JP2010174034A

JP2010174034A - Ｈｇｔ−ｎｋ４のｐｅｇ接合体

Info

Publication number: JP2010174034A
Application number: JP2010099120A
Authority: JP
Inventors: Michael Brandt; ブラント，ミヒャエル; Apollon Papadimitriou; パパディミトリオー，アポロン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2010-08-12
Also published as: US20030012775A1; CA2438308A1; PA8540501A1; BR0207510A; JP2004521139A; MXPA03007130A; AU2002233354B2; CN1571679A; PL367402A1; HUP0400979A2; EP1389132A2; CZ20032511A3; RU2293574C2; EP1234583A1; MA26998A1; US7846896B2; BG108125A; SK11652003A3; GT200200038A; NO20033737D0

Abstract

【課題】特性が改良され、腫瘍治療として療法的に有益な医薬剤を提供する。
【解決手段】ヘアピン領域、及びα鎖の４個のクリングル領域(kringle regions)、及び全体で約２０から４０ＫＤａの分子量を有するポリエチレン・グリコール基から成る肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）のＮ−末端断片を含む接合体。
【選択図】なし

Description

本発明は、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）と肝細胞増殖因子（ＮＫ４）のＮ−末端の４個のクリングル(kringle)構造を含む断片との接合体、その医薬組成物、その製造方法、及び使用方法に関する。

肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は、Nakamura, T.らのBiochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1984) 1450-1459（非特許文献１）に記載されるように同定、精製されたペプチドである。さらに、肝細胞増殖因子が、細胞分散因子（ＳＦ）と同一であり、Weidner, K. M.らの、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7001-7005（非特許文献２）を参照。ＨＧＦは、増殖性、有糸分裂の生成源、分岐チューブの形成、及び腫瘍細胞の例における侵入及び転移を含む、多くの表現型細胞の生成に関与し、分子量約１００ｋＤａの糖タンパク質である。

このことに関しては、Stuart, K. A.らのInternational Journal of Experimental Pathology 81(2000)17-30（非特許文献３）を参照。ラットのＨＧＦとヒトのＨＧＦが共に配列決定され、クローン化された、(Miyazawa, Kらの、 Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) 967-973（非特許文献４）；Nakamura, T.らの、Nature 342 (1989) 440-443（非特許文献５）；Seki, T.らの、Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990) 321-327（非特許文献６）；Tashiro, K. らの、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3200-3204（非特許文献７）；Okajima, A.らの、Eur. J. Biochem. 193 (1990) 375-381（非特許文献８）を参照。最初、５Ｎ−末端アミノ酸（ｄＨＧＦ）を欠損するＨＧＦの薬学動態的及び医薬的な効果が、Uematsu,Y.らにより研究され、J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131-135（非特許文献９）に記載されている。ｄＨＧＦの血清濃度が急激に減少し、そのため注入には、投与経路として注射にて用量を注入することが好ましい。

米国特許番号第５，９７７，３１０（特許文献１）では、ＰＥＧにより修飾されたＨＧＦが記載されている。こうしたＰＥＧにより修飾されたＨＧＦが、in vivoにおける伸張された隙間（clearance）を有し、ＨＧＦと同じ生理的活性を有す。しかしながら、米国特許番号第５，９７７，３１０（特許文献１）によれば、ＨＧＦの半減期をそれぞれ５９．２分から７６．７分又は９５．６分に延長することのみ可能である(米国特許番号第５，９７７，３１０（特許文献１）の実施例５を参照）。さらにモル量のＰＥＧ試薬が、ＨＧＦのモル重量の５から１００倍の範囲から選択できることが、この特許において示唆されている。リシン又はタンパク質のＮ末端のアミノ基を修飾する場合に、ＰＥＧ試薬の好ましいモル範囲が、ＨＧＦのモル重量の１０から２５倍である。

結合されたＰＥＧ鎖のモル重量が、約１０ｋＤａであった。さらにＰＥＧ及びＨＧＦ等のポリペプチドから成る接合体の合成方法が、ＷＯ９４／１３３２２（特許文献２）に記載されている。記載者によれば、これらの接合体が、治療として又は診断として所望される活性作用を介在する分子領域に高分子成分を導入する様、無作為な接合先導剤として、所定の位置にたがいに結合される。その結果その分子では、in vivoにおける半減期が延長され、そして異種のタンパク質の例では免疫原性が減少されるが、所望の生物活性作用を有意的又は完全に欠失するという犠牲をはらう必要がある（たとえば、Kitamura, K.らのCancer Res. 51 (1991) 4310-4315（非特許文献１０）及びMaiti, P. K.らのInt. J. Cancer Suppl.3 (1988) 17-22（非特許文献１１）を参照)。たとえばＰＥＧ化されたＩＦＮ−αは、ＰＥＧ化されていないＩＦＮ−αと比較して７％の効能しか示さなかった（Bailon, P., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195-202（非特許文献１２））。

Ｎ−末端のヘヤピン領域及びＨＧＦ／ＳＦの４個のＫｒｉｎｇｌｅ領域から成る、ＮＫ４と称するＨＧＦ／ＳＦ断片が、ＨＧＦ／ＳＦと完全に異なる薬理的特性を有し、そして結腸ガン細胞の運動性及び侵入性に及ぼすＨＧＦ／ＳＦの影響に対しアンタゴニストであり、さらに腫瘍の増殖及び転移を抑制する血管形成阻害剤である(ＷＯ９３／２３５４１（特許文献３）；Parr, C.らのInt. J. Cancer 85 (2000) 563-570（非特許文献１３）；Kuba, K.らのCancer Res. 60 (2000) 6737-6743（非特許文献１４）；Date, K.らのFEBS Letters 420 (1997) 1-6（非特許文献１５）；Date, K.らのOncogene 17 (1989) 3045-3054（非特許文献１６）；Tomioka, D.らのCancer Res. 61 (2001) 7518-7524（非特許文献１７））。

Kuba, K.らのCancer Res. 60 (2000) 6737-6743（非特許文献１８）から明らかなように、動物実験において、肺転移に及ぼすＮＫ４の影響を検出するには、ＮＫ４を２週間、継続して注入する必要があった。

特定ポリペプチドに重合体を結合させると、こうした血清の半減期が増大できることが知られている。たとえばこれは、ＰＥＧ化されたインターロイキン−６（ＥＰ０４４２７２４：特許文献４）又はインターロイキン−２（ＷＯ９０／０７９３８：特許文献５）、及びエリスロポエチン（ＷＯ０１／０２０１７：特許文献６）として見出された。しかしながら、ポリエチレン・グリコール及び他の重合体との結合は、これらの血清半減期の延長化に必ずしも誘導に必須とするものでなかった。たとえば、インターロイキン−８、Ｇ−ＣＳＦ、及び他のインターロイキンに異なるポリエチレン・グリコールを結合させると、特性に傷害のある分子を産生することになる（Mehvar, R., J. Pharm. Sci. 3 (1) (2000) 125-136：非特許文献１９）。

したがってポリペプチドのＰＥＧ化の結果は、極めて予測が難しい。Gaertner, H. F., and Offord, R. E., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44（非特許文献２０）では、タンパク質のアミノ末端にPEGを部位特異的に結合することが記載されている。Gaertnerら(すでにＷＯ９４／１３２２２（特許文献２）に言及されているように、上記参照）の記載によれば、結合部位が正確に制御できない場合に、ＰＥＧ化は、大きな問題を提示し、そのことが、タンパク質の安定性及び機能として重要な関連性を有する可能性がある。

Francis, G. E.らの Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18（非特許文献２１）では、サイトカイン及び他の治療用タンパク質におけるPEG化の概要が記載されている。Francisらの記載によれば、主要なPGE化方法により、実質的な生物活性の減少(典型的に20-95%)を報告されている。Francisらによる、タンパク質のＰＥＧ化は、良くトライ・アンド・エラーに基づき、実際にこうしたPEG化パラメータの全てが、産生物の機能性に驚くべき、そして極めて大きな効果を有することができる。Tsutsumi, Y.らのThromb. Haemost. 77 (1997) 168-173（非特許文献２２）により、インターロイキン−６のＰＥＧ化が記載されている。Tsutsumiらによれば、ＩＬ−６の約５４％のリシンアミノ基が、ＰＥＧ基(groups)当り５ｋＤａの分子量のＰＥＧにて結合された。

Tsutsumiらのin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553（非特許文献２３）により、ＰＥＧによる免疫毒性の化学的修飾が記載されている。無作為のＰＥＧ化では、特異的細胞毒性の活性作用の有意な損失が伴うため、Tsutsumiらは、ＰＥＧの結合に用いられる１又は２つの追加システインを伴う免疫毒性変異体を使用することによって、部位特異的ＰＥＧ化を行う。Heinzerling, L.らのDermatol. 201 (2000) 154-157（非特許文献２４）により、分子量5kDaのインターフェロン-α とPEGとの結合が記載されている。Tsutsumi, Y.らのJ. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 1006-1011（非特許文献２５）により、ＴＮＦ−αをＰＥＧの修飾が記載され、その場合使用されるＰＥＧ基の分子量が、再度５ｋＤａである。適用されるＰＥＧ化ＴＮＦ−αが、少なくとも８４ｋＤａの分子量（ＴＮＦ−αの分子量が１７ｋＤａであることにより）を有するため、ＴＮＦ−αに結合されるＰＥＧ基が少なくとも１３５ｋＤａある。

タンパク質のＰＥＧ化、及びその医薬効果が、Reddy, K. R., Ann. Pharmacotherapy 34 (2000) 915-923（非特許文献２５）記載によっても再検討されている。さらに治療タンパク質のＰＥＧ化を慎重に評価しなければならないことが、記載されている。Ｒｅｄｄｙらによれば、それぞれのタンパク質が相違し、異なる最適な化学処理が必要で、従ってＰＥＧ化の効果を予測することができない。

米国特許番号第５，９７７，３１０ＷＯ９４／１３３２２ＷＯ９３／２３５４１ＥＰ０４４２７２４ＷＯ９０／０７９３８ＷＯ０１／０２０１７

Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 22 (1984) 1450-1459 Weidner, K. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7001-7005 Stuart, K. A. et al., International Journal of Experimental Pathology 81(2000)17-30 Miyazawa, K et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) 967-973 Nakamura, T. et al., Nature 342 (1989) 440-443 Seki, T. et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990) 321-327 Tashiro, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3200-3204 Okajima, A. et al., Eur. J. Biochem. 193 (1990) 375-381 Uematsu,Y. et al., J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131-135 Kitamura, K. et al., Cancer Res. 51 (1991) 4310-4315 Maiti, P. K. et al., Int. J. Cancer Suppl.3 (1988) 17-22 Bailon, P., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195-202 Parr, C. et al., Int. J. Cancer 85 (2000) 563-570 Kuba, K. et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743 Date, K. et al., FEBS Letters 420 (1997) 1-6 Date, K. et al., Oncogene 17 (1989) 3045-3054 Tomioka, D. et al., Cancer Res. 61 (2001) 7518-7524 Kuba, K. et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743 Mehvar, R., J. Pharm. Sci. 3 (1) (2000) 125-136 Gaertner ,H.F.,and Offord, R. E., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44 Francis, G. E. et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18 Tsutsumi, Y. et al., Thromb. Haemost. 77 (1997) 168-173 Tsutsumi et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553 Heinzerling, L. et al., Dermatol. 201 (2000) 154-157 Tsutsumi, Y. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 1006-1011 Reddy, K. R., Ann. Pharmacotherapy 34 (2000) 915-923

本発明の目的は、１週当りほんのわずかの用量(bolus)を負荷するか、及び／又は極めて少量の用量として投与することができ、そして腫瘍の増殖、血管形成、及び転移を抑制できる、ＮＫ４活性を伴う改良されたポリペプチド、及びその医薬組成物を見出すことである。

約２０−４０ｋＤａの１つのポリエチレン・グリコ−ル（ＰＥＧ）基に共有結合しているＮＫ４から成り、好ましくはＮＫ４リシンのε−アミノ基、又はＮ−末端アミノ基を介するＮＫ４接合体（モノＰＥＧ化ＮＫ４）を提供する。最も好ましくは、ＮＫ４が、ＮＫ４リシンのε−アミノ基、及びＮ−末端アミノ基から成る群から１つのアミノ基に無作為にＰＥＧ化されることである。驚いたことに、本発明によるモノＰＥＧ化ＮＫ４が、ＮＫ４又はＰＥＧ化されたＮＫ４に関する治療適用可能性に関して極めて優れた特性を有することが見出された。

さらに本発明は、本発明によるモノＰＥＧ化されたＮＫ４の生成方法を含む。

さらに本発明は、モノＰＥＧ化されたＮＫ４を含む医薬組成物を含む。

さらに本発明は、モノＰＥＧ化されたＮＫ４を含む医薬組成物を製造する方法を含む。

さらに本発明は、モノＰＥＧ化されたＮＫ４の医薬的な有効量は、それが必要な患者に１週当り１乃至７の用量（bolus）を適応して投与されることを特徴とするヒトのガン（たとえば胸部、肺、前立腺、すい臓、又は結腸ガン）の治療方法を含む。

驚くべきことに、治療期間中に適用される本発明による無作為のＰＥＧ化Ｋ４の全量が、ＰＥＧ化されないＮＫ４と比較し、かなり低いことが見出された。従って、医薬治療に使用されるＰＥＧ化されたＮＫ４の量が、ＰＥＧ化されないＮＫ４の必要量の約５０％以下、好ましくは約２０％以下、及び最も好ましくは約１０％以下である。

図１は、ＮＫ４、２０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び３０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４によりＨＧＦにより誘発されるＨＵＶＥＣの増殖の阻害を示している。図２は、ＮＫ４、及び４０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４によりＨＧＦにより誘発されるＨＵＶＥＣの増殖の阻害を示している。図３は、ＮＫ４、３０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び４０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４によりｂＦＧＦにより誘発されるＨＵＶＥＣ増殖の阻害を示している。図４は、静脈（ｉ．ｖ．）（図４Ａ）又は皮下（ｓ．ｃ．）（図４Ｂ）注射後の血清中のＮＫ４、３０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び４０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４による時間−濃度曲線を示している。図４は、静脈（ｉ．ｖ．）（図４Ａ）又は皮下（ｓ．ｃ．）（図４Ｂ）注射後の血清中のＮＫ４、３０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び４０ｋＤａのモノ−ＰＥＧ−ＮＫ４による時間−濃度曲線を示している。

［配列の説明］
配列ＩＤ番号第１は、ＮＫ４のＤＮＡ及びポリペプチド配列を示す。
配列ＩＤ番号第２は、ＮＫ４のポリペプチド配列を示す。

ヒトＨＧＦは、２硫化物に結合した異種２量体で、それをアミノ酸Ｒ４９４とＶ４９５との間を切断することにより、４６３アミノ酸のα−サブユニット及び２３４アミノ酸のβ−サブユニットに切断することができる。α鎖のＮ−末端が、メチオニン基から開始される３１アミノ酸により進行される。この断片には、３１アミノ酸のシグナル配列が含まれる。α鎖は、アミノ酸３２にて開始し、4個のクリングル(Kringle)領域を含む。いわゆる、「ヘヤピン領域」が、アミノ酸７０−９６から成る。クリングル１(Kringle 1)領域が、アミノ酸１２８−２０６から成る。クリングル２(Kringle 2)領域が、α鎖の約アミノ酸２１１−２８８から成り、クリングル３(Kringle 3)領域が、アミノ酸３０５−３８３から成り、そしてクリングル４(Kringle 4)領域が、アミノ酸３９１−４６９から成る。これらの配列の変異体、特にＮＫ４の生物的作用に影響を与えない変異体が存在し（ＨＧＦに対しそのアンタゴニステック活性、及びその抗アンタゴニステック活性に特に影響を与えない）、その変異体が、たとえば、ＷＯ９３／２３５４１に記載されている。さらにＮＫ４の長さが、その生物特性が影響されないかぎり、わずかなアミノ酸の範囲にて変化することができる。

ＮＫ４が、ＨＧＦ／ＳＦα−鎖のＮ末端４４７アミノ酸から構成され、それには、上記ヘアピン領域及び４個のクリングル(Kringle)領域を含む。それが、組み換え型ヒトＨＧＦ／ＳＦの産生及びエラスターゼによる消化(Date,K.,FEBS Letters 420(1997)1-6)か、あるいは下記のように適切な宿主細胞におけるNK4をコードする核酸の組み換え体の発現のいずれかによって、組み換え体的に産生することができる。ＮＫ４糖タンパク質は、分子量が約５７ｋＤａ（ポリペプチド部分だけでは５２ｋＤａ）にて、腫瘍増殖、血管形成及び／又は転移の阻害を起こすというin vivoにおける生物的な活性を有する。

従って、本明細書に使用される「モノＰＥＧ化ＮＫ４(MonoPEGlated NK4)」は、分子量が２０から４０ｋＤａのポリエチレン・グリコール基と共有的に結合していることを意味する。この基が、好ましいくはＮＫ４の異なる部位に無作為に、しかしながら最も反応性の高い部位、たとえばリシン側鎖及びＮ末端アミノ酸にて結合できることが好ましい。モノＰＥＧ化ＮＫ４(MonoPEGlated NK4)（従って、ＮＫ４リシンのεアミノ基及びＮ末端アミノ基である異なる部位にてＰＥＧ化された、好ましくはモノＰＥＧ化ＮＫ４分子の混合物である）は、調製物の少なくとも９０％、そして最も好ましくはその調製物の９２％以上である。従って本発明によるモノＰＥＧ化ＮＫ４(MonoPEGlated NK4)の調製物は、均質な調製物としての利点を表す、たとえば医薬的な適用において実質的に十分な均質性がある。

本明細書に用いられる「実質的均一性」は、生成、含有、又は使用されるＰＥＧ−ＮＫ４接合体分子だけが、１個の結合されるＰＥＧ基を有することを意味する。この調製が、未反応（すなわちＰＥＧ基のない）タンパク質を含むことができる。ペプチドのマッピング、及びＮ−末端の配列決定により確かめられるように、下記の一例としては、少なくとも９０％のモノＰＥＧ−ＮＫ４の接合体、及び最大で２％の未処理タンパク質のある調製物が提供される。

本発明により用いられたＰＥＧ重合体分子は、分子量が約２０から４０ｋＤａであり、これにより２０、３０、又は４０ｋＤａのＰＥＧ重合体が、（本明細書に用いられる「分子量」とは、ＰＥＧの分子量の意味で、「約」という語は、前記ＰＥＧ調製におけるある種の分子が、記載の分子量より多いか、幾分少ない分子量となる）ことを理解すべきである。

本発明による「ＰＥＧ又はＰＥＧ基」は、重要部分としてのポリ（エチレン・グリコール）を含む残基の意味である。こうしたＰＥＧが、結合反応に必要な、分子の化学合成から生ずる、又は分子を最適な距離とするスペーサであるさらなる化学基を含むことができる。

さらにこうしたＰＥＧは、互いに結合される１又は複数のＰＥＧ側鎖から成ることができる。２本以上ＰＥＧ鎖のＰＥＧが、マルチアーム(multiarmed)又は分岐ＰＥＧと呼ばれる。たとえば、分岐ＰＥＧが、グリセロール、ペンタエリスリオール、及びソルビトールを含む種々のポリオールに、ポリエチレン・オキサイドを加えることにより調製することができる。たとえば、４個のアームを有する分岐ＰＥＧが、ペンタエリスリオール、及びポリエチレン・オキサイドから調製することができる。分岐ＰＥＧが、たとえばＥＰ−Ａ０４７４０８４及び米国特許番号第５，９３２，４６２号に記載されている。特に好ましいのは、リシンの一級アミノ基を介して結合された２個のＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を有するPEGである(Monfardini, C.らのBioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。分子量２０−３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧ分子を有するＰＥＧポリマーが好まれ、そして分子量が３０ｋＤａ以上、特に４０ｋＤａのＰＥＧ重合体としての分岐ＰＥＧが好ましい。同様、ＰＥＧ４０ｋＤＡの２本アームＰＥＧ（ＰＥＧ２）が、特に好ましい。

本発明による方法は、実質的に均一なモノＰＥＧ化ＮＫ４を産生するために提供される。ＮＫ４のＰＥＧ化は、先行技術記載の方法により、たとえば求電子的に活性化されるＰＥＧ反応により行うことができる(supplier: Shearwater Corp., USA, www.shearwatercorp.com)。好ましいＰＥＧ試薬は、たとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジール・プロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）又はブタノエイト(butanoates)、又はｍＰＥＧ２−ＮＨＳ(Monfardini, C.らのBioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)などの分岐したN-ヒドロキシスクシンイミドである。こうした方法の結果、ＮＫ４リシンのε−アミノ基、又はＮ−末端アミノ基にて無作為にＰＥＧ化されるＮＫ４ポリペプチドとなる。無作為ではない、Ｎ−末端ＰＥＧ化ＮＫ４は、ＷＯ９４／０１４５１に基づいて生成することができる。

本発明の好ましい例における、前記ＮＫ４は、化学式における１個のポリ（エチレン・グリコール）群に共有結合する。
−ＣＯ−（ＣＨ₂）_x−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_m−ＯＲ
この場合ＮＫ４のアミノ基とアミド結合を形成するポリ（エチレン・グリコール）基の−ＣＯ（すなわちカルボニル）、Ｒは低級アルキル、ｘは２又は３、ｍは、約４５０から約９５０、そしてｎ及びｍが、結合部の分子量からＮＫ４タンパク質を引いて、約２０から４０ｋＤａとなるように選択される。ＮＫ４のアミノ基としてＮＫ４リシンε−アミノ基が利用可能な（遊離）アミノ基である。

より詳細には、上記接合体を化学式(I)にて表すことができる。
Ｐ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ₂）_x−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_m−ＯＲ（Ｉ）
この場合Ｐは、本明細書に記載されたＮＫ４タンパク質のクループ（すなわち、化学式（Ｉ）にて示されるカルボニル基とアミド結合を形成する単一のアミノ基又は複数のアミノ基ではなく）、そしてＲが低級アルキル、ｘは２又は３、ｍが約４５０から約９５０、接合体の分子量よりＮＫ４タンパク質引き２０から４０ｋＤａと成るように選択される。本明細書に使用されるように、所定の範囲の「ｍ」が単に位置付けの意味を有しているだけである。「ｍ」範囲が、いずれの場合においても正確にＰＥＧグループの分子量によって決定される。

さらに本発明の好ましい例において、前記ＮＫ４が、化学式の１個のポリ（エチレン・グリコール）に共有結合する。

この場合ｙは１から４である。好ましくは４である。ｎ及びｐは共に、接合体の分子量からＮＫ４タンパク質を引き約２０から４０ｋＤａで、好ましくは４０ｋＤａであり、ｎ及びｐは、２５％以下だけ異なり、好ましくは１０％以下、そして最も好ましくは同一であり、Ｒは低級アルコールである。

本明細書に用いられるように、「低級アルキル」とは、１から６個の炭素原子（（Ｃ₁−Ｃ₆）のアルキル）を有する直鎖又は分岐アルキル基の意味である。低級アルキル基の例は、メチル、エチル及びイソプロピルを含む。Ｒは、任意の低級アルキルである。Ｒはメチルである接合体が好ましい。

符号「ｍ」は、ポリ（エチレン・オキサイド）基におけるエチレン・オキサイド基（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）の数を表している。エチレン・オキサイドの１個のＰＥＧサブユニットが、約４４ダルトン（daltons）の分子量を有す。従って接合体の分子量（ＮＫ４の分子量を除く）が、数「ｍ」に依存する。本発明の接合体における「ｍ」が、約４５０から約９５０である（約２０ｋＤａから約４０ｋＤａの分子量に相当）。数ｍは、得られる本発明の接合体が、未修飾ＮＫ４と比較可能な生理的活性を有するように選択され、その活性が、未修飾ＮＫ４の対応する活性と同じか、それより多いか、又はその１画分を表すことができる。分子量の「約」のある特定数は、従来の分析技術により決定されるその数が適切な範囲内にあることを意味する。数「ｍ」は、ＮＫ４タンパク質に共有結合されるポリ（エチレン・グリコール）基のそれぞれの分子量が、約２０ｋＤａから約４０ｋＤａとなるように選択される。

化学式（Ｉ）の化合物が、たとえば周知の活性化された重合体の材料から調製することができ；

式中Ｒ及びｍは、化学式IIの化合物を、ＮＫ４タンパク質により縮合することにより上記のようである。化学式（II）のｘが３である化合物は、ポリ（エチレン・グリコール）のα−低級アルコキシ酪酸・スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）である。アミドを形成するためのアミンと活性化エステルとを反応させる従来の方法を利用することができる。上記反応において明示されているスクシンイミジルエステルが、アミド形成により生ずる残基である。タンパク質による結合を形成する、たとえば化学式IIの化合物であるスクシンイミジルエステルの使用が、１９９７年９月３０日に発行（Harrisら）の米国特許番号第５，６７２，６６２に開示されている。

ヒトＮＫ４は、３０リシン残基の３０遊離ε−アミノ基を含む。ＰＥＧ化試薬が、化学式ＩＩのＳＢＡ化合物に結合されると、モノ−、ジ−、及び微量のトリ−ＰＥＧ化された細片が、タンパク質濃度を５から１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨを７．０から８．０、タンパク質とＰＥＧとの比を約１：３、そして反応温度を２０−２５℃にて、生成されることが見出された。タンパク質とＰＥＧの比が、約１：１又は１：２（たとえば、３０ｋＤａのＰＥＧ−ＳＢＡに対し約１：２、そして４０ｋＤａのＰＥＧ２−ＮＨＳに対して約１：５が好ましい）である時、主にモノＰＥＧ化された細片が生成された。操作する反応条件（たとえば、試薬の比率、ｐＨ、温度、タンパク質濃度、反応時間など）により、異なるモノＰＥＧ化種の相対量を、最適化することができる。限定されないが、典型的である条件は、約８から１２ｍｇ／ｍｌのＮＫ４、０．３Ｍの燐酸カリウム、ｐＨ８、２５℃、反応時間１時間である。３０ｋＤａのＰＥＧ−ＳＢＡを用いるこうした条件下にて、収率が、約３８％のモノＰＥＧ化ＮＫ４である。

さらにモノＰＥＧ化されたＮＫ４は、ＷＯ９４／０１４５１に記載された方法により生成することができる。ＷＯ９４／０１４５１では、修飾された末端アミノ酸のα−炭素反応基による、組み換え型ポリペプチドの調製方法が記載されている。上記方法の工程では、組み換え型ポリペプチドを形成させ、そしてＮ−末端のαアミン及びＣ−末端のαカルボニルにて１又は複数の生物的に付加される保護基にて、それを保護することに関与している。さらにポリペプチドは、反応性側鎖基を選択的に保護するための化学保護剤と反応することができ、それにより側鎖基が修飾されないように防止する。

さらにそのペプチドを、生物的保護基に対し特異的な切断試薬により切断し、未保護の末端アミノ酸α−炭素反応基を形成する。上記未保護の末端アミノ酸α−炭素反応基を、化学修飾剤により修飾する。さらに側鎖が保護された末端修飾の１本鎖複製ポリペプチドが、側鎖基にて脱保護され、末端にて修飾される組み換え型１本鎖複製ポリペプチドを形成する。この方法における工程の数及び順序を、ポリペプチドのＮ−及び／又はＣ−末端のアミノ酸に選択的に修飾を行うように変えることができる。

さらに本発明による好ましい接合体は、ＮＫ４のアミノ基とアミド結合を形成するリンカーのＣ（Ｏ）（上記のように、リシン残基のε−アミノ基が利用できる）と、化学式−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｓ−Ｙのリンカーを介して低級アルコキシ・ポリ（エチレン・グリコール）基に共有結合されているＮＫ４タンパク質から成り、Ｘが−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_k−、ｋは、１から１０、Ｙは；

ポリ（エチレン・グルコール）成分の平均分子量が、約２０ｋＤａから約４０ｋＤａで、そしてＮＫ４のポリペプチドが５２ｋＤａの分子量に対し、接合体の分子量が約７２ｋＤａから約９２ｋＤａであり、又はＮＫ４糖タンパク質が５７ｋＤａの分子量に対し約７７ｋＤａから約９７ｋＤａである。

さらにＮＫ４のこうした種類を、化学式（III）にて表すことができる。
Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｙ−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_m−ＯＲ（III）
式中Ｒは、任意のアルキル、メチル、エチル、プロピルなど１から６個までの炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基を意味する。好ましいアルキルは、メチルである。Ｘは、−（ＣＨ₂）_k又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_k−、この場合ｋは１から１０である。好ましくは、ｋは１から４、より好ましくは、ｋが１又は２、最も好ましくは、Ｘは−（ＣＨ₂）である。

化学式IIIにおけるYは；

好ましくは；

より好ましくは；

化学式(III)における、数値ｍは、化学式(III)から得られた接合体が、未修飾ＮＫ４と比較し生理学的活性を有するように選択され、その活性が、未修飾ＮＫ４の対応する活性と等しいか、有意的に多いか、あるいはその画分か、を表すことができる。ｍは、ＰＥＧ単位体におけるエチレン・オキサイド鎖の数を表している。単一のＰＥＧサブユニットである−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）−は、分子量が約４４ダルトン(daltons)である。従って、接合体の分子量（ＮＫ４の分子量を除いて）が、数ｍに依存する。「約(about)」のある特定数値の分子量は、従来の分析技術により決定される数が適切な範囲内にあることを意味する。従ってｍは、４５０から９５０（２０から４０ｋＤＡの分子量に相当）の範囲の整数である。

化学式（III)の好ましいＮＫ４タンパク質は次の化学式により表される。

最も好ましいＮＫ４タンパク質産生物は、以下の化学式により表される。

これらＮＫ４タンパク質が、以下によって調製することができる。

(a) 遊離アミノ基、好ましくはＮｋ４タンパク質のリシンアミノ酸のε−アミノ基又は化学式によるＰ−ＮＨ₂として表されるＮ−末端アミノ基に、化学式Ｚ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑとして表される二官能基試薬と共有的に反応させ、次の化学式にて表されるアミド連鎖による中間体を形成する。
Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑ
式中Ｐは、アミド連鎖を形成するアミノ基を有意的に少ないＮＫ４タンパク質である；Ｚは、反応基、たとえばカルボキシル−ＮＨＳのエステル、Ｘは、−（ＣＨ₂）_k−又は−ＣＨ₂（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_kであり、式中ｋは１から約１０、Ｑはアルカノイルのような保護基、たとえばアセチル基である。

(b) 工程(a)からのアミド連鎖による中間体と、化学式Ｗ−［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］_m−にて表される活性化ポリエチレン・グリコール誘導体とを共有的に反応させて、次の化学式にて表されるＮＫ４タンパク質生成物を形成する。

式中Ｗは、Ｙのスルフヒドリル反応形状で、ｍは、約４５０から約９５０の範囲の整数で、Ｒは低級アルキル、そしてＹは上に明示されている。

この例における、二官能基試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート、又はＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートが好ましく、Ｚは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドが好ましく、そして活性化ポリエチレン・グリコール誘導体Ｗ−［ＯＣＨ₂ＣＨ₂］_m−ＯＲは、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルフォン、及びメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドからなる群から選択されることが好ましい。

より詳細には、化学式（III）のＮＫ４タンパク質を、ＮＫ４にチオ基を共有結合（「活性化」）することより調製することができ、そして得られた活性化ＮＫ４にポリ（エチレン・グルコール）（ＰＥＧ）誘導体を結合させることができる。本発明によるモノＰＥＧ化ＮＫ４の調製のための第一の工程は、ＮＫ４のＮＨ₂基を介してチオール基を共有結合させることを含む。ＮＫ４のこうした活性作用は、活性化エステル（たとえば、スクシンイミジルエステル）、無水物、硫酸のエステル、カルボン酸のハロゲン化物、及びスルホン酸などそれぞれから、保護されたチオール基、及び付加反応基を運ぶ二官能基試薬により行われる。チオール基が、技術的に周知な基、たとえばアセチル基により保護される。これらの二官能基試薬が、アミドを形成することによりアミノ基と反応することができる。

好ましい例における、アミノ基の活性化が、スクシンイミジル成分を有する、二官能基試薬を用いた反応により、実現される。二官能基試薬が、異なるスペーサ成分（species）、たとえば、−（ＣＨ₂−）_k−又は−ＣＨ₂−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）_k−を運ぶことができ、式中ｋは、１から約１０、好ましくは１から約４、そしてより好ましくは１又は２、そして最も好ましくは１である。これら試薬の試料としては、上に明記したようにＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）及びＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）がある。

二官能基試薬の調製は、技術的に周知である。２−（アセチルチオ）−（エトキシ）_k−酢酸−ＮＨＳエステルがＤＥ−３９２２４７０５に記載されており、アセチルチオ化合物に対する誘導体化が、March,J.,Advanced Organic Chemistry(1977)375-376に記載されている。SATAは、商業的に入手できる(Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL)。

ＮＫ４分子にチオール基を１だけの添加は、反応パラメータを調整することにより、すなわちタンパク質（ＮＫ４）濃度、及びタンパク質／二官能基試薬の比により選択することができる。

反応は、たとえば、水性緩衝溶液にて、ｐＨ６．５−８．０、たとえば１０又は１００ｍＭのリン酸カリウム、３００ｍＭのＮａＣｌを用いる場合、用いない場合、ｐＨ７．３にて行われる。二官能基試薬をＤＭＳＯに加えることができる。反応が完了した後好ましくは３０分後に、リシンを加えることによりその反応を停止させる。過剰な二官能基試薬を、技術的に周知な方法、たとえば透析又はカラム濾過により分離することができる。ＮＫ４に加えられたチオール基の平均数は、Grasetti, D. R., and Murray, J. F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49に記載された光度測定法により、決定することができる。
上記反応の後に、活性化ポリエチレン・グリコール(PEG)誘導体を共有結合させる。適切なPEG誘導体が、約20から約40kDaの平均分子量のPEG分子に活性化される。

活性化されたＰＥＧ誘導体が技術的に周知であり、たとえば,Morpurgo,M.らのJ.Bioconj.Chem.7(1996)363 ff for PEG-vinylsulfoneに記載されている。直鎖及び分岐鎖ＰＥＧ成分(species)は、化学式Iの化合物の調製には適切である。反応性ＰＥＧ試薬の試料としては、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ及びメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルフォンがる。

これらのヨード活性化物質を使用することは、技術的に周知であり、たとえばHermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p.147-148に記載されている。

最も好ましくは、ＰＥＧ成分（species）が、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（ＭＷ２０，０００から４０，０００；Shearwater Polymers, Inc.)などのマレイミド（アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミド）の使用により活性化される。アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドの構造は、以下の通りである。

好ましくは式中ＲＲ、及びｍは、上に明示された通りである。

アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドとの結合反応が、水性緩衝溶液中、たとえば１０ｍＭのリン酸カリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．２におけるチオール保護基のin sutu切断後に行う。保護基の切断は、たとえば、ＤＭＳＯ、２５℃、ｐＨ６．２、約９０分間ヒドロキシルアミンにより行うことができる。ＰＥＧ修飾には、活性化ＮＫ４／アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比が、約１：１から約１：６にすべきである。その反応を、システインの付加、及び２硫化物の結合状態を形成できるＮ−メチルマレイミド又は他の適切な化合物と残っているチオール（−ＳＨ）との反応により停止することができる。Ｎ−メチルマレイミド又は他の適切な保護基などの保護基と残っている活性チオール基と反応することから、本発明の結合におけるＮＫ４タンパク質が、こうした保護基を含むことができる。一般的に本明細書に記載される方法は、異なる数の保護基により保護され、数が変わっているチオールを有する分子の混合物を生成することになり、それがＰＥＧ−マレイミドに結合されないタンパク質に対する活性化チオール基の数に依存する。

Ｎ−メチルマレイミドが、ＰＥＧ化されたタンパク質に残っているチオール基を停止させるために用いられる場合と同じ型の共有結合を形成するが、二硫化化合物が、分子間による硫化物／二硫化物の交換反応を起こして、停止試薬の二硫化物の架橋接合体となる。この種の停止反応に対する好ましい停止試薬は、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、システイン、及びシスタミンである。システインが付加されない場合、正味の電荷が、ＰＥＧ化タンパク質に導入されるが、停止試薬ＧＳＳＧ又はシスタアミンを使用すると、付加的に負に電荷、又は正に電荷することになる。

さらにジ−、トリ−及び複数のＰＥＧ化されたＮＫ４の種 (species)からモノ-のPEG化されたNK4種(species)を分離することを含む、化学式(III)の化合物の精製は、技術的に周知の方法、たとえばカラム・クロマトグラフィにより行うことができる。モノ−ＰＥＧ接合体の割合が、化合物中モノ−ＰＥＧの割合を減少させるための溶離ピーク近辺を有意的に広い画分として、又は化合物中モノ−ＰＥＧの割合を増加させるための狭い画分として、プールすることにより制御することができる。約９０％のモノ−ＰＥＧ接合体が、収率と活性の均衡が適切である。たとえば、接合体の少なくとも９２％、又は少なくとも９６％がモノ−ＰＥＧ種(species)である組成物が、要望される。本発明の例における、モノ−ＰＥＧ接合体の百分率は、９０％から９６％である。

医薬剤の生成
本発明の化合物は、当業者に知られた医薬組成物を調製する方法により生成することができる。こうした組成物の生成には、本発明によるモノＰＥＧ化ＮＫ４を、医薬的に受け入れ可能な担体と混合状態にて組み合わせる。こうした受け入れ可能な担体は、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, 1990, Mack Publishing Company, edited by Osloら(e.g. pp.1435-1712)に記載されている。典型的な化合物は、本発明による物質の有効量、たとえば適切な量の担体と共に約０．１から１００ｍｇ／ｍｌを含む。その組成物を非経口的に投与することができる。

さらに本発明は、本明細書に記載された接合体を含む医薬組成物を提供し、そのモノ−ＰＥＧ接合体の百分率が、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％である。

本発明による医薬生成物は、技術的に周知な方法により調製することができる。通常、モノ−ＰＥＧ化されたＮＫ４の溶液が、医薬組成物に使用されるよう意図される緩衝液に透析され、そして所望の最終タンパク質濃度は、濃縮又は希釈により調整される。

こうした医薬組成物は、注射にて投与するため使用することができ、医薬的に受け入れ可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と共に、モノ−ＰＥＧ化ＮＫ４の有効量を含んでいる。こうした組成物は、種々の緩衝液の希釈剤としての溶液（たとえばアルギニン、酢酸、リン酸）、ｐＨ及びイオン強度、洗剤及び安定剤(たとえばツイーン８０／ポリソルベート(Tween 80/polysorbate)，プルロニックＦ６８（pluronic F68）、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム）、抗酸化剤（たとえばアスクロビン酸、Ｌ−メチオニン）、防腐剤（チマゾール(Timersol)、ベンジルアルコール）、及びバルキング物質（たとえば多糖類、マニトール）などの添加物を含む、ポリ酪酸、ポリグリコール酸などの重合化合物の特定調製物に又はリポゾームにその物質を組み入れる。こうした組成物が、本発明によるモノＰＥＧ化ＮＫ４の放出及び浄化の生理的状態の安定率に影響を及ぼす。

用量及び医薬剤の濃度
典型的に標準的なガン治療の形態において、患者を、所定の期間、１日から約３０日又はそれ以上続けて、１日当り、ｋｇ当りモノＰＥＧ化ＮＫ４を１から３０ｍｇ範囲の用量にて治療する。医薬剤が、ｍｌ当り０．１から１００ｍｇのモノＰＥＧ化ＮＫ４を含む医薬生成物を、日１回の皮下又は静脈注射による用量として適用される。この療法は、標準療法の前、療法中、療法後にモノＰＥＧ化ＮＫ４を適用することにより、任意の標準治療（たとえば化学療法）と組み合わせることができる。このことは、標準療法だけと比較して改良された結果となっている。

いずれかの症例における本発明の投与されるＰＥＧ化ＮＫ４の全体の容量は、同じ治療に対するＮＫ４の量よりかなり低い。

以下の例として、文献及び配列リストが、本発明の理解を支援するために提供され、その真の範囲が添付の請求項において説明されている。その変更が本発明の精神から逸脱することなく、説明の過程において行うことができることが、理解されよう。

組み換え型のＮＫ４を生成
治療に使用するＮＫ４は、細菌又は真核生物の発現系を用いる組み換え型の手段により生成することができる。適切な真核生物の発現系は、たとえば遺伝子操作されたＨｅＬａ，ＢＨＫ又は好ましいＣＨＯ細胞である。ＮＫ４の生成に遺伝子操作される細胞は、適切な培地にて培養される。典型的には、１乃至５リッターの細胞培養液が、１０リッターの醗酵液に対する接種として使用される。３乃至５日後、１０リッターの醗酵液の培養液を、１００リッターの製造醗酵液に対する接種として使用することができる。醗酵液に付加したさらに３乃至５日後、この培養液を１０００リッターの醗酵液に対する接種として使用することができる。３乃至４日後、細胞を、濾過又は遠心分離により取り出し、そして廃棄する。ＮＫ４含有の上清液が濾過、収集され、そして精製期間中に精製処理される。この精製処理は、以下の実施例に記載されている。

精製
ヘパリン−セファローズ(Heparin- Sepharose)は、ヘパリンが共有結合する表面に対するセファローズビーズ(Sepharose beads)から成る。ＮＫ４がヘパリンに高い親和性を示すことから、それを、このカラムに保持し、高濃度の塩にて溶離することができ、一方タンパク質汚染物質及び他の不純物が、低濃度の塩にて結合しないかあるいは溶離されない。５０ｍＭのHepes、ｐＨ７．５における約０．７乃至１．１ＭのＮａＣｌにて溶離するＮＫ４含有の画分が、収集されさらにヒドロキシアパタイト・カラム(hydrokyapatite column)に負荷される。ＮＫ４が、約０．４乃至０．７Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．５にて溶離する。得られる画分には、汚染タンパク質が実質的に存在しなく、さらにＳ−セファローズ・クロマトグラフィにより精製することができる。

モノＰＥＧ化ＮＫ４の生成
上記方法により精製されたＮＫ４が、ＰＥＧ化反応として用いられる。上記３種の適切な方法を例示的に記載する。

ａ）ｍＰＥＧ−ＳＢＡによるＮＫ４のＰＥＧ化
数滴のＮＫ４を、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ（比較のためそれぞれ５ｋＤａ、２０ｋＤａ、及び３０ｋＤａ；Shearwater Polymers, Inc., Huntsville Alabama)と反応させる。反応を、試薬に対するタンパク質の比を１：１と１：５との間、約２時間、室温にて（２０及び３０ｋＤａのＰＥＧを使用する場合、１：２の比が好ましい）行った。その反応を、１０ｍＭのトリス緩衝液、又はアルギニンＨＣｌ、ｐＨ８、を添加することにより停止させ、そしてその試料を、平衡化及び溶離のため緩衝溶液５００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、ｐＨ６．８として使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はセファローズ６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサイズ排除クロマトグラフィにより分析した。その反応を、試薬に対するタンパク質の比、ｐＨ、時間及び温度を変えて、良好なモノＰＥＧ化ＮＫ４を得るために最適化した。

こうした条件は、たとえば：
Ｎｋ４の濃度：８−１２ｍｇ／ｍｌ
緩衝液系／ｐＨ：０．３Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ８
温度：２５℃
反応時間：１時間
モル比（Molar ratios）（タンパク質：試薬）：１：２
収率
モノＰＥＧ化ＮＫ４：３８％
ジＰＥＧ化ＮＫ４：１７％
未ＰＥＧ化ＮＫ４：４５％

ｂ）ｍＰＥＧ−ＳＰＡによるＮＫ４のＰＥＧ化
数滴のＮＫ４（０．３Ｍの燐酸カリウム、ｐＨ８におけるタンパク質濃度８乃至１２ｍｇ／ｍｌ）を、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（比較のためそれぞれ５ｋＤａ及び２０ｋＤａ、Shearwater Polymers, Inc., Huntsville Alabama)と反応させた。反応は、試薬に対するタンパク質の比を１：２、約２時間、室温にて行った。その反応を、１０ｍＭのトリス緩衝液、又はアルギニンＨＣｌを添加することにより停止させ、そしてその試料を、平衡化及び溶離化のため緩衝溶液５００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、ｐＨ６．８として使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ又はセファローズ６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるサイズ排除クロマトグラフィにより分析した。その反応を、試薬に対するタンパク質の比、ｐＨ、時間及び温度を変えて、ジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＮＫ４に比較して良好なモノＰＥＧ化ＮＫ４を得るため最適化した。

ｃ）ｍＰＥＧ２−ＮＨＳによるＮＫ４のＰＥＧ化
ＰＥＧ−ＳＰＡｍＰＥＧ２−ＮＨＳ（リシン・リンカーを介して分岐される、４０ｋＤａのＰＥＧ）に換え、モル比が１：５（タンパク質：ＰＥＧ試薬）にて使用されたことを除き、実施例３ｃに記載されたように行われた。

モノＰＥＧ化ＮＫ４の分離
モノＰＥＧ化ＮＫ４が、平衡化及び溶離化のため、緩衝溶液５００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、ｐＨ６．８として使用し、準備したサイズ排除クロマトグラフィ(たとえばSuperose 6又はSuperdex 200;Phamacia)、又はイオン交換クロマトグラフィにかけることにより、未ＰＥＧ化ＮＫ４、ジ−及びトリ−ＰＥＧ化ＮＫ４から分離することができる。精製されたタンパク質には、極めて良好なモノＰＥＧ化された種が含まれる。画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆相クロマトグラフィにより分析した。

モノＰＥＧ化ＮＫ４の分子特性
ａ）サイズ排除クロマトグラフィ
モノＰＥＧ化種は、サイズ排除クロマトグラフィ（たとえば、Superose 6又はSuperdex 200；Phamacia；平衡化及び溶離化のため、緩衝溶液５００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、ｐＨ６．８として使用）においては、未修飾の形状体と比較して容易に溶離する。これは、分子の水素運動半径の増大によるものである。

ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質が、これらの分子量により分離される。ＰＥＧ化によって分子量が増大することにより、モノＰＥＧ化ＴＫ４が、未修飾ＮＫ４と比較して移動距離が短くなることを示す。この移動は、ＰＥＧ成分の鎖の長さ、及びＮＫ４分子当り結合されるＰＥＧ基の数と逆の相関関係にある。

ｃ）ペプチドの作図
配列に特異的なエンド−プロテナーゼ（たとえばＬｙｓＣ又はトリプシン）によりモノＰＥＧ化ＴＫ４を消化させると、ペプチドの特徴的な地図となる。得られるペプチドを、逆相クロマトグラフィにより分離し、さらにマススペクトロメトリー及び／又はＮ−末端シーケンシングにより分析することができる。これは、ＮＫ４分子内のＰＥＧ修飾基の決定を可能にする。

ｄ）逆相クロマトグラフィ
さらにモノＰＥＧ化ＮＫ４は、逆相クロマトグラフィによっても特徴付けることができる。ＮＫ４をＰＥＧ化すると、未修飾ＮＫ４と比較して保持時間が変化することになる。

モノＰＥＧ化ＮＫ４、未ＰＥＧ化ＮＫ４、及び複数のＰＥＧ化ＮＫ４の比較
この実施例において、未ＰＥＧ化ＮＫ４、ＰＥＧ５ｋＤａ、ＰＥＧ２０ｋＤａ、ＰＥＧ３０ｋＤａ、ＰＥＧ４０ｋＤａを伴うモノＰＥＧ化されたＮＫ４及び複数のＰＥＧ化されたＮＫ４（２以上のＰＥＧ鎖によりＰＥＧ化されたＮＫ４）を使用した。

ａ）分散アッセイ(Scatter assay)
ＭＤＣＫ細胞を、組織培養プレートにおいてサブ密集成長(subconfluently grown)させる。細胞を、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、又はＨＧＦとＮＫ４を組み合わせて処理した。これらの実験におけるＨＧＦにて誘発される細胞の分散処理が、１０乃至１０００倍の過剰なモルのＮＫ４を添加することにより阻害され、それがＰＥＧ化されたＮＫ４の機能的な活性を示している。in vitroにおけるモノＰＥＧ化５ｋＤａ−ＰＥＧ−ＮＫ４、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＮＫ４、３０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＮＫ４、及び４０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＮＫ４の活性は、未ＰＥＧ化ＮＫ４と類似していることが見出された。さらに、２以上のＰＥＧ鎖（２０乃至４０ｋＤａ）を添加すると、in vitroにおける活性（表１）を有意的に失うことになることが見出された。

ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）にて誘発されるＭＤＣＫ細胞の分散を阻害することにおけるＮＫ４のＰＥＧ化された種々の形状の相対的な効能が、評価された。＋＋が完全な阻害を意味し、＋が阻害することを意味し、＋／−は、弱い阻害を意味し、そして−は、阻害しないことを意味する。

ｂ）ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
ＮＫ４によるＨＧＦの分裂促進活性を阻害することが、T.らのNature 342(1989)440-443に記載されたように、培地におけるＨＵＶＥＣの増殖を測定することにより決定された。これらの実験におけるＨＧＦに誘発される細胞の増殖が、１０乃至１０００倍の過剰なモルのＮＫ４を添加することにより阻害され、それがモノＰＥＧ化ＮＫ４（図１及び２）の機能的な活性を示している。

別の選択肢として、ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを、ＮＫ４によるｂＦＧＦ（塩基性繊維芽増殖因子）の分裂促進活性を阻害することにより行った。その阻害は、Kuba, K.らのCancer Res. 60 (2000) 6737-6743に記載されたように、培地におけるＨＵＶＥＣの増殖を測定することにより決定された。これらの実験におけるＦＧＦに誘発される細胞の増殖が、１０乃至１０００倍の過剰なモルのＮＫ４を添加することにより阻害され、それがモノＰＥＧ化ＮＫ４（図３）の機能的な活性を示している。

ｃ）逆アッセイ
このアッセイにおける腫瘍細胞の逆効能が分析された。このアッセイが、特にＨＴ１１５細胞を使用してAlbini,A.らの(1987)に記載されたように行われた。さらにＨＧＦにて誘発される（１０ｎｇ／ｍｌ）細胞の逆アッセイが、ＰＥＧ化されたＮＫ４の１０乃至１０００倍の過剰なモルにより阻害することが可能であり、それがモノＰＥＧ化ＮＫ４の機能的な活性を示している。

in vivoにおける活性
モデル：Panc Tu1ヒトすい臓ガン正常位のＳＣＩＤマウス・モデル(Alves,F.らのPancreas 23(2001)227-235)
処理：８日後に、それを２１日間にわたりモノＰＥＧ化ＮＫ４を日々１回の適用。

容量：１６ｍｇ／ｋｇ／日
４ｍｇ／ｋｇ／日
１ｍｇ／ｋｇ／日
Placebo
結果：モノＰＥＧ化ＮＫ４による処理は、１次腫瘍増殖及び細胞分裂の促進の容量依存による阻害を示しているが、一方でPlacebo処理クループにおいては、効果が全く見受けられなかった。

医薬組成物
適切な医薬組成物は、たとえば：
１乃至３０ｍｇ／ｍｌのモノＰＥＧ化ＮＫ４
１５０ｍＭのＮａＣｌ
１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２
：
１ｘ−乃至３０ｍｇ／ｍｌのモノＰＥＧ化ＮＫ４
１５０ｍＭのＮａＣｌ
0.01Tween 80又はTween 20又はpluronic F68
１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２
：
１乃至３０ｍｇ／ｍｌのモノＰＥＧ化ＮＫ４
５０ｍＭのＮａＣｌ
３％のマニトール(mannitol)
１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２
：
１乃至３０ｍｇ／ｍｌのモノＰＥＧ化ＮＫ４
５０ｍＭのＮａＣｌ
３％のマニトール(mannitol)
０．０１％のTween 80又はTween 20又はpluronic F68
１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２
：
モノＰＥＧ化ＮＫ４を上記緩衝溶液（マニトール（mannitol）を有する場合、又は有しない場合）に透析された組成物が調製される。タンパク質濃度を、濃縮又は緩衝溶液にて希釈することにより調整される。洗剤及びＮａＣｌが１０％のストック溶液から付加される。

ＮＫ４、３０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び４０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４の医薬動態的分析
成人のマウス（グループ当り４匹）が、単独にてＮＫ４、３０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び４０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４（注射の容量０．２５ｍｌ中４ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ静脈（ｉ．ｖ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）のボルス（ｂｏｌｕｓ）注射を受けた。時間による採取とし血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡによるＮＫ４、３０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び４０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４の含まれるものとして分析した。時間−濃度曲線を計算し、図４に示した。これらのデータでは、３０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４及び４０ｋＤａ−モノ−ＰＥＧ−ＮＫ４が、in vivoにいける安定性が有意に改良され、得られた結果が、未修飾ＮＫ４と比較して血漿の半減期が有意に増加していることを示した。

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WO 94/13322

Claims

ヘアピン領域、及びα鎖の４個のクリングル領域（kringle regions）から成る肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）のＮ−末端断片、及び約２０から４０ＫＤａの分子量を有する単一のポリエチレン・グリコール基を含む接合体。
前記ポリエチレン・グリコール基が次の化学式を有し；
−ＣＯ−（ＣＨ₂）_X−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_mＯＲ
そして、前記−ＣＯ基が、肝細胞増殖因子におけるＮ−末端断片のアミノ基の１つとアミド結合を形成し、その時Ｘは２又は３、ｍは約４５０から約９５０、Ｒは（Ｃ₁−Ｃ₆）のアルキルであることを特徴とする請求項１記載の接合体。
前記ポリエチレン・グリコール基が次の化学式を有し；

そして、前記−ＣＯ基が、肝細胞増殖因子におけるＮ−末端断片のアミノ基の１つとアミド結合を形成し、その時Ｙは１乃至１０、ｎ及びｐは、共に約４５０から約９５０、そしてＲは（Ｃ₁−Ｃ₆）のアルキルであることを特徴とする請求項１記載の接合体。
ポリエチレン・グリコール基が約３０から４０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の接合体。
単一又は複数の前記ポリエチレン・グリコール基が、単一又は複数のモノメトキシポリエチレン・グリコール基であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の接合体。
請求項１から５のいずれか１項記載の接合体、及び医薬的に受け入れ可能な担体を含む医薬組成物。
請求項６記載の医薬組成物を調製するための方法。
ガン治療に有益な医薬剤の調製のため請求項１から５のいずれか１項記載の接合体の使用。
請求項６記載の医薬組成物を、それが必要な患者に投与する工程を含む、ガン疾患を治療するための方法。