CZ20032511A3 - PEG-conjugates of HGF-NK4 - Google Patents
PEG-conjugates of HGF-NK4 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032511A3 CZ20032511A3 CZ20032511A CZ20032511A CZ20032511A3 CZ 20032511 A3 CZ20032511 A3 CZ 20032511A3 CZ 20032511 A CZ20032511 A CZ 20032511A CZ 20032511 A CZ20032511 A CZ 20032511A CZ 20032511 A3 CZ20032511 A3 CZ 20032511A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peg
- kda
- monopegylated
- group
- molecular weight
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Tento vynález se týká konjugátu N-terminálního fragmentu růstového faktoru hepatocytů obsahujícího čtyři kringle domény (NK4) s polyetylén glykolem (PEG), jejich farmaceutických preparátů, způsobů přípravy a způsobů použití.
Dosavadní stav techniky
Růstový faktor hepatocytů (HGF/SF) je polypeptid identifikovaný a purifikovaný Nakamurou, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1984) 1450-1459. Dále bylo zjištěno, že růstový faktor hepatocytů je identický s rozptylovacím faktorem (SF), Weidner, K.M., et al., Proč. Nad. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7001-7005. HGF je glykoprotein s molekulovou váhou zhruba 100 kDa, který hraje roli ve vývoji celé řady buněčných fenotypů zahrnujících proliferaci, mitogenezi, tvorbu větvících kanálků a v případě nádorových buněk invazi a metastázování. Přehled problematiky viz Stuart, K.A., et al., International Journal of Experimental Pathology 81 (2000) 1730. Potkaní HGF i lidský HGF byly sekvenovány a klonovány (Miyazawa, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) 967973; Nakamura, T., et al·., Nátuře 342 (1989) 440-443; Seki, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 172 (1990) 321-327; Tashiro, K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3200-3204; Okajima,
A., et al., Eur. J. Biochem. 193 (1990) 375-381). Farmakokinetické a farmakologické účinky HGF postrádajícího prvních pět Nterminálních aminokyselin (dHGF) byly zkoumány autory Uematsu, Y., et al., J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131-135. Bylo zjištěno, že sérové koncentrace dHGF se rychle snížily, a proto jako způsob podání byly preferovány infuse oproti bolusovým injekcím.
Patent U.S. Patent Č. 5,977,310 popisuje HGF modifikovaný pomocí
PEG. Tento HGF modifikovaný pomocí PEG má za podmínek v vivo prodloužené odbourávání a stejnou fyziologickou aktivitu jako HGF.
Avšak podle patentu U.S. Patent č. 5,977,310, je možné prodloužit • · · · · ·
poločas HGF pouze z 59,2 minut na 76,7 minut nebo respective 95,6 minut (viz Příklad 5 patent U.S. Patent č. 5,977,310). Dále je v tomto patentu navrhováno, že molární množství PEG činidla může být vybráno z rozpětí od 5 do 100 násobné molární váhy HGF. V případě modifikující amino skupiny lysinu nebo N-terminálního konce proteinu je preferované molární rozpětí PEG činidla od 10 do 25 násobku molekulové váhy HGF. Molekulová váha připojeného PEG řetězce byla zhruba 10 kDa. Způsoby pro syntézu konjugátů složených z PEG a polypeptidů, jako jsou například HGF, jsou také popsány v patentu WO 94/13322. Tyto konjugáty jsou spolu spojeny v předem definovaných pozicích, protože náhodná konjugace vede podle autorů k začlenění polymerních částí do domény molekuly tak, že způsobují teraputické nebo diagnosticky požadované aktivity. Molekuly mohou následně získat prodloužený poločas in vivo heterologních bílkovin sníženou immunogenicitu, významné nebo úplné ztráty požadovaných biologických aktivit (viz např. Kitamura, K., et al, Cancer Res. 51 (1991) 4310-4315; Maiti, P.K., et al., Int. J. Cancer Suppl. 3 (1988) 17-22). PEGylovaný
IFN-α vykazuje například pouze 7% účinnost ve srovnání s nonPEGylovaným IFN-α (Bailon, P., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195202) .
a v případě ale za cenu
Bylo dále zjištěno, že fragment HGF/SF označovaný NK4, složený z Nterminální stočené domény čtyř kringle domén HGF/SF má farmakologické vlastnosti, které jsou zcela odlišné od vlastností HGF/SF, a je antagonistou vlivu HGF/SF na motilitu a invazi nádorových buněk tlustého střeva a je navíc inhibitorem angiogeneze a potlačuje nádorový růst a metastázování (WO 93/23541; Parr, C., et al., Int. J. Cancer 85 (2000) 563-570; Kuba, K., et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743; Dáte, K., et al., FEBS Letters 420 (1997) 1-6; Dáte, K., et al., Oncogene 17 (1989) 3045-3054; Tomioka, D., et al., Cancer Res. 61 (2001) 7518-7524).
Jak vyplývá z práce autorů Kuba, K., et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743, musel být NK4 ve zvířecích experimentech pro detekci účinku NK4 na plicní metastázy infundován kontinuálně po dobu dvou · · • · · • · · * ·· ·· týdnů.
Je známo, že připojení polymerů k určitým polypeptidům může zvýšit jejich sérový poločas. Toto bylo zjištěno například pro PEGylovaný Interleukin-6 (ΈΡ 0442724) nebo Interleukin-2 {WO 90/07938) a erytropoetin (WO 01/02017). Avšak připojení polyetylén glykolu a jiných polymerů nevedlo nezbytně k prodloužení jejich sérového poločasu. Je známo například, že konjugace odlišných polyetylén glykolů k Interleukinu-8, G-CSF a jiným interleukinům vede k produkci molekul se zhoršenými vlastnosti (Mehvar, R., J. Pharm. Pharm. Sci. 3(1) (2000) 125-136). Výsledek PEGylace polypeptidu je tedy vysoce nepředvídatelná. Gaertner, H.F., Offord, R.E., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44 popisují připojení PEGu ke specifickému místu amino konce bílkovin. Gaertner et al. uvádějí (jak již bylo zmíněno v patentu WO 94/13222, viz výše), že PEGylace představuje velký problém, pokud místa připojení nemohou být přesně kontrolována, protože toto může mít velký dopad na stabilitu a funkci proteinu.
Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18, předkládají přehled PEGylace cytokinů a dalších teraputických bílkovin. Francis et al. uvádějí, že u většiny metod PEGylace bylo zaznamenáno významné snížení bioaktivity (typicky 20-95%). Podle Francise et al. je PEGylace bílkovin vždy založena na metodě pokusu a omylu a skutečně všechny parametry takové PEGylace mohou mít překvapivě velmi výrazný účinek na funkčnost produktu. Tsutsumi, Y., et al., Thromb. Haemost. 77 (1997) 168-173, popisují PEGylaci Interleukinu6. Podle autorů Tsutsumi et al. bylo zhruba 54% lysinových amino skupin IL-6 spojeno s PEG o molekulové váze 5 kDa na PEG skupinu. Tsutsumi et al., v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553, popisují chemickou modifikaci immunotoxinu pomocí PEGu. Protože náhodná PEGylace byla sdružena s výraznou ztrátou specifické cytotoxické aktivity, provedl Tsutsumi specifickou PEGylaci za použití imunotoxinové mutanty s jedním nebo dvěmi cysteiny navíc, které jsou použity pro připojení PEGu. Heinzerling, L., et al., Dermatol. 201 (2000) 154-157 popisuje připojení PEGu k Interferonua s molekulovou váhou 5 kDa. Tsutsumi, Y., et al. popisují v J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 1006-1011, modifikaci TNF-α pomocí PEGu, kde molekulová váha použitých PEGových skupin je opět 5 kDa. Protože aplikovaný PEGylovaný TNF-α má molekulovou.váhu alespoň 84 kDa (molekulovou váha TNF-α je 17 kDa), je k TNF-α připojeno alespoň 13 5-kDa PEGových skupin.
PEGylace bílkovin a následné farmakologické účinky jsou také shrnuty autorem Reddy, K.R., Ann. Pharmacotherapy 34 (2000) 915923. Opět je uváděno, že PEGylace teraputických bílkovin musí být hodnocena opatrně. Každý protein je podle autorů Reddy et al. odlišný, vyžaduje odlišnou optimalizaci chemických podmínek a proto nemůže být vliv PEGylace předpovídán.
Cílem předkládaného vynálezu bylo nalézt vylepšené polypeptidy s NK4 aktivitou a jejich farmaceutické preparáty, které mohou být podány pouze jako několik bolusových aplikací za týden a/nebo ve velmi nízkých dávkách, které jsou schopné potlačit nádorový růst, angiogenezi a metastázování.
Popis vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje NK4 konjugáty složené z NK4 kovalentně spojených s jednou polyetylén glykolovou (PEG) skupinou o zhruba 20-40 kDa (monoPEGylovaný NK4), přednostně přes ε-amino skupinu NK4 lysinu nebo N-terminální amino skupinu. Nejpřednostněji je NK4 náhodně PEGylován na jedné amino skupině skupiny obsahující ε-amino skupiny NK4 lysin N-terminální amino skupiny. Překvapivě bylo zjištěno, že monoPEGylovaný NK4 podle vynálezu má lepší vlastnosti, co se týká teraputické použitelnosti NK4 nebo jiných PEGylovaných NK4.
Vynález dále zahrnuje způsob tvorby monoPEGylovaného NK4 podle vynálezu.
Vynález dále zahrnuje farmaceutické preparáty obsahující
monoPEGylovaný NK4.
Vynález dále zahrnuje způsoby přípravy farmaceutických preparátů obsahujících monoPEGylovaný NK4.
Vynález dále zahrnuje způsoby léčby lidských nádorů (např. prsu, plic, prostaty, pankreatu nebo tlustého střeva) charakterizované tím, že farmaceuticky účinné množství monoPEGylovaného NK4 je podáno v jedné až sedmi bolusových applikacích za týden pacientovi potřebujícímu tuto léčbu.
Bylo překvapivě zjištěno, že celé množství náhodně PEGylovaného NK4 podle vynálezu, které má být podáno během léčby je významně nižší ve srovnání s aplikací nePEGylovaného NK4. Proto množství PEGylovaného NK4 používaného ve farmaceutické léčbě je zhruba 50% nebo méně, přednostně zhruba 20% nebo méně, nejpřednostněji zhruba 10% nebo méně, než je vyžadované množství nePEGylovaného NK4.
Detailní popis vynálezu
Lidský HGF je disulfidicky spojený heterodimer, který může být štěpen v a-podjednotce 463 aminokyselin a β-podjednotce 234 aminokyselin štěpením mezi aminokyselinami R494 a V495. N-konci ařetězce předchází 31 aminokyselin počínající methioninovou skupinou. Tento segment zahrnuje signální sekvenci 31 aminokyselin, a-řetězec začíná aminokyselinou 32 a obsahuje čtyři kringle domény. Takzvaná stočená doména se skládá z aminokyselin 70-96. Přibližně platí, že kringle 1 doména se skládá z aminokyselin 128-206. kringle 2 doména se skládá z aminokyselin 211-288, kringle 3 doména se skládá z aminokyselin 305-383, kringle 4 doména se skládá z aminokyselin 391-469 α-řetězce. Existují varianty těchto sekvencí v zásadě neovlivňující biologické vlastnosti NK4 (obzvláště neovlivňují jeho antagonistické aktivitu vůči HGF a jeho antiangiogenní aktivity), kteréžto varianty jsou popsány například v patentu WO 93/23541. Také délka NK4 se může lišit o několik aminokyselin pokud nejsou ovlivněny jeho biologické vlastnosti.
NK4 je tvořen N-terminálními 447 aminokyselinami HGF/SFa-řetězce, který zahrnuje výše zmíněnou stočenou doménu čtyř kringle domén. Může být připraven rekombinantě, buďto tvorbou rekombinantního lidského HGF/SF a natrávením elastázou (Dáte, K., FEBS Letters 420 (1997) 1-6) nebo rekombinantní expresí NK4 kódující nukleové kyseliny v příslušné hostitelské buňce, jak je popsáno níže. NK4 glykoprotein má molekulovou váhu zhruba 57 kDa (52 kDa má samotná polypeptidová část) a má in vivo biologickou aktivitu způsobující inhibici nádorového růstu, ángiogeneze a/nebo metastázování.
MonoPEGylovaný NK4, jak je zde tento termín používán, znamená, že NK4 má připojenu kovalentně jednu polyetylén glykolovou skupinu s molekulovou váhou od 20 do 40 kDa. Skupina může být připojena, přednostně náhodně, na odlišných místech NK4 molekuly, avšak přednostně na nej reaktivnějších místech, např. lysinových postranních řetězcích N-terminální amino skupiny. MonoPEGylovaný NK4 (který je proto přednostně směsí monoPEGylovaných NK4 molekul, PEGylovaných na odlišných místech, které jsou ε-amino skupinami NK4 lysinu N-terminální amino skupiny) je alespoň 90% přípravek, nejpřednostněji monoPEGylovaný NK4 je 92% nebo více procentní přípravek. MonoPEGylované NK4 přípravky podle vynálezu jsou proto významně dostatečně homogenní, aby vykazovaly výhody homogenního přípravku, např. ve farmaceutickém použití.
Termín významně homogenní, jak je zde používán, znamená, že molekuly PEG-NK4 konjugátu, které jsou produkovány, obsaženy nebo používány, jsou pouze ty, které mají připojenu jednu PEG skupinu. Přípravek může obsahovat nezreagovaný (t.j. postrádající PEG skupinu) protein. Jak bylo ověřeno peptidovým mapováním a Nterminálním sekvenováním, jeden příklad uvedený níže poskytuje přípravek, který je alespoň z 90% monoPEG-NK4 konjugát a obsahuje nanejvýš 2 % nezreagovaný protein.
Molekuly PEG polymeru používané podle vynálezu mají molekulovou váhu zhruba od 20 do 40 kDa, přičemž preferované jsou PEG polymery se zhruba 20, 30 nebo 40 kDa (termín molekulová váha, jak je zde
používán, znamená molekulovou váhu PEG; termín zhruba ukazuje, že v řečených PEG přípravcích, budou některé molekuly vážit více a některé méně, než je uváděna molekulová váha).
Termín PEG nebo PEG skupina podle vynálezu znamená reziduum obsahující poly(etylén glykol) jako hlavní součást. Takový PEG může dále obsahovat chemické skupiny, které jsou nezbytné pro vazebné reakce; který vzniká z chemické syntézy molekuly; nebo který je distančním prvkem pro optimální vzdálenost molekuly. Navíc se může takový PEG skládat z jednoho nebo více vedlejších řetězců PEGu, které jsou spolu spojeny. Molekuly PEGu s více než jedním PEG řetězcem jsou nazývány větvené molekuly PEGu. Větvené molekuly PEGu mohou být připraveny například přidáním polyetylén oxidu k různým polyolům, zahrnujících glycerol, pentaerytriol a sorbitol. Například PEG se čtyřmi větvemi může být připraven z pentaerytriolu a etylén oxidu. Větvené molekuly PEGu jsou popsány například v patentu EP-A 0473084 a patentu US Patent Č. 5,932,462. Obzvláště preferované jsou molekuly PEGu s dvěmi postranními řetězci PEGu (PEG2) spojené prostřednictvím primárních amino skupin lysinu (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Jako polymery PEGu s molekulovou váhu 20-30 kDa jsou preferované lineární PEG molekuly, jako polymery PEGu s molekulovou váhou více než 30 kDa, obzvláště 40 kDa, jsou preferované větvené molekuly PEGu. Jako PEG 40 kDa je obzvláště preferován PEG (PEG2).
Podle vynálezu je poskytnut způsob tvorby významně homogenního monoPEGylovaného NK4. PEGylace NK4 může být provedena podle způsobů známých v oboru, například reakcí NK4 s elektrofilně aktivními molekulami PEGu (dodavatel: Shearwater Corp., USA, www.shearwatercorp.com). Preferovaná činidla PEG jsou např. Nhydroxysukcinimidyl propionáty (PEG-SPA) nebo butanoáty (PEG-SBA) nebo větvené N-hydroxysukcinimidy, jako jsou například mPEG2-NHS (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Tyto metody vedou ke vzniku NK4 polypeptidu, který je náhodně PEGylovaný na ε-amino skupině NK4 lysinu nebo na N-terminální amino skupině. Ne náhodně může být N-terminálně PEGylovaný NK4 produkován podle
9 * · · • 9 9 99 patentu WO 94/01451.
V preferované formě vynálezu je řečený NK4 kovalentně spojen do jedné poly(etylén glykolové) skupiny se vzorcem
-CO- (CH2) χ- (OCH2CH2) a-0R s -CO (t.j. karbonyl) poly(etylén glykolové) skupinou vytvářející amidovou vazbu s jednou z amino skupin NK4; R je nižší alkyl; x je 2 nebo 3; m je od zhruba 450 do zhruba 950; n a m jsou zvoleny tak, že molekulová váha konjugátu minus NK4 protein je od zhruba 20 do 40 kDa. Jako amino skupina NK4 ε-amino skupiny NK4 lysinu je dostupná (volná) amino skupina.
Specifičtěji mohou být výše uvedené konjugáty reprezentovány vzorcem (I)
P-NHCO-(CH2)X-(OCH2CH2)m-OR (I) kde P je skupina NK4 proteinu zde popsaná, (t.j. bez amino skupiny nebo amino skupin, které vytvářejí amidovou vazbu s karbonylem, jak je·uvedeno ve vzorci (I); kde R je nižší alkyl; x je 2 nebo 3; m je od zhruba 450 do zhruba 950 je zvoleno tak, že molekulová váha konjugátu minus NK4 protein je od zhruba 20 do 40 kDa. Jak je zde používáno, mají daná rozmezí ”m čistě orientační význam. Rozmezí· m jsou určena v každém případě a přesně molekulovou váhou PEG skupiny.
V další přednostní formě vynálezu je řečený NK4 kovalentně spojen s jednou poly(etylén glykolovou) skupinou definovanou vzorcem (CH2)yNHCO(OCH2CH2)nOR
kde y je 1 až 4, přednostně 4, n a p spolu jsou zvoleny tak, že • · · · · molekulová váha konjugátu minus NK4 protein je od zhruba 20 do 4 0 kDa, přednostně 40 kDa, n a p se neliší o více než 25%, přednostně ne o více než 10%, nejpřednostněji jsou identické, a R je nižší alkyl.
Jak je zde používáno, znamená nižší alkyl lineární nebo větvenou alkylovou skupinu mající od jednoho do šesti uhlíkových atomů {CiC6 alkyl). Příklady nižších alkylových skupin zahrnují metyl, etyl isopropyl. Ve shodě s tímto vynálezem je R jakýkoli nižší alkyl. Konjugáty, v kterých je R metyl, jsou preferované.
Symbol m reprezentuje počet etylén oxidových skupin (OCH2CH2) v póly(etylén oxidové) skupině. Jednotlivá podjednotka PEG má molekulovou váhu zhruba 44 daltonů. Molekulová váha konjugátu (při vyloučení molekulové váhy NK4) tedy závisí na počtu m. V konjugátech podle tohoto vynálezu je m od zhruba 450 do zhruba 950 (odpovídající molekulové váze od zhruba 20 kDa do zhruba 40 kDa). Počet m je vybrán tak, že výsledný konjugát tohoto vynálezu má fyziologickou aktivitu srovnatelnou s nemodifikovaným NK4, kterážto aktivita může reprezentovat stejnou aktivitu, větší aktivitu nebo jen část aktivity nemodikovaného NK4. Molekulová váha zhruba určitého čísla znamená, že je v rozumném rozmezí takového čísla, jak může být určeno konvenčními analytickými technikami. Číslo m je vybráno tak, že molekulová váha každé póly (etylén glykolové) skupiny kovalentně spojené do NK4 proteinu je od zhruba 20 kDa do zhruba 40 kDa.
Sloučenina definovaná vzorcem (I) může být připravena například ze známého aktivovaného polymerního materiálu:
v kterém R a m jsou popsány výše, kondenzací sloučeninou definovanou Vzorcem II s NK4 proteinem. Sloučeniny definované • · · • » « • · « «♦« ·· vzorcem (II), v kterém x je 3, jsou sukcinimidyl estery alfa-nižší alkoxymáselné kyseliny poly(etylén glykolu) (nižší alkoxy-PEG-SBA). Sloučeniny definované vzorcem (II), v kterých x je 2, jsou sukcinimidyl estery alfa-nižší alkoxypropionové kyseliny poly(etylén glykolu) (nižší alkoxy-PEG-SPA). Může být jakýkoli konvenční způsob reakce aktivovaného esteru s aminem za vzniku amidu. V reakci popsané výše, je příkladem uvedený sukcinimidyl ester s odstupující skupinou způsobující vznik amidu. Použití sukcinimidyl esterů, jako jsou například sloučeniny definované vzorcem II, k tvorbě konjugátů s bílkovinami jsou uvedeny v patentu U.S. Patent č. 5,672,662, vydaného 30. září, 1997 (Harris, et al.).
Lidský NK4 obsahuje 30 volných ε-amino skupin 30 lysinových reziduí. Když bylo PEGylační činidlo zkombinováno se sloučeninou SBA definovanou vzorcem II, bylo zjištěno, že při proteinové koncentraci zhruba 5 až 10 mg/ml, při pH zhruba 7.0 až 8.0, poměru protein:PEG zhruba 1:3 a reakční teplotě od 20-25°C byla produkována směs mono-, di- a stopových množství tri-PEGylovaných sloučenin. Když byl poměr protein:PEG zhruba 1:1 nebo 1:2 (například přednostně zhruba 1:2 pro 30 kDa PEG-SBA a zhruba 1:5 pro 40 kDa PEG2-NHS), byly produkovány primárně monoPEGylované sloučeniny. Manipulací reakčních podmínek (např. poměr činidel, pH, teplota, koncentrace bílkoviny, čas reakce, atd.), může být optimalizováno relativní množství odlišných monoPEGylovaných sloučenin. Podmínky jsou typicky, ale vždy zhruba 8 až 12 mg/ml NK4, 0.3 M fosforečnan draselný, pH 8, 25°C, reakční doba 1 h. Za takových podmínek při použití 30kDa PEG-SBA (1:2, protein:PEG) , je výtěžek zhruba 38% monoPEGylovaného NK4.
MonoPEGylovaný NK4 může být také produkován podle způsobů popsaných v patentu WO 94/01451. Patent WO 94/01451 popisuje způsob přípravy rekombinantního polypeptidu s modifikovanou terminální aminokyselinovou alfa-uhlíkovou reaktivní skupinou. Kroky, metody zahrnují vytvoření rekombinantního polypeptidu a jeho ochranu jednou nebo více biologicky přidanými chránícími skupinami na Nterminálním alfa-aminu a C-terminálním alfa karboxylu. Polypeptid
4· » 4
4 «4 ♦ ··!
může být poté podroben reakci s chemickou chránící látkou, aby se selektivně chránil postranní řetězec skupin, aby nebyly modifikovány. Polypeptid je poté naštěpen štěpícím činidlem specifickým pro biologické chránící skupiny za vzniku nechráněné aminokyselinové alfa-uhlíkové reaktivní skupiny, terminální aminokyselinová alfa-uhlíková reaktivní modifikovaná chemicky modifikující látkou. Postranní řetězec chráněného terminálně modifikovaného polypeptidů v jedné kopii je poté zbaven ochrany na skupinách postranního řetězce za vzniku terminálně modifikovaného rekombinantního polypeptidů o jedné kopii. Počet sekvenčních kroků ve způsobu se může lišit, aby bylo dosaženo selektivní modifikace na N- a/nebo C-terminální aminokyselině polypeptidů.
terminální Nechráněná skupina je
Dálší preferované konjugáty podle vynálezu obsahují NK4 protein, který je kovalentně připojen k nižší-alkoxy poly(etylén glykolové) skupině pomocí vazebné skupiny definované vzorcem -C(O)-X-S-Y- s C(0) vazebné skupiny tvořící amidovou vazbu s amino skupinou NK4 (jak je zmíněno výše, ε-amino skupina lysinových reziduí je dostupná), X is-(CH2)k-ř nebo -CH2 (O-CH2-CH2) k“z k je od 1 do 10, Y je
nebo
L o průměrná molekulová váha poly(etylén glykolové) skupiny je od φ φ φ φ φφ • ΦΦΦ
ΦΦΦ zhruba 20 kDa do zhruba 40 kDa a molekulová váha konjugátu je od zhruba 72 kDa do zhruba 92 kDa při molekulové váze 52 kDa NK4 polypeptidu, nebo od 77 kDa do zhruba 97 kDa při molekulové váze kDa pro NK4 glykoprotein.
Tato NK4 sloučenina může být také reprezentována vzorcem (III)
P-NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR (III) kde R může být jakýkoli nižší alkyl, kterým je míněna lineární nebo větvená alkylová skupina mající od jednoho do šesti uhlíkových atomů, jako jsou například metyl, etyl, isopropyl, atd. Preferovaný alkyl je metyl. X může být -(CH2)k-, nebo CH2 (O-CH2-CH2) k-, kde k je od 1 do zhruba 10. Přednostně je k od 1 do zhruba 10, přednostněji je k 1 nebo 2. Nejpřednostněji je X -(CH2) .
Ve vzorci III je Y o
nebo přednostně více přednostně
Ve vzorci (III) je počet m je vybrán tak, že výsledný konjugát tohoto vynálezu má fyziologickou aktivitu srovnatelnou s nemodifikovaným NK4, kterážto aktivita může reprezentovat stejnou aktivitu, větší aktivitu nebo jen část aktivity nemodikovaného NK4. m reprezentuje počet etylén oxidových řetězců v PEG jednotce. Jednotlivá PEG podjednotka PEG -(OCH2CH2)- má molekulovou váhu zhruba 44 daltonů. Molekulová váha konjugátu (při vyloučení molekulové váhy NK4) tedy závisí na počtu m. Molekulová váha zhruba” určitého čísla znamená, že je v rozumném rozmezí takového čísla, jak může být určeno konvenčními analytickými technikami, m je proto celé číslo v rozmezí od zhruba 450 do zhruba 950 (což odpovídá molekulové váze od zhruba 20 do zhruba 40 kDa).
Přednostní NK4 bílkoviny definované vzorcem (III) jsou reprezentované vzorcem:
! O
Nejpřednostnější NK4 proteinové produkty jsou reprezentované vzorcem:
o
9« ·· ··
I · ·» ··.♦ *· ··· ··»· »· ··
Tyto NK4 bílkoviny mohou být připraveny pomocí (a) kovalentní reakcí volné amino skupiny, přednostně ε-amino skupiny lysinu NK4 proteinu nebo N-terminální amino skupiny reprezentované vzorcem P-NH2 s bifunkčnim činidlem reprezentovaným vzorcem Z-CO-X-S-Q za vzniku meziproduktu s amidovou vazbou reprezentovaného vzorcem:
P-NH-CO-X-S-Q kde P je NK4 protein bez amino skupiny, která tvoří amidovou vazbu; Z je reaktivní skupina, např. karboxylový-NHS ester; X je -(CH2)knebo -CH2 (O-CH2-CH2) k~r kde k je z 1 do zhruba 10; Q je chránící skupina jako alkanoyl, např. acetyl.
(b) kovalentní reakcí meziproduktu s amidovou vazbou z kroku (a) s aktivovaným polyetylén glykolovým derivátem reprezentovaným vzorcem W-[OCH2CH2]m-OR za vzniku NK4 proteinového produktu reprezentovaného vzorcem:
ρ~ Nvx's'Yd-o^-A,OR
O kde W je sulfhydrylová reaktivní forma Y; m je celé číslo v rozmezí od zhruba 450 do zhruba 950; R je nižší alkyl; Y jsou definovány výše.
V této formě vynálezu je bifunkční činidlo přednostně Nsukcinimidyl-S-acetylthiopropionát nebo N-sukcinimidyl-Sacetylthioacetát, Z je přednostně N-hydroxy-sukcinimid a aktivovaný polyetylén glykolový derivát W-[0CH2CH2Jj„-0R je přednostně vybrán ze skupiny složené z jodo-acetyl-metoxy-PEG, metoxy-PEG-vinylsulfonu a metoxy-PEG-maleimidu.
Detailněji mohou být NK4 bílkoviny definované vzorcem (III) připraveny kovalentní vazbou thiolové skupiny s NK4 (aktivace) a φ· ····
| 15 | • ♦· · 99 · ♦ ·· • ·· · • » · · ♦ • · · · | ·· ·· ···· • · · · · • · · · 9 9 9 * · • · · 9 · | |
| spojením výsledného | aktivovaného NK4 | proteinu | s derivátem |
| poly(etylén glykolu) | (PEG). První | krok pro | přípravu |
monoPEGylovaného ΝΚ4 podle předkládaného vynález zahrnuje kovalentní připojení thiolové skupiny prostřednictvím NH2-skupin NK4. Tato aktivace NK4 je provedena s bifunkčními činidly, které nesou chráněnou triolovou skupinu a další reaktivní skupinu, jako jsou například aktivní estery (např. sukcinimidylester), anhydridy, estery sulfonových kyselin, halogenidy karboxylových kyselin a respektive sulfonových kyselin. Thiolová skupina je chráněna skupinami známými v oboru, např. acetylovými skupinami. Tato bifunkční činidla jsou schopná reagovat s amino skupinami vytvořením amidové vazby.
V přednostní formě vynálezu je aktivace amino skupinami provedena reakcí s bifunkčními činidly majícími sukcinimidylovou skupinu. Bifunkční činidla mohou nést odlišné distanční prvky, např. skupiny -(CH2)k- nebo -CH2- (O-CH2-CH2-) k-, kde k je od 1 do zhruba 10, přednostně od 1 do zhruba 4, přednostněji 1 nebo 2, nejpřednostněji 1. Příklady těchto činidel jsou N-sukcinimidyl-Sacetylthiopropionát (SATP) a N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát
Acetythioalkyl-karboxylový-NHS-ester, jako
ŠATA „CH
NHS Ester 2-(Acetylthio)- (etoxy) k-kyseliny octové ·· ♦··· • · 1 ·· «· s k definovaným výše.
Příprava bifunkčních činidel je známa v oboru. Prekurzory NHSesterů 2-(acetylthio) - (etoxy)k-octové kyseliny jsou popsány v DE3924705, zatímco derivatizace na acetylthio sloučeninu je popsána v publikaci March, J., Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376. ŠATA je komerčně dostupná (Molecular Probes, Eugene, OR, USA Pierce, Rockford, IL).
Přidání pouze jedné thiolové skupiny k NK4 molekule může být vybráno úpravou reakčních parametrů, t.j. koncentrace proteinu (NK4) a poměru protein/bifunkční činidlo.
Reakce je provedena například ve vodném pufru s pH 6,5-8,0, např. v 10 nebo 100 mM fosforečnanu draselném, s nebo bez 300 mM NaCl, pH 7,3. Bifunkční činidlo může být přidáno v DMSO. Po ukončení reakce, přednostně po 30 minutách, je reakce zastavena přidáním lysinu. Nadbytek bifunkčního činidla může být oddělen způsoby známými v oboru, např. dialýzou nebo kolonovou filtrací. Průměrný počet thiolových skupin přidaných k NK4 může být určen fotometrickými způsoby popsanými například v publikaci Grasetti, D.R,. Murray, J.F. v J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49.
Výše uvedená reakce je následována kovalentním připojením aktivovaného polyetylén glykolového (PEG) derivátu. Vhodné PEG deriváty jsou aktivované PEG molekuly s průměrnou molekulovou váhou od zhruba 20 do zhruba 40 kDa.
Aktivované PEG deriváty jsou známé v oboru a jsou popsány například v publikaci Morpurgo, Μ., et al. J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363 ff pro PEG-vinylsulfon. Lineární řetězec a větvený řetězec PEG molekul jsou vhodné pro přípravu sloučenin definovaných Vzorcem 1. Příklady reaktivních PEG činidel jsou jodo-acetylmetoxy-PEG a metoxy-PEG-vinylsulfon:
·· ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ♦·
Použití těchto jodem aktivovaných látek je známo v oboru a je popsáno např. Hermansonem, G.T., v časopise Bioconjugate Techniques, Academie Press, San Diego (1996) p. 147-148.
Nejpřednostněji jsou PEG molekuly aktivované maleimidem za použití (alkoxy-PEG-maieimidu), jako je například metoxy-PEGmaleimid (MW 20,000 až 40,000; Shearwater Polymers, lne.). Struktura alkoxy-PEG-maieimidu je
γ.
OR or
S R a m definovanými
výše, přednostně
H
ΌΗ
OR
Spojovací reakce s alkoxy-PEG-maleimidem se uskutečňuje po in šitu odštěpení thiolové chránící skupiny ve vodném pufru, např.
v 10 mM fosforečnanu draselném, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.2.
Odštěpení chránící skupiny může být provedeno například hydroxyiaminem v DMSO při 25°C, pE 6.2 po dobu zhruba 90 minut.
·« » 4 • 9 ·· ····
Pro PEG modifikaci by měl být molární poměr aktivovaného NK4/alkoxy-PEG-maleimidu od zhruba 1:1 do zhruba 1:6. Reakce může být zastavena přidáním cysteinu a reakcí zbývajících thiolových (-SH) skupin s N-metylmaleimidem nebo dalšími vhodnými sloučeninami schopnými vytvářet disulfidové vazby. Kvůli reakci jakýchkoli zbývajících aktivních thiolových skupin s chránící skupinou, jako jsou například N-metylmaleimid nebo jiná vhodná chránící skupina, mohou NK4 bílkoviny v konjugátech podle tohoto vynálezu obsahovat takové chránící skupiny. Postup zde popsaný vede obecně ke vzniku směsi molekul majících různé počty triolových skupin chráněných odlišným počtem chránících skupin v závislosti na počtu aktivovaných thiolových skupin na proteinu, které nebyly konjugovány k PEG-maleimidu.
Zatímco N-metylmaleimid tvoří stejný typ kovalentní vazby, je-li používán k blokování zbývajících triolových skupin na PEGylovaném proteinu, disulfidové sloučeniny vedou k výměnné reakci intermolekulární sulfidové/disulfidové vazby se spojením blokovacího činidla disulfidickým můstkem. Preferovaná blokovací činidla pro tento typ blokovací reakce jsou oxidivaný glutathion (GSSG), cystein a cystamin. Zatímco cystein nevnáší do PEGylovaného proteinu žádný další náboj, použití blokovacího činidla GSSG nebo cystaminu vede k dalšímu negativnímu nebo pozitivnímu náboji.
Další purifikace sloučenin definovaných vzorcem (III), zahrnující separaci mono- z di-, tri- multi-PEGylovaných NK4 molekul, může být provedena způsoby známými v oboru, např. sloupcovou chromatografií. Procento mono-PEG konjugátů může být kontrolováno shromážděním širších frakcí okolo elučního vrcholu ke snížení procenta mono-PEG nebo užších frakcí ke zvýšení procenta mono-PEG v preparátu. Zhruba 90 procent mono-PEG konjugátů je dobrou rovnováhou výtěžku a aktivity. Mohou být požadovány preparáty, v kterých například alespoň 92 procent nebo alespoň 96 procent konjugátů jsou mono-PEG sloučeniny. Ve formě tohoto vynálezu je procento mono-PEG konjugátů od 90 do 96 »·· ···· procent.
Farmaceutické vzorce
Sloučeniny podle předkládaného vynález mohou být formulovány podle způsobů pro přípravu farmaceutických preparátů, kteréžto způsoby jsou známé osobě znalé oboru. Pro přípravu takových preparátů, je monoPEGylovaný NK4 podle vynálezu zkombinován ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem. Takové přijatelné nosiče jsou popsány například, v Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, 1990, Mack Publishing Company, vydáno autory Oslo et al. (např. str. 1435-1712). Typické preparáty obsahují účinné množství látky podle vynálezu, například od zhruba 0,1 do 100 mg/ml, spolu s vhodným množstvím nosiče. Preparáty mohou být podány parenterálně.
Tento vynález dále poskytuje farmaceutické preparáty obsahující konjugáty zde popsané, v kterých je procento mono-PEG konjugátů přednostně alespoň 90 procent, přednostněji alespoň 92 procent.
Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být připraveny podle způsobů známých v oboru. Roztoky monoPEGylovaného NK4 jsou obvykle dialyzovány proti pufru zamýšlenému k použití ve farmaceutickém, preparátu a požadovaná finální koncentrace proteinu je upravena koncentrací nebo naředěním.
Takové farmaceutické preparáty mohou být používány pro injekční podání a obsahují účinné množství monoPEGylovaného NK4 spolu s farmaceuticky přijatelnými ředícími látkami, konzervačními látkami, solubilizačními látkami, emulzifikačními látkami, adjuvantními látkami a/nebo nosiči. Takové preparáty zahrnují ředící látky různých pufrových složek (např. arginin, acetát, fosfát), pH a iontovou sílu, aditivní látky, jako jsou například detergenty a solubilizující látky (např. Tween 80/polysorbát, pluronic F68, chlorid sodný, sulfát sodný), antioxidační látky • φ φ
ΦΦ « « φφ φφφφ • ·· ·«··«» · • φ · · · • · φ φ · · • · φφφφ φφφ φφφφ φφ ·» (např. kyselina askorbová, L-methionin), konzervační látky (Timersol, benzyl alkohol), látky zvyšující objem (např. sacharóza, manitol), začlenění materiálu do konkrétního přípravku polymerních sloučenin, jako jsou například kyselina polymléčná, polyglykolová, atd. nebo do lipozómů. Takové preparáty mohou ovlivnit uvolňování a odbourávání monoPEGylovaného NK4 podle vynálezu na základě stabilitního poměru fyzikálního stavu.
Dávkování a lékové koncentrace
Ve standardním léčebném protinádorovém režimu jsou pacienti typicky léčeni dávkami v rozmezí mezi 1 až 30 mg monoPEGylovaného NK4 na kg per day po určitou dobu trvající od jednoho dne do zhruba 30 dnů nebo dokonce déle. Lék je aplikován jako jedna denní subkutánní nebo i. v. bolusová injekce farmaceutického přípravku obsahující 0.1 až 100 mg monoPEGylovaného NK4 na ml. Tato léčba může být zkombinována s jakoukoli standardní (např. chemoteraputickou) léčbou aplikací monoPEGylovaného NK4 před, během nebo po standardní léčbě. Toto vede ke zlepšeným výsledkům ve srovnání se standardní léčbou samotnou.
V každém případě je celkové množství podávaného PEGylovaného NK4 podle vynálezu významně nižší než množství NK4 pro stejnou léčbu.
Následující příklady, reference a seznam sekvencí jsou poskytnuty, aby pomohly pochopit předkládaný vynález, jehož celý rozsah je uveden v přiložených patentových nárocích. Je rozuměno, že v postupech mohou být provedeny modifikace, aniž by došlo k odchýlení od podstaty vynálezu.
·· ····
Popis sekvencí
SEQ ID č.l ukazuje DNA a sekvenci polypeptidu NK4.
SEQ ID č.2 ukazuje sekvenci polypeptidu NK4.
Popis Obrázků
Obr. 1 Inhibice HGF-indukované proliferace HUVEC pomocí
NK4, 20 kDa-mono-PEG-NK4 a 30 kDa-mono-PEG-NK4.
Obr. 2 Inhibice HGF-indukované HUVEC proliferace pomocí NK4 a 40 kDa-mono-PEG-NK4.
Obr. 3 Inhibice bFGF-indukované HUVEC proliferace pomocí
NK4, 30 kDa-mono-PEG-NK4 a 40 kDa-mono-PEG-NK4.
Obr. 4 Křivka času-koncentrace NK4, 30 kDa-monoPEG-NK4, kDa-mono-PEG-NK4 v plazmě po i.v. (Obr. 4A) nebo s.c. (Obr. 4B) injekci.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Rekombinantní tvorba NK4
NK4 pro terapeutické použití může být produkován rekombinantními způsoby za použití bakteriálních nebo eukaryotických expresních systémů. Vhodné eukaryotické expresní systémy jsou například upravené HeLa, BHK nebo přednostně CHO buňky. Buňky upravené pro NK4 produkci jsou kultivovány ve vhodném médiu. Jako inokulum pro 10 litrový fermentor je typicky používána 1 až 5 litrová buněčná kultura. Po 3 až 5 dnech může být kultura v 10 litrovém fermentoru používána jako inoculum pro 100 litrový fermentor. Po dalších 3 až 5 dnech fermentace může býta tato kultura použita jako inokulum pro 1000 litrový produkční fermentor. Po 3 až 4 dnech jsou buňky odstraněny filtrací nebo centrifugací.
Supernatant obsahující NK4 je zfiltrován, sebrán a zpracován během purifikace. Purifikační proces je popsán v následujícím příkladu.
Přiklad 2
Purifikace
Heparin-Sepharosa se skládá z kuliček Sepharosy, k jejichž povrchu je kovalentně navázán heparin. Protože NK4 vykazuje vysokou afinitu k heparinu, je zachycován na této koloně a může být eluován vysokými koncentracemi soli, zatímco protein kontaminující látky a další nečistoty se buďto neváží nebo se eluují při nižších koncentracích soli. Frakce obsahující NK4 eluované při zhruba 0.7 až 1.1 M NaCl v 50 mM Hepes pH 7.5 jsou shromážděny a naneseny na hydroxyapatitovou kolonu. NK4 se eluuje zhruba 0.4 až 0.7 M roztokem fosforečnanu draselného, pH 7.5. Výsledné frakce jsou významně bez kontaminujících bílkovin a mohou být dále purifikovány chromatografií s S-Sepharosou
Příklad 3
Produkce monoPEGylovaného NK4
Pro PEGylační reakce byl použit NK4 purifikovaný ve shodě s výše zmíněným postupem. Tři výše zmíněné vhodné způsoby jsou popsány příkladem.
a) PEGylace NK4 s mPEG-SBA
Alikvóty NK4 byly podrobeny reakci s met oxy-PEG-S BA (5 kDa pro srovnání, 20 kDa a respektive 30 kDa; Shearwater Polymers, lne., Huntsville Alabama). Reakce byla provedena při poměru proteinu ku činidlu mezi 1:1 a 1:5 po dobu zhruba 2 hod při pokojové teplotě (poměr 1:2 je preferován, je-li používán 20 a 30 kDa PEG) . Reakce byla zastavena přidáním 10 mM Tris pufru nebo
• · · · · · • · · • · · • · · • · · · arginin HCI, pH 8, a vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE nebo gelovou chromatografií na koloně se Superosou 6 (Pharmacia) za použití 500 mmol/1 fosforečnanu sodného jako pufru, pH 6.8, pro ekvilibraci a eluci. Reakce byla optimalizována změnou poměru bílkoviny ku činidlu, pH, času a teploty, aby byl získán převážně monoPEGylovaný NK4.
Takové podmínky jsou například:
Koncentrace NK4: 8-12 mg/ml
Pufr/pH: 0.3 M fosforečnan draselný, pH 8
Teplota: 25°C
Reakční čas: 1 h
Molární poměry (bílkovina:činidlo): 1:2
Výtěžek:
MonoPEGylovaný NK4: 38%
DiPEGylovanýNK4: 17%
NePEGylovaný NK4: 45%
b) PEGylace NK4 s mPEG-SPA
Alikvóty NK4 (koncentrace bílkoviny 8 až 12 mg/ml v 0.3 M fosforečnanu draselném, pH 8) byly podrobeny reakci s metoxyPEG-SPA (5 kDa pro srovnání a respektive 20 kDa; Shearwater Polymers, lne., Huntsville Alabama). Reakce byla provedena při poměru bílkoviny ku činidlu 1:2 po dobu zhruba 2 h při pokojové teplotě. Reakce byla zastavena přidáním 10 mM Tris pufru nebo arginin HCI a vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE, HPLC s reverzní fází nebo gelovou chromatografií koloně se Superosou 6 (Pharmacia) za použití 500 mmol/1 fosforečnanu draselného jako pufru, pH 6.8, pro ekvilibraci a eluci. Reakce byla optimalizována změnou poměru proteinu k činidlu, pH, času a teploty, aby byl získán převážně monoPEGylovaný NK4, ve srovnání s di- a tri-PEGylováným NK4.
• · • · · ·
c) PEGylace NK4 s mPEG2-NHS
Tato PEGylace byla provedena, jak je popsáno v Příkladu 3c s výjimkou, že místo PEG-SPA byl mPEG2-NHS (40 kDa PEG větvený prostřednictvím lysinového spojení) používán v molárním poměru 1:5 (bílkovina:PEG činidlo).
Příklad 4
Izolace monoPEGylovaného NK4
MonoPEGylovaný NK4 může být separován z nePEGylovaného, di- triPEGylovaného NK4 provedením preparativní gelové chromatografie (např. Superosa 6 nebo Superdex 200; Pharmacia) 500 mmol/1 fosforečnanu draselného jako pufru, pH 6.8, pro ekvilibraci a eluci, nebo ionexovou chromatografií. Purifikovaná bílkovina obsahuje převážně monoPEGylované molekuly. Frakce byly shromážděny a analyzovány pomocí SDS-PAGE a chromatografie na reverzní fázi.
Příklad 5
Molekulární charakterizace monoPEGylovaného NK4
a) Gelová chromatografie
MonoPEGylované molekuly se eluují gelovou chromatografií dříve (např. Superosa 6 nebo Superdex 200; Pharmacia; 500 mmol/1 fosforečnan draselný jako pufr, pH 6.8, pro ekvilibraci a eluci) ve srovnání s nemodifikovanou formou. Toto je způsobeno zvýšeným hydrodynamickým poloměrem molekuly.
b) SDS-PAGE
Pomocí SDS-PAGE jsou bílkoviny separovány podle své molekulové váhy. V důsledku zvýšení molekulové váhy PEGylací, vykazuje monoPEGylovaný NK4 kratší migrační vzdálenost ve srovnání s nemodifikovaným NK4. Migrační vzdálenost je inverzně korelována • · s délkou řetězce PEG části molekuly a počtem PEG skupin připojených k NK4 molekule.
c) Peptidové mapování
Natrávení monoPEGylovaného NK4 endo-proteinázami štěpícími specifické sekvence (např. LysC nebo trypsin) vede k vytvoření characteristické peptidové mapy. Výsledné peptídy mohou být separovány chromatografií na reverzní fázi a analyzovány hmotovou spektrometrií a/nebo N-terminální sekvenací. Toto umožňuje určení PEG-modifikovaných skupin v molekule NK4.
d) Chromatografie na reverzní fázi
MonoPEGylovaný NK4 může být také charakterizován chromatografií na reverzní fázi. PEGylace NK4 vede ke změně retenčního času ve srovnání s nemodifikovaným NK4.
Příklad 6
Srovnání monoPEGylovaného, nePEGylovaného a multi-PEGylovaného NK4
V tomto příkladu byly použity nePEGylovaný NK4, NK4 monoPEGylovaný s PEG 5 kDa, PEG 20 kDa, PEG 30 kDa, PEG 40 kDa a multiPEGylovaný NK4 (NK4 PEGylovaný s více než jedním . PEG řetězcem).
a) Analýza rozptylu
MDCK buňky byly téměř splývavě kultivovány na destičkách pro tkáňové kultury. Buňky byly léčeny s HGF (10 ng/ml) nebo s kombinacemi HGF NK4. V těchto experimentech byl rozptyl buněk indukovaných HGF inhibován přidáním 10 až 1000-násobného molárního nadbytku NK4 vykazujícího funkční aktivitu PEGylovaného NK4. Bylo zjištěno, že in vitro aktivita monoPEGylovaného 5 kDa-PEG-NK4, 20 kDa-PEG-NK4, 30 kDa-PEG-NK4 a • · · · • · · • · · kDa-PEG-NK4 je podobná nePEGylovanému NK4. Bylo také zjištěno, že přidání více než jednoho řetězce PEG (20 až 40 kDa) vede k významné ztrátě aktivity (Tabulka 1).
• ·· · «
Tabulka 1. Skóre MDCK v analýze rozptylu
| NK4 (kontrolní) | 40 kDa-PEG-NK4 | 30 kDa-PEG-NK4 | |||||||
| NK4 (ug ml) | NK4 | NK4 | Mono -PEG | Dí -PEG | Tri -PEG | Mono -PEG | Di- a Tri-PEG | Tri- Tetra PEG | Penta- PEG |
| 5,00 | ++ | ++ | ++ | + | + /- | ++ | + | - | |
| 1, 67 | ++ | ++ | + | - | ++ | 4- | +/- | - | |
| 0,56 | ++ | ++ | ++ | +/- | - | ++ | + | - | - |
| 0,19 | + | + | - | - | + | +/- | - | - | |
| 0,06 | +/- | +/- | +/- | - | - | +/- | - | - | - |
| 0,02 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 20 kDa-PEG-NK4 | 5 kDa-PEG-NK4 | |||||||||
| NK4 (ug /ml) | Mono- PEG | Di- PEG | Tri- PEG | Mono- PEG | Di- PEG | Tri- PEG | Tetra- PEG | Penfca- PEG | Hexa- PEG | Hepta -PEG |
| 5,00 | ++ | ++ | + | ++ | ++ | ++ | ++ | + | - | - |
| 1,67 | ++ | + | + | ++ | ++ | ++ | ++ | + | - | - |
| 0,56 | ++ | + | + /- | ++ | ++ | + | + | + /- | - | - |
| 0,19 | + | +/- | - | 4- | + | +/- | - | - | - | |
| 0,06 | + /- | - | - | +/- | */- | - | - | - | - | - |
| 0,02 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Byla testována relativní účinnost různých PEGylovaných forem NK4 na inhibici pomocí HGF (10 ng/ml) indukovaného rozptylu MDCK buněk. ++ znamená úplná inhibice, + znamená inhibice, +/znamená slabá inhibice, - znamená žádná inhibice.
b) Test proliferace HUVEC
Inhibice mitogenní aktivity HGF pomocí NK4 byla určena měřením proliferace HUVEC v kultuře, jak je popsáno v publikaci Nakamura, T., et al., Nátuře 342 (1989) 440-443. V těchto experimentech byla buněčná proliferace indukovaná HGF inhibována přidáním 10 až 1000-násobném molárním nadbytku NK4 vykazujícím funkční aktivitu monoPEGylovaného NK4 (Obr. 1 a 2).
Test proliferace HUVEC byl alternativně proveden inhibici mitogenní aktivity bFGF (bázický růstový faktor fibroblastů) pomocí NK4. Inhibice byla určena změřením proliferace buněk HUVEC v kultuře, jak je popsáno v publikaci Kuba, K., et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743. V těchto experimentech byla buněčná proliferace indukovaná FGF inhibována přidáním 10 až 1000-násobného molárního nadbytku NK4 vykazujícího funkční aktivitu monoPEGylovaného NK4 (Obr. 3).
c) Test invazivity
V tomto testu je analyzován invazivní potenciál nádorových buněk. Test byl stejně jako v publikaci Albíni, A., et al. (1987) za použití buněk HT115. Buněčná invazivita indukovaná HGF (10 ng/ml) mohla být opět inhibována přidáním 10 až 1000násobném molárním nadbytku NK4 vykazujícím funkční aktivitu monoPEGylovaného NK4 (Obr. 3).
Přiklad 7
Aktivita in vivo
Model: Ortotopický model SCID myši s lidským pankreatickým nádorem Pane Tul (Alves, F., et al., Pancreas 23 (2001) 227-235)
Léčba: Po 8 dnech jedna denní aplikace monoPEGylovaného NK4 po dobu 21 dnů.
Dávky: 16 mg/kg/day mg/kg/day 1 mg/kg/day Placebo
Výsledek: Léčba monoPEGylovaným NK4 ukazuje na dávce závislé potlačení růstu a metastázování primárního nádoru, zatímco ve skupinách léčených placebem není patrný žádný účinek.
Příklad 8
Farmaceutický preparát
Vhodné farmaceutické preparáty jsou například: 1 až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4 150 mM NaCl mM fosforečnanu sodného, pH 7.2 až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4
150 mM NaCl
0.01% Tween 80 nebo Tween 20 nebo pluronic F68 10 mM fosforečnanu sodného, pH 7.2 až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4 50 mM NaCl 3% mannitol mM fosforečnanu sodného, pH 7.2 až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4 mM NaCl
3% mannitol
0.01% Tween 80 nebo Tween 20 nebo pluronic F68 10 mM fosforečnanu sodného, pH 7.2
Přípravky jsou připraveny tak, že monoPEGylovaný NK4 je dialyzován proti výše uvedenému pufru (s nebo bez mannitolu). Koncentrace bílkoviny je upravena zakoncentrováním nebo naředěním pufrem. Z 10% zásobního roztoku jsou přidány detergent a NaCl.
Příklad 9
Farmakokinetická analýza NK4, 30 kDa-mono-PEG-NK4 a 40 kDa-monoPEG-NK4
Dospělé myši (4 na skupinu) byly léčeny jednou i,v. nebo s.c. bolusovou injekcí NK4, 30 kDa-mono-PEG-NK4 nebo 40 kDa-mono-PEGNK4 (4 mg/kg v 0.25 ml injekčního objemu). V různých časových bodech byly odebrány vzorky krve, které byly analyzovány pomocí ELISA testu na obsah NK4, 30 kDa-mono-PEG-NK4 nebo 40 kDa-monoPEG-NK4. Byly vypočteny křivky závislosti času na koncentraci a jsou uvedeny na Obrázku 4. Tyto údaje ukazují, že 30 kDa-monoPEG-NK4 a 40 kDa-mono-PEG-NK4 mají významně lepší stabilitu in vivo, což vede k významně vyššímu plazmatickému poločasu ve srovnání s nemodifikovaným NK4.
·· ···· ♦ · « • · · • · · 4 • · · 4 ·· ··
Seznam literatury
Albíni, A., et al., Cancer Res. 47 (1987) 3239-3245
Alves, F., et al., Pancreas 23 (2001) 227-235
Bailon, P., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195-202
Dáte, K., et al., FEES Letters 420 (1997) 1-6
Dáte, K., et al., Oncogene 17 (1989) 3045-3054
EP 0 442 724
EP-A 0 473 084
Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18
Gaertner, H.F., Offord, R.E., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44 Grasetti, D.R.., Murray, J.F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49
Heinzerling, L., et al., Dermatol. 201 (2000) 154-157
Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Technigues, Academie Press, San Diego,(1996) 147-148
Kuba, K., et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743
Maiti, P.K., et al., Int. J. Cancer Suppl. 3 (1988) 17-22 March, J,, Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376 Mehvar, R., J. Pharm. Pharm. Sci. 3 (1) (2000) 125-136
Miyazawa, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989)
967-973 Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 6269
Morpurgo, M., et al., Bioconj. Chem. 7 (1996) 363-368
Nakamura, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1984)
1450-1459 Nakamura, T., et al., Nátuře 342 (1989) 440-443
Okajima, A., et al., Eur. }. Biochem. 193 (1990) 375-381
Parr, C., et al., Int. J. Cancer 85 (2000) 563-570
Reddy, K.R., Ann. Pharmacotherapy 34 (2000) 915-923
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, 1990,
Mack Publishing Company, editoři Oslo et al. (např. pp. 14351712)
Seki, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 172 (1990) 321327
Stuart, K.A., et al., International of Journal Experimental
Pathology 81 (2000) 17-30
• 9
9 9 · «♦ 99
Tashiro, K., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87 (1990) 32003204 Tomioka, D., et al., Cancer Res. 61 (2001) 7518-7524 Tsutsumi, Y., et al., Thromb. Haemost. 77 (1997) 168-173 Tsutsumi et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553 Tsutsumi, Y., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 10061011
Uematsu, Y., et al., J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131-135 U.S. Patent Č. 5,672,662 US Patent Č. 5,932,462 U.S. Patent Č. 5,977,310
Weidner, K.M., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88 (1991)
7001-7005
WO 01/02017
WO 90/07938
WO 93/23541
WO 94/01451
WO 94/13322 ·
• 9 • · * ► ···· I
9· 99 · •9>« * » 9 9 9 ·99· 9
9 9 · 9
9 999 99 99
Claims (5)
1. Konjugát obsahující N-terminální fragment růstového faktoru hepatocytů (HGF/SF) složený z vlásenkové domény čtyř kringle oblastí α-řetězce a polyetylénové glykolové skupiny mající celkovou molekulovou váhu od zhruba 20 do 40 kDa.
2. Konjugát podle patentového nároku 1 charakterizovaný tím, že řečená polyetylén glykolová skupina má vzorec
-CO- (CH2) x- (OCH2CH2) mOR a řečená -CO skupina tvoří amidovou vazbu s jednou z amino skupin řečeného N-terminálního fragmentu růstového faktoru hepatocytů, kde
X je 2 nebo 3;
m je od zhruba 450 do zhruba 950;
R je (Ci-Ce)alkyl.
3. Konjugát podle patentového nároku 1 charakterizovaný tím, že řečená polyetylén glykolová skupina mé vzorec (CH£)yNHC0(0CH2CHJn0R
NHCO(OCH2CH2)pOR a řečená -CO skupina tvoří amidovou vazbu s jednou z amino skupin řečeného N-terminálního fragmentu růstového faktoru hepatocytů, kde y je 1 až 10;
nap spolu jsou od zhruba 450 do 950; a
R je (Ci-Cg)alkyl.
4. Konjugát podle patentových nároků 1 až 3 charakterizovaný tím, že řečená polyetylén glykolová skupina má molekulovou váhu od ·· ···· zhruba 30 do 40 kDa.
5. Konjugát podle patentových nároků 1 až 4 že řečená polyetylén glykolová monometoxypolyetylén glykolová skupina(y).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01104640A EP1234583A1 (en) | 2001-02-23 | 2001-02-23 | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20032511A3 true CZ20032511A3 (en) | 2004-03-17 |
Family
ID=8176596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20032511A CZ20032511A3 (en) | 2001-02-23 | 2002-02-21 | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030012775A1 (cs) |
| EP (2) | EP1234583A1 (cs) |
| JP (2) | JP2004521139A (cs) |
| KR (2) | KR20030072629A (cs) |
| CN (1) | CN100339393C (cs) |
| AR (1) | AR032574A1 (cs) |
| AU (1) | AU2002233354B2 (cs) |
| BG (1) | BG108125A (cs) |
| BR (1) | BR0207510A (cs) |
| CA (1) | CA2438308A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20032511A3 (cs) |
| EC (1) | ECSP034741A (cs) |
| GT (1) | GT200200038A (cs) |
| HR (1) | HRP20030659A2 (cs) |
| HU (1) | HUP0400979A2 (cs) |
| IL (1) | IL157426A0 (cs) |
| MA (1) | MA26998A1 (cs) |
| MX (1) | MXPA03007130A (cs) |
| NO (1) | NO20033737L (cs) |
| PA (1) | PA8540501A1 (cs) |
| PE (1) | PE20020992A1 (cs) |
| PL (1) | PL367402A1 (cs) |
| RU (1) | RU2293574C2 (cs) |
| SK (1) | SK11652003A3 (cs) |
| WO (1) | WO2002074344A2 (cs) |
| YU (1) | YU65103A (cs) |
| ZA (1) | ZA200306080B (cs) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004019991A2 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Scatter factor/hepatocyte growth factor antagonist nk4 for the treatment of glioma |
| WO2004085471A2 (en) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Novo Nordisk A/S | Glp-2 derivatives |
| ES2297673T3 (es) * | 2004-03-03 | 2008-05-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Metodo para la purificacion de un fragmento n-terminal del factor de crecimiento de hepatocitos. |
| JP2007525981A (ja) * | 2004-03-03 | 2007-09-13 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 肝細胞成長因子のｎ末端フラグメントを組み換え発現するための方法 |
| US20090202606A1 (en) * | 2008-01-25 | 2009-08-13 | Viromed Co., Ltd. | Treatment and Prevention of Cardiac Conditions Using Two or More Isoforms of Hepatocyte Growth Factor |
| CA2720611C (en) * | 2008-04-09 | 2016-07-12 | Viromed Co., Ltd. | Lyophilized dna formulations for enhanced expression of plasmid dna |
| CN102399293B (zh) * | 2008-06-03 | 2013-12-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种与纤维蛋白特异结合的重组蛋白及其应用 |
| US10532020B2 (en) | 2012-08-22 | 2020-01-14 | Revlon Consumer Products Corporation | Nail coatings having enhanced adhesion |
| CN106913865A (zh) | 2013-04-18 | 2017-07-04 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法 |
| EP3010527B1 (en) | 2013-06-17 | 2018-08-08 | Armo Biosciences, Inc. | Method for assessing protein identity and stability |
| CN105658232A (zh) | 2013-08-30 | 2016-06-08 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法 |
| RU2016122957A (ru) | 2013-11-11 | 2017-12-19 | Армо Байосайенсиз, Инк. | Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств |
| WO2015187295A2 (en) | 2014-06-02 | 2015-12-10 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of lowering serum cholesterol |
| AU2015333827A1 (en) | 2014-10-14 | 2017-04-20 | Armo Biosciences, Inc. | Interleukin-15 compositions and uses thereof |
| KR20170084033A (ko) | 2014-10-22 | 2017-07-19 | 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 | 질환 및 장애를 치료하기 위해 인터루킨-10을 사용하는 방법 |
| WO2016126615A1 (en) | 2015-02-03 | 2016-08-11 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| WO2016191587A1 (en) | 2015-05-28 | 2016-12-01 | Armo Biosciences, Inc. | Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer |
| WO2017035232A1 (en) | 2015-08-25 | 2017-03-02 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| BR112021012880A2 (pt) * | 2019-01-28 | 2021-11-16 | Toray Industries | Forma modificada por polietileno glicol de um fator de crescimento de hepatócito ou um fragmento ativo do mesmo, e, medicamento |
| BR112021012472A2 (pt) * | 2019-01-28 | 2021-11-30 | Toray Industries | Forma modificada por polietileno glicol de um fator de crescimento de hepatócito ou um fragmento ativo do mesmo, e, medicamento |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2181689T3 (es) | 1992-05-18 | 2003-03-01 | Genentech Inc | Variantes del factor de crecimiento de hepatocitos. |
| US6472178B1 (en) | 1998-02-27 | 2002-10-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof |
| GB9225448D0 (en) * | 1992-12-04 | 1993-01-27 | Erba Carlo Spa | Improved synthesis of polymer bioactive conjugates |
| KR100203824B1 (ko) * | 1994-03-31 | 1999-06-15 | 스티븐 엠. 오드리 | 거핵구 성장 및 분화를 자극하기 위한 조성물 및방법 |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| ATE257844T1 (de) * | 1995-03-10 | 2004-01-15 | Nakamura Toshikazu | Menschlicher wachstumsfaktor (hgf), verändert durch polyethylenglykol |
| ES2093593T1 (es) * | 1995-05-05 | 1997-01-01 | Hoffmann La Roche | Proteinas obesas (ob) recombinantes. |
| US6025324A (en) * | 1996-05-15 | 2000-02-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Pegylated obese (ob) protein compositions |
| WO1998031383A1 (en) | 1997-01-15 | 1998-07-23 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | Modified tumor necrosis factor |
| US6133426A (en) * | 1997-02-21 | 2000-10-17 | Genentech, Inc. | Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies |
| EP0922446A1 (en) * | 1997-12-03 | 1999-06-16 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates |
| EA003789B1 (ru) * | 1998-04-28 | 2003-10-30 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | КОНЪЮГАТЫ ПОЛИОЛ-β-ИНТЕРФЕРОН |
| US6420339B1 (en) * | 1998-10-14 | 2002-07-16 | Amgen Inc. | Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility |
| JO2291B1 (en) * | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
| CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
| US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| ES2361824T3 (es) * | 2000-12-20 | 2011-06-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugados de eritropoyetina (epo) con polietilenglicol (peg). |
-
2001
- 2001-02-23 EP EP01104640A patent/EP1234583A1/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-20 PA PA20028540501A patent/PA8540501A1/es unknown
- 2002-02-20 PE PE2002000144A patent/PE20020992A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-02-21 KR KR10-2003-7010748A patent/KR20030072629A/ko active Search and Examination
- 2002-02-21 JP JP2002573051A patent/JP2004521139A/ja not_active Withdrawn
- 2002-02-21 SK SK1165-2003A patent/SK11652003A3/sk unknown
- 2002-02-21 KR KR1020097002234A patent/KR20090020713A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-02-21 MX MXPA03007130A patent/MXPA03007130A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-02-21 CN CNB028052951A patent/CN100339393C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-21 PL PL02367402A patent/PL367402A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-02-21 EP EP02700263A patent/EP1389132A2/en not_active Withdrawn
- 2002-02-21 HU HU0400979A patent/HUP0400979A2/hu unknown
- 2002-02-21 AU AU2002233354A patent/AU2002233354B2/en not_active Ceased
- 2002-02-21 AR ARP020100593A patent/AR032574A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-02-21 WO PCT/EP2002/001837 patent/WO2002074344A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-02-21 BR BR0207510-5A patent/BR0207510A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-21 IL IL15742602A patent/IL157426A0/xx unknown
- 2002-02-21 CA CA002438308A patent/CA2438308A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-21 US US10/081,309 patent/US20030012775A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-21 CZ CZ20032511A patent/CZ20032511A3/cs unknown
- 2002-02-21 YU YU65103A patent/YU65103A/sh unknown
- 2002-02-21 RU RU2003127395/15A patent/RU2293574C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-22 GT GT200200038A patent/GT200200038A/es unknown
-
2003
- 2003-08-06 ZA ZA200306080A patent/ZA200306080B/en unknown
- 2003-08-19 HR HR20030659A patent/HRP20030659A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2003-08-19 MA MA27285A patent/MA26998A1/fr unknown
- 2003-08-21 EC EC2003004741A patent/ECSP034741A/es unknown
- 2003-08-22 NO NO20033737A patent/NO20033737L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-08-22 BG BG108125A patent/BG108125A/bg unknown
-
2007
- 2007-10-10 US US11/869,797 patent/US7846896B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-04-22 JP JP2010099120A patent/JP2010174034A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7846896B2 (en) | PEG conjugates of NK4 | |
| CA2942571C (en) | Conjugates of an il-15 moiety and a polymer | |
| AU2002233354A1 (en) | PEG-conjugates of HGT-NK4 | |
| EP1613274B1 (en) | Human il-18 substitution mutants and their conjugates | |
| EP1267942B1 (en) | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods | |
| US8299026B2 (en) | Derivatisation of erythropoietin (EPO) | |
| AU2006278490A1 (en) | Conjugates of a G-CSF moiety and a polymer | |
| EP1768700B1 (en) | Conjugates comprising gm-csf and a polymer | |
| ES2460671T3 (es) | Uso de eritropoyetina en el tratamiento de alteraciones de la distribución del hierro en enfermedades intestinales inflamatorias crónicas | |
| US20040110685A1 (en) | Scatter factor/hepatocyte growth factor antagonist NK4 for the treatment of glioma | |
| WO2003074089A1 (en) | Conjugates of the c domain of human gelatinase a and polyethylene glycol, methods of purification and uses thereof |