CN101218344A - 一种生产生物工程化形式的组织型纤溶酶原激活因子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产可溶形式的人组织型纤溶酶原激活因子变体的重组方法。在该变体中，内源的组织型纤溶酶原激活因子的103位苏氨酸被天门冬酰胺替换，以出现新的糖基化位点。内源的组织型纤溶酶原激活因子117位的天门冬酰胺被谷氨酰胺替换，从而除去了N连接糖基化位点。在296－299位，赖氨酸、组氨酸、精氨酸和精氨酸被四个丙氨酸替换。本发明还涉及编码组织型纤溶酶原激活因子的核酸序列的从头合成，将构建的核酸序列转化进感受态细菌并将其亚克隆进哺乳动物表达载体以表达期望的蛋白质。包括与目的基因结合的控制元件的DNA构建体已被公开。在本发明中的重组人组织型纤溶酶原激活因子、及其盐和功能性衍生物可以构成治疗心脏病发作和中风患者的药物组合物的活性成分。这些组合物是本发明的另一个方面。

Description

一种生产生物工程化形式的组织型纤溶酶原激活因子的方法
发明领域
本发明涉及用于生产可溶形式的人组织型纤溶酶原激活因子变体的重组方法。在该变体中，内源组织型纤溶酶原激活因子的103位苏氨酸被天门冬酰胺替换，以出现新的糖基化位点。内源组织型纤溶酶原激活因子117位的天门冬酰胺被谷氨酰胺替换，从而除去N连接糖基化位点。在296-299位，赖氨酸、组氨酸、精氨酸和精氨酸被四个丙氨酸替换。
本发明还涉及编码组织型纤溶酶原激活因子的核酸序列的从头合成，将构建的核酸序列转化进感受态细菌并将其亚克隆进哺乳动物表达载体以表达期望的蛋白质。
包括与目的基因结合的控制元件的DNA构建体已被公开。
本发明的重组人组织型纤溶酶原激活因子、及其盐和功能性衍生物可以构成治疗心脏病发作和中风患者的药物组合物的活性成分。这些组合物是本发明的另一个方面。
发明背景
纤溶酶原激活因子是活化纤溶酶原以产生丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶(降解纤维蛋白)的酶。在被研究的纤溶酶原激活因子之中，有链激酶、尿激酶和人组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)。这些纤溶酶原激活因子各自的作用机制是不同的。链激酶与纤溶酶原形成复合体而产生纤溶酶活性，尿激酶直接剪切纤溶酶原，而t-PA是与纤维蛋白和纤溶酶原形成三元复合体，在血块位置处活化纤溶酶原。
组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)，一种多结构域、糖基化的丝氨酸蛋白酶，是纤维蛋白特异的纤溶酶原激活因子和非常有效的溶栓剂。t-PA是一种重组蛋白，主要应用于心脏病发作和中风患者。最早于1979年，就将其描述为一种重要和有效的治疗各种血管疾病的生物药物，因为它的高纤维蛋白特异性和体内有效的溶解血块能力。
天然t-PA的血浆半衰期大约为6分钟或更短。因为它被快速从循环系统清除，t-PA必须靠输注以达到溶栓效果。以提高浓度的t-PA前载给药(front loadeddosing)显示出比标准输注方案更快更完全的溶解，而早期的有效性与改善的存活率相关。推射可以进一步提高溶解速率，因为这样能使较高浓度的酶快速与目标血块接触，但是因为清除速度过快，天然或野生型(wt)t-PA的单一推注给药并不能被普遍应用。
很多研究者生产出了更长半衰期的t-PA品种，这些t-PA可以推注给药，但发现绝大多数变体的纤维蛋白溶解活性都显著下降。
这样，本发明的目的是提供重组方法，用于生产在保留全部溶纤活性的同时具有减小的清除速率的分子，在t-PA的不同结构域做了系统突变研究。该药物还对新近形成的血栓有高特异性以及更强的亲和力，并且产生较少的循环性纤溶酶。因此，ICH和其它非脑部出血事件的发生率也会更低。该药对PAI-I具有抗性并且成本低。
发明概述
本发明涉及用于生产可溶形式的人组织型纤溶酶原激活因子变体的重组方法，在该变体中，内源的组织型纤溶酶原激活因子103位的苏氨酸被天门冬酰胺替换以产生新的糖基化位点。内源的组织型纤溶酶原激活因子117位的天门冬酰胺被谷氨酰胺替换，以去除N连接糖基化位点。在296-299位，赖氨酸、组氨酸、精氨酸和精氨酸被四个丙氨酸替换。
本发明一个特定方面涉及编码组织型纤溶酶原激活因子的核酸序列的从头合成、将构建的核酸序列转化进感受态细菌并将其亚克隆进哺乳动物表达载体以表达期望的蛋白。
本发明的再一个方面提供了并入了本发明DNA序列的新的具生物功能的环形质粒DNA载体，以及以所述载体稳定转化或转染的宿主。
本发明相应地提供了生产有用多肽的新方法，包括在有利于外源的、质粒携带的DNA序列大规模表达的条件下培养这类转化宿主细胞，特别是哺乳动物细胞，以及从培养基、溶胞产物或细胞膜组分中分离期望的多肽。
附图和序列详细说明
图1.编码组织型纤溶酶原激活因子的未经优化和经密码子优化形式的DNA核苷酸序列的配对序列对比
图2.从头合成的TENCT cDNA(合成的TNK-tPA)与TNK-tPA基因的确认序列的序列对比
图3.从头合成的TENECT-Opt cDNA(合成的TNK-tPA-Opt)与TNK-tPA-Opt基因的确认序列的序列比对
图4：凝胶纯化的TENECT、TENECT-Opt和pcDNA3.1D/V5-His的限制性酶切片段。
图5：限制性酶切分析pcDNA3.1-TENECT D/V5-His/TNK-tPA和pcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt的假定克隆。
图6：使用内部剪切TENECT和TENECT-Opt cDNA的酶，对PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA和PcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt克隆的限制性酶切分析。
图7.结构图：PcDNA3.1-TEMECT/V5-His/TNK-tPA
图8.结构图：PcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt
SEQ ID.No.1.编码重组组织型纤溶酶原激活因子的核苷酸序列
SEQ ID.No.2.编码重组组织型纤溶酶原激活因子的经密码子优化形式的核苷酸序列
发明详细说明
对于在高等真核系统中表达重组蛋白的几种方法已有阐述。CHO-K1、HEK-293(及其变体)细胞表达系统现已确立为哺乳动物蛋白表达的优选系统。载体构建的优化、可选标记的选择和基因打靶及高通量筛选策略的进步使得建立具有高特异性产量的重组细胞系变得比较普通，也节约了培养细胞系所需的时间。在使用传统的基于病毒启动子的表达载体的表达技术上的最新进展包括使用内部核糖体进入位点(IRES)序列或可变剪接的双顺反子表达策略的发展和优化。
实施例1
编码组织型纤溶酶原激活因子的DNA序列由从头合成方法得到。该方法可更有利于就特定细胞系进行更好的密码子优化。并且，使合成的DNA成为真核/原核表达的对象，提供可分离量的多肽，该多肽表现出天然产生的t-PA的生物学性质以及t-PA在体内和体外的生物活性。
编码重组组织型纤溶酶原激活因子的核苷酸序列(TENECT1)如SEQID.No.1中所示。组织型纤溶酶原激活因子的编码DNA序列中的密码子已经作为密码子优化过程的一部分被改变，以确保在诸如CHO K1和HEK293的哺乳动物细胞系中优化的重组蛋白表达，这些经改变的密码子用大写字母高亮显示。SEQ ID.No.2表示编码组织型纤溶酶原激活因子的经密码子优化的核苷酸序列(TENECT2)
编码组织型纤溶酶原激活因子的未经优化和经密码子优化的核苷酸序列的配对序列对比如图1所示。
实施例2：确认编码组织型纤溶酶原激活因子的从头合成的cDNA的真实性
商业服务提供商所提供的从头合成的cDNA的真实性是通过DNA自动测序进行确认的，所得结果描述在图2和3中。
实施例3：将TENECT和TENECT-Opt cDNAs亚克隆进pcDNA3.1D/V5-His哺乳动物细胞特异表达载体
在如上所示通过DNA自动测序以验证从头合成的cDNA分子(TENECT和TENECT-Opt)的真实性之后，TENECT和TENECT-Opt被分别亚克隆进哺乳动物细胞特异表达载体pcDNA3.1D/V5-His，生成用于转染的构建体。采用的方法详述如下：
A.试剂和酶
1.QIAGEN凝胶抽提试剂盒和PCR纯化试剂盒
2.pcDNA 3.1D/V5-His载体DNA(Invitrogen)
  酶   供应商   U/μl   10×缓冲液
  1.BamHI   Bangalore Genei   10   缓冲液E
  2.Xhol   Bangalore Genei   10   缓冲液E
  3.HindIII   Bangalore Genei   20   缓冲液E
  4.Xhol   Bangalore Genei   10   缓冲液E
  5.T4DNA连接酶   Bangalore Genei   40   连接酶缓冲液
所有的反应都按制造商建议进行。在每个反应中，提供的10X反应缓冲液都被稀释成为最终浓度1X。
B.载体和插入序列的限制性酶切
●步骤
使用以下的DNA样本和限制性酶：
Figure A20068001909200071
●限制性酶切反应
Figure A20068001909200081
将反应物混合、离心并在37℃孵育2小时。限制性酶切产物由琼脂糖凝胶电泳分析。观察到期望的酶切图谱，其以被切下的约1700bp(对于Rxn#3和4)基因片段为特征，并且观察到约5.5kb的载体骨架片段(Rxn#1和2)。代表TENECT和TENECT-Opt cDNAs的约1700bp DNA片段通过使用QIAGEN凝胶抽提试剂盒的凝胶抽提法分别纯化。pcDNA3.1D/V5-His哺乳动物表达载体酶切后的约5.5kb载体骨架也用同样的试剂盒纯化。在所需cDNA和载体DNA片段的限制酶切和凝胶提取后，各取一份(1-2微升)纯化DNA样品用琼脂糖凝胶电泳检查纯度和完整性，如以下图4所示：
C.pcDNA3.1D/V5-His骨架与TENECT和TENECT-Opt cDNA的连接：
估算经酶切并纯化的载体和插入片段的DNA浓度(参考上面图4)，连接按以下方式设定：
将反应物温和地混合、离心并温室孵育2-3小时。以连接反应混合物内容物转化DH10感受态细胞。
D.限制性酶切分析pcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA和pcDNA3.1D- TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt的假定克隆。
分别从在含氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上获得的克隆中纯化质粒DNA，并通过限制性酶切分析分离的质粒DNA，以确认期望的cDNA插入片段的存在，如图5所示。
按照限制性酶切几个带有pcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA和pcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt的假定克隆后所得到的结果，选出一些表现出期望限制性模式的克隆用于进一步的限制性酶切分析，该限制性酶切分析使用内部切割TENECT和TENECT-Opt cDNA的限制性酶以产生不同大小的片段，如图6所示。
基于已知的限制性内部位点，大多数选出用于限制性酶切谱分析的PcDNA3.1-TENECT/VS-His/TNK-tPA和PcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt克隆都得到了预期的片段大小，因此这些克隆将用DNA测序分析进一步确认。
使用从头合成的TENECT和TENECT-Opt cDNA构建的重组表达载体图如图7和图8所示。
实施例4：人t-PA构建体的保存与增殖
编码人t-PA的cDNA构建体的保存与增殖是在标准细菌培养物中进行。所有克隆的甘油菌(glycerol stock)均维持和保存在-70℃。
实施例5：CHO-K1细胞中重组蛋白的瞬时和稳定表达。
使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，一种FDA认可的用于生产治疗用蛋白的哺乳动物细胞系，进行人t-PA的瞬时和稳定表达。瞬时表达可用于检测构建体表达和快速获得小量的重组蛋白。
使用像体外生测或ELISA等方法筛选表达t-PA的稳定转染体，选择最好的生产细胞。同质稳定细胞系可用克隆稀释法选择，然后进行扩增和冻存。
使用像Western印迹、ELISA和功能检测等方法进一步分析蛋白表达情况。
实施例6：重组组织型纤溶酶原激活因子的纯化
按照管理机构指南建立过量表达所需重组蛋白的无污染细胞系之后，纯化策略将以步骤经济、加速上市、可扩展性(scalability)、可重现性和最大产品纯度为目标，而功能稳定和结构完整为主要目标。为了到达这一效果，可开发带有过滤(常规和切向流过滤)和层析这二者的的组合方案。工艺合格要求和验收标准的研究将在3批样品中实施。
质控步骤要求和验收标准的研究将在3批样品中实施。
相应地，本发明考虑了在纯化过程中和或本身为已知的标准方法的以下步骤：
a.使用常规和切向流步骤对粗培养基进行初步纯化和浓缩
b.超滤/透析过滤(基于切向流过滤)
c.色谱步骤-I：利用肝素、赖氨酸、金属(锌)螯合物Sepharose和固定至Sepharose的多克隆抗体进行亲合层析。更优选的是，在下游单元操作使用赖氨酸Sepharose。
e.色谱步骤-II：使用DEAE纤维素进行阴离子交换层析
f.除病毒和无菌过滤
g.除去内毒素
注意：另外，基于流出物的阴离子交换剂，如硫酸cellufine可被用于工艺污染物、内原性/外来病毒和柱可提取物的选择性结合。
实施例7：使用生物化学、免疫和物理化学方法确认目标蛋白身份
使用二喹啉甲酸方法(BCA)/Bradford染料结合方法测定每一步总蛋白质的回收率。在纯化每个阶段目标蛋白浓度将被例行测定，测定使用高特异性和高可靠性的基于酶的免疫测定技术，比如使用抗tPA的多克隆/单克隆抗体的捕获ELISA法，这些抗体以天然的序列t-PA作为标准。在每个步骤后，都要进行定性的和目标蛋白特异性western分析。使用反相色谱法、等电点聚焦和双向凝胶电泳来评价纯化产品。使用远紫外圆二色谱进行二级结构分析。使用体积排阻色谱和MALDI-TOF检测分子量和低聚状态。该研究也注意蛋白质与pH和温度有关的稳定性。
序列表
<110>Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd.
     Morawala Patell，Villoo
<120>一种生产生物工程化形式的组织型纤溶酶原激活因子的方法
<130>1
<150>673/CHE/2005
<151>2005-06-02
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1687
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>外显子
<222>(1)..(1687)
<400>1
atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt gga
   48
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                   10                  15
gca gtc ttc gtt tcg ccc agc cag gaa atc cat gcc cga ttc aga aga
   96
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg
            20                  25                  30
gga gcc aga tct tac caa gtg atc tgc aga gat gaa aaa acg cag atg
  144
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met
        35                  40                  45
ata tac cag caa cat cag tca tgg ctg cgc cct gtg ctc aga agc aac
  192
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn
    50                  55                  60
cgg gtg gaa tat tgc tgg tgc aac agt ggc agg gca cag tgc cac tca
  240
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser
65                  70                  75                  80
gtg cct gtc aaa agt tgc agc gag cca agg tgt ttc aac ggg ggc acc
  288
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
                85                  90                  95
tgc cag cag gcc ctg tac ttc tca gat ttc gtg tgc cag tgc ccc gaa
  336
Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu
            100                 105                 110
gga ttt gct ggg aag tgc tgt gaa ata gat acc agg gcc acg tgc tac
  384
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr
        115                 120                 125
gag gac cag ggc atc agc tac agg ggc aat tgg agc aca gcg gag agt
  432
Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Asn Trp Ser Thr Ala Glu Ser
    130                 135                 140
ggc gcc gag tgc acc aac tgg caa agc agc gcg ttg gcc cag aag ccc
  480
Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro
145                 150                 155                 160
tac agc ggg cgg agg cca gat gcc atc agg ctg ggc ctg ggg aac cac
  528
Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His
                165                 170                 175
aac tac tgc aga aac cca gat cga gac tca aag ccc tgg tgc tac gtc
  576
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val
            180                 185                 190
ttt aag gcg ggg aag tac agc tca gag ttc tgc agc acc cct gcc tgc
  624
Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys
        195                 200                 205
tct gag gga aac agt gac tgc tac ttt ggg aat ggg tca gcc tac cgt
  672
Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg
    210                 215                 220
ggc acg cac agc ctc acc gag tcg ggt gcc tcc tgc ctc ccg tgg aat
  720
Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn
225                 230                 235                 240
tcc atg atc ctg ata ggc aat gtt tac aca gca cag aac ccc agt gcc
  768
Ser Met Ile Leu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala
                245                 250                 255
cag gca ctg ggc ctg ggc aaa cat aat tac tgc cgg aat cct gat ggg
  816
Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly
            260                 265                 270
gat gcc aag ccc tgg tgc cac gtg ctg aag aac cgc agg ctg acg tgg
  864
Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp
        275                 280                 285
gag tac tgt gat gtg ccc tcc tgc tcc acc tgc ggc ctg aga cag tac
  912
Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr
    290                 295                 300
agc cag cct cag ttt cgc atc aaa gga ggg ctc ttc gcc gac atc gcc
  960
Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala
305                 310                 315                 320
tcc cac ccc tgg cag gct gcc atc ttt gcc gcg gcc gcg gcg tcg ccc
 1008
Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro
                325                 330                 335
gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc ata ctc atc agc tcc tgc tgg att
 1056
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile
            340                 345                 350
ctc tct gcc gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccg ccc cac cac ctg
 1104
Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu
        355                 360                 365
acg gtg atc ttg ggc aga aca tac cgg gtg gtc cct ggc gag gag gag
 1152
Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu
    370                 375                 380
cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac att gtc cat aag gaa ttc gat gat
 1200
Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp
385                 390                 395                 400
gac act tac gac aat gac att gcg ctg ctg cag ctg aaa tcg gat tcg
 1248
Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser
                405                 410                 415
tcc cgc tgt gcc cag gag agc agc gtg gtc cgc act gtg tgc ctt ccc
 1296
Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro
            420                 425                 430
ccg gcg gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gag ctc tcc ggc
 1344
Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly
        435                 440                 445
tac ggc aag cat gag gcc ttg tct cct ttc tat tcg gag cgg ctg aag
 1392
Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys
    450                 455                 460
gag gct cat gtc aga ctg tac cca tcc agc cgc tgc aca tca caa cat
 1440
Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His
465                 470                 475                 480
tta ctt aac aga aca gtc acc gac aac atg ctg tgt gct gga gac act
 1488
Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr
                485                 490                 495
cgg agc ggc ggg ccc cag gca aac ttg cac gac gcc tgc cag ggc gat
 1536
Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
            500                 505                 510
tcg gga ggc ccc ctg gtg tgt ctg aac gat ggc cgc atg act ttg gtg
 1584
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val
        515                 520                 525
ggc atc atc agc tgg ggc ctg ggc tgt gga cag aag gat gtc ccg ggt
 1632
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly
    530                 535                 540
gtg tac acc aag gtt acc aac tac cta gac tgg att cgt gac aac atg
 1680
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met
545                 550                 555                 560
cga ccg t
 1687
Arg Pro
<210>2
<211>1689
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>外显子
<222>(1)..(1689)
<400>2
atg gat gcc atg aag aga ggt ctg tgc tgc gtc ttg ctg ctg tgc gga
   48
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                   10                  15
gcg gtc ttc gtg tcc ccc tcc cag gaa atc cac gca agg ttc agg cgg
   96
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg
            20                  25                  30
ggc gcc cgg tcg tat cag gtc atc tgc cgt gat gag aag acc cag atg
  144
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met
        35                  40                  45
atc tac cag cag cac caa tcc tgg ctg aga ccc gtc ctg agg tcc aac
  192
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn
    50                  55                  60
cgg gtg gag tac tgt tgg tgt aac agt ggt cga gcc caa tgc cat tcc
  240
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser
65                  70                  75                  80
gtt ccc gtg aag agc tgt tcc gag ccc cgc tgc ttc aac ggc ggc aca
  288
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
                85                  90                  95
tgt cag cag gct ctt tac ttt tca gat ttc gtg tgc caa tgt cct gaa
  336
Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Set Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu
            100                 105                 110
ggc ttc gcc ggc aag tgc tgt gag atc gac aca cgc gcg aca tgt tac
  384
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr
        115                 120                 125
gag gat cag ggg ata tcc tac cgc ggt aac tgg tcg acg gca gag tcc
  432
Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Asn Trp Ser Thr Ala Glu Ser
    130                 135                 140
gga gcc gaa tgt acc aac tgg cag agt tcc gcc ctg gcg cag aag cca
  480
Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro
145                 150                 155                 160
tac tcg ggg cgc cgg cca gac gcc atc cgc ctg ggc cta ggc aac cac
  528
Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His
                165                 170                 175
aac tac tgt cga aac ccc gac agg gac tcc aag ccc tgg tgt tac gtc
  576
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val
            180                 185                 190
ttc aag gca ggt aag tac tcc tcc gag ttc tgc tct acc cca gcc tgc
  624
Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys
        195                 200                 205
tcg gaa ggt aat tct gac tgc tat ttt ggt aac ggc agt gcc tac cgc
  672
Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg
    210                 215                 220
ggc acg cac tcc ctg aca gag tcc gga gcc tca tgc ctg cca tgg aac
  720
Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn
225                 230                 235                 240
tcc atg ata tta atc ggc aac gtc tac acc gcc cag aac ccg agc gcg
  768
Ser Met Ile Leu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala
                245                 250                 255
cag gcc ctg ggc ctc ggc aag cac aac tac tgt cgg aat cct gac ggg
  816
Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly
            260                 265                 270
gac gca aaa cca tgg tgc cac gtc ttg aag aac cgc cgc ctc aca tgg
  864
Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp
        275                 280                 285
gag tac tgc gac gtg ccc tcg tgt tcg acc tgc gga ctc aga cag tac
  912
Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr
    290                 295                 300
tcg cag ccc cag ttc cgg atc aaa gga ggc tta ttc gcc gat atc gct
  960
Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala
305                 310                 315                 320
tcg cac ccc tgg caa gcc gcc atc ttc gca gcc gcg gcc gcg tcc ccc
 1008
Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro
                325                 330                 335
ggg gaa cgc ttc ctg tgc ggt ggc atc ctg atc agt agt tgc tgg atc
 1056
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile
            340                 345                 350
ctg tca gcg gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccc cca cac cac ctg
 1104
Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu
        355                 360                 365
act gtc atc ctg gga aga acc tac cgc gtg gtg cca ggg gaa gag gag
 1152
Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu
    370                 375                 380
cag aaa ttc gaa gtg gag aag tac att gtg cat aag gaa ttc gac gac
 1200
Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp
385                 390                 395                 400
gac acg tac gac aac gac atc gcc ttg ctg cag ctg aag tcg gac agc
 1248
Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser
                405                 410                 415
tcc cgc tgc gcc caa gaa tcg tcc gtg gtt agg acg gtg tgc ctc ccc
 1296
Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro
            420                 425                 430
cct gct gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gaa ctg tcg ggg
 1344
Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly
        435                 440                 445
tac ggc aag cac gag gcg ctc tcc cca ttc tac agc gag cgc ctc aag
 1392
Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys
    450                 455                 460
gaa gcc cac gtg cgc ctg tac ccc agt tcc agg tgc acc tct cag cac
 1440
Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His
465                 470                 475                 480
ttg ctg aac cgc act gtt acc gac aat atg ctg tgt gcc ggt gat acc
 1488
Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr
                485                 490                 495
agg tcc ggg ggc cct cag gcc aat ctg cat gac gcg tgc cag ggg gac
 1536
Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
            500                 505                 510
tcc ggc ggg ccc ctg gtg tgt ttg aac gat gga agg atg acc ctg gtc
 1584
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val
        515                 520                 525
ggg atc atc tct tgg ggc ctg ggc tgc ggc cag aag gat gtg cca ggc
 1632
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly
    530                 535                 540
gtc tac acc aag gtg acg aac tac ctg gac tgg att cgc gac aac atg
 1680
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met
545                 550                 555                 560
agg ccc tga
 1689
Arg Pro

Claims (9)

1.一种制备在体内具有生物活性的组织型纤溶酶原激活因子的方法，包括以下步骤：
(a)在合适的营养条件下培养用分离的DNA序列转化或转染的宿主细胞，所述DNA序列选自(i)SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中列出的DNA序列，或(ii)与(i)和(ii)中定义的DNA序列或它们的互补链在严紧条件下杂交的DNA序列；
(b)从中分离所述重组组织型纤溶酶原激活因子产物。
2.一种制备在体内具有生物学活性的组织型纤溶酶原激活因子产物的方法，包括以SEQ ID.No.1或2中所示的编码组织型纤溶酶原激活因子的合成DNA序列转化宿主细胞和从所述宿主细胞或者其生长培养基中分离所述产物的步骤。
3.如权利要求1或2中的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
4.如权利要求1或2的方法，其中所述的宿主细胞优选CHO K1细胞。
5.一种生产在体内具有治疗心脏病发作和中风的生物学性能的可溶形式的组织型纤溶酶原激活因子的方法，包括以下步骤：
a)在合适的营养条件下培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含不同于组织型纤溶酶原激活因子的启动子DNA的启动子DNA，所述启动子DNA可操作地连接至编码SEQ ID No.3的成熟的促红细胞生成素氨基酸顺序的DNA；和
b)纯化所述细胞表达的所述糖基化的促红细胞生成素多肽。
6.如权利要求5的方法，其中所述启动子DNA是病毒启动子DNA。
7.一种制备在体内具有生物学活性的组织型纤溶酶原激活因子产物的方法，包括用图7或8所示的载体构建体转化宿主细胞并从所述宿主细胞或其生长培养基中分离所述组织型纤溶酶原激活因子产物的步骤。
8.如权利要求7的方法，其中所述载体是哺乳动物细胞特异表达载体，并且最优选如图7和8所示的载体。
9.一种药物组合物，包含治疗有效量的人组织型纤溶酶原激活因子和药用稀释剂、佐剂或载体，其中所述织型纤溶酶原激活因子是从在培养物中生长的哺乳动物细胞纯化的。
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