KR20080036561A

KR20080036561A - 조직 플라스미노겐 활성제의 재조합 형태의 제조 방법

Info

Publication number: KR20080036561A
Application number: KR1020077030937A
Authority: KR
Inventors: 빌루 모라와라 파텔
Original assignee: 아베스타 겐그레인 테크놀로지스 피브이티 리미티드
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2008-04-28
Also published as: JP2009507467A; CA2610391A1; EP1891214A2; WO2006129191A3; US20090246188A1; IL187401A0; AU2006253855A1; AP2007004251A0; RU2007147921A; BRPI0610958A2; CN101218344A; ZA200711008B; WO2006129191A2; MX2007015091A

Abstract

본 발명은 인간 조직 플라스미노겐 활성제 변이체의 가용성 형태의 제조에 사용되는 재조합 방법에 관한 것이다. 이 변이체에서, 내생의 조직 플라스미노겐 활성제의 103 위치의 트레오닌은 아스파라긴으로 치환되어 새로운 글리코실화 자리를 생성한다. 내생의 조직 플라스미노겐 활성제의 117 위치에서, 아스파라긴은 글루타민으로 치환되어 N 연결된 글리코실화 자리의 제거를 이끈다. 296-299 위치에서, 아미노산 라이신, 히스티딘, 아르기닌 및 아르기닌은 4 개의 알라닌 아미노산으로 치환된다. 본 발명은 또한 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 핵산 서열의 드 노보 합성, 구축된 핵산 서열의 컴피턴트 박테리아로의 형질전환, 및 원하는 단백질의 발현을 위한 그의 포유류 발현 벡터로의 서브-클로닝에 관한 것이다. 목적 유전자와 연관된 제어 요소를 포함하는 DNA 구축물이 개시된다. 본 발명에 따른 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성제 및 그의 염 및 기능성 유도체는 심장발작 및 심장마비 환자 치료의 치료용 약학 조성물의 유효 성분을 포함할 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 또다른 측면이다.

Description

조직 플라스미노겐 활성제의 재조합 형태의 제조 방법{A METHOD FOR OPTIMIZED PRODUCTION OF A RECOMBINANT FORM OF TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR}

본 발명은 인간 조직 플라스미노겐 활성제 변이체의 가용성 형태의 제조에 사용되는 재조합 방법에 관한 것이다. 이 변이체에서, 내생의 조직 플라스미노겐 활성제의 103 위치의 트레오닌은 아스파라긴으로 치환되어 새로운 글리코실화 자리를 생성한다. 내생의 조직 플라스미노겐 활성제의 117 위치에서, 아스파라긴은 글루타민으로 치환되어 N 연결된 글리코실화 자리의 제거를 이끈다. 296-299 위치에서, 아미노산 라이신, 히스티딘, 아르기닌 및 아르기닌은 4 개의 알라닌 아미노산으로 치환된다.

본 발명은 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 핵산 서열의 드 노보 합성, 구축된 핵산 서열의 컴피턴트 박테리아로의 형질전환, 및 원하는 단백질의 발현을 위한 그의 포유류 발현 벡터로의 서브-클로닝에 관한 것이다.

목적 유전자와 연관된 제어 요소를 포함하는 DNA 구축물이 개시된다.

본 발명에 따른 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성제 및 그의 염 및 기능성 유도체는 심장발작 및 심장마비 환자 치료의 치료용 약학 조성물의 유효 성분을 포함할 수 있다. 이 조성물도 본 발명의 또다른 측면이다.

플라스미노겐 활성제는, 지모겐 플라스미노겐을 활성화하여, 피브린을 분해하는 세린 프로테아나제 플라스민을 생성하는 효소이다. 플라스미노겐 활성제 중, 스트렙토키나아제, 유로키나아제 및 인간 조직 플라스미노겐 활성제 (t-PA)가 연구되었다. 이들 플라스미노겐 활성제 각각의 활성 메카니즘은 상이하다. 스트렙토키나아제는 플라스미노겐과 복합체를 형성하여 플라스민 활성을 생성하고, 유로키나아제는 플라스미노겐을 직접적으로 분할하고, t-PA 는 피브린 및 플라스미노겐과 삼원 (ternary) 복합체를 형성하여, 혈전 (clot) 위치에서 플라스미노겐을 활성화시킨다.

다중 도메인 (multidomain), 글리코실화된 세린 프로테아제인, 조직 유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA)는 플라스미노겐의 피브린 특이적 활성제이자 매우 효과적인 혈전용해제이다. t-PA 는 재조합 단백질로, 그 일차적 적용이 심장발작 및 심장마비 환자의 치료이다. 이는 그의 높은 피브린 특이성 및 생체 내에서 혈전을 용해시키는 강한 능력으로 인해, 각종 혈관 질환들의 치료에 중요하고 유력한 생물학적 약제로서 1979년 처음 특징화되었다.

천연 t-PA 는 약 6 분 이하의 혈장 반감기를 갖는다. 순환으로부터 이의 신속한 클리어런스(clearance)로 인하여, 혈전용해를 달성하기 위해 t-PA 는 주입되어져야 한다. t-PA의 증가된 농도가 프론트 로딩된(front loaded) 투약은, 표준 주입 프로토콜에 비해 보다 신속하고 완전한 용해를 나타내었으며, 초기 효능은 개선된 생존률과 상관된다. 볼러스 (bolus) 투여는 타겟 혈전을 보다 높은 농도의 효소에 신속히 노출시킴에 의해 용해속도를 더욱 개선할 수 있으나, 천연 또는 야 생형 (wt) t-PA의 단일한 볼러스 투여는, 이의 클리어런스 속도로 인해 일반적으로 사용될 수 없다.

많은 연구자들은 볼러스로서 투여될 수 있는 t-PA의 보다 긴 반감기 형태를 제조하였으나, 이러한 변이체는 거의 모두 현저히 저하된 피브린 분해 활성을 갖는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명의 목적은, 완전한 피브린 분해 활성을 유지하는 한편, 감소된 클리어런스 속도를 갖는 분자의 제조에 사용되는 재조합 방법을 제공하는 것이며, 계통적 돌연변이 연구가 t-PA에 그의 다양한 도메인 상에 적용되었다. 그러한 약물은 새로운 혈전에 대해, 보다 큰 친화성으로, 높은 특이성을 가질 수도 있을 것이며, 보다 적게 순환하는 플라스민을 생산할 것이다. 결과적으로, ICH 및 기타 비-대뇌성 출혈의 빈도가 보다 낮을 것이다. 이러한 약물은 PA1-1에 대한 내성을 가질 것이며, 또한 비용효과적일 것이다.

발명의 개요

본 발명은 인간 조직 플라스미노겐 활성제 변이체의 가용성 형태의 제조에 사용되는 재조합 방법에 관한 것이다. 이 변이체에서, 내생의 조직 플라스미노겐 활성제의 103 위치의 트레오닌은 아스파라긴으로 치환되어 새로운 글리코실화 자리를 생성한다. 내생의 조직 플라스미노겐 활성제의 117 위치에서, 아스파라긴은 글루타민으로 치환되어, N 연결된 글리코실화 자리의 제거를 이끈다. 296-299 위치에서, 아미노산 라이신, 히스티딘, 아르기닌 및 아르기닌은 4 개의 알라닌 아미노산으로 치환된다.

본 발명의 특정 측면은 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 핵산의 드 노보 합성, 구축된 핵산 서열의 컴피턴트 박테리아로의 형질전환, 및 원하는 단백질의 발현을 위한 그의 포유류 발현 벡터로의 서브-클로닝에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 측면은, 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 신규의 생물학적 기능적으로 필수적인 환형 플라스미드 DNA 벡터, 및 상기 벡터로 안정하게 형질전환 또는 형질감염된 숙주 유기체를 제공한다.

이에 대응하여, 그러한 형질전환된 숙주 세포, 특히 포유류 세포의, 외생의 벡터 유래된 DNA-서열의 대규모 발현을 촉진하는 조건 하에서의 배양 성장을 포함하는 유용한 폴리펩티드 제조 및 그 성장 배지로부터 원하는 폴리펩티드의 분리를 위한 신규 방법이 본 발명에 의해 제공된다.

도 및 서열의 상세한 설명

도 1. 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 DNA 뉴클레오티드 서열의 비-최적화 및 코돈-최적화된 형태의 짝 서열 정렬.

도 2. TNK-tPA 유전자의 확립된 서열과, 드 노보 합성된 TENECT cDNA (synthetic_TNK-tPA)의 서열 정렬.

도 3. TNK-tPA-Opt 유전자의 확립된 서열과 드 노보 합성된 TENECT-Opt cDNA (synthetic TNK-tPA-Opt)의 서열 정렬.

도 4: TENECT, TENECT-Opt 및 pcDNA3.1D/V5-His의 겔 정제된 제한효소 절단된 단편.

도 5: pcDNA3.1-TENECT D/V5-His/TNK-tPA 및 pcDNA3.1-TENECT-Opt /V5-His/TNK-tPA-Opt 의 추정적인 클론의 제한효소 절단 분석.

도 6: TENECT 및 TENECT-Opt cDNAs 를 절단하는 효소를 사용하는, PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA 및 PcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt 의 제한효소 절단 분석.

도 7. 구축 맵: PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA

도 8. 구축 맵: PcDNA3.1 -TENECT-Opt /V5-His/TNK-tPA-Opt

서열번호 1. 재조합 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 2. 재조합 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 코돈-최적화된 형태

발명의 상세한 설명

보다 고등의 진핵 시스템에서 재조합 단백질의 발현을 위한 몇몇 방법이 설명되어 왔다. CHO-K1, HEK293 (및 변이체) 세포 발현 시스템은 이제 포유류 단백질 발현을 위한 유력한 시스템 선택으로서 확립되었다. 벡터 구축의 정밀화 (refinments), 선택가능한 마커의 선택, 및 유전자-타겟팅 (gene-targeting) 및 높은 처리량의 스크리닝 전략에서의 진보는, 고특이적 생산성을 갖는 재조합 세포주의 확립을 비교적 일반적으로 만들었으며, 세포주 개발에 요구되는 시간을 감소시켰다. 전통적인 바이러스성-프로모터에 기초한 발현 벡터를 사용하는 발현 기술에서의 최근 진보는, 내부 리보솜 도입 자리 (IRES) 서열 또는 선택적인 접합 중 하나를 사용하는 비-시스트로닉 발현 전략의 발전 및 정밀화를 포함한다.

실시예 1

조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 DNA 서열을 드 노보 시도에 의해 합성하였다. 이 시도는 사용되는 특정 포유류 세포주에 대하여, 더 나은 코돈 최적화를 가능하게 한다. 나아가, 합성 DNA는, 천연적으로 존재하는 t-PA 의 생물학적 성질 뿐만 아니라 t-PA 의 생체 내 및 시험관 내 생물학적 활성 모두를 나타내는 분리가능한 양의 폴리펩티드를 제공하는 진핵성/원핵성 발현의 대상이 되었다.

재조합 조직 플라스미노겐 활성제 (TENECT 1)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 서열번호 1 에 나타내었다. CHO K1 및 HEK 293 과 같은 포유류 세포주에서의 최적 재조합 단백질 발현을 보장하기 위하여 코돈-최적화 공정의 일부로서 변경된 조직 플라스미노겐 활성제의 코딩 DNA 서열 중의 코돈을 대문자로 강조하여 나타내었다. 서열번호 2는 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 나타낸다 (TENECT 2).

조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 비-최적화 및 코돈 최적화된 뉴클레오티드의 짝 서열 정렬을 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 드 노보 합성된 cDNA 의 진정성(authenticity)의 확인

상용 서비스 제공자에 의해 제공된 것과 같은 드 노보 합성된 cDNA 분자의 진정성의 확인을, 자동화 DNA 서열결정에 의해 수행하고, 수득된 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.

실시예 3: pcDNA3 .1D/ V5 - His 포유류 세포-특이적 발현 벡터 내로의 TENECT 및 TENECT - Opt cDNAs 의 서브- 클로닝

상기 나타낸 것과 같은 자동화 DNA 서열결정에 의해 드 노보 합성된 cDNA 분자 (TENECT 및 TENECT-Opt)의 진정성의 확인에 이어, TENECT 및 TENECT-Opt 를 포유류 세포-특이적 발현 벡터 pcDNA3.1D/V5-His 내로 각각 서브-클로닝하여 형질감염-준비된 구축물을 생성하였다. 사용된 과정의 상세한 내용을 아래 나타내었다:

A. 시약 및 효소:

I: QIAGEN 겔 추출 키트 및 PCR 정제 키트

2. pcDNA 3.1D/V5-His 벡터 DNA (Invitrogen)

효소	공급자	U/μl	10x buffer
1. BamHI 2. Xhol 3. HindIII 4. Xhol 5. T4 DNA 리가아제	Bangalore Genei Bangalore Genei Bangalore Genei Bangalore Genei Bangalore Genei	10 10 20 10 40	버퍼 E 버퍼 E 버퍼 E 버퍼 E 리가아제 버퍼

모든 반응은 제조자에 의해 권장된 바에 따라 실시하였다. 각 반응에 대해, 공급된 10x 반응 버퍼를 1x 의 최종 농도로 희석하였다.

B. 벡터 및 인서트의 제한효소 절단:

● 과정

하기 DNA 시료 및 제한 효소가 사용되었다:

DNA 샘플	제한 효소
Rxn # 1 벡터 (TNK-tPA 클로닝용) Rxn # 2 벡터 (TNK-tPA-Opt 클로닝용) Rxn # 3 pBSK/ TNK-tPA (#5) Rxn # 4 pBSK/ TNK-tPA-Opt (#18)	BamHI/XhoI HindIII/XhoI BamHI/XhoI HindIII/XhoI

● 제한 효소 절단 반응:

성분	최종 농도	Rxn #1	Rxn # 2	Rxn # 3	Rxn # 4
물 10x 버퍼 DNA BamHI XhoI HindIII XhoI 10xBSA 최종 부피	- 1x - 0.5U 0.5U 1.0U 0.5U 1x 20μl	2μl 2μl 12μl 1μl 1μl - - 2l 20μl	2μl 2μl 12μl - - 1μl 1μl 2μl 20μl	2μl 2μl 12μl 1μl 1μl - - 2μl 20μl	9μl 2μl 5μl - - 1μl 1μl 2μl 20μl

반응물을 혼합하고, 스핀 다운시키고 (spun down), 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 제한효소 절단을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 예측된 절단 패턴이 관찰되었으며 이는 약 1700 pb 의 유전자 단편 탈락 (fall out) (Rxn #3 및 4 에 대해) 및 벡터의 경우 약 5.5 kb 의 벡터 주쇄 단편 (Rxn #1 및 2)이 나타나는 것으로 특징지어졌다. TENECT 및 TENECT-Opt cDNAs 를 나타내는 약 1700 bp DNA 단편을 QIAGEN 겔 추출 키트를 사용하는 겔 추출 방법에 의해 별도로 정제하였다. pcDNA3.1D/V5-His 포유류 발현 벡터의 약 5.5kb 절단된 벡터 주쇄도 동일한 키트를 사용하여 정제하였다. 필요 cDNA 및 벡터 DNA 단편의 제한효소 절단 및 겔 추출에 이어, 각 정제된 DNA 샘플의 분액 (1~2 마이크로리터)을 아가로오스 겔 전기영동을 사용하여 분석하여, 아래 도 4에 나타낸 것과 같이 순도 및 온전성 (integrity)을 확인하였다:

C. pcDNA3 .1D/ V5 - His 주쇄의 TENECT 및 TENECT - Opt cDNAs 와의 라이게이션 :

절단 및 정제된 벡터 및 인서트 단편의 DNA 농도를 평가하였다 (상기 도 4 참조) 및 라이게이션을 하기 방식으로 설정하였다:

성분	최종 농도	Rxn #1 (T-V)	Rxn # 2 ((T-V+1)	Rxn # 3 (T-Opt-V)	Rxn # 4 (T-Opt-V+1)
물 10x Rxn 버퍼 벡터 인서트 T4 DNA 리가아제 최종 부피	- 1 50ng 10ng/8ng 15U 20μl	15μl 2μl 2μl - 1μl 20μl	10μl 2μl 2μl 5μl 1μl 20μl	15μl 2μl 2μl - 1μl 20μl	9μl 2μl 2μl 6μl 1μl 20μl

반응물을 부드럽게 혼합하고, 스핀다운하고 실온에서 2~3 시간 동안 인큐베이션하였다. DH1O 컴피턴트 세포를 라이게이션 반응 혼합물의 내용물로 형질전환시켰다.

D. pcDNA3 .1- TENECT / V5 - His / TNK - tPA 및 pcDNA3.1D-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt의 추정적인 클론의 제한효소 절단 분석.

암피실린을 함유하는 L.B. 한천 플레이트 상에서 수득된 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 개별적으로 정제하였으며, 도 5에 나타낸 것과 같이, 분리된 플라스미드 DNA의 제한효소 절단 분석에 의해 원하는 cDNA 인서트의 존재를 확인하였다.

pcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA 및 pcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt를 함유하는 몇몇 추정적인 클론의 제한효소 절단 후 수득된 결과에 따라, 바람직한 제한 패턴을 나타낸 클론 중 일부를, TENECT 및 TENECT-Opt cDNAs 를 내부적으로 절단하여 도 6에 나타낸 것과 같은 다양한 크기의 단편을 생성하는 제한 효소를 사용하는 추가의 제한효소 절단 분석을 위해 선발하였다.

제한 맵핑 분석을 위해 선발된 대부분의 PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA 및 PcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt 클론은, 알고있는 내부 제한 자리의 존재에 기초하여 예측된 단편 크기를 산출하였으며, 이에 따라 이들 클론은 DNA 서열결정 분석에 의해 더욱 확인될 것이다.

드 노보 합성된 TENECT 및 TENECT-Opt cDNAs 를 사용하여 만들어진 재조합 발현 구축물의 맵을 도 7 및 8에 그림으로 나타내었다.

실시예 4: 인간 t- PA 구축물의 유지 및 증식:

인간 t-PA를 암호화하는 cDNA 구축물의 유지 및 증식은 표준 박테리아 배지에서 수행될 것이다. 모든 클론의 글리세롤 스톡(stock)은 -70℃에서 유지 및 저장될 수 있다.

실시예 5: CHO - K1 세포에서의 일시적이며 안정한 재조합 단백질 발현:

FDA가 치료적 단백질의 제조에 대해 승인한 포유류 세포주인, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)를 사용하여 인간 t-PA 의 일시적이고 안정한 발현을 수행하였다. 일시적인 발현은 구축물의 발현의 확인 및 소량의 재조합 단백질을 신속히 수득하는데 유용하다.

시험관 내 생분석 또는 ELISA 와 같은 수단을 사용하는, t-PA 의 발현을 위해 안정한 형질전환체를 스크리닝하고, 최고의 제조자 (producer)를 선발할 것이다. 동종의 안정한 세포주를 클론 희석하여 선발할 수 있으며, 그 후 증폭 및 동결하였다.

단백질 발현은, 웨스턴 블롯, ELISA, 및 기능적 분석과 같은 분석 수단을 이용하여 더욱 분석할 수 있다.

실시예 6: 재조합 조직 플라스미노겐 활성제의 정제

규제관할 기관의 지침에 따른, 바람직한 재조합 단백질을 과잉발현하는, 오염물이 없는 세포주의 수립에 뒤이어, 정제 전략은 정제 전략은 주요 목적으로서 프로세스 경제학, 시장에 대한 속도, 확장성(scalability), 재현성, 및 기능적 안정성 및 구조적 온전성을 갖는 제품의 최대 순도를 겨냥할 것이다. 이러한 취지로, 여과 (정상 및 접선 흐름 여과) 및 크로마토그래피 양자를 갖는 조합 접근이 개발될 것이다. 프로세스 자격 요건 및 수용 기준 연구를 3개의 배취에 대해 수행할 것이다.

따라서, 현재 발명은 정제 공정에서 또는 그 자체로서 알려진 표준 방법들의 하기 단계를 고려한다.

a. 정상 및 접선 흐름 여과 과정을 사용하는 조생의 배양액의 초기 정화 및 농축

b. 한외 여과/투석 여과 (접선 흐름 여과에 기초)

c. 크로모(chromo) 단계 - I: 헤파린, 라이신, 금속 (아연)킬레이트, 세파로오스 및 세파로오스에 고정화된 mab을 이용하는 친화성 크로마토그래피. 보다 바람직하게는, 라이신 세파로오스가 다운스트림 단위 조작에서 사용될 것이다.

e. 크로모 단계 - II: DEAE 셀룰로오스를 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피.

f. 바이러스 제거 및 멸균 여과

g. 내독소 제거

주: 추가적으로, 셀루파인 설페이트와 같은 플로 쓰루(flow through) 기재의 음이온 교환기가 공정 오염물, 내생/외래 미생물 바이러스 및 컬럼 추출가능물의 선택적인 결합에 사용될 것이다.

실시예 7: 생화학적, 면역학적 및 이화학적 방법을 이용한 표적 단백질의 동일성의 확립:

각 단계에서 총 단백질의 회수율은 비신코닌산(BCA) 절차/브래드포드 염료 결합 방법을 이용하여 정량화될 것이다. 표적 단백질 농도는 정제의 각 단계에서 천연 서열 t-PA 에 대해 표준화된 폴리클로날/모노클로날 항-tPA 항체를 사용하는 포획 ELISA 와 같은 매우 특이적이고, 신뢰성 있는 효소 기재 면역분석법을 이용하여 일과적으로 결정될 것이다. 정성적이고 표적 특이적인 웨스턴 분석이 각 단계에서 따를 것이다. 역상 크로마토그래피, 등전점 포커싱 및 2차원 겔 전기영동을 정제된 산물을 평가하기 위해 이용할 것이다. 2차 구조 분석은 원자외선 원평광 이색성을 이용하여 조사할 수 있다. 분자 질량 및 올리고머 상태를 크기 배제 및 MALDI-TOF를 이용하여 조사할 것이다. 상기 조사는 또한 pH 및 온도에 대한 단백질의 안정성에 집중할 것이다.

<110> Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd. Morawala Patell, Villoo <120> A method for production of a bioengimeered form of Tissue Plasminoagen Activator <130> 1 <150> 673/CHE/2005 <151> 2005-06-02 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1687 <212> DNA <213> Human <220> <221> exon <222> (1)..(1687) <400> 1 atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt gga 48 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 gca gtc ttc gtt tcg ccc agc cag gaa atc cat gcc cga ttc aga aga 96 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg 20 25 30 gga gcc aga tct tac caa gtg atc tgc aga gat gaa aaa acg cag atg 144 Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met 35 40 45 ata tac cag caa cat cag tca tgg ctg cgc cct gtg ctc aga agc aac 192 Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn 50 55 60 cgg gtg gaa tat tgc tgg tgc aac agt ggc agg gca cag tgc cac tca 240 Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser 65 70 75 80 gtg cct gtc aaa agt tgc agc gag cca agg tgt ttc aac ggg ggc acc 288 Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr 85 90 95 tgc cag cag gcc ctg tac ttc tca gat ttc gtg tgc cag tgc ccc gaa 336 Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu 100 105 110 gga ttt gct ggg aag tgc tgt gaa ata gat acc agg gcc acg tgc tac 384 Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr 115 120 125 gag gac cag ggc atc agc tac agg ggc aat tgg agc aca gcg gag agt 432 Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Asn Trp Ser Thr Ala Glu Ser 130 135 140 ggc gcc gag tgc acc aac tgg caa agc agc gcg ttg gcc cag aag ccc 480 Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro 145 150 155 160 tac agc ggg cgg agg cca gat gcc atc agg ctg ggc ctg ggg aac cac 528 Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His 165 170 175 aac tac tgc aga aac cca gat cga gac tca aag ccc tgg tgc tac gtc 576 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val 180 185 190 ttt aag gcg ggg aag tac agc tca gag ttc tgc agc acc cct gcc tgc 624 Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys 195 200 205 tct gag gga aac agt gac tgc tac ttt ggg aat ggg tca gcc tac cgt 672 Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg 210 215 220 ggc acg cac agc ctc acc gag tcg ggt gcc tcc tgc ctc ccg tgg aat 720 Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn 225 230 235 240 tcc atg atc ctg ata ggc aat gtt tac aca gca cag aac ccc agt gcc 768 Ser Met Ile Leu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala 245 250 255 cag gca ctg ggc ctg ggc aaa cat aat tac tgc cgg aat cct gat ggg 816 Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly 260 265 270 gat gcc aag ccc tgg tgc cac gtg ctg aag aac cgc agg ctg acg tgg 864 Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp 275 280 285 gag tac tgt gat gtg ccc tcc tgc tcc acc tgc ggc ctg aga cag tac 912 Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr 290 295 300 agc cag cct cag ttt cgc atc aaa gga ggg ctc ttc gcc gac atc gcc 960 Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala 305 310 315 320 tcc cac ccc tgg cag gct gcc atc ttt gcc gcg gcc gcg gcg tcg ccc 1008 Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro 325 330 335 gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc ata ctc atc agc tcc tgc tgg att 1056 Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile 340 345 350 ctc tct gcc gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccg ccc cac cac ctg 1104 Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu 355 360 365 acg gtg atc ttg ggc aga aca tac cgg gtg gtc cct ggc gag gag gag 1152 Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu 370 375 380 cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac att gtc cat aag gaa ttc gat gat 1200 Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp 385 390 395 400 gac act tac gac aat gac att gcg ctg ctg cag ctg aaa tcg gat tcg 1248 Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser 405 410 415 tcc cgc tgt gcc cag gag agc agc gtg gtc cgc act gtg tgc ctt ccc 1296 Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro 420 425 430 ccg gcg gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gag ctc tcc ggc 1344 Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly 435 440 445 tac ggc aag cat gag gcc ttg tct cct ttc tat tcg gag cgg ctg aag 1392 Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys 450 455 460 gag gct cat gtc aga ctg tac cca tcc agc cgc tgc aca tca caa cat 1440 Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His 465 470 475 480 tta ctt aac aga aca gtc acc gac aac atg ctg tgt gct gga gac act 1488 Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr 485 490 495 cgg agc ggc ggg ccc cag gca aac ttg cac gac gcc tgc cag ggc gat 1536 Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp 500 505 510 tcg gga ggc ccc ctg gtg tgt ctg aac gat ggc cgc atg act ttg gtg 1584 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val 515 520 525 ggc atc atc agc tgg ggc ctg ggc tgt gga cag aag gat gtc ccg ggt 1632 Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly 530 535 540 gtg tac acc aag gtt acc aac tac cta gac tgg att cgt gac aac atg 1680 Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met 545 550 555 560 cga ccg t 1687 Arg Pro <210> 2 <211> 1689 <212> DNA <213> Human <220> <221> exon <222> (1)..(1689) <400> 2 atg gat gcc atg aag aga ggt ctg tgc tgc gtc ttg ctg ctg tgc gga 48 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 gcg gtc ttc gtg tcc ccc tcc cag gaa atc cac gca agg ttc agg cgg 96 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg 20 25 30 ggc gcc cgg tcg tat cag gtc atc tgc cgt gat gag aag acc cag atg 144 Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met 35 40 45 atc tac cag cag cac caa tcc tgg ctg aga ccc gtc ctg agg tcc aac 192 Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn 50 55 60 cgg gtg gag tac tgt tgg tgt aac agt ggt cga gcc caa tgc cat tcc 240 Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser 65 70 75 80 gtt ccc gtg aag agc tgt tcc gag ccc cgc tgc ttc aac ggc ggc aca 288 Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr 85 90 95 tgt cag cag gct ctt tac ttt tca gat ttc gtg tgc caa tgt cct gaa 336 Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu 100 105 110 ggc ttc gcc ggc aag tgc tgt gag atc gac aca cgc gcg aca tgt tac 384 Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr 115 120 125 gag gat cag ggg ata tcc tac cgc ggt aac tgg tcg acg gca gag tcc 432 Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Asn Trp Ser Thr Ala Glu Ser 130 135 140 gga gcc gaa tgt acc aac tgg cag agt tcc gcc ctg gcg cag aag cca 480 Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro 145 150 155 160 tac tcg ggg cgc cgg cca gac gcc atc cgc ctg ggc cta ggc aac cac 528 Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His 165 170 175 aac tac tgt cga aac ccc gac agg gac tcc aag ccc tgg tgt tac gtc 576 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val 180 185 190 ttc aag gca ggt aag tac tcc tcc gag ttc tgc tct acc cca gcc tgc 624 Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys 195 200 205 tcg gaa ggt aat tct gac tgc tat ttt ggt aac ggc agt gcc tac cgc 672 Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg 210 215 220 ggc acg cac tcc ctg aca gag tcc gga gcc tca tgc ctg cca tgg aac 720 Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn 225 230 235 240 tcc atg ata tta atc ggc aac gtc tac acc gcc cag aac ccg agc gcg 768 Ser Met Ile Leu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala 245 250 255 cag gcc ctg ggc ctc ggc aag cac aac tac tgt cgg aat cct gac ggg 816 Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly 260 265 270 gac gca aaa cca tgg tgc cac gtc ttg aag aac cgc cgc ctc aca tgg 864 Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp 275 280 285 gag tac tgc gac gtg ccc tcg tgt tcg acc tgc gga ctc aga cag tac 912 Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr 290 295 300 tcg cag ccc cag ttc cgg atc aaa gga ggc tta ttc gcc gat atc gct 960 Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala 305 310 315 320 tcg cac ccc tgg caa gcc gcc atc ttc gca gcc gcg gcc gcg tcc ccc 1008 Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro 325 330 335 ggg gaa cgc ttc ctg tgc ggt ggc atc ctg atc agt agt tgc tgg atc 1056 Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile 340 345 350 ctg tca gcg gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccc cca cac cac ctg 1104 Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu 355 360 365 act gtc atc ctg gga aga acc tac cgc gtg gtg cca ggg gaa gag gag 1152 Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu 370 375 380 cag aaa ttc gaa gtg gag aag tac att gtg cat aag gaa ttc gac gac 1200 Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp 385 390 395 400 gac acg tac gac aac gac atc gcc ttg ctg cag ctg aag tcg gac agc 1248 Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser 405 410 415 tcc cgc tgc gcc caa gaa tcg tcc gtg gtt agg acg gtg tgc ctc ccc 1296 Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro 420 425 430 cct gct gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gaa ctg tcg ggg 1344 Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly 435 440 445 tac ggc aag cac gag gcg ctc tcc cca ttc tac agc gag cgc ctc aag 1392 Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys 450 455 460 gaa gcc cac gtg cgc ctg tac ccc agt tcc agg tgc acc tct cag cac 1440 Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His 465 470 475 480 ttg ctg aac cgc act gtt acc gac aat atg ctg tgt gcc ggt gat acc 1488 Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr 485 490 495 agg tcc ggg ggc cct cag gcc aat ctg cat gac gcg tgc cag ggg gac 1536 Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp 500 505 510 tcc ggc ggg ccc ctg gtg tgt ttg aac gat gga agg atg acc ctg gtc 1584 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val 515 520 525 ggg atc atc tct tgg ggc ctg ggc tgc ggc cag aag gat gtg cca ggc 1632 Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly 530 535 540 gtc tac acc aag gtg acg aac tac ctg gac tgg att cgc gac aac atg 1680 Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met 545 550 555 560 agg ccc tga 1689 Arg Pro

Claims

하기 단계를 포함하는, 생체 내 생물학적으로 활성인 조직 플라스미노겐 활성제의 제조 방법:

(a) 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 분리된 DNA 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포를, 적절한 영양 조건 하에서, 배양하는 단계: (i) 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타낸 DNA 서열, 또는 (ii) 상기 (i) 및 (ii)에 정의된 DNA 서열에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 DNA 서열 또는 그의 상보 가닥; 및

(b) 상기 재조합 조직 플라스미노겐 활성제 생성물을 그로부터 분리하는 단계.
조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는, 서열번호 1 또는 2에 나타낸 합성 DNA 서열로 숙주 세포를 형질전환하고, 상기 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 상기 생성물을 분리하는 단계를 포함하는 생체 내 생물학적으로 활성인 조직 플라스미노겐 활성제 생성물의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 숙주 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 숙주 세포가 바람직하게는 CHO K1 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
하기 단계를 포함하는, 심장발작 및 심장마비를 치료하는 생체 내 생물학적 성질을 갖는 조직 플라스미노겐 활성제의 가용성 형태의 제조방법:

a) 조직 플라스미노겐 활성제 프로모터 DNA 외에, 서열번호 3의 성숙한 에리트로포이에틴 아미노산 서열을 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 프로모터 DNA 를 포함하는 포유류 세포를 적절한 영양 조건 하에서 배양하는 단계; 및

b) 상기 세포에 의해 발현된 글리코실화된 에리트로포이에틴 폴리펩티드를 분리하는 단계.
제 5 항에 있어서, 프로모터 DNA 가 바이러스성 프로모터 DNA 인 것을 특징으로 하는 방법.
도 7 또는 8의 벡터 구축물로 숙주 세포를 형질전환하는 단계 및 상기 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 조직 플라스미노겐 활성제 생성물을 분리하는 단계를 포함하는 생체 내 생물학적으로 활성인 조직 플라스미노겐 활성제 생성물의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 벡터가 포유류 세포 특이적 벡터이고, 가장 바람직하게는 도 7 및 8에 나타낸 것과 같은 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
배양물에서 키운 포유류 세포로부터 정제된, 치료학적 유효량의 인간 조직 플라스미노겐 활성제 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 보조제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.