SK16222000A3 - Polyol-interferón-beta konjugát, spôsob jeho výroby, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie - Google Patents

Polyol-interferón-beta konjugát, spôsob jeho výroby, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie Download PDF

Info

Publication number
SK16222000A3
SK16222000A3 SK1622-2000A SK16222000A SK16222000A3 SK 16222000 A3 SK16222000 A3 SK 16222000A3 SK 16222000 A SK16222000 A SK 16222000A SK 16222000 A3 SK16222000 A3 SK 16222000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
peg
polyol
ifn
interferon
moiety
Prior art date
Application number
SK1622-2000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK286217B6 (sk
Inventor
Tayar Nabil El
Michael J. Roberts
Milton Harris
Wayne Sawlivich
Original Assignee
Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems Ars Holding N. V. filed Critical Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Publication of SK16222000A3 publication Critical patent/SK16222000A3/sk
Publication of SK286217B6 publication Critical patent/SK286217B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka polyol-IFN-β konjugátov, v ktorých je polyolová jednotka kovalentne naviazaná na Cys17. Ďalším predmetom predloženého vynálezu je spôsob ich miestne-špecifickej produkcie, ako aj ich použitie na liečbu, profylaxiu alebo diagnostiku bakteriálnych infekcií, vírusových infekcií, autoimunitných ochorení a zápalových ochorení. Predložený vynález sa ďalej týka spôsobu postupného pripájania dvoch alebo viacerých PEG častí na polypeptid.
Predložená prihláška si uplatňuje prioritu podľa 35 U.S.C. §119(e) US provizórnej prihlášky č. 60/083339, ktorej obsah je tu ako celok zahrnutý jej citáciou.
Doterajší stav techniky
Ľudský fibroblastový interferón (IFN-β) má antivírusovú aktivitu a môže aj stimulovať prirodzené zabíjačské bunky proti neoplastickým bunkám. Je to polypeptid s hmotnosťou približne 20000 Da, indukovaný vírusmi a dvojvláknovými RNA. Z nukleotidovej sekvencie génu fibroblastového interferónu, ktorý bol klonovaný technológiou rekombinantnej DNA, Derynk a ďalší (Náture, 285: 542547, 1980) odvodili úplnú aminokyselinovú sekvenciu proteínu. Má dĺžku 166 aminokyselín.
Shepard a ďalší (Náture, 294:563-565, 1981) opísali mutáciu bázy 842 (CysTyr v polohe 141), ktorá ruší jeho anti-vírusový účinok, a variant klonu s deléciou nukleotidov 1119-1121.
Mark a ďalší (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81(18):5662-5666, 1984) zaviedli umelú mutáciu zámenou bázy 469 (T) za (A), čo spôsobilo zámenu aminokyseliny
-2Cys za Ser v polohe 17. Publikovali, že výsledný IFN-β bol rovnako účinný ako prirodzený IFN-β a bol stabilný počas dlhotrvajúceho uskladnenia (-70 °C).
Kovalentné pripojenie hydrofilného polymérného polyetylén glykolu, (PEG), ktorý je známy aj ako polyetylén oxid (PEO), na molekuly má dôležité aplikácie v biotechnológii a medicíne. V najbežnejšej forme je PEG lineárny polymér s hydroxylovými skupinami na oboch koncoch:
HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH
Tento vzorec je možné v krátkosti vyjadriť ako HO-PEG-OH, pričom -PEGznamená kostru polyméru bez koncových skupín:
-PEG- znamená: -CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-
PEG sa bežne používa ako metoxy-PEG-OH, (m-PEG), pričom na jednom konci je relatívne inertná metoxyskupina, zatiaľ čo na druhom konci je hydroxylová skupina, ktorá je predmetom chemických modifikácií.
Bežne sa používajú aj rozvetvené PEG. Rozvetvené PEG je možné vyjadriť ako R(-PEG-OH)m, kde R znamená centrálnu jadrovú časť, ako napríklad pentaerytritol alebo glycerol, a m znamená počet rozvetvujúcich ramien. Počet rozvetvujúcich ramien (m) môže byť v rozsahu od troch do sto alebo viac. Hydroxylové skupiny sú predmetom chemickej modifikácie.
Iná rozvetvená forma, ako napríklad forma opísaná v PCT prihláške vynálezu WO 96/21469, má jeden koniec, ktorý je predmetom chemickej modifikácie. Tento typ PEG je možné vyjadriť ako (CH3O-PEG-)pR-X, pričom p sa rovná 2 alebo 3, R znamená centrálne jadro, ako napríklad lyzín alebo glycerol, a X znamená funkčnú skupinu, ako napríklad karboxyl, ktorá je predmetom chemickej aktivácie. Ešte iná rozvetvená forma, príveskový PEG, má reaktívne skupiny, ako napríklad karboxyl, pozdĺž PEG kostry, a nie na konci PEG reťazcov.
-3Okrem týchto foriem PEG, je možné pripraviť aj polymér so slabými alebo degradovateľnými väzbami v kostre. Napríklad, Harris ukázal v US prihláške vynálezu č. 06/026716, že je možné pripraviť PEG s esterovými väzbami v kostre polyméru, ktoré sú predmetom hydrolýzy. Výsledkom tejto hydrolýzy je štiepenie polyméru na fragmenty s nižšou molekulovou hmotnosťou podľa nasledujúcej reakčnej schémy:
-PEG-CO2-PEG- + H2O -> -PEG-CO2H + HO-PEGV súlade s predloženým vynálezom je výraz polyetylén glykol alebo PEG mienený tak, že zahŕňa všetky vyššie opísané deriváty.
Kopolyméry etylénoxidu a propylénoxidu sú blízko príbuzné s PEG, čo sa týka ich chemických vlastností, a môžu byť použité namiesto PEG v mnohých jeho aplikáciách. Majú nasledujúci všeobecný vzorec:
HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH kde R znamená H alebo CH3.
PEG je užitočný polymér, ktorý je veľmi dobre rozpustný vo vode, ako aj v mnohých organických rozpúšťadlách. PEG je aj netoxický a neimunogénny. Keď sa PEG chemicky pripojí (PEGylácia) na vo vode nerozpustnú zlúčeninu, výsledný konjugát je vo všeobecnosti vo vode rozpustný, ako aj rozpustný v mnohých organických rozpúšťadlách.
PEG-proteínové konjugáty sa v súčasnosti používajú v terapiách nahradzujúcich protein a na iné terapeutické použitia. Napríklad, PEGylovaná adenozín deamináza (ADAGEN®) sa používa na liečbu ťažkej kombinovanej imunodeficiencie (SCIDS), PEGylovaná L-asparagináza (ONCAPSPAR®) sa používa na liečbu akútnej lymfoblastickej leukémie (ALL) a PEGylovaný interferón-α (INTRON(R) A) sa používa na liečbu hepatitídy C vo fáze III.
-4Všeobecné zhrnutie PEG-proteínových konjugátov s klinickou účinnosťou pozri v N.L. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218, 1994.
Na PEGyláciu proteínov boli vyvinuté rôzne metódy. Pripojenie PEG na reaktívne skupiny nachádzajúce sa na proteíne sa typicky uskutočňuje využitím elektrofilne aktivovaných PEG derivátov. Výsledkom pripojenia PEG na a- a εaminoskupiny nachádzajúce sa na lyzínových zvyškoch a N-koncoch je konjugát, ktorý pozostáva zo zmesi produktov.
Vo všeobecnosti takéto konjugáty pozostávajú z populácie niekoľkých PEG molekúl pripojených na jednu molekulu proteínu (PEGméry), pričom ich počet je v rozsahu od nuly po počet aminoskupín v proteíne. V molekule proteínu, ktorá bola modifikovaná len na jednom mieste, môže byť PEG jednotka pripojená na množstve rôznych amínových miest.
Výsledkom tohto typu nešpecifickej PEGylácie je množstvo konjugátov, ktoré sú takmer neaktívne. Redukcia aktivity je typicky spôsobená zakrytím aktívnej väzobnej domény proteínu, ako je to v prípade mnohých cytokínov a protilátok. Napríklad, Katre a ďalší v US patente 4766106 a US patente 4917888 opisujú PEGyláciu IFN-β a IL-2 veľkým nadbytkom metoxy-polyetylénglykol-/V-sukcinimidylgiutarátu a metoxy-polyetylénglykol-/V-sukcinimidylsukcinátu. Oba proteíny sa produkovali v mikrobiálnych hostiteľských bunkách, ktoré umožňovali miestnešpecifickú mutáciu voľného cysteínu na serín. Mutácia bola nevyhnutná na mikrobiálnu expresiu IFN-β na uľahčenie poskladania proteínu. Konkrétne, IFN-β použitý v týchto experimentoch je komerčný produkt Betaseron®, v ktorom je Cys17 zvyšok nahradený serínom. Okrem toho, absencia glykozylácie znižovala jeho rozpustnosť vo vodnom roztoku. Výsledkom nešpecifickej PEGylácie bolo zvýšenie rozpustnosti, ale veľkým problémom bolo zníženie úrovne aktivity a výťažku.
Európska prihláška vynálezu EP 593868, s názvom PEG-interferón konjugáty, opisuje prípravu PEG-IFN-α konjugátov. Avšak PEGylačná reakcia nie je miestne špecifická, a preto sa získava zmes pozičných izomérov PEG-IFN-a konjugátov (pozri aj Monkarsh a ďalší, ACS Symp. Ser., 680:207-216, 1997).
-5Kinstler a ďalší v európskej prihláške vynálezu EP 675201 demonštrovali selektívnu modifikáciu N-koncového zvyšku megakaryocytového rastového a vývinového faktora (MGDF) s mPEG-propiónaldehydom. To umožnilo reprodukovateľnú PEGyláciu a farmakokinetiky od podielu k podielu. Gilbert a ďalší v US patente 5711944 demonštrovali, že je možné vyprodukovať PEGyláciu IFN-α s optimálnou úrovňou aktivity. V tomto prípade bol potrebný pracný purifikačný krok na získanie optimálneho konjugátu.
Väčšina cytokínov, ako aj iných proteínov, okrem vyššie uvedených príkladov, nemá špecifické miesta na pripojenie PEG, a je preto veľmi pravdepodobné, že niektoré izoméry produkované PEGylačnou reakciu budú čiastočne alebo úplne neaktívne, čo spôsobí stratu aktivity konečnej zmesi.
V príprave takýchto proteínových konjugátov je preto cieľom miestne špecifická mono-PEGylácia.
Woghiren a ďalší v Bioconjugate Cem., 4(5):314-318, 1993 syntetizovali tiolselektívny PEG derivát na takúto miestne špecifickú PEGyláciu. Ukázalo sa, že stabilný tiol-chránený PEG derivát vo forme parapyridyldisulfidovej reaktívnej skupiny špecificky konjuguje s voľným cysteínom v proteíne, papaíne. Novo vytvorenú disulfidovú väzbu medzi papaínom a PEG bolo možné štiepiť v miernych redukčných podmienkach, čím sa regeneroval prirodzený protein.
Tu uvedená citácia akéhokoľvek dokumentu nie je mienená ako pripustenie, že tento dokument predstavuje relevantný predchádzajúci stav techniky alebo závažný materiál čo sa týka patentovateľnosti ktoréhokoľvek nároku predloženej prihlášky. Akékoľvek tvrdenie, čo sa týka obsahu alebo dátumu akéhokoľvek dokumentu je založené na informáciách dostupných prihlasovateľom v čase podania bez toho, aby sa skúmala ich správnosť.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu sú polyol-interferón-β konjugáty, a najmä PEG-IFN-β konjugáty, v ktorých je polyolová jednotka kovalentne naviazaná na Cys17.
-6Špecifická konjugácia sa dosahuje umožnením tiol-reaktívneho polyolového činidla reagovať s Cys17 zvyškom v IFN-β. Od takýchto konjugátov sa očakáva, že budú vykazovať zvýšenú účinnosť in vivo. Cieľom je dosiahnuť zvýšenú rozpustnosť pri neutrálnom pH, zvýšenú stabilitu (zníženie agregácie), zníženú imunogénnosť, a zachovanie aktivity s ohľadom na prirodzený IFN-β. Výsledkom takejto konjugácie by bolo zníženie počtu dávok na žiadaný účinok, zjednodušenie a stabilizácia zloženia farmaceutického prostriedku a možno aj zvýšenie dlhodobej účinnosti.
Predložený vynález ďalej poskytuje spôsob postupného pripájanie PEG častí v sériách na polypeptid.
Predložený vynález je založený na objave, že pripojenie polyolovej časti, špecifickejšie PEG časti na Cys17 zvyšok ľudského IFN-β neočakávane zvýšilo (alebo aspoň zachovávalo a neviedlo k poklesu) IFN-β biologickú aktivitu v porovnaní s aktivitou prirodzeného ľudského interferónu-β. Takže IFN-β s polyolovou časťou pripojenou na Cys17 zvyšok nie len že vykazuje rovnaký alebo zvýšený IFN-β biologický účinok, ale polyol-IFN-β konjugát má aj želateľné vlastnosti poskytované polyolovou časťou, ako napríklad zvýšenú rozpustnosť.
Tu používaný výraz IFN-β znamená ľudský fibroblastový interferón, získaný izoláciou z biologických tekutín alebo získaný DNA rekombinantnými technikami z prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek, ako aj jeho soli, funkčné deriváty, prekurzory a aktívne frakcie, s podmienkou, že obsahujú cysteínový zvyšok nachádzajúci sa v polohe 17 v prirodzene sa vyskytujúcej forme.
Polyolovou časťou v polyol-IFN-β konjugáte podľa predloženého vynálezu môže byť akýkoľvek vo vode rozpustný mono- alebo bifunkčný poly(alkylénoxid), ktorý má lineárny alebo rozvetvený reťazec. Typicky je polyolom poly(alkylénglykol), ako napríklad poly(etylénglykol) (PEG). Avšak pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že je možné vhodne použiť aj iné polyoly, ako napríklad poly(propylénglykol) a kopolyméry polyetylénglykolu a polypropylénglykolu.
Tu používaný výraz PEG časť je mienený ako, ale nie obmedzený na, lineárny alebo rozvetvený PEG, metoxy PEG, dendrimér PEG, kopolyméry PEG a
-7jedného alebo viacerých polyolov a kopolyméry PEG a PLGA (kyselina poly(mliečna/glykolová)).
Tu používaná definícia soli znamená tak soli karboxylových skupín, ako aj soli amino funkčných skupín zlúčeniny, ktoré je možné získať známymi spôsobmi. Soli karboxylových skupín zahŕňajú anorganické soli, ako napríklad sodné, draselné a vápenaté soli, a soli s organickými zásadami, ako napríklad soli vytvorené s amínom, ako trietanolamínom, arginínom alebo lyzínom. Soli aminoskupín zahŕňajú napríklad soli s anorganickými kyselinami, ako kyselinou chlorovodíkovou, a s organickými kyselinami, ako kyselinou octovou.
Tu používaná definícia funkčné deriváty znamená deriváty, ktoré je možné pripraviť z funkčných skupín nachádzajúcich sa na bočných reťazcoch aminokyselinových častí alebo na koncových N- alebo C-skupinách známymi spôsobmi, a sú zahrnuté predloženým vynálezom ak sú farmaceutický prijateľné, tzn. ak nenarušujú účinok proteínu, alebo ak nevnášajú toxicitu do farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú. Takéto deriváty zahŕňajú napríklad estery alebo alifatické amidy karboxylových skupín a N-acylové deriváty voľných aminoskupín alebo O-acylové deriváty voľných hydroxylových skupín, a sú vytvorené s acylovými skupinami, ako napríklad alkanoylovými alebo aroylovými skupinami.
Prekurzory sú zlúčeniny, ktoré sú v ľudskom alebo živočíšnom tele konvertované na IFN-β.
Aktívnymi frakciami proteínu sú podľa predloženého vynálezu akékoľvek fragmenty alebo prekurzory polypeptidového reťazca zlúčeniny, a to samotné alebo v kombinácii s príbuznými molekulami alebo zvyškami, ktoré sú na nich naviazané, napríklad zvyšky sacharidov alebo fosfátov alebo agregáty polypeptidovej molekuly, pričom takéto fragmenty alebo prekurzory vykazujú rovnakú IFN-β aktivitu ako liečivo.
Konjugáty podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravené akýmkoľvek spôsobom známym zo stavu techniky. V súlade s uskutočnením vynálezu reaguje IFN-β s PEGylačným činidlom vo vhodnom rozpúšťadle a požadovaný konjugát sa
-8izoluje a purifikuje, napríklad použitím jednej alebo viacerých chromatografických metód.
Chromatografická metóda znamená akúkoľvek techniku, ktorá sa používa na oddelenie zložiek zmesi prostredníctvom ich nanesenia na podklad (stacionárna fáza), cez ktorý preteká rozpúšťadlo (mobilná fáza). Rozdeľovacie princípy chromatografie sú založené na odlišnej fýzikálnej povahe stacionárnej a mobilnej fázy.
Niektoré konkrétne typy chromatografických metód, ktoré sú dobre známe z literatúry, zahŕňajú: kvapalnú, vysokotlakovú kvapalnú, iónovú výmennú, absorpčnú, afinitnú rozdeľovaciu, hydrofóbnu, reverznú fázovú, gélovú filtračnú, ultrafiltračnú chromatografiu, alebo chromatografiu na tenkej vrstve.
Tiol-reaktívne PEGylačné činidlo používané v predloženej prihláške znamená akýkoľvek PEG derivát, ktorý je schopný reagovať s tiolovou skupinou cysteínového zvyšku. Môže to byť napríklad PEG obsahujúci funkčnú skupinu, ako napríklad ortopyridyldisulfid, vinylsulfón, maleimid, jódacetimid a iné. Podľa výhodného uskutočnenia predloženého vynálezu je tiol-reaktívnym PEGylačným činidlom ortopyridyldisulfidový (OPSS) derivát PEG.
PEGylačné činidlo sa používa v jeho mono-metoxylovanej forme, v ktorej je len jeden koniec prístupný na konjugáciu, alebo v bifunkčnej forme, v ktorej sú na konjugáciu prístupné oba konce, ako napríklad pri vytváraní konjugátu s dvoma IFN-β kovalentne pripojenými na jednu PEG časť. Výhodne má molekulovú hmotnosť medzi 500 a 100000.
Typická reakčná schéma prípravy konjugátov podľa vynálezu je uvedená nižšie:
Proteín-SH + mPEG-S
pH<7
-— mPEG-S-S-Protei n
Proteín-S-H + mPEG-S-Η + HOCH2CH2-S-S-CH2CH2OH
-9Druhý riadok vyššie uvedenej schémy znázorňuje spôsob štiepenia väzby
PEG-proteín. mPEG-OPSS derivát je vysoko selektívny voči voľným sulfhydrylovým skupinám a rýchlo reaguje v podmienkach kyslého pH, v ktorých je IFN-β stabilný.
Vysokú selektivitu je možné demonštrovať redukciou konjugátu na prirodzenú formu
IFN-β a PEG.
Ukázalo sa, že disulfidová väzba, ktorá sa vytvára medzi proteínom a PEG časťami, je v obehu stabilná, ale môže byť redukovaná pri vstupe do bunkového prostredia. Preto sa očakáva, že tento konjugát, ktorý nevstupuje do bunky, bude v krvnom obehu stabilný, pokiaľ sa z neho nevytratí.
Treba poznamenať, že vyššie uvedená reakcia je miestne špecifická, pretože ďalšie dva Cys zvyšky nachádzajúce sa v polohách 31 a 141 v prirodzene sa vyskytujúcej forme IFN-β nereagujú s tiol-reaktívnym PEGylačným činidlom, keďže vytvárajú disulfidový mostík.
Predložený vynález sa týka aj spôsobu postupného pripájania dvoch alebo viacerých PEG častí na polypeptid. Tento spôsob je založený na zistení, že aktivovaný PEG s nízkou molekulovou hmotnosťou kompletnejšie reaguje so sféricky skrytým reakčným miestom na proteíne, ako aktivovaný PEG s vysokou molekulovou hmotnosťou. PEG-modifikácia drahých terapeutických proteínov musí byť cenovo efektívna, aby bola produkcia PEG konjugátu praktická. Okrem toho, by mal mať konjugát účinnú veľkosť rovnú veľkosti proteínu s molekulovou hmotnosťou 70 kDa, aby sa redukovala glomeruláma filtrácia, a aby sa optimalizovali farmakologické vlastnosti PEG-proteínového konjugátu. To znamená, že na miestne špecifickú modifikáciu, pri ktorej sa pripája jeden PEG, sa bude výhodne používať PEG derivát, ktorého molekulová hmotnosť je vyššia ako 20 kDa. Ak je miesto modifikácie priestorovo preplnené, môže byť ťažké pre reaktívnu skupinu na veľkej PEG časti dosiahnuť modifikačné miesto, a tak to bude viesť k nízkym výťažkom. Výhodný spôsob PEGylácie polypeptidu podľa predloženého vynálezu zvyšuje výťažok miestne špecifickej PEGylácie tým, že sa najprv pripojí malá hetero alebo homobifunkčná PEG časť, ktorá, vďaka svojej relatívne malej veľkosti, môže reagovať s priestorovo preplnenými miestami. Následne sa pripája PEG derivát s
-10veľkou molekulovou hmotnosťou na malý PEG, čo vedie k vysokému výťažku požadovaného PEGylovaného proteínu.
Spôsob postupného pripájania dvoch alebo viacerých PEG časti v sérii na polypeptid podľa predloženého vynálezu zahŕňa najprv pripojenie heterobifunkčnej alebo homobifunkčnej PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou na polypeptid, a potom pripojenie monofunkčnej alebo bifunkčnej PEG časti na voľný koniec PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá je už pripojená na polypeptid. Po postupnom pripojení dvoch alebo viacerých PEG častí v sérii na polypeptid, pričom polypeptidom je výhodne IFN-β, v ktorom Cys17 umiestnený na priestorovo preplnenom mieste je výhodným miestom na pripojenie PEG, je možné purifikovať PEG-polypeptidový konjugát použitím jednej alebo viacerých purifikačných techník, ako napríklad iónovej výmennej chromatografie, veľkostne vylučovacej chromatografie, hydrofóbnej interakčnej chromatografie, afinitnej chromatografie a reverznej fázovej chromatografie.
PEG časť s nízkou molekulovou hmotnosťou má vzorec:
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X kde W a X sú skupiny, ktoré nezávisle reagujú s amínovou, sulfhydrylovou, karboxylovou alebo hydroxylovou funkčnou skupinou, aby sa pripojila PEG časť s nízkou molekulovou hmotnosťou na polypeptid. W a X sú výhodne nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa ortopyridyldisulfid, maleimidy, vinylsulfóny, jódacetamidy, amíny, tioly, karboxylové zlúčeniny, aktívne estery, benzotriazolkarbonáty, p-nitrofenolkarbonáty, izokyanáty a biotín. PEG časť s nízkou molekulovou hmotnosťou má výhodne molekulovú hmotnosť v rozsahu približne 100 až 5000 daltonov.
Monofunkčná alebo bifunkčná PEG časť na pripojenie na voľný koniec PEG s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorý je pripojený na polypeptid, má výhodne molekulovú hmotnosť v rozsahu približne 100 daltonov až 200 kDa, a výhodne je ňou metoxy PEG, rozvetvený PEG, hydrolyticky alebo enzymaticky degradovateľný
-11 PEG, príveskový PEG alebo dendrimér PEG. Monofunkčný alebo bifunkčný PEG má vzorec:
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z kde Y reaguje s koncovou skupinou voľného konca PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá je pripojená na polypeptid, a Z je OCH3 alebo reaktívna skupina, prostredníctvom ktorej sa vytvára bifunkčný konjugát.
PEG-polypeptidový konjugát vytváraný vyššie uvedeným spôsobom na postupné pripájanie dvoch alebo viacerých PEG častí môže byť použitý na výrobu liečiva alebo farmaceutického prostriedku na liečbu ochorení alebo porúch, pri ktorých je polypeptid účinný ako aktívna zložka.
Ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť konjugáty v podstate purifikovanej forme, aby boli vhodné na použitie vo farmaceutických prostriedkoch ako účinné zložky na liečbu, diagnostiku alebo prognózu bakteriálnych a vírusových infekcii, ako aj autoimunitných, zápalových chorôb a nádorov. Takéto farmaceutické prostriedky predstavujú ďalší predmet predloženého vynálezu.
Neobmedzujúce príklady vyššie uvedených ochorení zahŕňajú: septický šok, AIDS, reumatoidnú artritídu, lupus erythematosus a sklerózu multiplex.
Ďalšie uskutočnenia a výhody vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho opisu.
Uskutočnením vynálezu je podávanie farmakologicky účinného množstva konjugátov podľa vynálezu subjektom, u ktorých je riziko vývinu jedného z vyššie uvedených ochorení, alebo subjektom, ktoré už vykazujú takéto patológie.
Použitý môže byť akýkoľvek spôsob podávania, ktorý je kompatibilný s aktívnym princípom. Výhodné je parenterálne podanie, ako subkutánne, intramuskulárne alebo intravenózna injekcia. Dávka účinnej zložky, ktorá sa má podávať závisí na lekárskom predpise, ktorý berie do úvahy vek, hmotnosť a individuálnu odpoveď pacienta.
Dávka môže byť medzi 10 pg a 1 mg na deň na priemernú telesnú hmotnosť 75 kg, a výhodne je denná dávka medzi 20 pg a 200 pg.
-12Farmaceutický prostriedok na parenterálne podanie je možné pripraviť v injektovateľnej forme, ktorá obsahuje účinnú zložku a vhodné vehikulum. Vehikuiá na parenterálne podanie sú v oblasti dobre známe a zahŕňajú napríklad vodu, fyziologický roztok, Ringerov roztok a/alebo dextrózu. Vehikulum môže obsahovať malé množstvá excipientov na udržiavanie stability a izotonicity farmaceutického prípravku. Príprava roztokov sa môže uskutočňovať v súlade s bežnými modalitami.
Predložený vynález bol opísaný s odvolaním sa na špecifické uskutočnenia, ale obsah opisu zahŕňa všetky modifikácie a substitúcie, ktoré by mohol vniesť priemerný odborník v oblasti bez toho, aby prekročil rámec významu a účelu nárokov.
Vynález bude teraz opísaný prostredníctvom nasledujúcich príkladov, ktoré by nemali byť považované za také, ktoré v akomkoľvek smere obmedzujú predložený vynález.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje graf kapilárnej elektroforézy (CE) PEG-IFN-β konjugátu pred purifikáciou.
Obrázky 2A až 2C znázorňujú purifikáciu PEG-IFN-β konjugátu uskutočňovanú veľkostnou vylučovacou chromatografiou (Superose 12): obrázok 2A - prvý prechod; obrázok 2B - druhý prechod; obrázok 2C - tretí prechod.
Obrázok 3 znázorňuje SDS-PAGE chromatografiu purifikovaného PEG-IFN-β konjugátu z tretieho prechodu chromatografie. V dráhach 1 a 4 sú štandardy molekulovej hmotnosti proteínu, v dráhe 2 je prirodzený IFN-β a v dráhe 3 je PEGIFN-β konjugát.
Obrázok 4 znázorňuje graf kapilárnej elektroforézy (CE) purifikovaného PEGIFN-β konjugátu, v ktorom je IFN-β PEGylovaný s mPEG-OPSS5k.
Na obrázku 5 je znázornené MALDI MS spektrum purifikovaného PEG-IFN-β konjugátu.
-13Obrázok 6 znázorňuje porovnanie anti-vírusovej aktivity prirodzeného IFN-β a PEG-IFN-β konjugátu. WISH bunky sa inkubovali s uvedenými koncentráciami
IFN-β vzoriek 24 hodín pred vybudením cytopatickou dávkou vezikulárneho stomatitídového vírusu. Cytopatický účinok sa stanovil po ďalších 48 hodinách prostredníctvom MTT konverzie.
Obrázok 7 znázorňuje väzobný profil IFN-β a PEG-IFN v Daudi bunkách.
Obrázok 8 znázorňuje farmokinetický profil IFN-β a PEG-IFN v myši po intravenóznom podaní. Bodkované čiary označujú test LOQ pre každú štandardnú krivku.
Obrázok 9 znázorňuje farmokinetický profil IFN-β a PEG-IFN v myši po subkutánnom podaní. Bodkované čiary označujú test LOQ pre každú štandardnú krivku.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava PEG-IFN-β konjugátu
Modifikácia IFN-β s mPEG5k-OPSS
Na prípravu PEG-IFN-β konjugátu sa použil rekombinantný ľudský IFN-β, ktorý je stabilný pri koncentrácii 0,37 mg/ml v 50mM tlmivom roztoku octanu sodného, pH 3,6. Približne 1,0 ml 6M močoviny sa pridalo ku 2 ml IFN-β v koncentrácii 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 x 10'8 mol). mPEG5k-OPSS sa pridal v molárnom nadbytku 50 molov ku jednému molu IFN-β a tieto dve zlúčeniny sa nechali reagovať v polypropylénovej skúmavke buď 2 hodiny pri 37 °C, alebo 1 hodinu pri 50 °C. Reakčná zmes sa analyzovala grafom kapilárnej elektroforézy (CE), aby sa stanovil rozsah vytvorenia PEG-IFN-β konjugátu PEGylačnou reakciou pred akoukoľvek purifikáciou (obrázok 1). Typickým výťažkom tejto reakcie je 50 % PEG-IFN-β. Reakčné produkty sa filtrovali z reakčnej zmesi s 0,22mm striekačkovým filtrom a prefiltrovaný roztok sa potom naniesol na veľkostnú vylučovaciu
- 14kolónu (buď Superose 12 alebo Superdex 75, Pharmacia) a eluoval sa tlmivým roztokom obsahujúcim 5mM fosforečnan sodný, 150mM NaCl, pH 7,0. Obrázok 2A znázorňuje elučný profil z purifikácie PEG-IFN-β konjugátu na Superose 12 veľkostnej vylučovacej chromatografickej kolóne. Vrcholy sa izolovali a analyzovali s SDS-PAGE (obrázok 3). Frakcie obsahujúce PEG-IFN-β konjugát sa spojili a koncentrát sa potom znovu naniesol na rovnakú veľkostnú vylučovaciu kolónu na ďalšiu purifikáciu PEG-IFN-β konjugátu, aby sa viac priblížil prirodzenému IFN-β vrcholu (obrázok 2B). Tento postup sa na zaistenie čistoty opakoval (tretí prechod) (obrázok 2C). Obrázok 4 znázorňuje graf kapilárnej elektroforézy a obrázok 5 znázorňuje MALDI MS spektrum purifikovaného PEG-IFN-β konjugátu.
Modifikácia IFN-β s mPEG30k-OPSS
Poskytol sa rekombinantný ľudský IFN-β, ktorý je stabilný v roztoku pri 0,36 mg/ml v 50mM tlmivom roztoku octanu sodného, pH 3,6. Približne 36 mg mPEG30kOPSS v 3 ml deionizovanej H2O sa pridalo do 3 ml IFN-β v koncentrácii 36 mg/ml (1,08 mg, 4,9 x 10-8 molov) a tieto dve zlúčeniny sa nechali reagovať v polypropylénovej skúmavke 2 hodiny pri 50 °C. Reakčná zmes sa analyzovala z hľadiska rozsahu modifikácie kapilárnou elektroforézou. Typické výťažky tejto reakcie boli nižšie ako 30 %. Roztok sa potom naniesol na veľkostnú vylučovaciu kolónu (Superose 12, Pharmacia) a eluoval sa tlmivým roztokom obsahujúcim 5mM fosforečnan sodný, 150mM NaCl, pH 7,0. Vrcholy sa izolovali a analyzovali z hľadiska ich obsahu prostredníctvom SDS-PAGE.
Príklad 2
Biologický účinok PEG-IFN-β konjugátu
Na stanovenie účinkov PEGylácie na anti-vírusovú aktivitu ľudského rekombinantného IFN-β sa ľudské WISH amniotické bunky predinkubovali buď s čerstvo pripraveným IFN-β (rovnakým množstvom ako bolo použité na PEGyláciu), alebo s PEG-IFN-β konjugátom. Anti-vírusová aktivita sprostredkovaná IFN-β, meraná WISH-VSV cytopatickým testom, sa stanovila podľa anti-vírusového WISH
-15biologického testu vyvinutého na základe protokolu podľa Novick a ďalší, J
Immunol., 129:2244-2247 (1982). V tomto WISH teste sa použili nasledujúce materiály:
- WISH bunky (ATCC CCL 25)
- zásobný roztok vezikulárneho stomatitídového vírusu (ATCC V-520-001-522), uskladňovaný pri -70 °C
- IFN-β, ľudský rekombinant, InterPharm Laboratories LTD (32, 075-typ, vzorka č. 205035), 82 x 106 IĽI/ml, špecifická aktivita: 222x106 iU/mg
- PEG-IFN-β konjugát pripravený v príklade 1 a udržiavaný v PBS, pH 7,4
- WISH rastové médium (MEM vysoká glukóza s Earlovými soľami + 10% FBS + 1,0% L-glutamín + penicilín/streptomycín (30 U/ml, 100 μg/ml)
- WISH testovacie médium (MEM vysoká glukóza s Earlovými soľami + 5% FBS + 1,0% L-glutamín + penicilín/streptomycín (100 U/ml, 100 pg/ml)
- MTT s koncentráciou 5 mg/ml v PBS, uskladňované pri -70 °C
Protokol pre WISH test je nasledovný:
- Rozriediť IFN-β vzorky na dvojnásobok východiskovej koncentrácie vo WISH testovacom médiu.
- Urobiť trojnásobné riedenia IFN-β vzoriek vo WISH testovacom médiu v 96jamkovej platni s plochým dnom tak, aby každá jamka obsahovala 50 μΙ nariedenej IFN-β vzorky (niektoré kontrolné jamky obdržia len 50 μΙ WISH testovacieho média).
- Zozbierať WISH bunky v log fáze rastu využitím trypsín/EDTA roztoku, premyť vo WISH testovacom médiu a doplniť do konečnej koncentrácie 0,8 x 106 buniek/ml.
- Pridať 50 μΙ WISH bunkovej suspenzie (4 x 104 buniek na jamku) do každej jamky. Konečná koncentrácia IFN-β, ktorá prichádza do kontaktu s bunkami, je teraz 1x.
- Po inkubovaní počas 24 hodín v 5% CO2 vlhkostnom inkubátore pridať 50 μΙ 1:10 riedenia (vo WISH testovacom médiu) VSV zásobného roztoku (dávka vopred určená na lýzu 100 % WISH buniek do 48 hodín) do všetkých jamiek s výnimkou kontrolných jamiek bez vírusu (do týchto jamiek sa pridáva len rovnaký objem testovacieho média).
-16- Po ďalších 48 hodinách pridať do všetkých jamiek 25 μΙ MTT roztoku, a potom inkubovať platne ďalšie 2 hodiny v inkubátore.
- Obsah jamiek odstrániť obrátením platne a do všetkých jamiek pridať 200 μ1100% etanolu.
- Po 1 hodine odčítať platne pri 595 nm použitím Soft max Pro softvérového balíka a Spectramax spektrofotometrického systému (Molecular Devices).
Tabuľka 1
Anti-vírusová aktivita PEGylovaných a falošne PEGylovaných IFN-β vzoriek
IFN-β vzorka* FP ** C'-'5O
PEG-IFN-β konjugát 3,9 +/- 0,7 pg/ml
IFN-β 16,4 +/-1,0 pg/ml
* Zásobné koncentrácie IFN-β vzoriek stanovené aminokyselinovou analýzou ** ECS0 (+/- S.D.) sa stanovila prostredníctvom sofwarového programu Microcal Origin 4.1
Ako je demonštrované na obrázku 6 a v tabuľke 1 vyššie, PEG-IFN-β konjugát udržiava úroveň anti-vírusovej aktivity vynikajúcu v porovnaní s aktivitou čerstvo pripravenej rodičovskej dávky IFN-β. Pozorovanie, že PEG-IFN-β konjugát má približne 4-násobne vyššiu biologickú aktivitu ako čerstvo pripravený IFN-β môže byť aj dôsledkom zvýšenia stability PEG-IFN-β konjugátu, v porovnaní s prirodzeným IFN-β, po pridaní WISH testovacieho média.
Príklad 3
In vitro testy relatívneho účinku PEG-IFN vzoriek
Relatívny biologický účinok PEG[30 kDj-IFN-β a PEG[2 x 20 kDj-IFN-β sa stanovil WISH testom použitím štandardného protokolu opísaného v príklade 2
-17(tabuľka 2). Uskutočnili sa tri nezávislé testy na troch odlišných jedincoch v rôznych časoch.
Tabuľka 2
Relatívny protivírusový účinok PEG-IFN-β
Relatívny účinok interferónu* (z troch štúdií)
Vzorka Test 1 Test 2 Test 3 Priemer (S.D.)
PEG[30 kDj-IFN-β 3,2 x vyšší 3,1 x vyšší 1,8 x vyšší 3,0 x (0,78) vyšší
PEG[2 x 20 kDj-IFN-β 4,2 x vyšší 1,3 x vyšší 0,85 x vyšší 2,1 x (1,8) vyšší
*Každý test zahŕňal porovnanie EC50 dávok so štandardným IFN-β ** Porovnanie na základe IFN-β koncentrácie 330 pg/ml. Zásobné koncentrácie PEG[30 kDj-IFN-β (5,41 pg/ml) a PEG[2 x 20 kDj-IFN-β (6,86 pg/ml) sa stanovili aminokyselinovou analýzou
Viazanie sa PEG-IFN-β na jeho receptor na bunkách sa stanovovalo v prítomnosti daného množstva 125l-IFN-a2a. IFN-a2A bol rádioaktívne značený s 125l použitím chloramín T metódy. Väzba 12SI na IFNa2a sa odstránila z voľného jódu spustením reaktantov cez Sephadex G25 kolónu a zhromaždením frakcií obsahujúcich protein (Pharmacia). 12Sl-IFN-a2a sa kvantifikoval prostredníctvom IFN-a2a ELISA testu (Biosource, USA) a stanovila sa špecifická aktivita. Zozbierali sa Daudi bunky v exponenciálnej fáze rastu a 2 x10s buniek sa inkubovalo s 0,5 nM 125l-IFN-a2a 3 hodiny pri laboratórnej teplote v prítomnosti rôznych koncentrácií PEG-IFN-β alebo IFN-a2a, ktoré boli nariedené v testovacom tlmivom roztoku, ktorým je RPM11640 obsahujúci 2% fetálne hovädzie sérum a 0,1% azid sodný. Na konci inkubácie sa bunky stočili cez vrstvu ftalátového oleja a rádioaktivita viazaná bunkami sa odčítala na gama čítači. Väzba PEG[30 kDj-IFN-β a PEG[2 x 20 kDjIFN-β na receptor bola veľmi podobná alebo blízka väzobnej aktivite IFN-β, ako je zrejmé z obrázku 7.
-18Okrem toho sa stanovila relatívna aktivita v Daudi bunkách (ľudský B bunkový lymfóm) anti-proliferatívnym testom (tabuľka 3). Všetky IFN sa pripravili ako 2x koncentrované s koncentráciou 200 ng/ml. Vzorky sa trojnásobne riedili v smere dlhšej strany platne do konečného objemu 100 μΙ. 1 x 105 buniek/jamku (100 μΙ) sa pridalo do každej jamky a inkubovalo sa celkovo 72 hodín pri 37 °C v CO2 zvlhčenom inkubátore. Po 48 hodinách sa pridal triciovaný (3H) tymidín v koncentrácii 1 pCi/jamku v 20 μΙ. Na konci 72 hodinovej inkubácie sa odobral obsah platní Tomtek Plate Harvesterom. Z výsledkov uvedených v tabuľke 3 vyplýva, že pri PEGylácii nebola pozorovaná žiadna detekovateľná strata IFN aktivity. V skutočnosti sa zistilo, že aktivita je o niečo vyššia ako aktivita voľného IFN-β. To môže byť vďaka vytváraniu neaktívnych agregátov pri voľnom IFN alebo rozdielmi v kvantifikačných metódach (aminokyselinová analýza pri PEG-IFN vzorkách a RPHPLC pri IFN-β).
Tabuľka 3
Daudi anti-proliferačný test
IC50 dávka* Násobok zlepšenia oproti IFN
IFN-β (platňa 1) 1153,1 -
PEG[30 kDj-IFN-β (71 A) 695,6 1,6x
IFN-β (platňa 2) 1005,8 -
PEG[40 kDj-IFN-β 629,4 1,7x
*pg/ml
Príklad 4
Farmakokinetické štúdie na myšiach
Intravenózne podanie
Myšiam sa injekčné podalo 100 ng IFN-β, PEG[30 kDj-IFN-β alebo PEG[2 x 20 kDj-IFN-β a potom sa v stanovených časoch odoberala krv. Koncentrácie IFN-β
-19v sére sa stanovili IFN-β špecifickou ELISA (Toray Industries) a výsledky sú uvedené na obrázku 8. 28 samičiek B6DF1 kmeňa myší (6 až 8 týždňové) (každá mala približne 20 g) sa rozdelilo do štyroch skupín nasledovne: Skupina 1 obsahovala deväť myší, ktorým sa injekčné podala jedna 200μΙ bolusová dávka 500 ng/ml ľudského IFN-β (konečná dávka 100 ng/myš); Skupina 2 (deväť myší) obdržala 200 μΙ rovnakého množstva PEG[30 kDj-IFN-β; Skupina 3 obdržala 200 μΙ rovnakého množstva PEG[2 x 20 kDj-IFN-β; a Skupina 4 je skupinou troch myší bez injekčného podania, ktorá slúži ako negatívna kontrola. Vzorky krvi (približne 200 μΙ/vzorku) sa odoberali v deviatich uvedených časoch z retro-orbitálneho žilového pletenca kapilárou. Vzorky krvi sa nechali 1 hodinu zrážať pri laboratórnej teplote, nechali sa rozvrstviť a mikrocentrifugovali sa. Z nich izolované séra sa uskladnili pri -70 °C pokiaľ sa neizolovali všetky vzorky. Séra sa testovali z hľadiska prítomnosti biologicky aktívneho ľudského IFN-β použitím Toray testu. Z výsledkov vyplýva, že oblasť pod krivkou (AUC) je oveľa väčšia v PEG-IFN vzorkách v porovnaní s voľným IFN-β, a že PEG[2 x 20 kDj-IFN-β je lepší ako PEG[30 kDjIFN-β.
Subkutánne podanie
Myšiam sa subkutánne podal IFN-β a PEG-IFN (100 ng/myš). Obrázok 9 demonštruje, že celková oblasť pod krivkou (AUC) je dramaticky väčšia pre PEGIFN vzorky v porovnaní s voľným IFN-β. Farmakokinetické štúdie potvrdili, že PEGIFN vzorky majú dlhší polčas rozpadu a zvýšenú AUC.
Príklad 5
Pripojenie PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou na polypeptid
Pripojenie OPSS-PEG2k-hydrazínu na interferón-β
Proteín-S-S-PEG2K-C-NH-NH2
-20Použil sa rekombinantný ľudský interferón-β v roztoku s koncentráciou 0,33 mg/ml v 50mM octane sodnom ako tlmivom roztoku, pH 3,8. Pridalo sa približne 3,6 mg (40 molový nadbytok na mol proteínu) heterobifunkčného PEG reakčného činidla, OPSS-PEG2k-hydrazínu, v 2 ml deionizovanej vody do 3 ml IFN-β v koncentrácii 0,33 mg/ml (0,99 mg) a tieto dve zlúčeniny sa nechali reagovať v polypropylénovej skúmavke 1 hodinu pri 45 °C. Reakčná zmes sa potom analyzovala kapilárnou elektroforézou, aby sa stanovil rozsah modifikácie. Typické výťažky boli v rozsahu od 90 do 97 %, čo záviselo na čistote interferónu β a PEG reakčného činidla. Roztok sa potom naniesol na veľkostnú vylučovaciu kolónu (Superdex 75, Pharmacia) a eluoval sa tlmivým roztokom obsahujúcim 5mM fosforečnan sodný, 150mM NaCl, pH 7,0. Vrcholy sa izolovali a analyzovali na SDS-PAGE. MonoPEGylované interferón-β frakcie sa spojili a použili v ďalšom modifikačnom kroku s PEG s vysokou molekulovou hmotnosťou.
Pripojenie (OPSS)2-PEG3400 na interferón-β
Použil sa rekombinantný ľudský interferón-β v roztoku s koncentráciou 0,33 mg/ml v 50mM octane sodnom ako tlmivom roztoku, pH 3,8. Pridalo sa približne 6,1 mg (40 molový nadbytok na mol proteínu) homobifunkčného PEG reakčného činidla, (OPSS)2-PEG340o, v 2 ml deionizovanej vody do 3 ml IFN-β v koncentrácii 0,33 mg/ml (0,99 mg) a tieto dve zlúčeniny sa nechali reagovať v polypropylénovej skúmavke 2 hodiny pri 50 °C. Reakcia sa monitorovala s neredukujúcou SDSPAGE a výsledná reakčná zmes sa analyzovala kapilárnou elektroforézou, aby sa stanovil rozsah modifikácie. Typické modifikácie boli v tejto reakcii s interferónom-β viac ako 95 %. Roztok sa potom naniesol na veľkostnú vylučovaciu kolónu (Superdex 75, Pharmacia) a eluoval sa tlmivým roztokom obsahujúcim 50mM
-21 fosforečnan sodný, 150mM NaCI, pH 7,0. Vrcholy sa izolovali a analyzovali na
SDS-PAGE na zistenie ich obsahu. MonoPEGylované interferón-β frakcie sa spojili.
Príklad 6
Pripojenie druhej PEG časti na polypeptid PEGylovaný PEGom s nízkou molekulovou hmotnosťou
Modifikácia IFN-S-S-PEG2k-hydrazínu s mPEG30k-aldehydom (ALD)
Proteín-S'S-PEGj^—C-NH-NHj l—Proteín-S-S-PEG2K—C-NH-N=CH-mPEG30K mPEG30K -CH2CH2CH
K spojeným frakciám IFN-SS-PEG2k-hydrazínu z príkladu 5 sa pridal mPEG30k-ALD v 20 molovom nadbytku ku proteínu. Reakcia sa uskutočňovala pri laboratórnej teplote (25 °C) 4 hodiny a vzorka sa naniesla na veľkostnú vylučovaciu kolónu (Superose 6, Pharmacia), aby sa stanovil modifikačný výťažok. Modifikačný výťažok tejto reakcie bol typicky väčší ako 80 % v závislosti na čistote PEG reakčného činidla a na reakčných podmienkach.
Z vyššie uvedeného opisu vynálezu bude priemernému odborníkovi v oblasti zrejmé, že rovnaký vynález je možné uskutočniť v rámci širokého rozsahu ekvivalentných parametrov, koncentrácií a podmienok bez vybočenia z ducha a rozsahu vynálezu, a bez nadmerného experimentovania.
Hoci bol tento vynález opísaný v spojitosti s jeho konkrétnymi uskutočneniami, bude zrejmé, že predmet vynálezu je možné ďalej modifikovať. Táto prihláška je mienená ako taká, ktorá zahŕňa akékoľvek varianty, použitia alebo adaptácie, ktoré sú v súlade so všeobecným predmetom vynálezu a zahŕňa také vybočenia z predloženého opisu, ktoré spadajú do rozsahu známej alebo bežnej
-22praxe v oblasti týkajúcej sa vynálezu, a ktoré môžu byť aplikované na základné znaky vyplývajúce z obsahu priložených nárokov.
Všetky tu uvedené citácie, vrátane článkov z časopisov alebo anotácií, zverejnených alebo nezverejnených US alebo zahraničných prihlášok vynálezov, udelených US alebo zahraničných patentov, alebo akékoľvek iné citácie, sú tu celé zahrnuté ich citáciou, vrátane všetkých údajov, tabuliek, obrázkov a textov, ktoré sa nachádzajúc v citovaných dokumentoch. Okrem toho je tu ich citáciou zahrnutý aj obsah celých dokumentov, ktoré sú citované v tu uvedenej literatúre.
Odvolávanie sa na známe spôsobové kroky, bežné spôsobové kroky, známe metódy alebo bežné metódy nie je v žiadnom prípade pripustením, že by akýkoľvek predmet, opis alebo uskutočnenie predloženého vynálezu bolo nárokované, spomenuté alebo navrhnuté v relevantnej oblasti techniky.
Predchádzajúci opis špecifických uskutočnení tak kompletne odhalil všeobecnú povahu vynálezu, že iný môžu použitím znalostí priemerného odborníka v oblasti (vrátane obsahu tu uvedených citácií) jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať rôzne aplikácie takýchto špecifických uskutočnení bez nadmerného experimentovania a bez vybočenia zo všeobecného konceptu predloženého vynálezu. Preto sú takéto adaptácie a modifikácie považované za táké, ktoré spadajú do znenia a rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení na základe tu uvedeného opisu a návodu. Je potrebné, aby bolo zrejmé, že tu použitá frazeológia alebo terminológia je podriadená účelu opisu a nie je obmedzením v tom zmysle, že terminológia a frazeológia predloženého opisu musí byť interpretovaná priemerným odborníkov v oblasti v spojitosti s tu uvedeným opisom a návodom, v kombinácii so znalosťami priemerného odborníka v oblasti.

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polyol-interferón-β konjugát, ktorý má polyolovú časť kovalentne naviazanú na Cys17 ľudského interferónu-β.
  2. 2. Polyol-interferón-β konjugát podľa nároku 1, kde polyolovou časťou je polyalkylénglykolová časť.
  3. 3. Polyol-interferón-β konjugát podľa nároku 2, kde polyalkylénglykolovou časťou je polyetylénglykolová časť, PEG.
  4. 4. Polyol-interferón-β konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý má rovnaký alebo vyšší interferón-β účinok ako prirodzený ľudský interferón-β.
  5. 5. Spôsob výroby polyol-interferón-β konjugátu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:
    reagovanie interferónu-β s tiol-reaktívnym polyolovým činidlom na miestne špecifické a kovalentné pripojenie polyolovej časti na Cys17 ľudského interferónu-β, na produkciu polyol-interferón-β konjugátu; a izoláciu vyprodukovaného polyol-interferón-β konjugátu.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že tiol-reaktívnym polyolovým činidlom je tiol-reaktívne PEGylačné činidlo.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že tiolreaktívne polyolové činidlo je mono-metoxylované.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že tiolreaktívne polyolové činidlo je bifunkčné.
    -249. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že tiolreaktívne polyolové činidlo je polyolový derivát, ktorého funkčná skupina je vybraná zo skupiny zahŕňajúcej ortopyridyldisulfid, vinylsulfón, maleimid a jódacetimid.
  9. 10. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že tiolreaktívne polyolové činidlo je ortopyridyldisulfidový derivát mono-metoxylovaného polyolu.
  10. 11. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že reakčný krok sa uskutočňuje v kyslom pH, pri ktorom je interferón-β stabilný.
  11. 12. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polyol-interferón-β konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 ako účinnú zložku a farmaceutický prijateľný nosič, vehikulum alebo pomocné činidlo.
  12. 13. Použitie polyol-interferón-β konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 na výrobu lieku na liečenie infekcií, nádorov a autoimunitných a zápalových ochorení.
  13. 14. Spôsob postupného pripájania polyetylénglykolových častí, PEG, v sérii na polypeptid, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že zahŕňa:
    reagovanie polypeptidu s heterobifunkčnou alebo homobifunkčnou PEG časťou s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá má vzorec:
    W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X kde W a X sú skupiny, ktoré nezávisle reagujú s amínovou, sulfhydrylovou, karboxylovou alebo hydroxylovou funkčnou skupinou, na pripojenie PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou na polypeptid: a
    -25reagovanie PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá je pripojená na polypeptid, s monofunkčnou alebo bifunkčnou PEG časťou na pripojenie monofunkčnej alebo bifunkčnej PEG časti na voľný koniec PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou a na vytvorenie PEG-polypeptid konjugátu.
  14. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že monofunkčná alebo bifunkčná PEG časť má vzorec:
    Y-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z kde Y reaguje s koncovou skupinou voľného konca PEG časti s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá je pripojená na polypeptid, a Z je -OCH3 alebo skupina reagujúca s X a vytvárajúca bifunkčný konjugát.
  15. 16. Spôsob podľa nároku 15, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že monofunkčná alebo bifunkčná PEG časť je metoxy PEG, rozvetvený PEG, hydrolyticky alebo enzymaticky degradovateľný PEG, príveskový PEG alebo dendrimér PEG.
  16. 17. Spôsob podľa nároku 14, v y z n a č uj ú c i sa tým.žeWaXsú nezávisle vybrané zo skupiny, ktorá zahŕňa ortopyridyldisulfid, maleimidy, vinylsulfóny, jódacetamidy, hydrazidy, aldehydy, sukcinimidylestery, epoxidy, amíny, tioly, karboxylové zlúčeniny, aktívne estery, benzotriazolkarbonáty, p-nitrofenolkarbonáty, izokyanáty a biotín.
  17. 18. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tý m , že PEG časť s nízkou molekulovou hmotnosťou má molekulovú hmotnosť v rozsahu približne 100 až 5000 daltonov.
  18. 19. Spôsob podľa nároku 14, vy z n aču j úci sa t ý m , že monofunkčná alebo bifunkčná PEG časť má molekulovú hmotnosť v rozsahu približne 100 daltonov až 200 kilodaltonov.
    -2620. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že PEG časť s nízkou molekulovou hmotnosťou a/alebo monofunkčná alebo bifunkčná PEG časť sú kopolymérom polyetylénglykolu.
  19. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že kopolymér polyetylénglykolu je vybraný zo skupiny zahŕňajúcej polyetylénglykol/polypropylénglykol kopolymér a polyetylénglykol/kyselina poly(mliečna/polyglykolová) kopolymér.
  20. 22. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa krok purifikácie PEG-polypeptid konjugátu po postupnom pripojení dvoch PEG častí v sériách na polypeptid.
  21. 23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že purifikačný krok zahŕňa jednu alebo viacero purifikačných techník vybraných zo skupiny obsahujúcej iónovú výmennú chromatografiu, veľkostnú vylučovaciu chromatografiu, hydrofóbnu interaktívnu chromatografiu, afinitnú chromatografiu a reverznú fázovú chromatografiu.
  22. 24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 23, vyznačujúci sa t ý m , že polypeptidom je interferón-β.
  23. 25. Použitie PEG-polypeptid konjugátov vyrobených spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 23 na prípravu lieku.
SK1622-2000A 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-interferón-ß konjugát, spôsob jeho výroby a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom SK286217B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28
PCT/US1999/009161 WO1999055377A2 (en) 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-ifn-beta conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK16222000A3 true SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
SK286217B6 SK286217B6 (sk) 2008-05-06

Family

ID=22177687

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1622-2000A SK286217B6 (sk) 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-interferón-ß konjugát, spôsob jeho výroby a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom
SK66-2007A SK286654B6 (sk) 1998-04-28 1999-04-28 Spôsob postupného pripájania polyetylénglykolových častí a použitie PEG-polypeptidových konjugátov vyrobených týmto spôsobom

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK66-2007A SK286654B6 (sk) 1998-04-28 1999-04-28 Spôsob postupného pripájania polyetylénglykolových častí a použitie PEG-polypeptidových konjugátov vyrobených týmto spôsobom

Country Status (31)

Country Link
US (3) US6638500B1 (sk)
EP (2) EP1421956B1 (sk)
JP (2) JP4574007B2 (sk)
KR (1) KR100622796B1 (sk)
CN (2) CN1187094C (sk)
AR (1) AR020070A1 (sk)
AT (2) ATE365563T1 (sk)
AU (1) AU762621B2 (sk)
BG (2) BG65046B1 (sk)
BR (1) BR9910023A (sk)
CA (2) CA2330451A1 (sk)
CY (1) CY1108022T1 (sk)
CZ (2) CZ298579B6 (sk)
DE (2) DE69920002T2 (sk)
DK (2) DK1075281T3 (sk)
EA (2) EA200300382A1 (sk)
EE (1) EE05214B1 (sk)
ES (2) ES2285286T3 (sk)
HK (2) HK1038194A1 (sk)
HU (1) HUP0300548A3 (sk)
IL (1) IL139286A (sk)
NO (2) NO329749B1 (sk)
NZ (1) NZ507456A (sk)
PL (2) PL193352B1 (sk)
PT (2) PT1421956E (sk)
SI (2) SI1421956T1 (sk)
SK (2) SK286217B6 (sk)
TR (2) TR200003161T2 (sk)
TW (2) TWI266800B (sk)
UA (2) UA66857C2 (sk)
WO (1) WO1999055377A2 (sk)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
ES2265693T3 (es) * 1998-10-16 2007-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Proteinas de fusion con interferon-beta y usos.
ES2630278T3 (es) * 1998-10-16 2017-08-21 Biogen Ma Inc. Conjugados poliméricos de interferón beta-1a y usos de los mismos
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
CN1244376C (zh) * 1999-04-23 2006-03-08 阿尔萨公司 可释放的键和含有该键的组合物
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
TR200101086A3 (sk) * 1999-10-15 2001-08-21
JP4593048B2 (ja) 1999-12-24 2010-12-08 協和発酵キリン株式会社 分岐型ポリアルキレングリコール類
ES2327606T3 (es) 2000-01-10 2009-11-02 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de g-csf.
DE60138364D1 (de) 2000-02-11 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
CA2436623C (en) 2001-01-30 2011-08-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Branched polyalkylene glycols
EP1234583A1 (en) 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
YU48703A (sh) 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
NZ530545A (en) 2001-07-11 2006-10-27 Maxygen Holdings Ltd Specific conjugates comprising a polypeptide exhibiting G-CSF activity and a non-polypeptide moiety
EA009783B1 (ru) 2002-01-18 2008-04-28 Байоджен Айдек Ма Инк. Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
PL219741B1 (pl) 2002-12-26 2015-07-31 Mountain View Pharmaceuticals Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanie
TWI364295B (en) 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
AU2004221761B2 (en) 2003-03-20 2010-01-07 Bayer Healthcare Llc FVII or FVIIa variants
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
JP2007538048A (ja) 2004-05-17 2007-12-27 アレス トレーディング ソシエテ アノニム ヒドロゲル・インターフェロン製剤
WO2005117948A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Ares Trading S.A. Method of stabilizing proteins
US7731948B2 (en) 2004-06-01 2010-06-08 Ares Trading S.A. Stabilized interferon liquid formulations
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
US7851565B2 (en) 2004-12-21 2010-12-14 Nektar Therapeutics Stabilized polymeric thiol reagents
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
NZ555386A (en) 2004-12-22 2011-01-28 Ambrx Inc Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
JP2009503111A (ja) * 2005-08-04 2009-01-29 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション Ｇ−ｃｓｆ部分および重合体の複合体
LT1917276T (lt) 2005-08-26 2018-05-25 Ares Trading S.A. Glikozilinto interferono beta gavimo būdas
JP2009507003A (ja) 2005-09-01 2009-02-19 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 視神経炎の治療
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2395099A3 (en) * 2006-05-02 2012-05-16 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
MX2008014971A (es) 2006-05-24 2008-12-05 Serono Lab Regimen de cladribine para tratar esclerosis multiple.
EP2213733A3 (en) 2006-05-24 2010-12-29 Novo Nordisk Health Care AG Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
WO2008137471A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
KR20100099298A (ko) 2007-12-20 2010-09-10 메르크 세로노 에스. 에이. Ｐｅｇ­인터페론­베타 제형
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
WO2009155102A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Barofold, Inc. Method for derivatization of proteins using hydrostatic pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
WO2011101242A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
EP2593130A2 (en) 2010-07-15 2013-05-22 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
EP3466968A1 (en) 2010-09-15 2019-04-10 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Factor viii variants having a decreased cellular uptake
JP2014506889A (ja) * 2011-02-18 2014-03-20 ステムディーアール インク． Ｓｉｒｔ１発現誘導物質を含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用組成物
CA2840552A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
SG10201602076QA (en) * 2011-10-01 2016-04-28 Glytech Inc Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
WO2013130684A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Amunix Operating Inc. Xten-folate conjugate compositions and methods of making same
CN104136038A (zh) 2012-02-29 2014-11-05 东丽株式会社 体腔积液抑制剂
CN104334574B (zh) 2013-03-29 2020-01-14 株式会社糖锁工学研究所 附加唾液酸化糖链的多肽
US11759500B2 (en) 2014-07-24 2023-09-19 Abion Inc. PEGylated interferon-beta variant
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
MX2017002140A (es) 2014-08-19 2017-08-21 Biogen Ma Inc Metodo de pegilacion.
EP4014985A1 (en) 2015-05-01 2022-06-22 Allysta Pharmaceuticals, Inc. Adiponectin peptidomimetics for treating ocular disorders
MD3310816T2 (ro) * 2015-06-19 2021-01-31 Eisai R&D Man Co Ltd Imunoglobuline conjugate Cys80
JP7146897B2 (ja) * 2017-04-17 2022-10-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト ホモシスチン尿症の治療のための酵素補充療法の最適化
WO2020158690A1 (ja) 2019-01-28 2020-08-06 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
WO2020158691A1 (ja) 2019-01-28 2020-08-06 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2524586B2 (ja) * 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
PT730470E (pt) 1993-11-10 2002-08-30 Enzon Inc Conjugados melhorados de interferao-polimero
US5766581A (en) 1994-03-31 1998-06-16 Amgen Inc. Method for treating mammals with monopegylated proteins that stimulates megakaryocyte growth and differentiation
AU696387B2 (en) * 1994-05-18 1998-09-10 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
ATE200030T1 (de) * 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
NZ502375A (en) * 1997-07-14 2001-11-30 Bolder Biotechnology Inc The addition of non-natural cysteine derivatives to cause the protein to act as antagonists of the GH family
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
AU762621B2 (en) 2003-07-03
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
CZ298579B6 (cs) 2007-11-14
PL344490A1 (en) 2001-11-05
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
SK286217B6 (sk) 2008-05-06
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
AR020070A1 (es) 2002-04-10
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
UA66857C2 (uk) 2004-06-15
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
NO329749B1 (no) 2010-12-13
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
PL196533B1 (pl) 2008-01-31
CN100335503C (zh) 2007-09-05
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
PT1421956E (pt) 2007-07-13
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
CN1637020A (zh) 2005-07-13
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
PT1075281E (pt) 2004-11-30
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
US7700314B2 (en) 2010-04-20
US7357925B2 (en) 2008-04-15
AU3767499A (en) 1999-11-16
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
BR9910023A (pt) 2000-12-26
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
HK1076115A1 (en) 2006-01-06
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
CN1302209A (zh) 2001-07-04
US6638500B1 (en) 2003-10-28
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
NO20100324L (no) 2000-12-28
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
TWI232882B (en) 2005-05-21
CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
BG64694B1 (bg) 2005-12-30
BG104871A (en) 2001-07-31
IL139286A0 (en) 2001-11-25
EE200000614A (et) 2002-04-15
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
HK1038194A1 (en) 2002-03-08
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
NO20005337L (no) 2000-12-28
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
BG109291A (en) 2006-04-28
EA003789B1 (ru) 2003-10-30
NZ507456A (en) 2003-10-31
TWI266800B (en) 2006-11-21
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
NO332224B1 (no) 2012-07-30
CN1187094C (zh) 2005-02-02
IL139286A (en) 2005-12-18
UA79430C2 (en) 2007-06-25
SK286654B6 (sk) 2009-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK16222000A3 (sk) Polyol-interferón-beta konjugát, spôsob jeho výroby, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
EP0809996B1 (en) Interferon conjugates
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates
KR20030045414A (ko) 인터페론-베타와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change of owner's name

Owner name: MERCK SERONO SA, COINSINS, VAUD, CH

Effective date: 20120709

MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20130428