JP2019527541A - 組換え型一本鎖ｆｖｉｉｉおよびその化学コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本出願は、少なくとも４つの糖鎖付加部位を含むように部分的に欠失されたＢ領域を含むが、フューリンにより切断される領域は含まない一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子、または、ＡまたはＢ領域がいくつかのペグ化された残基を有する一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子を提供する。本出願の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、完全な（intact）治療効果を有し、かつ、その一本鎖形態のために大量生産が容易に可能なだけでなく、ペグ化により延長されたインビボ半減期を有し、よって、血友病Ａの治療薬として患者の利便性を向上させ、生産コストを削減することにより医療費の削減をもたらす。

Description

技術分野
本発明は、血友病の治療のために用いられる組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質とその化学コンジュゲートの調製技術に関する。
背景技術
血友病は、凝固因子が欠如しているために出血が継続的に起こる疾病である。血液中の凝固因子は第Ｉ〜第ＸＩＩＩで構成される。その中で、血友病に関連する因子は、第ＶＩＩＩ、第ＩＸおよび第ＸＩである。血友病は、上記因子の遺伝的欠損により引き起こされる。欠損した凝固因子のタイプに応じて、血友病は、第ＶＩＩＩ因子が欠損している血友病Ａ、第ＩＸ因子が欠損している血友病Ｂ、および第ＸＩ因子が欠損している血友病Ｃに分類することができる。血友病Ａは、血友病の約８０〜８５％を占める。
血友病治療の目的は止血である。治療は、酵素補充療法（ＥＲＴ）を使用して、予防およびオンデマンド治療の２つの局面で行われる。現行の治療の傾向は、予防にシフトしている。
ＥＲＴに用いられるタンパク質治療薬としては、全血および血漿から抽出され濃縮されたＦＶＩＩＩ（血友病Ａ）およびＦＩＸ（血友病Ｂ）が過去に用いられていた。しかしながら、ヒト由来の原料を使用することから生じる副作用や合併症などの問題があった。そのため、最近は、組換えＤＮＡ技術により生産された様々な因子が開発され用いられている。感染症や合併症のリスクを軽減するＦＶＩＩＩもまた、組換えＤＮＡ技術によって生産されている。しかしながら、それは血液由来凝固因子ＦＶＩＩＩと同様短い半減期を有し、頻繁な投与を必要とするため、患者にとって不便である。それゆえに、長いインビボ半減期を有する様々なＦＶＩＩＩを開発することによって患者の生活の質を改善するための継続的な努力がなされてきた。
それらの１つが、ペグ化ＦＶＩＩＩであった。ペグ化ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩのインビボクリアランスに責任を負っていることが知られているＬＲＰ１（低密度リポプロテイン受容体関連タンパク質）の該ＦＶＩＩＩとの結合を低下させるために開発された。ペグ化ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩのクリアランスを防ぐことによってインビボ半減期を改善した。しかしながら、改善の程度は予想を下回っていた。ＦＶＩＩＩはｖＷＦと強く相互作用するので、ＦＶＩＩＩの大部分はｖＷＦと結合してインビボで存在する。そのため、ＦＶＩＩＩの半減期は、ＦＶＩＩＩに結合したｖＷＦのインビボ半減期によって決定される。この状況は、ペグ化ＦＶＩＩＩにも当てはまる。ペグ化ＦＶＩＩＩの半減期もまたペグ化後のｖＷＦの半減期によってコントロールされたため、ペグ化ＦＶＩＩＩの半減期の改善がｖＷＦの半減期を下回るという制限があった。
さらに、抗体のＦｃドメインがＦＶＩＩＩのＣ末端に融合したＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質（ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ）が開発されている。ＦＶＩＩＩ−Ｆｃは、ＦｃＲｎによるインビボリサイクリングにより、ＦＶＩＩＩよりも長いインビボ半減期を有する。しかしながら、ｖＷＦとの結合により、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃのインビボでの滞留時間もまた、ｖＷＦの半減期によりコントロールされた。
さらに、血友病Ａの治療のために、現在のＦＶＩＩＩ以外の他の経路を介してＦＶＩＩＩの血液凝固因子としての機能を代替するため、およびインビボで持続する効果および患者の利便性を促進するための、継続的な努力がなされている。
例として、ＦＩＸ（または活性化ＦＩＸ）およびＦＸに特異的な２種類のＦａｂを含有するインタクトＩｇＧ形態の二重特異性抗体であるＦＶＩＩＩミメティック二重特異性抗体が、インビボでのＦＶＩＩＩの機能を代替するように設計されている(Kitazawa et al, Nature medicine 2012 18 (10): 1570-4)。
別の例は、抗ＴＦＰＩ（組織因子経路インヒビター）の使用である。これはＴＦＰＩの機能を阻害する物質で、抗体やペプチドに加えてアプタマーの形態で開発されている(Hilden et al., BLOOD 2012, 119 (24): 5871-8)。ＴＦＰＩは、ＴＦ（組織因子）活性化ＦＶＩＩ複合体によるＦＸの活性化プロセスを阻害してＦＸａの産生を阻害し、それによってＦＸａによるトロンビンの産生を阻害して血液凝固の進行を停止させる。
抗トロンビンインヒビターも提案されている。これはトロンビンの活性を改善するために血中のトロンビンインヒビターの機能を阻害し、それによって血友病動物または血友病患者における血液凝固を促進する。
しかしながら、これらのアプローチは、血友病Ａまたは血友病ＢにおけるＦＶＩＩＩおよびＦＩＸタンパク質の欠損を直接置換または補足するものではないが、間接的にＦＶＩＩＩの活性を模倣またはバイパスするものである。これらのアプローチの作用機序は複雑であるため、臨床試験におけるそれらの安全性と有効性は十分に証明されるべきである。
韓国特許公開第２０１４−０１１４２６６号は、比活性が上昇した抗血友病第ＶＩＩＩ因子を開示している。
これまでに開発された治療薬は、機能面で投与（静脈内注射）の間隔が短く、短い半減期に起因する有効性の喪失により出血が頻発するという問題がある。また、生産性の面で、生産性の低さおよび治療コストの高さの問題も解決されるべきである。従って、半減期が改善され、高い生産性を有するＦＶＩＩＩの開発が必要である。
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、インビボでの滞留時間の改善を示し、大規模で簡単に産生することができる、一本鎖ＦＶＩＩＩを提供することである。
課題の解決
本発明の一実施形態によれば、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）の重鎖、軽鎖、および部分的に欠失しているＢドメイン断片を含む一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子であって、部分的に欠失しているＢドメイン断片が、フューリンプロテアーゼによる切断部位を含まないように、配列番号１の残基１６４８からＮ末端方向に少なくとも５つのアミノ酸と、配列番号１の残基１６４９からＣ末端方向に少なくとも５つのアミノ酸とを欠失し、かつ４〜６つの糖鎖付加部位を含有する一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子が、提供される。
本発明の一実施形態によれば、本発明の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子に含まれる部分的に欠失しているＢドメイン断片は、野生型Ｂドメイン配列の約１５％〜４０％を含むが、本発明の効果が達成される限り、これらに限定されない。当業者であれば、上述の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子に含まれるＢドメイン断片の条件を考慮して、適切な一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子を選択することができる。ここで、該Ｂドメインは、後述のａ３領域を含むと解釈される。
本発明の一実施形態によれば、上記条件を満たす部分的に欠失しているＢドメイン断片において欠失される部分は、連続的であっても非連続的であってもよく、部分的に欠失しているＢドメイン断片は、配列番号１の配列に基づく、（ｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９；（ｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９６５および１６５４〜１６８９；または（ｉｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２、１６３７〜１６４２、および１６５４〜１６８９の配列により表されてよい。
本発明の一実施形態によれば、本発明における一本鎖ＦＶＩＩＩは、配列番号２〜７で表されるアミノ酸配列を有する配列、またはそれと約９０％以上の相同性を有する配列を含み、該配列は、後述する相同性決定方法、および本発明の因子に関する開示、および生物学的機能的同等性とを参照することにより容易に決定することができる。
本発明の一実施形態によれば、配列番号２〜７で表されるアミノ酸配列を有する本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子は、配列番号１０〜１５で表される配列、細胞で発現するためにこれらからコドン最適化された配列、または、縮重コドンにより変化した核酸配列を含む。
本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩは、ＣＳまたはＡＰＴＴ法で測定した場合に、二本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子の９０％以上の比活性を有する。
本発明の一実施形態によれば、一本鎖ＦＶＩＩＩは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド、デキストラン、またはポリシアル酸（ｐｏｌｉｓｉａｌｉｃ）を含む親水性ポリマーとコンジュゲートし、ＰＥＧが用いられる場合、ＰＥＧは、コンジュゲート位置で、アクリロイル、スルホン、またはマレイミドを介して、コンジュゲートされてよい。
本発明の一実施形態によれば、コンジュゲートした血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、Ａドメインおよび／またはＢドメイン断片のいくつかのアミノ酸残基で親水性ポリマーとコンジュゲートし；Ｂドメイン断片のコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５および８９７からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつ、Ａドメインのコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つであり；かつ、コンジュゲート位置の残基が、親水性ポリマーとのコンジュゲートのためにシステインで置換されてよい。
本発明の別の実施形態によれば、一本鎖ＦＶＩＩＩはＰＥＧとコンジュゲートしており、特に、２０ｋＤａ以上の平均分子量を有する。
本発明の別の実施形態によれば、一本鎖ＦＶＩＩＩ、具体的には、配列番号２〜７で表される一本鎖ＦＶＩＩＩ、もしくは、コンジュゲート位置の残基が親水性ポリマーとのコンジュゲートのためにシステインで置換されている一本鎖ＦＶＩＩＩであって、Ｂドメインのコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５および８９７からなる群から選択される少なくとも１つであり；かつＡドメインのコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つである、ＦＶＩＩＩ；または、置換されたシステイン基を含む一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子が提供される。
本発明の別の実施形態によれば、システインが導入された残基は表３に示す通りであり、親水性ポリマーとのコンジュゲートのために特定の残基がシステインで置換されている核酸分子は配列番号１７〜３２で表され、それらに対応するアミノ酸配列は配列番号３３〜４８で表される。さらに、細胞で発現するためにコドン最適化された配列、または、縮重コドンにより変化した核酸配列もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明の別の実施形態によれば、本発明の核酸分子を含むベクター、および、該ベクターを含む細胞もまた、提供される。
本発明の別の実施形態によれば、一本鎖ＦＶＩＩＩを産生する方法であって、本発明のベクターを真核細胞にトランスフェクトすること；または代わりに本発明のベクターでトランスフェクトされた細胞を提供すること；細胞を培養液中で培養することにより、導入されたシステインの遊離のチオール基がシステインまたはグルタチオンによるジスルフィド結合によりマスクされている一本鎖ＦＶＩＩＩを発現させること；培養液から発現した一本鎖ＦＶＩＩＩを回収して、一本鎖ＦＶＩＩＩを還元剤で処理してマスクしたシステインまたはグルタチオンを遊離させること；および、処理した培養液をペグ化バッファーで処理することを含む方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、血友病患者もしくは血液凝固を必要とする患者に用いられる本発明に開示される一本鎖ＦＶＩＩＩの少なくとも１つを含む血液凝固キット、血友病患者の治療のための一本鎖ＦＶＩＩＩまたは組成物の使用、または、一本鎖ＦＶＩＩＩを治療的有効量で血友病患者もしくは血液凝固を必要とする患者に投与することを含む血液凝固方法もまた、提供される。
発明の効果
本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩは、配列の一部が欠失しているＢドメインによりつながれた重鎖および軽鎖を含む。具体的には、一本鎖ＦＶＩＩＩは、フューリンプロテアーゼにより切断される切断部位（正常なＦＶＩＩＩ発現プロセス中に生成される）を含まず、少なくとも４つの糖鎖付加部位を含有する、部分的に欠失しているＢドメインを含む。本発明の一本鎖第ＶＩＩＩ因子、またはＡまたはＢドメインのいくつかの残基がペグ化された一本鎖ＦＶＩＩＩは、活性を有するだけでなく、その一本鎖形態のために大規模で簡単に産生することができる。前記一本鎖第ＶＩＩＩ因子は、ペグ化により延長されたインビボ半減期を有し、血友病Ａの治療薬として患者の利便性を向上させ、生産コストを削減することにより医療費を削減する。
図面の簡単な説明
図１は、本発明の一実施形態のペグ化された一本鎖ＦＶＩＩＩ構造を模式的に示している。ここで、１６４８残基はフューリン切断部位を表す。
図２は、完全長ＦＶＩＩＩからの、本発明の一実施形態の一本鎖ＦＶＩＩＩの調製を図示している。フューリン切断部位（配列番号１に基づく１６４８番目のアミノ酸残基）が示され、図中の数字は指定した部位に対応するそれぞれのアミノ酸残基を示す。
図３は、本発明の一実施形態の一本鎖ＦＶＩＩＩ発現のウェスタンブロット解析の結果を示している。
図４は、本発明の一実施形態の一本鎖ＦＶＩＩＩの最適なペグ化位置を決定するために試験したペグ化位置を示している。
図５は、本発明の一実施形態の遊離のシステインが導入された変異体一本鎖ＦＶＩＩＩの発現後の、ＦＶＩＩＩ活性の解析結果を図示している。
図６は、本発明の一実施形態の遊離のシステインが導入された変異体一本鎖ＦＶＩＩＩのペグ化後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示しており、星印のついたラインは、ペグ化効率が比較的高い導入されたシステインを示している。
図７は、本発明の一実施形態のｓｃＦＶＩＩＩの、市販のＦＶＩＩＩ物質と比較したＰＫ（薬物動態）の試験結果を示す。
図８ａおよび図８ｂは、それぞれ、本発明の一実施形態のペグ化ｓｃＦＶＩＩＩの、尾の出血止血有効性（tail bleeding hemostatic efficacy）を、市販のＦＶＩＩＩ物質の有効性と比較するための実験方法の簡単な説明図および実験結果である。図８ｂは、ＰＥＧ４０ｋＤａ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、生産性およびインビボ安定性が向上した一本鎖の形態で発現され得る凝固第ＶＩＩＩ因子変異体の開発、並びに、第ＶＩＩＩ因子変異体のペグ化による患者への投与間隔に関する服薬遵守（compliance）が向上した血液凝固因子の開発に基づいている。
血液凝固第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインから構成され、一本鎖タンパク質として肝細胞で合成される。合成後、プロセシングを経て成熟し、重鎖および軽鎖から構成される２８０ｋＤａのヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体において、軽鎖は８０ｋＤａの分子量を有し、Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインから構成される。また、重鎖はＡ１−Ａ２−Ｂドメインから構成され、９０〜２００ｋＤａの分子量を有し、その分子量はＢドメインの長さおよび糖鎖付加の程度に応じて大きく異なる。Ａ１ドメインとＡ２ドメインとの間のａ１ドメイン、Ａ２ドメインとＢドメインとの間のａ２ドメイン、およびａ３ドメインは、重鎖に含まれる。ヘテロ二量体は、ｖＷＦと結合することにより血液中で不活性な状態で存在し、血管損傷などの刺激に曝された時に、アルギニン残基の後ろで、すなわち残基３７２、７４０および１６８９の後ろで、トロンビンにより切断される。その結果、ｖＷＦから分かれ、活性化されて、Ａ１、Ａ２およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２の三量体を形成する。次に三量体はＦＩＸａによるＦＸの活性化を触媒し、急速に不活性化される。
一本鎖ＦＶＩＩＩは構造的に安定であり、発現レベルの増加を示すことが報告されている（ＷＯ２００４／０６７５６６参照）。二本鎖の形態のＦＶＩＩＩは、Ｂドメインの長さに応じて発現レベルの違いを示すことが報告されている（Miao et al., Blood 2004 May 1; 103 (9): 3412-9）。
本発明において、一本鎖ＦＶＩＩＩの調製において、ａ３を含むＢドメインの長さおよび配列に応じた発現レベルの違いに加えて、比活性およびＡＰＴＴ／ＣＳ比が変化することが見出された。天然型の二本鎖ＦＶＩＩＩと同様の比活性およびＡＰＴＴ／ＣＳ比を有する組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩを、Ｂドメインの長さおよび配列を最適化することによって調製した。本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩは、野生型ＦＶＩＩＩの固有の性質を維持しながら、安定でありかつ発現レベルにおいて優れていることが見出された。
従って、一実施形態によれば、本発明は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖領域および軽鎖領域が、ヒト第ＶＩＩＩ因子の部分的に欠失しているＢドメイン断片により連結している、一本鎖第ＶＩＩＩ因子を提供する。具体的には、部分的に欠失しているＢドメイン断片が、フューリンプロテアーゼによる切断部位を含まないように、配列番号１の残基１６４８からＮ末端方向に少なくとも５つのアミノ酸と、配列番号１の残基１６４９からＣ末端方向に少なくとも５つのアミノと酸を欠失し、かつ４〜６つの糖鎖付加部位を含有する。
本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩは、Ａ１−Ａ２−部分的Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインを含む。本発明におけるＦＶＩＩＩに含まれる各ドメインの残基位置および配列は当業界で既知であり、ヒトＦＶＩＩＩなどのヒトアミノ酸配列は配列番号１の配列で表すことができる。該配列に基づき、重鎖はＡ１およびＡ２ドメインを含む１〜７４０残基から構成され；Ｂドメインは７４１〜１６８９残基から構成され；かつ、軽鎖はＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む１６９０〜２３３２残基から構成される（図２およびOrlova et al., Acta Naturae. 2013 Apr-Jun; 5(2): 19-39）。本発明のＢドメインは、図２に記載されるａ３ドメイン（１６４９〜１６８９）を含むことが意図されている。
これに関して、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩは、式Ａ１−Ａ２−Ｂ’−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２で表すことができ、ここで、Ａ１はＡ１ドメインであり、Ａ２はＡ２ドメインであり、Ｂ’はＢドメインの一部であり、Ａ３はＡ３ドメインであり、Ｃ１はＣ１ドメインであり、Ｃ２はＣ２ドメインである。各ドメインについて、上述の説明を参照することができる。
本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩの部分的に欠失しているＢドメイン（Ｂ’）は、タンパク質分解酵素フューリンの切断部位を欠失している。一実施形態によれば、Ｂ’ドメインは、配列番号１の残基１６４８からＮ末端方向に少なくとも５つのアミノ酸と、配列番号１の残基１６４９からＣ末端方向に少なくとも５つのアミノ酸とを欠失している。Ｂドメインはいくつかの糖鎖付加部位を有し、タンパク質の糖鎖付加は発現プロセスの間および後にタンパク質の活性および安定性に影響を及ぼすので、Ｂドメインの欠失部位を決定する際に、糖鎖付加の数を考慮に入れることができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｂドメインの欠失部位は、４〜６つの糖鎖付加部位を含むように決定される。
Ｂドメインの欠失部位を決定する際に、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩに含まれるフューリン切断部位を欠失したＢドメインを、野生型Ｂドメイン全体の約１５〜４０％を含む範囲内で決定することができる。
本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩに含まれる、部分的に欠失しているＢドメインの欠失部位は、連続的であっても非連続的であってもよい。
ある実施形態では、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩがフューリン切断部位を含む連続的欠失を有するＢドメインを含む場合、Ｂドメインは（ｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９により表される配列を有してよく（すなわち、Ｂドメインの９０３〜１６５３残基が連続的に欠失している）；（ｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９６５および１６５４〜１６８９により表される配列を有してよく（すなわち、Ｂドメインの残基９６６〜１６５３が欠失している）；または、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩが非連続的欠失を有するＢドメインを含む場合、Ｂドメインは(iii) 配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７４１〜９０２、１６３７〜１６４２、および１６５４〜１６８９の配列により表されてよい（すなわち、Ｂドメインの残基９６６〜１６５３が欠失している）。
別の実施形態によれば、これらの欠失したＢドメインを含む、本発明のＦＶＩＩＩアミノ酸配列は、配列番号２〜７により表されてよい。
本明細書に開示される組換え型ＦＶＩＩＩは上記の配列に限定されず、それらの生物学的同等物を含む。生物学的同等物は、本発明に開示されたアミノ酸配列に対してさらなる修飾がなされているが、本発明のポリペプチドと実質的に同じ活性を有することを意味し、これらの修飾には、例えば、アミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換が含まれる。
一実施形態によれば、本発明のＦＶＩＩＩに保存的アミノ酸置換を行うことによって調製された組換え型ＦＶＩＩＩポリペプチドが、本発明に含まれる。
保存的アミノ酸置換は、特定のポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさないかまたは、それを低下させない置換を指し、例えば、１〜１５個の保存的置換、または１〜１２個、例えば、１、２、５、７、９、１２、または１５個の保存的アミノ酸置換が含まれる。
保存的アミノ酸置換は当業界で既知であり、例えば、Creighton (1984) Proteins based on Blosum (BLOcks SUBstitution Matrix). W. H. Freeman and Company (Eds); および、Henikoff, S.and Henikoff, J.G. (1992). “Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks”. PNAS 89 (22): 10915-10919. doi: 10.1073/pnas.89.22.10915; ＷＯ２００９０１２１７５ Ａ１などにおける記述を参照することができる。
これらのアミノ酸修飾、特に置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズなどのアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいて行われる。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形およびタイプの解析に基づくと、アルギニン、リシンおよびヒスチジンは全て正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンは類似したサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは類似した形を有する。したがって、上記を考慮すると、アルギニン、リシンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；並びに、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは生物学的機能的同等物である。
また、アミノ酸置換を導入する際に、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮に入れることができる。各アミノ酸は、その疎水性および電荷に応じて、ヒドロパシー指標が与えられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。これらのヒドロパシー指標は、タンパク質に双方向性の生物学的機能を付与するために特に重要である。同様の生物学的活性を保持するためには、同様のヒドロパシー指標を有するアミノ酸で置換することが必要であることは当業界で既知である。ヒドロパシー指標を参照して変異が導入される場合、ヒドロパシー指標の差が、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらにより好ましくは±０．５以内を示すアミノ酸間で置換を行うことが有利である。
同様の親水性値を有するアミノ酸間の置換が、同等の生物学的活性を有するタンパク質をもたらすこともまた、当業界で既知である。例えば、米国特許第４，５５４，１０１号に開示されるように、以下の親水性値が各アミノ酸残基に与えられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。
本発明の組換え型タンパク質の活性を全く変化させないアミノ酸置換は当業界で既知である（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。例えば、最も一般的に実施される置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙの間の置換である。
したがって、上述のような生物学的および機能的同等性を有するバリアントは、本明細書に開示のアミノ酸配列またはそれをコードする核酸分子と実質的同一性を有し、本発明の範囲内に含まれる。
これらの実質的同一性は、当業界で既知の配列比較法を用いて決定することができる。本明細書に開示された配列および他の任意の配列がそれらの間の最大の一致でアラインメントされ、かつアラインメントされた配列が当業界で一般的に使用されるアルゴリズムを使用して分析される場合、好ましくは少なくとも８０％の相同性、具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上の相同性、さらにより具体的には９５％以上の相同性を示す配列は、実質的に同一の配列を意味する。配列比較のためのアラインメント法は、当業界で既知である。例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 および Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31に開示されている。NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）(Altschul et al., J. MoI. Biol. 215: 403-10(1990))は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biological In形成）（NBCI, Bethesda, Md.）などから入手可能であり、ｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと関連して使用される。ＢＬＡＳＴはwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でアクセスすることができ、このプログラムを使用した配列相同性比較法はwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast/help.htmlで利用可能である。
本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩには、モル活性が、野生型二本鎖ＦＶＩＩＩと比較して、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％のものが含まれる。野生型二本鎖ＦＶＩＩＩおよびその活性の測定方法は、当業界で既知であり、例えば、ＣＳおよび凝固アッセイにより測定された比活性値（ＡＰＴＴ：活性化部分トロンボプラスチン時間）および（ＡＰＴＴ）／ＣＳ比(Clotting assays Circulation 2005; 112: e53-e60)を決定することにより行うことができる。当業者であれば、当業界の技術および参考文献の記載を参照して適切な方法を選択することにより活性を測定し、その測定結果に基づいて本発明の範囲に含まれる組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩを決定することができるであろう。二本鎖ＦＶＩＩＩは上述のようにフューリンにより処理され、軽鎖および重鎖から構成される二量体の形態で存在する。本発明において、野生型ＦＶＩＩＩの組換え型タンパク質（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））との比較を行った。これはＣＨＯ細胞中で組換え型の形態で発現され、そのほとんどは様々な長さのＢドメインを含む二本鎖の形態である。野生型ＦＶＩＩＩの組換え型タンパク質は、血漿由来の野生型ＦＶＩＩＩと同様の組成を有する。
本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩと比較される二本鎖ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインを含むか、または、Ｂドメインを含まない。Ｂドメインを含まない二本鎖ＦＶＩＩＩは、野生型ＦＶＩＩＩの発現の過程で、ＦＸａ（活性型ＦＸ）とトロンビンによるタンパク質切断プロセスを利用した組換え法により、意図的にＢドメインを除去することにより、主に産生することができる。Ｂドメインの一部または全体を含む二本鎖ＦＶＩＩＩは、組換え法によって、すなわち野生型ＦＶＩＩＩの発現の過程におけるＦＸａ（活性型ＦＸ）およびトロンビンによるタンパク質切断プロセスによって、産生することができる。しかしながら、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩと比較した二本鎖ＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン全体を含む野生型ＦＶＩＩＩから組換えにより発現させた。二本鎖ＦＶＩＩＩは、細胞の内側から外側に分泌された際にフューリン処理によって産生されたＢドメイン全体を含む二本鎖ＦＶＩＩＩと、その後、トロンビンまたはＦＩＸａまたはＦＸａでＢドメインの一部または全体を除去することによって産生された、Ｂドメインを全く含まないか、またはＢドメインの一部を含むＦＶＩＩＩとの混合物であり、それらのほとんどは野生型ＦＶＩＩＩに類似する組換え型ＦＶＩＩＩである。
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子もしくはポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチドを含むベクター、または、該ベクターでトランスフェクトされた細胞（株）を提供する。
本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子は、本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩが発現される細胞のタイプに対してコドン最適化されているものを含む。本発明の一実施形態によれば、コドン最適化した核酸配列は、ＣＨＯ細胞のコドンに最適化されてよく、該核酸配列は、配列番号５のタンパク質をコードする最適化された核酸配列であり、配列番号１５で表され得る。
本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子はまた、上述のように、実質的に同一の、および、生物学的に同等のＦＶＩＩＩをコードする核酸分子を含む。
また、本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子は、様々な目的のために、様々な発現ベクターにクローニングすることにより、用いられてよい。発現ベクターの特定の構成は、本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩが発現される宿主細胞に応じて異なってよい。しかしながら、発現ベクターの特定の構成は、本発明の核酸分子のｍＲＮＡへの発現またはｍＲＮＡのタンパク質への発現を調節する配列、例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどを含む。上記目的または様々な他の目的のために用いられ得る様々なベクターおよび調節配列は、当業界で既知であり、本発明の特定の目的および効果に照らして当業者により適切に選択され得る。これらのベクターおよび配列には、例えば、本発明の実施例および図面に開示されたものが含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子を含むベクターは、当業界で既知の方法により調製されてよく、例えば、本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子を、プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結することにより調製されてよい。一実施形態によれば、本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子は、細胞内で外来遺伝子を発現することができる組換え発現ベクターに挿入され、これらのベクターの例には、ｐＭＳＧｎｅｏおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）などの一般的なタンパク質発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。ｐＭＳＧｎｅｏベクターは、核マトリックスに結合するＭＡＲ（マトリックス付着領域）エレメントを含む発現ベクターであり、ＭＡＲエレメントは、発現ベクターで使用される場合、位置非依存性発現を誘導することによって遺伝子発現を増強する役割を果たす。従って、ｐＭＳＧｎｅｏベクターが用いられる場合、安定かつ高い発現レベルを達成することができる。さらに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターは強力なＣＭＶプロモーターを含有するため、タンパク質発現に広く用いられている。
さらに、本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターは、様々な目的のために、以下に記載される適切な宿主細胞にトランスフェクトされてよい。ベクターに含有される核酸分子をタンパク質として発現するために、該タンパク質をコードする核酸分子のコード配列が、所望の細胞に好適に最適化されてよい。
これに関して、本発明は、本発明に従ってベクターでトランスフェクトまたは形質転換された組換え細胞を提供する。これらの細胞には、本発明のベクターの増幅および／または該ベクターに含まれる核酸分子の発現による所望のタンパク質の調製に使用できる、原核細胞および真核細胞の両方が含まれる。上記目的のために用いられ得る様々な細胞は、当業界で既知であり、当業者であれば、本発明の特定の目的および効果を考慮して、適切な細胞を選択することができるであろうし、これらの細胞は、本発明の実施例および図面に記載される細胞を含むが、これらに限定されない。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、哺乳動物細胞、酵母、植物細胞、および昆虫細胞が含まれ得る。本発明の一実施形態によれば、真核細胞、特に哺乳動物細胞株が、組換え型ＦＶＩＩＩの発現に用いられる。当業者であれば、本発明の組換え型ＦＶＩＩＩの性質を考慮して、これらの性質をもったタンパク質を調製できる適切な細胞株を選択できるであろう。例えば、当業界で既知のＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ７、ＨＥＫ細胞株などがこれらの哺乳動物細胞株として用いられてよい。好ましくは、ＣＨＯ細胞株（具体的にはＣＨＯ−Ｓ細胞株、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株もしくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株）またはＨＥＫ細胞株（具体的にはＨＥＫ２９３細胞株）が用いられてよい。
本発明のベクターは、発現のために前記宿主細胞に導入される。ベクターをこれらの宿主細胞に導入する方法は当業界で既知であり、当業界で既知の方法によって実行されてよく、硫酸カルシウム沈殿、ショットガン法、リポソームを用いる方法、ナノ粒子法、またはエレクトロポレーションなどの方法などが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩは、半減期を延長させる目的で、親水性ポリマーにより特定の残基で修飾されてよい。
Ｂドメインのタンパク質構造はいまだ明らかにされていない。Ｂドメインは、柔軟な構造、高程度の糖鎖付加、および豊富な負電荷を有するタンパク質として知られているが、その構造は予測することが難しい。言い換えれば、理論的には分子モデリング技術を用いてＢドメインの構造を予測することは可能であるが、Ｂドメインの翻訳後修飾および糖鎖付加による不均一性（heterogeneity）を考慮するとＢドメイン構造を予測することは困難である。Ｂドメイン中の修飾位置を選択するためには、Ｂドメインタンパク質構造の表面の構造情報が必要である。しかし、構造に関する情報がないため、ペグ化位置を選択することは非常に困難である。
しかし、本発明において、一本鎖ＦＶＩＩＩの活性に特に影響を与えないＡドメインおよび／またはＢドメインの残基が、予想外の努力により選択され、親水性ポリマーで修飾された。その結果、その固有の性質を保持しながら半減期が改善された、一本鎖ＦＶＩＩＩが得られた。
特に、本発明においてＢドメインの糖鎖付加近傍の残基（０）を基準として−６〜＋６残基の間の位置をペグ化位置として選択した。
これに関して、本発明は、一本鎖ＦＶＩＩＩがＡドメインおよび／またはＢドメイン断片のいくつかのアミノ酸残基で親水性ポリマーとコンジュゲートし；Ｂドメイン断片のコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５および８９７からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつＡドメインのコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つであり；かつ、コンジュゲート位置の残基が親水性ポリマーとのコンジュゲートのためにシステインで置換されている、一本鎖ＦＶＩＩＩに関する。
当業界で既知の様々なポリマーが、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩの修飾において用いられる親水性ポリマーとして用いられ得、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、デキストラン、ポリシアル酸などが含まれるが、これらに限定されない。これらのポリマーは、生体適合性（無毒または低毒性）の親水性の柔軟な構造を有しており、タンパク質と化学的にコンジュゲートすると、ポリマーは、非特異的な相互作用による他の分子や物質のタンパク質表面への接着に起因するコンジュゲートタンパク質の活性の喪失を抑制する役割、および、血液中のプロテアーゼによる不活性化を抑制する役割を果たす。
本発明の一実施形態によれば、ＰＥＧが用いられ、具体的には、２０ｋＤａ以上のＰＥＧが用いられる。ＰＥＧはタンパク質とコンジュゲートしており、タンパク質の周りを包む効果があり、スカベンジャー受容体に結合した後の喪失または不活性化プロテアーゼによる分解に対する防御をもたらす。ＰＥＧは、直鎖型（ｌｉｎｅａｒ）または分岐鎖型（ｂｒａｎｃｈｅｄ）の鎖状のポリマーであり、分子量が小さいＰＥＧはタンパク質を完全に包むことができず、したがってタンパク質を完全に保護することはできない。したがって、分子量は、保護されるタンパク質を十分に包むための臨界レベルと同じかまたはそれを超えるレベルであるべきである。本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩのペグ化は、ペグ化位置でシステインによりアミノ酸を置換し、次いで、システインに特異的なアクリロイル、スルホンまたはマレイミド基を一方の端に含有するＰＥＧに、コンジュゲートさせることによって実施することができる。
すなわち、本発明の一本鎖ＦＶＩＩＩでは、特定の残基が親水性ポリマーへの修飾のために置換されてよく、具体的には、一本鎖ＦＶＩＩＩにおいて親水性ポリマーがコンジュゲートする位置に応じて、置換される残基は異なり、当業者であれば、親水性ポリマーのコンジュゲートのために好適な残基で修飾することができ得るであろう。
本発明の一実施形態によれば、ペグ化が修飾のために用いられる。この場合、修飾される残基は、システインで置換される。
本発明の一実施形態によれば、修飾はＡ２ドメインの４９５バリン残基、および／またはＢドメインの７８２イソロイシン残基で行われ、具体的には、該残基がペグ化のためにシステインで置換され、該残基がペグ化される。
修飾のためにシステインで置換されたタンパク質の発現は、当業界で既知の方法を用いて行われ得る。例えば、還元状態で導入された遊離のシステインがペグ化直前に回復されるまで、導入された遊離のシステインをマスキングすることにより、導入された遊離のシステインを安定化させることによってペグ化有効性を高める必要がある。通常、ペグ化されるタンパク質の導入された遊離のシステインは、細胞内発現中または細胞外への分泌後に、遊離のチオール、システインまたはグルタチオンを含む低分子量の物質とのジスルフィド結合によって安定化される。
ペグ化は、当業界で既知の方法を用いて行われ得る。例えば、導入されたシステインの遊離のチオールが回復され得るように、遊離のシステインのマスキングのために用いられるシステインまたはグルタチオンは、ペグ化反応の前に取り除かなければならず、前記ステップは、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、βメルカプトエタノール、システイン、およびグルタチオン（還元型）などの還元剤で処理するステップと、還元によって切断されたＦＶＩＩＩの元のジスルフィド結合を回復させるための酸化ステップとを含んで、行われ得る。
発現された組換え型タンパク質の、導入されたシステインのマスキングは、既知の方法を用いて実施され得る。例えば、遊離のシステインのマスキングのために用いられるシステインまたはグルタチオンを、細胞培養培地の成分にさらに添加してよく、あるいは、細胞増殖および維持の間に細胞によって通常産生され、貯蔵され、そして分泌されるシステインまたはグルタチオン成分を、細胞培養培地成分にさらに添加することなく使用することができる。
別の局面では、本発明はまた、一本鎖ＦＶＩＩＩを産生する方法であって、上述の本発明のベクターを真核細胞にトランスフェクトすること；培養液中で該細胞を培養すること；該培養液を回収してシステイン導入ＦＶＩＩＩを精製すること；および精製されたシステイン導入ＦＶＩＩＩをペグ化バッファー液で処理すること；還元プロセスを介して導入されたシステインの遊離のチオール基を回復させること；得られたものを酸化して還元プロセスで分離した一本鎖ＦＶＩＩＩのジスルフィド結合を回復させること；還元チオール基で回復された一本鎖ＦＶＩＩＩ上のシステインをペグ化して、ペグ化された一本鎖ＦＶＩＩＩを単離することを含む方法を提供する。
本発明の方法で用いられる特定のベクター、細胞、および処理ステップに関して、本明細書の実施例に記載されるものを参照することができる。
本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩは、血液凝固を必要とする疾病、すなわち、血友病、具体的には血友病Ａを患う患者の血液凝固に有用であることができ、または、血友病Ａの治療に有用であることができる。
従って、本発明はまた、特許請求の範囲を含む本発明に記載される一本鎖ＦＶＩＩＩのいずれか１つを含む、血友病患者、または血液凝固を必要とする患者による使用のための血液凝固キット、血友病の治療における前記一本鎖ＦＶＩＩＩまたはそれを含む組成物の使用、前記一本鎖ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む組成物、血友病Ａの遺伝子治療における該組成物の使用、治療的有効量で、血友病患者、または血液凝固を必要とする患者に、前記一本鎖ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む組成物を投与すること、または前記一本鎖ＦＶＩＩＩを投与することを含む、血友病治療または血液凝固のための方法を提供する。
本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩは、医薬的に許容される担体も含有する、血友病を治療するための医薬組成物の形態で提供され得る。
さらに、本発明の医薬組成物は、単独で、または他の薬物療法と組み合わせて、および、生体応答修飾物質を使用する方法と組み合わせて、使用することができる。
上述の有効成分に加えて、本発明の組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体または薬理的に許容される担体をさらに含むことにより、調製されてよい。
本明細書で用いられる「担体」という用語は、使用される用量および濃度でそれに曝露された細胞または哺乳動物に対して無毒である、医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を意味することを意図している。これらの担体の例には、生理食塩水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量の（約１０アミノ酸より小さい）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンなどの糖、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成のための対イオン、および／またはｔｗｅｅｎ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
所望であれば、組成物はさらに、抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤などの当業界で既知の他の添加剤を含んでよい。本組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤を添加することによって、溶液、懸濁液、エマルジョンなどの注射用製剤に製剤化されてよい。
さらに、組成物は、好ましくは、当業界における、またはRemington’ s Pharmaceutical Science（最新版；Mack Publishing Company, Easton PA）に開示された適切な方法を用いて、疾病または成分に応じて製剤化され得る。
本発明の組成物は、好ましくは、所望の方法に従い、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内）に投与される。投与量は、患者の病状および体重、疾病の程度、薬剤タイプ、投与経路および投与時間に応じて異なるが、当業者であれば適切に選択することができる。
本発明の組成物は、治療的有効量で投与される。本発明において、「治療的有効量」とは、薬物療法に適用可能な妥当なリスク／ベネフィット比（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）で疾病を治療するのに十分な量を指す。有効な用量のレベルは、患者の疾病のタイプ、重症度、薬剤の活性、薬剤への感受性、投与時間，投与経路、排出率、治療期間、同時に使用される薬剤、および医薬分野で既知の他の要因に応じて決定されてよい。本発明の組成物は、単一治療薬として投与されてよく、あるいは、他の治療薬と組み合わせて投与されてよい。また、本発明の組成物は、従来の治療薬と共に、連続してまたは同時に投与されてよく、および、該組成物は、単回投与または複数回投与に用いられてよい。上述のすべての要因を考慮して、副作用なしに最大の効果をもたらすことができる最小量用量で組成物を投与することが重要であり、その用量は当業者であれば容易に決定し得る。
本発明の組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩは、血友病を患う対象、または血液凝固を必要とする対象に、治療的有効量で、そのまま、または上述の組成物の形態で投与されてよく、および、血液凝固方法または血友病を治療するための方法の形態で提供されてよく、前述の記述を参照することができる。
本明細書で用いられる場合、用語「治療」は、本発明の組成物の投与によって有益な方法で疾病の症候を改善または変化させる任意の行為を指す。本発明の方法が用いられる対象は、ヒトを含む霊長類であってよいが、これらに限定されない。
以下、本発明の理解を助けるための実施例が提示されている。しかしながら、以下の実施例は本発明の理解をより容易にするためのみに提供されるものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例
実施例１．一本鎖ＦＶＩＩＩの構築
ヒトＦＶＩＩＩの固有の性質を保持しながら、高い発現率を有する一本鎖形態のヒトＦＴＩＩＩ（一本鎖ＦＶＩＩＩ、ｓｃＦＶＩＩＩ）を調製するために、ＦＶＩＩＩのａ３を含むＢドメインの長さを改変することにより、様々な長さのＢドメインを含有する組換え型ｓｃＦＶＩＩＩを構築して、発現させ、その発現レベルおよび活性（ＡＰＴＴ、ＣＳ）を解析した。詳細な方法および結果は以下の通りである。
実施例１−１．ｓｃＦＶＩＩＩの調製
一本鎖の形態で発現されるＦＶＩＩＩの構築のために、フューリン切断部位、すなわち残基１６４８（完全長ＦＶＩＩＩアミノ酸配列を表す配列番号１のアミノ酸配列に基づく）を含むＢドメインの一部が欠失したＦＶＩＩＩを構築した。重鎖と軽鎖をつなぐＢドメインの長さはＦＶＩＩＩの最終的な活性および性質に影響を与える可能性があるため、ｓｃＦＶＩＩＩに含まれるＢドメインの長さを決定するために、表１に示すように合計７種類のＦＶＩＩＩを構築した。各ｓｃＦＶＩＩＩを、ＢドメインのＮ末端（配列番号１の７４１番目のアミノ酸残基）から数えて特定の長さのＢドメインを含み、Ｂドメインが、元々存在する糖鎖をそのまま含有するように構築した。
また、軽鎖と重鎖領域をつなぐＢドメインにより引き起こされる構造的干渉を最小限に抑えて野生型ＦＶＩＩＩ活性と同様の性質を付与するために、軽鎖ドメインに隣接するａ３ドメインの一部が、他のｓｃＦＶＩＩＩよりも多く含まれる構造もまた、調製した（配列番号６）。さらに、ＣＨＯ細胞における発現を改善するために、ＣＨＯコドンで最適化したｓｃＦＶＩＩＩを調製した（配列番号１５）。
部分的に欠失しているＢドメインを含む各ｓｃＦＶＩＩＩを、ヒトＦＶＩＩＩ核酸配列（ＮＭ０００１３２）に基づいて合成した。ｓｃＦＶＩＩＩ遺伝子発現ベクターを調製するために、ヒトＦＶＩＩＩ核酸配列（ＮＭ０００１３２）に基づき、５’末端にＮｏｔＩ−ＡｓｉｓＩ酵素切断部位を、３’末端にＸｈｏＩ−ＰａｃＩ酵素切断部位を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより、Ｇ１タンパク質配列（リーダー−重鎖−Ｂドメイン（７４１−７６４、１６５３−１６８９）−軽鎖）をコードさせ、該遺伝子全体を合成した。合成した遺伝子を、ｐｃＤＳＷベクターのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより、ｐｃＤＳＷ−Ｇ１発現ベクターを構築した発現ベクター構築の正確さを、ＡｓｉｓＩ／ＰａｃＩ酵素を用いて切断したバンドのサイズ比較により確認した。続いて、Ｂドメインが欠失した各ｓｃＦＶＩＩＩに対応する各遺伝子（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−ｆｌｅｘ、Ｇ６）を、ＦＶＩＩＩ重鎖のＡ２ドメインに存在するＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）から、軽鎖の末端のＰａｃｌ酵素切断部位までの配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより合成した。続いて、既存のＦＶＩＩＩの領域を、予め調製したｐｃＤＳＷ−Ｇ１発現ベクターから、酵素ＢａｍＨＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ酵素で切断して、ｐｃＤＳＷ−Ｇ１発現ベクターのＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、ｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さを、ＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ酵素で切断後に、サイズ比較により確認した。発現を改善するために、ｓｃＦＶＩＩＩ（Ｇ６＿ｏｐｔ）に関しては、５’末端にＮｏｔＩ−ＡｓｉｓＩ切断部位を、３’にＸｈｏＩ−ＰａｃＩ切断部位を含み、かつ、動物細胞での発現に好適であるように、コドン最適化および遺伝子合成を行った。合成した遺伝子をｐｃＤＳＷベクターのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングして、発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さを、ＢａｍＨＩ酵素で切断後に、サイズ比較により確認した。
実施例１−２．ｓｃＦＶＩＩＩの発現および活性測定
ｓｃＦＶＩＩＩの発現
実施例１−１で構築したｓｃＦＶＩＩＩを細胞で発現させ、細胞を細胞培養培地で培養した。まず、発現のために、実施例１−１で構築した発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃｏ．， カタログ番号 Ａ１４６３５）（一過性発現システム）を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間前に、Ｅｘｐｉ２９３培養培地を用いて、予想される必要量に従って、２．０×１０６細胞／ｍＬの濃度でＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を継代培養し、トランスフェクト当日に、細胞の数および細胞生存率を測定し、細胞生存率が９５％以上の場合に形質転換（transformation）を実施した。７．５×１０ ７の細胞をＥｘｐｉ２９３培養培地と共に１２５ｍＬフラスコに加え、最終容量２５．５ｍＬ（３０ｍＬを基準にして）とした。実施例１−１で構築した発現ベクター３０μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合して、全量１５００μｌを得た。トランスフェクション試薬８０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合して、全量１５００μｌとし、室温で５分間インキュベートした。５分後に、トランスフェクション試薬を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭを、ＤＮＡ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに加えて、それを穏やかに混合した。２０分〜３０分間、反応を室温で実行した。３ｍＬのＤＮＡ：トランスフェクション試薬混合物を、予め調製した１２５ｍＬフラスコのＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞に滴下して（全量：２８．５ｍＬ）、細胞を５％ＣＯ２振とう培養器中、３７℃、１２５ｒｐｍでインキュベートした。１６〜２０時間後、それぞれ１５０μＬおよび１．５ｍＬの、エンハンサー１およびエンハンサー２をそこに加えて、細胞を、３４℃および５％ＣＯ２の振とう培養器中、１２５ｒｐｍで培養した。培養３日目に、培地を回収し、以下のようにｓｃＦＶＩＩＩの活性を測定した。
発現したｓｃＦＶＩＩＩの活性の測定
現在、完全長ＦＶＩＩＩおよび欠失したＢドメインを有するＦＶＩＩＩの２種類の組換え型ＦＶＩＩＩが臨床的に使用されている。しかしながら、これらの２つの組換え型ＦＶＩＩＩが活性および有効性において、臨床的に同等かどうかという問題が提起されている（GRUPPO, R. A. et al., 2003. Comparative effectiveness of full-length and B domain deleted Factor VIII for prophylaxis-a metaanalysis. Haemophilia, 9, 251-60; LOLLAR, P. 2003. The Factor VIII assay problem: neither rhyme nor reason. J Thromb Haemost, 1, 2275-9; MIKAELSSON, M. et al., 2001. Measurement of Factor VIII activity of B domain deleted recombinant Factor VIII. Semin Hematol, 38, 13-23）。
凝固アッセイで測定したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの活性（ＡＰＴＴ）は発色アッセイ（ＣＳ）で測定した活性（ＣＳ）より最大５０％低いことがわかったが、完全長型のＦＶＩＩＩの活性は両方の測定で同様であった（BARROWCLIFFE et al., SEMIN THROMB HEMOST, vol. 28 (3), 2002: 47-56）。凝固アッセイにおけるＢＤＤの活性が低いことは、実際の長期予防において完全長ＦＶＩＩＩと比較して、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩが血友病Ａ患者における出血の予防において有効性が低いことの理由として示唆されてきた（GRUPPO, R. A., et al., 2003. Comparative effectiveness of full-length and B domain deleted Factor VIII for prophylaxis--a metaanalysis. Haemophilia, 9, 251-60; GRUPPO, R. A. et al., 2004. Meta-analytic evidence of increased breakthrough bleeding during prophylaxis with B domain deleted Factor VIII. Haemophilia,10, 747-50; GRUPPO, R. A. et al., 2004. Increased breakthrough bleeding during prophylaxis with B domain deleted Factor VIII-a robust metaanalytic finding. Haemophilia,10, 449-51）。
従って、本発明において、完全長の組換え型ＦＶＩＩＩと同様の比活性（ＣＳ、ＡＰＴＴ）および比活性の比（ＡＰＴＴ／ＣＳ）を有するｓｃＦＶＩＩＩを選択するために、ＣＳおよび凝固アッセイ（ＡＰＴＴ）で測定した比活性および比活性の比（ＡＰＴＴ／ＣＳ）を、実施例１−１で構築した各ｓｃＦＶＩＩＩについて解析し、結果をｓｃＦＶＩＩＩ選択のための基準として用いた。比較群として、インビボでの実際のＦＶＩＩＩと類似した、完全長で、二本鎖形態の組換え型ＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、Ｂａｘａｌｔａ）製品を、比較のためのコントロールとして用いた。
具体的には、本明細書で用いられるＦＶＩＩＩ活性測定試験法は、一段法（ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ｍｅｔｈｏｄ）および発色法である。一段法は、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、アクチベーター、リン脂質およびＦＶＩＩＩサンプルを混合し、次いで血液凝固時間を測定することによりサンプルのＦＶＩＩＩ活性を測定する方法である。発色法は、ＦＩＸａ、ＦＸ、トロンビン、カルシウム、リン脂質およびＦＶＩＩＩサンプルを混合した後、ＦＸａによって切断されたときに発色する発色基質を添加して、ＦＶＩＩＩサンプルによって活性化されたＦＸａの量を測定し、ＦＶＩＩＩの活性が発色基質の発色の程度に従って測定される方法である。これらの２つの方法の違いは、発色法はＦＶＩＩＩ欠損血漿を使用せずに、ＦＶＩＩＩの活性化に必要な因子および活性化型ＦＶＩＩＩを測定するための基質のみを添加した後に基質の発色の程度を測定するのに対し、一段法はＦＶＩＩＩ欠損血漿を使用して凝固時間を測定することである。
一段階法による活性測定は、ＡＣＬ ＴＯＰ ＣＴＳ ５００装置で、予め準備された自動アッセイ法を用いて以下のように行った。サンプルを、ＦＶＩＩＩ欠損血漿を用いて１ＩＵ／ｍＬに希釈して、標準サンプルをＮＩＢＳＣ ＦＶＩＩＩ標準バイアルに入れ、そこに１ｍＬの蒸溜水を加えることによって溶解し、次いでＦＶＩＩＩ欠損血漿を用いて１ＩＵ／ｍＬに希釈した。実験機器のラックのタイプに合わせて、消費試薬（consumption reagent）と測定サンプルを調製した。バイアルのバーコードが認識されるように、塩化カルシウムバイアルをＡＣＬ ＴＯＰ ＣＴＳ ５００機器のＲラックに連続的に入れ、また、磁気攪拌棒をＡＰＴＴ−ＳＰバイアルに入れ、次いでこれを、バイアルのバーコードが認識されるように、Ｒラックに入れた。サンプル数×４００μＬ（１サンプルあたり）に従い、ＦＶＩＩＩ欠損血漿を調製し、バーコードが認識されないようにバーコードの周りにテープを貼り、その後Ｒラックに入れた。ＤＡラックに、２．６３ｍＬのアルブミンを添加したＧ．Ｏ．バッファー（イミダゾール３．４ｇ、ＮａＣｌ５．８ｇ、１Ｌ、ｐＨ７．４）を含むバイアルを入れた。予め調製した４００μＬ以上のサンプルおよび標準サンプルをサンプルカップに入れた後、サンプルラックに入れた。ＡＣＬ ＴＯＰプログラムでは、認識されない試薬や測定サンプルの情報を入力し、予め準備された自動アッセイ法を実施した。自動アッセイ法における全ての反応は、３７℃で以下の通り進めた。まず、測定サンプルをＧ．Ｏ．バッファーで１０倍に予め希釈し、次いでさらにサンプルを１、３、および１０倍に希釈して、それぞれ１００％、３３、３３％、および１０％のサンプルを調製した。希釈した各サンプル５０μＬを３０〜４５秒間静置し、５０μＬのＦＶＩＩＩ欠損血漿と混合した後、６０〜７０秒間静置した。５０μＬの中間試薬ＡＰＴＴ−ＳＰを添加した後、３００〜３４０秒間静置し、最後に５０μＬの開始試薬（ＡＰＴＴ−ＳＰ ＣａＣｌ２）を添加した後、凝固時間を測定した。
発色法による活性測定については、ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ Ｃｏ．により発売されている発色アッセイキットをエンドポイント法として用い、製造者によって提供された試験方法を以下のように本試験に好適な方法に変更することによって試験を行った。具体的には、サンプルを、１×希釈バッファーを用いて、標準範囲（０．２５−１ＩＵ／ｍＬ）になるように希釈する。１×希釈バッファーを用いて、０、０．２５、０．５、および１ＩＵ／ｍＬの濃度で、キャリブレーション用血漿を調製した。調製したサンプル、および１０μｌのキャリブレーション用血漿を、７９０μＬの１×希釈バッファーにより希釈して、希釈したサンプル５０μｌを９６ウェルプレートに分注し、３７℃で５分間静置させた。５０μｌのファクター試薬（ｆａｃｔｏｒ ｒｅａｇｅｎｔ）を、自動分注ピペットを用いて各ウェルに分注し、その後３７℃で２分間反応させた。５０μの基質を各ウェルに分注し、その後発色のために３７℃で２分間静置させた。発色を示すサンプルに、５０ｍＬの２％クエン酸を添加することにより、反応を停止させた。吸光度を４０５ｎｍの波長で測定して線形検量線を描き、サンプルの吸光度を検量線に代入してサンプルの活性を測定した。
測定した結果を表２に示す。
発現の結果、培養液中のｓｃＦＶＩＩＩ発現レベルはＢドメインの長さが増加するにつれて増加し、１９８アミノ酸以上のＢドメインを有するｓｃＦ４、ｓｃＦ５、ｓｃＦ６、およびｓｃＦ７の発現レベルが顕著に増加したことが判明した。さらに、長さが９２アミノ酸以上のＢドメインを持つｓｃＦ３、ｓｃＦ４、ｓｃＦ５、ｓｃＦ６、およびｓｃＦ７は、比較のためにコントロールとして用いられる組換え形態の完全長ＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｂａｘａｌｔａ製品）と同様の比活性を示し、かつ、コントロールとして用いられるＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と同様のＡＰＴＴ／ＣＳ比もまた示した。一方では、１２８アミノ酸タンパク質配列よりも短いＢドメインを有する上述の実施例のｓｃＦ１、ｓｃＦ２およびｓｃＦ３は、比較のためにコントロールとして用いられる完全長ＦＶＩＩＩ、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）よりも、顕著に低い発現レベルを示し、８４アミノ酸タンパク質配列よりも短いＢドメインを有する上述の実施例のｓｃＦ１およびｓｃＦ２は、比較のためにコントロールとして用いられる完全長ＦＶＩＩＩ、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）よりも顕著に低い比活性を示した。
一本鎖ＦＶＩＩＩは、活性化ステップにおいて、重鎖および軽鎖をつなぐＢドメインを含有する部位でトロンビン切断することにより活性化される。重鎖および軽鎖の連結部位であるＢドメインの長さが短い場合、一本鎖ＦＶＩＩＩの活性に影響を及ぼし得る連結が短いことに起因する構造上の制約から、一本鎖ＦＶＩＩＩは通常、活性型ＦＶＩＩＩに変換されないと考えられる。しかしながら、二本鎖ＦＶＩＩＩの場合、このような構造上の制約はないため、トロンビン誘導性の活性化はＢドメインの長さに関係なくスムーズであると考えられ、これは、既存のＢドメインが完全に除去された二本鎖ＦＶＩＩＩの活性が、完全長ＦＶＩＩＩと同様の活性を示すという知見から明らかである。本発明において、予想外の努力により、一本鎖ＦＶＩＩＩのＢドメインの長さおよび配列を、トロンビンによる活性化に影響を及ぼさないように選択し、重鎖と軽鎖との間のトロンビンによる活性化部位（１６８９〜１６９０および７４０〜７４１；配列番号１の配列に基づく）は天然型（すなわち野生型）のＦＶＩＩＩと同様の方法で活性化され、比較のために用いられる完全長ＦＶＩＩＩと同様の比活性を示す一本鎖ＦＶＩＩＩを得た。
実施例１−３．構築したｓｃＦＶＩＩＩの発現パターンの解析
本明細書で構築した一本鎖ＦＶＩＩＩの培養液中での安定性を、ウェスタンブロット解析で確認した。
このために、培養液とＬＤＳサンプルバッファーを３：１の比で混合し、これを４〜１２％ビス−トリス（ＢＴ）ゲルと混合してサンプルを調製し、該サンプル３０μＬをロードして１５０ボルトで約１時間泳動した。泳動が完了したゲルをニトロセルロース（ＮＣ）メンブレンに移し、ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に１時間静置した。ＦＶＩＩＩの重鎖を認識する一次抗体（ＧＭＡ−０１２、Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および軽鎖を認識する一次抗体（ａｂ４１１８８、Ａｂｃａｍ）を、ＴＢＳＴバッファーで希釈することによって調製し、次いでブロッキングを完了したＮＣメンブレンに添加して、１時間反応させた。ＮＣメンブレンを、ＴＢＳＴバッファーを用いて５分間隔で３回洗浄した後、ＴＢＳＴバッファーで希釈した二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）を、１０分間ＮＣメンブレンと反応させた。その後、ＮＣメンブレンを、ＴＢＳＴバッファーを用いて５分間隔で５回洗浄した。ＮＣメンブレンを発色させるためにＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを散布した後、暗室中にて、該メンブレンをＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で発色させた。その結果、図３に示したように、一本鎖形態で作製したＦＶＩＩＩは全て、一本鎖形態で発現されたことが分かった。さらに、培養培地に分泌された、より短い長さのＢドメインを有する一本鎖ＦＶＩＩＩが、培養培地における分解がより少なく、より高い安定性を示すことが分かった。Ｂドメインが比較的短いｓｃＦ１、ｓｃＦ２、およびｓｃＦ３が、ｓｃＦ４、ｓｃＦ５、ｓｃＦ６、およびｓｃＦ７よりも優れた安定性を示したが、比較的低い発現レベルまたは低い比活性を示した。
本発明において、天然型の二本鎖ＦＶＩＩＩに由来する様々な長さのＢドメインを有する一本鎖ＦＶＩＩＩを構築し、それらの性質を解析した。Ｂドメインの長さが、発現レベル、比活性および安定性に及ぼす影響を評価し、それにより天然型のＦＶＩＩＩと同様の活性特性を有し、高い発現レベルを示す組換え型一本鎖ＦＶＩＩＩを調製した。
実施例２．ｓｃＦＶＩＩＩのペグ化
ペグ化位置の選択
Ｂドメインの一部を含む一本鎖ＦＶＩＩＩ中のＢドメインの配列および長さは、ＦＶＩＩＩの活性特性に影響を及ぼすことによって、組換え型血液凝固ＦＶＩＩＩの活性および特性に影響を及ぼすので、本実施例では、インビボでの持続性を提供するために、天然型の二本鎖ＦＶＩＩＩの活性特性を保持することができる長さおよび配列を有するＢドメインを含む、実施例１で調製したｓｃＦＶＩＩＩに基づいて、ペグ化位置を選択した。
Ｂドメインにおけるペグ化反応効率を最適化するために、ペグ化をＢドメインの様々な位置で行った。ペグ化はタンパク質の表面の残基を標的とするので、ペグ化位置を選択するためにはＢドメインの三次元構造が必要であるが、Ｂドメインの構造は知られておらず、ペグ化位置を選択することを困難にしている。本発明で選択されたＢドメインのペグ化位置は、Ｂドメインの糖鎖の周辺で、選択的にペグ化された。すなわち、糖鎖はタンパク質構造の外側に位置しており、Ｂドメインの糖鎖周辺の残基は常に外側を向いている可能性があり、これはペグ化に有利であると考えられる。しかしながら、残基が糖鎖に近いほど、糖鎖がＰＥＧの接近を妨げることによる立体障害が原因で、ペグ化が困難になり得るという問題があった。本発明において、Ｂドメインのタンパク質構造において外側に向いており、糖鎖による立体障害から開放されていることで高いペグ化効率を確保する、糖鎖から適切な距離に位置する糖鎖近傍の残基を、予想外の努力により選択した。
本実施例では、表３および図４に示すように、実施例１で構築したＧ４に基づいて、Ｂドメインの糖鎖近傍の様々な位置に、すなわち、Ｎ−糖鎖に基づいて＋６〜−６残基の間に、システインが導入された組換え型ｓｃＦＶＩＩＩを産生し、導入されたシステインに対してペグ化を選択的に行った。これらのペグ化はＧ４および一本鎖ＦＶＩＩＩに関して記載されているが、本明細書で同じ論理を用いて構築された糖鎖を含む他のｓｃＦＶＩＩＩのペグ化にも適用することができる。
実施例２−１．特定の部位がシステインで置換されたｓｃＦＶＩＩＩ発現ベクターの構築
システイン置換部位を含むＦＶＩＩＩ重鎖のＡ２ドメインに存在するＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）から、軽鎖およびＰａｃｌ酵素切断部位までの配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより遺伝子を合成した。続いて、既存の対応するＦＶＩＩＩの領域を、実施例１−１で作製したｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４発現ベクターから、酵素ＢａｍＨＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、システインで置換されたｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ａ３−１または４Ｌ）発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さを、配列解析により確認した。さらに、ｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４（Ａ２−１、Ａ２−２、またはＡ２−３）については、システイン置換部位を含むＦＶＩＩＩ重鎖のＡ１ドメインに存在するＡｓｉｓＩ酵素切断部位から、ＦＶＩＩＩ重鎖のＡ２ドメインに存在するＫｐｎＩ部位（ＧＧＴＡＣＣ）までの配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより遺伝子を合成した。続いて、既存の対応するＦＶＩＩＩの領域を、実施例１−１で作製したｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４発現ベクターから、酵素ＡｓｉｓＩ／ＫｐｎＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＡｓｉｓＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングし、システインで置換されたｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４（Ａ２−１、Ａ２−２、またはＡ２−３）発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さを、配列解析により確認した。
実施例１−２と同じ方法により、システインが導入された構築されたｍｓｃＦＶＩＩＩ発現ベクターを用いて、一過性発現を行った。システインを導入したＦＶＩＩＩのそれぞれの発現レベルを、以下の表３に示す。表３に示すように、Ｂドメインのグリカン鎖の周辺にシステインが導入されたｓｃＦＶＩＩＩ変異体は、培養液中で正常に発現していることがわかった。その発現レベルはシステインの導入前のｓｃＦＶＩＩＩより幾分低かったが、これはｓｃＦＶＩＩＩに導入されたシステインが培養液中のｓｃＦＶＩＩＩの発現プロセスおよび安定性に影響を及ぼすことを示唆している。
実施例２−２．ペグ化
ペグ化位置のスクリーニングのために、実施例２−１にようにシステインを導入したｓｃＦＶＩＩＩ変異体のペグ化を、以下の通り行った。５０ｍｌの細胞培養液を５ｋＤａ ＭＷＣＯ(分画分子量)で２０倍に濃縮して、５Ｍの高濃度ＮａＣｌ溶液をそこに添加し、最終濃度１Ｍ ＮａＣｌとした。平衡バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）で平衡化した０．１ｍＬ容量のＶ８選択樹脂（Ｖ８ ｓｅｌｅｃｔ ｒｅｓｉｎ）（ＧＥ）を０．１ｍＬと、濃縮したサンプルを一緒に十分に撹拌し、平衡化バッファーで洗浄し、溶出バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０、５０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール）で溶出した。溶出したサンプルを、５ｋＤａのＭＷＣＯメンブレンを用いて、ペグ化バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０、５％（ｗ／ｖ）スクロース）で置換し、次いでＴＣＥＰを最終濃度０．２ｍＭで処理し、４℃で１時間反応させた。その後、反応物のＴＣＥＰを除去するため、サンプルをペグ化バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０、５％（ｗ／ｖ）スクロース）で脱塩し、次いで、マレイミドＰＥＧ ４０ｋＤａ（ＮＯＦ）をモル比１：２０（ｓｃＦＶＩＩＩ：マレイミドＰＥＧ ４０ｋＤａ）で添加し、得られたものを４℃で１時間反応させた。
システインが導入されたｓｃＦＶＩＩＩ変異体では、細胞培養によって発現された場合、システインは、システインまたはグルタチオンによってジスルフィド結合によりマスクされている。従って、マスキングしているシステインおよびグルタチオンは、ペグ化のために除去されるべきである。本発明においては、システインの遊離のチオール基をマスキングしているシステインまたはグルタチオンを除去するために、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を添加し、ＴＣＥＰを、脱塩カラム（ＰＤ１０）を通して除去した。その後、得られたものを、マレイミド−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）で処理してペグ化した。
ペグ化の程度を解析するために、ペグ化された反応物についてＳＤＳ ＰＡＧＥを行った。
結果を図６に示す。システインが導入されたＧ４ｓｃＦＶＩＩＩ変異体は培養液中において活性型で発現され、ペグ化が容易に進行したことがわかった。システインの導入部位によって発現レベルおよびペグ化効率に違いがあり、導入されたシステインの部位によってＦＶＩＩＩの安定性とペグ化反応に違いがあるためと考えられる。
実施例３．ペグ化されたｓｃＦＶＩＩＩの産生
本実施例では、実施例２で選択した部位でペグ化されたｓｃＦＶＩＩＩを以下の通りに産生した。さらに、ペグ化されたｓｃＦＶＩＩＩを産生し、インビボでの長時間作用性血液凝固ＦＶＩＩＩとしてのその活性と、血液凝固ＦＶＩＩＩの活性に及ぼすペグ化の影響を評価した。ｓｃＦＶＩＩＩのＢドメインにおける７８２番目のイソロイシンがシステインで置換されたｓｃＦＶＩＩＩである、Ｇ４およびＢ３の部位特異的コンジュゲートを産生し、それらの活性をＣＳおよびＯＳ（ＡＰＴＴ）法により測定し、二本鎖形態の組換え型血液凝固ＦＶＩＩＩであるＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較した。
実施例３−１．細胞培養
実施例２−１でシステインを導入して構築したｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４（Ｂ３）およびｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４（Ａ２＿１）を各細胞で発現させ、培養した。具体的には、発現のために、実施例２−１で構築した発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１４６３５）を用いて、製造元の方法に従い、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞にトランスフェクトした。要するに、形質転換時に、細胞の数および細胞生存率を測定し、細胞生存率が９５％以上の場合に形質転換を実施した。Ｅｘｐｉ２９３培養培地を１２５ｍＬフラスコに加えて、７．５×１０７の濃度の細胞を得、２５．５ｍＬに調節した。実施例２−２で構築した発現ベクター３０μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合して、全量１５００μｌを得た。トランスフェクション試薬８０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合して、全量１５００μｌとし、室温で５分間インキュベートした。５分後に、トランスフェクション試薬を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭを、ＤＮＡ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに加えて、それを穏やかに混合した。２０分〜３０分間、反応を室温で実行した。３ｍＬのＤＮＡ：トランスフェクション試薬混合物を、予め調製した１２５ｍＬフラスコのＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞に滴下して（全量：２８．５ｍＬ）、細胞を５％ＣＯ２振とう培養器中、３７℃、１２５ｒｐｍでインキュベートした。１６〜２０時間後、それぞれ１５０μＬおよび１．５ｍＬの、エンハンサー１およびエンハンサー２をそこに加えて、細胞を、３４℃および５％ＣＯ２の振とう培養器中、１２５ｒｐｍで培養した。培養２日目に、全ての細胞を遠心分離して既存の培養培地を完全に取り除いた。細胞を３０ｍＬの新しい培養培地に完全に再懸濁して、５％ＣＯ２振とう培養器中、３４℃、１２５ｒｐｍで培養した。トランスフェクションから３日目に、ｓｃＦＶＩＩＩを発現した細胞を全て遠心分離し、培養液を回収した。培地の回収後に残っている細胞を、同じ容量の新しい培養培地に再懸濁し、３４℃で１日培養した。このプロセスを、トランスフェクションから５日目まで繰り返し、３日目、４日目、および５日目の培養液を回収し、システインを導入したｓｃＦＶＩＩＩの活性解析と精製を行った。
実施例３−２．ペグ化および精製
ペグ化および精製プロセスは、５つのステップから構成される。実施例３−１の培養培地の３、４、および５日目の培養液をプールして精製した。
第１のステップでは、ＧＥ社が精製用に開発したＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を用いて、培養培地からのＦＶＩＩＩの分離および精製のプロセスを実施した。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂をカラムに充填し、カラムを２％クエン酸で洗浄した。平衡バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）を流して、カラムを平衡化した。５Ｍ ＮａＣｌバッファーを最終濃度１Ｍ ＮａＣｌになるまで培養液に添加し、次いでこれをｐＨ７．０に滴定し、カラムにロードした。培養液をロードした後、ＵＶがベースラインに下がるまで平衡バッファーを流して平衡化した。ＦＶＩＩＩを、溶出バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．９Ｍアルギニン、４５％プロピレングリコール、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ６．５）を流すことにより迅速に溶出した。
また、第２のステップでは、ＧＥ社製ＳＰファーストフロー（SP fast flow）樹脂を用いて、第１のステップの溶出液中に混入しているプロピレングリコールを迅速に除去するステップを実施した。ＳＰファーストフロー樹脂をカラムに充填した後、洗浄バッファー（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ）を流すことによってカラムを洗浄した。平衡バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）を流して平衡化した。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔプロセスの溶出液を、平衡バッファーによって１０倍に希釈し、ｐＨ７．０に滴定した後、カラムにロードした。ロードした後、ＵＶがベースラインに下がるまで平衡バッファーを流して平衡化した。ＦＶＩＩＩを、溶出バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ６．５）を流すことにより迅速に溶出した。
第３のステップでは、精製したｓｃＦＶＩＩＩをＰＥＧとコンジュゲートさせるプロセスを実施した。ＴＣＥＰを、精製したｓｃＦＶＩＩＩ溶液に最終濃度０．１ｍＭになるまで添加し、４℃で１時間静置して挿入されたシステインを還元させた。ペグ化バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（GE healthcare）を用いて残留ＴＣＥＰを除去した。４℃で２時間静置して、還元型ＦＶＩＩＩ自体のジスルフィド結合を酸化させた。ｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４（Ｂ３）にＰＥＧをコンジュゲートさせるために、ＰＥＧ対タンパク質の比が１：２０となるように、ＤＭＳＯに溶解した４０ｋＤａ分岐鎖型メトキシマレイミドＰＥＧ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、次いで４℃で１２〜１６時間静置した。ｓｃＦＶＩＩＩ Ｇ４（Ａ２＿１）ＰＥＧコンジュゲーションは、６０ｋＤａの分岐鎖型のメトキシマレイミドＰＥＧを用いて実施した。
また、第４のステップでは、ペグ化プロセス中に形成された不純物である、ＰＥＧを含まないｓｃＦＶＩＩＩおよび２つ以上のＰＥＧを含むｓｃＦＶＩＩＩを除去するプロセスを、ＧＥ社のＳＰファーストフロー樹脂を用いて行った。ＳＰファーストフロー樹脂をカラムに充填し、洗浄バッファー（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ）で洗ってカラムを洗浄した。平衡化バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）を添加して平衡化した。ペグ化ＦＶＩＩＩを平衡化バッファーで１０倍に希釈し、ｐＨ７．０まで滴定し、カラムにロードした。ロードした後、ＵＶがベースラインに下がるまで平衡バッファーを流して平衡化した。溶出バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ６．５）のＮａＣｌの濃度を段階的に上昇させながら、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩを選択的に溶出した。
最後に、第５のステップでは、第４のステップで溶出した、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩを濃縮した。この目的のために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のａｍｉｃｏｎ ３０ｋＤａを使用してＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩを２５ＩＵ／ｍＬに濃縮した。
実施例３−３．活性測定
実施例３−２で用いた精製したペグ化ｓｃＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３、およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ａ２−２）の活性を、ＣＳおよびＡＰＴＴ法により測定した。ＣＳ試験は、実施例１−２で記載したのと同じ方法により実施し、ＡＰＴＴ試験は、実施例１−２に記載した方法を変更することにより実施した。ペグ化ＦＶＩＩＩの活性をＡＰＴＴ法で測定する場合、コロイダルシリカ系のＡＰＴＴ−ＳＰをアクチベーターとして使用すると分析時に本来の値より低い活性値が得られるのに対し、エラグ酸系のｓｙｎｔｈＡＦａｘ（ＩＬ）を使用すると、正常な活性が測定されることが知られている（Gu. J. M. et al., 2014. Evaluation of the activated partial thromboplastin time assay for clinical monitoring of PEGylated recombinant Factor VIII (BAY 94-9027) for haemophilia A. Haemophilia, 20, 593-600）。ペグ化ｓｃＦＶＩＩＩの性質を考慮して、ＳｙｎｔｈＡＦａｘをＡＰＴＴ試験におけるアクチベーターとして使用した。実施例１−２での方法と同じ方法を、他の試験法についても用いた。結果を表４に示す。
実験の結果、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ａ２−２のＡＰＴＴ／ＣＳ比（ＡＰＴＴ／ＣＳ）は、比較物質として用いた完全長のＢドメインを含む二本鎖ＦＶＩＩＩであるＡＤＶＡＴＥ（登録商標）のＡＰＴＴ／ＣＳ比と同様であるが、該Ｂドメインが除去された二本鎖ＦＶＩＩＩであるＸｙｎｔｈａのＡＰＴＴ／ＣＳ比とは異なることがわかった。天然型ＦＶＩＩＩの活性が、ＣＳおよびＡＰＴＴにおいてほとんど同じであることを考慮すると、この結果は、本発明により産生されたｓｃＦＶＩＩＩタンパク質が、一本鎖形成およびペグ化により、血液凝固ＦＶＩＩＩの活性特性において変化を示さなかったことを示した。ＸｙｎｔｈａはＢドメインを完全に除去した組換え型ＦＶＩＩＩであり、本実施例では、その血液凝固活性（ＡＰＴＴ）が、ＣＳにおける活性と比較して低下し、これは、Ｂドメインが完全に除去されると凝固活性が低下するという以前の報告と一致する。ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ａ２−２が一本鎖形成およびペグ化後も血液凝固活性を維持することを考慮すると、本発明のこれら２つの物質は血友病治療薬としての利点を有すると考えられる。
実施例４．動物ＰＫ試験
ペグ化ｓｃＦＶＩＩの半減期を、１１〜１２週齢の血友病Ａマウスモデル（Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ＴＭ１Ｋａｚ／Ｊ（ＦＶＩＩＩノックアウト）、ペンシルベニア大学から供給され、育種し、遺伝子型判定によって確認した）で、比較物質であるＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較した。試験物質は、Ｇ４（ｓｃＦＶＩＩＩ）、ＰＥＧ４０ｋＤａ−Ｇ４ｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３（Ｇ４のＢドメインの７８２イソロイシンをシステインで置換した後に、４０ｋＤａの分岐鎖型ＰＥＧマレイミドで位置特異的にペグ化した（実施例３参照））、ＰＥＧ６０ｋｄａ−Ｇ４ｓｃＦＶＩＩＩ−Ａ２−２（Ｇ４のＡ２ドメインの４９５バリンをシステインで置換した後に、６０ｋＤａの分岐鎖型ＰＥＧマレイミドで位置特異的にペグ化した）、およびＡｄｖａｔｅ（登録商標）（二本鎖組換え型ＦＶＩＩＩ）であった。
薬物動態に用いた試験動物は血友病マウス（雌）であり、各サンプルを３匹の動物に尾静脈内に１２５ＩＵ／ｋｇのレベルで投与した。血液サンプルを、投与後の各時点（５分、４時間、８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４０時間、４８時間、５６時間、および７２時間）で眼窩（ｏｒｂｉｔ）から回収し、これを抗凝固剤（３．２％クエン酸ナトリウム）により１０％で処理し、遠心分離して血漿を除去した。実施例１−２に記載のＣＳアッセイ試薬を用いて、血漿中に存在するＦＶＩＩＩの活性を測定した。各時点で各サンプル群のマウスから回収した血漿におけるＦＶＩＩＩ活性の平均のプロファイルを図７に示す。
ＰＫパラメータ解析については、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用いて、ＮＣＡ（非コンパートメント解析）により、血漿中のＦＶＩＩＩ ＣＳ活性測定値の平均値および標準偏差を計算した。その結果を表５に示す。薬剤の半減期は次の順序であることがわかった：Ｂ３≒Ａ２−２＞Ｇ４＞Ａｄｖａｔｅ（登録商標）（表５）。平均データに基づいて評価した場合、薬剤Ｂ３、Ａ２−２、およびＧ４の半減期は、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）に基づいて、それぞれ約１．９倍、約１．８倍、および約１．２倍延長した（表５）。

実施例５．動物ＰＤ（薬力学）試験（長期間）
マウスの尾の出血についての凝固効果を以下のように測定した。
実験概要を図８Ａに示す。具体的には、１１〜１２週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈが提供）および血友病Ａマウス（Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８ＴＭ１Ｋａｚ／Ｊ（ＦＶＩＩＩノックアウト）、ＦＶＩＩＩ ＫＯマウス）（ペンシルベニア大学から供給され、育種し、遺伝子型判定によって確認した）を、試験に用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、７日間馴化プロセスに供した。試験当日、１５ｍＬコニカルチューブに生理食塩水を１５ｍＬまで充填した後（ラット１匹あたり１つ）、生理食塩水の温度を３７℃に調節するために、チューブを加熱したウォーターバスに浸した。試験物質の投与前に、マウスの体重を測定して記録した。Ｅｎｔｏｂａｒ（ペントバルビタールナトリウム）を６０ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内に投与して、マウスを麻酔した。マウスの体重（１９〜２５ｇ）に基づき試験物質の容量を計算した後、試験物質を頸静脈に投与した。５分後に、マウスの尾を尾の端から４ｍｍの位置で切断した。約２ｃｍのマウス尾切断物を直ちに生理食塩水を含むコニカルチューブに浸し、３０分間採血した。
試験物質は実施例３で調製したＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３であり、これをＡｄｖａｔｅ（登録商標）と比較した。各試験物質群に含まれる、用量（用量および投与容量）およびマウスの配分（distribution）を以下の表６に示す。
各マウスから３０分間採取した血液を１５００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去した後、１０ｍＬピペットを用いて三次蒸留水（ｔｅｒｔｉａｒｙ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）をコニカルチューブに１０ｍＬまで添加し、その後、血液をボルテックスを用いて完全に溶血させた。失血量の測定を、ヘモグロビンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ、ＭＡＫ１１５−１ＫＴ）により提供されたマニュアルに従って行った。要するに、０．９ｍｌの三回蒸留水と０．１ｍｌの溶血サンプルとを、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、１０倍希釈するためによく混合した。９６ウェルプレート（２連（duplication））に５０μｌの３次蒸留水と５０μｌの標準物質を入れ、その上に２００μｌの３次蒸留水を加えた。各マウス溶血サンプル５０μｌをウェル（２連（duplication））に入れ、その上に２００μｌの試薬を加えた。入れた物質がよく混合されるように９６ウェルプレートを軽くたたき、マルチモードプレートリーダーを用いて４００ｎｍで吸光度を測定した。
吸光度の値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ ５．０１のダネット多重比較検定による一元配置分散分析（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて、吸光度値を失血量の値（Ｈｂ ｎｍｏｌ）と統計的に比較した。０．０５より大きいｐ値は統計的に有意な差ではないと考え、０．０５未満のｐ値は統計的に有意な差と考えた。
試験結果は、４０ｋＤａＰＥＧ−Ｇ４ｓｃＦＶＩＩ−Ｂ３とＡｄｖａｔｅ（登録商標）とを、５０、１００、および２００ＩＵ／ｋｇ投与した群はすべて、ＨＡ群の失血量の値と比較した場合に統計的に有意な差を示すことを示した。ＨＡマウスに４０ｋＤａのＰＥＧ−Ｇ４ｓｃＦＶＩＩ−Ｂ３とＡｄｖａｔｅ（登録商標）とを投与した後、急性尾切断（tail clip）試験を行った。その結果、２つの試験物質は共に、濃度依存的に失血量を減少させることがわかった（図８ｂ参照）。
まとめると、本発明において、発現に優れ、最大の天然のＦＶＩＩＩ活性を有し、かつ安定で培養培地中での分解を防ぐことができるｓｃＦＶＩＩＩを選択するために、種々の長さおよび配列のＢドメインを含むｓｃＦＶＩＩＩを、それらの活性を互いに比較しながら調製して発現させ、その後、安定性を確認することにより、血友病Ａ型治療薬として有用な性質を有するｓｃＦＶＩＩＩを開発した。さらに、本発明において開発されたｓｃＦＶＩＩＩに基づいて、様々なペグ化されたコンジュゲートを調製することにより、延長された半減期を有し、そのため治療薬としての有用性が改善された、ＦＶＩＩＩのペグ化されたコンジュゲートを開発した。
本発明を上述の特定の実施形態に関連して説明してきたが、当業者によってなされ得る、特許請求の範囲に規定されるような本出願の基本概念を使用した様々な修正および変更もまた本発明の範囲内に含まれることが、理解されるべきである。
本発明において使用された全ての技術用語は、他に特定されない限り、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。参考文献として本明細書に開示されている全ての刊行物の内容が、本発明に組み込まれる。

Claims (23)

  1. ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の重鎖、軽鎖、および部分的に欠失しているＢドメイン断片を含む一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子であって、部分的に欠失しているＢドメイン断片が、フューリンプロテアーゼによる切断部位を含まないように、配列番号１の残基１６４８からＮ末端方向に少なくとも５つのアミノ酸と、配列番号１の残基１６４９からＣ末端方向に少なくとも５つのアミノ酸とを欠失し、かつ４〜６つの糖鎖付加部位を含有する、一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  2. 部分的に欠失しているＢドメイン断片が、野生型Ｂドメイン配列の１５〜４０％を含む、請求項１に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  3. 部分的に欠失しているＢドメイン断片が、配列番号１の配列に基づく、（ｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９；（ｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９６５および１６５４〜１６８９；または（ｉｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２、１６３７〜１６４２、および１６５４〜１６８９の配列を有する、請求項２に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  4. 一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子が、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６により表される配列、または、前記配列に９０％以上の配列相同性を有する配列を有する、請求項３に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  5. ＣＳまたはＡＰＴＴ法で測定した場合に、二本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子の９０％以上の比活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  6. 血液凝固第ＶＩＩＩ因子がＡドメインおよび／またはＢドメイン断片のいくつかのアミノ酸残基で親水性ポリマーにコンジュゲートしており；
    Ｂドメイン断片のコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５および８９７からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつ、Ａドメインのコンジュゲート位置が配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つであり；かつ、
    コンジュゲート位置の残基が親水性ポリマーとのコンジュゲートのためにシステインで置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  7. 親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド、デキストラン、またはポリシアル酸を含み、ＰＥＧが、該位置で、アクリロイル、スルホン、またはマレイミドを介して連結されている、請求項６に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  8. ＰＥＧが平均分子量２０ｋＤａ以上を有する、請求項５に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  9. 配列番号２〜７のいずれかのアミノ酸配列で表される、請求項１に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  10. 請求項６に記載の配列番号２〜７におけるコンジュゲート位置の残基がシステインで置換されたアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  11. 請求項９または１０に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
  12. 請求項９に記載のタンパク質をコードする核酸分子が、配列番号１０〜１５のいずれかであり、請求項１０に記載のタンパク質をコードする核酸分子が、配列番号１７〜３２のいずれかである、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 請求項１１または１２に記載の核酸分子を含むベクター。
  14. 請求項１３に記載のベクターを含む細胞。
  15. 一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子を産生する方法であって、
    請求項１３に記載のベクターを真核細胞にトランスフェクトすること；または代わりに請求項１４に記載の細胞を提供すること；
    細胞を培養液中で培養することにより、導入されたシステインの遊離のチオール基がシステインまたはグルタチオンによるジスルフィド結合によりマスクされている一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子を発現させること；
    培養液から発現した一本鎖ＦＶＩＩＩを回収して、一本鎖ＦＶＩＩＩを還元剤で処理してマスクしたシステインまたはグルタチオンを遊離させること；および、
    処理した培養液をペグ化バッファーで処理すること、
    を含む方法。
  16. ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の重鎖、軽鎖、および部分的に欠失しているＢドメイン断片を含む一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子であって、
    部分的に欠失しているＢドメイン断片が、フューリンプロテアーゼによる切断部位を含まないが、少なくとも４つの糖鎖付加部位を含み；かつ
    部分的に欠失しているＢドメイン断片が、配列番号１の配列に基づく、（ｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９；（ｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９６５および１６５４〜１６８９；または（ｉｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２、１６３７〜１６４２、および１６５４〜１６８９の配列を有する、一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  17. ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の重鎖、軽鎖、および部分的に欠失しているＢドメイン断片を含む一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子であって、
    部分的に欠失しているＢドメイン断片が、フューリンプロテアーゼによる切断部位を含まないが、少なくとも４つの糖鎖付加部位を含み；
    部分的に欠失しているＢドメイン断片が、配列番号１の配列に基づく、（ｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９；（ｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９６５および１６５４〜１６８９；または（ｉｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２、１６３７〜１６４２、および１６５４〜１６８９の配列を有し；
    Ａドメインおよび／またはＢドメインのいくつかの残基がペグ化され；かつ
    Ｂドメインにおけるペグ化された残基の位置が、配列番号１の配列に基づく、アミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５および８９７からなる群から選択される少なくとも１つであり；かつ、Ａドメインにおけるペグ化された残基の位置が、配列番号１の配列に基づく、アミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つである、一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  18. ペグ化された残基がシステインで置換されている、請求項１７に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  19. ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の重鎖、軽鎖、および部分的に欠失しているＢドメイン断片を含む一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子であって、
    部分的に欠失しているＢドメイン断片が、フューリンプロテアーゼによる切断部位を含まないが、少なくとも４つの糖鎖付加部位を含み;
    部分的に欠失しているＢドメイン断片が、配列番号１の配列に基づく、（ｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９；（ｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９６５および１６５４〜１６８９；または（ｉｉｉ）アミノ酸残基７４１〜９０２、１６３７〜１６４２、および１６５４〜１６８９の配列を有し;
    Ａドメインおよび／またはＢドメインのいくつかの残基がペグ化され;
    Ｂドメインにおけるペグ化された残基の位置が、配列番号１の配列に基づく、アミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５および８９７からなる群から選択される少なくとも１つであり；かつ、Ａドメインにおけるペグ化された残基の位置が、配列番号１の配列に基づく、アミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つであり;かつ
    ペグ化された残基がシステインで置換されている、一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子。
  20. 血友病を治療するための方法であって、請求項１〜１０または１６〜１９のいずれか一項に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  21. 血液凝固のための方法であって、請求項１〜１０または１６〜１９のいずれか一項に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
  22. 請求項１〜１０または１６〜１９のいずれか一項に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子、および医薬的に許容される担体を含む、血友病を治療するための組成物。
  23. 血友病の治療のための、請求項１〜１０または１６〜１９のいずれか一項に記載の一本鎖血液凝固第ＶＩＩＩ因子の使用。
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