KR20090020713A

KR20090020713A - Ｈｇｆ-ｎｋ4 의 ｐｅｇ-복합체

Info

Publication number: KR20090020713A
Application number: KR1020097002234A
Authority: KR
Inventors: 미하엘 브란트; 아폴론 파파디미트리오우
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2009-02-26
Also published as: YU65103A; PL367402A1; US20030012775A1; CN1571679A; EP1234583A1; RU2003127395A; KR20030072629A; CZ20032511A3; US7846896B2; AU2002233354B2; PE20020992A1; CA2438308A1; CN100339393C; RU2293574C2; BR0207510A; NO20033737D0; JP2004521139A; BG108125A; MA26998A1; GT200200038A

Abstract

α-사슬의 4 개 링글 부위 및 헤어핀 도메인으로 이루어진 간세포 성장 인자 (HGF/SF) 의 N 말단 단편, 및 약 20 내지 40 kDa 의 분자량을 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜기를 포함하는 복합체는 향상된 성질을 가지고, 종양 치료를 위한 유용한 치료제이다.

폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 복합체

Description

ＨＧＦ-ＮＫ4 의 ＰＥＧ-복합체{PEG-CONJUGATES OF HGF-NK4}

본 발명은 간세포 성장 인자의 N 말단 4 개 링글을 함유하는 단편(NK4)의, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 복합체, 그것의 약학 조성물, 그것의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.

간세포 성장 인자 (HGF/SF) 는 [Nakamura, T. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1984) 1450-1459] 에 의해 동정되고 정제된 폴리펩티드이다. 또한 간세포 성장 인자는 산포 인자(SF : Scatter Factor)와 동일함이 밝혀졌다 [Weidner, K.M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7001-7005]. HGF 는 증식, 유사분열생식(mitogenesis), 분지 세관의 형성, 또한 종양 세포의 경우에는 침윤 및 전이를 포함하는 수많은 세포 표현형의 발현에 관여하는, 분자량 약 100 kDa 의 당단백질이다. 현황 개관을 위해, [Stuart, K.A. 등, International Journal of Experimental Pathology 81(2000)17-30] 을 참고한다. 래트 HGF 및 인간 HGF 의 모두가 시퀀싱 및 클로닝되었다 [Miyazawa, K. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) 967-973; Nakamura, T. 등, Nature 342 (1989) 440-443; Seki, T. 등, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990) 321- 327; Tashiro, K. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3200-3204; Okajima, A. 등, Eur. J. Biochem. 193 (1990) 375-381]. 첫 번째 5개의 N 말단 아미노산이 결핍된 HGF (dHGF) 의 약물동력학 및 약물학적 효과가 [Uematsu Y. 등, J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131-135] 에 의해 조사되었다. dHGF 의 혈청 농도가 급속히 감소하였고, 이에 따라 투여 경로로서 일시 주사(bolus injection)보다 주입(infusion)이 바람직하다는 것이 밝혀졌다.

미국 특허 No. 5,977,310 는 PEG-개질 HGF 를 기재하고 있다. 상기 PEG-개질 HGF 는 생체 내 연장된 소제(clearance)를 가지고, HGF 와 동일한 생리학적 활성을 가진다. 그러나 미국 특허 No. 5,977,310 에 따르면, 단지 HGF 의 반감기를 59.2 분에서 각기 76.7 분 또는 95.6 분으로 연장하는 것만이 가능하다 (미국 특허 No. 5,977,310 의 실시예 5를 참조한다). 또한, 상기 특허에서는 PEG 시약의 몰량이 HGF 의 몰 중량의 5 내지 100 배의 범위에서 선택될 수 있음이 제시된다. 라이신의 아미노기 또는 단백질의 N 말단을 개질하는 경우, PEG 시약의 바람직한 몰 범위는 HGF 의 몰 중량의 10 내지 25 배이다. 부착된 PEG 사슬의 분자량은 약 10 kDa 이었다. PEG, 및 HGF 와 같은 폴리펩티드로 이루어진 복합체의 합성 방법이 또한 WO 94/13322 호에 기재되어 있다. 상기 복합체는, 그 저자에 따르면, 소정의 위치에 함께 연결되며, 이 때 랜덤 복합체화는 중합체성 부분을, 치료학적으로나 진단상으로 바람직한 활성을 중재하는 분자의 도메인으로 도입시킨다. 결과적으로, 분자는 생체 내 연장된 반감기를 획득할 수 있고, 이종 단백질의 경우에는, 감소된 면역원성 (단, 원하는 생물학적 활성의 상당하거나 완전한 손실을 댓가로 함)을 획득할 수 있다 (예를 들어, [Kitamura, K. 등, Cancer Res. 51(1991) 4310-4315 및 Maiti, P.K. 등, Int. J. Cancer Suppl. 3 (1988) 17-22] 를 참조한다). PEG화 IFN-α는, 예를 들어 비-PEG화 IFN-α에 비해 잠재능의 단 7 % 만을 나타낸다 [Bailon, P., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195 - 202].

또한, NK4 라고 칭해지고, HGF/SF 의 4 개 링글 도메인 및 N 말단 헤어핀 도메인으로 이루어진 HGF/SF 단편은 HGF/SF 의 것과 완전 상이한 약물학적 성질을 가지고, 결장 암 세포의 운동력 및 침윤에 대한 HGF/SF 의 영향에 대한 길항자이고, 부가적으로 종양 성장 및 전이를 억제하는 혈관신생(angiogenesis) 억제제이다 [WO 93/23541; Parr, C. 등, Int. J. Cancer 85 (2000) 563-570; Kuba, K. 등, Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743; Date, K. 등, FEBS Letters 420 (1997) 1-6; Date, K. 등, Oncogene 17 (1989) 3045-3054; Tomioka, D. 등, Cancer Res. 61(2001) 7518-7524].

[Kuba, K. 등, Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743] 로부터 알 수 있는 바와 같이, 동물 실험에서, 폐 전이에 대한 NK4 의 영향을 탐지하기 위해, NK4 를 2 주 기간에 걸쳐 연속적으로 주입하여야 했다.

특정 폴리펩티드에 대한 중합체의 부착은 상기 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있음이 공지되어 있다. 이는 예를 들어, PEG화 인터류킨-6 (EP 0 442 724) 또는 인터류킨-2 (WO 90/07938) 및 에리트로포이에틴 (WO 01/02017) 에 대해 밝혀진 것이다. 그러나 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 중합체의 부착은 반드 시 그것의 혈청 반감기를 연장시키지는 않았다. 예를 들어, 상이한 폴리에틸렌 글리콜의 인터류킨-8, G-CSF 및 기타 인터류킨에의 복합체화(conjugation)이 손상된 성질을 갖는 분자를 생성시키는 것이 공지되었다 [Mehvar, R., J. Pharm. Pharm. Sci. 3(1) (2000) 125-136]. 따라서, 폴리펩티드의 PEG화의 결과는 매우 예측불가이다. [Gaertner, H.F. 및 Offord, R.E., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44] 는 PEG 의 단백질의 아미노 말단에 대한 위치 특이적 부착을 기재하고 있다. Gaertner 등은 (WO 94/13222 에 이미 언급된 바와 같음, 상기 참조) PEG화가, 부착 위치가 정확히 조절될 수 없으면 큰 문제를 제기하는데, 이는 단백질 안정성 및 기능에 대한 중요한 의미를 가질 수 있다.

[Francis, G.E. 등, Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18] 는 사이토킨 및 다른 치료 단백질의 PEG화의 개관을 제공한다. Francis 등은 대부분의 PEG화 방법에서, 생활성의 상당한 감소가 보고되었다 (통상, 20-95%) 고 언급하였다. Francis 등에 따라, 단백질의 PEG화는 항상 시행착오를 기초로 하고, 상기 PEG화의 실질적으로 모든 파라미터는 생성물에 기능성에 대해, 놀랍고 매우 상당한 효과를 가질 수 있다. [Tsutsumi, Y. 등, Thromb. Haemost. 77 (1997) 168-173] 는 인터류킨-6 의 PEG화를 기재하고 있다. Tsutsumi 등에 따르면, IL-6 의 라이신 아미노기의 약 54% 는 PEG 당 분자량이 5kDa 인 PEG 와 커플링되었다. [Tsutsumi 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553] 는 PEG 에 의한 면역독소의 화학적 개질을 기재하고 있다. 랜덤 PEG화는 특정 세포파괴 활성의 상당한 손실을 동반하였기 때문에, Tsutsumi 는 PEG 커플링에 사용되는 1 개 또는 2 개의 부가적 시스테인을 갖는 면역독소 변이체를 이용함으로써, 위치 특이적 PEG화를 수행하였다. [Heinzerling, L. 등, Dermatol. 201 (2000) 154-157] 는 분자량 5 kDa 의 인터페론-α에 대한 PEG 의 커플링을 기재하고 있다. [Tsutsumi, Y. 등의 J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 1006-lOll] 은, 사용된 PEG 기의 분자량이 다시 5 kDa 이도록 하는, TNF-α 의 PEG 개질을 기재하고 있다. 적용된 PEG화 TNF-α가 (TNF-α 의 분자량 17 kDa 에 의해) 84 kDa 이상의 분자량을 가지기 때문에, TNF-α 에 부착된 13 개 이상의 5-kDa PEG 기가 있다.

단백질의 PEG화 및 그것의 약물학적 효과가 또한 [Reddy, K.R. Ann. Pharmacotherapy 34 (2000) 915-923] 에 의해 검토되었다. 또다시, 치료학적 단백질의 PEG화가 주의깊게 평가되어야 함이 언급되었다. Reddy 등에 따르면, 상이한 각 단백질은 상이한 최적화 화학을 가지고, 따라서, PEG화의 영향을 예측할 수 없다.

본 발명의 한 목적은 NK4 활성을 갖는 향상된 폴리펩티드, 및 주 당, 오직 수회 일시 적용으로 및/또는 매우 낮은 투약량으로 투여될 수 있고, 종양 성장, 혈관신생 및 전이를 억제할 수 있는 상기 폴리펩티드의 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은, 바람직하게는 NK4 라이신의 ε-아미노기 또는 N 말단 아미노기를 통해, 약 20 내지 40 kDa 의 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기에 공유 연결된 NK4 (모노PEG화 NK4) 로 이루어진 NK4 복합체를 제공한다. 가장 바람직하게는, NK4 는 NK4-라이신의 ε-아미노기 및 N 말단 아미노기로 이루어진 군 중의 하나의 아미노기에서 랜덤 PEG화된다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 모노PEG화 NK4 는 NK4 또는 다른 PEG화 NK4 에 대해 치료적 적용가능성에 있어 우월한 성질을 가진다는 것이 밝혀졌다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 모노PEG화 NK4 의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 모노PEG화 NK4 를 함유하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 모노PEG화 NK4 를 함유하는 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 인간 암 (예컨대, 유방암, 폐암, 전립선암, 췌장암 또는 결장암) 의 치료 방법으로서, 약학적 유효량의 모노PEG화 NK4 를 주당 1 내지 7 회 일시 적용으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다.

놀랍게도, 치료 중에 적용되는 본 발명에 따른 랜덤 PEG화 NK4 의 전체량이 비PEG화 NK4 를 적용하는 것에 비해 상당히 적음이 밝혀졌다. 그러므로, 약학적 치료에 사용되는 PEG화 NK4 의 양은, 비PEG화 NK4 의 요구량의 약 50% 이하, 바 람직하게는 약 20% 이하, 가장 바람직하게는 약 10% 이하이다.

인간 HGF 는 아미노산 R494 및 V495 간의 분리에 의해, 463 개 아미노산의 α-서브유닛 및 234 개의 아미노산의 β-서브유닛에서 분리될 수 있는 디술피드-연결 헤테로다이머이다. α-사슬의 N 말단 앞에 메티오닌기로 시작되는 31 개 아미노산이 선행된다. 이 세그먼트는 31 개 아미노산의 시그널 서열을 포함한다. α-사슬은 아미노산 32 에서 시작하고, 4 개의 링글 도메인을 포함한다. 소위 "헤어핀 도메인"은 아미노산 70-96 으로 이루어진다. 링글 1 도메인은 아미노산 128-206 으로 이루어진다. 링글 2 도메인은 대략 α-사슬의, 아미노산 211-288 로 이루어지고, 링글 3 도메인은 아미노산 305-383 으로 이루어지며, 링글 4 도메인은 아미노산 391-469 로 이루어진다. 이들 서열의 변화, 특히 NK4 의 생물학적 성질에 영향을 주지 않는 (특히 HGF 및 그것의 항혈관신생 활성에 대해 길항적 활성에 영향을 주지 않는) 상기 변화가 존재하며, 상기 변화는 예를 들어 WO 93/23541 에 기재되어 있다. 또한 NK4 의 길이는 그것의 생물학적 성질에 영향을 주지 않는 한, 수개의 아미노산 내에서 변화할 수 있다.

NK4 는, 상기 언급된 헤어핀 도메인 및 4 개의 링글 도메인을 포함하는 HGF/SFα-사슬의 N 말단 447 개 아미노산으로 이루어진다. 그것은, 재조합 인간 HGF/SF 의 제조 및 엘라스타제를 이용한 소화[Date, K., FEBS Letters 420 (1997) 1-6] 에 의해, 혹은 이하 기재된 바와 같이, 적절한 숙주 세포 내 핵산을 코딩하는 NK4 의 재조합 발현에 의해, 재조합되어 제조될 수 있다. NK4 당단백 질은 분자량이 약 57 kDa (폴리펩티드 부분 단독에 대해서는 52 kDa) 이고, 종양 성장, 혈관신생 및/또는 전이의 억제를 야기할 수 있는 생체 내 생물학적 활성을 가진다.

그러므로 본원에 사용된 "모노PEG화 NK4" 는, NK4 가 분자량 20 내지 40 kDa 의 하나의 폴리에틸렌 글리콜 기에 공유 부착되어 있음을 의미한다. 상기 기는 NK4 분자의 상이한 위치에, 바람직하게 랜덤하게, 그러나 바람직하게는 가장 반응성있는 위치, 예컨대 라이신 측쇄 및 N 말단 아미노기에 부착될 수 있다. 모노PEG화 NK4 (그러므로 이는 바람직하게, NK4 라이신의 ε-아미노기 및 N 말단 아미노기인 상이한 위치에서 PEG화된 모노PEG화 NK4 분자의 혼합물임) 는 제제의 90% 이상이고, 가장 바람직하게는 모노PEG화 NK4 가 제제의 92% 이상이다. 그러므로 본 발명에 따른 모노PEG화 NK4 제제는 예컨대 약학 용도에서, 균질한 제제의 이점을 나타내기에 충분하게 실질적으로 균질하다.

본원에 사용된 "실질적으로 균질한"은, 제조, 함유 또는 사용된 단 PEG-NK4 복합체 분자만이 하나의 PEG 기가 부착되어진 것임을 의미한다. 제제는 미반응 (즉, PEG 기가 결핍된) 단백질을 함유할 수 있다. 펩티드 맵핑(mapping) 및 N 말단 시퀀싱에 의해 확인되는 바와 같이, 하기 하나의 실시예는 90% 이상의 모노PEG-NK4 복합체 및 2% 이하의 미반응 단백질인 제제를 위한 것이다.

본 발명에 따라 사용되는 PEG 중합체 분자는 분자량이 약 20 내지 40 kDa 이며, 이로써 분자량이 약 20, 30 또는 40 kDa 인 PEG 중합체가 바람직하다 (본원에 사용된 "분자량"은 PEG 의 평균 분자량을 의미하는 것으로 이해하도록 하며, 용어 "약" 은 상기 PEG 제제에서, 일부 분자가 언급된 분자량보다 많거나, 약간 작은 중량을 가짐을 가리킨다).

본 발명에 따른 "PEG 또는 PEG 기"는 필수 부분으로서 폴리(에틸렌 글리콜)을 함유하는 잔기를 의미한다. 상기 PEG 는, 분자의 화학적 합성으로부터 기인하거나, 또는 분자의 부분의 적정 거리를 위한 스페이서인 결합 반응에 필요한 화학기를 부가 포함할 수 있다. 게다가, 상기 PEG 는 함께 연결된 하나 이상의 PEG 측쇄로 이루어질 수 있다. 하나 초과의 PEG 사슬을 갖는 PEG 는 멀티암 PEG 또는 분지 PEG 라 불리운다. 분지 PEG 는 예를 들어 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소르비톨을 포함하는 각종 폴리올에 대한 폴리에틸렌 옥시드의 부가에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 4 개 암을 갖는 분지 PEG 는 펜타에리트리톨 및 에틸렌 옥시드로부터 제조될 수 있다. 분지 PEG 는 예를 들어 EP-A 0 473 084 및 미국 특허 No. 5,932,462 에 기재되어 있다. 특히 바람직한 것은, 라이신의 1차 아미노기를 통해 연결된 2 개의 PEG 측쇄 (PEG2)를 갖는 PEG 이다 [Monfardini, C. 등, Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]. 분자량이 20-30 kDa 인 PEG 중합체로서, 직선상 PEG 분자가 바람직하고, 분자량이 30 kDa 초과, 특히 40 kDa 인 PEG 중합체로서, 분지 PEG 가 바람직하다. PEG 40 kDa 로서, 2 암을 가진 PEG (PEG2) 가 특히 바람직하다.

본 발명에 따라, 실질적으로 균질한 모노PEG화 NK4 의 제조 방법이 제공된다. NK4 의 PEG화를 당 기술분야의 방법에 따라, 예를 들어 NK4 와 전기친화적으로 활성화된 PEG (공급업체 : Shearwater Corp., USA, www.shearwatercorp.com) 의 반응에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 PEG 시약은 예를 들어, N-히드록시숙신이미딜 프로피오네이트 (PEG-SPA) 또는 부타노에이트 (PEG-SBA) 또는 분지 N-히드록시숙신이미드, 예컨대 mPEG2-NHS 이다 [Monfardini, C. 등, Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]. 상기 방법의 결과, NK4 라이신의 ε-아미노기 또는 N 말단 아미노기에서 랜덤 PEG 화된 NK4 폴리펩티드가 수득된다. 랜덤하지 않으면서, N 말단이 PEG화된 NK4 를 WO 94/01451 에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 상기 NK4 는 하기 화학식의 하나의 폴리(에틸렌 글리콜)기에 공유 연결된다 :

-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR

(식 중, 폴리(에틸렌 글리콜)기의 -CO (즉, 카르보닐) 는 NK4 의 아미노기의 하나와 아미드 결합을 형성하고; R 은 저급 알킬이며; x 는 2 또는 3 이고; m 은 약 450 내지 약 950 이며; n 및 m 은 복합체에서 NK4 단백질을 뺀 분자량이 약 20 내지 40 kDa 가 되도록 선택된다). NK4 의 아미노기로서, NK4 라이신의 ε-아미노기는 입수가능한 (유리) 아미노기이다.

보다 구체적으로, 상기 복합체는 하기 화학식 I 로 표시될 수 있다 :

[화학식 I]

(식 중, P 는 본원에 기재된 NK4 단백질의 기 (즉, 화학식 I 에 나와 있는 카르보닐기와 아미드 연결기를 형성하는 아미노기(들)가 없음) 이며; R 은 저급 알 킬이고; x 는 2 또는 3 이고; m 은 약 450 내지 약 950 이고, 복합체에서 NK4 단백질을 뺀 분자량이 약 20 내지 40 kDa 가 되도록 선택된다). 본원에서 사용 시, "m"의 주어진 범위는 방향적 의미를 가진다. "m"의 범위는 임의의 경우에서 결정되고, 정확하게는 PEG 기의 분자량에 의해 결정된다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 상기 NK4 는 하기 화학식의 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 기에 공유 연결된다 :

(식 중, y 는 1 내지 4, 바람직하게는 4 이고, n 및 p 는 함께 복합체에서 NK4 단백질을 뺀 분자량이 약 20 내지 40 kDa, 바람직하게는 40 kDa 가 되도록 선택되며; n 및 p 는 25% 이하, 바람직하게는 10% 이하로 상이하고, 가장 바람직하게는 동일하고; R 은 저급 알킬이다).

본원에 사용 시, "저급 알킬" 은 탄소수 1 - 6 의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기 ((C₁ -C₆) 알킬)를 의미한다. 저급 알킬기의 예에는 메틸, 에틸 및 이소프로필이 포함된다. 본 발명에 따라, R 은 임의의 저급 알킬이다. R 이 메틸인 복합체가 바람직하다.

기호 "m" 은 폴리(에틸렌 옥시드) 기 내의 에틸렌 옥시드 기 (OCH₂CH₂) 의 수를 나타낸다. 에틸렌 옥시드의 단일 PEG 서브유닛은 분자량이 약 44 달톤이다. 따라서 복합체의 분자량 (NK4 의 분자량은 제외) 은, 수 "m" 에 따라 좌우 된다. 본 발명의 복합체에서, "m" 은 약 450 내지 약 950 (분자량 약 20 kDa 내지 약 40 kDa 에 상당함) 이다. 수 m 은, 본 발명의 수득된 복합체가 비개질 NK4 에 필적하는 생리학적 활성을 갖도록 선택되며, 상기 활성은 비개질 NK4 의 대응하는 활성과 동일하거나, 더 크거나, 더 작을 수 있다. "약" 특정수의 분자량은, 통상적 분석 기법에 의해 결정되는 수의 합당한 범위 내임을 의미한다. 수 "m" 은, NK4 단백질에 공유 연결된 각 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 분자량이 약 20 kDa 내지 약 40 kDa 이 되도록 선택된다.

화학식 I 의 화합물은, 예를 들어 공지의 활성화된 중합체성 물질로부터, 하기 화학식 II 의 화합물을 NK4 단백질과 축합함으로써 제조될 수 있다 :

[화학식 II]

(식 중, R 및 m 은 상기 기재된 바와 같다). 식 중, x 가 3 인 화학식 II 의 화합물은 폴리(에틸렌 글리콜)의 알파-저급 알콕시부티르산 숙신이미딜 에스테르 (저급 알콕시-PEG-SBA) 이다. 식 중, x 가 2 인 화학식 II 의 화합물은 폴리(에틸렌 글리콜)의 알파-저급 알콕시프로피온산 숙신이미딜 에스테르 (저급 알콕시-PEG-SPA) 이다. 활성화 에스테르를 아민과 반응시켜 아미드를 형성시키는 임의의 통상적 방법을 이용할 수 있다. 상기 반응에서, 예시되는 숙신이미딜 에스테르는 아미드 형성을 야기하는 이탈기이다. 화학식 II 의 화합물과 같은 숙신이미딜 에스테르를 사용하여 단백질과의 복합체를 제조함이 미국 특허 No. 5,672,662 (1997년 9월 30일 허여, Harris 등) 에 개시되어 있다.

인간 NK4 는 30 개 라이신 잔기의 30 개 유리 ε-아미노산을 함유한다. PEG화 시약이 화학식 II 의 SBA 화합물과 조합될 때, 단백질 농도 약 5 - 10 mg/ml, pH 약 7.0 내지 약 8.0, 단백질:PEG 비 약 1:3 및 반응 온도 20 - 25 ℃에서, 모노-, 디-, 및 미량의 트리-PEG화 종의 혼합물이 제조됨이 밝혀졌다. 단백질:PEG 비가 약 1:1 또는 1:2 (예를 들어, 바람직하게 30 kDa PEG-SBA 의 경우에는 약 1:2 이고, 40 kDa PEG2-NHS 의 경우에는 약 1:5 임) 일 때, 주로 모노PEG화 종이 제조된다. 반응 조건 (예컨대, 시약의 비, pH, 온도, 단백질 농도, 반응 시간 등) 을 조작함으로써, 상이한 모노PEG화 종의 상대적 양을 최적화할 수 있다. 전형적이나, 비제한적 조건은 약 8 내지 12 mg/ml NK4, 0.3 M 인산칼륨, pH 8, 25 ℃, 반응 시간 1 시간이다. 30 kDa PEG-SBA (1:2, 단백질:PEG)를 이용하는 상기 조건 하에서, 수율은 약 38% 모노PEG화 NK4 이다.

모노PEG화 NK4 는 또한 WO 94/01451 에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. WO 94/01451 는 개질 말단 아미노산 알파-탄소 반응기를 이용한 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 기재하고 있다. 그 방법의 단계는 재조합 폴리펩티드를 형성시키고, 그것을 N 말단 알파-아민 및 C 말단 알파-카르복실에 있는 하나 이상의 생물학적 부가 보호기로 보호함을 포함한다. 이어서 폴리펩티드를 화학적 보호제와 반응시켜, 반응성 측쇄 기를 선택적으로 보호하고, 이로써 측쇄 기가 개질되는 것을 방지할 수 있다. 이어서 폴리펩티드를 생물학적 보호기에 대해 특 이적인 분리 시약으로 분리시켜, 비보호 말단 아미노산 알파-탄소 반응성 기를 형성시킨다. 비보호 말단 아미노산 알파-탄소 반응기를 화학적 개질제로 개질시킨다. 이어서 측쇄가 보호되고, 말단 개질된 단일 복제 폴리펩티드를 측쇄기에서 탈보호되어, 말단 개질된 재조합 단일 복제 폴리펩티드를 형성시킨다. 그 방법에서의 단계의 수 및 순서를 변화시켜, 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산의 선택적 개질을 달성할 수 있다.

본 발명에 따른 또다른 바람직한 복합체는, 화학식 -C(O)-X-S-Y- 의 링커를 통해 (여기에서, 링커의 C(O) 는 NK4 의 아미노기 (상기 언급된 바와 같이, 라이신 잔기의 ε-아미노기가 이용가능함) 와 아미드기를 형성하고, X 는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- 이고, k 는 1 내지 10 이며, Y 는 하기 화학식임) :

저급 알콕시 폴리(에틸렌 글리콜) 기에 공유 연결되는 NK4 단백질로 구성되며, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 부분의 평균 분자량은 약 20 kDa 내지 약 40 kDa 이고, 복합체의 분자량은, 분자량 52 kDa 의 NK4 폴리펩티드에서는 약 72 kDa 내지 약 92 kDa 이거나, 분자량 57 kDa 의 NK4 당단백질에서는 약 77 kDa 내지 약 97 kDa 이 다.

상기 NK4 종은 또한 하기 화학식 III 으로 표시될 수 있다 :

[화학식 III]

P-NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)_m-OR

(식 중, R 은 임의의 저급 알킬 수 있고, 이는 탄소수 1 내지 6 의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 이소프로필 등을 의미한다). 바람직한 알킬은 메틸이다. X 는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH)_k- (식 중, k 는 1 내지 약 10 임) 일 수 있다. 바람직하게, k 는 1 내지 약 4, 더욱 바람직하게는 1 또는 2 이다. 가장 바람직하게는, X 는 -(CH₂) 이다.

화학식 III에서, Y 는 하기의 것이고 :

바람직하게는 하기의 것이며 :

가장 바람직하게는 하기의 것이다 :

화학식 III에서, 수 m 은, 화학식 III 의 수득된 복합체가 활성이 비개질 NK4 의 상응하는 활성과 동일하거나, 더 크거나, 작을 수 있는, 비개질 NK4 에 필적하는 생리학적 활성을 가진다. m 은 PEG 단위 내 에틸렌 옥시드의 수를 나타낸다. -(OCH₂CH₂)- 의 단일 PEG 서브유닛은 약 44 달톤의 분자량을 가진다. 따라서, 복합체의 분자량 (NK4 의 분자량은 제외) 은 수 m 에 따라 좌우된다. "약" 특정수의 분자량은 그것이 통상적 분석 기법에 의해 결정되는 수의 합당한 범위 내에 있음을 의미한다. 그러므로, m 은 약 450 내지 약 950 범위의 정수 (약 20 내지 40 kDa 의 분자량에 상당함) 이다.

화학식 III 의 바람직한 NK4 단백질은 하기 화학식으로 표시된다 :

가장 바람직한 NK4 단백질 생성물은 하기 화학식으로 표시된다 :

상기 NK4 단백질은 하기에 의해 제조될 수 있다 :

(a) NK4 단백질의 라이신 아미노산의 유리 아미노기, 바람직하게는 ε-아미노기, 또는 화학식 P-NH₂ 로 표시되는 N 말단 아미노기를, 화학식 Z-CO-X-S-Q 로 표시되는 이관능성 시약과 공유 반응시켜, 하기 화학식으로 표시되는 아미드 연결기를 갖는 중간체를 형성함 :

(식 중, P 는 아미드 연결기를 형성하는 아미노기가 덜 있는 NK4 단백질이고; Z 는 반응성 기, 예컨대 카르복실-NHS 에스테르이며; X 는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- (식 중, k 는 1 내지 약 10 임) 이고; Q 는 보호기, 예컨대 아세틸과 같은 알카노일이다);

(b) 단계 (a) 로부터의 아미드 연결기를 갖는 중간체를 화학식 W-[OCH₂CH₂]_m-OR 로 표시되는 활성화 폴리에틸렌 글리콜 유도체와 공유 반응시켜, 하기 화학식으로 표시되는 NK4 단백질 생성물을 형성함 :

(식 중, W 는 Y 의 술프히드릴 반응성 형태이고; m 은 약 450 내지 약 950 범위의 정수이며; R 은 저급 알킬이고; Y 는 상기 정의된 바와 같다).

이 구현예에서, 이관능성 시약은 바람직하게 N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트 또는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트이며, Z 는 바람직하게 N-히드록시숙신이미드이고, 활성화 폴리에틸렌 글리콜 유도체 W-[OCH₂CH₂]_m-OR 은 바람직하게 요오도-아세틸 메톡시-PEG, 메톡시-PEG-비닐술폰 및 메톡시-PEG-말레이미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

보다 구체적으로, 화학식 III 의 NK4 단백질은 티올기의 NK4 로의 공유 연결 ("활성화") 및 수득된 활성화 NK4 의 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 유도체와의 커플링에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 모노PEG화 NK4 의 제조를 위한 제 1 단계는 NK4 의 NH₂ 기를 통한 티올기의 공유 연결을 포함한다. 이 NK4 의 활성화는 보호된 티올기 및 부가적 반응성 기를 갖는 이관능성 시약, 예컨대 활성화 에스테르 (예컨대, 숙신이미딜에스테르), 술폰산의 무수물, 에스테르, 카르복실산 및 술폰산의 각각의 할로겐화물로 수행된다. 티올기는 당 기술분야에 공지된 기, 예컨대 아세틸기에 의해 보호된다. 상기 이관능성 시약은 아미드 연결기를 형성함으로써 아미노기와 반응할 수 있다.

한 바람직한 구현예에서, 아미노기의 활성화는 숙신이미딜 부분을 갖는 이관능성 시약과의 반응에 의해 수행된다. 이관능성 시약은 상이한 스페이서 종, 예컨대 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_k- 부분 (식 중, k 는 1 내지 약 10, 바람직 하게는 1 내지 약 4, 더욱 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1 임) 을 가질 수 있다. 상기 시약의 예는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트 (SATP) 및 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (SATA)

아세틸티오알킬-카르복실-NHS-에스테르, 예컨대

2-(아세틸티오)-(에톡시)_k-아세트산-NHS-에스테르

(식 중, k 는 상기 정의된 바와 같다) 이다.

이관능성 시약의 제조는 당 기술분야에 공지되어 있다. 2-(아세틸티오)-(에톡시)_k-아세트산-NHS-에스테르의 전구체가 DE-3924705 에 기재되어 있고, 한편 아세틸티오 화합물로의 유도체화가 [March, J. 의 Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376] 에 기재되어 있다. SATA 는 시중 구입가능하다 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL).

NK4 분자에 대한 단 하나의 티올의 부가는, 반응 파라미터, 즉 단백질 (NK4) 농도 및 단백질/이관능성 시약 비를 조정함으로써 선택될 수 있다.

반응은 예를 들어, pH 6.5-8.0 의 버퍼 수용액에서, 예컨대 pH 7.3 의 300 mM NaCl 의 존재 또는 부재 하, 10 또는 100 mM 인산칼륨 중에서 수행된다. 이관능성 시약은 DMSO 에 첨가될 수 있다. 반응 완료 후, 바람직하게는 30 분 후, 라이신의 첨가로써 반응을 중단시킨다. 과량의 이관능성 시약은 당 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 투석 또는 칼럼 여과로써 분리될 수 있다. NK4 에 첨가되는 티올기의 평균 수는 예를 들어, [Grasetti, D.R. 및 Murray, J.F. 의 J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49] 에 기재된 광도계 방법에 의해 결정될 수 있다.

상기 반응 후, 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체의 공유 커플링이 이어진다. 적당한 PEG 유도체는 평균 분자량이 약 20 내지 약 40 kDa 의 활성화 PEG 분자이다.

활성화 PEG 유도체가 당 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 PEG-비닐술폰에 대해 [Morpurgo, M. 등, J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363 ff] 에 기재되어 있다. 직쇄 및 분지쇄 PEG 종은 화학식 1 의 화합물의 제조에 적당하다. 반응성 PEG 시약의 예는 요오도-아세틸-메톡시-PEG 및 메톡시-PEG-비닐술폰이다 :

상기 요오도-활성화 물질의 용도가 당 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 [Hermanson, G.T. 의 Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148] 에 기재되어 있다.

가장 바람직하게는, PEG 종은 (알콕시-PEG-말레이미드), 예컨대 메톡시-PEG-말레이미드 (MW 20,000 내지 40,000; Shearwater Polymers, Inc.) 를 이용하여, 말레이미드에 의해 활성화된다. 알콕시-PEG-말레이미드의 구조는 하기와 같고 :

(식 중, R 및 m 은 상기 정의된 바와 같다),

바람직하게는

이다.

알콕시-PEG-말레이미드와의 커플링 반응은 버퍼(완충) 수용액, 예컨대 10 mM 인산칼륨, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.2 중, 티올 보호기의 원 위치(in situ) 분리 후에 일어난다. 보호기의 분리는 예를 들어, 약 90 분 간 25 ℃, pH 6.2 의 DMSO 에서 히드록실아민으로 수행될 수 있다. PEG 개질을 위해, 활성화 NK4/알콕시-PEG-말레이미드의 몰비는 약 1:1 내지 약 1:6 이어야 한다. 반응은 시스테인의 첨가 및 나머지 티올 (-SH) 기와 N-메틸말레이미드 또는 다른 적당한, 디술피드 결합 형성 가능 화합물의 반응에 의해 중단될 수 있다. 임의의 나머지 활성 티올 기와 N-메틸말레이미드와 같은 보호기 또는 다른 적당한 보호기의 반응으로 인하여, 본 발명의 복합체 내 NK4 단백질은 상기 보호기를 포함할 수 있다. 일반적으로 본원에 기재된 절차는 PEG-말레이미드에 복합체화되지 않은 단백질 상의 활성화 티올 기의 수에 따라, 상이한 수의 보호기에 의해 보호되는 변화하는 수의 티올을 갖는 분자의 혼합물을 생성시킬 것이다.

N-메틸말레이미드는 PEG화 단백질 상의 남아있는 티올 기를 블록킹하는데 사용될 때 동일 유형의 공유 결합을 형성하는 반면, 디술피드 화합물은 블록킹제의 디술피드 브릿지 연결된 커플링에 대한 분자간 술피드/디술피드 교환 반응을 일으키게 된다. 상기 유형의 블록킹 반응에 대해 바람직한 블록킹제는 산화 글루타티온 (GSSG), 시스테인 및 시스타민이다. 시스테인의 경우, 부가적 네트 전하가 PEG화 단백질에 도입되지 않는 반면, 블록킹제 GSSG 또는 시스타민을 사용하면 부가적 음성 또는 양성 전하가 야기된다.

디-, 트리- 및 멀티-PEG화 NK4 종으로부터의 모노-PEG화 NK4 종의 분리를 포함하는, 화학식 III 의 화합물의 부가 정제는 당 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 칼럼 크로마토그래피에 의해 행하여 질 수 있다. 모노-PEG 복합체의 퍼센티지는, 조성 내 모노-PEG 의 퍼센티지를 감소시키는 용출 피크 주위의 보다 넓은 분획, 또는 모노-PEG 의 퍼센티지를 증가시키는 용출 피크 주위의 보다 좁은 분획을 풀링(pooling)함으로써 조절될 수 있다. 약 90 % 의 모노-PEG 복합체는 수율 및 활성이 양호한 균형을 이룬다. 예를 들어 92 % 이상 또는 96 % 이상의 복합체가 모노-PEG 인 조성물이 요망될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 모노-PEG 복합체의 퍼센티지는 90 % 내지 96 % 이다.

약학 제형물

본 발명의 화합물은 당업자에게 공지된 방법인 약학 조성물의 제조 방법에 따라 조제될 수 있다. 상기 조성물의 제조를 위해, 본 발명에 따른 모노-PEG화 NK4 는 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물에 조합된다. 상기 허용가능한 담체는 예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 18 판, 1990, Mack Publishing Company, Oslo 등 저 (예컨대, pp. 1435-1712)] 에 기재되어 있다. 전형적 조성물은 유효량, 예를 들어 약 0.1 내지 100 mg/ml 의, 본 발명에 따른 물질을 적당량의 담체와 함께 함유한다. 조성물은 비경구 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 모노-PEG 복합체의 퍼센티지가 바람직하게 90 % 이상, 바람직하게는 92 % 이상인 본원에 기재된 복합체를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 제형물은 당 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 통상적으로, 모노-PEG화 NK4 의 용액은 약학 조성물에 사용되고자 의도된 버퍼액에 대해 투석되고, 원하는 최종 단백질 농도는 농축 또는 희석에 의해 조정된다.

상기 약학 조성물은 주사를 위한 투여에 사용될 수 있고, 약학적으로 허용가능한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 유효량의 모노-PEG화 NK4 를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 각종 버퍼 내용물 (예컨대, 아르기닌, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석액, 첨가제, 예컨대 세제 및 가용화제 (예컨대, 트윈(Tween) 80/폴리소르베이트, 플루로닉(Pluronic) F68, 염화나트륨, 황산나트륨), 산화방지제 (예컨대, 아스코르브산, L-메티오닌), 보존제 (티머솔(Timersol), 벤질 알콜) 및 벌크화 물질 (예컨대, 삭카로스, 만니톨), 중합체성 물질, 예컨대 폴리글리콜산 등의 입상물 제제로의, 또는 리포좀으로의 물질의 혼입을 포함한다. 상기 조성물은 본 발명에 따른 모노PEG화 NK4 의 방출 및 소제(clearance)의 물리적 상태 안정성 속도에 영향을 줄 수 있다.

투약량 및 약물 농도

전형적으로, 표준 암 치료 섭생법(regimen)에서, 환자를 특정 기간 동안 1 내지 30 mg의 모노-PEG화 NK4/일(day)의 투약량으로 치료하고, 이는 1 일 내지 약 30 일, 또는 그 이상 동안 지속된다. 약물은, 0.1 내지 100 mg 모노PEG화 NK4 / ml을 함유하는 약학 조성물의 단일(single) 일일 피하 또는 정맥 내 일시 주사로서 적용된다. 상기 치료는, 표준 치료 전, 중 또는 후에 모노PEG화 NK4 를 적용함으로써, 임의의 표준 (예컨대, 화학치료적) 치료법과 조합될 수 있다. 이는 표준 치료 단독에 비해 향상된 결과를 가져온다.

임의의 경우, 본 발명에 따른 투여된 PEG화 NK4 의 총량은 동일 치료를 위한 NK4 의 양보다 상당히 낮다.

하기 실시예, 참고예 및 서열목록은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것으로서, 그의 진정한 범주는 첨부된 청구범위에 설명된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서, 설명되는 절차에 변형이 가해질 수 있음을 이해하도록 한다.

[서열에 대한 설명]

서열번호 1 : NK4 의 DNA 및 폴리펩티드 서열을 나타냄.

서열번호 2 : NK4 의 폴리펩티드 서열을 나타냄.

실시예 1

NK4 의 재조합 제조

치료적 용도의 NK4 는 세균 또는 진핵(eukaryotic) 발현계를 이용한 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 적당한 진핵 발현계는 예를 들어 엔지니어링된 HeLa, BHK 또는 바람직하게는 CHO 세포이다. NK4 제조를 위해 엔지니어링된 세포를 적당한 배지에서 배양한다. 전형적으로, 1 내지 5 리터 세포 배양물을 10 리터 발효기를 위한 접종으로 사용한다. 3 내지 5 일 후, 10 리터 발효기 내 배양물을 100 리터 발효기를 위한 접종으로 사용할 수 있다. 부가적으로 3 내지 5 일 간의 발효 후, 상기 배양물을 1000 리터 제조 발효기를 위한 접종으로 사용할 수 있다. 3 내지 4 일 후, 세포를 여과 또는 원심분리로 제거하고 버린다. NK4 함유 상등액을 정제 중 여과하고, 수집하며, 처리하였다. 정제 공 정은 하기 실시예에 나와 있다.

실시예 2

정제

헤파린-세파로스는 헤파린 표면에 공유 결합된 세파로스 비이드로 이루어져 있다. NK4 가 헤파린에 대한 높은 친화성을 나타내기 때문에, 그것은 이 칼럼 상에 보유되고, 고 염 농도로 용출될 수 있는 반면, 단백질 오염물 및 기타 불순물은 낮은 염 농도에서 결합되거나 용출되지 않는다. 50 mM Hepes pH 7.5 중 약 0.7 내지 1.1 M NaCl에서 용출되는 NK4 함유 분획을 수집하고, 히드록시아파타이트 칼럼 상에 적재한다. 약 0.4 내지 0.7 M 인산칼륨, pH 7.5 으로 NK4 가 용출된다. 수득된 분획은 실질적으로 오염 단백질이 없고, S-세파로스 크로마토그래피로써 정제될 수 있다.

실시예 3

모노PEG화 NK4 의 제조

상기 언급된 절차에 따라 정제된 NK4 를 PEG화 반응에 사용하였다. 상기 언급된 적당한 방법 중 3 가지가 예로서 기재되어 있다.

a) mPEG-SBA 를 이용한 NK4 의 PEG화

분취량(aliquot)의 NK4 를 메톡시-PEG-SBA (각기, 비교를 위한 5 kDa 와, 20 kDa 및 30 kDa; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville Alabama) 와 반응시켰다. 반응을, 단백질:시약의 비 1:1 내지 1:5 에서 약 2 시간 동안 실온에서 수행하였다 (20 및 30 kDa PEG 사용 시, 1:2 의 비가 바람직함). 10 mM 트리스-버퍼 또는 아르기닌 HCl, pH 8 의 첨가로써 반응을 중단시켰고, 샘플을 SDS-PAGE, 또는 평형 및 용출을 위해 버퍼액으로 500 mmol/l 인산칼륨, pH 6.8을 이용하는 Superose 6 칼럼 (Pharmacia) 상의 크기 배제 크로마토그래피로써 분석하였다. 반응을 단백질:시약 비, pH, 시간 및 온도를 변화시켜 최적화하여, 우세적으로 모노PEG화된 NK4 를 수득하였다.

상기 조건은 예를 들어 하기와 같다 :

농도 NK4: 8-12 mg/ml

버퍼계/pH: 0.3 M 인산칼륨, pH 8

온도: 25 ℃

반응 시간: 1 시간

몰비 (단백질:시약): 1:2

수율:

모노PEG화 NK4: 38%

디PEG화 NK4: 17%

비PEG화 NK4: 45%

b) mPEG-SPA를 이용한 NK4 의 PEG화

분취량의 NK4 (단백질 농도 : 0.3 M 인산칼륨 중, 8 내지 12 mg/ml, pH 8)을 메톡시-PEG-SPA (각기 비교를 위한 5 kDa, 및 20 kDa; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville Alabama) 와 반응시켰다. 반응을 단백질:시약의 비가 1:2 로 하여 약 2 시간 동안 실온에서 수행하였다. 10 mM 트리스-버퍼 또는 아르기닌 HCl, pH 8 의 첨가로써 반응을 중단시켰고, 샘플을 SDS-PAGE, 역상 HPLC, 또는 평형 및 용출을 위해 버퍼액으로 500 mmol/1 인산칼륨, pH 6.8을 이용하는 Superose 6 칼럼 (Pharmacia) 상의 크기 배제 크로마토그래피로써 분석하였다. 반응을 단백질:시약 비, pH, 시간 및 온도를 변화시켜 최적화하여, 디- 및 트리-PEG화 NK4에 비해 우세적인 모노PEG화 NK4 를 수득하였다.

c) mPEG2-NHS를 이용한 NK4 의 PEG화

이 PEG화를 실시예 3c 에 기재된 바대로 수행하였고, 단 PEG-SPA 대신에 mPEG2-NHS (40 kDa PEG, 라이신 연결기를 통해 분지화)를 몰비 1:5 (단백질:PEG 시약) 로 사용하였다.

실시예 4

모노PEG화 NK4의 단리

평형 및 용출을 위해, 버퍼액으로 500 mmol/l K-포스페이트 pH 6.8을 이용하는 예비 크기 배제 크로마토그래피 (예컨대, Superose 6 또는 Superdex 200; Pharmacia)를 행함으로써, 비PEG화, 디- 및 트리-PEG화 NK4 로부터 모노PEG화 NK4 를 분리할 수 있다. 정제된 단백질은 우세적으로 모노PEG화된 종을 포함한다. 분획을 수집하고, SDS-PAGE 및 역상 크로마토그래피로써 분석하였다.

실시예 5

모노PEG화 NK4 의 분자적 특성

a) 크기 배제 크로마토그래피

예비 크기 배제 크로마토그래피 (예컨대, Superose 6 또는 Superdex 200; Pharmacia; 평형 및 용출을 위해, 버퍼액으로 500 mmol/l K-포스페이트 pH 6.8을 이용함)에서, 모노PEG화 종이 비개질 형태보다 일찍 용출된다. 이는 분자의 증가된 유체역학적 반경에 의한 것이다.

b) SDS-PAGE

SDS-PAGE에서, 단백질을 그것의 분자량에 따라 분리한다. PEG 화에 의한 분자량 증가로 인해, 모노PEG화 NK4 는 비개질 NK4 에 비해 보다 짧은 이주 거리(migration distance)를 나타낸다. 이주 거리는 PEG 부분의 사슬 길이, 및 NK4 분자 당 부착된 PEG 기의 수와 역 관계가 있다.

c) 펩티드 맵핑

서열-특이적 엔도-프로테나아제 (예컨대, LysC 또는 트립신)를 이용한 모노PEG화 NK4 의 절단으로, 특징적 펩티드 맵이 수득된다. 수득된 펩티드는 역상 크로마토그래피로 분리되고, 질량 분석법 및/또는 N 말단 시퀀싱으로 분석될 수 있다. 이로써, NK4 분자 내 PEG-개질 기를 결정할 수 있다.

d) 역상 크로마토그래피

모노PEG화 NK4 는 또한 역상 크로마토그래피로써 특징화될 수 있다. NK4 의 PEG화로써, 비개질 NK4 와 비교 시, 체류 시간(retention time)의 변화가 생긴다.

실시예 6

모노PEG화, 비PEG화 및 멀티-PEG화 NK4 의 비교

이 실시예에서, 비PEG화 NK4, PEG 5 kDa, PEG 20 kDa, PEG 30 kDa, PEG 40 kDa 로 모노PEG화된 NK4, 및 멀티PEG화 NK4 (하나 초과의 PEG 사슬로 PEG화된 NK4)를 사용하였다.

a) 산포 검정

MDCK 세포를 조직 배양 플레이트에서 부(副)-융합적으로(subconfluently) 성장시켰다. 세포를 HGF (10 ng/ml) 또는 HGF 와 NK4 의 조합물로 처리하였다. 이 실험에서, HGE-유도 세포 산포를 10 내지 1000-배 몰 과량의 NK4 의 첨가로써 억제하였고, 이는 PEG화 NK4 의 기능적 활성을 나타낸다. 모노PEG화 5 kDa-PEG-NK4, 20 kDa-PEG-NK4, 30 kDa-PEG-NK4, 및 40 kDa-PEG-NK4 의 시험관 내 활성이 비PEG화 NK4 와 유사하다는 것이 밝혀졌다. 또한, 하나 초과의 PEG 사슬 (20 내지 40 kDa) 의 부가로써, 시험관 내 활성이 상당히 손실된다는 것도 밝혀졌다 (표 1).

MDCK 세포의 HGF (10 ng/ml)-유도 산포의 억제에 있어서의 각종 PEG화 형태의 NK4 의 상대 잠재능을 검정합였다. ++ 은 완전 억제를 의미하고, + 는 억제를 의미하며, +/- 는 약한 억제를 의미하고, - 는 비억제를 의미한다.

b) HUVEC 증식 검정

NK4 에 의한 HGF 의 유사분열생식 억제를, [Nakamura, T. 등, Nature 342 (1989) 440-443] 에 기재되어 있는 바와 같이, 배양액 내 HUVEC 의 증식을 측정함으로써 결정하였다. 이 실험에서, HGF-유도 세포 증식은 10 내지 1000-배 몰 과량의 NK4 의 첨가로써 억제되었고, 이는 모노PEG화 NK4 의 기능적 활성을 나타낸다 (도 1 및 2).

대안적으로, HUVEC 증식 검정은 NK4 에 의한 bFGF (기본적 섬유모세포 성장 인자) 의 유사분열생식 활성을 억제함으로써 수행되었다. [Kuba, K. 등, Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743] 에 기재된 바대로, 배양액 내 HUVEC 의 증식을 측정함으로써 억제를 결정하였다. 이 실험에서, FGF-유도 세포 증식을, 10 내지 1000-배 몰 과량의 NK4 의 첨가로써 억제하였고, 이는 모노PEG화 NK4 의 기능적 활성을 나타낸다 (도 3).

c) 침윤 검정

이 검정에서, 종양 세포의 침윤 잠재능을 분석한다. HT115 세포를 이용하여, 이 검정을 본질적으로 [Albini, A. 등, (1987)] 에 기재된 대로 행하였다. HGF-유도 (10 ng/ml) 세포 침윤을 10 내지 1000-배 몰 과량의 NK4 의 첨가로써 억제하였고, 이는 모노PEG화 NK4 의 기능적 활성을 나타낸다.

실시예 7

생체 내 활성

모델: Panc Tu1 인간 췌장암 동소성(orthotopic) SCID 마우스 모델 (Alves, F. 등, Pancreas 23 (2001) 227-235)

처리: 8 일 후, 21 일의 기간에 걸쳐 모노PEG화 NK4 의 1일 1회 적용

투약량: 16 mg/kg/일

4 mg/kg/일

1 mg/kg/일

플라시보(Placebo)

결과: 모노PEG화 NK4 를 이용한 처리는, 일차적 종양 성장 및 전이의 투약량-의존성 억제를 보여주는 반면, 플라시보로 처리한 군에서는 효과가 없다.

실시예 8

약학 조성물

적당한 약학 조성물은 예를 들어 하기와 같다 :

1 내지 30 mg/ml 모노PEG화 NK4

150mM NaCl

10 mM 인산나트륨, pH 7.2

1 내지 30 mg/ml 모노PEG화 NK4

150mM NaCl

0.01% 트윈 80 또는 트윈 20 또는 플루로닉 F68

10 mM 인산나트륨, pH 7.2

1 내지 30 mg/ml 모노PEG화 NK4

50 mM NaCl

3% 만니톨

10 mM 인산나트륨, pH 7.2

1 내지 30 mg/ml 모노PEG화 NK4

50 mM NaCl

3% 만니톨

0.01% 트윈 80 또는 트윈 20 또는 플루로닉 F68

10 mM 인산나트륨, pH 7.2

(만니톨 존재 또는 부재 하에) 모노PEG화 NK4 가 상기 버퍼액에 대해 투석된 조성물을 제조한다. 단백질 농도를 농축 또는 버퍼액을 이용한 희석으로써 조정한다. 세제 및 NaCl 은 10% 원액으로부터 첨가되었다.

실시예 9

NK4, 30 kDa-모노-PEG-NK4 및 40 kDa-모노-PEG-NK4 의 약물동력학적 분석

성장(adult) 마우스 (군 당 4 마리) 에, NK4, 30 kDa-모노-PEG-NK4 또는 40 kDa-모노-PEG-NK4 (0.25 ml 주사 체적 내 4 mg/kg) 를 각기 단일 정맥 내 또는 s.c. 일시 주사하였다. 수 시점에서, 혈액 샘플을 취해, ELISA 에 의해 NK4, 30 kDa-모노-PEG-NK4 또는 40 kDa-모노-PEG-NK4 함량에 대해 분석하였다. 시간-농도 곡선을 계산하였고, 이는 도 4 에 나와 있다. 이 데이터는, 30 kDa-모노-PEG-NK4 및 40 kDa-모노-PEG-NK4 가 생체 내 상당히 향상된 안정성을 가지고, 이로써 비개질 NK4 에 비해 혈장 반감기가 상당히 증가하게 됨을 보여준다.

[참고문헌 목록]

Albini, A. 등, Cancer Res. 47 (1987) 3239-3245

Alves, F. 등, Pancreas 23 (2001) 227-235

Bailon, P., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195-202

Date, K. 등, FEBS Letters 420 (1997) 1-6

Date, K. 등, Oncogene 17 (1989) 3045-3054

EP 0 442 724

EP-A 0473 084

Francis, G.E. 등, Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18

Gaertner, H.F. 및 Offord, R.E., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44

Grasetti, D.R. 및 Murray, J.F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49

Heinzerling, L. 등, Dermatol. 201 (2000) 154-157

Hermanson, G.T. 등, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, (1996) 147-148

Kuba, K. 등, Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743

Maiti, P.K. 등, Int. J. Cancer Suppl. 3 (1988) 17-22

March, J., Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376

Mehvar, R., J. Pharm. Pharm. Sci. 3 (1) (2000) 125-136

Miyazawa, K. 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) 967-973

Monfardini, C. 등, Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69

Morpurgo, M. 등, Bioconj. Chem. 7 (1996) 363-368

Nakamura, T. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1984) 1450-1459

Nakamura, T. 등, Nature 342 (1989) 440-443

Okajima, A. 등, Eur. J. Biochem. 193 (1990) 375-381

Parr, C. 등, Int. J. Cancer 85 (2000) 563-570

Reddy, K.R., Ann. Pharmacotherapy 34 (2000) 915-923

Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 18 판, 1990, Mack Publishing Company, Oslo 등 저. (예. pp. 1435-1712)

Seki, T. 등, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990) 321-327

Stuart, K.A. 등, International Journal of Experimental Pathology 81 (2000) 17-30

Tashiro, K. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3200-3204

Tomioka, D. 등, Cancer Res. 61 (2001) 7518-7524

Tsutsumi, Y. 등, Thromb. Haemost. 77 (1997) 168-173

Tsutsumi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553

Tsutsumi, Y. 등, J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 1006-1011

Uematsu, Y. 등, J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131-135

US 특허 No. 5,672,662

US 특허 No. 5,932,462

US 특허 No. 5,977,310

Weidner, K.M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7001-7005

WO 01/02017

WO 90/07938

WO 93/23541

WO 94/01451

WO 94/13322

도 1 : NK4, 20 kDa-모노-PEG-NK4 및 30 kDa-모노-PEG-NK4 에 의한 HGF-유도 HUVEC 증식의 억제.

도 2 : NK4 및 40 kDa-모노-PEG-NK4 에 의한 HGF-유도 HUVEC 증식의 억제.

도 3 : NK4, 30 kDa-모노-PEG-NK4 및 40 kDa-모노-PEG-NK4 에 의한 bFGF-유도 HUVEC 증식의 억제.

도 4 : 정맥 내 (도 4a) 또는 s.c. (도 4b) 주사 후 혈장 내 NK4, 30 kDa-모노PEG-NK4, 40 kDa-모노-PEG-NK4 의 시간-농도 곡선

SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> PEG-conjugates of HGF-NK4 <130> Case 20859 <140> <141> <150> 01104640.6 <151> 2001-02-23 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1344 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1344) <400> 1 caa agg aaa aga aga aat aca att cat gaa ttc aaa aaa tca gca aag 48 Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 1 5 10 15 act acc cta atc aaa ata gat cca gca ctg aag ata aaa acc aaa aaa 96 Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys 20 25 30 gtg aat act gca gac caa tgt gct aat aga tgt act agg aat aaa gga 144 Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly 35 40 45 ctt cca ttc act tgc aag gct ttt gtt ttt gat aaa gca aga aaa caa 192 Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln 50 55 60 tgc ctc tgg ttc ccc ttc aat agc atg tca agt gga gtg aaa aaa gaa 240 Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu 65 70 75 80 ttt ggc cat gaa ttt gac ctc tat gaa aac aaa gac tac att aga aac 288 Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn 85 90 95 tgc atc att ggt aaa gga cgc agc tac aag gga aca gta tct atc act 336 Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr 100 105 110 aag agt ggc atc aaa tgt cag ccc tgg agt tcc atg ata cca cac gaa 384 Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu 115 120 125 cac agc ttt ttg cct tcg agc tat cgg ggt aaa gac cta cag gaa aac 432 His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn 130 135 140 tac tgt cga aat cct cga ggg gaa gaa ggg gga ccc tgg tgt ttc aca 480 Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr 145 150 155 160 agc aat cca gag gta cgc tac gaa gtc tgt gac att cct cag tgt tca 528 Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser 165 170 175 gaa gtt gaa tgc atg acc tgc aat ggg gag agt tat cga ggt ctc atg 576 Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met 180 185 190 gat cat aca gaa tca ggc aag att tgt cag cgc tgg gat cat cag aca 624 Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr 195 200 205 cca cac cgg cac aaa ttc ttg cct gaa aga tat ccc gac aag ggc ttt 672 Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe 210 215 220 gat gat aat tat tgc cgc aat ccc gat ggc cag ccg agg cca tgg tgc 720 Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys 225 230 235 240 tat act ctt gac cct cac acc cgc tgg gag tac tgt gca att aaa aca 768 Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr 245 250 255 tgc gct gac aat act atg aat gac act gat gtt cct ttg gaa aca act 816 Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr 260 265 270 gaa tgc atc caa ggt caa gga gaa ggc tac agg ggc act gtc aat acc 864 Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr 275 280 285 att tgg aat gga att cca tgt cag cgt tgg gat tct cag tat cct cac 912 Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His 290 295 300 gag cat gac atg act cct gaa aat ttc aag tgc aag gac cta cga gaa 960 Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu 305 310 315 320 aat tac tgc cga aat cca gat ggg tct gaa tca ccc tgg tgt ttt acc 1008 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr 325 330 335 act gat cca aac atc cga gtt ggc tac tgc tcc caa att cca aac tgt 1056 Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys 340 345 350 gat atg tca cat gga caa gat tgt tat cgt ggg aat ggc aaa aat tat 1104 Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr 355 360 365 atg ggc aac tta tcc caa aca aga tct gga cta aca tgt tca atg tgg 1152 Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp 370 375 380 gac aag aac atg gaa gac tta cat cgt cat atc ttc tgg gaa cca gat 1200 Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp 385 390 395 400 gca agt aag ctg aat gag aat tac tgc cga aat cca gat gat gat gct 1248 Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala 405 410 415 cat gga ccc tgg tgc tac acg gga aat cca ctc att cct tgg gat tat 1296 His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr 420 425 430 tgc cct att tct cgt tgt gaa ggt gat acc aca cct aca ata gtc taa 1344 Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val 435 440 445 <210> 2 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys 20 25 30 Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly 35 40 45 Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln 50 55 60 Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu 65 70 75 80 Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn 85 90 95 Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr 100 105 110 Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu 115 120 125 His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn 130 135 140 Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser 165 170 175 Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met 180 185 190 Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr 195 200 205 Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe 210 215 220 Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr 245 250 255 Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr 260 265 270 Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr 275 280 285 Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His 290 295 300 Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu 305 310 315 320 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr 325 330 335 Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys 340 345 350 Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr 355 360 365 Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp 370 375 380 Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp 385 390 395 400 Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala 405 410 415 His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr 420 425 430 Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val 435 440 445

Claims

α-사슬의 4 개 링글 부위 및 헤어핀 도메인으로 이루어진 간세포 성장 인자 (HGF/SF) 의 N 말단 단편, 및 20 내지 40 kDa 의 분자량을 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜기를 포함하는 복합체로서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 기가 하기 화학식을 가지고, 하기 -CO 기가 간세포 성장 인자의 상기 N 말단 단편의 아미노기들 중 하나와 아미드 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 복합체 :

-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR

(식 중,

X 는 2 또는 3 이고;

m 은 450 내지 950 이며;

R 은 (C₁-C₆)알킬이다).