JP2007525981A - 肝細胞成長因子のn末端フラグメントを組み換え発現するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、HGFのアルファ−鎖又はそのフラグメント(NKポリペプチド)を、微生物宿主細胞における当該NKポリペプチドをコードする核酸の発現、変性型の当該NKポリペプチドを含む封入体の単離、封入体の可溶化、及び変性したNKポリペプチドの再生により産生するための方法であって、当該核酸において、位置33、35及び36のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも1つがCGTであることを特徴とする方法を提供する。
ヒトHGFはジスルフィド結合したヘテロダイマーであり、アミノ酸R494とV495の間の開列により、463アミノ酸のα−サブユニットと234アミノ酸のβ−サブユニットに開裂することができる。α鎖のN末端は、メチオニン基で始まる31アミノ酸により先行される。このセグメントは、31アミノ酸のシグナル配列を含む。α鎖はアミノ酸32で始まり、4つのクリングルドメインを含む。いわゆる「ヘアピンドメイン」は、アミノ酸70〜96から成る。クリングル1ドメインは、アミノ酸128〜206から成る。クリングル2ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸211〜288から成り、クリングル3ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸305〜383から成り、クリングル4ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸391〜469から成る。これらの配列にはバリエーションが存在し、本質的にNKポリペプチドの生物学的特性に影響を及ぼさない(特に、HGFに対するアンタゴニスト活性及び抗血管形成活性に影響を及ぼさない)。そのバリエーションは、例えばWO93/23541号に記載されている。また、生物学的特性に影響を及ぼさない限り、NKポリペプチドの長さは、2、3のアミノ酸の範囲内で変わり得る。
配列番号1:HGFのα−鎖をコードするDNA配列及びアミノ酸配列、元の配列はGenBank M73239に従っている(シグナル配列は含まない)
配列番号2:HGFのα−鎖のタンパク質配列
配列番号3:本発明のNK4をコードするDNA配列及びアミノ酸配列(N末端のメチオニンを含むアミノ酸配列、2つの終止コドンを含むDNA配列)
配列番号4:NK4のタンパク質配列
NKポリペプチドの組み換え体の発現
HGFのアミノ酸位置32〜478から成るNK4ポリペプチドを、クローニング及び大腸菌における組み換え体の発現に用いた。DNAのソースとして用いた元のDNA配列については記載されている(データベース識別子「gb:M73239」)。NK4をコードするDNA(配列番号:1)を増幅し、同時に変更するために、PCRを実施した。全ての方法を標準条件下で実施した。
− 真核生物のシグナルペプチド配列を除去し、NK4のアミノ酸位置32の隣にATG開始コドンを融合すること
− タンパク質産物(Metの含まれていない)の均質性を向上させるために、アミノ酸位置32(配列番号:2における位置2)をGlnからSerに置換すること
− E.コリにおける遺伝子発現を向上させるために、位置33(AGGからCGT)、35(AGAからCGT)、及び36(AGAからCGT)におけるアミノ酸のコドンのDNA配列を変更すること
− PCR産物のベクターへの挿入を容易にするために、位置477(ATAからATC)及び478(GTCからGTT)におけるコドンのDNA配列を変更すること
− NK4タンパク質ドメインの終点に対応する位置で翻訳を止めるために、位置479(TAA)及び480(TAG)に2つの翻訳終止コドンを導入すること。
可溶化及び再生
6Mのグアニジン塩酸塩、pH8.5の0.1Mリン酸カリウム(10MのKOHを用いた滴定による)、1mMのEDTA、0.01mMのDTTを含むバッファーに、封入体を一晩溶解した。溶解したタンパク質の濃度を、ビウレット試験により決定し、最終的に室温で25mg 全タンパク質/mlの濃度に調節した。
精製
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーにより、精製を実施した。
バッファーA:pH8.0の50mM トリス
バッファーB:pH8.0の50mM トリス、2M NaCl
5〜25% バッファーB、2カラム容積
25〜60% バッファーB、16カラム容積
60〜100% バッファーB、0.7カラム容積
100% バッファーB、2カラム容積
バッファーA:1Mの硫酸アンモニウム、pH8.0の50mMリン酸カリウム
バッファーB:pH8.0の50mMリン酸カリウム、40%のエチレングリコール
0〜100%のバッファーB、20カラム容量
活性の決定
a)細胞分散試験
MDCK細胞を、組織培養プレート中でサブコンフルエントに(subconfluently)成長させた。細胞をHGF(10ng/ml)又はHGFとNK4との組み合わせにより処理した。これらの実験においては、HGF誘導細胞の分散は、10〜1000倍モルの過剰のNK4の添加により、少なくとも90%以上が阻害され、機能的活性を示した。
Nakamura他(1989)に記載されているように、初代培養における成体ラット肝細胞のDNA合成を測定することにより、NK4によるHGFの有糸分裂活性の阻害を決定した。これらの実験においては、HGF誘導細胞の増殖は、10〜1000倍モルの過剰のNK4の添加により、少なくとも90%以上が阻害され、機能的活性を示した。
この試験においては、腫瘍細胞の浸潤能力を分析した。この試験は、HT115細胞を用いて、基本的にAlbini,A.,他(Cancer Res.47(1987)3239−3245)に記載の通りに行った。この場合も、HGF誘導(10ng/ml)細胞の浸潤は、10〜1000倍モルの過剰のNK4により、少なくとも90%以上が阻害され、機能的活性を示した。
Claims (4)
- 肝細胞成長因子のα−鎖又はそのN末端フラグメントをコードする核酸であって、当該核酸において、位置33、35及び36のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも1つがCGTであることを特徴とする核酸。
- 位置33、35及び36のアミノ酸のコドンがCGTであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸。
- 肝細胞成長因子のα−鎖又はそのN末端フラグメント(NKポリペプチド)を、微生物宿主細胞における当該NKポリペプチドをコードする核酸の発現、変性型の当該NKポリペプチドを含む封入体の単離、封入体の可溶化、及び変性したNKポリペプチドの再生により産生するための方法であって、当該核酸において、位置33、35及び36のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも1つがCGTであることを特徴とする方法。
- 位置33、35及び36のアミノ酸のコドンがCGTであることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
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