NO332224B1 - Fremgangsmate for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid - Google Patents
Fremgangsmate for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid Download PDFInfo
- Publication number
- NO332224B1 NO332224B1 NO20100324A NO20100324A NO332224B1 NO 332224 B1 NO332224 B1 NO 332224B1 NO 20100324 A NO20100324 A NO 20100324A NO 20100324 A NO20100324 A NO 20100324A NO 332224 B1 NO332224 B1 NO 332224B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- peg
- ifn
- polypeptide
- molecular weight
- low molecular
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims description 123
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims description 33
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 10
- -1 succinimidyl esters Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 7
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 4
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 claims description 2
- BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;carbonic acid Chemical class OC(O)=O.C1=CC=C2NN=NC2=C1 BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical class C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical class NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 2
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 claims 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 claims 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 abstract description 47
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 abstract description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 17
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 11
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 8
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 3
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241001082241 Lythrum hyssopifolia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940060205 adagen Drugs 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000008431 aliphatic amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 102000051179 human NCKIPSD Human genes 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108010001564 pegaspargase Proteins 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
Abstract
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for den trinnvise festingen av PEG-andeler i serie til et polypeptid, og nærmere bestemt til IFN-P
Description
Den foreliggende oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for den trinnvise festingen av to eller flere polyetylenglykol (PEG)-andeler til et polypeptid.
Kovalent festing av den hydrofiliske polymer-polyetylenglykol (PEG), også kjent som polyetylenoksid, (PEO), til molekyler har viktige applikasjoner i bioteknologi og medisin. I dens mest vanlige form er PEG en lineær polymer som har hydroksylgrupper ved hver ende:
HO-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH2-OH
Denne formelen kan kort være representert som HO-PEG-OH, hvor det er ment at
-PEG- representerer den polymer ryggkjeden uten endegruppene:
"-PEG-" betyr "-CH2CH20(CH2CH20)I1CH2CH2-
PEG er vanlig anvendt som metoksy-PEG-OH, (m-PEG), hvor én ende er den relativt inerte metoksygruppen, mens den andre enden er en hydroksylgruppe som er utsatt for kjemisk modifisering.
CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH
Forgrenede PEGer er også i vanlig bruk. De forgrenede PEGer kan være representert som R(-PEG-OH)mhvor R representerer en sentral kjerneandel slik som pentaerytritol eller glyserol, og m representerer antallet forgreningsarmer. Antallet forgreningsarmer (m) kan være fra tre til hundre eller flere. Hydroksylgruppene er utsatt for kjemisk modifisering.
En annen forgrenet form, slik som den beskrevet i WO 96/21469, har en enkelt ende som er utsatt for kjemisk modifisering. Denne type PEG kan være representert som (CH30-PEG-)PR-X, hvor p er lik 2 eller 3, R representerer en sentralkjerne slik som lysin eller glyserol, og X representerer en funksjonell gruppe slik som karboksyl som er utsatt for kjemisk aktivering. Enda en forgrenet form "den pendante PEG", har reaktive grupper, slik som hydroksyl, langs PEG-ryggkjeden istedenfor ved enden av PEG-kjedene.
I tillegg til disse former av PEG kan polymeren også fremstilles med svake eller degraderbare koplinger i ryggkjeden. F.eks. har Harris vist i US patentsøknad 06/026 716 at PEG kan fremstilles med esterkoplinger i polymerryggkjeden som er utsatt for hydrolyse. Denne hydrolysen resulterer i kløyving av polymeren til fragmenter av lavere molekyl vekt, i henhold til reaksjonsraten:
-PEG-CO2-PEG- + H20 -» -PEG-CO2H + HO-PEG-
Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er uttrykket polyetylenglykol eller PEG ment å omfatte alle de ovennevnte derivater.
Kjemien til kopolymerene av etylenoksid og propylenoksid er nært relatert til PEG, og de kan anvendes istedenfor PEG i mange av dens applikasjoner. De har den
følgende generelle formelen:
HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH
hvor R er H eller CH3.
PEG er en nyttig polymer som har egenskapen av høy vannoppløselighet samt høy opp løselighet i mange organiske løsningsmidler. PEG er også ikke-toksisk og ikke-immunogenisk. Når PEG er kjemisk festet (PEGylering) til en vannuløselig forbindelse, er det resulterende konjugatet generelt vannløselig, samt løselig i mange organiske løsningsmidler.
PEG-proteinkonjugater er for tiden anvendt i proteinfornyelsesterapier og for andre terapeutiske anvendelser. F.eks. er PEGylert adenosindeaminase (ADAGEN<®>) anvendt for å behandle alvorlig kombinert immunomangelsykdom (SCIDS), PEGylert L-asparaginase (ONCAPSPAR<®>) anvendes for å behandle akutt lymfoblastisk leukemi (ALL), og PEGylert interferon-a (INTRON(R) A) er i fase III-forsøk for behandling av hepatitt C.
For en generell gjennomgåelse av PEG-proteinkonjugater med klinisk virkning vises det til N.L. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm..15:210-218, 1994. Den kjente teknikken er også tilkjennegitt i Goodson, R.J. et al., "Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site", Bio/Technology, vol.8, nr.4, 1990, side 343-346 og i WO 97/11957 Al.
En rekke metoder er blitt utviklet for å PEGylere proteiner. Festing av PEG til reaktive grupper funnet på proteinet utføres typisk ved anvendelse av elektrofilisk aktiverte PEG-derivater. Festing av PEG til a- og e-aminogrupper funnet på lysinrester og N-enden resulterer i et konjugat bestående av en blanding av produkter.
Generelt består slike konjugater av en populasjon av flere PEG-molekyler festet pr. proteinmolekyl ("PEGmerer") som er i området fra null til antallet av aminogrupper i proteinet. For et proteinmolekyl som er blitt noe modifisert, kan PEG-enheten være festet ved en rekke forskjellige aminsteder.
Denne type av ikke-spesifikk PEGylering har resultert i en rekke konjugater som blir nesten inaktiv. Reduksjon av aktivitet er typisk bevirket ved skjerming av proteinets aktive bindingsdomene som er tilfelle med mange cytokiner og antistoffer. F.eks. beskriver Katre et al. i US patent 4 766 106 og US patent 4 917 888 PEGyleringen av IFN-p og IL-2 med et stort overskudd av metoksy-polyetylenglykol N-succinimidylglutarat og metoksy-polyetylenglykolol N-succinimidylsukkinat. Begge proteiner ble produsert i mikrobielle vertsceller, som muliggjorde den arealbegrensede mutasjonen av det fri cysteinet til et serin. Mutasjonen var nødvendig i mikrobiell ekspresjon av IFN-p for å lette protein- sammenlegging. Særlig er IFN-p anvendt i disse forsøkene det kommersielle produktet Betaseron<®>, hvor Cys<I7->rest er erstattet med et serin. I tillegg reduserte fraværet av glykosylering dens løselighet i vandig løsning. Arealbegrenset PEGylering resulterte i øket løselighet, men et hovedproblem var det reduserte nivået av aktivitet og utbytte.
EP 593 868 med tittel PEG-interferonkonjugat, beskriver fremstillingen av PEG-IFN-a-konjugater. Imidlertid er PEGyleringsreaksjonen ikke arealbegrenset, og derfor oppnås en blanding av posisjonelle isomerer av PEG-IFN-a-konjugater (jfr. også Monkarsh et al, ACS Symp. Ser., 680:207-216, 1997).
Kinstler et al. i EP 675 201 demonstrerte den selektive modifiseringen av den N-enderesten av megakaryocyttvekst og utviklingsfaktor (MGDF) med mPEG-propionaldehyd. Dette førte til den reproduserbare PEGyleringen og farmako-kinetikker fra mengde til mengde. Gilbert et al. i US patent 5 711 944 demonstrerte at PEGylasjon av IFN-a med et optimalt aktivitetsnivå kunne produseres. I dette tilfellet var et omstendelig rensetrinn nødvendig for å oppnå det optimale konjugatet.
Størstedelen av cytokiner, samt andre proteiner, innehar ikke en spesifikk PEG-festesete og, bortsett fra eksemplene nevnt ovenfor, er det svært sannsynlig at noen av isomerene produsert ved PEGyleringsreaksjonen er delvis eller totalt inaktiv, som således fører til et tap med hensyn på aktivitet for sluttblandingen.
Arealbegrenset mono-PEGylering er således et ønsket mål ved fremstillingen av slike proteinkonjugater.
Woghiren et al. i Bioconjugate Chem., 4(5):314-318, 1993, syntetiserte et tiol-selektivt PEG-derivat for en slik arealbegrenset PEGylasjon. Et stabilt tiol-beskyttet PEG-derivat i formen av en parapyridyldisulfidreaktiv gruppe ble vist å spesifikt konjugere til det fri cysteinet i proteinet, papain. Den nylig dannede disulfidbindingen mellom papain og PEG kunne kløyves under milde reduksjonsbetingelser for å regenerere det native proteinet.
Angivelse av ethvert dokument her er ikke ment som en innrømmelse av at slike dokumenter er aktuelle innen teknikkens stand, eller ansett å være materiale vedrørende patenterbarheten til ethvert krav i den foreliggende fremstillingen. Enhver uttalelse hva angår innhold eller en dato for et hvilket som helst dokument er basert på informasjon tilgjengelig for søkerne ved tiden for innleveringen og er ikke en innrømmelse av hva angår det korrekte med en slik uttalelse.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for den trinnvise festingen av PEG-andeler i serie til et polypeptid.
Fig. 1 viser den kapillære elektroforese (CE) kurven av PEG-IFN-p-konjugatet før rensing. Fig. 2A-2C viser rensingen av PEG-IFN-p-konjugatet utført ved størrelses-eksklusjonskromatografi (Superose 12): Fig. 2A - første gjennomløp; Fig. 2B - andre gjennomløp; Fig. 2C - tredje gjennomløp. Fig. 3 viser SDS-PAGE-kromatografien av renset PEG-IFN-p-konjugat fra det tredje kromatografigjennomløpet. Felter 1 og 4 er proteinmolekylvektbestanddeler, felt 2 er «nativ» IFN-p, og felt 3 er PEG-IFN-p-konjugat. Fig. 4 rapporterer den kapillære elektroforese (CE) kurven av renset PEG-IFN-p-konjugat hvor IFN-p er PEGylert med mPEG-OPSS5k.
Fig. 5 rapporterer MALDI MS spektrumet av renset PEG-IFN-p-konjugat.
Fig. 6 viser en sammenligning mellom antivirusaktiviteten av «nativ» IFN-p og av PEG-IFN-p-konjugat. WISH-celler ble inkubert med indikerte konsentrasjoner av IFN-p-prøver i 24 timer før de ble utfordret med cytopatisk dose av vesikular stomotitisvirus. Den cytopatiske effekten ble bestemt etter ytterligere 48 timer ved MTT-konversj on.
Fig. 7 viser bindingsprofilen av IFN-p og PEG-IFN i Daudi-celler.
Fig. 8 viser den farmokinetiske profilen av IFN-p og PEG-IFN i mus etterfølgende intravenøs administrering. De prikkede linjene indikerer assay-LOQ for hver standardkurve. Fig. 9 viser den farmokinetiske profilen av IFN-p og PEG-IFN i mus etterfølgende subkutan administrering. De prikkede linjene indikerer assay-LOQ for hver standardkurve.
«IFN-p», som anvendt her, betyr human fibroblastinterferon, som oppnådd ved isolasjon fra geologiske fluider eller som oppnådd ved DNA-rekombinante teknikker fra prokaryote eller eukaryote vertsceller samt deres salter, funksjonelle derivater, forløpere med aktive fraksjoner, forutsatt at de inneholder cysteinresten som fremkommer ved posisjon 17 i den naturlig forekommende formen.
Polyolandelen i polyol-IFN-p-konjugatet kan være ethvert vannløselig mono- eller bifunksjonelt poly(alkylenoksid) som har en lineær eller forgrenet kjede. Typisk er polyolet et poly(alkylenglykol) slik som poly(etylenglykol) (PEG). Imidlertid vil fagfolk erkjenne at andre polyoler, slik som f.eks. poly(propylenglykol) og kopolymerer av polyetylenglykol og polypropylenglykol, kan velegnet til formålet anvendes.
Som anvendt her er uttrykket "PEG-andel" ment å omfatte, men er ikke begrenset til, lineær og forgrenet PEG, metoksy PEG, hydrolytisk eller enzymatisk degraderbar PEG, pendant PEG, dendrimer PEG, kopolymerer av PEG og én eller flere polyoler, og kopolymerer av PEG og PLGA (poly(melkesyre/glykolsyre)).
Definisjonen "salter" som anvendt her refererer både til saltene av karboksylgruppene og til saltene av aminofunksjonene av forbindelsen som er oppnåelig ved kjente metoder. Saltene av karboksylgruppene omfatter uorganiske salter som f.eks. natrium-, kalium- og kalsiumsalter og salter med organiske baser som de dannet med et amin som trietanolamin, argin eller lysin. Saltene av aminogruppene omfatter f.eks. salter med uorganiske syrer som saltsyre og med organiske syrer som eddiksyre.
Definisjonen "funksjonelle derivater" som anvendt her refererer til derivater som kan fremstilles fra de funksjonelle gruppene tilstede på de laterale kjedene av aminosyreandelene eller på de terminale N- eller C-gruppene i henhold til kjente metoder og er inkludert i den foreliggende oppfinnelsen når de er farmasøytisk akseptable, dvs. når de ikke kan ødelegge proteinaktiviteten eller ikke gir toksisitet til de farmasøytiske blandingene inneholdende dem. Slike derivater omfatter f.eks. estere eller alifatiske amider av karboksylgruppene og N-acylderivater av fri aminogrupper eller O-acylderivater av fri hydroksylgrupper og er dannet med acylgrupper som f.eks. alkanoyl- eller aroylgrupper.
"Forløperne" er forbindelser som er omdannet til IFN-p i menneske- eller dyre kroppen.
Som "aktive fraksjoner" av proteinet refereres det til ethvert fragment eller enhver forløper av polypeptidkjeden i selve forbindelsen, alene eller i kombinasjon med relaterte molekyler og rester bundet i den, f.eks. rester av sukre eller fosfater, eller aggregater av polypeptidmolekylet når slike fragmenter eller forløpere viser den samme aktiviteten av IFN-p som medikament.
"Kromatografisk metode" betyr enhver teknikk som er anvendt for å separere komponentene av en blanding ved deres applikasjon på en bærer (stasjonær fase) hvorigjennom et løsningsmiddel (mobil fase) strømmer. Separasjonsprinsippene i kromatografien er basert på den forskjellige fysikalske beskaffenheten til stasjonær og mobil fase.
Noen spesielle typer kromatografiske metoder, som er velkjent innen litteraturen, omfatter: væske, høy trykks væ ske, ioneutvekslings, absorpsjons, affinitets, partisjons, hydrofobisk, reversert fase, gelfilterering, ultrafiltrering eller tynnlags-kromatografi.
Den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot en fremgangsmåte for den trinnvise festingen av to eller flere PEG-andeler til et polypeptid. Denne fremgangsmåten er basert på erkjennelsen at en aktivert PEG med lav molekylvekt reagerer mer fullstendig med et sterisk hindret reaksjonssete på et protein enn et aktivert PEG med høy molekylvekt. PEG-modifisering av dyre terapeutiske proteiner må være kostnadseffektive for produksjonen av PEG-konjugatet skal være praktisk. I tillegg, for å redusere glomerular filtrasjon og optimalisere de farmakologiske egenskapene av PEG-proteinkonjugatet, bør konjugatet ha en effektiv størrelse ekvivalent med det for et protein med en molekylvekt på 70 kDa. Dette betyr at for en arealbegrenset modifisering hvor 1 PEG vil være festet, er et PEG-derivat som har en molekylvekt på større enn 20 kDa fortrinnsvis festet. Hvis stedet for modifisering er sterisk overfylt, kan den reaktive gruppen på den store PEG-andelen ha vanskeligheter med å nå modifiseringsstedet og vil således føre til lavere utbytter. En foretrukket metode for PEGylering av et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen øker utbyttet av arealbegrenset PEGylering ved først å feste en liten hetero eller homo bifunksjonell PEG-andel at, på grunn av dens relativt mindre størrelse, kan reagere med sterisk overfylte seter. Etterfølgende festing av et PEG-derivat med høy molekylvekt til det lille PEG resulterer i høyt utbytte av det ønskede PEGylerte proteinet.
Metoden for trinnvis festing av to eller flere PEG-andeler i serie til et polypeptid ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter festing av en lavmolekylvekt heterobifunksjonell eller homobifunksjonell PEG-andel først til polypeptidet og deretter festing av en monofunksjonell eller bifunksjonell PEG-andel til den fri enden av lavmolekylvekt PEG-andelen som er festet til polypeptidet. Etterfølgende den trinnvise festing av to eller flere PEG-andeler i serie til et polypeptid, hvis polypeptid er fortrinnsvis IFN-p og hvor Cys<17>, lokalisert i et sterisk overfylt sete, er det foretrukne setet for PEG-festing, kan PEG-polypeptidkonjugatet renses ved anvendelse av én eller flere av renseteknikkene slik som ioneutbyttekromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi, affinitetskromatografi, og reversibel fasekromatografi.
Lavmolekylvekt PEG-andelen har formelen:
hvor W og X er grupper som uavhengig reagerer med et amin, sulfhydryl, karboksyl eller hydroksylfunksjonell gruppe for å feste lavmolekylvekt PEG-andelen til polypeptidet. W og X er fortrinnsvis uavhengig valgt fra ortopyridyldisulfid, maleimider, vinylsulfoner, iodacetamider, aminer, tioler, karboksyler, aktive estere, benzotriazolkarbonater, p-nitrofenolkarbonater, isocyanater og biotin.
Lavmolekylvekt PEG-andelen har fortrinnsvis en molekylvekt i området på 100-5000 dalton.
Den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen for festing til den frie enden av et lavmolekylvekt PEG som er festet til polypeptidet har fortrinnsvis en molekylvekt i området på 100 Da -200 kDa og er fortrinnsvis en metoksy PEG, forgrenet PEG, hydrolytisk eller enzymatisk degraderbar PEG, pendant PEG, eller dendrimer PEG. Det monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG har videre formelen:
hvor Y er reaktiv til en terminal gruppe på den fri enden av lavmolekylvekt PEG-andelen som er festet til polypeptidet og Z er -OCH3eller en gruppe reaktiv med for dannelse av et bifunksjonelt konjugat.
PEG-polypeptidkonjugatet produsert ved den ovennevnte metoden for trinnvis festing av to eller flere PEG-andeler kan anvendes for å produsere et medikament eller farmasøytisk blanding for behandling av sykdommer eller forstyrrelser hvor polypeptidene er effektive som en aktiv bestanddel.
En annen hensikt med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe konjugatene i stort sett renset form for at de skal være egnet til bruk i farmasøytiske blandinger, som aktiv bestanddel for behandlingen, diagnose eller prognose av bakterielle infeksjoner og virusinfeksjoner samt autoimmune sykdommer, betennelses-sykdommer og tumorer.
Ikke-begrensende eksempler på de ovennevnte sykdommene omfatter: septisk sjokk, AIDS, reumatoid artritt, lupus erytematøs og multippel sklerose.
Ytterligere utførelser og fordeler med oppfinnelsen vil fremkomme i den følgende beskrivelsen.
Konjugatene kan administreres i en farmakologisk aktiv mengde til subjekter ved risiko for å utvikle én av sykdommene rapportert ovenfor eller til subjekter som allerede viser slike patologier.
Enhver administreringsrute som er kompatibel med det aktive prinsippet kan anvendes. Parenteral administrasjon, slik som subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon er foretrukket. Dosen av den aktive bestanddelen som administreres avhenger av basisen av de medisinske reseptene ifølge alder, vekt og enkeltvis respons for pasienten.
Dosen kan være mellom 10 \ ig og 1 mg daglig for en gjennomsnittlig kroppsvekt på 75 kg og den foretrukne daglige dosen er mellom 20 \ ig og 200 \ ig.
Den farmasøytiske blandingen for parenteral administrering kan fremstilles i en injiserbar form omfattende det aktive prinsippet og en egnet bærer. Bærere for den parenterale administreringen er velkjent på området og omfatter, f.eks. vann, saltholdig løsning, Ringer-løsning og/eller dekstrose. Bæreren kan inneholde små mengder av tilsetninger for å opprettholde stabiliteten og isotonisiteten av den farmasøytiske fremstillingen. Fremstillingen av løsningene kan utføres i henhold til de ordinære modalitetene.
Oppsummert vedrører foreliggende oppfinnelse dermed en fremgangsmåte for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid, der fremgangsmåten innbefatter trinnene: reagere et polypeptid med en lav molekylvektsheterobifunksjonell eller homobifunksjonell PEG-andel der den lave molekylvekt PEG-andelen har en molekylvekt i området på 100-5000 dalton, som har den følgende formelen:
W-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH2-X,
hvor W og X er grupper som uavhengig reagerer med et amin, sulfhydryl, karboksyl eller hydroksylfunksjonell gruppe for å feste den lave molekylvekt PEG-andelen til polypeptidet; og
reagere den lave molekylvekt PEG-andelen festet til polypeptidet med en monofunksjonell eller bifunksjonell PEG-andel for å feste den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen til den fri ende av den lave molekylvekt PEG-andelen og danne et PEG-polypeptid-konjugat.
Den foreliggende oppfinnelsen er blitt beskrevet under henvisning til de spesifikke utførelsesformene, men innholdet i beskrivelsen omfatter alle modifiseringer og substitusjoner som kan gjøres av en fagmann på området uten å gå utover meningen og hensikten med det som er angitt i kravene.
Oppfinnelsen vil nå beskrives ved hjelp av følgende eksempler, som ikke skal anses for å være begrensende på noen som helst måte.
EKSEMPEL 1: Fremstilling av PEG- IFN- B- koniugat
Modifisering av IFN- p med mPEGsw- OPSS
Rekombinant human IFN-p, stabil ved en konsentrasjon på 0,37 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 3,6, ble anvendt for fremstillingen av et PEG-IFN-p-konjugat. Omtrent 1,0 ml 6 M urea ble tilsatt 2 ml av IFN-p ved en konsentrasjon på 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 x 10"<8>mol). mPEG5k-OPSS ble tilsatt i molart overskudd av 50 mol til 1 mol av IFN-p og de to ble reagert i en polypropylenampulle for enten 2 timer ved 37 °C eller 1 time ved 50 °C. Reaksjonsblandingen ble analysert med kapillær elektroforese (CE) kurve for å bestemme graden av PEG- IFN-B-konjugatdannelse ved PEGyleringsreaksjonen før noen rensing (fig. 1). Et typisk utbytte for denne reaksjonen er 50 % PEG-IFN-p. Reaksjonsproduktene ble filtrert fra reaksjonsblandingen med et 0,22 mm sprøytefilter og den filtrerte løsningen ble så ført oppå en størrelseseksklusjonskolonne (enten Superose 12 eller Superdex 75, Pharmacia) og vasket ut med 50 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Fig. 2A viser elusjonsprofilen fra rensingen av PEG-IFN-p-konjugatet og en Superose 12 størrelseseksklusjonskromatografikolonne. Toppene ble samlet og analysert med SDS-PAGE (fig. 3). Fraksjonene inneholdende PEG-IFN-p-konjugatet ble slått sammen og konsentrat ble så på nytt ført til den samme størrelseseksklusjonskolonnen for ytterligere å rense PEG-IFN-p-konjugatet på grunn av nærheten av "den native" IFN-p-toppen (fig. 2B). Denne prosedyren ble gjentatt (tredje gjennomløp) for å forsikre seg om renhet (fig. 2C). Fig. 4 og fig. 5 viser den kapillære elektroforesekurven og MALDI MS-spektrumet, henholdsvis, for det rensede PEG-IFN-p-konjugatet.
Modifisering av IFN- p med mPEG^w- OPSS
Rekombinant human IFN-p ble tilveiebrakt i løsning ved 0,36 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 3,6. Omtrent 36 mg mPEG30k-OPSS i 3 ml avionisert H2O ble tilsatt 3 ml IFN-p ved 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4.9 x 10"<8>mol) og de to ble reagert i en polypropylenampulle i 2 timer ved 50 °C. Reaksjonsblandingen ble analysert med kapillær elektroforese for modifisering. Typiske utbytter for denne reaksjonen er < 30 %. Løsningen ble så ført oppå en størrelseseksklusjonskolonne (Superose 12, Pharmacia) og vasket ut med 50 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Toppene ble samlet og analysert med SDS-PAGE med hensyn på deres innhold.
EKSEMPEL 2: Biologisk aktivitet av PEG- IFN- B- koniugatet
For å fastslå effektene av PEGylering på anti-virusaktiviteten av human rekombinant IFN-p, ble humane WISH amniotiske celler preinkubert med enten nylig fremstilt IFN-p (samme mengde som anvendt for PEGylering) eller PEG-IFN-p-konjugat. Den IFN-p formidlede anti-virusaktiviteten, som målt ved WISH-VSV cytopatisitetsassay, ble bestemt ifølge et anti-virus WISH bioforsøk utviklet basert på protokollen til Novick et al., J- Immunol., 129:2244-2247 (1982). De anvendte materialene i dette WISH-assayet er som følger:
WISH-celler (ATCC CCL 25)
Vesikulære Stomatitisvirus-beholdninger (ATCC C-520-001-522), lagret ved -70 °C
IFN-p-human rekombinant, InterPharm Laboratories LTD (32, 075-type, Batch # 205035), 82 x IO<6>IU/ml, spesifikk aktivitet: 222 x IO<6>IU/mg PET-IFN-p-konjugat som fremtilt i eksempel 1 og opprettholdt i PBS, pH 7,4
WISH vekstmedium (MEM høy glukose med Earls salter + 10 % FBS + 1,0 % L-glutamin + penicillin/streptomycin (100 U/ml, 100 fig/ml)
WISH-assaymedium (MEM høy glukose med Earls salter + 5 % FBS + 1,0 % L-glutamin + penicillin/streptomycin (100 U/ml, 100 ug/ml)
MTT ved 5 mg/ml i PBS, lagret ved -70 °C. Protokollen for WISH-assayet er som følger:
- Fortynn IFN-p-prøvene til 2X startkonsentrasjonen i WISH-assaymediumet.
- Lag trippelfortynnede løsninger av IFN-p-prøver i WISH-assaymedium i flatbunnet 96-brønnplate slik at hver brønn inneholder 50 ^il av fortynnet IFN-p-prøve (noen kontrollbrønner mottar 50 jil av bare WISH-assaymedium). - Høst loggvekstfase WISH-celler med trypsin/EDTA-løsning, vask i WISH-assaymedium, og bring det til en sluttkonsentrasjon på 0,8 x IO6 celler/ml. - Tilsett 50 |xl av WISH-cellesuspensjon (4 x IO4 celler pr. brønn) til hver brønn. Sluttkonsentrasjon av IFN-p eksponert for cellene er nå IX. - Etter inkubering i 24 timer i en 5 % C02-humidifisert inkubator, tilsettes 50 fil av en 1:10 fortynning (i WISH-assaymedium) av VSV-beholdning (en dose forhånds-bestemt til «lyse» 100 % av WISH-celler i løpet av 48 timer) til alle brønner unntatt for ikke-viruskontrollbrønnene (disse mottar samme volum av bare assaymedium). - Etter ytterligere 48 timer tilsettes 25 fil av MTT-løsning til alle brønner, hvoretter plater inkuberes i ytterligere 2 timer i en inkubator. - Innholdene av brønnene fjernes ved plateinversjon, og 200^il av 100 % etanol tilsettes brønnene. - Etter 1 time avleses platene ved 595 nm ved anvendelse av Soft max Pro programpakke og Spectramax spektrofotometersystem (Molecular Devices).
Som vist i fig. 6 og tabell 1 holdt PEG-IFN-p-konjugatet et nivå av anti-virus aktivitet som er overlegen det for den nylig fremstilte parentale mengden av IFN-p. Observasjonen at PEG-IFN-p-konjugatet har omtrent fire ganger høyere bioaktivitet enn det for nylig fremstilt IFN-p kan også være en konsekvens av den økte stabiliteten av PEG-IFN-p-konjugatet med hensyn på det "native" IFN-p etter tilsetting av WISH-celleassaymedium.
EKSEMPEL 3: In vitro forsøk av den relative aktiviteten av PEG- IFN- prøver Relativ bioaktivitet av PEG[30 kD]-IFN-p og PEG[2 x 20 kD]-IFN-p ble bestemt ved WISH-forsøk ved anvendelse av standardprotokollen beskrevet i eksempel 2 (tabell 2). Tre uavhengige forsøk ble utført av tre forskjellige personer ved forskjellige tider.
Bindingen av PEG-IFN-p til dens reseptor på celler ble evaluert i nærværet av en bestemt mengde av12<5>I-IFN-a2a. IFN-a2a ble radiomerket med<125>I ved anvendelse av kloramin-T-metoden.<I25>I-bundet-IFNa2a ble fjernet fra fritt iod ved å føre reaktantene gjennom en Sephadex G25 kolonne og sammenslåing av de proteininneholdende fraksjonene (Pharmacia).<I25>I-IFN-a2a ble kvantifisert ved et IFN-a2a ELISA-forsøk (Biosource, USA) og den spesifikke aktiviteten ble bestemt. Daudi-celler dyrket i den eksponentielle vekstfasen ble høstet og 2 x IO6 celler ble inkubert med 0,5 nM<I25>I-IFN-a2a i 3 timer ved romtemperatur i nærværet av forskjellige konsentrasjoner av PEG-IFN-p eller IFN-a2a fortynnet i en forsøksbuffer som er RPMI 1640 inneholdende 2 % fosterbovinserum og 0,1 % natriumazid. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene spunnet gjennom et lag av ftalatolje og den cellebundne radioaktiviteten ble talt på gamma-telleren. Videre var bindingen av PEG[30 kD]-IFN-p og PEG[2 x 20 kD]-IFN-p til reseptoren svært lik eller nær bindingsaktiviteten av IFN-p som vist i fig. 7.
I tillegg ble relativ aktivitet bestemt i en Daudi-celle (human B cellelymfoma) anti-proliferasjonsforsøk (tabell 3). Alle IFNer ble laget ved en 2x konsentrasjon av 200 ng/ml. Prøver ble trippelfortynnet ned platens lengde ved et sluttvolum på 100 1 x 10<5>celler/brønn (100fils) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i totalt 72 timer ved 37 °C i C02-humidifisert inkubator. Etter 48 timer ble tritiatisert (<3>H) tymidin tilsatt ved 1 nCi/brønn i 20 Ved slutten av 72 timers inkubering ble platen høstet med Tomtek Plate Harvester. Resultatene vist i tabell 3 viser at ikke noe detekterbart tap av IFN-aktivitet ble observert fra PEGylering. Faktisk ble aktiviteten funnet å være noe høyere enn fri IFN-p. Dette kan skyldes dannelsen av inaktive aggregater i det fri IFN eller til forskjellene i kvantiseringsmetoder (aminosyreanalyse for PEG-IFN-prøver og RP-HPLC for IFN-p).
EKSEMPEL 4: Farmakokinetikkstudier i mus
Intravenøs administrering
Mus ble injisert med 100 ng av IFN-p, PEG[30 kD]-IFN-p eller PEG[2 X 20 kD]-IFN-p og blod ble fjernet ved angitte tider deretter. Serumkonsentrasjoner av IFN-p ble bestemt ved IFN-p-spesifikk ELIAS (Toray Industries) og resultatene er vist i fig. 8. 28 hunndyr B6D2F1 stammemus (6-8 uker) (omtrent 20 g hver) ble separert i fire grupper som følger: gruppe 1 inneholdt ni mus injisert med en 200^il enkel pille på 500 ng/ml human IFN-p (sluttdose på 100 ng/mus); gruppe 2 (ni mus) mottok 200 \ il av en ekvivalent masse av PEG30kD-IFN-p; gruppe 3 mottok 200^il av en ekvivalent masse av PEG (2 x 20 kD)-IFN-p; og gruppe 4 er en gruppe av tre uinjiserte mus som fungerer som en negativ kontroll. Blodprøver (omtrent 200^il/prøve) ble oppsamlet ved ni angitte tider ved avbrytelse av den retro-orbitale venøse pleksus med et kapillært rør. Blodprøver ble satt til å klumpe i 1 time ved romtemperatur, kantet og mikrosentrifugert. Sera fjernet derfra ble lagret ved -70 °C inntil alle prøver var oppsamlet. Sera ble undersøkt for nærværet av bioaktiv human IFN-p ved anvendelse av Toray-inspeksjonen. Resultatene indikerte at området under kurven (AUC) er økt i betydelig grad i PEG-IFN-prøvene i forhold til fri IFN- B og at PEG-IFN-prøvene i forhold til fri IFN-p og at PEG[2 x 20 kD]-IFN-p er mye bedre enn PEG[30 kD]-IFN-p.
Subkutan administrering
Mus ble injisert subkutant med IFN-p og PEG-IFN (100 ng/mus). Fig. 9 viser at det totale området under kurven (AUC) økes dramatisk for PEG-IFN-prøvene sammenlignet med fri IFN-p. De farmakokinetiske studiene er sammenfallende med PEG-IFN-prøvene som har en lengre halveringstid og økt AUC.
EKSEMPEL 5: Festing av lavmolekylvekt PEG- andel til polypeptid
Merking av interferon-beta med OPSS-PEG2k-hydrazid
Rekombinant human interferon-p ble ført i løsning ved 0,33 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer (pH 3,8). Omtrent 3,6 mg (40 mol overskudd til mol protein) av den heterobifunksjonelle PEG-reagensen, OPSS-PEG2k-hydrazid, i 2 ml avionisert vann ble tilsatt til 3 ml av IFN-p med 0,33 mg/ml (0,99 mg) og de to ble reagert i en polypropylenampulle i 1 time ved 45 °C. Reaksjonsblandingen ble deretter analysert med kapillær elektroforese for å bestemme modifiseringsgraden. Typiske utbytter var i området på 90-97 % som var avhengig av renheten av interferon-p og PEG-reagensen. Løsningen ble deretter ført oppå en størrelseseksklusjonskolonne (Superdex 75, Pharmacia) og vasket ut med 5 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Toppene ble samlet opp og analysert med SDS-PAGE. De monoPEGylerte interferon-p-fraksjonene ble slått sammen og deretter anvendt i et ytterligere modifiseringstrinn med høymolekylvekt PEG.
Merking av interferon- p med ( OPSS) 2- PEG34oo
Rekombinant human interferon-p ble ført i løsning ved 0,33 mg/ml i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 3,8. Omtrent 6,1 mg (40 mol overskudd til mol protein) av den homobifunksjonelle PEG-reagensen, (OPSS)2-PEG34oo, i 2 ml avionisert vann ble tilsatt 3 ml av interferon-p ved 0,33 mg/ml (0,99 mg) og de to ble reagert i en polypropylenampulle i 2 timer ved 50 °C. Reaksjonen ble styrt med ikke-reduserende SDS-PAGE og sluttreaksjonsblandingen ble analysert med kapillær elektroforese for å bestemme graden av modifisering. Typiske modifiseringer for denne reaksjonen med interferon-p var > 95 %. Løsningen ble så ført oppå en størrelseseksklusjonsblander (Superdex 75, Pharmacia) og vasket ut med 50 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0 buffer. Toppene ble oppsamlet og analysert med SDS-PAGE med hensyn på deres innhold. De monoPEGylerte interferon-p-fraksjonene ble kombinert.
EKSEMPEL 6: Festing av andre PEG- andel til lavmolekylvekt PEGylerings-polypeptid
Modifisering av IFN- S- S- PEGgk- hydrazid med mPEG^ ow- aldehyd ( ALP)
Til de kombinerte fraksjonene av IFN-S-S-PEG2k-hydrazid i eksempel 5 ble tilsatt mPEG30k-ALD i et 20 mol overskudd til protein. Reaksjonen ble utført ved romtemperatur (25 °C) i 4 timer og en prøve ble tilsatt til en størrelseseksklusjons-kolonne (Superose 6, Pharmacia) for å bestemme modifiseringsutbyttet. Modifiseringsutbyttet for denne reaksjonen var typisk > 80 % avhengig av renheten til PEG-reagensen og reaksjonsbetingelsene.
Ved at man nå fullstendig har beskrevet oppfinnelsen vil det nå erkjennes at for fagfolk på området kan det samme utføres innenfor et stort område av ekvivalente parametre, konsentrasjoner, og betingelser uten at å avvike fra rammen av oppfinnelsen og uten upassende eksperimentering.
Mens denne oppfinnelsen er blitt beskrevet i forbindelse med spesifikke utførelser derav, skal det forstås at den kan ytterligere modifiseres. Denne fremstillingen er ment å dekke enhver variasjon, anvendelse, eller tilpasning av oppfinnelsen etterfølgende, generelt, prinsippene for oppfinnelsen og omfattende slike avvik fra den foreliggende fremstillingen som er kjent innenfor vanlig praksis innen området som gjelder for oppfinnelsen og som kan gjelde for vesentlige trekk som her er fremsatt i patentkravene.
Alle referanser som her er angitt, omfattende journalartikler eller sammendrag, publisert eller upublisert US eller utenlandske patentsøknader, meddelte US eller utenlandske patenter, eller enhver annen referanse, er fullstendig innarbeidet ved referanse her, omfattende alle data, tabeller, figurer, og tekst presentert i de anførte referansene. Videre er alt innholdet av de anførte referansene innenfor referansene anført her også fullstendig innarbeidet ved referanse.
Referanse til kjente metodetrinn, konvensjonelle metodetrinn, kjente metoder eller konvensjonelle metoder er ikke på noen som helst måte en innrømmelse av at noe aspekt, beskrivelse eller utførelse av den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet, undervist eller foreslått i den relevante teknikken.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid,
karakterisert vedat den innbefatter trinnene: reagere et polypeptid med en lav molekylvektsheterobifunksjonell eller homobifunksjonell PEG-andel der den lave molekylvekt PEG-andelen har en molekylvekt i området på 100-5000 dalton, som har den følgende formelen: W-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH2-X,
hvor W og X er grupper som uavhengig reagerer med et amin, sulfhydryl, karboksyl eller hydroksylfunksjonell gruppe for å feste den lave molekylvekt PEG-andelen til polypeptidet; og
reagere den lave molekylvekt PEG-andelen festet til polypeptidet med en monofunksjonell eller bifunksjonell PEG-andel for å feste den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen til den fri ende av den lave molekylvekt PEG-andelen og danne et PEG-polypeptid-konjugat.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,
karakterisert vedat den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen har den følgende formelen: Y-CH2CH20(CH2CH20)mCH2CH2-Z,
hvor Y er reaktiv til en terminal gruppe på den fri enden av den lave molekylvekt PEG-andelen festet til polypeptidet og Z er -OCH3eller en gruppe reaktiv med X for å danne et bifunksjonelt konjugat.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2,
karakterisert vedat den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen er metoksy PEG, forgrenet PEG, hydrolytisk eller enzymatisk degraderbar PEG, pendant PEG eller dendrimer PEG.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,
karakterisert vedat W og X er uavhengig valgt fra gruppen bestående av ortopyridyldisulfid, maleimider, vinylsulfoner, iodacetamider, hydrazider, aldehyder, succinimidylestere, epoksider, aminer, tioler, karboksyler, aktive estere, benzotriazolkarbonater, p-nitrofenolkarbonater, isocyanater og biotin.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,
karakterisert vedat den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen har en molekylvekt i området på 100 dalton til 200 kilodalton.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,
karakterisert vedat den lave molekylvekt PEG-andelen og/eller den monofunksjonelle eller bifunksjonelle PEG-andelen er en kopolymer av polyetylenglykol.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6,
karakterisert vedat kopolymeren av polyetylenglykol er valgt fra gruppen bestående av polyetylenglykol/polypropylenglykol-kopolymerer og polyetylenglykol/poly(melkesyre/glykolsyre)-kopolymerer.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,
karakterisert vedat den ytterligere omfatter trinnet for rensing av PEG-polypeptidkonjugatet etterfølgende den trinnvise festingen av to PEG-andeler i serie til et polypeptid.
9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8,
karakterisert vedat trinnet for rensing omfatter én eller flere renseteknikker valgt fra gruppen bestående av ioneutbyttekromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi, affinitetskromatografi og reversibel fasekromatografi.
10. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 1 -9,karakterisert vedat polypeptidet er interferon-p.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8333998P | 1998-04-28 | 1998-04-28 | |
| PCT/US1999/009161 WO1999055377A2 (en) | 1998-04-28 | 1999-04-28 | Polyol-ifn-beta conjugates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20100324L NO20100324L (no) | 2000-12-28 |
| NO332224B1 true NO332224B1 (no) | 2012-07-30 |
Family
ID=22177687
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20005337A NO329749B1 (no) | 1998-04-28 | 2000-10-23 | Polyol-interferon-ß-konjugat, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk blanding derav og anvendelse derav for fremstilling av medikamenter. |
| NO20100324A NO332224B1 (no) | 1998-04-28 | 2010-03-09 | Fremgangsmate for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20005337A NO329749B1 (no) | 1998-04-28 | 2000-10-23 | Polyol-interferon-ß-konjugat, fremgangsmate for fremstilling derav, farmasoytisk blanding derav og anvendelse derav for fremstilling av medikamenter. |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6638500B1 (no) |
| EP (2) | EP1421956B1 (no) |
| JP (2) | JP4574007B2 (no) |
| KR (1) | KR100622796B1 (no) |
| CN (2) | CN1187094C (no) |
| AR (1) | AR020070A1 (no) |
| AT (2) | ATE365563T1 (no) |
| AU (1) | AU762621B2 (no) |
| BG (2) | BG65046B1 (no) |
| BR (1) | BR9910023A (no) |
| CA (2) | CA2330451A1 (no) |
| CY (1) | CY1108022T1 (no) |
| CZ (2) | CZ298579B6 (no) |
| DE (2) | DE69920002T2 (no) |
| DK (2) | DK1075281T3 (no) |
| EA (2) | EA200300382A1 (no) |
| EE (1) | EE05214B1 (no) |
| ES (2) | ES2285286T3 (no) |
| HK (2) | HK1038194A1 (no) |
| HU (1) | HUP0300548A3 (no) |
| IL (1) | IL139286A (no) |
| NO (2) | NO329749B1 (no) |
| NZ (1) | NZ507456A (no) |
| PL (2) | PL193352B1 (no) |
| PT (2) | PT1421956E (no) |
| SI (2) | SI1421956T1 (no) |
| SK (2) | SK286217B6 (no) |
| TR (2) | TR200003161T2 (no) |
| TW (2) | TWI266800B (no) |
| UA (2) | UA66857C2 (no) |
| WO (1) | WO1999055377A2 (no) |
Families Citing this family (78)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| IL121860A0 (en) | 1997-08-14 | 1998-02-22 | Yeda Res & Dev | Interleukin-18 binding proteins their preparation and use |
| US7704944B2 (en) | 1997-08-14 | 2010-04-27 | Yeda Research And Development Company Ltd. | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis |
| US7220717B2 (en) | 1997-08-14 | 2007-05-22 | Yeda Research And Development Company Ltd. | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use |
| ES2265693T3 (es) * | 1998-10-16 | 2007-02-16 | Biogen Idec Ma Inc. | Proteinas de fusion con interferon-beta y usos. |
| ES2630278T3 (es) * | 1998-10-16 | 2017-08-21 | Biogen Ma Inc. | Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos |
| US7303760B2 (en) * | 1999-04-23 | 2007-12-04 | Alza Corporation | Method for treating multi-drug resistant tumors |
| US7238368B2 (en) * | 1999-04-23 | 2007-07-03 | Alza Corporation | Releasable linkage and compositions containing same |
| CN1244376C (zh) * | 1999-04-23 | 2006-03-08 | 阿尔萨公司 | 可释放的键和含有该键的组合物 |
| US7431921B2 (en) | 2000-04-14 | 2008-10-07 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules |
| US6531122B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
| US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
| TR200101086A3 (no) * | 1999-10-15 | 2001-08-21 | ||
| JP4593048B2 (ja) | 1999-12-24 | 2010-12-08 | 協和発酵キリン株式会社 | 分岐型ポリアルキレングリコール類 |
| ES2327606T3 (es) | 2000-01-10 | 2009-11-02 | Maxygen Holdings Ltd | Conjugados de g-csf. |
| DE60138364D1 (de) | 2000-02-11 | 2009-05-28 | Bayer Healthcare Llc | Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate |
| CA2436623C (en) | 2001-01-30 | 2011-08-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Branched polyalkylene glycols |
| EP1234583A1 (en) | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| YU48703A (sh) | 2001-02-27 | 2006-05-25 | Maxygen Aps | Novi interferonu beta-slični molekuli |
| NZ530545A (en) | 2001-07-11 | 2006-10-27 | Maxygen Holdings Ltd | Specific conjugates comprising a polypeptide exhibiting G-CSF activity and a non-polypeptide moiety |
| EA009783B1 (ru) | 2002-01-18 | 2008-04-28 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения |
| TWI334785B (en) | 2002-06-03 | 2010-12-21 | Serono Lab | Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race |
| AU2003254641A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-19 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
| US8129330B2 (en) * | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
| PL219741B1 (pl) | 2002-12-26 | 2015-07-31 | Mountain View Pharmaceuticals | Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanie |
| TWI364295B (en) | 2002-12-26 | 2012-05-21 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
| AU2004221761B2 (en) | 2003-03-20 | 2010-01-07 | Bayer Healthcare Llc | FVII or FVIIa variants |
| TWI272948B (en) | 2003-05-01 | 2007-02-11 | Ares Trading Sa | HSA-free stabilized interferon liquid formulations |
| GB0316294D0 (en) | 2003-07-11 | 2003-08-13 | Polytherics Ltd | Conjugated biological molecules and their preparation |
| EP2641611A3 (en) | 2003-10-17 | 2013-12-18 | Novo Nordisk A/S | Combination therapy |
| AU2008201682B2 (en) * | 2004-02-02 | 2011-02-24 | Ambrx, Inc. | Modified human interferon polypeptides and their uses |
| AU2005319099B2 (en) | 2004-02-02 | 2010-09-16 | Ambrx, Inc. | Modified human growth hormone |
| AU2005211362B2 (en) | 2004-02-02 | 2008-03-13 | Ambrx, Inc. | Modified human interferon polypeptides and their uses |
| EP1586334A1 (en) * | 2004-04-15 | 2005-10-19 | TRASTEC scpa | G-CSF conjugates with peg |
| JP2007538048A (ja) | 2004-05-17 | 2007-12-27 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | ヒドロゲル・インターフェロン製剤 |
| WO2005117948A1 (en) | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Ares Trading S.A. | Method of stabilizing proteins |
| US7731948B2 (en) | 2004-06-01 | 2010-06-08 | Ares Trading S.A. | Stabilized interferon liquid formulations |
| TW200633718A (en) * | 2004-12-16 | 2006-10-01 | Applied Research Systems | Treatment of hepatitis c in the asian population |
| US7851565B2 (en) | 2004-12-21 | 2010-12-14 | Nektar Therapeutics | Stabilized polymeric thiol reagents |
| EP1836316A4 (en) | 2004-12-22 | 2009-07-22 | Ambrx Inc | PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE |
| NZ555386A (en) | 2004-12-22 | 2011-01-28 | Ambrx Inc | Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid |
| JP5335422B2 (ja) | 2005-06-17 | 2013-11-06 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化 |
| JP2009503111A (ja) * | 2005-08-04 | 2009-01-29 | ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション | Ｇ−ｃｓｆ部分および重合体の複合体 |
| LT1917276T (lt) | 2005-08-26 | 2018-05-25 | Ares Trading S.A. | Glikozilinto interferono beta gavimo būdas |
| JP2009507003A (ja) | 2005-09-01 | 2009-02-19 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | 視神経炎の治療 |
| US20070238656A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-11 | Eastman Kodak Company | Functionalized poly(ethylene glycol) |
| US20080096819A1 (en) * | 2006-05-02 | 2008-04-24 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| EP2395099A3 (en) * | 2006-05-02 | 2012-05-16 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| MX2008014971A (es) | 2006-05-24 | 2008-12-05 | Serono Lab | Regimen de cladribine para tratar esclerosis multiple. |
| EP2213733A3 (en) | 2006-05-24 | 2010-12-29 | Novo Nordisk Health Care AG | Factor IX analogues having prolonged in vivo half life |
| WO2008137471A2 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| CA2707840A1 (en) * | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Allozyne, Inc. | Amino acid substituted molecules |
| KR20100099298A (ko) | 2007-12-20 | 2010-09-10 | 메르크 세로노 에스. 에이. | Ｐｅｇ인터페론베타 제형 |
| SG188143A1 (en) | 2008-02-08 | 2013-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| CN101525381B (zh) * | 2008-03-04 | 2012-04-18 | 北京百川飞虹生物科技有限公司 | 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达 |
| WO2009155102A2 (en) * | 2008-05-30 | 2009-12-23 | Barofold, Inc. | Method for derivatization of proteins using hydrostatic pressure |
| US20110124614A1 (en) * | 2008-10-25 | 2011-05-26 | Halina Offner | Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders |
| DE102009032179A1 (de) * | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Biogenerix Ag | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
| ES2365343B1 (es) | 2009-11-19 | 2012-07-10 | Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii | Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial. |
| WO2011101242A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Novo Nordisk A/S | Factor viii molecules with reduced vwf binding |
| AR080993A1 (es) | 2010-04-02 | 2012-05-30 | Hanmi Holdings Co Ltd | Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina |
| WO2011143274A1 (en) | 2010-05-10 | 2011-11-17 | Perseid Therapeutics | Polypeptide inhibitors of vla4 |
| EP2593130A2 (en) | 2010-07-15 | 2013-05-22 | Novo Nordisk A/S | Stabilized factor viii variants |
| EP3466968A1 (en) | 2010-09-15 | 2019-04-10 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Factor viii variants having a decreased cellular uptake |
| JP2014506889A (ja) * | 2011-02-18 | 2014-03-20 | ステムディーアール インク． | Ｓｉｒｔ１発現誘導物質を含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用組成物 |
| CA2840552A1 (en) | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Relaxin fusion polypeptides and uses thereof |
| SG10201602076QA (en) * | 2011-10-01 | 2016-04-28 | Glytech Inc | Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same |
| WO2013130684A1 (en) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | Amunix Operating Inc. | Xten-folate conjugate compositions and methods of making same |
| CN104136038A (zh) | 2012-02-29 | 2014-11-05 | 东丽株式会社 | 体腔积液抑制剂 |
| CN104334574B (zh) | 2013-03-29 | 2020-01-14 | 株式会社糖锁工学研究所 | 附加唾液酸化糖链的多肽 |
| US11759500B2 (en) | 2014-07-24 | 2023-09-19 | Abion Inc. | PEGylated interferon-beta variant |
| WO2016013697A1 (ko) * | 2014-07-24 | 2016-01-28 | 에이비온 주식회사 | 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체 |
| MX2017002140A (es) | 2014-08-19 | 2017-08-21 | Biogen Ma Inc | Metodo de pegilacion. |
| EP4014985A1 (en) | 2015-05-01 | 2022-06-22 | Allysta Pharmaceuticals, Inc. | Adiponectin peptidomimetics for treating ocular disorders |
| MD3310816T2 (ro) * | 2015-06-19 | 2021-01-31 | Eisai R&D Man Co Ltd | Imunoglobuline conjugate Cys80 |
| JP7146897B2 (ja) * | 2017-04-17 | 2022-10-04 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト | ホモシスチン尿症の治療のための酵素補充療法の最適化 |
| WO2020158690A1 (ja) | 2019-01-28 | 2020-08-06 | 東レ株式会社 | 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体 |
| WO2020158691A1 (ja) | 2019-01-28 | 2020-08-06 | 東レ株式会社 | 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| JP2524586B2 (ja) * | 1985-06-26 | 1996-08-14 | シタス コーポレイション | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
| US5206344A (en) * | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
| US5208344A (en) * | 1987-07-31 | 1993-05-04 | American Home Products Corporation | Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents |
| US5166322A (en) * | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
| US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| US5382657A (en) | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| PT730470E (pt) | 1993-11-10 | 2002-08-30 | Enzon Inc | Conjugados melhorados de interferao-polimero |
| US5766581A (en) | 1994-03-31 | 1998-06-16 | Amgen Inc. | Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation |
| AU696387B2 (en) * | 1994-05-18 | 1998-09-10 | Inhale Therapeutic Systems, Inc. | Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| SE9503380D0 (sv) * | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
| TW517067B (en) * | 1996-05-31 | 2003-01-11 | Hoffmann La Roche | Interferon conjugates |
| US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
| KR0176625B1 (ko) | 1996-11-05 | 1999-04-01 | 삼성전자주식회사 | 적외선 물체검출장치 |
| ATE200030T1 (de) * | 1997-01-29 | 2001-04-15 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Pegylationsverfahren |
| NZ502375A (en) * | 1997-07-14 | 2001-11-30 | Bolder Biotechnology Inc | The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family |
| US6307024B1 (en) * | 1999-03-09 | 2001-10-23 | Zymogenetics, Inc. | Cytokine zalpha11 Ligand |
| US6531122B1 (en) * | 1999-08-27 | 2003-03-11 | Maxygen Aps | Interferon-β variants and conjugates |
-
1999
- 1999-04-28 CA CA002330451A patent/CA2330451A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-28 DK DK99920094T patent/DK1075281T3/da active
- 1999-04-28 ES ES04003053T patent/ES2285286T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 EE EEP200000614A patent/EE05214B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 AT AT04003053T patent/ATE365563T1/de active
- 1999-04-28 AT AT99920094T patent/ATE275422T1/de active
- 1999-04-28 DE DE69920002T patent/DE69920002T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 TR TR2000/03161T patent/TR200003161T2/xx unknown
- 1999-04-28 HU HU0300548A patent/HUP0300548A3/hu unknown
- 1999-04-28 CN CNB998054968A patent/CN1187094C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-28 UA UA2000116719A patent/UA66857C2/uk unknown
- 1999-04-28 UA UA20031212655A patent/UA79430C2/uk unknown
- 1999-04-28 EA EA200300382A patent/EA200300382A1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 PT PT04003053T patent/PT1421956E/pt unknown
- 1999-04-28 SK SK1622-2000A patent/SK286217B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 IL IL13928699A patent/IL139286A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 EP EP04003053A patent/EP1421956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 PT PT99920094T patent/PT1075281E/pt unknown
- 1999-04-28 CN CNB2004100898478A patent/CN100335503C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-28 CZ CZ20003995A patent/CZ298579B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 WO PCT/US1999/009161 patent/WO1999055377A2/en active IP Right Grant
- 1999-04-28 AU AU37674/99A patent/AU762621B2/en not_active Ceased
- 1999-04-28 PL PL344490A patent/PL193352B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 SI SI9930974T patent/SI1421956T1/sl unknown
- 1999-04-28 CA CA002565375A patent/CA2565375A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-28 CZ CZ20050048A patent/CZ298597B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 KR KR1020007011587A patent/KR100622796B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 DK DK04003053T patent/DK1421956T3/da active
- 1999-04-28 SI SI9930662T patent/SI1075281T1/xx unknown
- 1999-04-28 PL PL378728A patent/PL196533B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 BR BR9910023-1A patent/BR9910023A/pt active Search and Examination
- 1999-04-28 SK SK66-2007A patent/SK286654B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 NZ NZ507456A patent/NZ507456A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 EP EP99920094A patent/EP1075281B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 EA EA200001111A patent/EA003789B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-28 TR TR2001/01751T patent/TR200101751T2/xx unknown
- 1999-04-28 ES ES99920094T patent/ES2224649T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 DE DE69936409T patent/DE69936409T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-28 JP JP2000545574A patent/JP4574007B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-04-29 AR ARP990101987A patent/AR020070A1/es active IP Right Grant
- 1999-07-26 TW TW093123043A patent/TWI266800B/zh active
- 1999-07-26 TW TW088112596A patent/TWI232882B/zh active
-
2000
- 2000-10-17 BG BG109291A patent/BG65046B1/bg unknown
- 2000-10-17 BG BG104871A patent/BG64694B1/bg unknown
- 2000-10-23 NO NO20005337A patent/NO329749B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-10-30 US US09/698,133 patent/US6638500B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-12-24 HK HK01109037A patent/HK1038194A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-08-28 US US10/649,609 patent/US7357925B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-11-17 HK HK05110273A patent/HK1076115A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-02-13 US US11/674,476 patent/US7700314B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-07-19 CY CY20071100966T patent/CY1108022T1/el unknown
-
2010
- 2010-03-09 NO NO20100324A patent/NO332224B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-04-26 JP JP2010100840A patent/JP2010184929A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO332224B1 (no) | Fremgangsmate for trinnvis festing av polyetylenglykol (PEG) andeler i serie til et polypeptid | |
| US6042822A (en) | Interferon polymer conjugates | |
| EA008866B1 (ru) | ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | |
| JP5563475B2 (ja) | Ｐｅｇインターフェロン−ベータ製剤 | |
| MXPA00010223A (en) | Polyol-ifn-beta conjugates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |