JPH0995497A - 新規蛋白質およびそれをコードするｄｎａ並びに該蛋白質の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）活性化因子のプロ
テアーゼ活性を阻害する活性を有する新規蛋白質を精
製、単離した。さらに、分子量（４０，０００ダルトン
前後）、Ｎ末端アミノ酸配列および部分アミノ酸配列を
決定し、それをコードする遺伝子をクローニングし、塩
基配列を決定した。さらに、この遺伝子ＤＮＡをベクタ
ーに組込み、宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養
して目的とする蛋白質を得た。 【効果】 本願蛋白質は、in vivoまたはin vitroでの
ＨＧＦやＨＧＦ活性化因子の活性調節因子として用いる
ことができる。また、本願蛋白質の動態解析の手段とし
て用いることができる抗体を得るための抗原やそのアッ
セイ系での標準品として用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な蛋白質および
それをコードするＤＮＡに関し、詳細には肝細胞増殖因
子活性化因子（ＨＧＦ活性化因子）のプロテアーゼ活性
を阻害する活性を有する新規な蛋白質（以下、本蛋白質
を「ＨＡＩ−Ｉ」と称することもある）およびそれをコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含有してなる発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された形質転換体、該形
質転換体を用いたＨＡＩ−Ｉの産生方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＨＧ
Ｆ活性化因子（特開平5-103670号、同6-141859号、同6-
153946号、および同6-153966号各号公報参照；肝細胞増
殖因子（ＨＧＦ）を一本鎖から二本鎖へ変換する活性を
有する因子）の正の活性制御としてその前駆体の活性化
をトロンビンが担うことが既に報告されていたが、負の
制御因子としてその生理活性を阻害する生体由来のプロ
テアーゼインヒビターは知られていなかった。そのた
め、ＨＧＦ活性化因子が生体内でどのように制御されて
いるかは不明であった。また、ＨＧＦ活性化因子が作用
する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の活性をも間接的に影響
を及ぼす可能性があり、ＨＧＦのin vivoでの作用機構
解析のためにも生体由来のプロテアーゼインヒビターの
単離、同定が求められていた。

【０００３】このプロテアーゼインヒビター、並びにプ
ロテアーゼインヒビターに対する抗体を用いることでＨ
ＧＦ活性化因子のin vivoでの生理作用とその作用解析
や、ＨＧＦの活性化の制御機構の解析等を従来と異なる
面から行うことが可能となる。

【０００４】さらに、ＨＡＩ−Ｉの生体における詳細な
機能、あるいは肝障害時におけるＨＡＩ−Ｉの働き等を
調べるためには多量のＨＡＩ−Ｉを必要とする。しかし
ながら、現在に至るまでＨＡＩ−Ｉを取得する方法とし
ては、ＭＫＮ４５細胞、Ａ５４９細胞等のヒト癌細胞株
の培養上清を材料として、その中に微量に存在するＨＡ
Ｉ−Ｉを精製するしかなかった。この方法は、人的、時
間的、価格的に必ずしも最良の方法ではなく、また、微
量なＨＡＩ−Ｉのみを安定に取り出すことは困難を極め
る。そこで、ＨＡＩ−Ｉの安定かつ大量取得のために、
発現系の構築が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、肝細胞
増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
を指標に種々の培養細胞株をスクリーニングし、ヒト癌
細胞株（ＭＫＮ４５細胞、Ａ５４９細胞等の上皮様細胞
株）の培養上清中にその活性を持つ物質が存在すること
を見い出した。さらに、その阻害活性の本体を明らかに
すべく、ＭＫＮ４５細胞の培養上清から種々のカラムク
ロマトグラフィーを用いてその精製を試みた。その結
果、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分子量が約４
０，０００ダルトン付近の新規の蛋白質を見い出し、こ
れをプロテインシークエンサーで分析することにより、
この蛋白質のアミノ末端アミノ酸配列を得た。またこの
蛋白質を蛋白質分解酵素で分解し生成するペプチドを分
離した後、各ペプチドを上記と同様にしてアミノ酸配列
分析することにより部分アミノ酸配列を決定した。更
に、この部分アミノ酸配列からＤＮＡ 塩基配列を推定
し、そのオリゴヌクレオチドをプローブとしてｃＤＮＡ
ライブラリーからスクリーニングすることにより、本蛋
白質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功
し、本発明を完成するに至った。

【０００６】また、本発明者らは、この蛋白質を組換え
ＤＮＡ技術により安定かつ大量に取得するため種々の検
討をした結果、この目的に有用な、この蛋白質をコード
する発現ベクターを新たに構築し、この蛋白質の発現を
可能にした。すなわち、この蛋白質の一部または全部の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、動物
細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ等のプラスミドベクター
あるいは酵母、大腸菌等における発現ベクターのプロモ
ーターの下流に挿入した蛋白質発現用プラスミドを作製
し、該プラスミドで宿主細胞を形質転換することにより
得られる形質転換体が優れたＨＡＩ−Ｉ産生能を有する
ことを見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち本発明の要旨は、下記の理化学的性質
（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量が約４０，０００ダルトンであり、（２）肝細胞
増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
を有し、（３）配列表の配列番号１〜７のいずれかに記
載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸
配列を有する蛋白質；配列表の配列番号１〜７に記載の
アミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列
を有し、肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性
を阻害する活性を有する蛋白質；配列表の配列番号８に
記載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ
酸配列を有する蛋白質；配列表の配列番号８に記載のア
ミノ酸配列において３６番目のグリシンから５１３番目
のロイシンまでの配列またはこれと実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質；それらの蛋白質をコ−ドする
ＤＮＡおよび遺伝子；該ＤＮＡまたは遺伝子を含有して
なる発現ベクター；該発現ベクターで宿主細胞を形質転
換することにより得られる形質転換体；ならびに該形質
転換体を培養することによる肝細胞増殖因子活性化因子
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を有する蛋白質の産
生方法に存する。

【０００８】なお、配列表の配列番号８に示す塩基配列
は他の相補的な塩基配列を省略し一本鎖のみを記載し
た。この遺伝子より組み換えＤＮＡ技術により、例えば
配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列を有する当該蛋
白質を発現することができる。この時、当該蛋白質をコ
ードするｍＲＮＡから翻訳される蛋白質はシグナル配列
を含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル
配列が切断され配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列
の３６番目のグリシン残基以降のアミノ酸配列を有する
当該蛋白質が産生される。シグナル配列として、他の蛋
白質のシグナル配列を利用することもできる。また、宿
主細胞内にシグナル配列のない成熟型蛋白質を発現させ
る場合は、当該蛋白質をコードする遺伝子として配列表
の配列番号８に示す塩基配列のうち１０６番目のグアニ
ン残基から以降の塩基配列を有する遺伝子をベクターの
ＡＴＧコドンにつなげて使用すればよい。さらに本発明
においては、ＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻
害する活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸もし
くは核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行っ
たもの、即ち「実質的に同一なアミノ酸配列」および
「実質的に同一な塩基配列」を有するものも本発明に含
まれる。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明をさらに詳細に説明する
に、本発明のプロテアーゼインヒビター活性を有する新
規な蛋白質は、以下のような精製段階を経ることにより
得られる。例えば、ヒト癌細胞株（ＭＫＮ４５細胞、Ａ
５４９細胞（それぞれ財団法人がん研究振興財団（Japa
nese Cancer Research Resources Bank)に、登録番号JC
RB0254、JCRB0076として登録）等の上皮様細胞株）を無
血清培地で数日培養して、その培養上清を回収して細胞
を除去後、濃縮して、ヘパリン−セファロースカラム
（ファルマシア社製等）に供する。その素通り画分をＣ
ｏｎＡ−セファロースカラム（ファルマシア社製等）に
供し、吸着画分と素通り画分に分離する。吸着画分をＰ
ｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製等）等の疎水クロマト
グラフィーに供する。得られた当該タンパク質を含む画
分をＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー（ポ
リマーラボラトリー社製等）に供し、その後、ハイドロ
キシアパタイトカラム（三井東圧化学社、生化学工業社
等）に供す。その後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー（旭化成社製ＧＳ５２０等）に供し、当該蛋白質を得
ることができる。必要に応じて、逆相カラムクロマトグ
ラフィー等を精製のステップに組み込むこともできる。

【００１０】精製された本発明の蛋白質はＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約４０，０
００ダルトンで、糖鎖、アミノ酸残基の修飾、Ｃ末端側
の変異の相違と思われる数本のフラグメントもしくはス
メアーなバンドとして泳動する。当該蛋白質はＨＧＦ活
性化因子と反応させることで、ＨＧＦ活性化因子のプロ
テアーゼ活性を阻害する活性を有する。また、本発明の
蛋白質は下記実施例２の表１に記載のアミノ酸配列を含
む。

【００１１】本発明の新規蛋白質をコードする遺伝子の
ＤＮＡ断片は次のようにして得ることができる。上記の
ようにして精製した新規蛋白質を気相プロテインシーケ
ンサー（アプライド・バイオシステムズ社製等）で分析
することにより、アミノ末端アミノ酸配列を決定するこ
とができる。更に、当該蛋白質をリジルエンドペプチダ
ーゼ（アクロモバクタープロテアーゼＩ等）で分解し、
生成するペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＹＭＣ社製等）で分離した後、各ペプチド断片を上
記と同様にしてアミノ酸配列分析すれば、蛋白質内部の
アミノ酸配列を知ることができる。

【００１２】こうして決定したアミノ酸配列からＤＮＡ
塩基配列を推定し、オリゴヌクレオチドを合成してプロ
ーブとして使用する。当該蛋白質をコードする遺伝子を
スクリーニングするｃＤＮＡライブラリーとしてはヒト
由来の肝臓ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブ
ラリー、胎盤ｃＤＮＡライブラリー等（クローンテック
社製等）が利用できる。その他当該蛋白質を発現してい
る細胞株および組織材料から常法に従ってｃＤＮＡライ
ブラリーを作成してもよい。

【００１３】このようなｃＤＮＡが組み込まれたλファ
ージを大腸菌に感染させ（Maniatisらの方法：「モレキ
ュラークローニング」）、これを培養する。形成された
プラークを当該蛋白質の一部のアミノ酸配列から推定さ
れる塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドをプロー
ブとしてプラークハイブリダイゼイション法に従って選
択することにより、容易に目的とする当該蛋白質のアミ
ノ酸配列を有し、なおかつ当該蛋白質のアミノ酸配列の
プローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異
なるλファージクローンをいくつか得ることができる。

【００１４】更に、上記スクリーニング陽性のプラーク
からManiatisらの方法によりファージを増殖させ、その
ものからグリセロールグラディエント法に従ってＤＮＡ
を精製し適切な制限酵素で切断後、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９等のプラスミドベクターあるいはＭ１３ｍｐ１８、
Ｍ１３ｍｐ１９等の一本鎖ファージベクターにｃＤＮＡ
をサブクローニングし、Sangerらのジデオキシ法に従っ
て目的ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定すること
ができる。得られたクローンの塩基配列を解析し、それ
らを統合することにより当該蛋白質の一部をコードする
ｃＤＮＡ群によって配列表の配列番号８に示す当該蛋白
質の全アミノ酸配列のすべてに対応する遺伝子を得るこ
とができる。

【００１５】また、本ｃＤＮＡの一部をプローブとして
使用し、ＰＣＲ法を用いることにより、各種ｃＤＮＡラ
イブラリーから、本ｃＤＮＡの全てを含む遺伝子、本ｃ
ＤＮＡの一部の塩基配列が欠失した遺伝子、本ｃＤＮＡ
に他の塩基配列が挿入された遺伝子もしくは本ｃＤＮＡ
の一部の塩基配列が他の塩基配列に置換された遺伝子な
ども得ることができる。このような塩基配列の欠失、付
加あるいは置換等の部位特異的変異は、Method in Enzy
mol., 217, 218-227（993）、同217, 270-279（1993）
等に記載の方法により容易に行うことができる。

【００１６】このようにして得られるｃＤＮＡ群をその
塩基配列の順番が本蛋白質のアミノ酸配列に従う形でつ
なぎ、当該蛋白質の全領域を含むＤＮＡ断片とし、これ
をｐＣＤＬ−ＳＲα２９６等のプラスミドのプロモータ
ーの下流に翻訳開始コドンＡＴＧとフェーズを合わせ
て、蛋白質発現用プラスミドを構築し、当該プラスミド
で形質転換された動物細胞の宿主内等で当該蛋白質を発
現させることができる。続いて常法に従い精製し、発現
された当該蛋白質を得ることができる。

【００１７】すなわち、上記のようにして得られる各種
ｃＤＮＡをｐＭＥ１８Ｓ等のプラスミドのプロモーター
の下流に挿入して、蛋白質発現用プラスミドを構築し、
当該プラスミドで形質転換された動物細胞の宿主等で、
当該蛋白質、当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が欠失し
た蛋白質、当該蛋白質に他のアミノ酸配列が挿入された
蛋白質もしくは当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が他の
アミノ酸配列に置換された蛋白質を発現させることがで
きる。具体的には、動物細胞としてＣＨＯ細胞、ＣＯＳ
細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ
３Ａ細胞等を用いて発現させることが可能である。これ
らの動物細胞等を宿主とする場合は、シグナル配列とし
て、配列表の配列番号８に示すＤＮＡ塩基配列、すなわ
ち当該蛋白質の遺伝子の１から３５番目の塩基配列もし
くは既存のシグナル配列を使用することにより、当該蛋
白質が細胞外に分泌生産、もしくは細胞膜表面上に生産
されることが期待される。

【００１８】動物細胞を宿主とした発現用プラスミドは
次のように構築される。プロモーターとしては全ての既
存のプロモーターが使用可能であるが、例えばＳＲαプ
ロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはメタルチオ
ネイン遺伝子のプロモーターが使用できる。このプロモ
ーター下流に上記シグナル様配列を含む当該蛋白質の遺
伝子の全てを含むＤＮＡ、本遺伝子の一部の塩基配列が
欠失したＤＮＡ、本遺伝子に塩基配列が挿入されたＤＮ
Ａもしくは本遺伝子の一部の塩基配列が別の塩基配列に
置換されたＤＮＡを転写方向にしたがって挿入する。

【００１９】また、当該蛋白質の発現ベクター構築の際
には該プロモーターの下流に当該蛋白質をコードする遺
伝子のＤＮＡ断片を２〜３個結合したものを挿入しても
よい。また当該蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片
の５’上流側にＳＶ４０などのプロモーターを結合した
ＤＮＡ断片を単位としたものを転写方向を揃えて２〜３
個結合してベクターに挿入してもよい。

【００２０】この当該蛋白質をコードする遺伝子の下流
にはポリアデニル化部位を付加する。例えば、ＳＶ４０
ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子またはメタルチオネイン
遺伝子由来のポリアデニル化部位が当該蛋白質をコード
する遺伝子の下流に付加することが可能である。また、
プロモーターと当該蛋白質をコードする遺伝子を結合し
たＤＮＡ断片を２〜３個結合する場合には、各単位の当
該蛋白質をコードする遺伝子の３’側にそれぞれポリア
デニル化部位を存在させることもできる。この発現ベク
ターを用いて、動物細胞、例えばＣＨＯ細胞を形質転換
する際に、薬剤耐性遺伝子を使用し、目的とする発現細
胞を選択することが可能である。

【００２１】薬剤耐性遺伝子としては、メトトレキセー
ト耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子（ジャーナルオブモレキ
ュラバイオロジー（J. Mol. Biol.）159巻601頁（198
2））、抗生物質Ｇ−４１８耐性を与えるＮｅｏ遺伝子
（ジャーナルオブモレキュラアプライドジェネティクス
（J. Mol. Appl. Genet.）1巻327頁（1982））、ミコフ
ェノール酸耐性を与える大腸菌由来のＥｃｏｇｐｔ遺伝
子（プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサ
イエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）78巻2072
頁（1981））、抗生物質ハイグロマイシン耐性を与える
ｈｐｈ遺伝子（モレキュラセルバイオロジー（Mol. Cel
l. Biol.）5巻410頁（1985））等が挙げられ、各耐性遺
伝子の５’上流側にはプロモーター、例えば前述のＳＶ
４０由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺伝
子の３’下流側には、前述のポリアデニル化部位が含ま
れる。

【００２２】当該蛋白質の発現ベクターにこれらの耐性
遺伝子を挿入する場合、当該蛋白質をコードする遺伝子
のポリアデニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿
入すればよい。これらの発現ベクターは、形質転換体を
得る際に選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二
重形質転換する必要がない。また当該蛋白質の発現ベク
ターにこれらの選択マーカー遺伝子が挿入されていない
場合には、形質転換体の選択のマーカーを有するベクタ
ー、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ（ジャーナルオブモレキュラ
アプライドジェネティクス（J. Mol. Appl. Genet.）1
巻327頁（1982））、ｐＭＢＧ（ネイチャー（Nature）2
94巻228頁（1981））、ｐＳＶ２ｇｐｔ（プロシーディ
ングオブナショナルアカデミーオブサイエンス（Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.）78巻2072頁（1981））、ｐ
Ａｄ-Ｄ２６-１（ジャーナルオブモレキュラバイオロジ
ー（J. Mol. Biol.）159巻601頁（1982））などを当該
蛋白質をコードする遺伝子の発現ベクターと共に形質転
換し、薬剤耐性遺伝子の表現形質により形質転換体を容
易に選択できる。

【００２３】発現ベクターの動物細胞への導入は、リン
酸カルシウム法（ヴァイロロジー（Virology）52巻456
頁（1973））、エレクトロポレーション法（ジャーナル
オブメンブレンバイオロジー（J. Membr. Biol.）10巻2
79頁（1972））等により行うことができる。

【００２４】形質転換された動物細胞の培養は、常法に
より浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地
としては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５〜
１０％血清の存在下もしくは適当量のインシュリン、ト
ランスフェリン等の存在下、もしくは無血清下にて培養
する。さらに当該蛋白質を、酵母や大腸菌、例えば、Sa
ccharomyes cerevisiae株や Escherichia coli YA-21株
等の微生物を使用して生産することも出来る。

【００２５】当該蛋白質を発現している細胞はその培養
上清中、もしくは細胞表面上に当該蛋白質を発現するこ
とから、この組換え体の培養上清もしくは細胞を用いて
当該蛋白質の分離精製を行うことが可能である。具体的
には、生産された当該蛋白質を含む培養上清もしくは細
胞抽出液を各種クロマトグラフィー、例えば、ヘパリン
−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、ハイドロキ
シアパタイト等を組み合わせたクロマトグラフィーにて
精製することにより当該蛋白質を単離精製することがで
きる。

【００２６】

【発明の効果】本発明に関わるプロテアーゼインヒビタ
ー活性を有する蛋白質は、ＨＧＦ活性化因子のプロテア
ーゼ活性を阻害する活性を持つため、in vivoまたはin
vitroでのＨＧＦ活性化因子の調節因子として、また、
間接的にはＨＧＦの活性の調節因子として、さらにはそ
れら因子の機能解析の道具、手段として、当該蛋白質に
対する抗体、当該蛋白質をコードする遺伝子も含めて使
用される。

【００２７】また、当該蛋白質をコードする遺伝子が導
入された発現ベクターを動物細胞に導入することにより
今まで困難であった生物学的活性のある当該蛋白質の一
部または全部あるいは当該蛋白質様蛋白質を、大量、安
定かつ容易に生産することが可能となる。

【００２８】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらにより詳
細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、
以下の実施例によって限定されるものではない。

【００２９】実施例１ ＭＫＮ４５細胞の培養上清を用
いての当該蛋白質の精製 ＭＫＮ４５細胞［内藤ら、癌と化学療法、5、89（197
8）；免疫生物研究所から入手］をローラーボトル８５
０の５％ＦＢＳを含むｅＲＤＦ培地中に播種して、コン
フルエントな状態になるまで増殖させた。増殖後、ＦＢ
Ｓを含む培養液を除去後、無血清ｅＲＤＦ培地で２度洗
浄した。洗浄用培地を除去後、無血清ｅＲＤＦ培地５０
０ｍｌを加えて３〜６日間３７℃でインキュベーション
した。インキュベーション後、培養液を回収して、新し
い無血清ｅＲＤＦ培地５００ｍｌを加えて再度インキュ
ベーションした。これを数回繰り返して、回収した培養
上清をＹＭ３０限外濾過膜（アミコン社製）にて約２０
倍にまで濃縮した。

【００３０】この濃縮液をヘパリン−セファロースカラ
ム（ＰＢＳで平衡化）に供し、その素通り画分を回収し
た。このヘパリンカラム素通り画分を、ＣｏｎＡ−セフ
ァロースカラム（ＰＢＳで平衡化）に供し、素通り画分
と、２００ｍＭ α−メチルＤ−マンノシドを含むＰＢ
Ｓ溶液での溶出画分に分離した。ＣｏｎＡ吸着画分をＹ
Ｍ３０を用いて濃縮、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）溶液へ緩衝液置換を行
い、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製；１Ｍ硫酸アン
モニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で
平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、１Ｍ硫酸アンモニウ
ムから０Ｍへの直線濃度勾配溶出を行い、目的のプロテ
アーゼインヒビター活性が存在する画分を回収した。

【００３１】当画分を０．０５％ＣＨＡＰＳを含む２０
ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８）に透析後、ＤＥＡＥ
（０．０５％ＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭトリス／塩酸緩
衝液（ｐＨ８）で平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、０
Ｍから５００ｍＭ ＮａＣｌへの直線濃度勾配溶出を行
い、目的のプロテアーゼインヒビター活性が存在する画
分を回収した。当画分を０．０５％ＣＨＡＰＳを含む５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６．８）に透析して、ＨＣＡ
Ａ−４００７カラム（三井東圧化学社製）（０．０５
％ＣＨＡＰＳを含む５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６．
８）で平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、その素通り画
分を回収した。当画分をＧＳ−５２０（０．０５％ＣＨ
ＡＰＳを含むＰＢＳで平衡化）に供し、活性画分（約５
０〜３０ｋＤａ付近の画分）を回収した。マイナーバン
ドを除去するため、当画分をＹＭＣ ｐａｃｋＣ４カラ
ム（ＹＭＣ社製）に供し、０．１％ＴＦＡを含むアセト
ニトリル／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１０
％から５０％まで３０分間の直線濃度勾配溶出を行い、
活性画分を１Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８）にて中和
後、減圧下で乾燥させた。乾燥後、０．０５％ＣＨＡＰ
Ｓを含むＰＢＳに溶解して、精製蛋白質を得た。

【００３２】実施例２ 当該蛋白質のアミノ末端アミノ
酸配列および部分アミノ酸配列の決定 実施例１に従って精製し、逆相ＨＰＬＣで溶出させたプ
ロテアーゼインヒビター活性を有する蛋白質を、中和せ
ずに減圧下で乾燥させた。これを、５０％ＴＦＡ（トリ
フルオロ酢酸）６０μｌに溶解し、ポリブレン処理した
グラスフィルターに添加し、Applied Biosystems社製４
７０Ａシークエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端領域の
アミノ酸配列を決定した。フェニルヒダントイン（ＰＴ
Ｈ）アミノ酸の同定は、三菱化学社製ＭＣＩ ｇｅｌ
ＯＤＳ ＩＨＵ（０．４６ｘ１５ｃｍ）カラムを用い、
酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）、０．
０１％ＳＤＳ、３８％アセトニトリル）による単一溶媒
溶出法を流速１．２ｍｌ／分、温度４３℃で行い、ＰＴ
Ｈアミノ酸の検出は２６９ｎｍの吸光度で行った。

【００３３】この結果、表１に示すＮ末端アミノ酸配列
を同定した。次に、同じく実施例１に従って精製し、逆
相ＨＰＬＣで溶出させたプロテアーゼインヒビター活性
を有する蛋白質を、４Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ９．０）１００μｌに溶解し、これにリジルエン
ドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテアーゼＩ）を
添加して３７℃で８時間反応させた。生成したペプチド
混合物はＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ８カラム（ＹＭＣ社）を
用いた逆相ＨＰＬＣにより分離して各ペプチド断片を得
た。６つのペプチドについて気相プロテインシークエン
サー（Applied Biosystems社製 model470A）を用いて
アミノ酸配列分析を行ったところ、表１に示す配列が見
い出された。

【００３４】

【表１】表１ ペプチドのアミノ酸配列 Ｎ末端：Gly-Pro-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Gly-Leu-Pro-Al
a-Gly-Ala-Asp-Cys-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Ala-Gly-Val-
Pro-Gly-Phe-Val-Leu-Asp-Thr-Xaa-Ala-Ser-Val-Ser-As
n-Gly-Ala-Thr-Phe（配列表の配列番号１） 部分アミノ酸配列 １：Val-Gln-Pro-Gln-Glu-Pro-Leu-Val-Leu-Lys（配列
表の配列番号２） ２：Asp-Val-Glu-Asn-Thr-Asp-Trp-Arg-Leu-Leu-Arg-Gl
y-Asp-Thr-Asp-Val-Arg-Val-Glu-Arg-Lys（配列表の配
列番号３） ３：Ala-Trp-Ala-Gly-Ile-Asp-Leu-Lys（配列表の配列
番号４） ４：Ser-Xaa-Val-Tyr-Gly-Gly-Xaa-Leu-Gly-Asn-Lys
（配列表の配列番号５） ５：Asp-Pro-Asn-Gln-Val-Glu-Leu-Trp-Gly-Leu-Lys
（配列表の配列番号６） ６：Asn-Asn-Tyr-Leu-Arg-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Leu-Al
a-Xaa-Arg-Gly-Val-Gln（配列表の配列番号７） （配列中、Xaaは未決定のアミノ酸を示す。）

【００３５】実施例３ Ａ５４９細胞の培養上清を用い
ての当該蛋白質の精製とアミノ酸配列解析 Ａ５４９細胞［財団法人がん研究振興財団（Japanese C
ancer Research Resources Bank）から入手］を実施例1
と同様に培養して培養上清を調製した。その培養上清を
用いて実施例１と同じ操作によって、ＨＧＦ活性化因子
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を持つ蛋白質を得
た。この蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ＭＫＮ４５細胞
由来のものと同じ分子量を示した。また、この蛋白質の
Ｎ末端領域のアミノ酸配列を実施例１と同様の方法で決
定した。この結果、その配列はＭＫＮ４５細胞由来と同
じであった。このことより、当該蛋白質はＭＫＮ４５由
来の蛋白質と同じである可能性が示された。

【００３６】実施例４ 当該蛋白質のＨＧＦ活性化因子
のプロテアーゼ活性を阻害する活性を測定する方法とそ
の活性 測定しようとするサンプル１〜１０μｌを、２〜５ｎｇ
血清由来ＨＧＦ活性化因子を含むＰＢＳ、０．０５％Ｃ
ＨＡＰＳ溶液３０〜４０μｌに添加した。３７℃で３０
分間インキュベーション後、５〜１０μｇの一本鎖ＨＧ
Ｆを添加し、さらに２時間インキュベーションを継続し
た。この混合液を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、クマシーブ
リリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）で染色し、一本鎖
ＨＧＦと二本鎖ＨＧＦの割合を比較することで、活性を
検出した。

【００３７】精製した当該蛋白質数１０ｎｇと５ｎｇ血
清由来ＨＧＦ活性化因子をＰＢＳ、０．０５％ＣＨＡＰ
Ｓ溶液３０〜４０μｌ中で３７℃で３０分間インキュベ
ーションした後、１０μｇ一本鎖ＨＧＦを添加し、さら
に２時間インキュベーションを継続した。この混合液
を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動に供し、電気泳動後、ＣＢＢで染色した。結果を図
１に示す。図中、１はＨＧＦ活性化因子と当該蛋白質を
無添加の場合を、２はＨＧＦ活性化因子を添加、当該蛋
白質無添加の場合を、３はＨＧＦ活性化因子と当該蛋白
質を添加した場合の結果を表す。当該蛋白質の添加によ
り、ＨＧＦ活性化因子のＨＧＦを一本鎖から二本鎖に変
換する活性が抑制された。

【００３８】実施例５ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動 ＭＫＮ４５細胞の培養上清とＡ５４９細胞の培養上清よ
り実施例１と２に従って精製されたプロテアーゼインヒ
ビター活性を持つ当該蛋白質の見かけ上の分子量を求め
るため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
った。最終的に精製された当該蛋白質を１２．５％のポ
リアクリルアミド・スラブゲルを用いたＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に、非還元下で供した。分子
量マーカーとしては、分子量マーカー「第一」III Laem
mli法用（第一化学薬品社製）を用いた。電気泳動後、
銀染色試薬（関東化学社製）を用いて発色させた。当該
蛋白質と標準分子量マーカーの蛋白質との泳動距離の相
対的比較により、ＭＫＮ４５細胞の培養上清とＡ５４９
細胞の培養上清から得られた当該蛋白質は、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動上のみかけの分子量とし
て約４０，０００ダルトン前後に糖鎖、アミノ酸残基の
修飾または末端領域の相違によるものと思われる数本の
フラグメントもしくはスメアーなバンドを示した。

【００３９】実施例６ 当該蛋白質をコードする遺伝子
のクローニングおよび塩基配列の決定 実施例２により得られた当該蛋白質のＮ末端アミノ酸配
列（配列表の配列番号１）に含まれる、Gly-Ala-Asp-Cy
s-Leu-Asn および Gly-Phe-Val-Leu-Asp-Thrの配列を基
に推定可能な二種類のオリゴヌクレオチドプライマー
（プライマー１およびプライマー２）を作成した。ま
た、当該蛋白質の部分アミノ酸配列（配列番号１）の中
で、Ser-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly （配列番号５）およびGl
n-Val-Glu-Leu-Trp-Gly （配列番号６）の配列を基に推
定可能な二種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プラ
イマー３およびプライマー４）を作成した。これらプラ
イマーの配列を以下に示す。

【００４０】

【表２】 プライマー１：5'-GGNGCNGAYTGYTTRAA-3'（配列表の配
列番号：９）および5'-GGNGCNGAYTGYCTNAA-3'（配列表
の配列番号：１０）の混合物 プライマー２：5'-GTRTCYAANACRAANCC-3'（配列表の配
列番号：１１）および5'-GTRTCNAGNACRAANCC-3'（配列
表の配列番号：１２）の混合物 プライマー３：5'-CCNCCRTANACRAANGA-3'（配列表の配
列番号：１３）および5'-CCNCCRTANACRAARCT-3'（配列
表の配列番号：１４）の混合物 プライマー４：5'-CCCCANAGYTCNACYTG-3'（配列表の配
列番号：１５）および5'-CCCCAYAAYTCNACYTG-3'（配列
表の配列番号：１７）の混合物 （配列中、N=A, G, CまたはT、Y= C または T、R=A ま
たはGを示す。）

【００４１】一方、胃癌細胞株であるＭＫＮ４５細胞よ
りトータルＲＮＡをアナリティカルバイオケミストリー
(Anal. Biochem.）162卷156頁（1987）記載の方法に従
って調製し、これをオリゴ（ｄＴ）カラムに供すことに
よりｐｏｌｙ−（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。

【００４２】次に当該蛋白質のＮ末端アミノ酸配列に相
当するｃＤＮＡ断片の取得を試みた。 ＭＫＮ４５細胞
より調製したｐｏｌｙ−（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とし、先
に作成した二種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プ
ライマー１及びプライマー２）を用いてＲＴ−ＰＣＲ
（reverse transcription-polymerase chain reactio
n、羊土社、林 件志 編、1995年2月5日発刊「ＰＣＲ法
の最新技術」p44-p52参照）を行った。このＲＴ−ＰＣ
Ｒにて得られた反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳
動法にて解析した結果、約５６ｂｐのＤＮＡ断片が検出
された。そこでこのＤＮＡ断片をポリアクリルアミドよ
り抽出後、フェノールクロロホルム処理およびエタノー
ル沈殿を行いＤＮＡ断片を回収後、ダイデオキシ法にて
塩基配列を決定した。

【００４３】そこで、この塩基配列の一部を含むプライ
マーを5'-AACAGCTTTACCG-3'（プライマー５）（配列表
の配列番号：１６）を作成し、以下の当該ｃＤＮＡ取得
に使用した。先に調製したＭＫＮ４５細胞株のｐｏｌｙ
−（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型とし、プライマー３及びプライ
マー５を使用してＰＣＲを行った。更に、得られたＰＣ
Ｒ増幅ＤＮＡ、プライマー４及びプライマー５を用いて
ＰＣＲを行った結果、４８０ｂｐの当該蛋白質特異的な
ＤＮＡフラグメントを取得した。ここに得られた４８０
ｂｐのＤＮＡフラグメントをモレキュラークローニング
（コールドスプリングハーバーラボラトリー、1982年）
に記載の方法に従って³²Ｐ標識し、これをスクリーニン
グ用プローブとした。

【００４４】全長の当該蛋白質ｃＤＮＡを取得するため
のライブラリーとして、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー
（クローンテック社製）を用いた。まず大腸菌Ｙ−１０
９０株に、約４ｘ１０⁵プラークとなるようにヒト胎盤
ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１１、クローンテック社
製）として調製されているファージを感染させ、ＮＺＹ
培地中で４２℃一晩培養した。次にジーンスクリーニン
グプラス（デュポン社製）にトランスファーさせた。そ
のメンブレンを０．１Ｍ水酸化ナトリウム／０．５Ｍト
リス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）が染み込んだ濾紙上
に２分間静置し、続いて１．５Ｍ塩化ナトリウム／０．
５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）が染み込んだ
濾紙上で５分間静置した。この一連の処理を更に２回繰
り返した後、２ｘＳＳＣ（２倍ＳＳＣ）で洗浄し、乾い
た濾紙上で風乾した。さらにこのメンブレンを２０ｍＪ
／ｃｍ²でＵＶ照射することにより、メンブレンに移し
たＤＮＡの固定を行った。こうして処理したメンブレン
を５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１Ｍ
塩化ナトリウムおよび１％ＳＤＳよりなる溶液５０ｍｌ
に浸漬し、６５℃で２時間保持した。

【００４５】次に、上記の³²Ｐで標識したプローブ５ｎ
ｇ／ｍｌ、鮭精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ、５０ｍＭト
リス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび１％ＳＤＳよりなる溶液４０ｍｌに浸漬し、６
５℃で１６時間保持した。その後、このメンブレンを２
ｘＳＳＣで室温５分間、０．１ｘＳＳＣで室温３０分間
２回の順に洗浄した後、オートラジオグラフィーを行
い、８４個の当該蛋白質ｃＤＮＡを含むと考えられるポ
ジティブクローンを得た。

【００４６】得られた各クローンから、５００μｌのＳ
Ｍバッファー（５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ
７．５）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ硫酸マ
グネシウムおよび０．０１％ゼラチン）と２０μｌのク
ロロホルムによりファージを抽出した。上記１００μｌ
のファージ抽出液と１００μｌの１０ｍＭ硫酸マグネシ
ウムに懸濁した大腸菌Ｙ−１０９０株とを混合した後、
９ｃｍのＬＢ寒天培地に、３ｍｌの上層寒天培地ととも
にまき、３７℃で一晩培養した。プラークの形成を確認
した後、３ｍｌのＳＭバッファーとクロロホルムを数滴
加え、室温で１時間放置した。ファージを含むこのＳＭ
バッファーを回収し、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心
し、上清を回収した。

【００４７】得られたファージ溶液１０μｌと大腸菌Ｙ
−１０９０株３００μｌを混合した後、１０ｍＭ硫酸マ
グネシウムを含む１０ｍｌのＬＢ培地に加え、３７℃で
振盪培養した。溶菌後、クロロホルムを数滴加え、更に
１０分間振盪し、１０、０００ｒｐｍ、５分間遠心し
た。上清を回収し、終濃度５μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ
および２μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で３
０分間静置した。続いて５ｇのＮａＣｌおよび１．１ｇ
のＰＥＧ６０００を加え、４℃で１時間放置し、１０、
０００ｒｐｍで１５分間遠心して、沈殿を回収した。こ
の沈殿をＳＭバッファー４００μｌに懸濁した。さらに
フェノール／クロロホルム処理およびエタノール沈殿を
行い、当該蛋白質ｃＤＮＡを含むファージＤＮＡを取得
した。次に、このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにて切断
し、アガロースゲル電気泳動により、ｃＤＮＡ断片を解
析した。

【００４８】このアガロースゲル電気泳動にて最長のｃ
ＤＮＡ断片を分離および抽出後、プラスミドベクターＰ
ＵＣ１９のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、当該蛋白質ｃＤ
ＮＡを含むプラスミドベクターｐＨＡＩを作成した。得
られたプラスミドベクターｐＨＡＩに挿入されたｃＤＮ
Ａの塩基配列を解析し、当該蛋白質をコードする全遺伝
子の塩基配列を決定した（配列表の配列番号８）。

【００４９】実施例７ 当該蛋白質発現プラスミドの調
製 実施例６によって得られた当該蛋白質ｃＤＮＡを含むプ
ラスミド（ｐＨＡＩ）は制限酵素ＥｃｏＲＩで処理する
ことにより、プラスミドベクターｐＵＣ１９と全長の当
該蛋白質ｃＤＮＡ断片（翻訳開始コドンである塩基配列
ＡＴＧと終止コドンであるＴＧＡを含む全長の当該蛋白
質ｃＤＮＡ断片）を分離することが可能である。そこで
Maniatisらの方法（「モレキュラークローニング」、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー、164頁（198
2））に従い、アガロースゲル電気泳動を行い、当該蛋
白質ｃＤＮＡを含む約２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ
ＲＩＤＮＡ断片を分離および抽出した。得られた当該蛋
白質ｃＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて
平滑末端にした。この後、フェノールクロロホルム抽出
およびエタノール沈澱を行い、１０μｌの水に溶解し
た。

【００５０】一方、発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（メディ
カルイミュノロジー、20卷27頁（1990））は制限酵素Ｘ
ｈｏＩで切断後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて平
滑末端にした。この後、フェノールクロロホルム抽出お
よびエタノール沈澱を行い、４００μｌの５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂溶液に
溶解した。さらにバクテリアルアルカリホスファターゼ
（東洋紡、ＢＡＰ−１０１）１ｕｎｉｔを添加し、６５
℃下３０分の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこ
の反応液からフェノールクロロホルム抽出とエタノール
沈澱により制限酵素ＸｈｏＩで切断されたｐＭＥ１８Ｓ
ベクターを精製し、１０μｌの水に溶解した。

【００５１】このｐＭＥ１８ＳベクターのＤＮＡ断片
０．０１μｇと前述の平滑末端化された当該蛋白質ｃＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ断片０．１μｇを含む溶液２０μｌ
（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６
ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトール、６６
μＭ ＡＴＰ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡ＬＧＡ−
１０１）存在下で１４℃で１２時間反応させ、両ＤＮＡ
断片の結合反応を行った。

【００５２】次にこの反応液１０μｌを用いて大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株（宝酒造）を形質転換し、アンピシリンを５
０μｇ／ｍｌの濃度で含む培地上で培養することにより
数十個のアンピシリン耐性株を得た。これらの組換え体
をManiatisらの方法（「モレキュラークローニング」、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、86頁〜96頁
（1982））に従い解析することにより、発現ベクターｐ
ＭＥ１８Ｓのプロモーターとポリアデニレーション部位
の中間に存在する制限酵素ＸｈｏＩ切断部位に当該蛋白
質をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド、ｐＭＥ
１８Ｓ−ＨＡＩプラスミドを得た。その構造を図２に示
す。

【００５３】実施例８ 当該蛋白質を発現する細胞株の
取得 実施例７で作製された発現ベクターｐＭＥ１８Ｓの制限
酵素ＸｈｏＩ切断部位に当該蛋白質ｃＤＮＡが挿入され
たプラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩを、Maniatisらの方
法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリン
グハーバーラボラトリー、86頁〜96頁（1982））に従
い、組換え体の大腸菌から回収、精製し当該蛋白質発現
プラスミドＤＮＡを大量に得た。

【００５４】一方、ＣＯＳ細胞をＦＢＳ（牛胎児血清）
が１０％入ったｅＲＤＦ培地中でセミコンフルエントな
状態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除き
そこにＤＮＡ溶液を滴加するが、ＤＮＡ溶液は予め次に
示す手順に従って調製した。まず直径９ｃｍのシャーレ
一枚につき３００μｌの２ｘＨＥＢＳ溶液（２ｘＨＥＢ
Ｓ溶液；１．６％塩化ナトリウム、０．０７４％塩化カ
リウム、０．０５％燐酸水素二ナトリウム１２水塩、
０．２％デキストロース、１％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０
５））と１０μｇのプラスミドＤＮＡを加え、滅菌水で
５７０μｌに合わせた溶液を、エッペンドルフ遠心管中
に準備する。次に該ＤＮＡ溶液に３０μｌの２．５Ｍの
塩化カルシウム溶液を滴加しながらボルテックスミキサ
ーを用い数秒間激しく混和する。これを室温で３０分間
放置するが、その間およそ１０分おきにボルテックスミ
キサーで混和する。

【００５５】この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細
胞にかけて室温で３０分間静置した。その後ＦＢＳが１
０％入ったｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）９ｍｌをシャ
ーレに入れて３７℃、５％ＣＯ₂存在下で４〜５時間培
養した。次にシャーレから培地を除き５ｍｌの１ｘＴＢ
Ｓ＋＋溶液（１ｘＴＢＳ＋＋溶液；２５ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５）１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩
化カリウム、０．６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、０．０
８ｍＭ塩化カルシウム、０．０８ｍＭ塩化マグネシウ
ム）で細胞を洗浄し、１ｘＴＢＳ＋＋溶液を除去した
後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）を１０％含む
１ｘＨＥＢＳ溶液を、５ｍｌ細胞にかけて室温で１〜２
分間静置した後上清を除去した。その後５ｍｌの１ｘＴ
ＢＳ＋＋溶液で細胞を再び洗浄しＦＢＳが１０％入った
ｅＲＤＦ培地１０ｍｌをシャーレに入れて３７℃、５％
ＣＯ₂存在下で培養し、４８時間が経過した時点で培地
を回収した。回収した培養上清を２０倍に濃縮して、Ｈ
ＧＦ活性化因子に対する阻害活性を上述の実施例４と同
様にして測定したところ、阻害活性が確認された。

【００５６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 他の情報 31番目のXaaは未同定のアミノ酸を示す。 配列 Gly Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gly Leu Pro Ala Gly Ala Asp Cys Leu 1 5 10 15 Asn Ser Phe Thr Ala Gly Val Pro Gly Phe Val Leu Asp Thr Xaa Ala 20 25 30 Ser Val Ser Asn Gly Ala Thr Phe 35 40

【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45

【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 配列 Asp Val Glu Asn Thr Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly Asp Thr Asp Val 1 5 10 15 Arg Val Glu Arg Lys 20

【００５９】配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45

【００６０】配列番号：５ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 他の情報 2番目及び7番目のXaaは未同定のアミノ酸を示す。

【００６１】配列番号：６ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45

【００６２】配列番号：７ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 他の情報 6〜9番目及び13番目のXaaは未同定のアミノ酸を示す。 配列 Asn Asn Tyr Leu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Leu Ala Xaa Arg Gly Val 1 5 10 15 Gln

【００６３】配列番号：８ 配列の長さ：１５４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 株名：MKN45 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1542 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..105 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：106..1542 特徴を決定した方法：E 配列 ATG GCC CCT GCG AGG ACG ATG GCC CGC GCC CGC CTC GCC CCG GCC GGC 48 Met Ala Pro Ala Arg Thr Met Ala Arg Ala Arg Leu Ala Pro Ala Gly 1 5 10 15 ATC CCT GCC GTC GCC TTG TGG CTT CTG TGC ACG CTC GGC CTC CAG GGC 96 Ile Pro Ala Val Ala Leu Trp Leu Leu Cys Thr Leu Gly Leu Gln Gly 20 25 30 ACC CAG GCC GGG CCA CCG CCC GCG CCC CCT GGG CTG CCC GCG GGA GCC 144 Thr Gln Ala Gly Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gly Leu Pro Ala Gly Ala 35 40 45 GAC TGC CTG AAC AGC TTT ACC GCC GGG GTG CCT GGC TTC GTG CTG GAC 192 Asp Cys Leu Asn Ser Phe Thr Ala Gly Val Pro Gly Phe Val Leu Asp 50 55 60 ACC AAC GCC TCG GTC AGC AAC GGA GCT ACC TTC CTG GAG TCC CCC ACC 240 Thr Asn Ala Ser Val Ser Asn Gly Ala Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr 65 70 75 80 GTG CGC CGG GGC TGG GAC TGC GTG CGC GCC TGC TGC ACC ACC CAG AAC 288 Val Arg Arg Gly Trp Asp Cys Val Arg Ala Cys Cys Thr Thr Gln Asn 85 90 95 TGC AAC TTG GCG CTA GTG GAG CTG CAG CCC GAC CGC GGG GAG GAC GCC 336 Cys Asn Leu Ala Leu Val Glu Leu Gln Pro Asp Arg Gly Glu Asp Ala 100 105 110 ATC GCC GCC TGC TTC CTC ATC AAC TGC CTC TAC GAG CAG AAC TTC GTG 384 Ile Ala Ala Cys Phe Leu Ile Asn Cys Leu Tyr Glu Gln Asn Phe Val 115 120 125 TGC AAG TTC GCG CCC AGG GAG GGC TTC ATC AAC TAC CTC ACG AGG GAA 432 Cys Lys Phe Ala Pro Arg Glu Gly Phe Ile Asn Tyr Leu Thr Arg Glu 130 135 140 GTG TAC CGC TCC TAC CGC CAG CTG CGG ACC CAG GGC TTT GGA GGG TCT 480 Val Tyr Arg Ser Tyr Arg Gln Leu Arg Thr Gln Gly Phe Gly Gly Ser 145 150 155 160 GGG ATC CCC AAG GCC TGG GCA GGC ATA GAC TTG AAG GTA CAA CCC CAG 528 Gly Ile Pro Lys Ala Trp Ala Gly Ile Asp Leu Lys Val Gln Pro Gln 165 170 175 GAA CCC CTG GTG CTG AAG GAT GTG GAA AAC ACA GAT TGG CGC CTA CTG 576 Glu Pro Leu Val Leu Lys Asp Val Glu Asn Thr Asp Trp Arg Leu Leu 180 185 190 CGG GGT GAC ACG GAT GTC AGG GTA GAG AGG AAA GAC CCA AAC CAG GTG 624 Arg Gly Asp Thr Asp Val Arg Val Glu Arg Lys Asp Pro Asn Gln Val 195 200 205 GAA CTG TGG GGA CTC AAG GAA GGC ACC TAC CTG TTC CAG CTG ACA GTG 672 Glu Leu Trp Gly Leu Lys Glu Gly Thr Tyr Leu Phe Gln Leu Thr Val 210 215 220 ACT AGC TCA GAC CAC CCA GAG GAC ACG GCC AAC GTC ACA GTC ACT GTG 720 Thr Ser Ser Asp His Pro Glu Asp Thr Ala Asn Val Thr Val Thr Val 225 230 235 240 CTG TCC ACC AAG CAG ACA GAA GAC TAC TGC CTC GCA TCC AAC AAG GTG 768 Leu Ser Thr Lys Gln Thr Glu Asp Tyr Cys Leu Ala Ser Asn Lys Val 245 250 255 GGT CGC TGC CGG GGC TCT TTC CCA CGC TGG TAC TAT GAC CCC ACG GAG 816 Gly Arg Cys Arg Gly Ser Phe Pro Arg Trp Tyr Tyr Asp Pro Thr Glu 260 265 270 CAG ATC TGC AAG AGT TTC GTT TAT GGA GGC TGC TTG GGC AAC AAG AAC 864 Gln Ile Cys Lys Ser Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Lys Asn 275 280 285 AAC TAC CTT CGG GAA GAA GAG TGC ATT CTA GCC TGT CGG GGT GTG CAA 912 Asn Tyr Leu Arg Glu Glu Glu Cys Ile Leu Ala Cys Arg Gly Val Gln 290 295 300 GGC CCC TCC ATG GAA AGG CGC CAT CCA GTG TGC TCT GGC ACC TGT CAG 960 Gly Pro Ser Met Glu Arg Arg His Pro Val Cys Ser Gly Thr Cys Gln 305 310 315 320 CCC ACC CAG TTC CGC TGC AGC AAT GGC TGC TGC ATC GAC AGT TTC CTG 1008 Pro Thr Gln Phe Arg Cys Ser Asn Gly Cys Cys Ile Asp Ser Phe Leu 325 330 335 GAG TGT GAC GAC ACC CCC AAC TGC CCC GAC GCC TCC GAC GAG GCT GCC 1056 Glu Cys Asp Asp Thr Pro Asn Cys Pro Asp Ala Ser Asp Glu Ala Ala 340 345 350 TGT GAA AAA TAC ACG AGT GGC TTT GAC GAG CTC CAG CGC ATC CAT TTC 1104 Cys Glu Lys Tyr Thr Ser Gly Phe Asp Glu Leu Gln Arg Ile His Phe 355 360 365 CCC AGT GAC AAA GGG CAC TGC GTG GAC CTG CCA GAC ACA GGA CTC TGC 1152 Pro Ser Asp Lys Gly His Cys Val Asp Leu Pro Asp Thr Gly Leu Cys 370 375 380 AAG GAG AGC ATC CCG CGC TGG TAC TAC AAC CCC TTC AGC GAA CAC TGC 1200 Lys Glu Ser Ile Pro Arg Trp Tyr Tyr Asn Pro Phe Ser Glu His Cys 385 390 395 400 GCC CGC TTT ACC TAT GGT GGT TGT TAT GGC AAC AAG AAC AAC TTT GAG 1248 Ala Arg Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Tyr Gly Asn Lys Asn Asn Phe Glu 405 410 415 GAA GAG CAG CAG TGC CTC GAG TCT TGT CGC GGC ATC TCC AAG AAG GAT 1296 Glu Glu Gln Gln Cys Leu Glu Ser Cys Arg Gly Ile Ser Lys Lys Asp 420 425 430 GTG TTT GGC CTG AGG CGG GAA ATC CCC ATT CCC AGC ACA GGC TCT GTG 1344 Val Phe Gly Leu Arg Arg Glu Ile Pro Ile Pro Ser Thr Gly Ser Val 435 440 445 GAG ATG GCT GTC GCA GTG TTC CTG GTC ATC TGC ATT GTG GTG GTG GTA 1392 Glu Met Ala Val Ala Val Phe Leu Val Ile Cys Ile Val Val Val Val 450 455 460 GCC ATC TTG GGT TAC TGC TTC TTC AAG AAC CAG AGA AAG GAC TTC CAC 1440 Ala Ile Leu Gly Tyr Cys Phe Phe Lys Asn Gln Arg Lys Asp Phe His 465 470 475 480 GGA CAC CAC CAC CAC CCA CCA CCC ACC CCT GCC AGC TCC ACT GTC TCC 1488 Gly His His His His Pro Pro Pro Thr Pro Ala Ser Ser Thr Val Ser 485 490 495 ACT ACC GAG GAC ACG GAG CAC CTG GTC TAT AAC CAC ACC ACC CGG CCC 1536 Thr Thr Glu Asp Thr Glu His Leu Val Tyr Asn His Thr Thr Arg Pro 500 505 510 CTC TGA 1542 Leu *

【００６４】配列番号：９ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＹはＣ又はＴを示し、Ｒ
はＡ又はＧを示す。 配列 GGNGCNGAYT GYTTRAA 17

【００６５】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＹはＣ又はＴを示し、Ｒ
はＡ又はＧを示す。 配列 GGNGCNGAYT GYCNRAA 17

【００６６】配列番号：１１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＹはＣ又はＴを示し、Ｒ
はＡ又はＧを示す。 配列 GTRTCYAANA CRAANCC 17

【００６７】配列番号：１２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＲはＡ又はＧを示す。 配列 GTRTCNAGNA CRAANCC 17

【００６８】配列番号：１３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＲはＡ又はＧを示す。 配列 CCNCCRTANA CRAANGA 17

【００６９】配列番号：１４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＲはＡ又はＧを示す。 配列 CCNCCRTANA CRAARCT 17

【００７０】配列番号：１５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＹはＣ又はＴを示す。 配列 CCCCANAGYT CNACYTG 17

【００７１】配列番号：１６ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACAGCTTTA CCG 13

【００７２】配列番号：１７ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状： 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報 ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ＹはＣ又はＴを示す。 配列 CCCCAYAAYT CNACYTG 17

【図面の簡単な説明】

【図１】本願蛋白質のHGF活性化因子のプロテアーゼ活
性を阻害する活性を測定した結果を表す図である。

【図２】プラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩの構造を表す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/55 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 9162−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/64 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 宮澤 恵二 東京都文京区西片１−11−５

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する蛋白質。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
   分子量が約４０，０００ダルトンであり、（２）肝細胞
   増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性
   を有し、（３）配列表の配列番号１〜７のいずれかに記
   載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸
   配列を有する。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１〜７に記載のアミノ
   酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有
   し、肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻
   害する活性を有する蛋白質。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配
   列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋
   白質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配
   列において３６番目のグリシンから５１３番目のロイシ
   ンまでの配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列
   を有する蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
6. 【請求項６】 請求項２記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】 請求項３記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号８に記載の塩基配列ま
   たはこれと実質的に同一の塩基配列で表わされることを
   特徴とする請求項７記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項４記載の蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号８に記載の塩基配列
    において１０６番目のグアニンから１５４２番目のアデ
    ニンまでの塩基配列またはこれと実質的に同一の塩基配
    列で表わされることを特徴とする請求項９記載のＤＮ
    Ａ。
11. 【請求項１１】 請求項１記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
12. 【請求項１２】 請求項２記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
13. 【請求項１３】 請求項３記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
14. 【請求項１４】 配列表の配列番号８に記載の塩基配列
    またはこれと実質的に同一の塩基配列で表わされること
    を特徴とする請求項１３記載の遺伝子。
15. 【請求項１５】 請求項４記載の蛋白質をコードする遺
    伝子。
16. 【請求項１６】 配列表の配列番号８に記載の塩基配列
    において１０６番目のグアニンから１５４２番目のアデ
    ニンまでの塩基配列またはこれと実質的に同一の塩基配
    列で表わされることを特徴とする請求項１５記載の遺伝
    子。
17. 【請求項１７】 請求項５から１６のいずれかに記載の
    ＤＮＡまたは遺伝子を含有してなる発現ベクター。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載の発現ベクターで宿主
    細胞を形質転換することにより得られる形質転換体。
19. 【請求項１９】 宿主細胞が動物細胞であることを特徴
    とする請求項１８記載の形質転換体。
20. 【請求項２０】 請求項１８または１９記載の形質転換
    体を培養して肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ
    活性を阻害する活性を有する蛋白質を産生することを特
    徴とする肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性
    を阻害する活性を有する蛋白質の産生方法。
21. 【請求項２１】 蛋白質が請求項１から４のいずれかに
    記載の蛋白質であることを特徴とする請求項２０記載の
    蛋白質の産生方法。