JP2005526505A

JP2005526505A - ヒトゲラチナーゼａのｃドメイン及びポリエチレングリコールの接合体、その精製方法及び使用

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Publication number: JP2005526505A
Application number: JP2003572604A
Authority: JP
Inventors: ディモウディス，ニコラオス; コペツキ，エルハルト; ランツェンドエルファー，マルティン; シュオイアー，ベルナー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-03-02
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2005-09-08
Also published as: EP1482982A1; AU2003227028A1; WO2003074089A1; CA2475370A1; US20050153416A1

Abstract

ヒトゲラチナーゼAのCドメイン（PEXドメイン、PEX）；及び約10〜40kDaの全体分子量を有し、そして前記PEXの第一アミノ基を通して結合される、１〜３個のポリ（エチレングルコール）基を含んで成る接合体は、癌の処理のために有用である。

Description

本発明は、ヒトゲラチナーゼAのCドメイン（PEXドメイン、PEX）とポリエチレングリコール（PEG）との接合体、その医薬組成物、調製及び精製方法及び使用方法に関する。

基質メタプロテイナーゼ（MMP）は、細胞外基質及び基礎膜のすべての成分を一緒に分解することができるタンパク質加水分解酵素のファミリーを構成する。MMP活性は、胚形成、転移及び炎症性疾患を包含する生理学的及び病理学的工程の間、役割を演じる（Nicolson, G. L.,など. , Curr. Opin. Cell Biol. 1 (1989) 1009-10019; StetlerStevenson, W. G. , など. , Annu. Rev. Cell Biol. 9 (1993) 541-573; Docherty, A. J., and Murphy, G. , Ann. Rheum. Dis. 49 (1990) 469-479; 及び Woessner, J. F. , Jr. , FASEB J. 5 (1991) 2145-2154）。MMPは、異なった構成ドメイン、例えばNH₂−末端チモーゲン、触媒ドメイン、及びヘモペキシン−様ドメインとも呼ばれるC−末端ドメインにおいて組織化される。

ガラチナーゼA（72−kDaゲラチナーゼ、MMP-2、EC3.4.24.24）は、前記基質メタロプロテイナーゼのファミリーメンバーである。ガラチナーゼAは、Swiss-Prot Database under No. P08253 and by Collier, I. E. , など. , Genomics 9 (1991) 429-434に記載されている。その不活性形は、その活性部位をブロックするプロドメインを含むプロゲラチナーゼと呼ばれる。

プロゲラチナーゼAの細胞表面活性化は、プロゲラチナーゼA、TIMP-2及びMT1-MMP間の複合体において生じる。MT1-MMPは、そのプロドメインを分解し、そして従ってこの酵素を活性化することによって、MMP2に対して作用する（Murphy, G. ,など. , APMIS 107 (1999) 33-44; Nagase, H. , 及び Woessner, J. F. , J. Biol. Chem. 274 (1999) 21491- 21494を参照のこと）。活性化されたMMP2による細胞外基質分解は、固形腫瘍からの腫瘍細胞の逸脱及び転移の形成のための先行必要条件の１つである（Cockett, M. I. , など. , Biochem. Soc. Symp. 63 (1998) 295-313）。

この機構に基づいて、ゲラチナーゼAの阻害が、一次腫瘍の成長、腫瘍細胞の侵入及び転移を妨げ、そして脈管形成を阻害することが仮定される（Pfeifer, A. , など. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 12227-12232; Silletti, S. ,など. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 119-124）。そのようなインヒビターはまた、Brooks, PC.,など., Cell 92 (1998) 391-400により提案されるように、単離されたPEXドメインであり得る。

PEXはインテグリンavb3に結合し、そして損なわれていないMMP2の結合を阻害する（Brooks, P.,など., Cell 85 (1996)683-693）。さらに、PEXは、脈管形成及び腫瘍増殖を阻害する（Brooks, P., など., Cell 92 (1998) 391-400）。Pfeifer, A. , など. , in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 12227-12232は、PEXのレンチウィルス供給による脈管形成の抑制を記載する。Bello, L. , など. , in Cancer Res. 61 (2001) 7501-7506は、PEXと組み合わされる化学療法、及びグリオーム脈管形成、細胞増殖及び侵入のPEXによる阻害を記載する。しかしながら、PEX処理は、生存性及び誘発された重度の副作用の改良性をもたらさなかった。

ポリ（エチレングリコール）（PEG）によるタンパク質の共有修飾は、身体におけるいくらかのタンパク質の循環半減期を拡張する方法であることがわかっている（Hershfield, M. S. , など., New England Journal of Medicine 316 (1987) 589-596; 及び Meyers, F. J. , など. , Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313）。PEG化の他の利点は、溶解性上昇及びタンパク質免疫原生低下である（Katre, N.V., J. Immunol. 144 (1990) 209-213）。タンパク質のPEG化のための方法は、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）のようなアミノ反応性試薬により活性化されたポリ（エチレングリコール）の使用である。そのような試薬により、ポリ（エチレングリコール）は、遊離第一アミノ基、例えばリシン残基のN−末端α−アミノ基及びε−アミノ基でタンパク質に結合される。

しかしながら、このアプローチの主な制限は、タンパク質が典型的には、相当量のリシン残基を含み、そして従って、ポリエチレン基がすべての遊離ε−アミノ基で非特異的態様でタンパク質に結合され、ランダムのPEG化されたタンパク質の異種生成物混合物がもたらされることである。従って、多くのNHS−PEG化は、低い比活性及び異種性のために、商業的使用のためには不適切であり、そして一定のポリペプチドのPEG化に何が影響を及ぼすかを予測することは不可能である。不活性化は、１又は複数のリシン残基又は生物学的活性のために必要とされるN−末端アミノ酸残基の共有修飾、又はタンパク質の活性部位近くか又はその位置でのポリ（エチレングリコール）残基の共有結合に起因する。

例えば、NHS−PEG化試薬を用いてのヒト成長ホルモンの修飾がタンパク質の生成学的活性を、10倍以上、低めることが見出された（Clark, R. , など. , J. Biol. Chem. 271 (1996) 21969- 21977）。ヒト成長ホルモンは、N−末端アミノ酸の他に、９個のリシンを含む。一定のそれらのリシンは、受容体結合のために決定的であることが知られているタンパク質の領域に位置する（Cunningham, B. C. , など., Science 254 (1991) 821- 825）。さらに、アミノ反応性ポリ（エチレングリコール）試薬の使用によるエリトロポイエチンの修飾はまた、生物学的活性のほぼ完全な損失をもたらす（Wojchowski, D. M. ,など. , Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232）。

アミノ反応性PEG化試薬によるインターフェロンα２の共有修飾は生活性の40〜70％の損失をもたらす（アメリカ特許第5,282,657号）。G-CSFの類似する修飾は、活性の60％以上の損失をもたらし（Tanaka, H. , など. , Cancer Research 51 (1991) 3710-3714）、そしてインターロイキン−２の修飾は、生活性90％以上の損失をもたらす（Goodson, R. J. , and Katre, N. V. , BioTechnology 8 (1990) 343- 346）。
腫瘍処理のための許容できる治療活性及び効能を有し、そして癌を有する患者の生存性を高めることができるPEXタンパク質形を見出すことが、本発明の目的である。

本発明は、PEXの第一アミノ基のPEG化により、１〜３個のポリエチレングリコール（PGE）基（PEG化されたPEX）を形成するたに共有結合されるPEXから成る接合体を提供する。そのような接合体は驚くべきことには、修飾されていないPEXによる処理に比較して、腫瘍処理において生存率に対して陽性の影響を有する。
従って、本発明は、ヒトゲラチナーゼAのCドメイン（PEXドメイン、PEX）；及び約10〜40kDaの全体分子量を有し、そして前記PEXの第一アミノ基を通して結合される、１〜３個のポリ（エチレングルコール）基を含んで成る接合体を提供する。

本発明によれば、ポリ（エチレングリコール）基は好ましくは、下記式：
-CO-(CH₂)x-(OCH₂CH₂)mOR
[式中、−CO基は前記PEXの１つのアミノ基とアミド結合を形成し；
xは２又は３であり；
ｍは、ポリ（エチレングリコール）基の分子量に依存して、約220〜約900であり；
Rは低級アルキルである]を有する。

本発明によれば、好ましい接合体は、下記式I：
P-[NHCO-(CH₂)x-(OCH₂CH₂)m-OR]n （I）
[式中、ｘは２又は３であり；
x、R及びｍは上記に定義された通りであり；
ｎは１〜３であり；
Pは、ポリ（エチレングリコール）基と共にアミド結合を形成する、ｎ個のアミノ基を有さない前記PEXである]
を有する。

枝分かれ鎖のPEGを含んで成る接合体がまた好ましい。
本発明はさらに、本発明の接合体の生成方法も包含する。
本発明はさらに、本発明の接合体を含む医薬組成物も包含する。
本発明はさらに、医薬的有効量で本発明の接合体を含む医薬組成物の生成方法も包含する。
本発明はさらに、癌の処理に有用な薬剤の調製のためへの本発明の化合物の使用も包含する。
本発明はさらに、医薬的有効量のアミノ反応性PEG化されたPEXが週当たり１〜７回のボーラス適用で、その必要な患者に投与されることを特徴とする、ヒト癌（例えば、乳、肺、前立腺又は結腸癌）の処理方法も包含する。

アミノ反応性PEG化とは、本明細書において使用される場合、反応性ポリ（エチレングリコール）の使用により、好ましくはメトキシポリ（エチレングリコール）のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの使用により、標的タンパク質PEXの第一アミノ基にポリ（エチレングリコール）鎖をランダムに結合するための方法を示す。カップリング反応は、反応性第一アミノ基、例えばリシン残基のε−アミノ基、又はPEXのN−末端アミノ酸のα−基に、ポリ（エチレングルコール）を選択的に結合する。タンパク質へのPEGのそのようなアミノ基結合は、当業界において広く知られている。そのような方法の再考は、例えばVeronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417により与えられる。Veroneseによれば、タンパク質の第一アミノ基へのPEGの接合は、前記第一アミノ基のアルキル化を行う、活性化されたPEGを用いることによって行われ得る。

そのような反応のためには、活性化されたアルキル化PEG、例えばPEGアルデヒド、PEG−塩化トレシル又はPEGエポキシドが使用され得る。さらなる有用な試薬は、アシル化PEG、例えばカルボキシル化されたPEGのヒドロキシスクシンイミジル、又は末端ヒドロキシル基がクロロホルメート又はカルボニルイミダゾールにより活性化されているPEGである。さらなる有用なPEG試薬は、アミノ酸アームを有するPEGである。そのような試薬は、いわゆる枝分かれ鎖のPEGを含むことができ、それによれば、少なくとも２つの同一の又は異なったPEG分子が、ペプチドスペーサー（好ましくは、リシン）により一緒に結合され、そして例えば、リシンスペーサーの活性化された炭水化物としてPEXに結合される。

アミノ基PEG化のためのもう１つの方法は、第１段階において、タンパク質が、そのタンパク質の第一アミノ基に結合するアミノ反応性基を含み、そして好ましくは、保護されたチオール基を含む二官能価試薬と共有的に反応せしめられることから成る。タンパク質への試薬の結合の後、チオール基が、チオール反応性形のポリ（エチレングリコール）と反応せしめられる。そのような活性化されたPEGはまた、当業界において知られており、そして例えばPEG−オルトピリジル−ジスルフィド、PEG−マレイミド、PEG−ビニルスルホン及びPEG−ヨードアセトアミドである。

従って、“アミノ−反応性のPEG化されたPEX”、“アミノ−反応性PEG化”又は“PEG化されたPEX”とは、PEXが１，２又は３個のポリ（エチレングリコール）基を、PEX分子へのアミノ反応性カップリングにより共有結合したことを意味する。前記基は、第１アミノ基であるPEX分子の異なった部位で、又は好ましくはほとんどの反応性部位、例えばリシン鎖のε−アミノ基又はN末端α−アミノ基で結合される。使用される合成方法のために、PEG化されたPEXは、一、二−及び/又は三PEG化されたPEXの混合物から成り、それによりPEG化の部位は、異なった分子で異なり、又は分子当たりのポリ（エチレングリコール）鎖；及び/又は分子におけるPEG化の部位の量に関して、実質的に相同で有り得る。

次に及び例においては、アミノ反応性のPEG化されたPEXの生成のために好ましいそれらの試薬のいくつかが記載されている。Verunese，F., Biomaterials 22 (2001) 405-417により記載される方法に基づいての修飾は、PEXの第１アミノ基を通してPEGとPEXとの間でカップリングが生じる限り、前記工程において行われ得、そして約10〜40kDaの全体分子量を有する１〜32個のPEGがカップリングされることが理解される。

標的タンパク質におけるいくつかの可能性ある反応性第一アミノ基（PEXに関しては、リシン、及び１つの末端アミノ酸が存在する）の存在は、ポリ（エチレングリコール）鎖の結合の点で異なり、そして次のように位置異性体と呼ばれるであろう一連のPEG化されたPEX異性体を導く。単一のPEX分子における結合部位は、明確には、予測されず、そしてこの理由のために、ランダムとして言及される。

本発明は、改良された性質を有する、アミノ反応性のPEG化された形のPEXを提供する。そのようなPEG化されたPEXは、それにランダムに結合された線状又は枝分かれ鎖のPEG基を含み、それにより、接合体におけるすべてのPEG基の全分子量は、10〜40kDaである。“分子量”とは、本明細書において使用される場合、PEGの平均分子量が理解されされるべきであり、そして用語“約”は、前記PEG調製においては、いくつかの分子が言及された分子量により高く、そして幾分、低いであろうことを示す。

これは、本発明のPEG化された形のPEXが、例えば、次のものを含んで成ることを意味する：
−一PEG化されたPEX（約20〜40kDaの分子量を有するPEG基）；
−二PEG化されたPEX（それぞれ、約10kDa〜20kDaの分子量を有するPEG基）；
−三PEG化されたPEX（それぞれ、約10kDaの分子量を有するPEG基）；又は
それらの混合物。

本発明の“PEG又はPEG基”は、必須部位としてポリ（ポリエチレングリコール）を含む残基を意味する。そのようなPEGは、結合反応のために必要であり；分子の化学合成に起因し；又はお互いからの分子の一部の最適距離のためのスペーサーである追加の化学基を含むことができる。さらに、そのようなPEGは、一緒に結合される１又は複数のPEG側鎖から成る。１つよりも多くのPEG鎖を有するPEGは、複数アームの又は枝分かれ鎖のPEGと呼ばれる。

枝分かれ鎖のPEGは例えば、種々のポリオール、例えばグリセロール、ペンタエリトリオール及びソルビトールへのポリ酸化エチレンの付加により調製されえる。例えば、４−アームの枝分かれ鎖のPEGは、ペンタエリトリオール及び酸化エチレンから調製され得る。枝分かれされたPEGは、例えばヨーロッパ特許出願0473084号及びアメリカ特許第5,932,462号に記載される。リシンの第一アミノ基を通して結合される２個のPEG側鎖（PEG2）を有するPEGが特に好ましい（Monfardini, C. など. , Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69））。

“実質的に相同な”とは、本明細書に使用される場合、生成され、含まれ、又は使用される、PEG化されたPEX分子のみが１，２又は３個のPEG基を有するそれらの分子であり、そしてPEG化の部位に関して、相同であることを意味する。ペプチドマッピング及びN−末端配列決定により確かめられる場合、下記１つの例は、少なくとも90％のPEG−PEX接合体（好ましくは、一PEG化された）、多くとも5％の末反応タンパク質である調製物を提供する。PEG化されたPEXのそのような相同調製物の単離及び通常の精製方法、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーにより行われ得る。

“一PEG化された”とは、本明細書において使用される場合、PEGがPEX分子当たりわずか１つのアミノ基でPEG化され、それにより、わずか１つのPEG基がこの部位で共有結合され、そして結合の部位は、その一PEG化された種内で変化することができる。一PEG化されたPEXは、調製物の少なくとも90％であり、そして最も好ましくは、一PEG化されたPEXは調製物の92％又はそれ以上である。従って、本発明の一PEG化されたPEX調製物は、例えば医薬用途において、相同調製物の利点を示すのに十分に相同である。
PEXのPEG化は、従来の方法に従って行われ得る。

本発明の好ましい方法においては、本発明の接合体は、下記式（I）：
P-[NHCO-(CH₂)x-(OCH₂CH₂)m-OR]n (I)
[式中、Pは、本明細書に記載されるPEXタンパク質であり（すなわち、式（I）に示されるカルボニルと共にアミド結合を形成するアミノ基を有さない）；そしてRは低級アルキルであり；xは２又は３であり；ｎは１〜３であり；そしてｎ及びｍは、接合体−PEXタンパク質の分子量が10kDa〜40kDaであるよう選択される]
により表され得る。

本明細書において使用される場合、“低級アルキル”とは、１〜６個の炭素原子を有する、直鎖又は枝分かれ鎖のアルキル基を意味する。低級アルキル基の例は、メチル、エチル及びイソプロピルを包含する。本発明によれば、Rはいずれかの低級アルキルである。Rがメチルである接合体が好ましい。

記号“ｍ”は、ポリ（酸化エチレン）基における酸化エチレン基の数を表す。酸化エチレンの単一のPEGサブユニットは、約44ドルトンの分子量を有する。従って、接合体の分子量（PEXの分子量を除く）は、数値“ｍ”に依存する。本明細書において使用される場合、与えられる“ｍ”の範囲は、単なる配向を意味を有する。“ｍ”の範囲は、いずれの場合においても、及び正確に、PEG基の分子量により決定される。本発明の接合体においては、“ｍ”は約224〜約900（約10kDa〜約40kDaの分子量に対応する）である。

数値ｍは、活性が、本発明の得られる接合が、修飾されていないPEXのその対応する活性と同じか又はそれ以上の割合を表すことができる、修飾されていないPEXに適合できる生理学的活性を有するようなこの範囲内で選択される。“約”一定数の分子量とは、それが従来の分析技法により決定されるような数値の適度な範囲内にあることを意味する。数値“ｍ”は、PEXタンパク質に共有結合される個々のポリ（エチレングリコール）基の分子量が約10kDa〜約40kDaであるが、しかしながらすべてのポリ（エチレングリコール）基の最大分子量が共に40kDaを超えないよう選択される。

本発明の接合体においては、数値“ｎ”は、アミド結合を通して、PEXタンパク質の遊離アミノ基（例えば、リシンアミノ酸のε−アミノ基及び/又はアミノ末端アミノ基を包含する）に共有結合されるポリ（エチレングリコール）基の数である。本発明の接合体は、PEXの分子当たり１，２又は３個のPEG基を有することができる。“ｎ”は、１〜３、好ましくは１又は２、及びより好ましくは１の整数である。PEG分子が枝分かれ鎖のPEGである場合、ｎは、結合される枝分かれ鎖のPEG分子の数として理解される。例えば、枝分かれ鎖のPEGが２つのPEG分子を含む場合、ｎ＝２は、２個の枝分かれ鎖のPEG（結果的に、４子のPEG分子）がPEXに結合されるが、しかしながら、与えられる分子量範囲を超えないことを示す。

式（I）の化合物は、例えば既知の活性化されたポリマー材料：

［式中、R及びｍは上記の通りである］
から、式IIの化合物をPEXタンパク質により縮合することにより調製され得る。式（II）（式中、ｘは２である）の化合物は、ポリ（エチレングリコール）のα−低級、アルコキシプロピオン酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−PEG−SPA）である。アミドを形成するために活性化されたエステルとアミンとを反応せしめるいずれの従来の方法でも利用され得る。上記反応においては、例示されるスクシンイミジルエステルは、アミド形成を引き起こす脱離基である。スクシンイミジルエステル、例えば式IIの化合物の、タンパク質を有する接合体を生成するためへの使用は、アメリカ特許第5,672,662号に開示される。

PEG化試薬が式IIスクシンイミジルエステル化合物と組み合わされる場合、約7．0のpH、約１：３のタンパク質：PEG比及び20〜25℃の反応温度で、一、二、及び微量の三−PEG化された種の混合物が生成されことが見出された。タンパク質：PEGの比が約１：１である場合、主に一−PEG化された種が生成される。反応条件（例えば、試薬の割合、pH、温度、タンパク質濃度、反応時間、等）を操作することによって、異なったPEG化された種の相対量は変更され得る。

一PEG化されたPEXはまた、WO94/01451号に記載される方法に従って生成され得る。
WO94/01451号は、修飾された末端アミノ酸α−炭素反応基を有する組換えポリペプチドを調製するための方法を記載する。この方法の段階は、組換えポリペプチドを形成し、そしてそれを、N−末端α−アミノ及びC末端α−カルボキシルで１又は複数の生物学的に付加された保護基により保護することを包含する。次に、ポリペプチドは、反応性側鎖を選択的に保護し、側鎖の修飾を妨げるために、化学的保護剤と反応せしめられ得る。

次に、ポリペプチドは、保護されていない末端アミノ酸α−炭素反応基を形成するために、生物学的保護基に対して特異的な分解試薬により分解される。保護されていない末端アミノ酸α−炭素保護基は、化学的変性剤により修飾される。次に、側鎖保護された、末端修飾された単一コピーのポリペプチドは、末端修飾された組換え単一コピーのポリペプチドを形成するために側鎖基で保護解除される。前記方法における段階の数及び順序は、選択的に修飾を達成するために、変更され得る。

本発明のさらなる好ましい接合体は、１〜３個の低級−アルコキシポリ（エチレングリコール）基に共有結合されるPEXタンパク質から成り、個々のポリ（エチレングリコール）基は、式−C（O）−X−S-Y−のリンカーを通してタンパク質に共有され、ここでリンカーのC（O）は前記アミノ基の１つと共にアミドを形成し、Xは-(CH₂)k又は-CH₂(O-CH₂-CH₂)kであり、ｋは１〜10であり、Yは下記式：

であり、個々のポリ（エチレングリコール）成分の平均分子量は、約20kDa〜約40kDaであり、すべてのポリ（エチレングリコール）成分に関して40kDaを超えず、そして接合体の分子量は、PEXポリペプチドについて24kDaの分子量で約44kDa〜約64kDaであるか、又はPEX糖タンパク質について28kDaの分子量で約48KDa〜約68Kdaである。

それらのPEX接合体はまた、下記式（III ）：
P-[NH-CO-X-S-Y-(OH₂CH₂)m-OR]n (III )
によっても表され得、ここでRは、いずれかの低級アルキルであり、これによれば、１〜６子の炭素原子を有する直鎖又は枝分かれ鎖のアルキル基、例えばメチル、エチル、イソプロピル、等を意味する。好ましいアルキルは、メチルでありる。Xは-(CH₂)k-又は-CH₂(O-CH₂-CH₂)k-（ここで、ｋは１〜約10である）であり得る。好ましくは、kは１〜約４、より好ましくはkは１又は２である。最も好ましくはXは-(CH₂)である。

式（III ）において、Yは、

好ましくは、

より好ましくは、

である。

式（III ）においては、数値ｍは、得られる式（III ）の接合体が、修飾されていないPEXのその対応する活性と同じか、それよりも高いか又はその割合に比較できる生理学的活性を有するよう選択される。ｍは、PEG単位における酸化エチレンの数を表す。-(OCH₂CH₂)-の単一のPEGサブユニットは、約44ドルトンの分子量を有する。従って、接合体の分子量（PEXの分子量を除外する）は、数値ｍに依存する。“約”の数値の分子量は、それが従来の分析技術により決定去れるような数値の適切な範囲内にあることを意味する。従って、ｍは約220〜約900の範囲の整数（約10〜40kDaの分子量に対応する）である。

式（III ）においては、数値ｎは、アミド結合を通してPEG単位に共有結合されるPEXタンパク質におけるリシンアミノ酸のεの−アミノ基の数である。本発明の接合体は、PEXの分子当たり、１，２又は３個のPEG単位を有することができる。ｎは、１〜３の範囲の整数であり、好ましくはｎは１又は２であり、そしてより好ましくは、ｎは１つである。
式（III ）の好ましいPEXタンパク質は、下記式：

により表される。

最も好ましいPEXタンパク質生成物は、下記式：

により表される。

そのような接合体は、
（ａ）下記式：
P-[NH-CO-X-S-Q]n
により表されるアミド結合を有する中間体を形成するために、下記式：
Z-CO-X-S-Q（アミノ反応性カップリング）
により表される二官能価試薬と、式：P-[NH₂]nにより表されるPEXタンパク質の第一アミノ基とを共有反応せしめ（ここで前記式中、Pはアミド結合を形成するアミノ基以下のPEXタンパク質であり；ｎは１〜３の範囲の整数であり；Zは反応性基、例えばカルボキシル−NHSエステルであり；Xは−(CH₂)k-又は-CH₂(O-CH₂-CH₂)k-であり、ここでｋは1〜約10であり；そしてQは保護基、例えばアルカノイル、例えばアセチル基である）；

（ｂ）下記式：

により表されるPEXタンパク質生成物を形成するために、下記式：
W-[OCH₂CH₂]m-OR
により表される、活性化されたポリ（エチレングリコール）誘導体と、段階（ａ）からのアミド結合を有する中間体とを共有反応せしめる（ここで前記式中、WはYのスルフヒドリル反応形であり；ｍは約220〜約900の範囲の整数であり（10〜40kDaのPEG残基の分子量に対応する）；Rは低級アルキルであり；そしてYは上記で定義された通りである）ことにより調製され得る。

この態様においては、二官能価試薬は好ましくは、N−スクシンイミジル−S−アセチルチオプロピオネート又はN−スクシンイミジル−S−アセチルチオアセテートであり、Zは好ましくは、N−ヒドロキシ−スクシンイミドであり、そして活性化されたポリ（エチレングリコール）誘導体W-[OCH₂OH₂]m-ORは好ましくは、ヨードアセチル−メトキシ−PEG, メトキシ−PEG−ビニルスルホン及びメトキシ−PEG−マレイミドから成る群から選択される。

一般的に、式（III ）のPEX接合体は、PEXへのチオール基のアミノ反応性共有結合（“活性化”）、及び得られる活性化されたPEXのポリ（エチレングリコール）誘導体のカップリングにより調製され得る。前記第１段階は、PEXのNH₂−基を通してのチオール基の共有結合を含んで成る。PEXのこの活性化は、保護されたチオール基及び追加の反応性基、例えばそれぞれスルホン酸の活性エステル（例えば、スクシンイミジルエステル）、無水物、エステル、カルボン酸、及びスルホン酸のハロゲン化物を担持する二官能価試薬により行われ得る。チオール基は、当業界において知られている基、例えばアセチルにより保護される。それらの二官能試薬は、アミド結合を形成することによって、リシンアミノ酸のε−アミノ基と反応することができる。

好ましい態様においては、ε−アミノリシン基の活性化は、スクシンイミジルの成分を有する二官能試薬とその反応により行われる。二官能価試薬は、異なったスペーサー種、例えば-(CH₂)k -又は-CH₂-(O-CH₂-CH₂)k−成分（ここで、kは１〜約10、好ましくは１〜約４、及びより好ましくは1又は２、及び最も好ましくは１である）を担持することができる。
それらの試薬の例は、それぞれ下記式で表される、アセチルチオアルキル−カルボキシル−NHS−エステル、N−スクシンイミジル−S−アセチルチオプロピオネート（SATP）又はN−スクシンイミジル−S−アセチルチオアセテート（SATA）、及び２−（アセチルチオ）−(エトキシ)k-酢酸−NHS−エステル（kは上記で定義された通りである）である：

二官能価試薬の調製は、当業界において知られている。２−（アセチルチオ）− (エトキシ)k−酢酸−NHS−エステルの前駆体は、DE3924705号に記載されており、そしてアセチルチオ化合物への誘導体化はMarch，J．，Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376により記載されている。SATAは、市販されている（Molecular Probes, Engene, USA and Pierce, Rockford, IL）。

PEX分子に付加されるべきチオール基の数は、反応パラメーター、すなわちタンパク質（PEX）濃度、及びタンパク質/二官能価比を調節することによって選択され得る。好ましくは、PEXは、PEX分子当たり１〜５個のチオール基、より好ましくはPEX分子当たり1.5〜３個のチオール基を共有結合することによって活性化される。それらの範囲は、PEXタンパク質集団にわたってのチオール基の統計学的分布を言及する。

反応は例えば、緩衝水溶液（pH6.5〜8.0）において、例えば10mMのリン酸カリウム、300mMのNaCl溶液（pH7.3）において行われる。二官能試薬は、DMSOにおいて添加され得る。反応完結の後、好ましくは30分後、反応はリシンの添加により停止される。過剰の二官能価試薬は、当業界において知られている方法、例えば透析又はカラム濾過により分離され得る。PEXに付加されるチオール基の平均数は、例えばGrasetti, D. R., and Murray, J.F.J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49により決定され得る。
上記反応に続いて、活性化されたポリ（エチレングリコール）（PEG）誘導体の共有カップリングが存在する。適切なPEG誘導体は、約10〜約40kDaの平均分子量を有する活性化されたPEG分子である。

活性化されたPEG誘導体は、当業界において知られており、そしてPEG−ビニルスルホンについて、Morpurgo, M., など., J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363に記載される。直鎖及び枝分かれ鎖のPEG種が、式１の化合物の調製のために適切である。反応性PEG試薬の例は、下記式：

で表されるヨード−アセチルメトキシ−PEG及びメトキシ−PEG−ビニルスルホンである。

それらのヨード−活性化された物質の使用は、当業界において知られており、そしてHermanson, G. T. , in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148により記載される。
最も好ましくは、PEG種は、（アルコキシ−PEG−マレイミド）、例えばメトキシ−PEG−マレイミド（MW10000〜40000：Shearwater Polymers, Inc.）を用いて、マレイミドにより活性化される。

アルコキシ−PEG−マレイミドの構造は、下記式：

[式中、R及びｍは上記で定義された通りである]、好ましくは、下記式：

で表される通りである。

アルコキシ−PEG−マレイミドとのカップリング反応は、緩衝水溶液、例えば10mMのリン酸カルシウム、300mMのNaCl, 2mMのEDTA（pH6.2）の溶液におけるチオール保護基の現場分解の後に生じる。保護基の分解は、例えばDMSO中、ヒドロキシルアミンにより、25℃、pH6.2で約90分間、行われ得る。PEG修飾に関しては、活性化されたPEX/アルコキシ−PEG−マレイミドのモル比は、約１：１〜約１：６であるべきである。反応は、システインの添加により停止され得、そして残るチオール（−SH）基の反応は、N−メチルマレイミド、又はジスルフィド結合を形成できる他の適切な化合物により停止される。

保護基、例えばN−メチルマレイミド又は他の適切な保護基との残る活性チオール基の反応のために、本発明の接合体におけるPEXタンパク質は、そのような保護基を含むことができる。一般的に、本明細書に記載される方法は、PEG−マレイミドに接合されなかったタンパク質上の活性化されたチオールの数に依存して、異なった数の保護基により保護される種々の数のチオールを有する分子の混合物を生成するであろう。

N−メチルマレイミドは、PEG化されたタンパク質上の残るチオール基を阻止するために使用される場合、同じタイプの共有結合を形成するが、ジスルフィド化合物は、ブロッキング試薬のジスルフィド架橋されたカップリングへの分子間スルフィド/ジスルフィド交換反応を導くであろう。そのタイプのブロッキング反応のための好ましいブロッキング試薬は酸化されたグルタチオン（GSSG）、システイン及びシスタミンである。システインにより、追加の正味電荷がPEG化されたタンパク質中に導入されるが、ブロッキング試薬GSSG又はシスタミンの使用は追加の負又は正の電荷をもたらす。

式（III ）の化合物のさらなる精製、例えば一、二及び三−PEG化されたPEX種の分離は、当業界において知られている方法、例えばサイズ排除、カラムウクロマトグラフィーにより行われ得る。
驚くべきことには、PEG化されたPEXは、イオン交換クロマトグラフィーにより、特に好都合な態様で精製され得る。カチオン交換体材料は、SP−セファロース（Pharmacia，Uppsula, Sweden）から成る。一PEG化されたPEXは、一PEG化された及び多PEG化されたPEXから塩グラジエント溶出において分離された（20mMのNaCl〜1MのNaCl、50mMのトリス、pH8.5）。

一PEG接合体の％及び一及び二PEG種の割合は、一PEGの％を低めるための溶出ピーク近くの広い画分、又は組成物における一PEGの％を高めるための狭い画分をプールすることによって調節され得る。約90％の一PEG接合体が、収率及び活性の良好なバランスである。時々、例えば少なくとも92％又は又は少なくとも96％の接合体が一PEG種である組成物（ｎは１に等しい）が所望される。本発明の１つの態様においては、ｎが１である接合体の％は、90％〜96％である。

医薬製剤：
ぺギレート化されたPEXは、混合物として、又はイオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー分離され、異なったPEX化された種として投与され得る。本発明の化合物は、当業界者に知られている、医薬組成物の調製のための方法に従って配合され得る。そのような組成物の生成に関しては、本発明のPEG化されたPEXは、医薬的に許容できるキャリヤーと共に組み合わされ得る。そのような許容できるキャリヤーは、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18 edition, 1990, Mack Publishing Company, edited by Oslo et al. (例えば. pp. 1435-1712)に記載される。典型的な組成物は、適切な量のキャリヤーと共に、有効量、例えば約0.1〜100mg/mlの本発明の物質を含む。組成物は非経口投与され得る。

本発明はさらに、ｎが１，２及び/又は３である接合体の％が好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも92％である、本明細書に記載される接合体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の医薬製剤は、当業界において知られている方法に従って調製され得る。通常、PEG化されたPEXの溶液が医薬組成物に使用される緩衝液に対して透析され、そして所望する最終タンパク質濃度が濃縮又は希釈により調節される。

そのような医薬組成物は、注射又は注入のために使用され得、そして医薬的に許容できる希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、アジュバント及び/又はキャリヤーと共に、有効量の一PEG化されたPEXを含む。そのような組成物は、種々の緩衝液含有物（例えば、アルギニン、酢酸、リン酸）の希釈剤、pH及びイオン強化剤、添加剤、例えば界面活性剤及び溶解剤（例えば、Tween^TM80/ポリソルベート、pluronic^TM F68）、酢酸防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタニ硫化ナトリウム）、保存剤（Timersol^TM, ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、サッカロース、マンニトール）を含み、それらの材料は、ポリマー化合物、例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、等の特定調製物、又はリポソーム中に組み込まれる。そのような組成物は、本発明の一PEG化されたPEXの放出及びクリアランスの物理的状態安定性度に影響を及ぼすことができる。

投与量及び薬物濃度：
典型的には、標準の癌処理レジメにおいては、患者は、１〜約30日又はそれ以上続く一定の期間、１日当たり0.1〜30mgのPEG化されたPEG/kgの範囲の用量により処理される。薬剤は、ml当たりの0.1〜10mgのPEG化されたPEXを含む医薬製剤の１日当たり皮下又はi.v.ボーラス注射又は注入として投与される。この処理は、いずれかの標準（例えば、化学療法）の処理と共に、その標準の処理の前、その間又はその後、PEG化されたPEXを適用することによって組み合わされ得る。これは、標準の処理のみに比較して、改良された結果をもたらす。
次の例文献は、本発明の理解を助けるために提供される。修飾は、示される方法において本発明の範囲内で行われ得ることが理解される。

例１．組換えPEXの企画及び発現
材料及び方法：
MMP-2 PEX (アミノ酸残基451−660；SWISS-PROT受託番号P08253)のC−末端ヘモペキシン−様ドメインを含んで成る、195個のアミノ酸残基のcDNAを、市販のヒトcDNAライブラリーからPCRにより単離した。

ベクター構成：
発現されるべき遺伝子フラグメント/構成遺伝子を、PCRにより増幅した。遺伝子フラグメントを、PCRプライマーの5’−オーバーハング末端によりサブクローン化するために適切な単一エンドヌクレアーゼ制限部位により供給した。必要なら、ATG翻訳開始コドン及び“最適化されたATG翻訳開始領域”を、同じ技法により導入した。調製された発現プラスミド；基本ベクター、及びクローニングのために使用される制限部位が図１に示される。最終発現プラスミドを、制限マッピングにより同定し、そしてサブクローン化された遺伝子のDNAを、DNA配列により確証した。

細胞培養物：
E.コリ株を、20〜37℃の温度で、適切な抗生物質により補充されたLB又はDYT培地を有する振盪フラスコにおいて増殖した。細胞を、それぞれIB発酵のために１〜5mMのIPIGにより、及び可溶性タンパク質の合成のために0.1mMのIPTGにより誘発した。

IB−調製：
IB-供給を、10Lの発酵器において細胞培養により達成した。E.コリにおいて合成されるPEXタンパク質は、相同であり、そして不溶性細胞残骸画分（IB）において独占的に見出された。発現収率は、合計のE.コリタンパク質に対して10〜50％であった。推定される発現収率は、2.8g/L乾量及び合計タンパク質の80％の純度であった。

発現分析：
組換え発現生成物を、下記に関して、SDS PAGEにより、及びクーマシーブリリアントブルー色素による染色によりE.コリ細胞溶解物において分析した：
−見掛け分子量、
−発現収率、及び
−溶解性（IB−形成）。
一般的に、細胞溶解物を、遠心分離により、可溶性上清液画分及び不溶性細胞ペレット画分に加工した。後者を、６〜８Mのウレアを含む１×SDSサンプル緩衝液により再懸濁し/抽出した。

例２．E.コリからの組換えPEXの再折りたたみ
20gのIB調製物を、100mlの溶解緩衝液（６Mのグラニジン塩酸塩、2mMのEDTA、10mMのDTT、100mMのトリス、pH,7.7）に室温で溶解し、そして復元緩衝液（0.6Mのアルギニン、100mMのトリス、5mMのCaCl₂、5mMのGSSG、1mMのGSH、pH7.5）により4℃で復元した。
復元されたタンパク質を、緩衝液（50mMのトリス、5mMのCaCl₂、20mMのNaCl、pH7.2）に対して、透析管において透析する。

タンパク質混合物を、SPセファロース（Pharmacia）により精製する。
緩衝液A：50mMのトリス、5mMのCaCl₂、20mMのNaCl、pH7.2；
緩衝液B：50mMのトリス、5mMのCaCl₂、１MのNaCl、pH7.2；
グラジエント：20CV（カラム体積）において０〜50％のB。
所望する画分をプールし、そして濃度を、280nmのUVで決定した。

例３．PEG−SPA MW20,000を用いてのPEXのPEG化
この精製されたPEXを、50mMのトリス、20mMのNaCl, 5mMのCaCl₂, pH7.2 (pH範囲：７〜９)を用いて、0.4m/mlの濃度で調節する。
タンパク質を、１：１の分子比で、mPEG−SPA（MW20,000, Shearwater No. 2M4M0P01）と共に混合し、そして攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。反応を、エタノールアミン（100mlのサンプルバッチ当たり10μl）の添加により停止し、そしてインキュベーションを再び、攪拌しながら１時間、行う。
サンプルを、50mMのトリス、20mMのNaCl、pH8.5の溶液に対して一晩、透析する。

例４．精製
材料：SP−セファロース（Pharmacia）;
緩衝液A：50mMのトリス、20mMのNaCl、pH8.5；
緩衝液B：50mMのトリス、１MのNaCl、pH8.5；
グラジエント：80CV中、0〜40％；
バンド検出：SDS PAGE；
濃度の決定：UV280nm。

例５．薬理動態
s.c. 投与後のネズミにおける20kDaのPEG−PEXの血漿レベル：

Xで示される時点での採血（採血時点当たり約0.2ml）。血漿サンプルを、室温での遠心分離により血液から得た。血漿サンプルを、分析まで-29℃で凍結貯蔵した。

s.c.投与後の雌マウスにおける20kDaのPEG-PEXの薬理動態データ；

文献の列挙：
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図１は、発現プラスミドpDS-PEX-2の機能的要素（例えば、選択マーカー、複製及び発現カセットの起点、プロモーター、発現される遺伝子、及び転写ターミネーター）を示す。図２は、40mg/kgの１回のs.c.投与のマウスにおける20kDaのPEG化されたPEXの血漿濃度を示す。図３は、40mg/kgの１回のs.c.投与後のマウスにおける血漿濃度（修飾されていないPEX, ５kDaのPEG化されたPEX, 20kDaのPEG化されたPEX）の比較を示す。

Claims

ヒトゲラチナーゼAのCドメイン（PEXドメイン、PEX）；及び約10〜40kDaの全体分子量を有し、そして前記PEXの第一アミノ基を通して結合される、１〜３個のポリ（エチレングルコール）基を含んで成る接合体。
前記ポリ（エチレングリコール）基が、モノメトキシポリ（エチレングリコール）基であることを特徴とする請求項１記載の接合体。
１つのポリ（エチレングリコール）基を含むことを特徴とする請求項１記載の接合体。
前記ポリ（エチレングリコール）基が、枝分かれ鎖のポリ（エチレングリコール）基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の接合体。
下記式I：
P-[NHCO-(CH₂)x-(OCH₂-CH₂)m-OR]n
[式中、ｘは２又は３であり；
ｍはポリ（エチレングリコール）基の分子量に依存して、約220〜約900であり；
ｎは１〜３であり；
Pは、ポリ（エチレングリコール）基と共にアミド結合を形成する、ｎ個のアミノ基を有さない前記PEXである]
を有する請求項１〜４のいずれか１項記載の接合体。
下記式（III ）：
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)m-OR]n (III )
[式中、ｍはポリ（エチレングリコール）基の分子量に依存して、約220〜約900であり；
ｎは１〜３であり；
Rは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は枝分かれ鎖のアルキル残基であり；
Xは、-(CH₂)k-又は-CH₂(O-CH₂-CH₂)k-であり、ここでｋは１〜約10であり；
Yは、下記式：

で表され、
Pは、ポリ（エチレングリコール）基と共にアミド結合を形成する、ｎ個のアミノ基を有さない前記PEXである]
を有する請求項１〜４のいずれか１項記載の接合体。
ヒトゲラチナーゼAのCドメイン（PEXドメイン、PEX）；及び約10〜40kDaの全体分子量を有し、そして前記PEXの第一アミノ基を通して結合される、１〜３個のポリ（エチレングルコール）基を含んで成る接合体の調製方法であって、前記PEXと前記（ポリエチレン）グリコールとを、１〜３個の（ポリエチレン）グリコール基がPEXの第一アミノ基に化学的に接合される条件下で、反応せしめることを特徴とする方法。
治療的有効量の請求項１〜６のいずれか１項記載の接合体を含んで成る医薬組成物。
請求項８記載の医薬組成物の調製方法。
癌の処理において有用な薬剤の調製のためへの請求項１〜６のいずれか１項記載の接合体の使用。
請求項８記載の医薬組成物を、その必要な患者に投与する段階を含んで成る、癌疾患の処理方法。