CN109689683A - 重组单链fvⅲ及其化学缀合物 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了单链凝血因子VIII，其包含B区，所述B区部分缺失以包含至少四个糖基化位点但不包含重链、轻链和待由蛋白酶切割的区域，或者单链凝血因子VIII，其中A或B区具有一些聚乙二醇化残基。根据本申请的单链凝血因子VIII不仅保持完整的治疗效力并且由于其单链形式而可以容易地大规模生产，而且通过聚乙二醇化在体内具有提高的半衰期，因此其作为血友病A的治疗剂提高了患者的便利性，并通过降低生产成本引起医疗费用的降低。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗血友病的重组单链FVIII蛋白质及其化学缀合物的制备技术。
背景技术
血友病是由于缺乏凝血因子而不断发生出血的疾病。血液中的凝血因子由I至XIII构成。其中，与血友病有关的因子是VIII、IX和XI。血友病是由上述因子的遗传缺损引起的。根据缺乏的凝血因子类型，血友病可分为因子VIII缺乏的血友病A、因子IX缺乏的血友病B和因子XI缺乏的血友病C。血友病A占血友病的约80％至85％。
血友病治疗的目标是止血。使用酶替代治疗(ERT)在两个方面进行治疗，即预防和按需治疗。目前的治疗趋势是转向预防。
至于用于ERT的蛋白质治疗剂，过去使用从全血和血浆提取并浓缩的FVIII(血友病A)和FIX(血友病B)。然而，存在使用人源原料引起的诸如副作用和并发症的问题。因此，最近，已经开发并使用了通过重组DNA技术产生的多种因子。通过重组DNA技术还产生了FVIII，其降低了感染性疾病和并发症的风险。然而，它如血液来源的凝血FVIII一样具有短的半衰期，需要频繁施用，并且对患者不方便。因此，已经作出了持续的努力以通过开发具有长体内半衰期的多种FVIII来提高患者的生存质量。
它们中的一个是聚乙二醇化FVIII。它被开发用于降低LRP1(低密度脂蛋白受体相关蛋白)与聚乙二醇化FVIII的结合，已知LRP1负责FVIII的体内清除。聚乙二醇化FVIII通过阻止FVIII的清除提高了体内半衰期。但是，提高的程度低于预期。由于FVIII与vWF强烈相互作用，因此大多数FVIII与vWF缔合存在于体内。因此，FVIII的半衰期由与FVIII结合的vWF的体内半衰期决定。这种情况也适用于聚乙二醇化FVIII。由于聚乙二醇化FVIII的半衰期也受聚乙二醇化后的vWF的半衰期控制，所以存在其半衰期的提高低于vWF半衰期的限制。
另外，已经开发了FVIII-Fc融合蛋白(FVIII-Fc)，其中抗体的Fc结构域与FVIII的C末端融合。由于FcRn的体内再循环，FVIII-Fc具有比FVIII更长的体内半衰期。然而，通过与vWF的结合，FVIII-Fc的体内保留时间也受vWF的半衰期控制。
此外，对于血友病A的治疗，一直在努力通过除目前的FVIII之外的其他途径替代FVIII作为凝血因子的功能，并促进体内持续作用和患者便利性。
作为一个实例，FVIII模拟双特异性抗体，其是完整IgG形式的双特异性抗体，包含对FIX(或活化的FIX)和FX具有特异性的两种类型的Fab，已被设计用于替代FVIII在体内的功能(Kitazawa等，Nature medicine 2012 18(10)：1570-4)。
另一个实例是抗TFPI(组织因子途径抑制剂)的使用。这是抑制TFPI功能的物质，并且除抗体和肽之外，其还以适配体的形式开发(Hilden等，BLOOD 2012，119(24)：5871-8)。TFPI通过TF(组织因子)活化的FVII复合物阻止FX的活化过程以抑制FXa的产生，从而通过FXa抑制凝血酶的产生以使血液凝固进程停止。
还提出了抗凝血酶抑制剂。它抑制血液中凝血酶抑制剂的功能以提高凝血酶的活性，从而促进血友病动物或血友病患者的血液凝固。
然而，这些方法不能直接替代或补充血友病A或血友病B中缺乏的FVIII和FIX蛋白质的活性，而是间接地模拟或绕过FVIII的活性。由于这些方法的作用方式很复杂，因此应充分证明其在临床试验中的安全性和有效性。
韩国专利公开No.2014-0114266公开了具有提高的比活性的抗血友病因子VIII。
由于半衰期短，迄今为止开发的治疗剂具有在功能方面短的施用(静脉内注射)间隔以及效力丧失引起的频繁出血的问题。此外，就生产率而言，还应该解决低生产率和高处理成本的问题。因此，有必要开发具有提高的半衰期和高生产率的FVIII。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供显示出改善的体内保留时间并且可以容易地大规模生产的单链FVIII。
问题的解决方案
根据本发明的一个实施方案，提供了单链凝血因子VIII(因子VIII)，其包含人因子VIII的重链、轻链和部分缺失的B结构域片段，其中所述部分缺失的B结构域片段缺少从SEQ ID NO：1的第1648位残基至N-末端方向的至少5个氨基酸和从SEQ ID NO：1的第1649位残基至C-末端方向的至少5个氨基酸，以免包含弗林蛋白酶的切割位点，并且所述部分缺失的B结构域片段包含4至6个糖基化位点。
根据本发明的一个实施方案，包含在本发明的单链凝血因子VIII中的部分缺失的B结构域片段包含约15％至40％的野生型B结构域序列，但不限于此，只要实现根据本发明的效果即可。考虑到包含在上述单链凝血因子VIII中的B结构域片段的情况，本领域技术人员可以选择合适的单链凝血因子VIII。在此，将B结构域解释为包含随后描述的a3区。
根据本发明的一个实施方案，在满足上述条件的部分缺失的B结构域片段中缺失的部分可以是连续的或非连续的，并且基于SEQ ID NO：1的序列，所述部分缺失的B结构域片段可以由以下序列表示：(i)第741至902和1654至1689位氨基酸残基；(ii)第741至965和1654至1689位氨基酸残基；或者(iii)第741至902、1637至1642和1654至1689位氨基酸残基。
根据本发明的一个实施方案，本发明中的单链FVIII包括具有SEQ ID NO：2至7所示氨基酸序列的序列或与其具有约90％或更高同源性的序列，其可以参考随后描述的同源性确定方法和涉及根据本发明的因子和生物学功能等同性的公开内容容易地确定。
根据本发明的一个实施方案，编码具有SEQ ID NO：2至7所示氨基酸序列的本发明单链FVIII的核酸分子包括SEQ ID NO：10至15所示的序列、由此用于在细胞中表达的密码子优化的序列、或由于简并密码子而改变的核酸序列。
当通过CS或APTT方法测量时，根据本发明的单链FVIII的比活性是双链凝血因子VIII的90％或更高。
根据本发明的一个实施方案，单链FVIII与亲水性聚合物缀合，所述亲水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷、葡聚糖或聚唾液酸并且当使用PEG时，其可以通过丙烯酰基、砜或马来酰亚胺在缀合位置处缀合。
根据本发明的一个实施方案，缀合的凝血因子VIII在A结构域和/或B结构域片段的一些氨基酸残基处与亲水性聚合物缀合；基于SEQ ID NO：1的序列，所述B结构域片段的缀合位置是选自第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个，并且基于SEQ ID NO：1的序列，所述A结构域的缀合位置是选自第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个；并且缀合位置的残基可以被半胱氨酸替换，用于与亲水性聚合物缀合。
根据本发明的另一个实施方案，单链FVIII与PEG，特别是平均分子量为20kDa或更高的PEG缀合。
根据本发明的另一个实施方案，提供了单链FVIII，特别是由SEQ ID NO：2至7表示的单链FVIII，或其中缀合位置的氨基酸残基被半胱氨酸替换用于与亲水性聚合物缀合的单链FVIII，其中基于SEQ ID NO：1的序列，B结构域中的缀合位置是选自第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个，并且基于SEQ ID NO：1的序列，A结构域中的缀合位置是选自第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个；或者编码包含经替换的半胱氨酸基团的单链FVIII的核酸分子。
根据本发明的另一个实施方案，引入半胱氨酸的残基如表3中所示，其中特定残基被半胱氨酸替换用于与亲水性聚合物缀合的核酸分子由SEQ ID NO：17至32表示，并且与其对应的氨基酸序列由SEQ ID NO：33至48表示。此外，用于在细胞中表达的密码子优化序列或由简并密码子改变的核酸序列也包括在本发明的范围中。
根据本发明的另一个实施方案，还提供了包含根据本发明的核酸分子的载体，和包含该载体的细胞。
根据本发明的另一个实施方案，提供了产生单链FVIII的方法，其包括：将本发明的载体转染到真核细胞中；或者替代地，提供用本发明的载体转染的细胞；通过在培养液中培养细胞来表达单链FVIII，其中通过半胱氨酸或谷胱甘肽用二硫键掩蔽引入所述单链FVIII中的半胱氨酸的游离巯基；收集从培养液表达的单链FVIII，并用还原剂处理所述单链FVIII，以释放掩蔽的半胱氨酸或谷胱甘肽；以及用聚乙二醇化缓冲液处理经处理的培养液。
在本发明的另一个实施方案中，还提供了血液凝固药盒，其包含待用于血友病患者或需要血液凝固的患者的至少一种本发明中公开的单链FVIII；单链FVIII用于治疗血友病患者的用途或组合物；或者用于血液凝固的方法，其包括向血友病患者或需要血液凝固的患者施用治疗有效量的单链FVIII。
发明的有益效果
根据本发明的单链FVIII包含重链和轻链，其通过其中部分序列缺失的B结构域连接。特别地，单链FVIII包含部分缺失的B结构域，其不包含由弗林蛋白酶(其在正常FVIII表达过程中产生)切割的切割位点，并包含至少4个糖基化位点。根据本发明的单链因子VIII或其中A或B结构域的一些残基被聚乙二醇化的单链FVIII不仅保留了活性，而且由于其单链形式也可以容易地大规模生产。所述单链因子VIII通过聚乙二醇化提高了体内半衰期，以提高作为血友病A的治疗剂对患者的便利性，并通过降低生产成本引起医疗费用的降低。
附图简述
图1示意性地示出了根据本发明一个实施方案的聚乙二醇化单链FVIII结构，其中第1648位残基代表弗林蛋白酶切割位点。
图2示意性地示出了由全长FVIII制备根据本发明一个实施方案的单链FVIII。示出了弗林蛋白酶切割位点(基于SEQ ID NO：1的第1648位氨基酸残基)，并且图中的数字指示对应于指定位点的相应氨基酸残基。
图3示出了根据本发明一个实施方案的单链FVIII表达的Western印迹分析的结果。
图4示出了为确定根据本发明一个实施方案的单链FVIII的最佳聚乙二醇化位置而测试的聚乙二醇化位置。
图5举例说明了根据本发明的一个实施方案，在表达其中引入游离半胱氨酸的突变体单链FVIII之后的FVIII活性的分析结果。
图6示出了根据本发明的一个实施方案，在对其中引入游离半胱氨酸的突变体单链FVIII进行聚乙二醇化之后的SDS-PAGE分析的结果，并且用星号标记的线表示聚乙二醇化效率相对较高的引入的半胱氨酸。
图7描述了与商业化的FVIII物质相比，根据本发明一个实施方案的scFVIII的PK(药代动力学)的测试结果。
图8a和8b分别是用于将根据本发明一个实施方案的聚乙二醇化scFVIII的尾部出血止血效力测试与商业化的FVIII物质的效力进行比较的实验方法的简要举例说明和实验结果。图8b示出了PEG40kDa-scFVIII-B3。
具体实施方式
本发明基于这样的凝血因子VIII突变体的开发：其可以以单链的形式表达，具有提高的生产率和体内稳定性；并且基于这样的凝血因子的开发：其通过因子VIII突变体的聚乙二醇化在患者的施用间隔方面具有改善的依从性。
凝血因子VIII由在肝细胞中合成为单链蛋白质的A1-A2-B-A3-C1-C2结构域构成。合成后，通过加工使其成熟，以形成由重链和轻链构成的280kDa异二聚体。其中，轻链的分子量为80kDa且由A3-C1-C2结构域构成。并且重链由A1-A2-B结构域构成且分子量为90至200kDa，并且其分子量根据B结构域的长度和糖基化程度的差异而显著变化。A1和A2结构域之间的a1结构域、A2和B结构域之间的a2结构域、以及a3结构域包含在重链中。异二聚体通过与vWF结合而在血液中以失活状态存在，并且当暴露于刺激例如血管损伤时，其在精氨酸残基之后，即在第372、740和1689位残基之后由凝血酶切割。结果，它与vWF分离并被活化以形成A1、A2和A3-C1-C2的三聚体。然后三聚体通过FIXa催化FX的活化，并且迅速失活。
据报道，单链FVIII在结构上是稳定的并且表现出表达水平的提高(参见WO2004/067566)。据报道，根据B结构域的长度，双链形式的FVIII显示出表达水平的差异(Miao等，Blood 2004年5月1日；103(9)：3412-9)。
在本发明中，发现在单链FVIII的制备中，除表达水平的差异之外，比活性和APTT/CS比值也根据包含a3的B结构域的长度和序列而变化。通过优化B结构域的长度和序列，制备具有与天然型双链FVIII相似的比活性和APTT/CS比值的重组单链FVIII。发现根据本发明的单链FVIII在维持野生型FVIII的固有特性的同时，还是稳定的且表达水平优异。
因此，根据一个实施方案，本发明提供了单链因子VIII，其中人因子VIII的重链区和轻链区通过人因子VIII的部分缺失的B结构域片段连接。特别地，所述部分缺失的B结构域片段缺少从SEQ ID NO：1的第1648位残基至N-末端方向的至少5个氨基酸和从SEQ IDNO：1的第1649位残基至C-末端方向的至少5个氨基酸，以免包含弗林蛋白酶的切割位点，并且包含4至6个糖基化位点。
根据本发明的单链FVIII包含A1-A2-部分B-A3-C1-C2结构域。包含在本发明中的FVIII中的每个结构域的残基位置和序列是本领域已知的，并且人氨基酸序列例如人FVIII可以由SEQ ID NO：1的序列表示。基于该序列，重链由第1至740位残基构成，包含A1和A2结构域；B结构域由第741至1689位残基构成；并且轻链由第1690至2332位残基构成，包含A3、C1和C2结构域(图2；和Orlova等，Acta Naturae.2013年4月-6月；5(2)：19-39)。本发明中的B结构域旨在包含图2中所述的a3结构域(1649至1689)。
在这方面，根据本发明的单链FVIII可以由式A1-A2-B′-A3-C1-C2表示，其中A1是A1结构域，A2是A2结构域，B′是部分B结构域，A3是A3结构域，C1是C1结构域，并且C2是C2结构域。可以参考上述对每个结构域的描述。
根据本发明的单链FVIII中部分缺失的B结构域(B′)缺少蛋白水解酶弗林蛋白酶的切割位点。根据一个实施方案，B′结构域缺少从SEQ ID NO：1的第1648位残基至N-末端方向的至少5个氨基酸和从SEQ ID NO：1的第1649位残基至C-末端方向的至少5个氨基酸。由于B结构域具有数个糖基化位点并且蛋白质的糖基化在表达过程期间和之后影响蛋白质的活性和稳定性，因此在确定B结构域的缺失位点时可以将糖基化的数量考虑在内。
根据本发明的一个实施方案，确定B结构域的缺失位点以包含4至6个糖基化位点。
在确定B结构域的缺失位点时，可以在包含整个野生型B结构域的约15％至40％的范围内确定包含在根据本发明的单链FVIII中的具有弗林蛋白酶切割位点缺失的B结构域。
包含在根据本发明的单链FVIII中的部分缺失的B结构域的缺失位点可以是连续的或非连续的。
在一个实施方案中，基于SEQ ID NO：1的序列，在根据本发明的单链FVIII包含具有连续缺失(包含弗林蛋白酶切割位点)的B结构域的情况下，B结构域可具有由以下表示的序列：(i)第741至902和1654至1689位氨基酸残基(即B结构域的第903至1653位残基连续缺失)；(ii)第741至965和1654至1689位氨基酸残基(即B结构域的第966至1653位残基缺失)；或者在根据本发明的单链FVIII包含具有非连续缺失的B结构域的情况下，B结构域可以由(iii)第741至902、1637至1642和1654至1689位氨基酸残基的序列表示。
根据另一个实施方案，包含如此缺失的B结构域的根据本发明的FVIII氨基酸序列可以由SEQ ID NO：2至7表示。
本文公开的重组FVIII不限于上述序列，而是包括其生物学等同物。生物学等同物意味着它们具有与根据本发明的多肽基本相同的活性，尽管已对本发明中公开的氨基酸序列进行了另外的修饰，并且这样的修饰包括例如氨基酸序列残基的缺失、插入和/或替换。
根据一个实施方案，通过对根据本发明的FVIII进行保守氨基酸替换而制备的重组FVIII多肽包括在本发明中。
保守氨基酸替换是指基本上不影响或降低特定多肽活性的替换，并且包括例如1至15个保守替换，或1至12例如1、2、5、7、9、12或15个保守氨基酸替换。
保守氨基酸替换是本领域已知的，并且可以参考例如以下中的描述：Creighton(1984)Proteins based on Blosum(BLOcks SUBstitution Matrix).W.H.Freeman和Company(编辑)；和Henikoff，S.；Henikoff，J.G(1992).″Amino Acid SubstitutionMatrices from Protein Blocks″.PNAS 89(22)：10915-10919.doi：10.1073/pnas.89.22.10915；WO2009012175 A1等。
根据氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等，进行这样的氨基酸修饰，尤其是替换。根据对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型进行的分析，精氨酸、赖氨酸和组氨酸均为带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，考虑到上述情况，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是生物学功能等同物。
此外，当引入氨基酸替换时，可以将氨基酸的亲水指数考虑在内。根据每种氨基酸的疏水性和电荷，给出其亲水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。这样的亲水指数对于赋予蛋白质相互作用的生物学功能特别重要。本领域中已知的是，必须用具有相似亲水指数的氨基酸进行替换以保持相似的生物活性。当参照亲水指数引入突变时，在显示亲水指数相差优选在±2内，更优选在±1内，甚至更优选在±0.5内的氨基酸之间进行替换是有利的。
本领域中还已知的是，具有相似亲水性值的氨基酸之间的替换得到具有等同生物活性的蛋白质。例如，如美国专利No.4,554,101中所公开的，对每种氨基酸残基给出以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。
不完全改变根据本发明重组蛋白质活性的氨基酸替换是本领域中已知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。例如，最常进行的替换是在以下氨基酸残基之间的那些替换：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
因此，具有如上所述的生物学和功能等同的变体与本说明书中公开的氨基酸序列或编码其的核酸分子具有相当大的同一性，并且包括在本发明的范围内。
可以使用本领域中已知的序列比较方法确定这样的相当大的同一性。当将本文公开的序列和任何其他序列比对以获得它们之间的最大对应性并使用本领域常用的算法分析比对的序列时，显示优选至少80％同源性，特别是85％或更高，更特别的是90％或更高同源性，甚至更特别的是95％或更高同源性的序列意味着相当大的同一性。用于序列比较的比对方法是本领域中已知的。例如，它们公开于以下文献中：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.(1981)2：482；Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.(1970)48：443；Pearson和Lipman，Methods in Mol.Biol.(1988)24：307-31；Higgins和Sharp，Gene(1988)73：237-44；Higgins和Sharp，CABIOS(1989)5：151-3；Corpet等，Nuc.Acids Res.(1988)16：10881-90；Huang等，Comp.Appl.BioSci.(1992)8：155-65以及Pearson等，Meth.Mol.Biol.(1994)24：307-31。NCBI基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等，J.MoI.Biol.215：403-10(1990))可从国家生物信息中心(National Centerfor Biological Information，NBCI，Bethesda，Md.)等获得，用于与序列分析程序例如blast、blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx相关联。BLAST可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上获取，并且使用该程序的序列同源性比较方法可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html上获得。
与野生型双链FVIII相比，根据本发明的重组单链FVIII包括摩尔活性为90％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或100％的那些。用于测量野生型双链FVIII及其活性的方法是本领域已知的，并且可以例如通过测定通过CS和凝集测定(APTT：活化的部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time))测量的比活性值和(APTT)/CS比值(Coagulation assays Circulation 2005；112：e53-e60)来进行。本领域技术人员将能够通过参考本领域技术和参考文献的描述选择合适的方法来测量活性，并基于该测量确定包括在本发明范围内的重组单链FVIII。双链FVIII由上述弗林蛋白酶处理，并且为由轻链和重链构成的二聚体形式。在本发明中，与野生型FVIII的重组蛋白质进行比较，所述野生型FVIII的重组蛋白质在CHO细胞中以重组形式表达，并且其大多数为包含不同长度B结构域的双链形式。野生型FVIII的重组蛋白质具有与血浆来源的野生型FVIII类似的组成。
与根据本发明的单链FVIII进行比较的双链FVIII包含或不包含B结构域。不包含B结构域的双链FVIII可主要通过在野生型FVIII表达过程中使用FXa(FX的活性形式)和凝血酶的蛋白质切割过程通过重组方法有意去除B结构域而产生。包含部分或全部B结构域的双链FVIII可以在野生型FVIII表达过程中通过重组方法，或通过FXa(FX的活性形式)和凝血酶的蛋白质切割过程而产生。然而，与本发明的单链FVIII进行比较的双链FVIII是从包含全部B结构域的野生型FVIII重组表达的。双链FVIII是包含全部B结构域的双链FVIII(其当从细胞内部分泌到外部时通过弗林蛋白酶加工而产生)和完全不包含B结构域或包含部分B结构域的FVIII(其通过由凝血酶或FIXa或其后的FXa去除部分或全部B结构域而产生)的混合物，其大部分是与野生型FVIII相似的重组FVIII。
根据另一个实施方案，本发明提供了编码根据本发明的单链FVIII的核酸分子或多核苷酸，或者包含该多核苷酸的载体，或者用该载体转染的细胞(系)。
编码根据本发明的重组单链FVIII的核酸分子包括针对其中表达根据本发明重组单链FVIII的细胞的类型的密码子优化的核酸分子。根据本发明的一个实施方案，密码子优化的核酸序列可以针对CHO细胞密码子进行优化，并且可以由SEQ ID NO：15表示，所述CHO细胞密码子是编码SEQ ID NO：5的蛋白质的优化的核酸序列。
如上所述，编码根据本发明的重组单链FVIII的核酸分子还包括编码基本上相同并且是生物学等同物的FVIII的核酸分子。
此外，编码根据本发明的重组单链FVIII的核酸分子也可用于克隆用于多种目的的多种表达载体。表达载体的具体构成可以根据其中待表达根据本发明的重组单链FVIII的宿主细胞而变化。然而，它包含调控本发明的核酸分子表达mRNA或mRNA表达蛋白质的序列，例如如启动子和/或增强子等。可用于以上或多种其他目的的多种载体和调控序列是本领域已知的，并且可由本领域技术人员根据本发明的具体目的和效果适当地选择。这样的载体和序列可包括，例如，在本发明的实施例和附图中公开的那些，但不限于此。
包含编码根据本发明的重组单链FVIII的核酸分子的载体可以通过本领域已知的方法，例如，通过有效地将编码根据本发明的重组单链FVIII的核酸分子与启动子和/或增强子连接来制备。根据一个实施方案，将其插入能够在细胞中表达外来基因的重组表达载体中，并且这样的载体的实例包括但不限于一般的蛋白质表达载体例如pMSGneo和pcDNA3.1(+)。pMSGneo载体是包含与核基质结合的MAR(基质附着区)元件的表达载体，并且当用于表达载体时，MAR元件通过诱导位置无关表达而起到增强基因表达的作用。因此，当使用pMSGneo载体时，可以实现稳定且高的表达水平。另外，pcDNA3.1(+)载体包含强CMV启动子，并因此广泛用于蛋白质表达。
另外，如下所述，可以将包含编码根据本发明的重组单链FVIII的核酸分子的重组表达载体转染到用于多种目的的合适宿主细胞中。为了将包含在载体中的核酸分子表达为蛋白质，可以针对期望的细胞对编码蛋白质的核酸分子的编码序列进行适当地优化。
在这方面，本发明提供了用根据本发明的载体转染或转化的重组细胞。这样的细胞包括原核细胞和真核细胞二者，它们可通过扩增根据本发明的载体和/或表达包含在载体中的核酸分子而用于制备期望的蛋白质。可用于上述目的的多种细胞是本领域已知的，并且本领域技术人员将能够考虑到本发明的具体目的和效果选择合适的细胞，包括本发明的实施例和附图中所述的那些，但不限于此。例如，可以包括大肠杆菌(E.coli)、哺乳动物细胞、酵母、植物细胞和昆虫细胞。根据本发明的一个实施方案，将真核细胞，特别是哺乳动物细胞系用于表达重组FVIII。考虑到根据本发明的重组FVIII的特性，本领域技术人员将能够选择能够制备具有这样的特性的蛋白质的合适细胞系。例如，可以将本领域已知的CHO、BHK、COS7、HEK细胞系等用作这样的哺乳动物细胞系。优选地，可以使用CHO细胞系，特别是CHO-S细胞系、CHO-DG44或CHO-K1细胞系，或者HEK细胞系，特别是HEK293细胞系。
将根据本发明的载体转移至所述宿主细胞用于表达。用于将载体转移至这样的宿主细胞的方法是本领域已知的，其可通过本领域已知的方法来实施，所述方法例如磷酸钙沉淀、鸟枪法、使用脂质体的方法、纳米针法或电穿孔，但不限于此。
可以通过亲水性聚合物在特定残基处对根据本发明的单链FVIII进行修饰，以提高半衰期。
尚未揭示B结构域的蛋白质结构。B结构域已知为具有柔性结构、高的糖基化程度和丰富的负电荷的蛋白质，但其结构难以预测。换句话说，理论上可以使用分子建模技术预测B结构域的结构，但是当考虑到由B结构域的翻译后修饰和糖基化引起的异质性时，难以预测B结构域结构。为了选择B结构域中的修饰位置，需要B结构域蛋白质结构表面上的结构信息。然而，由于没有关于结构的信息，因此很难选择聚乙二醇化位置。
然而，在本发明中，通过出乎意料的努力选择不特别影响单链FVIII活性的A结构域和/或B结构域的残基并用亲水性聚合物修饰。结果，获得了在保持其固有特性的同时还具有提高的半衰期的单链FVIII。
特别地，在本发明中，选择基于B结构域的糖基化附近的残基(0)的第-6和+6位残基之间的位置作为聚乙二醇化位置。
在这点上，本发明涉及单链FVIII，其中所述单链FVIII在A结构域和/或B结构域片段的一些氨基酸残基处与亲水性聚合物缀合；基于SEQ ID NO：1的序列，所述B结构域片段的缀合位置是选自第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个，并且基于SEQ ID NO：1的序列，所述A结构域的缀合位置是选自第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个；并且缀合位置的残基被半胱氨酸替换用于与亲水性聚合物缀合。
本领域已知的多种聚合物可用作用于对根据本发明的单链FVIII进行修饰的亲水性聚合物，其包括例如聚乙二醇、聚环氧乙烷、葡聚糖、聚唾液酸等，但不限于此。这些聚合物具有生物相容性(无毒或低毒性)亲水性柔性结构，并且当与蛋白质化学缀合时，由于通过非特异性相互作用附着于其他分子或材料的表面，聚合物起到抑制缀合蛋白质活性丧失，并抑制血液中蛋白酶失活的作用。
根据本发明的一个实施方案，使用PEG，特别地，使用20kDa或更高的PEG。PEG与蛋白质缀合并提供包裹蛋白质的作用，这导致在与清道夫受体结合或通过失活的蛋白酶降解后防止损失。PEG是直链或支链形式的聚合物，并且具有小分子量的PEG不能完全包裹蛋白质，并因此不能完全保护蛋白质。因此，分子量应该与临界水平相同或在其之上，以充分包裹待保护的蛋白质。可以通过用半胱氨酸替换聚乙二醇化位置处的氨基酸，并随后在一端与包含对半胱氨酸具有特异性的丙烯酰基、砜或马来酰亚胺基团的PEG缀合来进行本发明的单链FVIII的聚乙二醇化。
也就是说，在根据本发明的单链FVIII中，可以替换特定的残基以对亲水性聚合物进行修饰，并且特别地，待替换的残基根据亲水性聚合物在单链FVIII中缀合的位置而变化，并且本领域技术人员可能能够用合适的残基修饰，以用于与亲水性聚合物缀合。
根据本发明的一个实施方案，将聚乙二醇化用于修饰。在这样的情况下，待修饰的残基被半胱氨酸替换。
根据本发明的一个实施方案，在A2结构域的第495位的缬氨酸残基和/或B结构域的第782位的异亮氨酸残基处进行修饰，并且特别地，残基被半胱氨酸替换用于聚乙二醇化，并且残基是聚乙二醇化的。
可以使用本领域已知的方法进行用半胱氨酸替换进行修饰的蛋白质的表达。例如，有必要通过掩蔽引入的游离半胱氨酸来稳定引入的游离半胱氨酸，直到刚好在聚乙二醇化之前使在还原条件下引入的游离半胱氨酸恢复来提高聚乙二醇化效力。通常，在细胞内表达期间或在细胞外分泌之后，用包含游离巯基、半胱氨酸或谷胱甘肽的低分子量物质通过二硫键来稳定待聚乙二醇化蛋白质的引入的游离半胱氨酸。
可以使用本领域已知的方法进行聚乙二醇化。例如，应该在聚乙二醇化反应之前去除用于掩蔽游离半胱氨酸的半胱氨酸或谷胱甘肽，以使得可以使引入的半胱氨酸的游离巯基恢复，并且可以进行所述过程，包括用还原剂(例如TCEP、DTT、β-巯基乙醇、半胱氨酸和谷胱甘肽(还原型))处理的步骤，以及用于恢复通过还原切割的FVIII的原始二硫键的氧化步骤。
可以使用已知方法进行表达的重组蛋白质之引入半胱氨酸的掩蔽。例如，可以进一步向细胞培养基组分添加用于掩蔽游离半胱氨酸的半胱氨酸或谷胱甘肽，或者可以使用通常由细胞在细胞生长和维持期间产生、储存和分泌的半胱氨酸或谷胱甘肽组分，而无需进一步向细胞培养基组分添加。
在另一个方面，本发明还提供了用于产生单链FVIII的方法，其包括将上述根据本发明的载体转染到真核细胞；在培养液中培养细胞；收集培养液以对引入半胱氨酸的FVIII进行纯化；并用聚乙二醇化缓冲溶液处理经纯化的引入半胱氨酸的FVIII；通过还原过程恢复引入的半胱氨酸的游离巯基；在还原过程期间氧化生成物以回收单链FVIII中分离的二硫键；对用还原的巯基基团恢复的单链FVIII的半胱氨酸进行聚乙二醇化，并分离聚乙二醇化的单链FVIII。
关于在根据本发明的方法中使用的特定载体、细胞和处理步骤，可以参考本文实施例中描述的那些。
根据本发明的重组单链FVIII可用于患有需要血液凝固的疾病，即血友病，特别是血友病A的患者的血液凝固，或者可用于治疗血友病A.
因此，本发明还提供了血友病患者或需要血液凝固的患者使用的血液凝固药盒，其包含包括权利要求书在内的本发明中所述的任何一种单链FVIII；所述单链FVIII用于治疗血友病的用途或包含其的组合物；包含编码所述单链FVIII的核苷酸序列的组合物；所述组合物在基因治疗血友病A中的用途；用于血友病治疗或血液凝固的方法，其包括向血友病患者或需要血液凝固的患者以治疗有效量施用包含编码所述单链FVIII的核苷酸序列的组合物或施用所述单链FVIII。
根据本发明的重组单链FVIII可以以药物组合物的形式提供，用于治疗血友病，所述药物组合物还包含可药用载体。
另外，本发明的药物组合物可以单独使用或与使用生物反应调节物的其他药物治疗和方法组合使用。
除上述活性成分之外，本发明的组合物还可以通过进一步包含至少一种可药用或生理学上可接受的载体来制备。
如本文使用的术语“载体”旨在意指在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的可药用载体、赋形剂或稳定剂。这样的载体的实例包括盐水，林格溶液，缓冲盐水，缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸，抗氧化剂例如抗坏血酸，具有低分子量的多肽(约小于10个氨基酸)，蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸，碳水化合物例如单糖、二糖、和葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂例如EDTA，糖醇例如甘露醇或山梨醇，用于盐形成的反荷离子例如钠，和/或非离子表面活性剂例如聚乙二醇(PEG)和
如果需要，该组合物可进一步包含本领域已知的其他添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂、抗菌剂。通过添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、黏合剂和润滑剂，可将组合物配制成可注射制剂例如溶液剂、混悬剂、乳剂等。此外，可以使用本领域中的合适方法或如Remington′s Pharmaceutical Science(最近版；Mack Publishing Company，Easton PA)中所公开的，优选根据疾病或成分配制组合物。
本发明的组合物优选根据期望的方法肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内)施用。剂量根据疾病状况和患者体重、疾病程度、药物类型、施用途径和时间而变化，但可由本领域技术人员适当选择。
根据本发明的组合物以治疗有效量施用。在本发明中，“治疗有效量”是指以合理的收益/风险比足以治疗疾病的量，其适用于药物治疗。有效剂量的水平可以根据包括以下的因素来确定：患者的疾病类型、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗周期、同时使用的药物、和医药领域已知的其他因素。本发明的组合物可以作为单一治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用。此外，本发明的组合物可以与常规治疗剂依次或同时施用，并且该组合物可用于单次或多次施用。考虑到上述所有因素，重要的是以引起最大效果而没有副作用的最小剂量施用组合物，并且剂量可由本领域技术人员容易地确定。
根据本发明的重组单链FVIII可以原样或以如上所述组合物的形式以治疗有效量施用于患有血友病或需要血液凝固的对象，并且可以以血液凝固的方法或用于治疗血友病的方法的形式提供，并且可以参考前面的描述。
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用本发明的组合物以有益的方式改善或改变疾病症状的任何作用。使用根据本发明方法的对象可以是灵长类动物包括人类，但不限于此。
在下文中，将呈现有助于理解本发明的实施例。然而，提供以下实施例仅仅是为了更容易理解本发明，并且本发明不限于以下实施例。
实施例
实施例1.单链FVIII的构建
为了制备具有高表达率同时保留人FVIII固有特性的单链形式的人FVIII(单链FVIII，scFVIII)，通过修改FVIII的包含a3的B结构域的长度构建包含不同长度B结构域的重组scFVIII并对其进行表达，并分析其表达水平和活性(APTT，CS)。详细的方法和结果如下。
实施例1-1.scFVIII的制备
为了构建以单链形式表达的FVIII，构建了其中包含弗林蛋白酶切割位点，即第1648位残基(基于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其代表全长FVIII氨基酸序列)的B结构域的一部分缺失的FVIII。由于连接重链和轻链的B结构域的长度可能影响FVIII的最终活性和特性，因此如表1中所示构建了总共7种类型的FVIII，用于确定包含在scFVIII中的B结构域的长度。构建每个scFVIII，使得其包含从B结构域的N末端(SEQ ID NO：1的第741位氨基酸残基)计的特定长度的B结构域，并且B结构域包含最初原样存在的糖链。
另外，为了通过使由连接轻链和重链区的B结构域引起的结构干扰最小化而赋予类似于野生型FVIII活性的性质，还制备了其中包含比其他scFVIII更多的与轻链结构域相邻的a3结构域部分的结构(SEQ ID NO：6)。此外，为了提高在CHO细胞中的表达，制备用CHO密码子优化的scFVIII(SEQ ID NO：15)。
基于人FVIII核酸序列(NM000132)合成包含部分缺失的B结构域的每个scFVIII。为了制备scFVIII基因表达载体，编码G1蛋白序列(前导序列-重链-B结构域(第741至764，1653至1689位)-轻链)，并基于人FVIII核酸序列(NM000132)通过GeneArt合成整个基因以包含5′端的NotI-AsisI酶切割位点和3′端的XhoI-PacI酶切割位点。通过将合成的基因克隆到pcDSW载体的NotI/XhoI位点中来构建pcDSW-G1表达载体。通过使用AsisI/PacI酶切割的条带的大小比较确定了表达载体构建的准确性。然后，通过GeneArt合成对应于其中缺失B结构域的每个scFVIII的每个基因(G2、G3、G4、G4-flex、G6)，以包含从存在于FVIII重链的A2结构域的BamHI位点(GGATCC)至轻链末端处的PacI酶切割位点的序列。然后，使用酶BamHI/PacI从先前制备的pcDSW-G1表达载体中去除预先存在的FVIII区，并用BamHI/PacI酶切割合成的基因并将其克隆到pcDSW-G1表达载体的BamHI/PacI位点中，以构建pcDSW-scFVIII表达载体。通过用BamHI/PacI酶切割后的大小比较确定了表达载体构建的准确性。对于scFVIII(G6_opt)，为了提高表达，通过GneArt进行密码子优化和基因合成以包含5′处的NotI-AsisI切割位点和3′处的XhoI-PacI切割位点，并且以适合于动物细胞表达。将合成的基因克隆到pcDSW载体的NotI/XhoI位点中以构建表达载体。通过用BamHI酶切割后的大小比较确定了表达载体构建的准确性。
表1.在本发明中构建的包含不同长度B结构域的scFVIII
*基于SEQ ID NO：1的序列进行描述
**CHO细胞的密码子优化
实施例1-2.scFVIII表达和活性测量
scFVIII表达
将实施例1-1中构建的scFVIII在细胞中表达，并将细胞在细胞培养基中培养。首先，对于表达，使用Expi293FTM表达系统试剂盒(Thermofisher Co.，目录号A14635)(瞬时表达系统)，将实施例1-1中构建的表达载体转染到Expi293FTM细胞中。在转染前24小时，使用Expi 293培养基，根据预期的所需量，将Expi293FTM细胞以2.0×106个细胞/mL的浓度进行传代培养，并且在转染当天，测量细胞数和细胞生存力，并且如果细胞生存力为95％或更高，则进行转化。将7.5×107个细胞添加至具有Expi293培养基的125mL烧瓶中至最终体积为25.5mL(基于30mL)。将30μg实施例1-1中构建的表达载体与Opti-MEM混合以获得1500μl的总体积。将80μl转染试剂与Opti-MEM混合至总体积为1500μl，并在室温下孵育5分钟。5分钟后，将包含转染试剂的Opti-MEM添加至包含DNA的Opti-MEM，并轻轻地使生成物混合。将反应在室温下进行20至30分钟。将3mL的DNA：转染试剂复合物逐滴添加至预先制备的125mL烧瓶的Expi293FTM细胞(总体积：28.5mL)，并将细胞在37℃下，5％CO2摇动培养箱中以125rpm孵育。16至20小时之后，分别向其中添加150μl和1.5mL的增强剂1和增强剂2，并将细胞在34℃下和5％CO2的摇动培养箱中以125rpm培养。在培养的第三天，收获培养基并如下测量scFVIII的活性。
表达的scFVIII活性的测量
目前，临床上使用两种类型的重组FVIII，全长FVIII和具有缺失的B结构域的FVIII。然而，这两种重组FVIII在活性和效力方面是否在临床上等同的问题已经提出(GRUPPO，R.A.等，2003.Comparative effectiveness of full-length and B domaindeleted Factor VIII for prophylaxis-a metaanalysis.Haemophilia，9，251-60；LOLLAR，P.2003.The Factor VIII assay problem：neither rhyme nor reason.J ThrombHaemost，1，2275-9；MIKAELSSON，M.等，2001.Measurement of Factor VIII activity ofB domain deleted recombinant Factor VIII.Semin Hematol，38，13-23)。
发现，通过凝集测定(APTT)测量的BDD-FVIII活性比通过显色测定(CS)测量的活性低达50％，而全长形式的FVIII活性在两次测量中相似(BARROWCLIFFE等，SEMIN THROMBHEMOST，卷28(3)，2002：47-56)。BDD在凝集测定中的低活性已被认为是在实际的长期预防中BDD-FVIII在预防血友病A患者出血方面比全长FVIII效力较差的原因(GRUPPO，R.A.等，2003.Comparative effectiveness of full-length and B domain deleted FactorVIII for prophylaxis--a metaanalysis.Haemophilia，9，251-60；GRUPPO，R.A.等，2004.Meta-analytic evidence of increased breakthrough bleeding duringprophylaxis with B domain deleted Factor VIII.Haemophilia，10，747-50；GRUPPO，R.A.等，2004.Increased breakthrough bleeding during prophylaxis with B domaindeleted Factor VIII-a robust metaanalytic finding.Haemophilia，10，449-51)。
因此，在本发明中，为了选择具有与全长重组FVIII类似的比活性(CS，APTT)和比活性比(APTT/CS)的scFVIII，对于实施例1-1中构建的每种scFVIII，对通过CS和凝集测定(APTT)测量的比活性和比活性比(APTT/CS)进行分析，并将结果用作scFVIII选择的标准。作为比较组，使用与体内实际FVIII类似的全长和双链形式的重组FVIII(Baxalta)产品作为对照进行比较。
具体地，在此使用的FVIII活性测量测试方法是一步法和显色法。一步法是通过将FVIII缺乏的血浆、活化剂、磷脂和FVIII样品混合，并随后测量血液凝固时间来测量样品的FVIII活性的方法。显色方法是这样的方法：其中将FIXa、FX、凝血酶、钙、磷脂和FVIII样品混合，并随后添加由FXa切割时形成颜色的显色底物以测量FVIII样品活化的FXa的量，并根据显色底物的颜色形成程度测量FVIII的活性。这两种方法的区别在于，一步法使用FVIII缺乏的血浆并测量凝血时间，而显色法不使用FVIII缺乏的血浆，但仅在添加活化FVIII所需的因子和用于测量活化的FVIII的底物之后测量底物的颜色形成程度。
使用之前在ACL TOP CTS 500仪器中准备的自动化测定方法，如下进行通过一步法的活性测量。使用FVIII缺乏的血浆将样品稀释至1IU/mL，并将标准样品放入NIBSCFVIII标准小瓶中并通过向其中添加1mL蒸馏水使其溶解，并随后使用FVIII缺乏的血浆稀释至1IU/mL。根据实验设备的架类型制备消耗试剂和测量样品。将氯化钙小瓶连续放入ACLTOP CTS 500设备的R架中，以使得可以识别小瓶的条形码，并将磁力搅拌棒放入APTT-SP小瓶中，然后将小瓶放入R架中，以使得可以识别小瓶的条形码。根据样品数量×400μl(每个样品)制备FVIII缺乏的血浆，并将胶带放置在它们的条形码周围，以使得条形码不能被识别，并随后放入R架中。向DA架中放入包含添加有2.63mL白蛋白的G.O.缓冲液(咪唑3.4g，NaCl 5.8g，1L，pH 7.4)的小瓶。将400μl或更多样品和之前制备的标准样品放入样品杯中之后，然后将样品杯放入样品架中。在ACL TOP程序中，输入未被识别试剂和测量样品的信息，并实施之前准备的自动测定方法。在37℃下，如下进行自动测定方法中的所有反应。首先，用GO.缓冲液将测量样品预稀释10倍，并随后将样品分别进一步稀释1、3和10倍，以制备100％、33.33％和10％的样品。将50μl每种稀释样品静置30至45秒，将其与50μl FVIII缺乏的血浆混合，并随后静置60至70秒。添加50μl中间试剂APTT-SP之后，将生成物静置300至340秒，并且最后向其中添加50μl起始试剂(APTT-SP CaCl2)，然后测量凝血时间。
对于通过显色法测量的活性，使用CHROMOGENIX Co.售出的显色测定试剂盒作为终点法，并且通过将制造商提供的测试方法修改为适合于本测试如下来进行测试。具体地，使用1×稀释缓冲液将样品稀释至标准范围(0.25至1IU/mL)内。使用1×稀释缓冲液制备浓度为0、0.25、0.5和1IU/mL的校准血浆。将制备的样品和10μl校准血浆用790μl的1×稀释缓冲液稀释，并将50μl经稀释的样品分配到96孔板中并使其在37℃下静置5分钟。使用自动分配器移液管将50μl因子试剂分配到各个孔中，然后使其在37℃下反应2分钟。将50μl底物分配到各个孔中，然后使其在37℃下静置2分钟用于颜色形成。通过向显示颜色形成的样品添加50mL的2％柠檬酸来终止反应。在405nm波长处测量吸光度以绘制线性校准曲线，并将样品的吸光度代入校准曲线以测量样品的活性。
测量结果如表2中所示。
表2.表达的重组scFVIII的活性测量结果
作为表达的结果，发现培养液中的scFVIII表达水平随着B结构域的长度增加而提高，并且B结构域为198个氨基酸或更多的scF4、scF5、scF6和scF7的表达水平显著提高。另外，B结构域长度为92个氨基酸或更长的scF3、scF4、scF5、scF6和scF7显示出与用作比较的对照的重组形式的全长FVIII(Baxalta产品)类似的比活性，并且还显示与用作对照的类似的APTT/CS比值。另一方面，B结构域短于128个氨基酸蛋白质序列的上述实施例的scF1、scF2和scF3显示出显著更低的表达水平，并且B结构域短于84个氨基酸蛋白质序列的上述实施例的scF1和scF2显示出比用作比较的对照的全长FVIII显著更低的比活性。
在活化步骤中，在包含连接重链和轻链的B结构域的位点处通过凝血酶切割来活化单链FVIII。当作为重链和轻链之间连接位点的B结构域的长度短时，认为由于短连接的结构限制，单链FVIII通常不会转换为活性形式FVIII，这可能会影响其活性。然而，在双链FVIII的情况下，认为不存在这样的结构限制，因此无论B结构域的长度如何，凝血酶诱导的活化都是顺利的，从该发现可以明显看出，其中已经完全去除预先存在的B结构域的双链FVIII的活性显示出与全长FVIII相似的活性。在本发明中，通过出乎意料的努力，选择单链FVIII的B结构域的长度和序列，以免影响凝血酶活化，并且以与天然型(即野生型)FVIII相似的方式活化重链和轻链之间的凝血酶活化位点(第1689至1690和740至741位；基于SEQID NO：1的序列)，以获得显示与用于比较的全长FVIII相似的比活性的单链FVIII。
实施例1-3.构建的scFVIII的表达模式分析
通过Western印迹分析确定本文构建的单链FVIII在培养物中的稳定性。
为此，将培养液和LDS样品缓冲液以3∶1的比混合，将其与4％至12％bis-tris(BT)凝胶混合以制备样品，并且加载30μl样品并以150伏运行约1小时。将完成运行的凝胶转移至硝酸纤维素(NC)膜后，将凝胶置于封闭缓冲液(Thermo Scientific)中1小时。通过在TBST缓冲液中进行稀释来制备识别FVIII的重链(GMA-012，Green Mountain Antibodies)和轻链(ab41188，Abcam)的一抗，并随后将其添加至完成封闭的NC膜，并反应1小时。用TBST缓冲液以5分钟的间隔洗涤膜三次之后，使在TBST缓冲液中稀释的二抗(山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物)与NC膜反应10分钟。并随后使用TBST缓冲液以5分钟的间隔洗涤膜5次。在将ECLPrime Western Blotting检测试剂分散至NC膜以使膜形成颜色后，将膜在暗室中在Hyperfilm ECL(GE healthcare)中显影。结果，如图3中所示，发现以单链形式产生的所有FVIII都以单链形式表达。另外，发现分泌到培养基中的具有较短长度B结构域的单链FVIII显示出在培养基中分解较少且稳定性较高。其中B结构域相对短的scF1、scF2和scF3显示出对scF4、scF5、scF6和scF7的优异稳定性，但显示出相对低的表达水平或低的比活性。
在本发明中，构建具有来源于天然型双链FVIII的不同长度的B结构域的单链FVIII，并分析它们的特性。评估B结构域长度对表达水平、比活性和稳定性的影响，从而制备具有与天然型FVIII相似的活性特征并显示高表达水平的重组单链FVIII。
实施例2.scFVIII的聚乙二醇化
聚乙二醇化位置的选择
由于包含部分B结构域的单链FVIII中B结构域的序列和长度通过影响FVIII的活性特征而影响重组凝血FVIII的活性和特征，因此在该实施例中，基于实施例1中制备的scFVIII(其包含具有能够保留天然型双链FVIII的活性特征的长度和序列的B结构域)来选择聚乙二醇化位置，以提供体内持久性。
为了优化B结构域中的聚乙二醇化反应效率，在B结构域的多个位置进行聚乙二醇化。由于聚乙二醇化靶向蛋白质的表面残基，需要B结构域的三维结构来选择聚乙二醇化位置，但B结构域的结构未知，使得难以选择聚乙二醇化位置。在B结构域的糖链周围选择性地对本发明中选择的B结构域的聚乙二醇化位置进行聚乙二醇化。也就是说，糖链位于蛋白质结构之外，并且B结构域中糖链周围的残基可能总是向外指向，这被认为对聚乙二醇化是有利的。然而，存在一个问题，越接近糖链聚乙二醇化就越困难，这可能是由于糖链的空间位阻干扰PEG的进入。在本发明中，通过出乎意料的努力选择位于与糖链适当距离处的糖链附近的残基，其在B结构域的蛋白质结构中向外指向并且不受糖链的空间位阻，从而确保高的聚乙二醇化效率。
在该实施例中，如表3和图4中所示，产生重组scFVIII，所述重组scFVIII是其中在基于实施例1中构建的G4的B结构域的糖链附近的多个位置中，即基于N-糖链的第+6和-6位残基之间引入半胱氨酸，并且对引入的半胱氨酸选择性地进行聚乙二醇化。已对于G4和单链FVIII描述了这样的聚乙二醇化，但其也可以应用于包含本文用相同逻辑构建的糖链的其他scFVIII的聚乙二醇化。
实施例2-1.特定位点被半胱氨酸替换的scFVIII表达载体的构建
由GeneArt合成基因，以包含从存在于包含半胱氨酸替换位点的FVIII重链A2结构域中的BamHI位点(GGATCC)至轻链的序列，和PacI酶切割位点。然后，使用酶BamHI/PacI从实施例1-1中产生的pcDSW-scFVIII G4表达载体中去除预先存在的相应FVIII区，并将合成的基因克隆到BamHI/PacI位点中以构建被半胱氨酸替换的pcDSW-scFVIIIG4(B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、A3-1或4L)表达载体。通过序列分析确定了表达载体构建的准确性。另外，对于scFVIII G4(A2-1、A2-2或A2-3)，该基因由GeneArt合成，以包含从存在于包含半胱氨酸替换位点的FVIII重链的A1结构域中的AsisI酶切割位点至存在于FVIII重链的A2结构域中的KpnI位点(GGTACC)的序列。然后，使用酶AsisI/KpnI从实施例1-1中产生的表达载体pcDSW-scFVIII G4中去除预先存在的相应FVIII区，并将合成的基因克隆到AsisI/KpnI位点中以构建被半胱氨酸替换的pcDSW-scFVIIIG4(A2-1、A2-2或A2-3)表达载体。通过序列分析确定了表达载体构建的准确性。
使用向其中引入半胱氨酸的构建的mscFVIII表达载体，通过与实施例1-2中相同的方法进行瞬时表达。引入半胱氨酸的FVIII的每种表达水平示于下表3中。如表3中所示，发现在B结构域的聚糖链周围引入半胱氨酸的scFVIII突变体在培养液中正常表达。其表达水平稍微低于引入半胱氨酸之前的scFVIII，表明引入scFVIII的半胱氨酸影响表达过程和scFVIII在培养液中的稳定性。
实施例2-2.聚乙二醇化
为了筛选聚乙二醇化位置，如下进行如实施例2-1中的引入半胱氨酸的scFVIII突变体的聚乙二醇化。用5kDa MWCO(截止分子量)将50mL细胞培养液浓缩20倍，并向其中添加5M NaCl浓缩溶液至终浓度为1M NaCl。将用平衡缓冲液(20mM组氨酸，500mM NaCl，0.1％(w/v)80，pH 7.0)平衡的0.1mL体积的V8选择树脂(GE)和浓缩的样品一起充分搅拌，用平衡缓冲液洗涤，并用洗脱缓冲液(20mM组氨酸，500mM NaCl，0.1％(w/v)80，pH 7.0，50％(v/v)丙二醇)洗脱。使用5kDa MWCO膜将洗脱的样品与聚乙二醇化缓冲液(20mM组氨酸，500mM NaCl，0.1％(w/v)80，pH 7.0，5％(w/v)蔗糖)交换，然后最终以0.2mM处理TCEP，并在4℃下反应1小时。然后，为了去除反应物的TCEP，用聚乙二醇化缓冲液(20mM组氨酸，500mM NaCl，0.1％(w/v)80，pH 7.0，5％(w/v)蔗糖)对样品进行脱盐，然后以1∶20(scFVIII：马来酰亚胺PEG 40kDa)的摩尔比添加马来酰亚胺PEG 40kDa(NOF)，并使生成物在4℃下反应1小时。
在其中引入半胱氨酸的scFVIII突变体中，当通过细胞培养物表达时，半胱氨酸被具有二硫键的半胱氨酸或谷胱甘肽掩蔽。因此，应去除掩蔽半胱氨酸和谷胱甘肽以进行聚乙二醇化。在本发明中，添加TCEP(三(2-羧乙基)膦)以去除掩蔽半胱氨酸的游离巯基的半胱氨酸或谷胱甘肽，并通过脱盐柱(PD10)去除TCEP。并且然后，将生成物用马来酰亚胺-PEG(40kDa)处理并进行聚乙二醇化。
对聚乙二醇化反应物进行SDS PAGE以分析聚乙二醇化程度。
结果示于图6中。发现，其中引入半胱氨酸的G4scFVIII突变体在培养液中以活性形式表达，并且聚乙二醇化容易地进行。根据半胱氨酸的引入位点，表达水平和聚乙二醇化率存在差异，这被认为是由于FVIII的稳定性和聚乙二醇化反应的差异取决于引入半胱氨酸的位点。
[表3]其中scFVIII缀合位点被cys替换的突变体的表达水平和聚乙二醇化率。
*：上表3中的残基基于SEQ ID NO：1的序列
实施例3.聚乙二醇化scFVIII的产生
在该实施例中，如下产生在实施例2中选择的位点处聚乙二醇化scFVIII。另外，产生聚乙二醇化scFVIII，并评价它们在体内作为长效型凝血FVIII的活性和聚乙二醇化对凝血FVIII活性的作用。产生G4和B3的位点特异性缀合物，其中G4和B3是其中scFVIII的B结构域中第782位的异亮氨酸被半胱氨酸替换的scFVIII，并且通过CS和OS(APTT)方法测量它们的活性，并与为双链形式重组凝血FVIII的进行比较。
实施例3-1.细胞培养
将其中引入半胱氨酸并在实施例2-1中构建的scFVIII G4(B3)和scFVIII G4(A2_1)在每个细胞中表达并培养。特别地，为了表达，使用Expi293FTM表达系统试剂盒(Thermofisher，目录号A14635)根据制造商的方法将实施例2-1中构建的表达载体转染到Expi293FTM细胞中。总之，在转化时测量细胞数目和生存力，并且当细胞生存力为95％或更高时进行转化。将Expi293培养基添加至125mL烧瓶，以获得7.5×107个细胞的浓度，将其调节至25.5mL。将30μg实施例2-2中构建的表达载体与Opti-MEM混合至总体积为1500μl。将80μl转染试剂与Opti-MEM混合至总体积为1500μl，并在室温下孵育5分钟。5分钟后，将包含转染试剂的Opti-MEM添加至包含DNA的Opti-MEM，并轻轻地使生成物混合。将反应在室温下进行20至30分钟。将3mL的DNA：转染试剂复合物逐滴添加至预先制备的125mL烧瓶的Expi293FTM细胞(总体积：28.5mL)，并将细胞在37℃下，5％CO2摇动培养箱中以125rpm孵育。16至20小时之后，分别向其中添加150μl和1.5mL的增强剂1和增强剂2，并将细胞在34℃下和5％CO2的摇动培养箱中以125rpm培养。在培养的第二天，将所有细胞离心并完全去除预先存在的培养基。将细胞完全重悬于30mL新培养基中，并在34℃下，5％CO2摇动培养箱中以125rpm培养。在转染的第3天，将表达scFVIII的细胞全部离心并回收培养液。将培养基回收后剩余的细胞重悬于相同体积的新培养基中，并在34℃下培养1天。重复该过程直至转染的第5天，并回收转染第3天、第4天和第5天的培养液，以进行引入半胱氨酸的scFVIII的活性分析和纯化。
实施例3-2.聚乙二醇化和纯化
聚乙二醇化和纯化过程由五个步骤构成。合并实施例3-1中培养基第3天、第4天和第5天的培养液以进行纯化。
在第一步中，使用由GE Inc.开发的用于纯化的VIIISelect树脂进行从培养基中分离并纯化FVIII的过程。将VIIISelect树脂塞进柱中，并用2％柠檬酸洗涤柱。通过使平衡缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl2，1M NaCl，0.02％80，pH 7.0)流动来使其平衡。将5M NaCl缓冲液添加至培养液至终浓度为1M NaCl，然后滴定至pH 7.0，并加载到柱上。加载培养液后，通过使平衡缓冲液流动来使其平衡，直至UV降至基线。通过使洗脱缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl2，0.9M精氨酸，45％丙二醇，0.02％80，pH 6.5)流动来快速洗脱scFVIII。
并且，在第二步中，使用来自GE Inc.的SP快速流动树脂进行快速去除在第一步中混合在洗脱液中的丙二醇的过程。在将SP快速流动树脂塞进柱中之后，通过使洗涤缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)流动来洗涤柱。通过使平衡缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl2，0.02％80，pH 7.0)流动来使其平衡。将VIIISelect过程中的洗脱液用平衡缓冲液稀释10倍，滴定至pH 7.0，并加载到柱上。加载后，通过使平衡缓冲液流动来使其平衡，直至UV降至基线。通过使洗脱缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl2，400mM NaCl，0.02％80，pH6.5)流动来快速洗脱scFVIII。
在第三步中，进行将PEG与经纯化的scFVIII缀合的过程。将TCEP添加至经纯化的scFVIII溶液至终浓度为0.1mM，并使其在4℃下静置1小时以还原插入的半胱氨酸。使用用聚乙二醇化缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl2，200mM NaCl，0.02％80，pH 7.0)平衡的PD-10柱(GE healthcare)去除残留的TCEP。将其在4℃下静置2小时以氧化经还原的FVIII本身的二硫键。对于与scFVIII G4(B3)的PEG缀合，以PEG与蛋白质比为1∶20来添加在DMSO中溶解的40-kDa支化型甲氧基马来酰亚胺PEG溶液(50mg/mL)，并随后使生成物在4℃下静置12至16小时。使用60kDa支化形式的甲氧基马来酰亚胺PEG进行scFVIII G4(A2_1)PEG连接。
并且，在第四步中，使用GE Inc.的SP快速流动树脂进行去除不含PEG的scFVIII和含有两种或更多种PEG的scFVIII的过程，其是在聚乙二醇化过程中形成的杂质。将SP快速流动树脂塞进柱中，并用洗涤缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)洗涤以洗涤柱。添加平衡缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl2，0.02％80，pH 7.0)以达到平衡。用平衡缓冲液将聚乙二醇化FVIII稀释10倍，滴定至pH 7.0，并加载到柱上。加载后，使平衡缓冲液流动直至UV降至基线，以达到平衡。逐步提高洗脱缓冲液(20mM组氨酸，5mM CaCl2，50至400mM NaCl，0.02％80，pH 6.5)的NaCl浓度的同时，选择性洗脱PEG-scFVIII。
最后，在第五步中，浓缩在第四步中洗脱的PEG-scFVIII。为此，使用MilliporeCo.的amicon 30kDa将PEG-scFVIII浓缩至25IU/mL。
实施例3-3.活性测量
通过CS和APTT方法测量实施例3-2中使用的经纯化的聚乙二醇化scFVIII(PEG-scFVIII-B3和PEG-scFVIII-A2-2)的活性。通过与实施例1-2中所述相同的方法进行CS测试，并通过修改实施例1-2中所述的方法进行APTT测试。已知当通过APTT方法测量聚乙二醇化FVIII的活性时，如果使用胶体硅系列的APTT-SP作为活化剂，则在分析后获得低于初值的活性值，而如果使用鞣花酸系列的synthAFax(IL)，则测量正常活性(Gu.J.M.等，2014.Evaluation of the activated partial thromboplastin time assay forclinical monitoring of PEGylated recombinant Factor VIII(BAY 94-9027)forhaemophilia A.Haemophilia，20，593-600)。考虑到聚乙二醇化scFVIII的特性，使用SynthAFax作为APTT测试中的活化剂。将与实施例1-2中相同的方法用于其他测试方法。结果示于表4中。
[表4]
作为该实验的结果，发现PEG-scFVIII-B3、PEG-scFVIII-A2-2的APTT/CS比值(APTT/CS)与的相似，但与Xyntha的不同，是包含全长B结构域的双链FVIII，其用作比较物质，Xyntha是从中去除B结构域的双链FVIII。考虑到天然型FVIII的活性在CS和APTT中几乎相同，结果表明，由于单链形成和聚乙二醇化，本发明产生的scFVIII蛋白质没有显示出凝血FVIII的活性特征的变化。Xyntha是B结构域被完全从中去除的重组FVIII，并且在该实施例中，其凝血活性(APTT)与在CS中的相比降低，这与之前报道的“当完全去除B结构域时，凝血活性降低”一致。考虑到PEG-scFVIII-B3和PEG-scFVIII-A2-2即使在单链形成和聚乙二醇化后也保持凝血活性，根据本发明的这两种物质被认为具有作为血友病治疗剂的优点。
实施例4.动物PK测试
在11至12周龄的血友病A小鼠模型(B6；129S4-F8tm1Kaz/J(FVIII-敲除))中，将聚乙二醇化scFVIII的半衰期与比较物质的半衰期进行比较，该模型从宾夕法尼亚大学(Pennsylvania University)分发、繁殖并通过基因分型确定。测试物质是G4，其是scFVIII；PEG40kDa-G4scFVIII-B3，其在G4的B结构域的第782位异亮氨酸被半胱氨酸替换之后用40kDa支化PEG马来酰亚胺进行位置特异性聚乙二醇化(参见实施例3)；PEG60kda-G4scFVIII-A2-2，其在G4的A2结构域中的第495位缬氨酸被半胱氨酸替换之后用60kDa支化的PEG马来酰亚胺进行位置特异性聚乙二醇化；以及其是双链重组FVIII。
用于药物药代动力学的测试动物是血友病小鼠(雌性)，并且将每个样品以125IU/kg的水平施用于3只动物的尾静脉中。在施用之后的每个时间点(5分钟、4小时、8小时、16小时、24小时、32小时、40小时、48小时、56小时和72小时)从眼眶收集血液样品，用抗凝剂(3.2％柠檬酸钠)处理10％，并离心以去除血浆。如实施例1-2中所述，使用CS测定试剂测量血浆中存在的FVIII的活性。每次从每个样品组中的小鼠收集的血浆中FVIII活性平均值的谱示于图7中。
对于PK参数分析，使用WinNonlin软件通过NCA(Non Compartmental Analysis，非房室分析)方法计算血浆中FVIII CS活性测量值的平均值和标准偏差，并且结果示于表5中。发现药物的半衰期顺序如下： (表5)。当根据平均数据进行评价时，基于药物B3、A2-2和G4的半衰期分别提高了约1.9倍、约1.8倍和约1.2倍(表5)。
[表5]PK结果
实施例5.动物PD测试(长期)
如下测量关于小鼠尾部出血的凝固作用。
实验概要示于图8a中。具体地，将11至12周龄的雄性C57BL/6小鼠(由OrientBiotech提供)和从宾夕法尼亚大学分发、繁殖并通过基因分型确定的血友病A小鼠(B6；129S4-F8tm1Kaz/J(FVIII敲除)，FVIII KO小鼠)用于测试。使C57BL/6小鼠接受7天的适应环境过程。在测试当天，将盐水装入15mL锥型管中至14mL(x1/大鼠)，并将管浸入加热的水浴中以将盐水的温度调节至37℃。在施用测试物质之前测量并记录小鼠的重量。以60mg/kg的浓度腹膜内施用Entobar(戊巴比妥钠)以使小鼠麻醉。在基于小鼠的重量(19至25g)计算测试物质的剂量后，将测试物质施用到颈静脉中。施用之后5分钟，在距离末端4mm的点处切割小鼠的尾部。将约2cm的小鼠尾部切口立即浸泡在含有盐水的锥型管中，并收集血液30分钟。
测试物质是实施例3中制备的PEG-scFVIII-B3，将其与进行比较。每个测试物质组中包括的小鼠的剂量(剂量和剂量体积)和分布示于下表6中。
[表6]
将从每只小鼠收集30分钟的血液以1500x g离心5分钟，并去除上清液，然后使用10mL移液管将三级蒸馏水添加到锥型管至10mL，然后使用涡旋使血液完全溶血。根据血红蛋白测定试剂盒(Sigma，MAK115-1KT)提供的手册进行失血测量。总之，将0.9mL三级蒸馏水和0.1mL溶血样品放入1.5mL eppendorf管中并充分混合用于10倍稀释。将50μl三级蒸馏水和50μl校准物放入96孔板(重复)中，并在其上添加200μl三级蒸馏水。将50μl每种小鼠溶血样品放入孔(重复)中，并在其上添加200μl试剂。轻轻敲打96孔板，以使得放入的物质可以充分混合，并使用Multimode板阅读仪在400nm处测量吸光度。
使用单因素ANOVA和GraphPad Prism ver 5.01的Dunnett多重比较检验，将吸光度值与失血值(Hb nmol)进行统计学比较。p值大于0.05被认为是统计学非显著性差异，并且p值小于0.05被认为是统计学显著性差异。
测试结果表明，与HA组的失血值相比，施用40kDaPEG-G4scFVIII-B3和50、100和200IU/kg的组均显示出统计学显著性差异。向HA小鼠施用40kDa PEG-G4scFVIII-B3和然后进行急性尾部剪切测试。结果发现，两种测试物质均以浓度依赖方式降低了失血量(参见图8b)。
总之，在本发明中，为了选择表达优异、具有最大的天然FVIII活性、并且稳定(以使得可以防止其在培养基中的分解)的scFVIII，制备并表达包含不同长度和序列的B结构域的scFVIII，比较它们彼此的活性，并随后通过确定它们的稳定性来开发具有作为血友病A型治疗剂的有用特性的scFVIII。另外，基于本发明开发的scFVIII，制备多种聚乙二醇化缀合物，从而开发具有提高的半衰期的FVIII聚乙二醇化缀合物，从而改善作为治疗剂的有用性。
虽然已经关于以上具体实施方案描述了本发明，但应认识到，使用本领域技术人员可以做出的如权利要求书中限定的本申请的基本概念的各种修改和变化也属于本发明的范围。
除非另有说明，否则本发明中使用的所有技术术语具有与本领域技术人员理解的相同含义。将本说明书中公开的所有出版物的内容作为参考文献并入本发明中。
Claims (23)
1.单链凝血因子VIII(因子VIII)，其包含人因子VIII的重链、轻链和部分缺失的B结构域片段，其中所述部分缺失的B结构域片段缺少从SEQ ID NO：1的第1648位残基至N-末端方向的至少5个氨基酸和从SEQ ID NO：1的第1649位残基至C-末端方向的至少5个氨基酸，以免包含弗林蛋白酶的切割位点，并且所述部分缺失的B结构域片段包含4至6个糖基化位点。
2.根据权利要求1所述的单链凝血因子VIII，其中所述部分缺失的B结构域片段包含15％至40％的野生型B结构域序列。
3.根据权利要求2所述的单链凝血因子VIII，其中基于SEQ ID NO：1的序列，所述部分缺失的B结构域片段具有以下序列：(i)第741至902和1654至1689位氨基酸残基；(ii)第741至965和1654至1689位氨基酸残基；或者(iii)第741至902、1637至1642和1654至1689位氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的单链凝血因子VIII，其中所述单链凝血因子VIII具有SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的序列，或者与其具有90％或更高序列同源性的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的单链凝血因子VIII，其中当通过CS或APTT方法测量时，所述单链凝血因子VIII的比活性是双链凝血因子VIII的90％或更高。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的单链凝血因子VIII，其中所述凝血因子VIII在A结构域和/或B结构域片段的一些氨基酸残基处与亲水性聚合物缀合；
基于SEQ ID NO：1的序列，所述B结构域片段的缀合位置是选自第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个，并且基于SEQ ID NO：1的序列，所述A结构域的缀合位置是选自第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个；并且
所述缀合位置的残基被半胱氨酸替换用于与所述亲水性聚合物缀合。
7.根据权利要求6所述的单链凝血因子VIII，其中所述亲水性聚合物包含聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷、葡聚糖或聚唾液酸，并且所述PEG通过丙烯酰基、砜或马来酰亚胺在所述位置处连接。
8.根据权利要求5所述的单链凝血因子VIII，其中所述PEG的平均分子量为20kDa或更高。
9.根据权利要求1所述的单链凝血因子VIII，其由SEQ ID NO：2至7中任一个的氨基酸序列表示。
10.根据权利要求9所述的单链凝血因子VIII，其具有这样的氨基酸序列，其中SEQ IDNO：2至7中根据权利要求6所述的缀合位置的残基被半胱氨酸替换。
11.核酸分子，其编码权利要求9或10所述的蛋白质。
12.根据权利要求11所述的核酸分子，其中编码权利要求9的蛋白质的所述核酸分子是SEQ ID NO：10至15中的任一个，并且编码权利要求10的蛋白质的所述核酸分子是SEQ IDNO：17至32中的任一个。
13.载体，其包含权利要求11或12所述的核酸分子。
14.细胞，其包含权利要求13所述的载体。
15.用于产生单链凝血因子VIII的方法，其包括：
将权利要求13所述的载体转染到真核细胞中；或者替代地，提供权利要求14所述的细胞；
通过在培养液中培养所述细胞来表达单链凝血因子VIII，其中通过半胱氨酸或谷胱甘肽用二硫键掩蔽引入所述单链凝血因子VIII中的半胱氨酸的游离巯基；
收集从所述培养液表达的单链FVIII，并用还原剂处理所述单链FVIII，以释放掩蔽的半胱氨酸或谷胱甘肽；以及
用聚乙二醇化缓冲液处理该经处理的培养液。
16.单链凝血因子VIII，其包含人因子VIII的重链、轻链和部分缺失的B结构域片段，其中所述部分缺失的B结构域片段不包含弗林蛋白酶的切割位点，但包含至少4个糖基化位点；并且
其中基于SEQ ID NO：1的序列，所述部分缺失的B结构域片段具有以下序列：(i)第741至902和1654至1689位氨基酸残基；(ii)第741至965和1654至1689位氨基酸残基；或者(iii)第741至902、1637至1642和1654至1689位氨基酸残基。
17.单链凝血因子VIII，其包含人因子VIII的重链、轻链和部分缺失的B结构域片段，其中所述部分缺失的B结构域片段不包含弗林蛋白酶的切割位点，但包含至少4个糖基化位点；
其中基于SEQ ID NO：1的序列，所述部分缺失的B结构域片段具有以下序列：(i)第741至902和1654至1689位氨基酸残基；(ii)第741至965和1654至1689位氨基酸残基；或者(iii)第741至902、1637至1642和1654至1689位氨基酸残基；并且
其中A结构域和/或B结构域的一些残基是聚乙二醇化的；并且
其中，基于SEQ ID NO：1的序列，聚乙二醇化残基在所述B结构域中的位置是选自第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个；并且基于SEQ ID NO：1的序列，聚乙二醇化残基在所述A结构域中的位置是选自第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个。
18.根据权利要求17所述的单链凝血因子VIII，其中所述聚乙二醇化残基被半胱氨酸替换。
19.单链凝血因子VIII，其包含人因子VIII的重链、轻链和部分缺失的B结构域片段，其中所述部分缺失的B结构域片段不包含弗林蛋白酶的切割位点，但包含至少4个糖基化位点；
其中基于SEQ ID NO：1的序列，所述部分缺失的B结构域片段具有以下序列：(i)第741至902和1654至1689位氨基酸残基；(ii)第741至965和1654至1689位氨基酸残基；或者(iii)第741至902、1637至1642和1654至1689位氨基酸残基；
其中A结构域和/或B结构域的一些残基是聚乙二醇化的；
其中，基于SEQ ID NO：1的序列，聚乙二醇化残基在所述B结构域中的位置是选自第754、781、782、788、789、825和897位氨基酸残基中的至少一个；并且基于SEQ ID NO：1的序列，聚乙二醇化残基在所述A结构域中的位置是选自第491、495、498和1806位氨基酸残基中的至少一个；并且
其中所述聚乙二醇化残基被半胱氨酸替换。
20.用于治疗血友病的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1至10或16至19中任一项所述的单链凝血因子VIII。
21.用于血液凝固的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1至10或16至19中任一项所述的单链凝血因子VIII。
22.用于治疗血友病的组合物，其包含权利要求1至10或16至19中任一项所述的单链凝血因子VIII和可药用载体。
23.权利要求1至10或16至19中任一项所述的单链凝血因子VIII用于治疗血友病的用途。
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2021
- 2021-04-07 JP JP2021065146A patent/JP2021118696A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008005847A2 (en) * | 2006-06-30 | 2008-01-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| WO2014008480A2 (en) * | 2012-07-06 | 2014-01-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HONGZHI Z. MIAO等: "Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion", 《BLOOD》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| EP3476860A1 (en) | 2019-05-01 |
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Legal Events
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