多种官能团、残基或部分可以消除或削弱本发明的二聚体和/或多肽的任何不希望的副作用，和/或这样的一种或多种官能团、残基或部分可以为本发明的二聚体和/或多肽赋予其他有利的性质和/或减少本发明的二聚体和/或多肽的不希望的性质；或者前述中两种以上的任何组合。这样的官能团、残基或部分的实例和用于引入它们的技术对技术人员来说将会是清楚的，并且通常可以包括在本文中引用的一般背景技术中提及的全部官能团、残基或部分和技术以及对于药物蛋白的修饰来说、并且尤其是对于抗体或抗体片段(包括scFv和单一结构域抗体)的修饰来说本身已知的官能团、残基或部分和技术，为此参考例如雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(1980)。
考虑到特异性，本发明的二聚体和/或多肽也非常适用于与在本文中也表示为标记试剂的显像剂缀合。用于与抗体缀合的适合的显像剂是在本领域内公知的，并且类似地，可用于与本发明的二聚体和/或多肽缀合。适合的显像剂包括但不限于优选选自由下列各项组成的组中的分子：有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、地高辛配基(digoxigenin)、生物素、金属配合物、金属、胶体金、荧光标记物、金属标记物、生物素、化学发光物、生物发光物、发色团以及它们的混合物。
因此，本发明涉及还包含显像剂的根据本发明的二聚体和/或多肽，所述显像剂包括但不限于优选选自由下列各项组成的组中的分子：有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、地高辛配基、生物素、金属配合物、金属、胶体金、荧光标记物、金属标记物、生物素、化学发光物、生物发光物、发色团以及它们的混合物。
根据被标记的多肽的预期用途，一个或多个可检测标记物或其他产生信号的基团、残基或部分可以与本发明的二聚体和/或多肽偶联。用于连接、使用和检测它们的适合的标记物和技术对技术人员来说将会是清楚的，并且例如包括但不限于荧光标记物、发磷光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物、放射性同位素、金属、金属螯合物、金属阳离子、发色团和酶，如在WO 08/020079的第109页提及的那些。因它们用作检测剂而在本领域中已知的放射性同位素和放射性核素包括但不限于，3H、14C、15N、18F、35S、64Cu、67Cu、75Br、76Br、77Br、89Zr、90Y、97Ru、99Tc、105Rh、109Pd、111ln、123l、124l、125l、131l、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、203Pb、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、和225Ac。铟111特别优选作为诊断性放射性核素，因为：约1至约10mCi之间可以安全地施用而不具有可检测的毒性；并且显像数据通常预测性后续的PDC分布(参见下文)。参见，例如，Murray 26J.Nuc.Med.3328(1985)和Carraguillo等人,26J.Nuc.Med.67(1985)。
其他适合的标记物对技术人员来说将会是清楚的，并且例如包括可以使用NMR或ESR光谱法检测的部分。例如，如在实施例部分中例示出的，可以用89Zr对本发明的多肽进行放射性标记。根据特异性标记物的选择，这样标记的本发明的多肽可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定如ELISA、RIA、EIA和其他“夹心式测定”等)以及体内诊断和显像目的。在优选的实施方案中，通过microPET显像来检测本发明的放射性标记的多肽和/或二聚体。可以使用AMIDE医疗图像数据检查仪(Medical Image Data Examiner)软件(版本1.0.4，斯坦福大学)重建图像。
可以连接官能团、残基或部分，其为特异性结合对如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分。这样的官能团可以用于将本发明的二聚体和/或多肽连接至与结合对的另一半结合的另一个蛋白、多肽或化合物，即通过形成结合对。例如，本发明的二聚体和/或多肽可以与生物素缀合，并且连接至与抗生物素蛋白(avidin)或链霉抗生物素蛋白(streptavidin)缀合的另一个蛋白、多肽、化合物或载体。例如，可以使用这样的缀合的二聚体和/或多肽作为报告蛋白，例如在其中产生可检测信号的试剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中。这样的结合对也可以例如用于将本发明的二聚体和/或多肽与载体、包括适用于药物目的的载体结合。一个非限制性实例是Cao和Suresh 2000(Journal of Drug Targeting 8(4):257)描述的脂质体制剂。这样的结合对也可以用于将治疗活性剂与本发明的多肽连接。
其他潜在的化学和酶修饰对技术人员来说将会是清楚的。也可以出于研究目的而引入这样的修饰(例如，至研究功能-活性关系)。例如参考Lundblad和Bradshaw 1997(Biotechnol.Appl.Biochem.26:143-151)。
本发明的二聚体和/或多肽可以与治疗剂如药物缀合。因此，在一些实施方案中，本发明的二聚体和/或多肽与药物缀合以形成二聚体/多肽-药物缀合物(在本文中共同缩写为“PDC”)。
在肿瘤学应用中使用同时的抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体-药物缀合物用于药物如细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、毒素或毒素部分的局部递送的用途允许药物部分向肿瘤的靶向递送，这可以允许更高的功效、更低的毒性等。这些ADC具有三种组分：通过(2)接头与(3)药物部分如毒素部分或毒素缀合的(1)单克隆抗体。在Ducry等人，BioconjugateChem.,21:5-13(2010)，Carter等人，Cancer J.14(3):154(2008)和Senter，CurrentOpin.Chem.Biol.13:235-244(2009)中提供了这种技术的概述，其全部通过整体引用结合于此。本发明的PDC也具有三种组分：通过(2)接头与(3)药物如毒素部分或毒素缀合的(1)二聚体或多肽。如以上指出的，尽管与较大尺寸的抗体相比接头和药物的缀合对抗体片段如本发明的多肽的聚集、生物分布和PK特征具有更大且不利的影响，本领域技术人员将会理解的是，ADC的技术、方法、方式等通常等同适用于PDC(参考Feng等人，见上文)。
本发明提供了包含药物如毒素或毒素部分的本发明的多肽(无论是否包含在本发明的二聚体中)。为了完整，本发明提供了包含药物如毒素或毒素部分的二聚体本发明的。
药物，例如毒素部分或毒素可以使用任何适合的方法与二聚体和/或多肽连接或缀合。通常，如在本领域中已知的，缀合通过与二聚体和/或多肽共价连接完成，并且通常依赖于接头，其通常为肽键。例如，药物如毒素部分或毒素可以与多肽直接或通过适合的接头共价结合。适合的接头可以包括不可裂解或可裂解接头，例如包含用于细胞酶(例如，细胞酯酶、细胞蛋白酶如组织蛋白酶B，参见例如实施例部分)的切割位点的可pH裂解接头。这样的可裂解接头可以用于制备可以释放在多肽内在化之后释放药物如毒素部分或毒素的配体。如本领域人员将会理解的，可以改变每个二聚体和/或多肽的药物部分的数量，这取决于反应的条件，并且可以从1:1到20:1药物:多肽变化(也表示为药物-抗体比率或DAR)。如本领域人员还将会理解的，当不严格控制反应和/或纯化时，实际数量是平均值。优选地，本发明的二聚体还包含药物，其中药物与二聚体的比率(DAR)是1。可以使用各种用于将药物如毒素部分或毒素与二聚体和/或多肽连接或缀合的方法。所选择的具体方法将会取决于药物如毒素部分或毒素以及待连接或缀合的二聚体和/或多肽。如果需要，可以使用含有端部官能团的接头连接二聚体和/或多肽和药物例如毒素部分或毒素。通常，通过使含有反应性官能团(或被修饰以含有反应性官能团)的药物例如毒素部分或毒素与接头或直接用二聚体和/或多肽反应来完成缀合。通过使含有(或被修饰以含有)可以在适当条件下与第二化学基团反应而由此形成共价键的化学部分或官能团的药物例如毒素部分或毒素反应而形成共价键。如果需要，可以使用任何适合的方法将适合的反应性化学基团加入至多肽中或加入至接头中(参见，例如，Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press:SanDiego,CA(1996))。许多适合的反应性化学基团组合是在本领域中已知的，例如胺基可以与亲电基团如甲苯磺酸根离子、甲磺酸根离子、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺基酯(NHS)等反应。巯基可以与马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛官能团可以与含胺或含酰肼分子偶联，并且叠氮化物基团可以与三价磷基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺连接。将活化基团引入分子中的适合的方法是在本领域中已知的(参见例如，Hermanson，见上文)。
如在实施例中所示，意外地发现，包含在C末端含有半胱氨酸部分的C端延伸的本发明的多肽明显适用于以非常可控的方式缀合特定的药物数量/多肽，例如1的DAR。与现有技术分子相比，这得到了更好的受控的功效和安全性。因此，本发明涉及包含单一缀合的药物的如在本文中所描述的多肽，例如DAR＝1。本发明的过程因此允许以提高的均匀性制备多肽和二聚体(得到更好的可控PK/PD特征、功效和最终的患者安全性)。
如以下所述，PDC的药物可以是任何数量的试剂，提供包括但不限于细胞生长抑制剂、细胞毒性剂如化疗剂、生长抑制试剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物、或动物来源的酶活性毒素或其片段)、毒素部分、或放射性同位素(即，放射性缀合物)。在其它实施方案中，本发明还提供了使用PDC的方法。本发明还涉及放射免疫疗法(RIT)，其中用放射性同位素标记本发明的多肽或二聚体以将细胞毒性辐射递送至靶细胞。
用于在本发明中使用的药物包括细胞毒性药物，尤其是用于癌症治疗的那些。这样的药物通常包括DNA损伤剂、抗代谢物、天然产物和它们的类似物。示例性类型的细胞毒性剂包括酶抑制剂如二氢叶酸还原酶抑制剂、和胸苷酸合成酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA断裂剂(cleaver)、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类抗生素家族的药物、长春花(vinca)药物、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、细胞毒性核苷、蝶啶家族的药物、diynene、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、多拉司他汀(dolastatin)、美登素类化合物(maytansinoid)、分化诱导剂、和紫杉酚(taxol)。
这些类型的成员包括，例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、氨甲蝶呤(methopterin)、二氯甲氨蝶呤(dichloromethotrexate)、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、美法仑(melphalan)、长春罗新(leurosine)、leurosideine、放线菌素(actinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、丝裂霉素A(mitomycin A)、洋红霉素(caminomycin)、氨基蝶呤(aminopterin)、他利霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和鬼臼毒素衍生物如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、紫杉烷(taxane)类，包括紫杉醇、泰索帝(taxotere)、视黄酸、丁酸、N8-乙酰基亚精胺、喜树碱(camptothecin)、卡奇霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、烯二炔类、多卡霉素(duocarmycin)A、多卡霉素SA(duocarmycin SA)、卡奇霉素(calicheamicin)、喜树碱(camptothecin)、美登素类化合物(maytansinoid)(包括DM1)、单甲基-耳他汀E(monomethyl-auristatin E,MMAE)、单甲基耳他汀F(monomethylauristatin F,MMAF)、和美登素类化合物(DM4)以及它们的类似物，优选MMAE。优选地，与药物如毒素或毒素部分缀合的所述多肽选自由下列各项组成的组：ABL 100-NC003-1、ABL 100-NC003-3、ABL 100-NC003-5、ABL 100-NC003-6和ABL 100-BF012-1，最优选ABL 100-BF012-1。
可以使用药物如毒素作为多肽-毒素缀合物和/或二聚体-毒素缀合物并且包括细菌毒素如白喉毒素，植物毒素如蓖麻毒蛋白，小分子毒素如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等人(2002)BioconjugateChem.13:786-791)，美登素类化合物(EP 1391213；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)，和卡奇霉素(Lode等人(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥它们的细胞毒性和细胞生长抑制作用。
本发明的多肽和/或二聚体和一个或多个小分子毒素如美登素类化合物(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、耳他汀(auristatin)、新月毒素(trichothecene)、卡奇霉素(calicheamicin)、和CC1065、以及具有毒素活性的这些毒素的衍生物的缀合物是预期的。
可以与本发明的二聚体和/或多肽缀合的其他药物，如抗肿瘤药剂包括BCNU、链脲佐菌素(streptozotocin)、长春新碱(vincristine)和5-氟尿嘧啶、美国专利号5,053,394、5,770,710中描述的统称为LL-E33288复合物的药剂家族、以及埃斯培拉霉素(esperamicin)(美国专利号5,877,296)。
可以使用的药物，如酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和新月毒素(tricothecene)。参见，例如，WO 93/21232，1993年10月28日公开。
本发明进一步考虑了在本发明的二聚体和/或多肽和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间形成的PDC。
为了选择性破坏肿瘤，本发明的二聚体和/或多肽可以包含高度放射性的原子。各种放射性同位素可用于制备放射性缀合的PDC。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。
可以以已知的方式在缀合物中结合放射性标记物或其他标记物。例如，多肽和/或二聚体可以生物合成或者可以通过化学氨基酸合成使用适合氨基酸前体(例如，包括用氟-19代替氢)来合成。标记物如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111可以通过肽中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。Iodogen法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57可以用于结合碘-123。可以通过如在Valentine等人(1989)J.Biol.Chem.264:11282中描述的碘珠(iodobead)法对碘-125进行放射性标记。“免疫闪烁成像中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)”(Chatal,CRC Press 1989)详细描述了其他方法。
本领域技术人员可以建立放射性缀合的PDC的有效单一治疗剂量(例如，治疗有效量)，其尤其取决于具体的放射性标记物、PDC的半衰期、毒性、靶标等。优选地，有效单一治疗剂量范围优选在约5至约75mCi之间，更优选约10至约40mCi之间。
PDC化合物的产生可以通过对ADC领域中的技术人员来说已知的任何技术完成。简而言之，PDC化合物可以包括作为抗体单元的本发明的二聚体和/或多肽、药物、和任选的连接药物和本发明的二聚体和/或多肽的接头。
确定药物或抗体-药物缀合物是否发挥作用，例如对细胞的细胞生长抑制和/或细胞毒性作用的方法是已知的。通常，抗体药物缀合物的作用，例如细胞毒性或细胞生长抑制活性可以通过以下方式测量：在细胞培养基中使表达靶蛋白的哺乳动物细胞暴露于抗体药物缀合物；将细胞培养约6小时至约5天的时间段；并且测量细胞活力。基于细胞的体外测定可以用于测量抗体药物缀合物的活力(增殖)、细胞毒性、和细胞凋亡的诱导(半胱天冬酶活化)。这些方法同样适用于PDC。
因此，本发明涉及还包含药物如毒素或毒素部分的本发明的多肽(无论是否包含在本发明的二聚体中)。为了清楚，本发明涉及还包含药物如毒素或毒素部分的二聚体(包含本发明的多肽)。
因此，本发明涉及与药物如毒素或毒素部分缀合的根据本发明的多肽(无论是否包含在本发明的二聚体中)。为了清楚，本发明涉及与药物如毒素或毒素部分缀合的二聚体(包含本发明的多肽)。
PDC将高度选择性的靶向部分的选择性与药物的杀伤效力组合。对于起成功的PDC的组分的作用的根据本发明的多肽(无论是否包含在本发明的二聚体中)来说，多肽需要与在靶细胞例如肿瘤细胞表面上的靶抗原结合。对于大多数药物来说，PDC通过细胞内在化从而变得有效(参见，例如Trail 2013Antibodies 2:113-129综述)。在内在化之后，将PDC输送至溶酶体，在那里后续的PDC的细胞内加工将会将释放生物活性药物以发挥其对靶细胞如肿瘤细胞的(毒性)作用。不仅应当将生物活性药物内在化，而且还优选将用于放射免疫疗法(RIT)的放射性同位素内在化，从而使放射性有效负荷的毒性作用高度局部化。借助本发明的放射性标记的多肽(无论是否包含在本发明的二聚体中)的精确靶向在较低的放射性剂量下导致靶细胞(例如，肿瘤细胞)的选择性的且极其有效的细胞毒性，使副作用最小化。
发明人证实，与相应的单体和二价基准相比，本发明的二聚体的总体内在化似乎更强效和有效，尤其是在具有低靶标数量的细胞中。这种内在化的差异较不明显，然而在以极高水平表达靶标的细胞中仍然明显。
因此，本发明涉及用于癌症的治疗的本发明的二聚体，其中所述二聚体发生内在化。优选地，所述二聚体与(细胞毒性)药物缀合。
因此，本发明涉及本发明的二聚体用于制造用于癌症的治疗的药物的用途，其中所述二聚体发生内在化。优选地，所述二聚体与(细胞毒性)药物缀合。
在一个实施方案中，本发明的二聚体可以用于靶向表达低数量的针对相应ISVD的结合位点的细胞，如少于10*105个结合位点，如5*105个结合位点，或甚至少于10*104个结合位点、5*104个结合位点、1*104个结合位点，或少于5000个结合位点。
在一个实施方案中，本发明涉及用于癌症的治疗的如在本文中所描述的二聚体，其中所述二聚体发生内在化。优选地，所述二聚体与(细胞毒性)药物缀合。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体用于制造用于癌症的治疗的药物的用途，其中所述二聚体发生内在化。优选地，所述二聚体与(细胞毒性)药物缀合。
本发明的发明人还证实，与相关遗传融合的构建体相比，本发明的二聚体具有优秀的特征。如上文所描述的，本发明的二聚体可以通过在第一多肽的半胱氨酸部分和第二多肽的半胱氨酸部分之间的二硫键(例如，通过二硫化物衍生物胱氨酸)直接缀合。通过这种缀合机制，限制了两个多肽之间的柔性。这在大多数情况中是令人满意的，并且与相应的基准相比得到改善的结合特征。
然而，在一些情况中，可以需要在两个单独多肽之间更高的柔性。在一些实例中，可能有利的是允许更高柔性的可以缀合本发明的多肽、并且优选也可以缀合药物的接头。
已经在WO 2005/007197和WO 2013/190292中广泛描述了
Figure BDA0001427334130000701
接头缀合，其通过引用明确地结合在本文中。这种ThioBridge技术针对抗体和其片段如Fab和F(ab’)2而确立。尤其是，ThioBridge技术可以用于在抗体的铰链区中的单一重链间二硫键或者可以用于整个位于抗体的轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的链间二硫键(WO2013/190292)。然而，ThioBridge技术尚未用于ISVD如纳米抗体的二聚体。实际上，在WO 2005/007197和WO 2013/190292中使用的常规抗体与本发明的二聚体之间存在重要的差异。在通过ThioBridge技术在常规抗体或其片段中将链间二硫桥还原的情况中，这些抗体和片段，如VH和VL结构域，通过疏水和静电相互作用和范德华力保持结合。相比之下，在本发明的二聚体中的多肽彼此完全独立，即通常在这些多肽之间不存在除二硫桥之外的相互作用。作为结果，当将cys连接的纳米抗体二聚体还原时，反应性-S-部分可能会与在其附近的任何可用受体基团配对，而并非必须是ThioBridge接头。因此，ThioBridge技术的成功率明显降低。
出乎意料的是，
Figure BDA0001427334130000702
接头缀合适用于本发明的二聚体。
因此，在优选的实施方案中，本发明涉及其中使本发明的二聚体与在来源于二硫键的半胱氨酸残基之间形成桥的缀合试剂反应的方法。优选地，缀合试剂包括聚合物。甚至更优选地，缀合试剂含有官能团(硫桥)：
Figure BDA0001427334130000703
其中W表示吸电子基团；A表示C1-5亚烷基或亚烯基链；B表示键或C1-4亚烷基或亚烯基链；并且每个L独立地表示离去基团。
优选地，聚合物选自由下列各项组成的组：诊断、治疗或标记试剂，如，例如上文所限定的药物，能够结合诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的结合剂(例如，上文所限定的接头)，和聚乙二醇(PEG)。试剂优选具有式(la)，其中W表示氰基，或(lb)：
Figure BDA0001427334130000711
其中Q表示连接基团并且D表示诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物，或者用于诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的结合剂。在式II、III和IV中给出了一些优选的基团Q。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的方法，其中试剂具有式II、III或IV：
Figure BDA0001427334130000712
其中X和X’中的一个表示聚合物并且另一个表示氢原子；
Q表示连接基团；
W表示吸电子基团；或者，如果X’表示聚合物，则X-Q-W可以共同表示吸电子基团；
A表示C1-5亚烷基或亚烯基链；
B表示键或C1-4亚烷基或亚烯基链；并且
每个L独立地表示离去基团；
Figure BDA0001427334130000713
其中X、X’、Q、W、A和L具有对于通式II所给出的含义，并且此外，如果X表示聚合物，则X’和吸电子基团W连同之间的原子一起可以形成环，并且m表示1、2、3、或4的整数；或
X-Q-W-CR1R1’-CR2.L.L’(IV)
其中X、Q和W具有对于通式II所给出的含义，并且
R1表示氢原子或C1-4烷基，R1’表示氢原子，并且L和L’中的每一个独立地表示离去基团；或
R1表示氢原子或C1-4烷基，L表示离去基团，并且
R1和L’共同表示键；或
R1和L共同表示键并且R1和L’共同表示键；并且
R表示氢原子或C1-4烷基。
连接基团Q和离去基团L优选为如在WO2013/190292中描述的，其内容明确地结合在本文中。例如，离去基团L可以例如表示-SR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、卤素、或
Figure BDA0001427334130000721
其中R具有以上所给出的含义，并且
Figure BDA0001427334130000722
表示取代的芳基，尤其是苯基，其含有至少一个吸电子取代基，例如-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR’COR、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、卤素(尤其是氯或尤其是氟)、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中每个R独立地具有以上所给出的含义之一。
本发明涉及如在本文中所描述的方法，所述方法包括将所得缀合物中的吸电子基团W还原的额外步骤。
通常，本发明的多肽与缀合试剂的反应包括将在二聚体中的胱氨酸二硫键还原并且随后使还原产物与缀合试剂反应。适合的反应条件在WO2013/190292中给出。
本发明涉及二聚体，其中缀合试剂通过来源于在多肽的C端末端的二硫桥的两个硫与二聚体结合；其特征在于所述二硫桥是在二聚体中存在的唯一重链间二硫键。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和所述第二多肽与硫桥再桥连。
在一个实施方案中，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，其中所述第一多肽和所述第二多肽通过硫桥缀合。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的二聚体，其中所述药物通过硫桥与二聚体共价结合。
本发明涉及二聚体，其中根据式(V)或式(VI)，所述第一多肽和所述第二多肽通过在所述第一多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)和在所述第二多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)的硫醚键共价连接。
Figure BDA0001427334130000731
其中
“-C-”表示在本发明的多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分，包括在C端延伸的C末端的半胱氨酸部分；
“-C”表示在本发明的多肽的C端延伸的C末端的半胱氨酸部分；
R1表示C1-4烷基；并且D表示诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物，或者用于诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的结合剂，例如，接头。
因此，本发明涉及如在本文中所描述的二聚体，所述二聚体包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸；其中所述第二多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和包含半胱氨酸部分(优选在C末端)的C端延伸；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽通过在所述第一多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)的硫醚键和所述第二多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)的硫醚键共价连接，并且化合物是根据式(V)或式(VI)。
诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物可以通过使用已经负载诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的如在本文中所描述的缀合试剂与二聚体直接缀合，或者可以在例如通过使用含有针对诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物的连接基团的缀合试剂使缀合试剂与二聚体缀合之后加入诊断、治疗或标记试剂，如，例如药物。
本发明涉及包含单一缀合的药物的如在本文中所描述的二聚体，例如DAR＝1。本发明的过程因此允许以提高的均匀性制备多肽和二聚体。尤其是，使用横跨二聚体的链间二硫键结合的缀合试剂提供了具有提高的加载化学计量的二聚体缀合物，并且其中存在特异性附着位点，而不破坏ISVD的天然的链间(典型)二硫键。使用具有单一分子间二硫键的二聚体还降低了二硫键错配。二硫化物错配，即半胱氨酸对不正确地组装为二硫键，已知影响ISVD的抗原结合能力并且导致降低的活性。通过使用本发明使错配最小化提高了缀合的二聚体的均匀性。具有提高的均匀性的二聚体-药物缀合物在治疗中提供益处。均匀的二聚体缀合物还在诊断和显像应用中提供更准确且一致的测量。
在癌症治疗中使用的大多数药物是疏水性的。这是有利的，因为这些疏水性药物可以穿透细胞膜。然而，这些药物可以穿透也来自非癌细胞的任何膜。这些药物仍然是有效的，因为癌细胞比“正常”细胞更快地分裂。应该理解的是，使用这些药物带来了严重的副作用。为了得到更大程度靶向的途径，已经将这些药物中的多种与用作优选靶向癌细胞的载体的常规抗体偶联。这些常规抗体具有约150kD的尺寸，而药物平均具有约1kD的尺寸。因此，抗体:药物的尺寸比是约150:1。这种比率是药物的疏水性对抗体药物缀合物(ADC)整体上几乎没有影响的原因之一。
已经证实，ISVD的物理化学性质特别取决于其变得暴露于溶剂的表面暴露的氨基酸。这在用于ISVD的大量不同制剂中反映。与常规抗体形成巨大反差的是，ISVD具有仅约15kD的尺寸。因此，ISV:药物的尺寸比仅为15:1，即与常规抗体相比小10倍。因此，药物的疏水性特征对PDC的性质具有不成比例地较大的影响。实际上，关于PDC的主要问题是聚集。然而，意外地观察到，本发明的PDC是稳定的，易于体内施用，并且能够降低体内肿瘤生长。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗需要其的受试者的与如在本文中所描述的毒素缀合的多肽或与毒素缀合的如在本文中所描述的二聚体，例如用于治疗癌症。
本发明涉及用于治疗，优选用于癌症治疗的如上所述的二聚体。此外，本发明涉及如上所述的二聚体用于制造用于癌症的治疗的药物的用途。
术语“癌症”是指由恶性肿瘤细胞的增殖导致的任何癌症，如肿瘤、赘生物、癌(carcinoma)、肉瘤、白血病、和淋巴瘤。用于治疗的目标癌症包括但不限于，癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、中枢神经系统癌、头颈癌、肾癌、骨癌、血液癌或淋巴系统癌。这样的癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、口腔癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌(包括，例如，HER2阳性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、多种骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑癌、头颈癌、和相关转移。
“实体肿瘤癌症”是包含异常组织块的癌症。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤癌症(例如，癌、和淋巴瘤乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、头颈癌、结肠癌、肉瘤、或肾上腺皮质癌)。
本发明提供了用于治疗和/或预防和/或缓解与癌症(例如，如以上所限定的)相关的病症的方法。
如在本文中所使用的，并且如在本领域中充分理解的，“治疗”病况或病况(例如，在本文中所述的病况如癌症)的“治疗”是用于得到有益或所需的结果如临床结果的途径。有益或所需的结果可以包括但不限于，一种或多种症状或病况的缓解或改善；疾病、病症、或病况的程度的降低；疾病、病症、或病况的稳定(即，不恶化)的状态；预防疾病、病症、或病况的传播；延迟或延缓疾病、病症、或病况的发展；疾病、病症、或病况的改善或缓和；以及可检测或不可检测的减轻(部分或全部)。使疾病、病症、或病况“缓和”意指，与在不存在治疗的情况下的程度或时间进程相比，减弱疾病、病症、或病况的程度和/或不希望的临床表现和/或延缓或延长发展的时间进程。
如在本文中所使用的，术语“有效量”的药剂(例如，任何前述缀合物)是足以引起有益或所需的结果，如临床结果的量，并且因此，“有效量”取决于其所应用的上下文。
“受试者”意指人或非人动物(例如，哺乳动物)。
本发明涉及一种治疗癌症例如肿瘤的方法，所述方法包括向患者施用本发明的二聚体、多肽和/或PDC。
本发明本发明还提供了用于治疗和/或预防和/或缓解与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、银屑病(psoriasis)、或肺中黏液的分泌过多相关的病症的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的受试者施用(有效量的)如在本文中所描述的与毒素缀合的多肽。
本发明提供了用于将与毒素缀合的预防性或治疗性多肽或二聚体递送至体内的特定位置、组织或细胞类型的方法，所述方法包括向受试者施用如在本文中所描述的与毒素缀合的多肽或如在本文中所描述的与毒素缀合的二聚体的步骤。本发明提供了用于治疗需要其的受试者的方法，所述方法包括施用如在本文中所描述的与毒素缀合的多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含如上所述的与毒素缀合的多肽或如在本文中所描述的与毒素缀合的二聚体。本发明提供了连同药用载体的；任选连同另外的药剂的本发明的二聚体。
因此，本发明提供了如在本文中所描述的与药物如毒素或毒素部分缀合的本发明的多肽(无论是否包含在本发明的二聚体中)。优选地，所述多肽包含针对EGFR的ISVD，其还可以包含针对血清白蛋白的ISVD。
在一个实施方案中，本发明提供了如在本文中所描述的与毒素缀合的多肽，其中至少一个ISVD抑制和/或阻止表皮生长因子(EGF)和EGFR之间的相互作用。
如在本文中所使用的，术语“药物组合物”表示含有与药用赋形剂一起配制的在本文中所述的化合物的组合物。在一些实施方案中，药物组合物凭借政府管理机构的批准作为用于治疗哺乳动物中的疾病的治疗方案的一部分制造或销售。例如，药物组合物可以被配制用于以单位剂型(例如，片剂、胶囊、囊片(caplet)、明胶胶囊(gelcap)、或糖浆)口服施用；用于局部施用(例如，作为乳膏、凝胶、洗剂、或软膏)；用于静脉内施用(例如，作为不含微粒栓塞(emboli)的无菌溶液和在适用于静脉内使用的溶剂体系中)；或用于在本文中所述的任何其他配制物。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的二聚体、多肽和/或PDC的组合物，优选地，所述组合物是药物组合物，其任选还包含至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂并且任选包含一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。可以针对辐射治疗计划、诊断性治疗、或治疗性治疗施用含有有效量的组合物。当针对辐射治疗计划或诊断性目的施用时，以诊断有效剂量和/或有效确定治疗有效剂量的量向受试者施用缀合物。在治疗应用中，以足以治愈或至少部分阻止病症及其并发症的症状的量向已经罹患病况(例如，癌症)的受试者(例如，人)施用组合物。足以实现这种目的的量被定义为“治疗有效量”，即足以基本上改善与疾病或医学病况有关的至少一种症状的化合物的量。例如，在癌症的治疗中，降低、预防、延迟、抑制、或阻止疾病或病况的任何症状的药剂或化合物将会是治疗有效的。治疗有效量的药剂或化合物并非必须治愈疾病或病况，而是将会为疾病或病况提供治疗，从而延迟、阻止、或预防疾病或病况的发病，或者改善疾病或病况症状，或者改变疾病或病况的程度(例如较不严重)，或者加速个体中的恢复(参考上文)。本发明的二聚体、多肽和/或PDC可以用于通过以下方式治疗癌症：以有效用于辐射治疗计划的量向受试者施用第一剂量的前述二聚体、多肽和/或PDC或组合物中的任一种，接着以治疗有效量施用第二剂量的前述二聚体、多肽和/或PDC或组合物中的任一种。
有效用于这些用途的量可以取决于疾病或病况的严重程度和受试者的重量和总体状态。本发明的和在本发明的方法中使用的施加至哺乳动物(例如，人)的治疗有效量的二聚体和组合物可以由普通技术人员在考虑哺乳动物的年龄、重量、和状态的个体差异的情况下确定。因为本发明的某些PDC展现出提高的靶向癌细胞的能力并且剩余(residualize)，本发明的化合物的剂量可以低于未缀合的药剂的治疗效果所需的等同剂量(例如，小于或等于其约90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％)。以作为在被治疗的受试者中产生理想结果的量的有效量，向受试者(例如，哺乳动物，如人)施用本发明的药剂。治疗有效量也可以由本领域技术人员通过经验确定。可以以由治疗医师选择的剂量水平和方式进行包含有效量的本发明的组合物的一次或多次施用。可以基于受试者中的疾病或病况的严重程度来确定和调节剂量和施用日程，所述严重程度可以在整个治疗过程中根据通常由临床医师实施的方法或在本文中所述的那些进行监测。
本发明的二聚体可以与常规的治疗方法或疗法组合使用或者可以与常规的治疗方法或疗法分开使用。
当在与其他药剂的组合疗法中施用本发明的二聚体时，可以将它们依次或同时施用至个体。备选地，根据本发明的药物组合物可以由本发明的化合物连同如在本文中所描述的药用赋形剂和在本领域中已知的另一种治疗性或预防性药剂的组合组成。
通常，对于药物用途来说，可以将本发明的二聚体、PDC和/或多肽配制为药物制剂或组合物，其包含至少一种本发明的二聚体、PDC和/或多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选包含一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例，这样的配制物可以是适用于下列各项的形式的：口服施用，肠胃外施用(如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部施用，通过吸入、通过皮肤贴剂、通过植入物、通过栓剂施用，等等，其中肠胃外施用是优选的。这样的适合的施用形式——取决于施用方式，其可以是固体、半固体或液体——以及用于制备其的方法和载体对技术人员来说将会是清楚的，并且在本文中进一步描述。这样的药物制剂或组合物在本文中通常将会被称为“药物组合物”。用于在非人生物中使用的药物制剂或组合物在本文中通常将会被称为“兽医组合物”。
因此，在另外的方面中，本发明涉及一种药物组合物，其含有至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的PDC或至少一种本发明的二聚体和至少一种适合的载体、稀释剂或赋形剂(即，适用于药物用途)以及任选的一种或多种另外的活性物质。
通常，可以以本身已知的任何适合的方式配制并且施用本发明的多肽、PDC和/或二聚体。例如，参考以上引用的一般背景技术(并且尤其参考WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867和WO 08/020079)以及参考标准手册，如雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack Publishing Company,USA(1990)，雷明顿，药学科学和实践(Remington,the Science and Practice of Pharmacy)，第21版，Lippincott Williams和Wilkins(2005)；或治疗性抗体手册(Handbook ofTherapeutic Antibodies)(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
可以以用于常规抗体和抗体片段(包括scFv和双抗体)和其他药物活性蛋白的本身已知的任何方式配制并且施用本发明的多肽、PDC和/或二聚体。这样的配制物和用于制备其的方法对技术人员来说将会是清楚的，并且例如包括适用于肠胃外施用(例如，静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内施用)或适用于局部(即经皮或皮内)施用的制剂。
例如，用于肠胃外施用的制剂可以是适用于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳液。例如，用于这样的制剂的适合的载体或稀释剂包括，但不限于在WO 08/020079的第143页提及的那些。通常优选水性溶液或混悬液。
因此，本发明的多肽、PDC和/或二聚体可以与药用载体如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合全身施用，例如口服。它们可以封装在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以被压制为片剂，或者可以直接与患者饮食的食物结合。对于口服治疗性施用来说，本发明的多肽、PDC和/或二聚体可以与一种或多种赋形剂组合并且以可摄取的片剂、颊含片剂、锭剂(troche)、胶囊、酏剂(elixir)、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。这样的组合物和制剂应当含有至少0.1％的本发明的多肽、PDC和/或二聚体。当然，它们在组合物和制剂中的百分比可以变化并且可以方便地在所给定的单位剂型的重量的约2至约60％之间。在这样的治疗上有用的组合物中的本发明的多肽、PDC和/或二聚体的量使得将会获得有效的剂量水平。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有结合物、赋形剂、崩解剂、润滑剂和增甜剂或调味剂，例如在WO 08/020079的第143-144页提及的那些。当单位剂型是胶囊时，除了以上类型的材料以外，其还可以含有液体载体，如植物油或聚乙二醇。可以存在多种其他材料，其作为包衣，或者另外用于改变单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以含有本发明的二聚体、PDC、多肽、化合物和/或构建体，作为增甜剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯，染料和调味剂如樱桃或橙香料。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料应该是药用的并且在使用量中是基本无毒的。此外，本发明的多肽、PDC和/或二聚体可以结合至缓释制剂和装置中。
也可以为用于口服施用的制剂和配制物提供将会允许本发明的构建体抵御胃部环境并且进入肠中的肠溶包衣。更一般地，可以适宜地配制用于口服施用的制剂和配制物以用于在胃肠道的任何所需部分中递送。此外，适合的栓剂可以用于向胃肠道中的递送。
本发明的多肽、PDC和/或二聚体也可以通过输注或注射而静脉内或腹膜内施用。具体实例如在WO 08/020079的第144和145页或在PCT/EP2010/062975(全部文献)中进一步描述。
对于局部施用来说，可以以纯净形式施加本发明的多肽、PDC和/或二聚体，即当它们是液体时。然而，通常将会理想的是将它们作为组合物或配制物与可以是固体或液体的皮肤病学可接受的载体组合施用至皮肤。具体实例如在WO 08/020079的第145页进一步描述。
本发明的PDC、多肽、二聚体、化合物和/或构建体的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。用于将在小鼠和其他动物中的有效剂量外推法至人的方法是本领域已知的；例如，参见US 4,938,949。
通常，本发明的多肽、PDC和/或二聚体在液体组合物如洗剂中的浓度将会为约0.1-25重量％，优选约0.5-10重量％。在半固体或固体组合物如凝胶或粉末中的浓度将会为约0.1-5重量％，优选约0.5-2.5重量％。
用于在治疗中使用所需的本发明的多肽、PDC和/或二聚体的量将不仅随着所选择的特定多肽、PDC和/或二聚体变化，而且还随着给药途径、被治疗的病况的性质以及患者的年龄和状态变化，并且最终将会取决于助理医师或临床医师的判断力。此外，本发明的多肽、PDC和/或二聚体剂量根据靶细胞、肿瘤、组织、移植物、或器官而变化。
理想的剂量可以方便地以单剂量或作为以适当间隔施用的分剂量(例如，作为每天二、三、四或更多个子剂量)给出。子剂量本身可以进一步被分为例如离散的松散间隔的施用。
施用方案可以包括长期的、日常治疗。“长期”意指至少两周，并且优选数周、数月、或数年的持续时间。这个剂量范围的必要修改可以由本领域普通技术人员仅使用在本文中的教导给出的常规实验而确定。在任何并发症的情况下中，剂量还可以由个体医师进行调整。
实施例
1构建单元的生成
从如在表4中描述的EGFR结合纳米抗体7D12和9G08、和白蛋白结合纳米抗体ALB11开始，在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中产生各种构建体。
表4：构建体
产物名称 构建单元
T023800001-A 7D12-20GS-ALB11-GGC-A
T023800003-A 7D12-20GS-7D12-GGC-A
T023800005-A 7D12-20GS-9G08-GGC-A
T023800006-A 7D12-20GS-7D12-20GS-ALB11-GGC-A
T023800008-A 7D12-20GS-9G08-20GS-ALB11-GGC-A
T023800001-二聚体 <sub>N</sub>[7D12-ALB11-GGC]<sub>C</sub>-S-S-<sub>C</sub>[CGG-ALB11-7D12]<sub>N</sub>
1.1遗传融合
根据标准方案，例如由Garaicoechea等人(Garaicoechea等人(2008)J Virol.82:9753–9764)描述的，通过遗传融合进行在T023800001、T023800003、T023800005和T023800006中的多种转座(顺序)的构建单元7D12和Alb11和接头的偶联。产生包含多种接头长度和组成(ISVD的顺序和个体ISVD)的多肽。还通过遗传融合构建包含GGC的C端延伸。在表6中提供了T023800001(SEQ ID NO:27)、T023800003(SEQ ID NO:28)、T023800005(SEQID NO:29)和T023800006(SEQ ID NO:30)和T023800008(SEQ ID NO:31)的序列。
通过制造具有不同C端延伸的多种多肽证实了构建在C末端包含半胱氨酸部分的不同C端延伸的可行性：-C(SEQ ID NO:1)、-GC(SEQ ID NO:2)、-GGC(SEQ ID NO:3)、-GGGC(SEQ ID NO:4)、-CG(SEQ ID NO:10)、-GCG(SEQ ID NO:11)、-GGGCG(SEQ ID NO:13)、-GGGGCGGGG(SEQ ID NO:15)和-AAAC(SEQ ID NO:8)(数据未示出)。
1.2丙氨酸延伸
根据广泛接受的方案(参见以下)，在接近中性的条件(pH 6.5-7.5)下将丙氨酸部分(N-马来酰基-β-丙氨酸；Sigma-Aldrich)通过马来酰亚胺化学性质与位于C端的半胱氨酸的巯基(-SH)缀合，以形成稳定的硫醚键。简而言之，首先确定所讨论的多肽的浓度。将2-5摩尔过量的N-马来酰基-β-丙氨酸加入至多肽中以阻挡全部可用的半胱氨酸。将混合物在RT下温育1h，接着在4℃下温育过夜。在次日通过LC MS测定缀合效率。通过SEC色谱将包含Ala延伸的多肽纯化至均匀以移除过量的N-马来酰基-β-丙氨酸。
将所得的构建体表示为T023800001-A、T023800003-A、T023800005-A和T023800006-A(图1；表4)。
进一步证实，丙氨酸也可以与具有不同于GGC的包含半胱氨酸的C端延伸的构建体缀合(还参见以上1.1；数据未示出)。
1.3二聚化
在毕赤酵母生长过的培养基中，通过化学缀合进行多肽向二聚体中的偶联，在其中在所述两个多肽中的每一个中的C端延伸中的C端半胱氨酸接近中性pH下通过它们的巯基部分被氧化为二硫化物衍生物胱氨酸。基本上如在WO2010/125187中给出的，为了优化氧化过程，添加氧化性铜离子(CuSO4形式的Cu2+)。将二聚体纯化至均匀并且随后通过尺寸排阻色谱分析。样品还通过LC-MS进行确认。所得数据证实，在用1mM CuSO4在室温下处理2h之后，几乎100％的巯基部分被氧化。在所有色谱图中，均未观察到明显的(不希望的)前峰的形成。此外，在所有色谱图中，均未看到关于明显的前峰的形成的证据，表明铜处理似乎未将蛋白中的甲硫氨酸氧化，总质量分析也未检测到任何+16Da质量增加，这将与在例如甲硫氨酸上的单一氧化一致。
由T023800001、T023800003、T023800005和T023800006制备二聚体。在图1中示出了T023800001的二聚体(表示为T023800001-二聚体)。
1.4稳定性
在严格胁迫条件下储存之后，测试本发明的不同的构建体，例如二聚体、多肽和基准的稳定性。基本上如在WO2014/184352中给出的，这些条件由包括将发明的多肽在不同温(25℃和40℃)下温育较长的时间段(3周和6周)。
证实本发明的多肽(例如，具有包含半胱氨酸部分的C端延伸)和二聚体具有与它们所来自的亲本分子相似的性质并且在4℃、25℃下以及在40℃下在长时间段内稳定，而没有化学降解和改性(数据未示出)。此外，如在功能性测定(参考以下)中所示，在多个冷冻-解冻循环和4℃储存较长时间段(即，>4d)之后的稳定性不变。
1.5高级接头
如以上所指出的，借助遗传融合，通过制造具有不同C端延伸的多种多肽证实了构建在C末端包含半胱氨酸部分的不同C端延伸的可行性：-C(SEQ ID NO:1)、-GC(SEQ ID NO:2)、-GGC(SEQ ID NO:3)、-GGGC(SEQ ID NO:4)、-CG(SEQ ID NO:10)、-GCG(SEQ ID NO:11)、-GGGCG(SEQ ID NO:13)、-GGGGCGGGG(SEQ ID NO:15)和-AAAC(SEQ ID NO:8)(参考实施例1.1)。随后，丙氨酸部分通过马来酰亚胺化学性质与位于C端的半胱氨酸的巯基(-SH)缀合(参考实施例1.2)。
在备选的方法中，提供了包含也已经包含位于C端的丙氨酸的半胱氨酸部分的不同的C端延伸。如在实施例1.1中描述的，这些接头随后通过遗传连接与构建体缀合。这些C端延伸的实例是：-CA、-GCA、-GGCA、-GGGCA、-GGGGCA、-ACA、-AACA、-AAACA、-AAAACA、-CGA、-GCGA、-GGCGA、-GGGCGA、-GGGGCGA、和-GGGGCGGGGA。
1.6另外的构建体
为了进一步证实本发明的二聚体的普遍存在的适用性和特征，按照在WO2015044386中给出的，产生多种双特异性构建体。这些多肽的总结在表1.6中给出。测试个体构建单元以及双特异性多肽二者的多种特征如亲和力和效力(IC50、KD)。结果还在WO2015044386中提供。所得序列在表6中提供。
表1.6：双特异性构建体的总结
Figure BDA0001427334130000841
1.7另外的二聚体
为了方便，仅实施例1.5的接头-GGGCA与实施例1.6的双特异性多肽遗传连接，得到20个具有这种C端延伸的构建体。基本上按照在WO2015044386中给出的，测试这些双特异性多肽的完整性，包括亲和力和效力。在不存在任何亲和力和效力的大量损失的情况下，如在实施例1.3中给出的，这些多肽随即二聚化。根据实施例1.6和WO2015044386的操作作为母体双特异性多肽类似地测试所得二聚体，之后比较各种结果。
与实施例2和3(以下)的结果类似，预测二聚体将会比相应的基准表现更好，进一步证实了本发明的普遍存在的适用性。然而，如在WO2015044386中指出的，在一些实例中，当将二聚体与在不同位置的构建单元进行比较时，参见例如与包含多肽CXCR4-CD123的二聚体比较的包含多肽CD123-CXCR4的二聚体，根据个体构建单元的取向可能会存在对亲和力和/或效力的影响。
2与MDA-MB-468细胞结合的多肽的表征
在结合竞争测定中对多肽进行表征以评估EGFR结合亲和力。
使用MDA-MB-468乳腺细胞癌细胞系(乳腺/乳房；来源于转移位置：胸腔积液；ABL216)。
为了检测多肽与表达EGFR的细胞的结合，使用FLAG标记的7D12作为竞争物。为了设置测定，首先对MDA-MB-468细胞进行FLAG标记的7D12的滴定系列。在其中滴定未标记的多肽的竞争设置中选择FLAG标记的7D12的EC90(41nM)。
简而言之，将100 000个细胞转移至平板。通过在4℃下以200g离心3分钟将平板洗涤两次。将上清液移除并且以总计100μl/孔将50μl的纯化多肽连同50μl的FLAG标记的7D12(最终浓度41nM)一起加入至孔中。在4℃下进行90分钟温育之后，通过在4℃下离心30min将平板洗涤三次。将上清液移除并且加入100μl/孔的0.5μg小鼠抗flag mAb(Sigma-Aldrich，目录号F1804)或FACS缓冲液，接着在4℃下进行30分钟温育。通过在4℃以200g离心3分钟将细胞洗涤三次。在移除上清液之后，将110μl/孔的山羊抗小鼠PE或山羊抗人IgG PE加入至细胞中并且在4℃下温育30分钟。之后在4℃以200g将平板离心30分钟，将上清液移除并且加入100μl/孔的FACS缓冲液，并且通过在4℃以200g离心3分钟依次将平板洗涤三次。接下来，用100μl TOPRO(Molecular Probes，T3605)/孔将死细胞染色并且在FACS Canto(Becton Dickinson)上对细胞依次进行测量。首先，如根据散射特征确定的，在完整细胞上设置门控(gate)。之后，通过它们来自TOPRO染色(5nM，Molecular Probes，T3605)的荧光特征门控选出死细胞。作为对照，选取不存在多肽或存在已知的不相关多肽的条件(数据未示出)。
评价T023800001-A(在本文中也表示为T023800001)、T023800003-A(在本文中也表示为T023800003)、T23800005-A(在本文中也表示为T023800005)、T023800006-A(在本文中也表示为T023800006)和未还原的T023800001-二聚体。
结果在图2中描述。
根据这些结果可以断定，T023800001、T023800003、T023800005和T023800006与EC90 7D12-FLAG(即，41nM)的竞争对于T023800001、T023800003、T023800005和T023800006分别得到15nM、0.63nM、0.25nM和1.16nM的Ki。使用Cheng-Prusoff方程计算绝对抑制常数Ki。
Figure BDA0001427334130000861
意外地，T023800001-二聚体显示出0.12nM的Ki，这比表现最好的遗传融合构建体T023800005-A好2倍，并且甚至比T023800001-二聚体的直接比较物T023800006-A好多于9倍。
3在HER14细胞系中的EGFR磷酸化的量化
为了确认如在竞争FACS(参见以上实施例2)中观察到的效力的增加是否还转化为EGFR介导的信号转导的调节，发明人给出了在NIH3T3/HER14细胞中借助纳米抗体的EGF介导的EGFR磷酸化的阻断实验。所使用的构建体是T023800001-A和T023800006-A以及T023800001-二聚体。在仅表达EGFR的HER14细胞上评估EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制。
简而言之，将HER14细胞一式两份接种至涂布有0.1％明胶的96孔培养板中并且在含有10％FBS/BS的DMEM培养基中生长24h。次日，将细胞在补充有0.1％FCS的培养基中血清饥饿(serum-starved)24小时并且之后与构建体一起温育温育，接着用0.5nM的重组人EGF(R&D Systems，目录号236-EG)刺激10分钟。EGF浓度基于在HER14细胞中得到的EC50(EC50＝3.5ng/ml)。在每个平板中，包括不相关的对照多肽作为参考(数据未示出)。将单层用冰冷的D-PBS冲洗两次，并且随后在用1mM PMSF替换的冰冷的RIPA缓冲液中裂解。使用Phospho(Tyr1173)/总EGFR全细胞裂解物试剂盒(Meso Scale Discovery-K15104D)测量细胞裂解物中的EGF依赖性的受体活化。将平板加载30μl的裂解物，在振荡的情况下在RT温育1h并且根据制造商的方案进行处理。在Sector Imager 2400(Meso Scale Discovery)上对平板进行读数。使用下式计算磷-蛋白相对于总蛋白的百分比：(2×p-蛋白)/(p-蛋白+总蛋白)×100。
结果在图3中描述。
仅在表达EGFR的HER14细胞上观察到EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制。因为功能性磷酸化仅通过EGFR信号传导介导，由多价形式化(formatting)引起的抗体亲抗原性的增加预期转化为细胞特异性方式的EGFR磷酸化的增加的抑制。
甚至比来自竞争FACS的结果更明显，当与形成的二价纳米抗体T023800006-A(26.6nM)相比时，T023800001-二聚体(4.4nM)显示出5-6倍的效力的增加。T023800001-A得到105nM的效力。
4借助SEC的半胱氨酸延伸的单体纳米抗体的制备
4.1背景信息
意识到包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和在C末端含有半胱氨酸部分的C端延伸的本发明的多肽适用于基于偶联反应的马来酰亚胺化学性质(参考以上实施例1.2)。
为了将二聚体转化为单体多肽并且使C端半胱氨酸可用于偶联，需要进行还原。然而，应当注意设计优化的条件，以引起二硫化物二聚体的还原而不还原内部典型ISVD二硫键。优选使用DTT或TCEP进行还原。不同于TCEP，DTT需要被移除以创造最佳的偶联病况。通过尺寸排阻色谱(SEC)，将单体纳米抗体与未还原的二聚体纳米抗体和DTT分离。
4.2还原方案
还原方案由在D-PBS中用10mM DTT在4℃下过夜(或在室温下在最少2h期间内)处理组成。ISVD浓度在2至10mg/ml之间。证实这些条件不影响内部典型二硫键(参见图4)。使用TCEP获得了类似的结果，在这里我们根据制造商方案使用固定的TCEP(Pierce，固定的TCEP二硫化物还原凝胶，#77712)。备选地，使用在4℃下30分钟期间内的对10mM TCEP的短的暴露。
4.3尺寸排阻色谱(SEC)
为了进行纯化，优选将Superdex 75柱(GE Healthcare)(分离范围5-100kDa)用于包含至多三个ISVD的多肽以生成单体还原产物。出于分析目的，使用HPLC柱如AgilentSEC-3。平衡和流动缓冲液是D-PBS。
在图5中提供了在SEC之后的被完全还原的纯净产物的实例。
在SEC之后，将被还原的单体多肽立刻用于缀合或冷冻以防止重新氧化为二聚体。实验证据表明，GGC延伸的多肽的被还原的单体级分在4℃下在D-PBS中稳定至多24h(数据未示出)。
将包含两个ISVD的多肽用10mM DTT在2h期间在环境温度下还原并且在D-PBS中平衡的Superdex 75XK 16/60柱(GE Healthcare)上确定尺寸。仅检测到少量的二聚体；材料的其余部分被还原为单体并且因此准备用于缀合。凝胶过滤标准品(Biorad)的分子量由虚线表示。
5与MMAE偶联的多肽
疏水性抗有丝分裂剂单甲基耳他汀E(monomethyl auristatin E,MMAE)是天然产物多拉司他汀(dolastatin)10的合成类似物。MMAE是分裂细胞中微管蛋白聚合的强效抑制剂。
在本实施例中，发明人着手将MMAE与本发明的多肽的被释放的C端半胱氨酸偶联。简而言之，出于药物靶向目的，MMAE通过缬氨酸-瓜氨酸接头与多肽缀合。缬氨酸-瓜氨酸接头在血清中高度稳定，但是在缀合物通过靶细胞内在化之后被溶酶体酶如组织蛋白酶B裂解。以下接头缩写在本文中使用并且具有所指出的定义：Val Cit是在可蛋白酶裂解接头中的缬氨酸-瓜氨酸、二肽位点；PAB是对氨基苯甲酰基；mc是缀合的马来酰亚胺。
在4℃下将纳米抗体用10mM DTT过夜还原并且之后缓冲液交换以移除过量的DTT。在22℃下进行使用mc-val-cit-PAB-MMAE(MW约0.7kDa；图6)的缀合。在1小时之后，将反应猝灭，20当量N-乙酰基-半胱氨酸/游离药物。通过离心浓缩将所得产物纯化并且缓冲液交换为最终缓冲液。用于进行较大规模的纯化，非离心渗滤方法是更适合的。将产物溶液无菌过滤(0.2mm)。
与MMAE缀合的多肽：
T023800001＝>T023800001-mc-val-cit-PAB-MMAE(ABL 100-NC003-1或T023800001-MMAE)
T023800003＝>T023800003-mc-val-cit-PAB-MMAE(ABL 100-NC003-3或T023800003-MMAE)
T023800005＝>T023800005-mc-val-cit-PAB-MMAE(ABL 100-NC003-5或T023800005-MMAE)
T023800006＝>T023800006-mc-val-cit-PAB-MMAE(ABL 100-NC003-6或T023800006-MMAE)
T023800008＝>T023800008-mc-val-cit-PAB-MMAE(ABL 100-BF012-1)
进行HIC-HPLC分析以确定药物与多肽的比率(DAR)。简而言之，使用与DionexUltimate 3000RS HPLC系统连接的TOSOH,TSKgel丁基-NPR柱(35×4.6mm)进行缀合物的分析型HIC。在30min内，在0.8mL/min的流量下，线性梯度从100％缓冲液A(在50mM磷酸钠中的1.5M硫酸铵，pH 7.0)到100％缓冲液B(在50mM磷酸钠中的20％异丙醇(v/v))。在整个分析期间将柱温维持在30℃并且在280nm下进行UV检测。对于每个分析，注射10μg的样品。基于向更高保留时间的移动和通过A248/A280比率，为各个峰指定药物与多肽的比率(DAR)。通过将个体DAR值的总和乘以物种的分数(表示为小数)来计算平均DAR。所使用的多肽是ABL100-NC003-1、ABL 100-NC003-3、ABL 100-NC003-5和ABL 100-NC003-6。
结果在表5中提供。
Figure BDA0001427334130000891
进行SDS-PAGE分析以确定多肽的氧化状态。简而言之，使用
Figure BDA0001427334130000892
4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号NP0321BOX)，在非还原条件下用MES缓冲液进行SDS-PAGE分析。为了进行分析，将1μg的样品(基于蛋白质)加载至每条道的凝胶上。将电泳在200V下进行35min。将凝胶用INSTANTBLUETM(Expedeon，目录号ISB1LUK)染色以用于蛋白质检测并且使用
Figure BDA0001427334130000893
显像设备(GE Healthcare)分析。
结果的总结也在表5中提供。示例性结果作为图7提供。
为了进一步确认并且阐述SDS-PAGE的结果，进行SE-HPLC分析以确定百分比纯度和聚集。简而言之，使用与Agilent Infinity 1260Bioinert系统连接的Waters
Figure BDA0001427334130000901
UPLC BEH200SEC柱(4.6mm x 30cm，1.7μm)进行SE-HPLC。流动相是0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.8，含有15％(v/v)异丙醇。使流量保持恒定在0.15mL/min。在整个分析中将柱维持在25℃。在30min等度洗脱中使用在280nm下的UV检测进行分析。对于每个分析，注射10μg的样品。通过分别比较主峰和早期洗脱峰的峰面积与总峰面积来计算所存在的％纯度和％聚集。
结果总结在表5中。偶联结果的示例性HIC分析在图8中描述。
这意味着，对于全部多肽来说，反应得到超过98％的多肽用于与ADC的缀合的效率。此外，反应得到1的DAR，一方面说明ISVD是完整的，例如未使用内部巯基，另一方面说明每个多肽的药物的数量是非常可控的。相比于与常规抗体缀合的药物的高斯分布，这得到了更好的安全性。
表6
Figure BDA0001427334130000902
Figure BDA0001427334130000911
Figure BDA0001427334130000921
Figure BDA0001427334130000931
5.1与MMAE偶联的多肽的体外细胞毒性
使用
Figure BDA0001427334130000932
仪器(分析仪型号W380；SN：281081212038,Roche)测试MMAE缀合的多肽对细胞增殖和/或细胞毒性的影响。该仪器量化在细胞在培养皿中附着并且铺开时电阻抗的变化，将它们显示为被称为细胞指数的无量纲参数，即与被细胞覆盖的组织培养孔的总面积的直接比例(Duchateau等人，2013.Phys.Status Solidi 10:882-888以及Giaever和Keese 1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7896-7900)。
Figure BDA0001427334130000933
仪器(分析仪型号W380；SN：281081212038)使用E平板96(ACEABiosciences；目录号05 232 368 001；批号20140138；平板1：ID号079605；平板2：ID号079606)作为用于接种细胞的组织培养孔板。所使用的构建体是T023800001-A和T023800001-MMAE、T023800003-A和T023800003-MMAE、T023800005-A和T023800005-MMAE、以及T023800006-A和T023800006-MMAE。使用以下方案，用
Figure BDA0001427334130000934
仪器评估未缀合的和MMAE缀合的纳米抗体对MDA-MB-468(乳腺/乳房；来源于转移位置：胸腔积液；ABL216)细胞增殖的剂量依赖性抑制作用。
简而言之，在5％CO2的存在下，将
Figure BDA0001427334130000935
台放置在37℃的温育器中。在含有RPMI(Gibco，目录号：72400-021)补充有1％P/S(储液的青霉素-链霉素10,000U/mL；Gibco，目录号：15140-122)；1％丙酮酸Na(Gibco，目录号：11360-039)和10％FBS(Sigma-Aldrich，目录号：F7524)的T175瓶中使MDA-MB-468细胞生长。通过胰蛋白酶消化(trypsinization)收获细胞，将它们离心并且重悬为指定的细胞密度，将50μl的细胞培养基加入至E平板96的每个孔中并且对
Figure BDA0001427334130000941
系统进行空白读数以测量在不存在细胞的情况下的背景阻抗。向E平板96的每个孔转移6000个细胞(50μl)并且温育20h以使细胞贴壁。从500nM(总体积/孔为200μl)开始，以1:3稀释系列施用100μL的每个多肽。以15分钟的间隔对阻抗读数编程。在时间点162h(±7d)时停止实验。在对于全部测试浓度进行接种之后，将在时间点116h测量的细胞指数用于剂量-响应分析。
增殖曲线和剂量-响应曲线分别在图9和图10中描述。获得的IC50值在表7中给出。
表7.对于未缀合的和MMAE缀合的多肽观察到的IC50和％抑制
Figure BDA0001427334130000942
除了表现出对细胞增殖的轻微抑制作用的双互补位T023800005-A之外，未缀合的多肽T023800001-A、T023800003-A、T023800005-A和T023800006-A未展现出对MDA-MB-468细胞的增殖性质的明显影响。相比之下，如在图9中所示，MMAE缀合的多肽T023800001-MMAE、T023800003-MMAE、T023800005-MMAE和T023800006-MMAE清楚地显示出几乎在最高剂量下完全抑制的对细胞增殖的剂量依赖性抑制作用。
5.2与MMAE偶联的多肽的体内功效
在皮下异种移植小鼠模型中评估抗EGFR多肽药物缀合物的体内功效研究。
通过向6-8周龄的健康SWISS裸雌性小鼠的右侧腹中皮下注射1x107个FaDu细胞来诱导肿瘤。FaDu细胞系是由从56岁的高加索人种/印度人种男性患者中移除的下咽肿瘤的打孔活组织检查(punch biopsy)建立的头颈癌细胞系。当肿瘤达到在100-200mm3之间的平均体积时开始进行治疗。
动物接受每4天一次总计6次注射(Q4Dx6)的5mg/kg的T023800008-MMAE的日常注射。第一对照组接受每4天一次总计6天的非EGFR结合、但是等摩尔剂量的MMAE缀合的多肽的日常注射。第二对照组接受每4天一次总计6次注射的载体的日常注射。每个组由12只动物组成。
用测径器每周两次测量肿瘤的长度和宽度，并且根据下式估算肿瘤的体积：
与2个对照组相比，多肽-MMAE缀合物T023800008-MMAE显示出明显的肿瘤生长的抑制(图11)。
6双特异性二聚体的生成
在本实施例中，提供实现生成双特异性二聚体，即其中多肽1与多肽2不相似的二聚体的方案。
6.1标准方案
在第一种情况中，仿照以上实施例1.3的方案，但是其中一个毕赤酵母菌株产生两个不相似的多肽。在毕赤酵母生长过的培养基中，还通过化学缀合进行多肽向二聚体中的偶联，在其中在所述两个多肽中的每一个中的C端延伸中的C端半胱氨酸接近中性pH下通过它们的巯基部分被氧化为二硫化物衍生物胱氨酸。基本上如在WO2010/125187中给出的，为了优化氧化过程，添加氧化性铜离子(CuSO4形式的Cu2+)。将二聚体纯化至均匀(离子交换色谱)并且随后通过尺寸排阻色谱分析。样品还通过LC-MS进行确认。标准方案将会生成预期的双特异性NB1-NB2二聚体。然而，预期的是，级分将会还含有单特异性二聚体，例如NB1-NB1和NB2-NB2。
6.2备选方案
可以使用两个不同的C端半胱氨酸延伸的Nb在不使用交联剂的情况下生成纳米抗体异二聚体(双特异性二聚体)。
这可以通过第一纳米抗体(＝NbA)的非共价固定同时使其对第二纳米抗体(＝NbB)可用的游离巯基形成C端异二聚体二硫键来实现。
在第一步骤中，将NbA还原以获得100％单体材料。用于将典型纳米抗体溶液[5-10mg/ml]还原的通用条件是在D-PBS中的10mM DTT在4℃下过夜或在室温(RT)下在1-2h期间。优选地，针对每个个体纳米抗体确定最佳条件从而其典型二硫键保持完整。
在步骤2中，NbA单体级分在还原条件下与载体结合。这样的载体可以是优选仅结合NbA且不结合NbB的色谱树脂。以低密度固定NbA以避免在固定时NbA-NbA二聚体的形成。通过将柱使用非最佳结合条件(例如，对典型亲和树脂来说过高的流量)或借助通过膨胀床色谱加载来实现这样的个体NbA的空间分隔。优选地，载体仅结合NbA。因此，如果NbA(并且优选不是NbB)是蛋白A结合剂，则可以使用蛋白A。如果纳米抗体A和B二者均结合载体，则在固定NbA之后，在施加NbB之前，应当用非半胱氨酸延伸的纳米抗体使载体饱和。
在步骤3中，将也处于还原形式的过量的第二纳米抗体(NbB)(参见以上)施加并且经过柱循环(任选在略微氧化性的条件下)。使NbB经过载体直到被固定的NbA通过二硫键与NbB完全配合。随后可以测量NbB的浓度降低以匹配饱和的NbA群。针对该步骤，优化条件以限制NbB-NbB二聚体形成的量。该群将不会结合载体，并且可以被回收并且在将来的偶联反应中使用。
在步骤4中，通过针对该柱的典型洗脱条件(即，针对蛋白A的酸性条件)从树脂中回收NbA-NbB二聚体制剂并且将其进一步处理/配制。
7通过ThioBridgeTM缀合的多肽
如在实施例2和3中证实的，与相关遗传融合构建体相比，本发明的二聚体具有优秀的特征。上文描述的二聚体通过在第一多肽的半胱氨酸部分和第二多肽的半胱氨酸部分之间的二硫键直接缀合(例如，至二硫化物衍生物胱氨酸)。通过这种缀合机制，限制了两个多肽之间的柔性。这在大多数情况中是令人满意的。然而，在一些情况中，可以需要在两个单独多肽之间更高的柔性。此外，二聚体的多肽需要适用于与药物缀合。还如上文描述的，这些药物主要通过接头缀合，形成例如PDC。因此，在一些实例中，可能有利的是允许更高柔性的可以缀合本发明的多肽、并且优选也可以缀合药物的接头。
在本实施例中，辨别了本发明的多肽是否可以通过ThioBridgeTM技术缀合。
已经在WO 2005/007197和WO 2013/190292中广泛描述了ThioBridge接头缀合，二者均在Polytherics名下。基本上，ThioBridge技术将在天然蛋白质如抗体或其片段中自然形成二硫键的两个硫原子缀合。在图12中描述了ThioBridge技术的一般原理。
如以上指出的，ThioBridge技术针对抗体和其片段如Fab和F(ab’)2而确立。然而，ThioBridge技术尚未用于ISVD如纳米抗体的二聚体。实际上，在WO 2005/007197和WO2013/190292中使用的常规抗体与本发明的二聚体之间存在重要的差异。在通过ThioBridge技术在常规抗体或其片段中将链间二硫桥还原的情况中，这些抗体和片段，如VH和VL结构域，通过疏水和静电相互作用和范德华力保持结合。相比之下，在本发明的二聚体中的多肽彼此完全独立，即通常在这些多肽之间不存在除二硫桥之外的相互作用。作为结果，当将cys连接的纳米抗体二聚体还原时，反应性-S-部分可能会与在其附近的任何可用受体基团配对，而并非必须是ThioBridge接头。因此，预期ThioBridge技术的成功率明显降低。
本发明的发明人着手优化并且建立了用于本发明的多肽的ThioBridge技术方案。在所有工作包(work package)中，将二聚体纯化至均匀并且随后通过尺寸排阻色谱分析。样品还通过LC-MS进行确认。
在第一工作包(WP1)中，二聚体的第一和第二多肽相同(在图13中的NB1和NB1)。当将在第一和第二多肽之间的二硫键还原时，这有助于配对，即第二加成，为正确的二聚体(ThioBridge二聚体)。预期的是，如以上给出的常规抗体和本发明的多肽之间的差异将会损害常规ThioBridge方案的直接适用性。当成功设计ThioBridge技术方案时，通过用不同的多肽，即由NB2和NB2组成的二聚体2重复方案来检查WP1的普遍存在的适用性。
当成功推断WP1时，启动第二工作包(WP2)以使用ThioBridge技术生成双特异性纳米抗体药物缀合物，即在图15中描述的由NB1-NB1组成的二聚体和由NB2-NB2组成的二聚体。在第一种情况中，在WP1中确立的ThioBridge技术方案用于将二聚体1(由NB1和NB1组成)的多肽(NB1)和二聚体2(由NB2和NB2组成)的多肽(NB2)再桥连为由NB1和NB2组成的ThioBridge双特异性二聚体(参考图15)。考虑到复杂性，预期的是，即使当重新再桥连时，所得二聚体的大多数也与母体二聚体相同：NB1-NB1的ThioBridge二聚体和NB2-NB2的ThioBridge二聚体，而存在NB1-NB2的ThioBridge二聚体，但是是少数。
为了增加成功率并且增加NB1-NB2二聚体级分，如下调整在WP2中使用的ThioBridge技术方案(WP3-图16)。在第三工作包(WP3)的第一步中，以与在WP1和WP2中类似的方式将多肽1(NB1)和多肽2(NB2)的二聚体还原。在第二加成步骤中和在再桥连之前，为还原的多肽1的部分和还原的多肽2的部分负载保护基以避免母体二聚体(NB1-NB1和NB2-NB2)的形成，例如，保护基是如之前给出的载体。在第三步中，将多肽1的被保护的部分与多肽1的反应性部分分离并且将来自多肽2的被保护的部分与来自多肽2的反应性部分分离。在第四步中，将多肽1的被保护的部分与多肽2的反应性部分混合并且将多肽2的被保护的部分与多肽1的反应性部分混合。在此之后，将来自被保护的级分的保护基团移除，以允许双特异性、异二聚体(NB1-NB2和NB2-NB1)的形成。因为考虑到保护基团而使反应强制向一个方向，与通过WP2的方法相比，所需的双特异性二聚体的生成更高。
在工作包4(WP4)中，使用相对于WP2和WP3的备选策略产生双特异性ThioBridge二聚体。尤其是，Cys连接的纳米抗体二聚体已经是双特异性的(参考实施例6)。在第一种情况中，使用在WP1中确立的ThioBridge技术方案在双特异性二聚体中建立再桥连的二硫键，得到多肽1和多肽2的双特异性ThioBridge二聚体(参见图14)。为了增加成功率，如果需要，可以调整ThioBridge技术方案。预期的是，与通过WP2相比，根据WP4的双特异性ThioBridge二聚体的形成更有效。然而，在一些实例中，与WP4的方案相比，可能有利的是使用WP2或WP3的方案。
8二聚体和药物缀合的多肽的研究
如以上所指出的，由于尺寸差异，药物与本发明的多肽的二聚化和缀合具有比对常规抗体大得多的影响。因此，发明人着手评估与具有DAR＝1的纳米抗体缀合的有效负荷对PK性质的影响。
此外，发明人着手评估包含2个人血清白蛋白结合结构域(“Alb”)的本发明的二聚体的PK性质。如根据以上实施例将会显而易见的，与具有两个不相似部分的二聚体相比，包含两个相同部分(即，多肽1＝多肽2)的二聚体更容易并且更成本有效地生成并且纯化。在用于延长构建体的半衰期的多个实例中，人血清白蛋白结合结构域是必需的。然而，具有额外的人血清白蛋白结合结构域不应对构建体的PK特征具有任何负面影响。
8.1多肽的放射性标记
通过放射性标记的多肽测试PK性质。简而言之，用89Zr、NCS-Bz-Df随机通过在游离-NH2上的缀合将多肽放射性标记(参见图17)。将22nmol多肽(1.0mg)与0.9％NaCl混合，直到500μL的最终体积(最终浓度2mg/mL)。接下来，通过加入0.1M Na2CO3将pH设定为8.9-9.1。最后，加入66nmol NCS-Bz-Df在DMSO中的溶液(3eq、10μL)并且在37℃下反应30min。在30min之后，通过使用50mM NaOAc/200mM蔗糖预洗的PD10柱将反应混合物纯化。将产物收集在1.0mL的级分中。接下来用89Zr在pH～7下将Df-PK-多肽在室温下放射性标记60min(反应混合物含有：100μL 1M草酸，含89Zr、45μL 2M Na2CO3、500μL 0.5M Hepes缓冲液(pH 7.2)和355μL NCS-Df-多肽(～0.4mg))。接下来，经过预洗的PD10柱用50mM NaOAc/200mM蔗糖将反应混合物纯化并且将产物收集在1.5mL中。
放射性标记结果总结在表8中。
放射性标记产率在9.6％至37.6％之间变化(通常预期70％的放射性标记收率)。很可能，这种低的标记收率与在修饰期间使用的低的多肽量有关。HPLC和旋转过滤器(Spinfilter)分析显示，用于89Zr-T023800006A和89Zr-T023800006-MMAE来说放射化学纯度是令人满意的(>96％)。对于旋转过滤器分析来说，89Zr-T023800001显示出<90.0％的纯度，HPLC显示出8.6％的游离89Zr。通常，构建体应当具有>90.0％的放射性标记纯度。在这种情况中，无论如何都决定使用89Zr-T023800001用于PK研究，因为89Zr-T023800001的旋转过滤器纯度接近90％并且HPLC分析显示出>90％纯度的产物。对于所有多肽来说，Lindmo结合>90％(数据未示出)。
随后，将89Zr-PK放射性标记的多肽配制为0.22MBq/小鼠的活性、50μg/mL的浓度，注射体积为130μL。
表8标记结果多肽
Figure BDA0001427334130001001
总之，放射性标记产率不如预期那样有效。89Zr-T023800006A和89Zr-T023800006-MMAE的放射化学纯度良好(根据旋转过滤器>97％并且根据HPLC>96％)。Lindmo结合结果高，并且>90％。89Zr-T023800001不如旋转过滤器分析所要求那样纯净。最终，仍然决定使用89Zr-T023800001。成功地配制并且注入所有多肽。
8.2体内PK研究
用放射性标记的(89Zr)多肽对3只小鼠进行注射，并且在9个时间点检测cpm(计数/分钟)值：5min、1h、3h、24h、48h、72h、140h、168h和192h。之后使用这些值计算多肽的％注射剂量/g小鼠(％ID/g)。对于每个多肽来说，将3只小鼠的结果平均。
结果总结在图18中。
结果意外地显示，二价多肽(T023800006-A)的生物分布特征与药物缀合的多肽(T023800006-MMAE)的生物分布特征相似。将本发明的多肽与有效负荷缀合缀合对生物分布特征没有影响。在不受任何理论约束的情况下，假设得到DAR＝1的严格控制的缀合过程预测了PK性质(在这种情况中，与未缀合的多肽相比没有变化)。
还意外地，本发明的cys连接的二聚体(T023800001)的生物分布特征与相应的二价多肽(T023800006-A)相似。在本发明的cys连接的二聚体中的两个人血清白蛋白结合单元的存在不影响分布特征。
9通过二聚体改善的内在化
这个实验的目标是评估Cys连接的二聚体(DIM T023800001，即从功能性上来看是二价的)与其单体对应物(T023800001-A)和传统连接的遗传融合的二价形式(T023800006-A)相比是否显示出增加的内在化。出于此目的，对适度表达EGF受体的NCI-H292细胞进行内在化实验。通过流式细胞技术(Flow CytoMetry,FCM)使用pHrodoTM标记的白蛋白(50μg/ml)作为检测工具，测量在生命细胞中内在化纳米抗体的积累。
Figure BDA0001427334130001012
染料是pH敏感性分子探针并且在中性pH下几乎是非荧光的。在酸性环境中，如在内体和溶酶体中，其发出明亮的荧光。在平底96孔板中转移细胞(30.000细胞/孔)并且在37℃下用不同浓度的特定多肽和构建体连同pHrodoTM标记的白蛋白(50μg/ml)一起温育5小时。之后将细胞洗涤、收获、基于FCM测量并且分析。
获得的剂量-响应曲线在图19中给出并且相关的EC50值和顶部MFI顶部水平在表9中列出。
表9.估算的EC50值和MFI顶部水平
Figure BDA0001427334130001011
明显地，与单体T023800001-A和传统连接的二价纳米抗体T023800006-A相比，在NCI-H292细胞中，DIM T023800001的总体内在化似乎更加强效和有效。此外，这种内在化的差异较不明显，然而在以极高水平表达EGFR的细胞如MDA-MB-468中仍然明显(数据未示出)。
在整个本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权的专利、公布的专利申请、和共同待审的专利申请)的全部内容通过引用明确地结合，尤其是对于在上文引用的教导。
附图和实验部分/实施例仅给出以进一步说明本发明并且不应以任何方式被解释或理解为限制本发明的范围和/或所附权利要求的范围，除非在本文中明确地另外指出。
Figure BDA0001427334130001031
序列表
<110> 埃博灵克斯股份有限公司
<120> Cysteine linked dimers -2
<130> P15-003-PCT-1
<150> US62/112,218
<151> 2015-02-05
<150> US62/269,434
<151> 2015-12-18
<160> 110
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 1
Cys
1
<210> 2
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 2
Gly Cys
1
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 3
Gly Gly Cys
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 4
Gly Gly Gly Cys
1
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Cys
1 5
<210> 6
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 6
Ala Cys
1
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 7
Ala Ala Cys
1
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 8
Ala Ala Ala Cys
1
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 9
Ala Ala Ala Ala Cys
1 5
<210> 10
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 10
Cys Gly
1
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 11
Gly Cys Gly
1
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 12
Gly Gly Cys Gly
1
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 13
Gly Gly Gly Cys Gly
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Cys Gly
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 16
Ala Ala Ala
1
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 18
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> linker
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 27
<211> 262
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 27
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
165 170 175
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
245 250 255
Val Ser Ser Gly Gly Cys
260
<210> 28
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobdy
<400> 28
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
165 170 175
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
180 185 190
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
260 265 270
<210> 29
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 29
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
165 170 175
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
180 185 190
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
245 250 255
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Cys
<210> 30
<211> 406
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 30
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
165 170 175
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
180 185 190
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
290 295 300
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
305 310 315 320
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
325 330 335
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
340 345 350
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
355 360 365
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
370 375 380
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
385 390 395 400
Val Ser Ser Gly Gly Cys
405
<210> 31
<211> 409
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 31
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
165 170 175
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
180 185 190
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
245 250 255
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
290 295 300
Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
305 310 315 320
Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
325 330 335
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala
340 345 350
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr
355 360 365
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
370 375 380
Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr
385 390 395 400
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
405
<210> 32
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 35
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 36
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 38
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 40
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala
115
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala Ala
115
<210> 42
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly
115
<210> 43
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly
115
<210> 44
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly
115
<210> 45
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 45
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework1
<400> 46
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg
20 25 30
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> cdr1
<400> 47
Ser Tyr Gly Met Gly
1 5
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework2
<400> 48
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> cdr2
<400> 49
Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework3
<400> 50
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> cdr3
<400> 51
Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework4
<400> 52
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> 9G8
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework1
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> cdr1
<400> 55
Ser Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework2
<400> 56
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Val
1 5 10
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> cdr2
<400> 57
Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework3
<400> 58
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> cdr3
<400> 59
Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> framework4
<400> 60
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 1210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> hEGFR
<400> 61
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770 775 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865 870 875 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930 935 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965 970 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe
1010 1015 1020
Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala
1025 1030 1035 1040
Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln
1045 1050 1055
Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp
1060 1065 1070
Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro
1075 1080 1085
Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser
1090 1095 1100
Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser
1105 1110 1115 1120
Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro
1125 1130 1135
Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp
1140 1145 1150
Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp
1155 1160 1165
Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn
1170 1175 1180
Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val
1185 1190 1195 1200
Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1205 1210
<210> 62
<211> 273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser His Pro Pro Thr Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
165 170 175
Gly Ile Ser Ser Ser Lys Arg Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Lys Gln Arg Glu Ser Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Lys
195 200 205
Asp Tyr Thr Asp Ala Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr
210 215 220
Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Ile Glu Ala Gly Thr Gly Trp Ala Thr
245 250 255
Arg Arg Gly Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 63
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser His Pro Pro Thr Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
165 170 175
Gly Arg Ala Phe Ser Arg Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Pro Ser Lys
195 200 205
Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala Lys Phe Val Asn Thr Asp Ser
245 250 255
Thr Trp Ser Arg Ser Glu Met Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 64
<211> 273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ser Ser Ser Lys Arg
20 25 30
Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ser Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Lys Asp Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ile Glu Ala Gly Thr Gly Trp Ala Thr Arg Arg Gly Tyr Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
145 150 155 160
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
165 170 175
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn Val Met Gly
180 185 190
Trp Tyr Arg Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala Ala
195 200 205
Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ser His
245 250 255
Pro Pro Thr Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 65
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Pro Ser Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Phe Val Asn Thr Asp Ser Thr Trp Ser Arg Ser Glu Met
100 105 110
Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly
180 185 190
Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
195 200 205
Trp Val Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser
210 215 220
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Asn Ser His Pro Pro Thr Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 66
<211> 283
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Arg Ala Leu Asn Met Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Arg Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ser Thr Pro Thr Met Asn Ile Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ser Ser Ser Lys
180 185 190
Arg Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ser
195 200 205
Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Lys Asp Tyr Thr Asp Ala Val
210 215 220
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Thr Lys Asn Thr Val Tyr
225 230 235 240
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
245 250 255
Lys Ile Glu Ala Gly Thr Gly Trp Ala Thr Arg Arg Gly Tyr Thr Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 67
<211> 287
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Arg Ala Leu Asn Met Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Arg Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ser Thr Pro Thr Met Asn Ile Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
165 170 175
Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Arg
180 185 190
Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
195 200 205
Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Pro Ser Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
210 215 220
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Lys Phe Val Asn Thr Asp Ser Thr Trp Ser Arg Ser Glu
260 265 270
Met Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 68
<211> 283
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ser Ser Ser Lys Arg
20 25 30
Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ser Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Lys Asp Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ile Glu Ala Gly Thr Gly Trp Ala Thr Arg Arg Gly Tyr Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
145 150 155 160
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
165 170 175
Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Arg Ala Leu Asn Met Tyr Val Met Gly
180 185 190
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
210 215 220
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
225 230 235 240
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Arg Cys Ala Ala Ser
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Thr Pro Thr Met Asn Ile Leu Glu Glu Tyr Arg Tyr
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 69
<211> 287
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Pro Ser Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Phe Val Asn Thr Asp Ser Thr Trp Ser Arg Ser Glu Met
100 105 110
Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Arg Ala Leu Asn Met
180 185 190
Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe
195 200 205
Val Ala Ala Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser
210 215 220
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Arg
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ser Thr Pro Thr Met Asn Ile Leu Glu
260 265 270
Glu Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 70
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn Val Met
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp Gly Tyr
100 105 110
Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
145 150 155 160
Gly Arg Ala Phe Ser Arg Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
165 170 175
Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Trp Gly Pro Ser Lys
180 185 190
Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
195 200 205
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu
210 215 220
Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala Lys Phe Val Asn Thr Asp Ser
225 230 235 240
Thr Trp Ser Arg Ser Glu Met Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 71
<211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Pro Ser Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Phe Val Asn Thr Asp Ser Thr Trp Ser Arg Ser Glu Met
100 105 110
Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser
145 150 155 160
Gly Arg Thr Phe Asn Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr
180 185 190
Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn
225 230 235 240
Pro Ala Arg Trp Asp Gly Tyr Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser
260
<210> 72
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr Trp
180 185 190
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
195 200 205
Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr Trp
260 265 270
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 73
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr Trp
180 185 190
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Ala Val Ala
195 200 205
Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr Trp
260 265 270
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 74
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met
180 185 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly
195 200 205
Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
260 265 270
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 75
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr Gly Met
180 185 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Gly
195 200 205
Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
260 265 270
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 76
<211> 287
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Leu Arg Trp Ser Ser Ser Asn Ile Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Gly Asp Tyr Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Arg Trp Gly Val Met Glu Ser Asp Thr
100 105 110
Glu Tyr Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn
180 185 190
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
195 200 205
Ala Ala Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
225 230 235 240
Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp
260 265 270
Gly Tyr Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 77
<211> 287
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Leu Arg Trp Ser Ser Gly Asn Ile Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Gly Asp Tyr Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Arg Trp Gly Val Met Glu Ser Asp Thr
100 105 110
Glu Tyr Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn
180 185 190
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
195 200 205
Ala Ala Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
225 230 235 240
Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp
260 265 270
Gly Tyr Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 78
<211> 287
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Pro Arg Leu Val
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Leu Ser Lys Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Ile Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gly Arg Gln Asn Trp Ser Gly Ser Pro Ala Arg Thr Asn
100 105 110
Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn
180 185 190
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
195 200 205
Ala Ala Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
225 230 235 240
Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp
260 265 270
Gly Tyr Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 79
<211> 287
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Pro Ser Ile Ile
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Leu Ser Lys Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ala Lys Asn Thr Ile Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Gln Asn Trp Ser Gly Asn Pro Thr Arg Thr Asn
100 105 110
Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn
180 185 190
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
195 200 205
Ala Ala Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
225 230 235 240
Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp
260 265 270
Gly Tyr Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 80
<211> 279
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Asp
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala His Arg Thr Ser Gly Ile Ser Thr Val Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gly Met Lys Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Asp Ala Ser Gly Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys
165 170 175
Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
180 185 190
Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Arg Trp Ser Ser Thr
195 200 205
Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr
210 215 220
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Tyr
245 250 255
Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp Gly Tyr Asp Phe Arg Gly Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 81
<211> 285
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ile Gly Glu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Tyr Tyr Thr Ala Tyr Val Ala Ala Ala Asp Glu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
165 170 175
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn Val Met
180 185 190
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
195 200 205
Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser
210 215 220
Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
225 230 235 240
Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp Gly Tyr
260 265 270
Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 82
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 82
Cys Ala
1
<210> 83
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 83
Gly Cys Ala
1
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 84
Gly Gly Cys Ala
1
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 85
Gly Gly Gly Cys Ala
1 5
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 86
Gly Gly Gly Gly Cys Ala
1 5
<210> 87
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 87
Ala Cys Ala
1
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 88
Ala Ala Cys Ala
1
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 89
Ala Ala Ala Cys Ala
1 5
<210> 90
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 90
Ala Ala Ala Ala Cys Ala
1 5
<210> 91
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 91
Cys Gly Ala
1
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 92
Gly Cys Gly Ala
1
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 93
Gly Gly Cys Gly Ala
1 5
<210> 94
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 94
Gly Gly Gly Cys Gly Ala
1 5
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 95
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala
1 5
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> c-terminal extension
<400> 96
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 97
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser His Pro Pro Thr Leu Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Gly Pro Ser Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Phe Val Asn Thr Asp Ser Thr Trp Ser Arg Ser Glu Met
100 105 110
Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 99
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Ser Ser Ser Lys Arg
20 25 30
Asn Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ser Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Lys Asp Tyr Thr Asp Ala Val Lys
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ile Glu Ala Gly Thr Gly Trp Ala Thr Arg Arg Gly Tyr Thr Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Arg Ala Leu Asn Met Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Arg Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ser Thr Pro Thr Met Asn Ile Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Arg Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 101
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Asn Val Met
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Val Arg Trp Ser Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ser Asn Pro Ala Arg Trp Asp Gly Tyr
100 105 110
Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 102
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 105
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Leu Arg Trp Ser Ser Ser Asn Ile Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Gly Asp Tyr Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Arg Trp Gly Val Met Glu Ser Asp Thr
100 105 110
Glu Tyr Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 106
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Leu Arg Trp Ser Ser Gly Asn Ile Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Gly Asp Tyr Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Arg Trp Gly Val Met Glu Ser Asp Thr
100 105 110
Glu Tyr Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 107
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Pro Arg Leu Val
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Leu Ser Lys Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Ile Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gly Arg Gln Asn Trp Ser Gly Ser Pro Ala Arg Thr Asn
100 105 110
Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 108
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Pro Ser Ile Ile
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Leu Ser Lys Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ala Lys Asn Thr Ile Thr
65 70 75 80
Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Gln Asn Trp Ser Gly Asn Pro Thr Arg Thr Asn
100 105 110
Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 109
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Asp
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala His Arg Thr Ser Gly Ile Ser Thr Val Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gly Met Lys Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Asp Ala Ser Gly Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> CHAIN
<223> nanobody
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ile Gly Glu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Tyr Tyr Thr Ala Tyr Val Ala Ala Ala Asp Glu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (39)

1.用于制备二聚体的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(i)提供第一多肽，其中所述第一多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含半胱氨酸部分的C端延伸；
(ii)提供第二多肽，其中所述第二多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含半胱氨酸部分的C端延伸；和
(iii)通过加入氧化性铜离子Cu2+并且在pH 6.5至pH 7.5将在所述第一多肽的所述半胱氨酸部分的巯基部分和在所述第二多肽的所述半胱氨酸部分的巯基部分氧化为二硫化物衍生物胱氨酸；
(iv)使所述二硫化物衍生物胱氨酸与在来源于所述胱氨酸的两个半胱氨酸残基之间形成桥的缀合剂反应；和
(v)任选将所述二聚体纯化；
其特征在于维持了所述ISVD的完整性，
其中所述ISVD是其中抗原结合位点存在于单一免疫球蛋白结构域上并且由单一免疫球蛋白结构域形成的分子；
其中所述C端延伸选自由SEQ ID NO:1-15和82-96组成的组；
其中所述缀合剂选自由下列各项组成的组：
-包含式(I)的官能团的缀合剂
Figure FDA0003489766530000011
其中W表示吸电子基团；A表示C1-5亚烷基或亚烯基链；B表示键或C1-4亚烷基或亚烯基链；并且每个L独立地表示离去基团；
-包含式(Ia)的官能团的缀合剂：
Figure FDA0003489766530000021
其中Q表示连接基团并且D表示诊断、治疗或标记试剂或者用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂；W表示氰基；
-包含式(Ib)的官能团的缀合剂：
Figure FDA0003489766530000022
其中Q表示连接基团并且D表示诊断、治疗或标记试剂或者用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂；
包含式(II)、(III)或(IV)的官能团的缀合剂：
Figure FDA0003489766530000023
其中X和X’中的一个表示聚合物并且另一个表示氢原子；
Q表示连接基团；
W表示吸电子基团；或者，如果X’表示聚合物，则X-Q-W可以共同表示吸电子基团；
A表示C1-5亚烷基或亚烯基链；
B表示键或C1-4亚烷基或亚烯基链；并且
每个L独立地表示离去基团；
Figure FDA0003489766530000024
其中X、X’、Q、W、A和L具有对于通式(II)所给出的含义，并且此外，如果X表示聚合物，则X’和吸电子基团W连同之间的原子一起可以形成环，并且m表示1、2、3或4的整数；或
X-Q-W-CR1R1’-CR2.L.L’(IV)
其中X、Q和W具有对于通式(II)所给出的含义，并且
R1表示氢原子或C1-4烷基，R1’表示氢原子，并且L和L’中的每一个独立地表示离去基团；或
R1表示氢原子或C1-4烷基，L表示离去基团，并且
R1和L’共同表示键；或
R1和L共同表示键并且R1和L’共同表示键；并且
R2表示氢原子或C1-4烷基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(v)中，通过尺寸排阻色谱将所述二聚体纯化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过质谱法确定，所述第一多肽和所述第二多肽的至少80％是二聚化的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中D表示药物或者用于药物的结合剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合剂是接头。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述药物选自由下列各项组成的组：化疗剂、生长抑制试剂、毒素和放射性同位素。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述毒素是细菌、真菌、植物、或动物来源的酶活性毒素或其片段。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述药物是细胞生长抑制剂。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述药物是细胞毒性剂。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述药物是MMAE。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述药物是毒素部分。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合剂是用于诊断、治疗或标记试剂的接头。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽还包含马来酰亚胺-val-cit-MMAE。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述接头是不可裂解接头或可裂解接头。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述接头是包含用于细胞酶的切割位点的可pH裂解接头。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞酶是细胞酯酶或细胞蛋白酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞酶是组织蛋白酶B。
18.根据权利要求4所述的方法，其中所述药物与二聚体之比(DAR)是1。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述C端延伸与所述多肽中位于最C端的ISVD的C端末端遗传融合。
20.一种二聚体，所述二聚体包含第一多肽和第二多肽，
其中所述第一多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含半胱氨酸部分的C端延伸；
其中所述第二多肽包含
-至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)和
-包含半胱氨酸部分的C端延伸；并且
其中所述ISVD是其中抗原结合位点存在于单一免疫球蛋白结构域上并且由单一免疫球蛋白结构域形成的分子；
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过在所述第一多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)的硫醚键和所述第二多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分(C)的硫醚键共价连接，并且化合物是根据式(V)或式(VI)
Figure FDA0003489766530000041
其中
“-C-”表示在本发明的多肽的C端延伸中的半胱氨酸部分；
“-C”表示在本发明的多肽的C端延伸的C末端的半胱氨酸部分；
R1表示C1-4烷基；并且D表示诊断、治疗或标记试剂或者用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂；
其中所述第一多肽和所述第二多肽各自包括以下之一：SEQ ID NO:27-31和62-81；
其中所述C端延伸选自由SEQ ID NO:1-15和82-96组成的组。
21.根据权利要求20所述的二聚体，其中D表示药物或者用于药物的结合剂。
22.根据权利要求20所述的二聚体，其中所述结合剂是接头。
23.根据权利要求21所述的二聚体，其中所述药物选自由下列各项组成的组：化疗剂、生长抑制试剂、毒素和放射性同位素。
24.根据权利要求23所述的二聚体，其中所述毒素是细菌、真菌、植物、或动物来源的酶活性毒素或其片段。
25.根据权利要求21所述的二聚体，其中所述药物是细胞生长抑制剂。
26.根据权利要求21所述的二聚体，其中所述药物是细胞毒性剂。
27.根据权利要求21所述的二聚体，其中所述药物是MMAE。
28.根据权利要求21所述的二聚体，其中所述药物是毒素部分。
29.根据权利要求20所述的二聚体，所述二聚体包含马来酰亚胺-val-cit-MMAE。
30.根据权利要求20所述的二聚体，其中所述结合剂是用于诊断、治疗或标记试剂的接头。
31.根据权利要求20所述的二聚体，其中所述接头是不可裂解接头或可裂解接头。
32.根据权利要求31所述的二聚体，其中所述接头是包含用于细胞酶的切割位点的可pH裂解接头。
33.根据权利要求32所述的二聚体，其中所述细胞酶是细胞酯酶或细胞蛋白酶。
34.根据权利要求33所述的二聚体，其中所述细胞酶是组织蛋白酶B。
35.根据权利要求21所述的二聚体，其中所述药物与二聚体之比(DAR)是1。
36.根据权利要求20所述的二聚体，其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含含有半胱氨酸部分的50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸残基的C端延伸，其中所述半胱氨酸部分位于C末端。
37.根据权利要求22所述的二聚体，其中所述C端延伸选自由SEQ ID NO:1-15组成的组。
38.根据权利要求20所述的二聚体，所述二聚体用于治疗癌症，其中所述二聚体内在化。
39.根据权利要求20至37中任一项所述的二聚体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症，其中所述二聚体内在化。
CN201680020654.8A 2015-02-05 2016-02-05 通过c端改造的半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体 Active CN107667113B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562112218P 2015-02-05 2015-02-05
US62/112,218 2015-02-05
US201562269434P 2015-12-18 2015-12-18
US62/269,434 2015-12-18
PCT/EP2016/052578 WO2016124781A1 (en) 2015-02-05 2016-02-05 Nanobody dimers linked via c-terminally engineered cysteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107667113A CN107667113A (zh) 2018-02-06
CN107667113B true CN107667113B (zh) 2022-05-03

Family

ID=55315425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680020654.8A Active CN107667113B (zh) 2015-02-05 2016-02-05 通过c端改造的半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11021544B2 (zh)
EP (1) EP3262068A1 (zh)
JP (1) JP6894375B2 (zh)
CN (1) CN107667113B (zh)
AU (2) AU2016214317B2 (zh)
CA (1) CA2975810A1 (zh)
HK (1) HK1249528A1 (zh)
WO (1) WO2016124781A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016097313A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Ablynx N.V. Cysteine linked nanobody dimers
EP3630847A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Merck Patent GmbH Adamts binding immunoglobulins
CN108610415A (zh) * 2018-05-15 2018-10-02 大连理工大学 一种抗体复合物的制备方法
EP3792283A1 (en) * 2019-09-16 2021-03-17 Lava Therapeutics B.V. Treatment of cancer comprising administration of vgamma9vdelta2 t cell receptor binding antibodies
CN111004328A (zh) * 2019-12-11 2020-04-14 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种用于双抗体夹心法检测癌胚抗原的纳米抗体组合
GB201918230D0 (en) 2019-12-11 2020-01-22 Prec Therapeutics Ltd Antibodies and their uses
EP4126971A1 (en) * 2020-03-30 2023-02-08 Ablynx N.V. Method for the production and purification of multivalent immunoglobulin single variable domains
EP4214235A1 (en) * 2020-09-16 2023-07-26 LinXis B.V. Internalizing binding molecules
CN114957476A (zh) * 2021-02-23 2022-08-30 复旦大学 一种半胱氨酸工程化的结合人5t4的全人源纳米抗体
CN113624898B (zh) * 2021-08-23 2023-08-25 成都诺和晟泰生物科技有限公司 一种手性镇痛类多肽药物的纯化方法
WO2023133595A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
CN114957478B (zh) * 2022-05-30 2023-08-18 华南农业大学 一种抗肉桂酰胺类杀菌剂的纳米抗体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013190292A2 (en) * 2012-06-19 2013-12-27 Polytherics Limited Novel process for preparation of antibody conjugates and novel antibody conjugates
CN104114579A (zh) * 2011-10-27 2014-10-22 根马布股份公司 异二聚体蛋白的生成

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1517921B1 (en) * 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
US9701754B1 (en) * 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
US7958832B2 (en) * 2008-08-29 2011-06-14 Nike, Inc. Awl for making an awl feature in material for apparel
EP2982690B1 (en) * 2009-04-30 2021-01-27 Ablynx N.V. Method for the production of domain antibodies
HUE051430T2 (hu) * 2009-07-10 2021-03-01 Ablynx Nv Eljárás variábilis domének elõállítására
CA2819187A1 (en) * 2010-11-29 2012-06-07 National Research Council Of Canada Covalently dimerized bivalent binding agents
PL3049439T3 (pl) * 2013-09-26 2020-07-13 Ablynx N.V. Bispecyficzne nanociała
WO2016097313A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Ablynx N.V. Cysteine linked nanobody dimers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104114579A (zh) * 2011-10-27 2014-10-22 根马布股份公司 异二聚体蛋白的生成
WO2013190292A2 (en) * 2012-06-19 2013-12-27 Polytherics Limited Novel process for preparation of antibody conjugates and novel antibody conjugates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemoenzymatic Strategy for the Synthesis of Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Multimodal PET and Optical Imaging;Brian M. Zeglis，et al.;《Bioconjugate Chem.》;20141217;第25卷(第12期);第2123-2128页 *
纳米抗体的应用及其研究新进展;姜忍忍等;《生命的化学》;20130630;第33卷(第3期);第307-315页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3262068A1 (en) 2018-01-03
US20190100599A1 (en) 2019-04-04
AU2021290305B2 (en) 2024-01-18
HK1249528A1 (zh) 2018-11-02
CA2975810A1 (en) 2016-08-11
JP2018509394A (ja) 2018-04-05
WO2016124781A1 (en) 2016-08-11
JP6894375B2 (ja) 2021-06-30
AU2021290305A1 (en) 2022-01-27
US11021544B2 (en) 2021-06-01
CN107667113A (zh) 2018-02-06
AU2016214317B2 (en) 2022-01-13
AU2016214317A1 (en) 2017-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230211006A1 (en) Cysteine linked nanobody dimers
CN107667113B (zh) 通过c端改造的半胱氨酸连接的纳米抗体二聚体
JP2018516539A (ja) 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体−細胞毒性薬物複合体ならびにそれらの医薬用途
KR102342935B1 (ko) 항체-약물 접합체 및 면역독소
KR102342934B1 (ko) 항체-약물 접합체 및 면역독소
JP2024500405A (ja) Ｒｏｒ１特異的バリアント抗原結合分子
US20210346508A1 (en) Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
JP2019534267A (ja) 抗ｃ ｍｅｔ抗体‐細胞傷害性薬物複合体の医学的使用
JP2022540946A (ja) コンジュゲーションのためのポリペプチド複合体及びその応用
TWI839357B (zh) 抗ｍｕｃ１抗體藥物複合體
RU2806049C2 (ru) Конъюгаты анти-her2 бипаратопных антител-лекарственных веществ и способы их применения
RU2806049C9 (ru) Конъюгаты анти-her2 бипаратопных антител-лекарственных веществ и способы их применения
WO2023247729A1 (en) Ror1/egfr bi-specific antigen binding molecules

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant