KR20110017420A

KR20110017420A - 폰 빌레브란트 질환의 치료를 위한 ｆｖｉｉｉ 뮤테인

Info

Publication number: KR20110017420A
Application number: KR1020117000028A
Authority: KR
Inventors: 하이얀 지앙; 글렌 피어스; 존 이. 머피; 준리앙 판; 신 장; 통야오 리우
Original assignee: 바이엘 헬스케어 엘엘씨
Priority date: 2008-06-04
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2011-02-21
Also published as: MX2010013219A; JP5674650B2; EP2297330A4; BRPI0913374A2; IL209719A0; AU2009256093A1; CA2726942A1; ZA201008720B; WO2009149303A1; JP2011523663A; EP2297330A1; US20110286988A1; CN102112623A

Abstract

본 발명은 N-말단 아민이 아닌 미리 정해진 부위에서 폴리에틸렌 글리콜과 같은 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합으로 결합된 제VIII 인자 뮤테인(mutein)의 투여에 의한 폰 빌레브란트 질환(von Willebrand Disease)의 치료에 관한 것이다. 이러한 뮤테인 접합체는 FVIII 응고촉진(procoagulant) 활성을 유지하고, 폰 빌레브란트 인자가 없는 대상에서의 약동학 성질이 개선되었다.

Description

폰 빌레브란트 질환의 치료를 위한 ＦＶＩＩＩ 뮤테인{FVIII MUTEINS FOR TREATMENT OF VON WILLEBRAND DISEASE}

본 출원은 미국 가출원 일련 번호 61/058,795 (2008년 6월 4일 출원)를 우선권으로 청구하고, 이의 내용은 전문이 거명에 의해 본원에 포함된다.

기술 분야

본 발명은 폰 빌레브란트 질환 (vWD: von Willebrand Disease)의 치료에 유용한 제VIII 인자 (FVIII) 뮤테인(mutein) 및 이의 유도체에 관한 것이다. 이러한 FVIII 뮤테인은 정해진 부위에서의 폴리에틸렌 글리콜과 같은 하나 이상의 생체적합성 중합체에의 커플링을 허용한다. 또한, 치료 목적을 위한 이의 관련된 제형, 투여량 및 투여 방법이 제공된다. 이러한 변형된 FVIII 변이체, 및 관련된 조성물 및 방법은 폰 빌레브란트 질환을 앓고 있는 개체에게 주사 빈도가 감소되고 면역원성 응답이 감소된 치료 선택권을 제공하는데 유용하다.

배경 기술

vWD는 다양한 병인의 유전적 또는 후천성 질환들의 군을 기술하는 용어이다. vWD의 다수의 유형의 기초는, 여러 성질들 중에서도, 응고촉진(procoagulant) FVIII에 결합하고 혈액 순환에서의 천연 FVIII의 반감기를 연장하는 일련의 다량체성 혈장 당단백질인 폰 빌레브란트 인자 (vWF)의 기능에 있다 (예를 들어, [Federici, Haemophilia 10 (suppl 4):169, 2004]; [Denis, et al., Thromb. Haemost. 99:271, 2008] 참조). 정상인에서, FVIII의 반감기는 vWF의 부재 하에서는 약 8분이고, vWF의 존재 하에서는 8시간이다.

경미한 형태 (제1형)에서, vWD는 매우 통상적인데, 집단 내의 100명 중 많게는 1명에게 영향을 미치고, 남성과 여성에게 동등하게 영향을 미친다.

제2형 vWD는 중증 형태의 vWD일 수 있고, 5가지 아유형이 공지되어 있다: 2A, 2B, 2C, 2M 및 2N. 이들 중에서, 제2N형은 vWF에 대한 FVIII의 결합의 결핍을 특징으로 한다. 따라서, 제2N형 vWD 환자에서, FVIII이 급속하게 분해되고, 순환 수준이 낮다. vWF 제2N형은 FVIII에 대한 결합을 손상시키는 동형접합성 또는 화합물-이형접합성 vWF 돌연변이에 의해 야기된다. vWF와의 복합체 상태가 아닌 유리 FVIII은 순환으로부터 급속하게 소거되기 때문에, vWD 2N은 보통염색체성 열성 형태의 A형 혈우병을 가장한다. 그러나, 환자들은 전형적으로 vWF-혈소판 GP1b 결합을 위한 vWF-항원 및 리스토세틴(Ristocetin) 보조인자 활성 (vWF:RCo 활성)의 수준은 정상이지만, FVIII 수준이 감소되었다.

에릭 폰 빌데브란트(Eric von Willebrand)가 핀란드 가족에서 최초로 기술한 제3형 vWD는 vWF의 동형접합성 결핍 또는 이중 이형접합성 결핍이다. 제3형 vWD는 vWF를 코딩하는 핵산 내로의 소형 삽입 또는 결실로 인한 논센스(nonsense) 돌연변이 또는 프레임시프트(frameshift)에 의해 야기되고, 이는 vWF의 완전한 또는 거의 완전한 결핍을 초래한다. 대부분의 경우에, vWF:RCo 및 vWF:Ag가 검출가능하지 않고, FVIII 수준이 크게 감소된다. 제3형 vWD 환자는, 혈우병과 매우 유사하게, 혈관절증 및 관절 또는 관절 공간 내로의 출혈이 있을 수 있다.

후천성 vWD는 항-vWF 항체의 발달, 유체 전단 응력-유도 단백질분해, 또는 혈소판 또는 다른 세포에 대한 증가된 결합으로 인한 자가면역 소거에 의해 일반적으로 야기된다. 후천성 vWD 증후군은 vWD 제3형과 유사하고, 이때 vWF-Ag, vWF:Rco 및 FVIII 수준이 감소된다. vWD 제3형 및 후천성 vWD 환자는 vWD에 특징인 점막 출혈뿐만 아니라, A형 혈우병에 특징적인 연조직, 근육 및 관절 출혈을 또한 앓는다.

A형 혈우병은 추정 발병률이 남성 5000명 당 1명인, 가장 통상적인 유전적 응고 장애이다. 이는 내인성 혈액 응고 경로의 결정적인 성분인 FVIII의 결핍 또는 구조적 결함에 의해 야기된다. A형 혈우병에 대한 현재의 치료는 인간 FVIII의 정맥내 주사를 수반한다. 인간 FVIII은 약 300 kD의 단일 사슬 분자로서 재조합에 의해 생산되었다. 이는 구조 도메인 A1-A2-B-A3-C1-C2로 구성된다 ([Thompson, Semin. Hematol. 29:11-22, 2003]). 전구체 생성물이 골지체에서 200 kD (중쇄) 및 80 kD (경쇄)의 2개의 폴리펩티드 사슬로 프로세싱되고, 이때 2개의 사슬은 금속 이온에 의해 함께 유지된다 ([Kaufman, et al., J. Biol. Chem. 263:6352, 1988]; [Andersson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2979, 1986]).

B-도메인 결실 FVIII (BDD, 90 kD A1-A2 중쇄 + 80 kD 경쇄)이 A형 혈우병에 대한 대체 요법으로서 효과적인 것으로 또한 나타난 바와 같이, FVIII의 B-도메인은 없어도 되는 것으로 보인다. B-도메인 결실 FVIII 서열은 B-도메인의 아미노산 14개를 제외한 모두의 결실을 함유한다.

현재 A형 혈우병 환자는 요청 시의 또는 1주일에 여러번 투여되는 예방 요법으로서의 FVIII의 정맥내 투여에 의해 치료된다. 예방 치료를 위해, 체중 1 ㎏ 당 15-25 IU의 FVIII이 일주일에 3회 제공된다. 이는 환자에서 지속적으로 요구된다. 인간에서의 짧은 반감기로 인해, FVIII은 빈번하게 투여되어야 한다. 전장 단백질에 대한 300 kD을 초과하는 대형 크기에도 불구하고, FVIII은 인간에서의 반감기가 단지 약 11시간이다 ([Ewenstein, et al., Semin. Hematol. 41:1-16, 2004]). 빈번한 정맥내 주사를 요구하는 것은 환자 순응도에 대한 중대한 장벽을 생성시킨다. 반감기가 더 길고 따라서 덜 빈번한 투여를 필요로 하는 FVIII 제품이 개발될 수 있다면 환자에게 더욱 편리할 것이다. 또한, 반감기가 증가되면 더 적은 투여량이 필요할 수 있기 때문에 치료 비용이 감소될 수 있다.

현재의 요법에 대한 추가적인 단점은 환자 중 약 25-30％에서 FVIII 활성을 억제하는 항체가 발달된다는 것이다 ([Saenko, et al., Haemophilia 8:111, 2002]). 억제 항체의 주요 에피토프들은 A2 도메인의 잔기 484-508, A3 도메인의 잔기 1811-1818, 및 C2 도메인 내에 위치한다. 항체 발달은 대체 요법으로서 FVIII을 사용하지 못하게 하여, 이러한 군의 환자들이 고용량의 재조합 제VIIa 인자 및 면역 내성 요법을 사용하는 더욱 고가의 치료를 찾게 한다.

하기의 연구들에서 억제 항체의 FVIII 에피토프들이 확인되었다. 25개의 억제 혈장 샘플의 연구에서, 11개는 트롬빈에 의해 생성된 73 kD 경쇄 단편 A3C1C2에 결합하고, 4개는 A2 도메인에 결합하며, 10개는 양쪽 모두에 결합하는 것으로 발견되었다 ([Fulcher, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2:7728-32, 1985]). 또다른 연구에서, 환자로부터의 8개의 A2 도메인 억제제 중 6개가 재조합 A2 폴리펩티드에 의해 중화되었다 ([Scandella, et al., Blood 82:1767-75, 1993]). 환자로부터의 9개의 억제제 중 6개에 대한 에피토프가 A2 잔기 379538에 맵핑되었다 ([Scandella, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6152-6, 1988]). 18개의 중쇄 억제제에 대한 에피토프가 A2 도메인의 동일한 N-말단 18.3 kD 영역에 국소화되었다 ([Scandella, et al., Blood 74:1618-26, 1989]).

인간 A2 도메인 잔기 387-604를 상동성 돼지 서열로 교체함으로써 생성된, 활성 재조합 하이브리드 인간/돼지 FVIII 분자가 환자 A2 억제제에 대해 저항성이었고 ([Lubin, et al., J. Biol. Chem. 269:8639-41, 1994]), A2에 결합하는 것에 대해 환자 A2 억제제와 경쟁하는 뮤린 모노클로날 항체 mAB 413 IgG에 대해 저항성이었다 ([Scandella, et al., Thromb Haemost. 67:665-71, 1992). 이러한 A2 도메인 에피토프가 A2 도메인 잔기 484-508에 추가로 국소화되었고, 이때 mAB 413 IgG 및 4개의 환자 억제제가 A2 도메인 잔기 484-508이 돼지의 것으로 교체된 하이브리드 인간/돼지 FVIII을 억제하지 못했음을 실험이 나타냈다 ([Healey, et al., J. Biol. Chem. 270:14505-14509, 1995). 또한 이러한 하이브리드 FVIII은 스크리닝된 23개의 환자 혈청 중 절반 이상에 대해 더욱 저항성이었다 ([Barrow, et al., Blood 95:564-568, 2000]). 알라닌 스캐닝(scanning) 돌연변이유발에서, 잔기 487이 테스트된 5개의 환자 억제제 모두에 대한 결합에 결정적인 것으로 확인된 한편, 잔기 484, 487, 489 및 492가 mAB 413 IgG와의 상호작용에 모두 중요하였다 ([Lubin, J. Biol. Chem. 272:30191-30195, 1997]). R484A/R489A/P492A 돌연변이체가 제공된 마우스에서의 억제 항체 역가는 대조군 인간 BDD FVIII이 제공된 마우스에서보다 유의하게 낮았지만, R484A/R489A 돌연변이체는 그렇지 않았다 ([Parker, et al., Blood 104:704-710, 2004]). 요약하면, A2 도메인의 484-508 영역이 FVIII 활성의 억제제에 대한 결합 부위인 것으로 보인다.

FVIII에 대한 면역 응답의 발달에 더하여, 통상적인 요법의 또다른 문제점은 생체 내에서의 FVIII의 짧은 반감기로 인해 빈번한 투약을 필요로 한다는 것이다. 순환으로부터의 FVIII 소거에 대한 메커니즘이 연구되었다.

순환으로부터의 FVIII 소거는 리간드 특이성이 광범위한 간 소거 수용체인 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 (LRP)에 대한 특이적 결합에 부분적으로 기인하였다 ([Oldenburg, et al., Haemophilia 10 Suppl 4:133-139, 2004]). 최근, 저밀도 지질단백질 (LDL) 수용체가, 예컨대 FVIII의 혈장 수준을 조절하는 것에서 LRP와 협력함으로써, FVIII 소거에서 역할을 하는 것으로 또한 나타났다 ([Bovenschen, et al., Blood 106:906-910, 2005]). 양쪽 상호작용 모두 세포-표면 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG)에 대한 결합에 의해 촉진된다. 마우스에서의 혈장 반감기가 LRP가 차단되는 경우 3.3배만큼 또는 LRP와 세포 표면 HSPG 양쪽 모두가 차단되는 경우 5.5배만큼 연장될 수 있다 ([Sarafanov, et al., J. Biol. Chem. 276:11970-11979, 2001]). HSPG는 세포 표면 상에 FVIII을 농축시키고, 이를 LRP에 제시하는 것으로 가정된다. FVIII 상의 LRP 결합 부위는 A2 잔기 484-509 ([Saenko, et al., J. Biol. Chem. 274:37685-37692, 1999]), A3 잔기 1811-1818 ([Bovenschen, et al., J. Biol. Chem. 278:9370-9377, 2003]), 및 C2 도메인 내의 에피토프 ([Lenting, et al., J. Biol. Chem. 274:23734-23739, 1999])에 국소화되었다.

FVIII은 프로티에이스(protease)의 작용에 의해 순환으로부터 또한 소거된다. 이러한 효과를 이해하기 위해, FVIII이 혈액 응고에서 수반되는 메커니즘을 이해하여야 한다. FVIII은 vWF에 결합된, 중쇄 및 경쇄의 이종이량체로서 순환된다. vWF 결합은 FVIII 잔기 1649-1689 ([Foster, et al., J. Biol. Chem. 263:5230-5234, 1998]), 및 C1 ([Jacquemin, et al., Blood 96:958-965, 2000]) 및 C2 도메인 ([Spiegel, et al., J. Biol. Chem. 279:53691-53698, 2004])의 일부를 수반한다. 잔기 372, 740 및 1689 뒤의 펩티드 결합을 절단하는 트롬빈에 의해 FVIII이 활성화되어, A1, A2 및 A3-C1-C2 도메인의 이종삼량체가 생성된다 ([Pittman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 276:12434-12439, 2001]). 활성화 시, FVIII이 vWF로부터 해리되고, 인지질에 결합함으로써 혈소판의 세포 표면에 농축된다. 인지질 결합은 FVIII 잔기 2199, 2200, 2251 및 2252를 수반한다 ([Gilbert et al., J. Biol. Chem. 277:6374-6381, 2002]). 이곳에서, FVIII 잔기 558-565 ([Fay, et al., J. Biol. Chem. 269:20522-20527, 1994]) 및 1811-1818 ([Lenting, et al., J. Biol. Chem. 271:1935-1940, 1996])과의 상호작용을 통해 FIX에, 그리고 FVIII 잔기 349-372 ([Nogami, et al., J. Biol. Chem. 279:15763-15771, 2004])를 통해 FX에 결합하고, 내인성 응고 경로의 필수 성분인 FX의 FIX 활성화에 대한 보조인자로서 작용한다. 활성화된 FVIII (FVIIIa)은 FVIII 잔기 336 및 562 뒤에서의 절단을 통해 프로티에이스에 의해 활성화된 단백질 C (APC)에 의해 부분적으로 불활성화된다 ([Regan, et al., J. Biol. Chem. 271:3982-3987, 1996]). 그러나, 불활성화의 주된 결정인자는 A1 및 A3-C1-C2로부터의 A2 도메인의 해리이다 ([Fay, et al., J. Biol. Chem. 266:8957-8962, 1991]).

단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 실연된 한가지 방법은 PEG화이다. PEG화는 장쇄 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자가 단백질 또는 또다른 분자에 공유결합에 의해 부착되는 것이다. 여러 특색의 여러 분자들이 생산되도록 PEG는 선형 형태 또는 분지형 형태일 수 있다. 펩티드 또는 단백질의 반감기를 증가시키는 것 이외에, PEG화는 항체 발달을 감소시키는데, 단백질을 프로티에이스 소화로부터 보호하는데, 그리고 물질이 신장 여과되지 않도록 하는데 사용되었다 ([Harris, et al., Clinical Pharmacokinetics 40:539-551, 2001]). 또한, PEG화는 단백질의 전반적인 안정성 및 가용성도 증가시킬 수 있다. 마지막으로, 약물의 저점(trough)-대-피크 수준을 감소시키고, 따라서 초기 시점에 초-생리학적 수준의 단백질을 도입할 필요를 없앰으로써, PEG화된 단백질의 지속적인 혈장 농도는 유해 부작용의 정도를 감소시킬 수 있다.

PEG 및 덱스트란과 같은 대형 중합체로 1차 아민 (N-말단 및 라이신)을 표적화하는 것에 의한 FVIII의 무작위 변형이 시도되었고, 이때 성공 정도가 다양하였다 (WO94/15625, US 특허 4970300, US 특허 6048720). 1994년의 특허 출원 (WO94/15625)에서 공개된 가장 극적인 개선은 전장 FVIII을 50배 몰과량의 PEG와 반응시킨 후 4배 반감기 개선을 나타냈지만, 2배 활성 손실이 희생되었다. WO2004/075923에는 무작위 변형을 통해 생성된 FVIII과 폴리에틸렌 글리콜의 접합체가 개시되어 있다. 무작위로 PEG화된 단백질, 예컨대 인터페론-알파 ([Kozlowski, et al., BioDrugs 15:419-429, 2001])는 과거에 치료제로서 승인되었다.

그러나, 이러한 무작위 접근법은 이종이량체성 FVIII에 대해서는 더 문제가 된다. FVIII에는 158개의 라이신, 2개의 N-말단, 및 여러 히스티딘, 세린, 트레오닌 및 타이로신이 포함되는 수백개의 잠재적인 PEG화 부위가 있고, 이들 모두 1차 아민을 주로 표적화하는 시약으로 잠재적으로 PEG화될 수 있다. 예를 들어, PEG화된 인터페론 알파-2b에 대한 주요 위치 이성질체체가 히스티딘인 것으로 나타났다 ([Wang, et al., Biochemistry 39:10634-10640, 2000]). 또한, 전장 FVIII의 비균질적인 프로세싱은 출발 물질들의 혼합물에 이를 수 있고, 이는 PEG화 생성물에서의 추가적인 복잡성에 이른다. FVIII 상의 PEG화 부위를 제어하지 않는 것의 추가적인 단점은 PEG가 결정적인 활성 부위에서 또는 이의 근처에서 부착된 경우, 특히 1개를 초과하는 PEG 또는 1개의 대형 PEG가 FVIII에 접합된 경우의 잠재적인 활성 감소이다. 무작위 PEG화에서는 늘 다량의 다중 PEG화 생성물이 생산될 것이기 때문에, 모노-PEG화 생성물만을 수득하기 위한 정제는 전반적인 수율을 극적으로 저하시킬 것이다. 마지막으로, 생성물 프로파일에서의 거대한 비균질성이 각각의 로트의 일관적인 합성 및 특성화를 거의 불가능하게 만들 것이다. 양호한 제작은 일관적이고 잘 특성화된 생성물을 필요로 하기 때문에, 생성물 비균질성은 상업화에 대한 장벽이다. 모든 이러한 이유로, FVIII을 PEG화하는 더욱 특이적인 방법이 요망된다.

다양한 부위-지정 단백질 PEG화 전략들이 최근의 리뷰에 요약되어 있다 ([Kochendoerfer, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 9:555-560, 2005]). 한가지 접근법은 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의해 비천연 아미노산을 단백질 내로 혼입한 후, 이러한 비천연 아미노산과 특이적으로 반응할 PEG 유도체를 부가하는 것을 수반한다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 천연 단백질에서 발견되지 않는 케토(keto) 기를 함유하는 것일 수 있다. 그러나, FVIII처럼 큰 단백질에 대해서는 단백질의 화학적 합성이 실현가능하지 않다. 현재의 펩티드 합성 한계는 잔기 약 50개이다. 여러 펩티드가 결찰되어 더 큰 폴리펩티드 조각이 형성될 수 있지만, 심지어 B-도메인이 결실된 FVIII을 생산하는 것도 20회를 초과하는 결찰을 필요로 할 것이고, 이는 이상적인 반응 조건 하에서도 1％ 미만의 회수를 초래할 것이다. 비천연 아미노산이 있는 단백질의 재조합 발현은 지금까지 주로 비-포유류 발현 시스템에 한정되었다. 이러한 접근법은 포유류 시스템에서 발현될 필요가 있는 FVIII과 같은 복합적인 대형 단백질에 대해 문제가 있을 것으로 예상된다.

단백질의 부위 특이적 PEG화를 위한 또다른 접근법은 N-말단 골격 아민을 PEG-알데하이드로 표적화하는 것에 의한 것이다. 그러나, 다른 아민 기를 능가하는 특이성을 달성하기 위해 이러한 공정에서 요구되는 낮은 pH는 FVIII의 안정성에 필요한 중성에 가까운 협소한 pH 범위에 적합하지 않다 ([Wang, et al., Intl. J. Pharmaceutics 259, pp. 1-15, 2003]). 또한, FVIII의 N-말단 PEG화는 이러한 영역이 혈장 소거에 수반되지 않는 경우 개선된 혈장 반감기에 이르지 않을 수 있다

WO90/12874에는 시스테인을 삽입하거나 시스테인으로 또다른 아미노산을 치환한 후, 설프하이드릴 반응성 기가 있는 리간드를 부가하는 것에 의한 인간 IL-3, 과립구 콜로니 자극 인자 및 에리트로포이에틴 폴리펩티드의 부위 특이적 변형이 개시되어 있다. 이러한 리간드는 시스테인 잔기들에 선택적으로 커플링된다. FVIII 또는 이의 임의의 변이체의 변형은 개시되어 있지 않다.

EP 0 319 315에는 감소된 vWF 결합을 초래하는 vWF 결합 부위의 결실 또는 변경이 있는 FVIII 뮤테인이 개시되어 있다. EP 0 319 315에는 이같은 뮤테인을 투여하는 것에 의한 vWF 억제 활성으로부터 초래되는 FVIII 결핍의 완화가 추가로 개시되어 있다.

[Rottensteiner et al., Blood 110(11), 3150A (2007)]에는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리시알산과의 접합체를 형성하기 위한 FVIII 내의 라이신 잔기의 무작위 화학적 변형이 개시되어 있다. [Rottensteiner et al., 상기 문헌]에서 무작위로 변형된 FVIII이 제2N형 vWD에서 유용할 수 있다는 것이 추가로 제안되었다.

상기 언급된 이유들로 인해, 기능적 활성을 유지하면서 생체 내에서의 작용 기간이 더 길고 면역원성이 감소된 개선된 FVIII 변이체가 요구된다. 또한, 이같은 단백질이 일관적인 방식으로 균질한 생성물로서 생산되는 것이 바람직하다.

발명의 개요

본 발명의 목표는 약동학 특성 및 치료 특성이 개선된, 생체적합성 중합체가 접합된 기능성 FVIII 폴리펩티드의 투여를 포함하는 vWD의 치료 방법을 제공하는 것이다.

FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 치료적 유효량으로 vWD의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, vWD의 치료 방법을 제공하는 것 또한 본 발명의 목표이다. 폰 빌레브란트 질환은 폰 빌레브란트 인자의 결핍 및/또는 이상을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또다른 목표는 FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 제조하는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, vWD의 치료를 위한 의약의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 방법은 FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 FVIII의 시스테인 치환 변이체를 치료적 유효량으로 vWD의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 변이체는 FVIII 서열 내의 아미노산이 시스테인 잔기로 치환된 것을 특징으로 하고, 이때 상기 치환은 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 내에 시스테인 잔기가 존재하지 않는 아미노산 위치에서 시스테인 잔기를 야기하고, 상기 시스테인 부가 변이체는 상기 치환 시스테인 잔기에 공유결합에 의해 부착된 생체적합성 중합체가 있는 것을 추가로 특징으로 하는 것인, vWD의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목표는 약동학 성질이 개선된, 생체적합성 중합체가 접합된 B 도메인 결실 FVIII 단백질을 vWD의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 vWD의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목표는 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 (LRP), 저밀도 지질단백질 (LDL) 수용체, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG) 및/또는 FVIII에 대한 억제 항체에 대한 결합이 감소된, 생체적합성 중합체가 접합된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 vWD의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 vWD의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목표는 일관적인 방식으로 균질한 생성물로서 생산될 수 있는, 생체 내에서의 작용 기간이 더 길고 면역원성이 감소된 개선된 FVIII 변이체를 치료적 유효량으로 vWD의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 vWD의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 양상에서, 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위가 N-말단 아민이 아닌, FVIII 응고촉진 활성이 있는 접합체를 치료적 유효량으로 vWD의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 vWD의 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 양상에서, FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 치료적 유효량으로 대상에게 수술 전에 투여하고, 이에 의해 에피소드성(episodic) 출혈이 감쇠되는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, 수술 전의 예방적 처치 방법이 제공된다. 대상은 vWD, 예를 들어 제3형 vWD에 걸렸을 수 있다. 유리하게는, 접합체가 수술 전 24시간 이내, 바람직하게는 수술 전 8시간, 가장 바람직하게는 0.5시간 내지 2시간 이내에 투여된다.

본 발명의 또다른 양상에서, FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 치료적 유효량으로 외상 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하고, 이에 의해 에피소드성 출혈이 감쇠되는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, 외상의 치료 방법이 제공된다. 대상은 제3형 vWD이 포함되는 vWD에 걸렸을 수 있다.

도면의 간단한 설명
도 1. vWD 녹아웃(knockout) (KO) 마우스에서 FVIII 반감기를 정상으로 복원시키는 PEG화된 FVIII의 효과. 이러한 도면은 i) rFVIII을 vWF KO 마우스에게 투여하는 것 (흑색 원), ii) rFVIII을 FVIII KO 마우스에게 투여하는 것 (백색 원), iii) PEG화된 rFVIII을 vWF KO 마우스에게 투여하는 것 (64 kD PEG14, 흑색 사각형), 및 iv) 상이하게 PEG화된 rFVIII을 vWF KO 마우스에게 투여하는 것 (64 kD PEG2+14, 흑색 삼각형)에서의 혈장 FVIII 활성의 시간에 따른 추이를 도해한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 FVIII 활성이 있는 폴리펩티드가 N-말단 아민이 아닌 미리 정해진 위치에서 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착될 수 있고, 이같은 폴리펩티드가 이의 응고 활성을 실질적으로 유지한다는 발견을 기초로 한다. 또한, 이러한 폴리펩티드 접합체는 순환 시간이 개선되었고 항원성이 감소되었다.

본 발명은 미리 정해진 부위에서 생체적합성 중합체에 공유결합으로 연결된 FVIII 뮤테인이 변형되지 않은 FVIII보다 vWF가 없는 대상의 순환에서의 응고촉진 활성의 반감기가 더 길다는 발견을 추가로 기초로 한다. 본 발명의 접합체를 사용하여 vWF가 실질적으로 없는 대상을 치료하는 것은 FVIII에 대한 무작위 중합체 부착 또는 N-말단에서의 부착이 있는 종래 기술의 접합체를 사용하는 것보다 유리할 수 있다. 부위-지정 부착은 생물학적 활성에 필요한 영역을 피하는 변형을 디자인하도록, 그리고 이에 의해 실질적인 FVIII 활성을 유지하도록 허용한다. 이는 중합체를 부착시켜 FVIII 소거에 수반되는 부위에서의 결합을 차단하도록 디자인하는 것을 또한 허용한다. 또한 부위-지정 부착은 무작위 중합체 커플링에 의해 종래 기술에서 생산된 균질하지 않은 접합체보다는 균일한 생성물을 허용한다. 경쇄의 N-말단 아민에서의 부착을 피함으로써, 본 발명의 접합체는 리간드를 FVIII 폴리펩티드의 활성 부위에서 부착시키는 것으로부터의 가능한 활성 손실을 피한다.

정의

생체적합성 중합체. 생체적합성 중합체에는 폴리알킬렌 옥사이드 예컨대 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 콜로민산 또는 기타 탄수화물계 중합체, 아미노산 중합체, 비오틴 유도체, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말산 무수물, 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 헤파린, 알부민, 셀룰로스, 키토산 가수분해물, 전분 예컨대 하이드록시에틸-전분 및 하이드록시프로필-전분, 글리코겐, 아가로스 및 이의 유도체, 구아 검, 풀루란, 이눌린, 잔탄 검, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물, 기타 생체-중합체 및 이들의 임의의 등가물이 포함된다. 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 예컨대 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)이다. 또다른 유용한 폴리알킬렌 글리콜 화합물은 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리부틸렌 글리콜 (PBG), PEG-글리시딜 에테르 (Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸 (CDI-PEG), 분지형 폴리에틸렌 글리콜, 선형 폴리에틸렌 글리콜, 포크형(forked) 폴리에틸렌 글리콜 및 다지형 또는 "초-분지형" 폴리에틸렌 글리콜 (성상(star)-PEG)이다.

폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 사용된 "PEG" 및 "폴리에틸렌 글리콜"은 상호교환가능하고, 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함한다. 전형적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 PEG는 "-(OCH2CH2)n-" [식중 n은 2 내지 4000이다]의 구조를 포함한다. 본원에서 사용된 PEG는 말단 산소가 치환되었는지 또는 아닌지 여부에 따라 "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" 및 "-(OCH2CH2)nO-"를 또한 포함한다. 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, 용어 "PEG"는 다양한 말단 또는 "끝부분 캡핑(capping)" 기, 예컨대 비제한적으로 하이드록실 또는 C1-20 알콕시 기가 있는 구조를 포함한다는 것을 기억하여야 한다. 용어 "PEG"는 과반수, 즉 50％를 초과하는 -OCH2CH2- 반복 서브유닛을 함유하는 중합체를 또한 의미한다. 구체적인 형태와 관련하여, PEG는 임의의 수의 다양한 분자량, 뿐만 아니라 구조 또는 기하형태 예컨대 분지형, 선형, 포크형 및 다관능성을 취할 수 있다.

PEG화. PEG화는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 단백질과 같은 분자에 공유결합에 의해 부착되는 과정이다.

활성화된 또는 활성 관능기. 생체적합성 중합체와 같은 관능기가 활성화된 것으로 기술되는 경우, 이러한 관능기는 또다른 분자 상의 친전자체 또는 친핵체와 쉽게 반응한다.

B 도메인 결실 FVIII (BDD). 본원에서 사용된 BDD는 FVIII의 B 도메인의 아미노산 14개를 제외한 모두의 결실을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. B-도메인의 처음 4개의 아미노산 (SFSQ, 서열 2)이 B-도메인의 마지막 10개의 잔기 (NPPVLKRHQR, 서열 3)에 연결된다 ([Lind, et al., Eur. J. Biochem. 232:19-27, 1995]). 본원에서 사용된 BDD의 아미노산 서열은 서열 4이다. BDD 폴리펩티드의 예가 거명에 의해 본원에 포함된 WO 2006/053299에 기술되어 있다.

FVIII. 제VIII 혈액 응고 인자 (FVIII)는 간에 의해 합성되어 혈류 내로 방출되는 당단백질이다. 순환 혈액에서, 이는 폰 빌레브란트 인자 (vWF, FVIII-관련 항원으로 또한 공지됨)에 결합되어, 안정적인 복합체를 형성한다. 트롬빈에 의한 활성화 시, 이러한 인자가 복합체로부터 해리되어 응고 케스케이드 내의 또다른 응고 인자와 상호작용하고, 이는 결국 혈전의 형성에 이른다. 인간 전장 FVIII은 서열 1의 아미노산 서열을 갖지만, 대립유전자 변이체가 가능하다.

기능성 FVIII 폴리펩티드. 본원에서 사용된 기능성 FVIII 폴리펩티드는, 생체 내에서 또는 시험관 내에서, A형 혈우병을 예를 들어 특징으로 하는 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 기능성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 조합물을 가리킨다. FVIII는 천연 상태에서 여러 분해 또는 프로세싱 형태를 지닌다. 이들은 본원에서 실연되는 바와 같이 1쇄 단백질인 전구체로부터 단백질분해에 의해 유도된다. 기능성 FVIII 폴리펩티드는 이같은 단일쇄 단백질을 포함하고, 인간 FVIII 결핍을 교정하는 생물학적 활성이 있는 이러한 다양한 분해 생성물들을 또한 제공한다. 대립유전자 변이가 아마 존재할 것이다. 인간 FVIII의 기능성 절편을 함유하고, 인간 FVIII의 필수적이고 특징적인 기능 활성이 본질적으로 영향을 받지 않고 유지되는 한, 기능성 FVIII 폴리펩티드는 FVIII의 유도체를 초래하는 모든 이같은 대립유전자 변이, 글리코실화 버젼, 변형 및 단편을 포함한다. 필요한 기능 활성을 보유하는 이러한 FVIII 유도체들을 본원에 기술된 직접적인 시험관내 테스트에 의해 쉽게 확인할 수 있다. 또한, 기능성 FVIII 폴리펩티드는 FIXa, 칼슘 및 인지질의 존재 하에 제X 인자 (FX) → FXa 전환을 촉매할 수 있을 뿐만 아니라, A형 혈우병을 앓는 개체로부터 유래된 혈장에서의 응고 결함을 교정할 수 있다. 본원에서의 인간 FVIII 아미노산 서열 및 기능성 영역의 서열의 개시로부터, DNA의 제한 효소 절단 또는 인간 FVIII 단백질의 단백질분해적 또는 기타 분해를 통해 유래될 수 있는 단편이 당업자에게 명백할 것이다. 기능성 FVIII 폴리펩티드의 예가 거명에 의해 본원에 포함된 WO 2006/053299에 개시되어 있다.

FIX. 본원에서 사용된 FIX는 응고 인자 IX를 의미하고, 이는 인간 응고 인자 IX 또는 혈장 트롬보플라스틴 성분으로 또한 알려져 있다.

FX. 본원에서 사용된 FX는 응고 인자 X를 의미하고, 이는 인간 응고 인자 X라는 명칭 및 스튜어트-프라워(Stuart-Prower) 인자라는 이름의 시조로 또한 알려져 있다.

약동학. "약동학" ("PK")은 신체 내에서의 약물의 흡수, 분포, 대사 및 제거의 성질을 기술하도록 사용되는 용어이다. 약물의 약동학에 대한 개선은 약물을 생체 내에서 치료제로서 더욱 효과적이게 만드는 특성들, 특히 신체 내에서의 이의 유용한 기간의 개선을 의미한다.

뮤테인. 뮤테인은 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 실험실에서 유도된 돌연변이의 결과로서 발생하는 유전자 조작 단백질이다.

단백질. 본원에서 사용된 단백질과 폴리펩티드는 동의어이다.

FVIII 소거 수용체. 본원에서 사용된 FVIII 소거 수용체는 하나 이상의 다른 분자와 결합 또는 회합하여 순환으로부터의 FVIII 소거를 초래하는 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 수용체 영역을 의미한다. FVIII 소거 수용체에는 LRP, LDL 수용체 및/또는 HSPG에 결합하는 FVIII 분자의 영역이 비제한적으로 포함된다.

본 발명의 방법에 따라 임의의 기능성 FVIII 폴리펩티드가 미리 정해진 부위에서 돌연변이된 후, 이러한 부위에서 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착될 수 있는 것으로 고려된다. 유용한 폴리펩티드에는, 비제한적으로, 서열 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 전장 FVIII 및 서열 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 BDD FVIII가 포함된다.

본 발명의 접합체에서 사용되는 생체적합성 중합체는 상기 개시된 중합체들 중 임의의 것일 수 있다. 약동학에서의 원하는 개선을 제공하도록 생체적합성 중합체가 선택된다. 예를 들어, 활성에서의 허용가능하지 않은 감소 없이 FVIII 활성이 있는 폴리펩티드의 순환 반감기를 개선하도록 또는 폴리펩티드의 항원성을 감소시키도록 중합체의 신원, 크기 및 구조가 선택된다. 중합체는 PEG를 포함할 수 있고, 예를 들어, 이의 분자량의 50％ 이상이 PEG일 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알켄옥시, 치환된 알켄옥시, 알킨옥시, 치환된 알킨옥시, 아릴옥시 및 치환된 아릴옥시와 같은 끝부분-캡핑 모이어티(moiety)로 말단에서 캡핑된 폴리에틸렌 글리콜이다. 또다른 실시양태에서, 중합체는 메톡시폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 중합체는 크기 범위가 3 kD 내지 100 kD, 또는 5 kD 내지 64 kD, 또는 5 kD 내지 43 kD인 메톡시폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.

중합체에 반응성 모이어티가 있을 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 공유결합 연결을 형성하도록 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 유리 시스테인과 반응할 수 있는 설프하이드릴 반응성 모이어티가 중합체에 있다. 이같은 설프하이드릴 반응성 모이어티에는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜, 또는 말레이미드 모이어티가 포함된다. 한 실시양태에서, 중합체는 선형이고, 한쪽 말단에 설프하이드릴에 대해 강하게 반응성이지 않은 "캡" (예컨대 메톡시)을, 다른쪽 말단에 설프하이드릴 반응성 모이어티를 지닌다. 한 실시양태에서, 접합체는 PEG-말레이미드를 포함하고, 크기 범위가 5 kD 내지 64 kD이다.

유용한 생체적합성 중합체를 선택하기 위한 추가적인 지침이 하기의 실시예에서 제공된다.

FVIII 활성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 부위 지정 돌연변이는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 일어날 수 있다. 방법에는 중합체의 공유결합 부착을 위해 선택된 부위에 시스테인 코돈을 도입하는 돌연변이유발이 포함된다. 이는 시판되는 부위-지정 돌연변이유발 키트 예컨대 스트라타진(Stratagene)의 씨퀵체인지(cQuickChange)™ II 부위-지정 돌연변이유발 키트, 클론테크(Clontech)의 트랜스포머(Transformer) 부위-지정 돌연변이유발 키트 번호 K1600-1, 인비트로젠(Invitrogen)의 젠테일러(GenTaylor) 부위-지정 돌연변이유발 시스템 번호 12397014, 프로메가(Promega)의 얼터드 사이트(Altered Sites) II 시험관내 돌연변이유발 시스템 키트 번호 Q6210, 또는 타카라 마이러스 바이오(Takara Mirus Bio)의 LA PCR 돌연변이유발 키트 번호 TAK RR016을 사용하여 달성될 수 있다.

먼저 기능성 FVIII 폴리펩티드의 표면 상의 하나 이상의 아미노산에 대한 코돈을 시스테인에 대한 코돈으로 교체하고, 재조합 발현 시스템에서 시스테인 뮤테인을 발현시키고, 뮤테인을 시스테인-특이적 중합체 시약과 반응시키고, 뮤테인을 정제함으로써 본 발명의 접합체가 제조될 수 있다.

이러한 시스템에서, 중합체 상의 말레이미드 활성 관능기를 통해 시스테인 부위에서의 중합체의 부가가 달성될 수 있다. 이러한 기술의 예가 하기에서 제공된다. 설프하이드릴 반응성 중합체의 사용량은 유도체화될 시스테인의 몰량과 적어도 등몰량이어야 하고, 바람직하게는 과량으로 존재한다. 예를 들어, 5배 이상의 몰과량의 설프하이드릴 반응성 중합체가 사용되거나, 또는 10배 이상의 과량의 이같은 중합체가 사용된다. 공유결합 부착에 유용한 또다른 조건들은 당업자의 기술 범위 내에 속한다.

하기의 실시예에서, 당업계에서 통상적인 방식으로 뮤테인이 명명된다. 돌연변이체 명명에 대한 관례는 서열 1에서 제공된 바와 같은 성숙형 전장 FVIII에 대한 아미노산 서열을 기초로 한다. 분비형 단백질로서, FVIII은 번역 프로세스 동안 단백질분해적으로 절단되는 신호 서열을 함유한다. 아미노산 19개의 신호 서열의 제거 후, 분비형 FVIII 생성물의 첫번째 아미노산은 알라닌이다.

통상적이고 본원에서 사용된 바와 같이, BDD FVIII 내의 돌연변이된 아미노산을 언급하는 경우, 돌연변이된 아미노산은 전장 FVIII의 서열 내의 이의 위치에 의해 명시된다. 예를 들어, 하기에 논의되는 PEG6 뮤테인은 전장 서열 내의 1808과 유사한 위치에서 라이신 (K)이 시스테인 (C)으로 변화되었기 때문에 K1808C로 명시된다.

중합체의 공유결합을 위한 미리 정해진 부위는 FVIII 활성에 수반되지 않는, 폴리펩티드의 표면 상에 노출된 부위들로부터 최적으로 선택된다. 이같은 부위들은 FVIII이 탈활성화되거나 순환으로부터 소거되는 메커니즘에 수반되는 것으로 공지된 부위들로부터 또한 최적으로 선택된다. 이러한 부위들의 선택이 하기에서 상세하게 논의된다. 바람직한 부위에는 (a) 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질, (b) 헤파린 설페이트 프로테오글리칸, (c) 저밀도 지질단백질 수용체, 및/또는 (d) FVIII 억제 항체에 대한 결합 부위 내 또는 근처의 아미노산 잔기가 포함된다. "결합 부위 내 또는 근처"는 이러한 부위에 대한 생체적합성 중합체의 공유결합 부착이 결합 부위의 입체 장애를 초래하도록 결합 부위에 충분히 가가운 잔기를 의미한다. 예를 들어, 이같은 부위는 결합 부위의 20 Å 이내인 것으로 예상된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 (a) FVIII을 분해할 수 있는 프로티에이스에 대한 결합 부위 및/또는 (b) FVIII 억제 항체에 대한 결합 부위 내 또는 근처의 아미노산 잔기에서 기능성 FVIII 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착된다. 프로티에이스는 활성화된 단백질 C (APC)일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드에 대한 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록, 예를 들어, 2배를 초과하여 적도록, 생체적합성 중합체가 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드에 대한 헤파린 설페이트 프로테오글리칸의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록, 예를 들어, 2배를 초과하여 적도록, 생체적합성 중합체가 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착된다. 추가적인 실시양태에서, 폴리펩티드에 대한 FVIII 억제 항체의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록, 예를 들어, 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 결합보다 2배를 초과하여 적도록, 생체적합성 중합체가 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착된다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드에 대한 저밀도 지질단백질 수용체의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록, 예를 들어, 2배를 초과하여 적도록, 생체적합성 중합체가 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착된다. 또다른 실시양태에서, 혈장 프로티에이스가 폴리펩티드를 폴리펩티드가 접합되지 않은 경우보다 덜 분해하도록, 생체적합성 중합체가 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착된다. 추가적인 실시양태에서, 동일한 기간에 걸쳐 동일한 조건 하에 측정했을 때 혈장 프로티에이스에 의한 폴리펩티드의 분해는 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드의 분해보다 2배를 초과하여 적다.

FVIII에 대한 LRP, LDL 수용체, 또는 HSPG 결합 친화력을 표면 플라즈몬 공명 기술 (Biacore)을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, FVIII을 직접적으로 또는 FVIII 항체를 통해 간접적으로 비아코어(Biacore)™ 칩에 코팅할 수 있고, 다양한 농도의 LRP를 칩 상에 통과시켜, 상호작용의 온(on)-속도 및 오프(off)-속도 양쪽 모두를 측정할 수 있다 ([Bovenschen, et al., J. Biol. Chem. 278:9370-9377, 2003]). 2가지 속도 간의 비율이 친화력의 척도를 제공한다. PEG화 시 친화력에서의 2배, 5배, 10배, 또는 30배 감소가 바람직할 것이다.

프로티에이스 APC에 의한 FVIII의 분해를 당업자에게 공지된 방법들 중 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다.

한 실시양태에서, 방법은 FVIII 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착된 생체적합성 중합체를 투여하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 생체적합성 중합체가 FVIII 아미노산 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되고, (1) 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질에 대한 접합체의 결합이 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적거나; (2) 저밀도 지질단백질 수용체에 대한 접합체의 결합이 저밀도 지질단백질 수용체에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적거나; 또는 (3) 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 및 저밀도 지질단백질 수용체 양쪽 모두에 대한 접합체의 결합이 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 및 저밀도 지질단백질 수용체에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적다.

추가적인 실시양태에서, 방법은 FVIII 아미노산 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556 및 711 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착된 생체적합성 중합체를 투여하는 단계를 포함하고, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 대한 접합체의 결합이 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적다. 추가적인 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 FVIII 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되고, FVIII 억제 항체에 대한 접합체의 결합이 미접합 폴리펩티드보다 적다. 추가적인 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 FVIII 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서, 예를 들어, 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556 및 711 중 하나 이상에서, 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되고, 접합체가 FVIII를 분해할 수 있는 혈장 프로티에이스로부터 미접합 폴리펩티드보다 덜 분해된다. 혈장 프로티에이스는 활성화된 단백질 C일 수 있다.

추가적인 실시양태에서, 방법은 아미노산 위치 129, 491, 1804 및/또는 1808에서 B-도메인 결실 FVIII에 공유결합에 의해 부착된 생체적합성 중합체를 투여하는 단계를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 FVIII 아미노산 위치 1804에서 폴리펩티드에 부착되고, 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 생체적합성 중합체 부착을 위한 하나 이상의 미리 정해진 부위는 부위 특이적 시스테인 돌연변이에 의해 제어될 수 있다.

기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 하나 이상의 부위, 예를 들어, 1개 또는 2개가 중합체 부착을 위한 미리 정해진 부위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 모노-PEG화 또는 디-PEG화된다.

또한 본 발명은 기능성 FVIII 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시켜 미리 정해진 부위에서 시스테인 잔기에 대한 코딩 서열로 치환하는 단계; 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 발현시켜, 시스테인이 강화된 뮤테인을 생산하는 단계; 뮤테인을 정제하는 단계; 접합체가 형성되도록, 실질적으로 환원된 시스테인 잔기에서만 폴리펩티드와 반응하도록 활성화된 생체적합성 중합체와 뮤테인을 반응시키는 단계; 및 접합체를 정제하는 단계를 포함하는 접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 부위-지정 FVIII 뮤테인을 발현시키고, 이때 이러한 뮤테인에서 FVIII 뮤테인의 노출된 표면 상의 아미노산 잔기를 시스테인이 교체하고, 이러한 시스테인이 캡핑되어 있는 단계; (b) 시스테인 뮤테인을 가볍게 환원시키고 캡을 방출시키는 조건 하에 시스테인 뮤테인을 환원제와 접촉시키는 단계; (c) 캡 및 환원제를 시스테인 뮤테인으로부터 제거하는 단계; 및 (d) 환원제를 제거하고 나서 약 5분 이상, 15분 이상, 30분 이상 동안, PEG화된 FVIII 뮤테인이 생산되도록 하는 조건 하에 시스테인 뮤테인을 설프하이드릴 커플링 모이어티를 포함하는 PEG로 처리하는 단계를 포함하는 FVIII 뮤테인의 부위-지정 PEG화 방법을 제공한다. PEG의 설프하이드릴 커플링 모이어티는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜 및 말레이미드 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 접합체 및 제약상 허용가능한 보조제(adjuvant)를 포함하는 비경구 투여용 제약 조성물에 또한 관련된다. 제약상 허용가능한 보조제는 제제의 제형 또는 안정화를 돕기 위해 활성 성분에 첨가될 수 있고 환자에게 유의한 독성학적 유해 효과를 야기하지 않는 물질이다. 이같은 보조제의 예는 당업자에게 주지되어 있고, 물, 당 예컨대 말토스 또는 수크로스, 알부민, 염 등을 포함한다. 기타 보조제들이, 예를 들어, [E. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있다. 이같은 조성물들은 호스트(host)에게의 효과적인 투여에 적절한 제약상 허용가능한 조성물을 제조하기 위해 적절한 양의 비히클과 함께 유효량의 본원의 접합체를 함유할 것이다. 예를 들어, 접합체는 출혈 에피소드의 중증도에 따라 변할 수 있는 투여량으로 A형 혈우병을 앓고 있는 대상에게 비경구적으로 투여될 수 있다. A형 혈우병에 대해 정맥내 투여되는 평균 용량은 수술전 징후에 대해서 40 유닛/㎏, 경미한 출혈에 대해 15 내지 20 유닛/㎏, 유지 용량을 위해 8시간 기간에 걸쳐 투여되는 20 내지 40 유닛/㎏ 범위이다. vWD의 치료를 위해, 투여량은 25-400 IU/㎏일 수 있다. vWD에 대한 또다른 유용한 투여량은 25-50, 25-100, 50-75, 50-100, 100-200, 150-200, 200-300, 250-300, 300-350, 300-400, 25-250, 100-400 및 200-400 IU/kg이다. 더 낮은 투여량이 예방에 유용하고, 더 높은 투여량이 FVIII 억제제가 있는 환자에서의 면역 내성 유도에 유용하다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 표면 BDD 아미노산을 시스테인으로 교체하는 단계, 포유류 발현 시스템에서 시스테인 뮤테인을 생산하는 단계, 성장 배지로부터의 시스테인에 의해 발현 동안 캡핑된 시스테인을 환원시키는 단계, 환원제를 제거하여 BDD 디설피드가 재형성되도록 하는 단계, 및 시스테인-특이적 생체적합성 중합체 시약, 예컨대 PEG-말레이미드와 반응시키는 단계를 수반한다. 이같은 시약의 예는 넥타 쎄라퓨틱스(Nektar Therapeutics) (San Carlos, CA)에서 넥타 카탈로그 번호 2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000 Da, 2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 kD, 2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40 kD 하에 각각 입수가능한 PEG 크기가 5, 22, 또는 43 kD인 PEG-말레이미드 또는 NOF 코포레이션 (NOF Corporation) (Tokyo, Japan)으로부터 NOF 카탈로그 번호 선브라이트(Sunbright) ME-120MA 및 선브라이트 ME-300MA 하에 각각 입수가능한 PEG 크기가 12 또는 33 kD인 PEG-말레이미드이다. PEG화 생성물을 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 미반응 PEG를 제거하고, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 미반응 BDD를 제거한다. 이러한 방법을 사용하여, FVIII와의 임의의 바람직하지 않은 상호작용, 예컨대 수용체-매개 소거, 억제 항체 결합, 및 단백질분해성 효소에 의한 분해를 확인하고, 이를 선택적으로 차폐할 수 있다. 본 발명가들은 넥타 또는 NOF에서 5 kD로 공급한 PEG 시약이 본 발명가들의 실험실에서 6 kD로 테스트되었고, 유사하게 본 발명가들의 실험실에서 선형 20 kD로 공급된 PEG가 22 kD로 테스트되었으며, 40 kD로 공급된 것이 43 kD로 테스트되었고, 60 kD로 테스트된 것이 64 kD로 테스트되었음을 주지하였다. 혼란을 피하기 위해, 본 발명가들은 본 발명가들의 실험실에서 테스트된 분자량을 본원의 논의에서 사용하였고, 단 5 kD PEG에 대해서는 제조사가 이를 식별하는 바와 같이 5 kD로 보고하였다.

BDD의 위치 491 및 1808에서의 시스테인 돌연변이 (상기 개시됨)에 더하여, 위치 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803 및 1804를 시스테인으로 돌연변이시켜, PEG화 시 잠재적으로 LRP 결합의 차단을 허용하였다. 또한, 위치 377, 378 및 556을 시스테인으로 돌연변이시켜, PEG화 시 LRP 및 HSPG 결합 양쪽 모두의 차단을 허용하였다. 위치 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091 및 2284를 BDD 상에서 동일하게 이격되도록 선택하여, 이러한 위치들에서의 대형 PEG (>40 kD)로의 부위-지정 PEG화가 천연 글리코실화 부위 (41, 239 및 2118) 및 LRP 결합 부위에서의 PEG화와 함께 BDD의 표면을 완전히 덮게 하고, BDD에 대한 신규 소거 메커니즘을 확인하였다.

한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 디설피드 결합을 형성함으로써 뮤테인 상의 시스테인 잔기를 "캡핑"하는 시스테인을 함유한다. 접합체의 제조에서, 재조합 시스템에서 생산된 시스테인 뮤테인이 배지로부터의 시스테인으로 캡핑되고, 이러한 캡은 시스테인-특이적 중합체 시약을 부가하기 전에 캡을 방출시키는 가벼운 환원에 의해 제거된다. 당업자에게 명백할 바와 같이, FVIII의 부위 특이적 돌연변이를 위한 당업계에 공지된 또다른 방법들을 또한 사용할 수 있다.

FVIII 의 구조 활성 관계 분석

FVIII 및 BDD FVIII은 생물학적 반응에 수반되는 다수의 상이한 부위들이 있는 대형 복합체이다. 이들을 공유결합에 의해 변형시켜 약동학적 성질을 개선하려는 기존의 시도들의 결과는 다양하였다. 분자들이 특이적으로 돌연변이된 후 중합체가 부위 특이적 방식으로 부가될 수 있다는 것이 놀라웠다. 또한, 비특이적 부가 및 감소된 활성을 야기한 과거의 중합체성 접합체들의 문제점을 고려했을 때, 약동학적 성질이 개선되고 활성이 유지된 결과가 또한 놀라웠다.

한 실시양태에서, 본 발명은 시스테인-특이적 리간드 예컨대 PEG-말레이미드를 사용한 부위-지정 돌연변이유발에 관한 것이다. 돌연변이되지 않은 BDD에는 PEG-말레이미드와 반응할 임의의 이용가능한 시스테인이 없고, 따라서 돌연변이된 시스테인 위치만이 PEG화 부위일 것이다. 더욱 구체적으로, BDD FVIII에는 19개의 시스테인이 있는데, 이중 16개는 디설파이드를 형성하고, 나머지 3개는 유리 시스테인이다 ([McMullen, et al., Protein Sci. 4:740-746, 1995]). BDD의 구조적 모델은 3개의 유리 시스테인 모두가 매립되어 있음을 시사한다 ([Stoliova-McPhie, et al., Blood 99:1215-1223, 2002]). 산화된 시스테인은 PEG-말레이미드에 의해 PEG화될 수 없기 때문에, BDD에서 디설파이드를 형성하는 16개의 시스테인은 먼저 환원되지 않으면 PEG화될 수 없다. BDD의 구조적 모델을 기초로, BDD 내의 3개의 유리 시스테인은 먼저 이러한 시스테인들이 PEG 시약에 노출되도록 단백질을 변성시키지 않으면 PEG화될 수 없다. 따라서, BDD 구조를 극적으로 변경시키지 않으면 천연 시스테인 잔기에서의 PEG화에 의한 BDD의 특이적 PEG화를 달성하는 것이 실행가능한 것으로 보이지 않고, 이러한 변경은 아마도 이의 기능을 파괴할 것이다.

전장 FVIII의 B 도메인 내의 4개의 시스테인의 산화환원 상태는 알려져 있지 않다. B 도메인 내의 4개의 시스테인이 디설파이드를 형성하지 않고 표면에 노출되어 있다면 이들의 PEG화가 가능할 수 있다. 그러나, 전장 FVIII와 BDD의 약동학 (PK) 프로파일이 유사하고 생체내 반감기가 비슷하기 때문에 ([Gruppo, et al., Haemophilia 9:251-260, 2003]), PEG가 B 도메인이 아닌 영역을 또한 우연히 보호하지 않는다면 B 도메인 PEG화는 개선된 혈장 반감기를 초래하지 않을 것이다.

FVIII 활성을 유지시키고 약동학을 개선시킬 중합체 부착을 위한 FVIII 활성이 있는 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위를 결정하기 위해, 하기의 지침이 BDD FVIII을 기초로 제시된다. 변형은 소거, 불활성화 및 면역원성 메커니즘 예컨대 LRP, HSPG, APC, 및 억제 항체 결합 부위에 대해 표적화되어야 한다. [Stoilova-McPhie, et al., Blood 99: 1215-23, 2002]에서 BDD의 구조가 제시되었다. 예를 들어, 반감기를 연장시키기 위해, 단일 PEG가 A2 잔기 484-509 및 A3 잔기 1811-1818 내의 LRP 결합 부위 또는 이러한 부위 근처의 특정 부위에서 도입될 수 있다. 이러한 부위들에서의 부피가 큰 PEG의 도입은 LRP에 결합하는 FVIII의 능력을 파괴하고 순환으로부터의 FVIII의 소거를 감소시켜야 한다. 활성에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 반감기를 연장시키기 위해 잔기 1648에서 PEG가 도입될 수 있는 것으로 또한 여겨지고, 상기 잔기는 전장 분자에서는 B 도메인과 A3 도메인의 접합부에 있고, BDD에서는 A2 도메인과 A3 도메인 사이의 아미노산 14개의 링커 I 내에 있다.

재조합 DNA 돌연변이유발 기술을 사용하여 A2 또는 A3 도메인 내로 단일 시스테인 잔기를 조작한 후, 도입된 시스테인을 시스테인-특이적 PEG 시약 예컨대 PEG-말레이미드로 부위-특이적으로 PEG화시킴으로써 PEG화의 특이성이 달성될 수 있다. 484-509 및 1811-1818에서의 PEG화의 또다른 장점은 이러한 두 에피토프가 환자에서의 억제 항원 부위의 3가지 주요 클래스 중 2개를 나타낸다는 것이다. 개선된 순환 반감기 및 면역원성 응답 감소의 최대 효과를 달성하기 위해, 디-PEG화 생성물이 산출되도록 A2 및 A3 LRP 결합 부위 양쪽 모두를 PEG화시킬 수 있다. 1811-1818 영역 내에서의 PEG화는 이러한 영역이 FIX 결합에 또한 수반되기 때문에유의한 활성 손실에 이를 수 있음을 주지하여야 한다. 558-565 내에서의 부위 지정 PEG화는 HSPG 결합을 폐지해야 하지만, 이러한 영역이 FIX에 또한 결합하기 때문에 활성을 또한 감소시킬 수 있다.

FVIII의 신규 소거 메커니즘을 확인하기 위해 추가적인 표면 부위들을 PEG화시킬 수 있다. A2 도메인이 활성화 시 FVIII으로부터 해리되고, 이의 더 작은 크기로 인해 FVIII 분자의 나머지 부분보다 빠르게 순환으로부터 제거될 것이라는 점에서 A2 도메인의 PEG화는 추가적인 장점을 제공할 수 있다. 한편, PEG화된 A2는 신장 소거로부터 탈출하기에 충분히 클 수 있고, 혈장 반감기가 FVIII의 나머지 부분에 필적하며, 따라서 활성화된 FVIII을 생체 내에서 재구성할 수 있다.

A2 및 A3 영역에서의 PEG 부위의 확인. 추정 A2 LRP 결합 영역 또는 이러한 영역 근처의 5개의 위치 (PEG1-5 위치에 상응하는 Y487, L491, K496, L504 및 Q468)가 높은 표면 노출 및 Cα → Cβ 궤도(trajectory)의 바깥쪽을 향하는 방향을 기초로 부위-지정 PEG화에 대한 예로서 선택되었다. 또한, 이러한 잔기들은 분자의 3차원 구조에서 서로로부터 거의 같은 거리여서, 이러한 전체 영역을 함께 나타낼 수 있다. 추정 A3 LRP 결합 영역 또는 이러한 영역 근처의 8개의 위치 (PEG6-14에 상응하는 1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804)가 부위-지정 PEG화에 대한 예로서 선택되었다. PEG6 (K1808)은 1811-1818, 및 1810의 천연 N-연결 글리코실화 부위에 인접한다. 위치 1810에서의 PEG화 (PEG7)는 당을 PEG로 교체할 것이다. PEG8 위치 T1812에서의 돌연변이 또한 글리코실화 부위를 폐지할 것이다. PEG9 위치 (K1813)는 안쪽을 향하는 것으로 예상되었지만, 구조 모델이 정확하지 않은 경우를 생각하여 선택되었다. PEG10 (Y1815)는 LRP 결합 루프 내의 부피가 큰 소수성 아미노산이고, 결정적인 상호작용 잔기일 수 있는데, 이는 소수성 아미노산들이 단백질-단백질 상호작용의 중심에서 전형적으로 발견되기 때문이다. 1811-1818 영역은 LRP 및 FIX 결합 양쪽 모두에서 수반되는 것으로 보고되었기 때문에, 이러한 루프 내에서의 PEG화는 아마도 감소된 활성을 초래할 것으로 생각되었다. 따라서, 여러 PEG 크기들로 LRP와 FIX 결합을 해리시킬 수 있도록, 1811-1818 루프 근처이지만 루프 내는 아니도록 PEG11PEG14 (1795, 1796, 1803, 1804)가 디자인되었다.

LRP 결합 부위 양쪽 모두를 동시에 차단하기 위해, 예를 들어, PEG2 및 PEG6 위치에서의 이중 PEG화가 생성될 수 있다.

558-565 영역은 HSPG 및 FIX 양쪽 모두에 결합하는 것으로 나타났기 때문에, 이러한 영역 내에서는 부위가 디자인되지 않았다. 대신, 부착된 PEG가 양쪽 모두의 상호작용을 방해할 수 있고 이들 사이의 가능한 상호작용을 파괴할 수 있도록 PEG15-PEG17 (377, 378, 및 556)이 A2 LRP와 HSPG 결합 영역 사이에서 디자인되었다. 표면에 노출되어 있고 바깥쪽을 향하는 추가적인 부위들이 LRP 및 HPSG 결합 영역 내에서 또는 이러한 영역들 근처에서 또한 선택될 수 있었다. 신규 소거 메커니즘을 확인하기 위해, FVIII을 체계적으로 PEG화할 수 있다. PEG1-17에 더하여, 3개의 또다른 천연 글리코실화 부위, 즉, PEG18-20에 상응하는 N41, N239 및 N2118이 PEG화를 위한 결속점(tethering point)으로 사용될 수 있는데, 이는 이들이 표면에 노출되어야 하기 때문이다. PEG2, PEG6 및 4개의 글리코실화 부위의 Cβ 원자로부터 20 옹스트롬 반경 이내의 표면 구역이 vWF, FIX, FX, 인지질 및 트롬빈에 대한 기능적 상호작용에 더하여 BDD 모델 상에 맵핑되었다.

그후, Y81, F129, K422, K523, K570, N1864, T1911, Q2091 및 Q2284에 상응하는 PEG21-29가 이들의 Cβ 원자 각각으로부터 20 옹스트롬 반경으로 거의 전체적인 나머지 BDD 표면을 덮는 이들의 능력을 기초로 선택되었다. 완전히 노출되고, 바깥쪽을 향하며, 천연 시스테인으로부터 멀리 있어 가능한 부정확한 디설파이드 형성을 최소화하기 때문에, 이러한 위치들이 또한 선택되었다. 대형 PEG, 예컨대 64 kD 분지형 PEG가 약 20 옹스트롬 반경의 구체를 가릴 잠재력이 있다고 예상되기 때문에 20 옹스트롬 반경이 선택된다. PEG21-29의 PEG화는 PEG2 및 PEG6 및 글리코실화 부위 PEG18, 19 및 20과 함께 FVIII의 거의 전체적인 비-기능성 표면을 보호하는 것 같다.

개선된 PK 프로파일, 더 큰 안정성 또는 감소된 면역원성과 같은 강화된 성질에 이르는 PEG화 위치들이 조합되어, 성질들이 최대로 강화된 다중-PEG화 생성물이 생성될 수 있다. 각각 A2 및 A3 도메인 내의 노출된 디설피드를 제거함으로써 PEG30 및 PEG31이 디자인되었다. PEG30 또는 C630A는 이의 디설피드 결합 파트너 C711을 PEG화를 위해 해방시켜야 한다. 유사하게, PEG31, C1899A는 C1903이 PEG화도록 허용하여야 한다.

실시예

본 발명이 더 잘 이해될 수 있기 위하여, 하기의 실시예들이 기재된다. 이러한 실시예들은 오직 설명만을 위한 것이고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 거명에 의해 전문이 포함된다.

실시예 1. 돌연변이유발

PEG화용으로 선택된 부위에 시스테인 코돈을 도입함으로써 FVIII의 부위-지정 PEG화를 위한 기질이 생성될 수 있다. 스트라타진(Stratagene)의 cQuickChange™ II 부위-지정 돌연변이유발 키트가 모든 PEG 돌연변이체를 제조하는데 사용되었다 (Stratagene Corporation (La Jolla, CA)). cQuikChange™ 부위-지정 돌연변이유발 방법이 PfuTurbo® DNA 중합효소 및 온도 싸이클러(cycler)를 사용하여 수행된다. 원하는 돌연변이를 함유하는 2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PfuTurbo®를 사용하여 신장되고, 이는 프라이머를 교체하지 않을 것이다. 야생형 FVIII 유전자를 함유하는 dsDNA가 주형으로 사용된다. 다중 신장 사이클 후, 생성물을 메틸화된 DNA에 대해 특이적인 DpnI 엔도뉴클리에이스로 소화시킨다. 돌연변이를 함유하는 새롭게 합성된 DNA는 메틸화되지 않는 반면, 어버이의 야생형 DNA는 메틸화된다. 그후, 소화된 DNA를 사용하여 XL-1 블루 초-수용성(super-competent) 세포를 형질전환시킨다.

돌연변이유발 반응이 pSK207+BDD C2.6 또는 pSK207+BDD에서 수행되었다. 거명에 의해 본원에 포함된 2006/053299에서 FVIII의 부위-지정 돌연변이유발, 뮤테인의 정제, PEG화, 및 활성 측정을 확인할 수 있다. 뮤테인들의 요약이 표 1에서 제공된다.

실시예 2. vWF 결합 ELISA

FVIII를 용액에서 중증 혈우병 혈장 내의 vWf에 결합시켰다. 그후, FVIII-vWf 복합체를 vWf-특이적 모노클로날 항체로 코팅된 미량역가 플레이트 상에서 포획하였다. vWf에 결합된 FVIII를 FVIII 폴리클로날 항체 및 양고추냉이 과산화효소-항-토끼 접합체로 검출하였다. 과산화효소가 접합된 항체 복합체는 기질의 첨가 시 유색 반응을 일으킨다. 4-파라메터 피트 모델을 사용하여 표준 곡선으로부터 샘플 농도가 내삽되었다. FVIII 결합 결과는 ㎍/㎖로 보고되었다. PEG화 시 활성 중 어느 것에 대해서도 유의한 영향이 없었고, 이는 B 도메인에서의 PEG화와 일관될 것이다. 표 2에서 결과를 확인할 수 있다.

실시예 3. 약동학적 활성

PEG화된 FVIII 및 B 도메인-결실 FVIII (BDD-FVIII)의 PK를 FVIII 녹아웃 (KO) 마우스에서 결정하였다. 마우스에게 200 IU/kg의 BDD-FVIII, 108 IU/kg의 아미노산 위치 1804에서 도입된 시스테인 돌연변이에서 64 kD PEG와 접합된 BDD-FVIII (64 kD PEG14), 또는 194 IU/kg의 위치 491 및 1804에서 도입된 시스테인 돌연변이 각각에서 64 kD PEG와 접합된 BDD-FVIII (64 kD PEG2+14)을 정맥내 (i.v.) 주사하였다. 처치된 마우스로부터 5분, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간, 32시간 및 48시간 시점에 혈액 검체를 수집하였다 (5마리의 마우스/처치/시점). 혈장 FVIII 활성을 코아테스트(Coatest) 분석법에 의해 결정하였다. 윈논린(WinNonLin)에서의 활성 대 시간 곡선의 비-구획 모델링에 의해 최종 반감기를 결정하였다. FVIII KO 마우스에서의 BDD-FVIII에 대한 t₁ _/2은 6시간인 한편, 64 kD PEG (64 kD PEG14) 또는 128 kD PEG (64 kD PEG2+14)와 접합된 FVIII에 대한 t₁ _/2은 각각 12.43시간 및 12.75시간이었다. 따라서, PEG화된 FVIII에 대한 반감기가 FVIII KO 마우스에서 BDD-FVIII과 비교하여 약 2배만큼 증가되었다.

vWF KO 마우스에서 실연된 바와 같이, 순환 내의 vWF의 부재는 PEG화된 FVIII의 반감기 연장에 대한 제한을 제거하였다. 200 IU/kg의 BDD-FVIII, 520 IU/kg의 64 kD PEG14, 또는 400 IU/kg의 64 kD PEG2+14를 마우스에게 정맥내 투여하였다. BDDFVIII으로 처치된 마우스로부터 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간 시점에, 그리고 PEG화된 FVIII으로 처치된 마우스로부터 5분, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간, 32시간 및 48시간 시점에 혈액 검체를 수집하였다 (5마리의 마우스/처치/시점). vWF KO 마우스에서 정상 수준의 약 2％인 내인성 뮤린 FVIII으로부터의 배경 활성을 제거하기 위해, 주입된 인간 FVIII의 혈장 활성을 캡쳐 코아테스트(Capture Coatest)에 의해 측정하였다. 혈장 내의 BDD-FVIII 및 PEG화된 FVIII을 먼저 인간 FVIII의 A3 도메인에 대해 특이적인 mAb R8B12 (2 ㎍/㎖)에 의해 포획한 후, 코아테스트에 의해 측정하였다. vWF로부터의 보호 없이 급속하게 소거되어 t₁ _/2이 18분으로 짧은 BDD-FVIII와 대조적으로, 64 kD PEG14 및 64 kD PEG2+14의 t₁ _/2은 각각 5.7시간 및 8.2시간이었다 (도 1). 따라서, FVIII KO 마우스에서 vWF의 존재 하에 관찰된, BDD-FVIII와 비교했을 때 PEG-FVIII의 t₁ _/2에서의 제한된 2배 증가와 달리, 64 kD PEG14 및 64 kD PEG2+14의 t₁ _/2이 vWF KO 마우스에서 vWF의 부재 하에 19배 내지 27배만큼 연장되었다. 또한, PEG-FVIII의 t₁ _/2에서의 증가는 PEG의 크기에 비례하였다.

상기 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 거명에 의해 본원에 포함된다. 설명된 본 발명의 방법들의 다양한 변형 및 변동이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명이 특정 실시양태들과 관련하여 기술되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 이같은 특정 실시양태들에 과도하게 한정되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 생화학 및 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 상기 기술된 방식들의 다양한 변형이 하기 청구항의 범주 내에 속하도록 의도된다. 당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 다수의 등가물들을 인지하거나, 또는 단지 관례적일 뿐인 실험을 사용하여 이들을 확인할 수 있을 것이다. 이같은 등가물들은 하기의 청구항에 의해 포함되도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare LLC Jiang, Haiyan Pierce, Glenn Murphy, John E. Pan, Junliang Zhang, Xin Liu, Tongyao <120> FVIII MUTEINS FOR TREATMENT OF von WILLEBRAND DISEASE <130> MSB-7331 <150> US 61/058,795 <151> 2008-06-04 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val 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Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe 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Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 1457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from human Factor VIII sequence <400> 4 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser 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Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu 755 760 765 Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln 770 775 780 Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu 785 790 795 800 Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe 805 810 815 Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp 820 825 830 Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln 835 840 845 Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr 850 855 860 Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His 865 870 875 880 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile 885 890 895 Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser 900 905 910 Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 915 920 925 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val 930 935 940 Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp 945 950 955 960 Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 965 970 975 Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990 Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe 995 1000 1005 Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020 Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1025 1030 1035 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr 1040 1045 1050 Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe 1070 1075 1080 Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met 1100 1105 1110 Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly 1115 1120 1125 Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser 1130 1135 1140 Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1445 1450 1455

Claims

FVIII 응고촉진(procoagulant) 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 치료적 유효량으로 폰 빌레브란트 질환(von Willebrand Disease)의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, 폰 빌레브란트 질환의 치료 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 메톡시폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 메톡시폴리에틸렌 글리콜의 크기 범위가 5 kD 내지 64 kD인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 (a) FVIII 소거 수용체에 대한 결합 부위, (b) FVIII을 분해할 수 있는 프로티에이스(protease)에 대한 결합 부위 및/또는 (c) FVIII 억제 항체에 대한 결합 부위 내 또는 이러한 부위 근처의 아미노산 잔기에서 기능성 FVIII 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가, 폴리펩티드에 대한 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 접합체에 대한 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 결합의 1/2 미만인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가, 폴리펩티드에 대한 헤파란 설페이트 프로테오글리칸의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 접합체에 대한 헤파린 설페이트 프로테오글리칸의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 결합의 1/2 미만인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가, 폴리펩티드에 대한 FVIII 억제 항체의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 접합체에 대한 FVIII 억제 항체의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 결합의 1/2 미만인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가, 폴리펩티드에 대한 저밀도 지질단백질 수용체의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 것보다 적도록 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 접합체에 대한 저밀도 지질단백질 수용체의 결합이 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드에 대한 결합의 1/2 미만인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가, 혈장 프로티에이스가 폴리펩티드를 폴리펩티드가 접합되지 않은 경우보다 덜 분해하도록 기능성 FVIII 폴리펩티드 상의 미리 정해진 부위에서 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 동일한 기간에 걸쳐 동일한 조건 하에 측정했을 때 혈장 프로티에이스에 의한 폴리펩티드의 분해가 접합되지 않은 경우의 폴리펩티드의 분해의 1/2 미만인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 아미노산 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되고, 추가로 이때 (1) 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질에 대한 접합체의 결합이 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적거나; (2) 저밀도 지질단백질 수용체에 대한 접합체의 결합이 저밀도 지질단백질 수용체에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적거나; 또는 (3) 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 및 저밀도 지질단백질 수용체 양쪽 모두에 대한 접합체의 결합이 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 및 저밀도 지질단백질 수용체에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적은 것인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 아미노산 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556 및 711 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되고, 추가로 이때 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 대한 접합체의 결합이 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 대한 미접합 폴리펩티드의 결합보다 적은 것인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되고, FVIII 억제 항체에 대한 접합체의 결합이 미접합 폴리펩티드보다 적은 것인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유결합에 의해 부착되고, 접합체가 FVIII를 분해할 수 있는 혈장 프로티에이스로부터 미접합 폴리펩티드보다 덜 분해되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 혈장 프로티에이스가 활성화된 단백질 C인 방법.
제1항에 있어서, 기능성 FVIII 폴리펩티드가 B 도메인-결실 FVIII인 방법.
제22항에 있어서, 생체적합성 중합체가 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 아미노산 위치 129, 491, 1804 및/또는 1808에서 B 도메인-결실 FVIII에 공유결합에 의해 부착되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 아미노산 위치 1804에서 폴리펩티드에 부착되고, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생체적합성 중합체 부착을 위한 하나 이상의 미리 정해진 부위가 시스테인 잔기인 방법.
제1항에 있어서, 폰 빌레브란트 질환이 폰 빌레브란트 인자의 결핍 및/또는 이상을 특징으로 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 폰 빌레브란트 질환이 제N2형인 방법.
제1항에 있어서, 폰 빌레브란트 질환이 제3형인 방법.
FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 제조하는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, 폰 빌레브란트 질환의 치료를 위한 의약의 제조 방법.
FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 FVIII의 시스테인 치환 변이체를 치료적 유효량으로 폰 빌레브란트 질환의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 변이체는 FVIII 서열 내의 아미노산이 시스테인 잔기로 치환된 것을 특징으로 하고, 이때 상기 치환은 서열 1의 성숙형 전장 인간 FVIII 아미노산 서열과 관련하여 FVIII 내에 시스테인 잔기가 존재하지 않는 아미노산 위치에서 시스테인 잔기를 야기하고, 상기 시스테인 부가 변이체는 상기 치환 시스테인 잔기에 공유결합에 의해 부착된 생체적합성 중합체가 있는 것을 추가로 특징으로 하는 것인, 폰 빌레브란트 질환의 치료 방법.
제30항에 있어서, 생체적합성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 치료적 유효량으로 예방적 처치를 필요로 하는 대상에게 수술 전에 투여하고, 이에 의해 에피소드성(episodic) 출혈이 감쇠되는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, 예방적 처치 방법.
제32항에 있어서, 대상이 제3형 vWD를 앓고 있는 것인 방법.
제32항에 있어서, 생체적합성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 생체적합성 중합체 부착에 대한 하나 이상의 미리 정해진 부위가 시스테인 잔기인 방법.
FVIII 응고촉진 활성이 있고 인간 FVIII 결핍을 교정할 수 있는 접합체를 치료적 유효량으로 외상 대상에게 투여하고, 이에 의해 에피소드성 출혈이 감쇠되는 단계를 포함하고, 여기서 접합체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 미리 정해진 부위에서 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유결합에 의해 부착된 기능성 FVIII 폴리펩티드를 포함하고, 이때 미리 정해진 부위는 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 숫자로 표현된 위치에 의해 확인되는 특정 아미노산 잔기이고 N-말단 아민이 아닌 것인, 외상의 치료 방법.
제36항에 있어서, 대상이 제3형 vWD를 앓고 있는 것인 방법.
제36항에 있어서, 생체적합성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 생체적합성 중합체 부착에 대한 하나 이상의 미리 정해진 부위가 시스테인 잔기인 방법.