KR101841906B1 - 변형된 제 ix 인자 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

변형된 제 ix 인자 폴리펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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크리스토퍼. 타노스
그랜트 엘리스월스. 블라우스
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Abstract

변형된 제 IX 인자 (FIX) 폴리펩티드 및 그의 용도가 제공된다. 상기 변형된 FIX 폴리펩티드는 FIXa 및 FIX의 다른 형태를 포함한다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중에는, 변경된 활성, 전형적으로 변경된 응혈촉진 활성, 예를 들어 증가된 응혈촉진 활성을 갖는 것들이 있다. 따라서, 상기 변형된 폴리펩티드들은 치료제이다.

Description

변형된 제 IX 인자 폴리펩티드 및 이의 용도{MODIFIED FACTOR IX POLYPEPTIDES AND USES THEREOF}
변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 개선된 성질들, 예컨대, 증가된 응혈 활성을 나타내도록 변형된다. 또한, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하는 방법이 제공된다.
재조합적으로 제조된 제 IX 인자 (FIX) 폴리펩티드는 혈우병, 특히 혈우병 B의 치료에 승인되었다. 또한, 혈전 용해성 질환의 치료에 유용한 항-응고 활성을 나타내는 FIX 폴리펩티드가 치료제로 관심이 있다. 따라서, 다른 응고 인자와 마찬가지로, FIX 는 응혈촉진 및 항-응고 치료를 위한 중요한 치료제이다. 치료용 용도의 FIX 폴리펩티드에 대한 요청이 있다.
따라서, 본원의 목적 중에는 개선된 치료적 성질을 갖도록 설계된 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공하는데 목적이 있다.
관련 출원
우선권의 이익은 발명의 명칭 "변형된 제 IX 인자 폴리펩티드 및 이의 용도", 출원일 2010년 11월 3일, 에드윈 메디슨, 크리스토퍼 타노스 및 그랜트 엘스웨쓰 블루제의 미국 가출원번호 61/456,298호에 대하여 주장된다.
본 출원은 또한 미국 가출원번호 61/456,298호를 기초로 역시 우선권을 주장하고, 발명의 명칭 "변형된 제 IX 인자 폴리펩티드 및 이의 용도"이며, 본원과 동일자로 제출되는 (변호사 서류번호 33328.04918.US01/4918) 대응 미국 출원과 관련이 있다.
허용되는 경우, 상기 언급된 출원들 각각의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다.
전자적으로 제공된 서열목록의 참조 포함
서열목록의 전자 버전이 본원과 함께 제출되며, 그 내용은 전체가 참조로써 본원에 포함된다. 전자파일은 1.07 메가바이트 크기이며, 제목은 4918SEQPC1.txt이다.
요약
변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 개선된 응혈촉진성 치료적 성질들을 가진다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중에는 응혈 활성 증가, 촉매 활성 증가, AT-III, 헤파린 및/또는 AT-III/헤파린 복합체에 대한 내성 증가, 및/또는 개선된 약동학적 성질, 예컨대, i) 제거율 감소, ii) 분포 용적의 변경 (예컨대, 증가 또는 감소), iii) 생체내 회수율 향상, iv) 생체내 총 단백질 노출 (즉, AUC) 향상, v) 혈청 반감기 증가 (α-, β- 및/또는 γ-상), vi) 평균 공명 시간 (MRT: Mean Resonance Time) 증가를 나타내는 것들이 제공된다. 일부 예에서, 개선된 약동학적 성질들은 글리코실화 증가 및/또는 저밀도 리포단백질 수용체-관련 단백질 (LRP)에 대한 결합 감소의 결과이다. 또한, 본원에서는 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 변형된 FIX 폴리펩티드의 이용방법, 예컨대, 출혈 장애의 치료 방법이 제공된다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중에는 비-변형된 FIX 폴리펩티드 중에 2개의 아미노산 치환을 포함하는 것으로서, 제1 아미노산 치환이 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 53, 61, 64, 85, 103, 104, 105, 106, 108, 155, 158, 159, 167, 169, 172, 179, 202, 203, 204, 205, 228, 239, 241, 243, 247, 249, 251, 257, 259, 260, 262, 265, 284, 293, 312, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 321, 333, 338, 343, 346, 345, 392, 394, 400, 403, 410, 412 및 413 중에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에 있고, 제2 아미노산 치환이 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 5, 53, 61, 64, 85, 155, 158, 159, 167, 239, 260, 284, 293, 312, 318, 333, 338, 346, 400, 403, 410, 412 및 413 중에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에 있는 것들이 있다.
일부 예에서, 제1 또는 제2 아미노산 치환은 알라닌 (Ala, A); 아르기닌 (Arg, R); 아스파라긴 (Asn, N); 아스파르트산 (Asp, D); 시스테인 (Cys, C); 글루탐산 (Glu, E); 글루타민 (Gln, Q); 글리신 (Gly, G); 히스티딘 (His, H); 이소루이신 (Ile, I); 루이신 (Leu, L); 라이신 (Lys, K); 메티오닌 (Met, M); 페닐알라닌 (Phe, F); 프롤린 (Pro, P); 세린 (Ser, S); 트레오닌 (Thr, T); 트립토판 (Trp, W); 티로신 (Tyr, Y); 및 발린 (Val, V) 중에서 선택되는 아미노산 잔기를 이용한 치환이며, 단 치환 아미노산은 치환되는 아미노산과 동일하지 않다. 특별한 예에서, 제1 아미노산 치환은 알라닌; 아스파라긴; 아스파르트산, 글루탐산; 글루타민; 히스티딘; 이소루이신; 루이신; 라이신; 메티오닌; 페닐알라닌; 세린; 트레오닌; 티로신 및 발린 중에서 선택되는 아미노산 잔기를 이용한 치환이다. 예를 들어, 아미노산 치환의 예는 S53A, S61A, D64A, D64N, D85N, A103N, D104N, N105S, K106S, K106N, V108S, Y155F, Y155H, Y155Q, S158A, S158D, S158E, T159A, N167D, N167Q, T169A, T172A, T179A, V202M, V202Y, D203M, D203Y, A204M, A204Y, K228N, E239A, E239N, E239S, E239R, E239K, T241N, H243S, K247N, N249S, I251S, H257F, H257E, H257F, H257Y, H257S, Y259S, N260S, A262S, K265T, Y284N, K293E, K293A, R312Q, R312A, R312Y, R312L, F314N, H315S, K316S, K316N, K316A, K316E, K316S, K316M, G317N, R318A, R318E, R318Y, R318N, S319N, A320S, L321S, R333A, R333E, R333S, R338A, R338E, R338L, T343R, T343E, T343Q, F342I, Y345A, Y345T, N346D, N346Y, K392N, K394S, K400A, K400E, R403A, R403E, E410Q, E410N, E410D, E410S, E410A, T412A, T412V 또는 K413N 을 포함한다. 다른 아미노산 치환의 예는 보존적 아미노산 치환이다.
일부 예에서, 제2 아미노산 치환은 알라닌; 아르기닌; 아스파라긴; 아스파르트산; 글루탐산; 글루타민; 히스티딘; 루이신; 라이신; 페닐알라닌; 세린; 트레오닌; 티로신; 또는 발린 중에서 선택되는 아미노산 잔기를 이용한 치환이다. 예를 들어, 아미노산 치환의 예는 K5A, S53A, S61A, D64A, D64N, D85N, Y155F, Y155H, Y155Q, S158A, S158D, S158E, T159A, N167D, N167Q, E239A, E239N, E239S, E239R, E239K, N260S, Y284N, K293E, K293A, R312Q, R312A, R312Y, R312L, R318A, R318E, R318Y, R318N, R333A, R333E, R333S, R338A, R338E, R338L, N346D, N346Y, K400A, K400E, R403A, R403E, E410Q, E410N, E410D, E410S, E410A, T412A, T412V 또는 K413N 을 포함한다. 다른 아미노산 치환의 예는 보존적 아미노산 치환이다.
특별한 예에서, 제1 아미노산 치환은 155, 247, 249, 318, 338, 403 및 410 중에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에 있으며, 예를 들어, Y155F, K247N, N249S, R318Y, R338E, R403E 및 E410N 이다. 추가의 예로, 제2 아미노산 치환은 155, 247, 249, 318, 338, 403 및 410 중에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에 있으며, 예를 들어, Y155F, K247N, N249S, R318Y, R338E, R403E 및 E410N 이다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중에는 K400E/R403E, R318E/R403E, R318Y/E410N, K228N/R318Y, Y155F/K228N, Y155F/I251S, Y155F/N346D, Y155F/N260S, R338E/T343R, E410N/T412A, E410N/T412V, R318Y/R338E, D85N/K228N, D85N/I251S, K400A/R403A, R338A/R403A, R338E/R403E, K293A/R403A, K293E/R403E, R318A/R403A, R338E/E410N, K228N/E410N, K228N/R338E, K228N/R338A 및 R403E/E410N 에 상응하는 아미노산 치환 중에서 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 것들이 있다.
일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 하나 이상의 추가의 아미노산 치환, 예를 들어, 서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드에서 53, 61, 64, 85, 103, 104, 105, 106, 108, 155, 158, 159, 167, 169, 172, 179, 202, 203, 204, 205, 228, 239, 241, 243, 247, 249, 251, 257, 259, 260, 262, 265, 284, 293, 312, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 321, 333, 338, 343, 346, 345, 392, 394, 400, 403, 410, 412 및 413 중에서 선택되는 위치에서 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 Y5A, S53A, S61A, D64A, D64N, D85N, A103N, D104N, N105S, K106S, K106N, V108S, Y155F, Y155H, Y155Q, S158A, S158D, S158E, T159A, N167D, N167Q, T169A, T172A, T179A, V202M, V202Y, D203M, D203Y, A204M, A204Y, K228N, E239A, E239N, E239S, E239R, E239K, T241N, H243S, K247N, N249S, I251S, H257F, H257E, H257F, H257Y, H257S, Y259S, N260S, A262S, K265T, Y284N, K293E, K293A, R312Q, R312A, R312Y, R312L, F314N, H315S, K316S, K316N, K316A, K316E, K316S, K316M, G317N, R318A, R318E, R318Y, R318N, S319N, A320S, L321S, R333A, R333E, R333S, R338A, R338E, R338L, T343R, T343E, T343Q, F342I, Y345A, Y345T, N346D, N346Y, K392N, K394S, K400A, K400E, R403A, R403E, E410Q, E410N, E410D, E410S, E410A, T412A, T412V 및 K413N, 또는 보존적 아미노산 치환 중에서 선택되는 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 R318Y/R338E/R403E, D203N/F205T/R318Y, R318Y/R338E/E410N, K228N/R318Y/E410N, R318Y/R403E/E410N, R318Y/R338E/R403E/E410N, D203N/F205T/R318Y/E410N, A103N/N105S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/R318Y/E410N/R338E, I251S/R318Y/E410N/R338E, D104N/K106S/I251S/R318Y/E410N/R338E, A103N/N105S/Y155F, D104N/K106S/Y155F, Y155F/K247N/N249S, A103N/N105S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, A103N/N105S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/E240N, Y155F/R318Y/R338E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/E410N, D104N/K106S/Y155F/K228N/K247N/N249S, D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S, D104N/K106S/Y155F/K228N, Y155F/K228N/K247N/N249S, R318Y/R338E/R403E/E410S, R318Y/R338E/R403E/E410N/T412V, R318Y/R338E/R403E/E410N/T412A, R318Y/R338E/R403E/T412A, R318Y/R338E/E410S, R318Y/R338E/T412A, R318Y/R338E/E410N/T412V, D85N/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N, Y155F/R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N, Y155F/N260S/N346D, K247N/N249S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, D104N/K106S/Y155F/N260S, Y155F/K247N/N249S/N260S, D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S/N260S, D104N/K106S/Y155F/K228N, D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S, D85N/D203N/F205T, D85N/D104N/K106S/I251S, K293A/R338A/R403A, K293E/R338E/R403E, R338E/R403E/E410N, D203N/F205T/K228N, D203N/F205T/E410N, D203N/F205T/R338E, D203N/F205T/R338A, D203N/F205T/R338E/R403E, K228N/R338E/R403E, K247N/N249S/N260S, D104N/K106S/N260S, K228N/K247N/N249S/D104N/K106S, A103N/N105S/K228N, D104N/K106S/K228N, A103N/N105S/I251S, D104N/K106S/I251S, A103N/N105S/K247N/N249S, D104N/K106S/K247N/N249S, K228N/K247N/N249S, D104N/K106S/K228N/K247N/N249S, K247N/N249S/N260S, D104N/K106S/N260S, Y259F/K265T/Y345T 및 D104N/K106S/K247N/N249S/N260S 에 상응하는 아미노산 치환들 중에서 선택되는 아미노산 치환을 포함한다.
또한, 비-변형된 FIX 폴리펩티드에 변형을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드로서, 상기 변형이 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 아미노산 치환 S61A, D64A, Y155F, N157D, S158A, S158D, S158E, N167D, N167Q, T169A, T172A, D203M, D203Y, A204M, A204Y, E239S, E239R, E239K, H257F, H257E, R312Y, R312L, K316M, R318E, R318Y, T343R, T343E, F342I, N346Y, K400E, E410D, E410S, E410A, T412A 및 T412V 에 상응하는 변형 중에서 선택되는 것인 변형된 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 상기 아미노산 치환들 중 둘 이상을 포함한다.
특별한 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 돌연변이 Y155F 를 포함한다. 예를 들어, Y155F 및 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 247, 249, 338, 403 및 410 에 상응하는 위치 중에서 선택되는 아미노산 위치에서 변형을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 예에서, 변형된 FIX 는 Y155F/K247N/N249S 를 포함한다. 추가의 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드 돌연변이 R318Y 를 포함한다. 예를 들어, R318Y 및 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 338, 403 및 410 에 상응하는 위치로부터 선택되는 아미노산 위치에서 변형, 예를 들어, R338E, R403E 또는 E410N 을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 서열을 갖는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 5, 53, 61, 64, 85, 103, 104, 105, 106, 108, 148, 155, 157, 158, 159, 167, 169, 172, 179, 202, 202, 203, 204, 205, 228, 239, 241, 243, 247, 249, 251, 257, 259, 260, 262, 265, 284, 293, 312, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 333, 338, 343, 345, 346, 392, 394, 400, 403, 410, 412 및 413 에 상응하는 위치 중에서 선택되는 아미노산 위치에서 하나 이상의 추가의 변형을 포함한다. 변형(들)의 예는 아미노산 치환 K5A, S53A, S61A, D64A, D64N, D85N, A103N, D104N, N105S, N105T, K106N, K106N, K106T, V108S, V108T, T148A, Y155F, Y155H, N157D, N157Q, S158A, S158D, S158E, T159A, N167D, N167Q, T169A, T172A, T179A, V202M, V202Y, D203M, D203Y, D203N, A204M, A204Y, F205S, F205T, K228N, E239N, T241N, E239S, E239A, E239R, E239K, H243S, H243T, K247N, N249S, N249T, I251S, I251T, H257F, H257Y, H257E, H257S, N260S, A262S, A262T, Y284N, K293E, K293A, R312Q, R312A, R312Y, R312L, F314N, H315S, K316S, K316T, K316M, G317N, R318E, R318Y, R318N, R318A, S319N, A320S, L321N, L321S, L321T, R333A, R333E, R338A, R338E, T343R, T343E, T343Q, F342I, Y345A, Y345T, N346D, N346T, K392N, K394S, K394T, K400A, K400E, R403A, R403E, E410Q, E410S, E410N, E410A, E410D, T412V, T412A 및 K413N 에 상응하는 변형 중에서 선택된다.
따라서, 본원에서는 아미노산 치환 K400E/R403E, R318E/R403E, R318Y/E410N, R318Y/R338E/R403E, D203N/F205T/R318Y, K228N/R318Y, R318Y/R338E/E410N, K228N/R318Y/E410N, R318Y/R403E/E410N, R318Y/R338E/R403E/E410N, D203N/F205T/R318Y/E410N, A103N/N105S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/R318Y/E410N/R338E, I251S/R318Y/E410N/R338E, D104N/K106S/I251S/R318Y/E410N/R338E, A103N/N105S/Y155F, D104N/K106S/Y155F, Y155F/K228N, Y155F/I251S, Y155F/K247N/N249S, A103N/N105S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, A103N/N105S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/E240N, Y155F/R318Y/R338E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/E410N, D104N/K106S/Y155F/K228N/K247N/N249S, D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S, D104N/K106S/Y155F/K228N, Y155F/K228N/K247N/N249S, R318Y/R338E/R403E/E410S, R318Y/R338E/R403E/E410N/T412V, R318Y/R338E/R403E/E410N/T412A, R318Y/R338E/R403E/T412A, R318Y/R338E/E410S, R318Y/R338E/T412A, R318Y/R338E/E410N/T412V, D85N/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N, Y155F/N346D, Y155F/R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N, Y155F/N260S, Y155F/N260S/N346D, K247N/N249S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, D104N/K106S/Y155F/N260S, Y155F/K247N/N249S/N260S, R338E/T343R and D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S/N260S, D104N/K106S/Y155F/K228N, D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S, T343R/Y345T, E410N/T412A, R410N/T412V 및 R318Y/R338E 에 상응하는 변형 중에서 선택되는 변형을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 특별한 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 치환 R318Y/R338E/R403E/E410N 또는 Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N 에 상응하는 변형을 포함한다.
일부 예에서, 비-변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 20 또는 325 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이들의 종 변이체, 또는 서열번호 2, 3, 20 또는 325 중 어느 하나의 FIX 와 60% 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체이거나, 서열번호 2, 3, 20 또는 325 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 FIX 폴리펩티드의 활성 절편이다. 예를 들어, 상기 종 변이체는 서열번호 4-18 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 예에서, 서열번호 2, 3, 20 또는 325 중 어느 하나의 FIX 와 60% 이상 서열 동일성을 갖는 변이체는 서열번호 75-272 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가진다. 추가의 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 활성 절편이고; 변형된 FIX 폴리펩티드는 상기 변형(들)을 포함한다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중 임의의 것은 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 글리코실화 위치를 도입 및/또는 제거하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 글리코실화 위치는 N-, O- 및 S-글리코실화 위치 중에서 선택된다. 한 예에서, 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 N-글리코실화 위치가 도입된다. 일부 예에서, N-글리코실화 위치는 서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드 중 Y1, S3, G4, K5, L6, E7, F9, V10, Q11, G12, L14, E15, R16, M19, E20, K22, S24, F25, E26, E27, A28, R29, E30, V31, F32, E33, T35, E36, R37, T39, E40, F41, W42, K43, Q44, Y45, V46, D47, G48, D49, Q50, E52, S53, N54, L57, N58, G59, S61, K63, D65, I66, N67, S68, Y69, E70, W72, P74, F77, G79, K80, N81, E83, L84, D85, V86, T87, N89, 190, K91, N92, R94, K100, N101, S102, A103, D104, N105, K106, V108, S110, E113, G114, R116, E119, N120, Q121, K122, S123, E125, P126, V128, P129, F130, R134, V135, S136, S138, Q139, T140, S141, K142, A146, E147, A148, V149, F150, P151, D152, V153, D154, Y155, V156, S158, T159, E160, A161, E162, T163, I164, L165, D166, I168, T169, Q170, S171, T172, Q173, S174, F175, N176, D177, F178, T179, R180, G183, E185, D186, K188, P189, K201, V202, D203, E213, E224, T225, G226, K228, E239, E240, T241, H243, K247, N249, I251, R252, I253, P255, H257, N258, N260, A261, A262, I263, N264, K265, A266, D276, E277, P278, V280, N282, S283, Y284, D292, K293, E294, N297, I298, K301, F302, G303, S304, Y306, R312, F314, H315, K316, G317, R318, S319, L321, V322, Y325, R327, P329, L330, D332, R333, A334, T335, L337, R338, K341, F342, T343, Y345, N346, H354, E355, G357, R358, Q362, E372, E374, G375, E388, M391, K392, G393, K394, R403, N406, K409, E410, K411, 및 K413 중에서 선택되는 위치에 상응하는 아미노산 위치에 도입된다.
글리코실화를 도입하는 변형의 예는 아미노산 치환 Y1N, Y1N + S3T, S3N + K5S/T, G4T, G4N + L6S/T, K5N + E7T, L6N + E8T, E7N + F9T, F9N +Q11S/T, V10N+G12S/T, Q11N + N13T, G12N + L14S/T, L14N + R16T, E15T, E15N + E17T; R16N +C18S/T, M19N + E21T; E20N + K22T, K22N, S24N + E26T; F25N + E27T; E26N + A28T; E27N + R29T; A28N + E30T; R29N+V31S/T, E30N + F32T; V31N + E33T; F32N + N34T, E33N, T35N + R37S/T, E36T; E36N; R37N, T39N + F41S/T, E40N + W42T, F41N + K43S/T, W42N +Q44S/T, K43N + Y45T; Q44N+V46S/T, Y45N + D47T, V46N +G48S/T, D47N + D49S/T, G48N +Q50S/T, D49N +C51S/T, Q50N + E52S/T, E52N + N54T, S53N + P55S/T, C56S/T, L57N+G59S/T, G59N + S61T; G60S/T, S61N + K63S/T, K63N + D65S/T, D65N + N67S/T, I66N + S68S/T, Y69S/T, Y69N +C71S/T, S68N + E70S/T, E70N+W72S/T, W72N + P74S/T, P74N+G76S/T, F75N, G76N + E78T, E78N + K80T, F77T, F77N+G79S/T, G79N + N81S/T, K80N+C82S/T, E83S/T, E83N + D85S/T, L84N+V86S/T, D85N, V86A, V86N +C88S/T, T87N + N89S/T, I90N + N92S/T, K91S/T, I90N + N92S/T, K91N+G93S/T, R94S/T, R94N + E96S/T, K100N, A103S/T, S102N + D104S/T, A103N + N105S/T, D104N + K106S/T, V107S/T, K106N+V108S/T, V108N+V110S/T, S111N, E113N+Y115S/T, G114N + R116S/T, R116N+A118S/T, E119N +Q121S/T, K122S/T, Q121N + S123S/T, K122N+C124S/T S123N + E125S/T, E125N+A125S/T, P126N+V128S/T, A127N + P129T, V128N + F130S/T, P129N + P131S/T, F130N+C132S/T, R134N, V135N+V137S/T, S136N, S138N, V137N + Q139T; Q139N, T140N + L142S/T, S141N + L143S/T, K142N, A146N+A148S/T, E147N+V149S/T, T148N+ F150S/T, V149N + P151S/T, F150N + D152S/T, P151N+V153S/T, D152N + D154S/T, V153N+Y155S/T, D154N+V156S/T, Y155N + N157S/T, V156N, S158N + E160S/T, T159N+A161S/T, E160N + E162S/T, A161N, E162N +I164S/T, T163N + L165S/T, I164N + D166S/T, L165N + N167S/T, D166N + I168S/T, I168N+Q170S/T, T169N, Q170N, S171N +Q173S/T, T172N, Q173N + F175S/T, S174N + N176S/T, F175N + D177S/T, F178S/T, D177N, D177E, F178N + R180S/T, T179N+V181S/T, R180N+V182S/T, G183 + E185S/T, G184N + D186T, E185N+A187S/T, D186N + K188S/T, A187N + P189T, K188N+G190S/T, P189N +Q181S/T, G200N + V202T, K201N + D203S/T, K201T, V202N+A204S/T, D203N + F205S/T, E213N +W215S/T, K214T, V223T, E224N+G226S/T, T225N+V227S/T, G226N + K228S/T, V227N + I229T, K228N, H236N + I238T; I238N + E240T; E239N, E240N + E242S/T, E242N, T241N + H243S/T, H243N + E245S/T, K247N + N249S/T, V250N + R252T, I251S/T, I251N + I253S/T, R252N + I254S/T, I253N + P255S/T, P255N + H257S/T, H257N+Y259S/T, N260S/T, A262S/T, A261N + I263S/T, A262N + N264S/T, I263N + K265S/T, K265N + N267S/T, A266N + H268S/T, D276N + P278S/T, P278N+V280S/T, E277N + L279S/T, V280N + N282S/T, Y284S/T, S283N+V285S/T, Y284N, D292N + K294S/T, K293N+Y295S/T, E294N, F299S/T, I298N + L300S/T, K301N+G303S/T, F302N, G303N +G305S/T, S304N+Y306S/T, Y306N +S308S/T, R312N + F314S/T, V313N + H315T, F314N + K316S/T, H315N +G317S/T, K316N + R138S/T, G317N, R318N+A320S/T, S319N + L321S/T, A320N + V322T, L321N + L323S/T, V322N+Q324S/T, Y325N + R327S/T, R327N + P329S/T, P329N+V331S/T, L330N + D332S/T, D332N+A334S/T, R333N, A334N+C336S/T, T335N + L337S/T, L337N, R338N, S339N + K341T, T340N + F342T; K341N, F342N + I344S/T, T343N+Y345S/T, Y345N + N347S/T, M348S/T, G352N + H354T, F353N, F353N + E355T, H354N +G356S/T, H354V, H354I, E355T, E355N+G357S/T, G356N + R358T, G357N + D359S/T, R358N, Q362N + D364S/T, V370N; T371V; T371I; E372T, E372N + E374S/T, E374N, G375N, W385N + E387T; G386N + E388T, E388N+A390S/T, A390N + K392T, M391N+G393S/T, K392N + K394S/T, K392V, G393T, G393N+Y395S/T, K394N+G396S/T, R403N+V405S/T, I408S/T, K409N + K411S/T, E410N, K411N + K413S/T, 및 K413N 에 상응하는 변형 중에서 선택되는 것들을 포함한다. 일부 예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상의 글리코실화 위치가 도입된다.
본원에서는 또한 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 N-글리코실화 위치를 제거하는 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드의 N157 또는 N167 에 상응하는 아미노산 위치의 N-글리코실화 위치가 제거될 수 있다. N-글리코실화 위치를 제거하는 변형의 예는 아미노산 치환 N157D, N157Q, N167D 및 N167Q 에 상응하는 변형 중에서 선택되는 것들을 포함한다. 추가의 예에서, FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 O-글리코실화 위치를 제거하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, 제거될 수 있는 O-글리코실화 위치는 서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드의 S53, S61, T159 및 T169 중에서 선택되는 위치에 상응하는 아미노산 위치들을 포함한다. N-글리코실화 위치를 제거하는 변형의 예는 아미노산 치환 S53A, S61A, T159A 및 T169A 에 상응하는 변형 중에서 선택되는 것들을 포함한다.
또한, 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 설페이트화 위치를 도입 및/또는 제거하는 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 한 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드의 위치 Y155 에 상응하는 아미노산 위치에 설페이트화 위치를 제거하는 변형을 포함한다. 그러한 변형의 예는 아미노산 치환 Y155H, Y155F 및 Y155Q 에 상응하는 것들이 있다.
비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 포스포릴화 위치를 도입 및/또는 제거하는 하나 이상의 변형을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 한 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드의 위치 S158 에 상응하는 아미노산 위치에서 포스포릴화 위치를 제거하는 변형을 포함한다. 그러한 변형의 예는 아미노산 치환 S158A, S158D 및 S158E 에 상응하는 것들이다. 또한, 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 β-히드록실화 위치를 도입 및/또는 제거하는 하나 이상의 변형을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 한 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드의 위치 D64 에 상응하는 아미노산 위치에서 β-히드록실화 위치를 제거하는 변형을 포함한다. 그러한 변형의 예는 아미노산 치환 D64N 및 D64A 에 상응하는 것들이다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중 임의의 것은 당 분야에 알려진 기타 다른 돌연변이들, 예를 들어 다음의 아미노산 치환들 중에서 선택되는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다: 아미노산 치환 Y1A, Y1C, Y1D, Y1E, Y1G, Y1H, Y1K, Y1N, Y1P, Y1Q, Y1R, Y1S, Y1T, S3T, K5A, K5I, K5L, K5F, K5E, L6A, L6C, L6D, L6E, L6G, L6H, L6K, L6N, L6P, L6Q, L6R, L6S, L6T, L6M, F9A, F9C, F9D, F9E, F9G, F9H, F9K, F9N, F9P, F9Q, F9R, F9S, F9T, F9I, F9M, F9W, V10A, V10C, V10D, V10E, V10G, V10H, V10K, V10N, V10P, V10Q, V10R, V10S, V10T, V10F, V10I, V10K, V10M, V10W, V10Y, Q11E, Q11D, Q11A, Q11C, Q11G, Q11P, G12D, G12E, G12G, G12H, G12K, G12N, G12P, G12Q, G12R, G12S, G12T, N13A, N13C, N13G, N13H, N13P, N13T, L14A, L14C, L14D, L14E, L14G, L14H, L14K, L14N, L14P, L14Q, L14R, L14S, L14T, L14F, L14I, L14M, L14V, L14W, L14Y, E15D, E15H, E15P, R16E, R16A, R16C, R16G, R16P, R16T, E17A, E17C, E17G, E17P, E17T, C18D, C18E, C18G, C18H, C18K, C18N, C18P, C18Q, C18R, C18S, C18T, M19A, M19C, M19D, M19E, M19G, M19H, M19K, M19N, M19P, M19Q, M19R, M19S, M19T, M19F, M19I, M19M, M19V, M19W, M19Y, E20A, E20C, E20G, E20P, E20T, E21A, E21C, E21G, E21P, K22H, K22P, K22T, S24H, S24P, F25A, F25C, F25D, F25E, F25G, F25H, F25K, F25N, F25P, F25Q, F25R, F25S, F25T, F25I, F25M, F25W, F25Y, E26A, E26C, E26G, E26P, E27A, E27C, E27G, E27H, E27P, E27S, E27T, A28C, A28D, A28E, A28G, A28H, A28K, A28N, A28P, A28Q, A28R, A28S, A28T, R29A, R29C, R29G, R29P, R29F, E30D, E30H, E30P, V31A, V31C, V31D, V31E, V31G, V31H, V31K, V31N, V31P, V31Q, V31R, V31S, V31T, V31F, V31I, V31W, V31Y, F32A, F32C, F32D, F32E, F32G, F32H, F32K, F32N, F32P, F32Q, F32R, F32S, F32T, E33H, E33N, E33P, E33Q, E33S, E33T, N34E, N34D, N34F, N34I, N34L, T35D, T35E, T35A, T35C, T35G, T35P, F41A, F41C, F41D, F41E, F41G, F41H, F41K, F41N, F41P, F41Q, F41R, F41S, F41T, F41M, F41W, F41Y, W42A, W42C, W42D, W42E, W42G, W42H, W42K, W42N, W42P, W42Q, W42R, W42S, W42T, K43A, K43C, K43G, K43P, Q44P, Q44T, Q44, Y45A, Y45C, Y45D, Y45E, Y45G, Y45H, Y45K, Y45N, Y45P, Y45Q, Y45R, Y45S, Y45T, V46A, V46C, V46D, V46E, V46G, V46H, V46K, V46N, V46P, V46Q, V46R, V46S, V46T, V46F, V46I, V46M, V46W, V46Y, D47A, D47C, D47G, D47H, D47P, D47T, G48D, G48E, G48P, G48T, D49H, D49P, D49Q, D49T, Q50A, Q50C, Q50D, Q50G, Q50H, Q50P, Q50T, C51D, C51E, C51G, C51H, C51K, C51N, C51P, C51Q, C51R, C51S, C51T, E52P, E52T, S53A, S53C, S53G, S53H, S53P, S53T, N54H, N54P, N54T, L57A, L57C, L57D, L57E, L57G, L57H, L57K, L57N, L57P, L57Q, L57R, L57S, L57T, L57F, L57I, L57M, L57W, L57Y, G60C, G60D, G60H, G60P, G60T, C62D, C62H, C62P, K63T, D65H, D65T, I66A, I66C, I66D, I66E, I66G, I66H, I66K, I66N, I66P, I66Q, I66R, I66S, I66T, I66M, I66W, I66Y, Y69A, Y69C, Y69D, Y69E, Y69G, Y69H, Y69K, Y69N, Y69P, Y69Q, Y69R, Y69S, Y69T, C71H, C71P, W72A, W72C, W72D, W72E, W72G, W72H, W72K, W72N, W72P, W72Q, W72R, W72S, W72T, W72I, W72Y, F75A, F75C, F75D, F75E, F75G, F75H, F75K, F75N, F75P, F75Q, F75R, F75S, F75T, F77A, F77C, F77D, F77E, F77G, F77H, F77K, F77N, F77P, F77Q, F77R, F77S, F77T, L84A, L84C, L84D, L84E, L84G, L84H, L84K, L84N, L84P, L84Q, L84R, L84S, L84T, L84M, L84W, L84Y, V86I, V86L, V86M, V86F, V86W, V86Y, V86A, V86C, V86D, V86E, V86G, V86H, V86K, V86N, V86P, V86Q, V86R, V86S, V86T, I90A, I90C, I90D, I90E, I90G, I90H, I90K, I90N, I90P, I90Q, I90R, I90S, I90T, I90M, I90W, K91A, K91C, K91G, K91P, N92A, N92C, N92G, N92P, N92T, G93D, G93E, G93H, G93K, G93N, G93P, G93Q, G93R, G93S, G93T, R94A, R94C, R94G, R94P, C95D, C95E, C95G, C95H, C95K, C95N, C95P, C95Q, C95R, C95S, C95T, E96P, E96T, Q97A, Q97C, Q97G, Q97P, F98A, F98C, F98D, F98E, F98G, F98H, F98K, F98N, F98P, F98Q, F98R, F98S, F98T, F98M, F98W, F98Y, K100A, K100C, K100G, K100P, N101H, N101T, A103D, A103E, A103H, A103K, A103N, A103P, A103Q, A103R, A103S, A103T, D104T, K106H, K106P, K106T, V107A, V107C, V107D, V107E, V107G, V107H, V107K, V107N, V107P, V107Q, V107R, V107S, V107T, V108A, V108C, V108D, V108E, V108G, V108H, V108K, V108N, V108P, V108Q, V108R, V108S, V108T, V108F, V108M, V108W, V108Y, S110A, S110C, S110G, S110P, C111D, C111E, C111H, C111K, C111N, C111P, C111Q, C111R, C111S, C111T, T112A, T112C, T112G, T112P, E113D, E113H, E113P, G114D, G114E, G114H, G114K, G114N, G114P, G114Q, G114R, G114S, G114T, Y115A, Y115C, Y115D, Y115E, Y115G, Y115H, Y115K, Y115N, Y115P, Y115Q, Y115R, Y115S, Y115T, Y115M, Y115W, R116P, R116T, L117A, L117C, L117D, L117E, L117G, L117H, L117K, L117N, L117P, L117Q, L117R, L117S, L117T, A118D, A118E, A118H, A118K, A118N, A118P, A118Q, A118R, A118S, A118T, N120D, N120H, N120P, Q121T, S123H, S123T, V128A, V128C, V128D, V128E, V128G, V128H, V128K, V128N, V128P, V128Q, V128R, V128S, V128T, F130A, F130C, F130D, F130E, F130G, F130H, F130K, F130N, F130P, F130Q, F130R, F130S, F130T, V135A, V135C, V135D, V135E, V135G, V135H, V135K, V135N, V135P, V135Q, V135R, V135S, V135T, V135W, V135Y, V137A, V137C, V137D, V137E, V137G, V137H, V137K, V137N, V137P, V137Q, V137R, V137S, V137T, V137M, V137W, V137Y, S138H, S138T, T140D, T140H, S141T, K142H, K142P, L143A, L143C, L143D, L143E, L143G, L143H, L143K, L143N, L143P, L143Q, L143R, L143S, L143T, L143F, L143I, L143M, L143V, L143W, L143Y, R145H, R145P, R145T, A146P, A146T, T148H, T148P, V149A, V149C, V149D, V149E, V149G, V149H, V149K, V149N, V149P, V149Q, V149R, V149S, V149T, V149F, V149I, V149M, V149W, V149Y, F150A, F150C, F150D, F150E, F150G, F150H, F150K, F150N, F150P, F150Q, F150R, F150S, F150T, F150M, F150W, F150Y, D152A, D152C, D152G, D152P, D152S, D152T, V153A, V153C, V153D, V153E, V153G, V153H, V153K, V153N, V153P, V153Q, V153R, V153S, V153T, V153F, V153I, V153M, V153W, V153Y, D154A, D154C, D154G, D154P, D154Q, D154S, Y155A, Y155C, Y155D, Y155E, Y155G, Y155H, Y155K, Y155N, Y155P, Y155Q, Y155R, Y155S, Y155T, Y155M, Y155V, Y155W, V156A, V156C, V156D, V156E, V156G, V156H, V156K, V156N, V156P, V156Q, V156R, V156S, V156T, V156I, V156M, V156W, V156Y, N157A, N157C, N157G, N157H, N157P, N157Q, N157T, S158H, S158P, S158T, T159A, T159C, T159G, T159P, E160A, E160C, E160G, E160P, A161C, A161D, A161E, A161H, A161K, A161N, A161P, A161Q, A161R, A161S, A161T, E162P, E162T, T163A, T163C, T163G, T163P, I164A, I164C, 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G309N, G311Q, G311N, R312H, R312Q, F314I, F314V, K316N, K316Q, R318H, R318Q, L321I, L321V, Y325I, R327Q, P329A, P329S, D332N, D332Q, T335Q, T335H, T335N, L337I, L337V, R338H, R338Q, S339Q, S339H, S339N, T340Q, T340H, T340N, K341N, K341Q, F342I, F342V, T343Q, T343H, T343N, Y345I, M348I, M348V, F349V, G352Q, G352H, G352N, F353V, D359N, S360Q, S360H, S360N, G363Q, G363H, G363N, D364N, D364Q, S365Q, S365H, S365N, G366Q, G366H, G366N, G367Q, G367H, G367N, P368A, P368S, T371Q, T371H, T371N, E372Q, E372H, E372N, E374Q, E374H, E374N, G375Q, G375N, T376Q, T376H, T376N, S377Q, S377H, S377N, F378I, F378V, L379V, T380Q, T380H, T380N, S384Q, S384H, S384N, G386Q, G386H, G386N, E387Q, E387N, M391V, K392N, K392Q, K394N, K394Q, Y395I, G396Q, G396H, G396N, I397Q, I397H, I397N, Y398I, T399Q, T399H, T399N, K400N, K400Q, S402Q, S402H, S402N, R403H, R403Q, Y404I, K409N, K409Q, E410Q, E410N, K411N, K411Q, T412Q, T412H, T412N, K413N, K413Q, L414I, L414V, T415Q, T415H, T415N, R252A, H268A, K293A, K400A, R403A, R403E 및 K411A.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 항트롬빈 III, 헤파린 및/또는 AT-III/헤파린 복합체에 대한 내성 증가를 나타낸다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 항트롬빈 III 및/또는 헤파린에 대한 내성 증가를 나타낼 수 있다. 추가의 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 촉매활성을 나타낸다. 이는 FVIIIa 부재 또는 존재하에 있을 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 촉매 활성을 나타낼 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드는 추가로 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 약동학적 성질 개선, 예를 들어, 제거율 감소 (예컨대, 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 제거율), 분포 용적 변경 (예컨대, 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 분포 용적의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 감소 또는 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 분포 용적의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 증가), 생체내 회수율 증가 (예를 들어, 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 생체내 회수율의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상), 생체내 총 변형된 FIX 폴리펩티드 노출 증가 (예컨대, 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 생체내 총 노출의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 증가), 혈청 반감기의 증가 (비-변형된 FIX 폴리펩티드 혈청 반감기의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상), 및/또는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 평균 공명 시간 (MRT) 증가 (예를 들어, 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 생체내 MRT 의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 증가)를 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 개선된 약동학적 성질이 증가된 혈청 반감기인 경우, 혈청 반감기는 α. β 또는 γ 상이다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 응혈촉진 활성 증가, 예를 들어, 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 응혈촉진 활성을 나타낸다.
일부 예에서, 비-변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가진다. 따라서, 본원에서는 서열번호 75-272 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 다른 예에서, 비-변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 폴리펩티드의 변이체이며, 예컨대, 상기한 변형(들)을 제외하고 서열번호 3에 제시된 폴리펩티드와 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 대립유전자 또는 종 변이체이다.
일부 예에서, 상기 제공된 변형된 FIX 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드이다. 다른 예에서, 이들은 비-인간 폴리펩티드이다. 추가의 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 성숙한 폴리펩티드이다. 또한, 단일쇄 및 이중쇄 FIX 폴리펩티드, 및 활성 또는 활성화된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 예에서, 활성화는 제 IX 인자 (FIXa) 또는 조직 인자/제 VIIa 인자 복합체에 의한 단백분해 절단에 의해 달성된다.
일부 예에서, 상기 제공된 변형된 FIX 폴리펩티드는 오직 1차 서열상 변형되어 있다. 다른 예에서, 화학적 변형 또는 번역후 변형이 포함된다 (예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 글리코실화, 카르복실화, 히드록실화, 설페이트화, 포스포릴화, 알부민화 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기에 컨쥬게이트된다). 또한, 키메릭 또는 융합 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는, 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 하나 이상의 FIX 활성 (예를 들어, VIIIa 인자 결합, 제 X 인자 결합, 인지질 결합, 및/또는 응혈 활성)을 유지하는 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 변형 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 약 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 활성을 보유할 수 있다. 일부 예에서 보유되는 활성은 비-변형 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된다. 다른 예에서, 보유되는 활성은 비-변형된 FIX 폴리펩티드에 비하여 감소된다. 활성은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 측정될 수 있다.
상기 제공된 변형된 FIX 폴리펩티드 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 또한, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 상기 벡터는 예를 들어 원핵생물세포 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련-바이러스, 레트로바이러스, 헤르피스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 또는 사이토메갈로바이러스), 또는 진핵생물세포 벡터 (예를 들어, 포유동물세포 벡터)일 수 있다. 또한, 상기 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 세포는 예를 들어, 진핵생물세포, 예를 들어 포유동물 세포 (예를 들어, 어린 햄스터 신장 세포 (BHK-21) 또는 293 세포 또는 CHO 세포)일 수 있다. 전형적으로, 상기 세포는 변형된 FIX 폴리펩티드를 발현한다. 따라서, 본원에서 제공되는 세포들 중 어느 하나에 의해 생산된 변형된 FIX 폴리펩티드가 또한 제공된다.
약제학적으로 허용가능한 비히클 내에 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드를 치료적으로 유효한 농도 또는 양으로 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 예에서, 약제학적 조성물은 국소, 전신 또는 국부 투여, 예를 들어, 경구, 비강, 폐, 구강, 경피, 피하, 십이지장내, 장, 비경구, 정맥내 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 추가의 예에서, 제어-방출 또는 단일-용량 투여를 위하여 제형화된다.
상기 제공된 약제학적 조성물을 투여하여 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체가 FIX 또는 응혈원의 투여에 의해 치료되는 질환 또는 상태를 갖는 방법이 제공된다. 일부 예에서, 상기 질환 또는 상태는 활성인 FIX (FIXa) 또는 활성화되지 않은 FIX의 투여에 의해 치료된다. 일부 예에서, 상기 약제학적 조성물을 이용한 치료는 상기 질환 또는 상태와 연관된 징후를 개선하거나, 완화한다. 또한, FIX 또는 응혈원의 투여에 의해 치료되는 질환 또는 상태와 연관된 징후의 변화를 대상체에 대하여 모니터링하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
상기 방법을 이용하여 치료되는 질환 또는 상태는 혈액 응고 장애, 혈액 장애, 출혈성 장애, 혈우병 및 출혈 장해 중에서 선택될 수 있다. 일부 예에서, 혈우병은 혈우병 B이다. 상기 방법은 또한 하나 이상의 추가의 응고 인자, 예를 들어, 혈장 정제형 또는 재조합 응고 인자, 비타민 K, 비타민 K 유도체, 및 단백질 C 저해제와 같은 응혈원, 혈장, 혈소판, 적혈구 또는 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 포함한다.
또한, 포장재 및 포장재에 포함된 상기 제공된 변형된 FIX 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 제조품이 제공된다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 FIX 또는 응혈원의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환의 치료에 효과적이며, 상기 포장재는 변형된 FIX 폴리펩티드가 FIX 또는 응혈원의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환의 치료를 위하여 사용되는 것을 지시하는 라벨을 포함한다.
본원에서 제공되는 약제학적 조성물 중 어느 하나, 조성물의 투여장치, 및 선택적으로 투여지침서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
상세한 설명
개요
A. 정의
B. 지혈작용 및 그안의 제 IX 인자의 역할
1. 혈소판 부착 및 응집
2. 응고 캐스캐이드
a. 개시
b. 증폭
c. 전파
3. 응고의 조절
C. 제 IX 인자 (FIX) 구조 및 기능
1. FIX 구조
2. FIX 번역후 변형
3. FIX 활성화
4. FIX 기능
5. 생물약제로써 FIX
D. 변형된 FIX 폴리펩티드
1. 아미노산 치환의 예시
a. 변경된 글리코실화
i. 글리코실화의 장점
ii. 변경된 글리코실화를 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드의 예
(a). 비-천연 글리코실화 부위(들)의 도입
(b). 천연 글리코실화 부위의 제거
b. AT-III 및 헤파린에 대한 내성 증가
i. AT-III
ii. 헤파린
iii. AT-III 및 헤파린에 대한 증가된 내성을 갖는 FIX 폴리펩티드의 예
c. 촉매 활성을 증가시키기 위한 돌연변이
d. LRP 결합을 감소시키기 위한 돌연변이
e. 번역후 변형을 변경시키기 위한 다른 돌연변이들
2. 조합 변형
a. 활성을 증가시키기 위한 변형
b. 인지질에 대한 결합력을 증가시키거나 콜라겐과의 결합을 감소시키기 위한 변형
c. 저해제에 대한 내성을 증가시키기 위한 추가의 변형
d. 글리코실화를 변경하기 위한 추가의 변형
e. 프로테아제에 대한 내성을 증가시키기 위한 변형
f. 면역원성을 감소시키기 위한 변형
g. 조합 변형의 예
3. 컨쥬게이트 및 융합 단백질
E. FIX 폴리펩티드의 제조
1. 벡터 및 세포
2. 발현 시스템
a. 원핵생물세포 발현
b. 효모
c. 곤충 및 곤충세포
d. 포유동물 세포
e. 식물
2. 정제
3. 융합 단백질
4. 폴리펩티드 변형
5. 뉴클레오티드 서열
F. 변형된 FIX 폴리펩티드 활성 평가
1. 시험관내 분석
a. 글리코실화
b. 다른 번역후 변형
c. 단백분해 활성
d. 응고 활성
e. 다른 단백질 및 분자와 결합 및/또는 그에 의한 저해
e. 인지질 친화력
2. 비-인간 동물 모델
3. 임상 분석
G. 제형화 및 투여
1. 제형화
a. 용량
b. 제형
2. 변형된 FIX 폴리펩티드의 투여
3. 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 투여(유전자 치료)
H. 치료 용도
혈우병
a. 혈우병 B
b. 혈우병 A
J. 병용 요법
K. 제조품 및 키트
L. 실시예
A. 정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서 전반에 언급된 모든 특허, 특허출원, 공개출원 및 문헌, 진뱅크 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 공개자료들은 다른 언급이 없는 한, 본 발명에 전문이 참고 인용된다. 본 명세서에서 용어에 대한 정의가 복수개인 경우에는, 이 섹션에 제시된 정의가 우세하다. URL 또는 다른 이와 같은 식별자 또는 주소가 참고되는 경우에, 이러한 식별자는 변할 수 있고, 인터넷 상의 특정 정보는 변화할 수 있지만, 인터넷 조사를 통해 동등한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 참조는 그러한 정보의 입수용이성 및 공개 보급을 증명한다.
본 명세서에 사용된 응고 경로 또는 응고 캐스캐이드는 불용성 피브린 응괴의 형성을 야기하는 일련의 활성화 사건들을 의미한다. 응고 캐스캐이드 또는 경로에서 세린 프로테아제의 불활성 단백질(자이모겐이라고도 불림)은 하나 이상의 펩티드 결합의 절단에 의해 활성 프로테아제로 전환되고, 이어서 캐스캐이드 중의 다음 자이모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로 작용한다. 캐스캐이드의 최종 단백분해 단계에서 피브리노겐은 트롬빈에 의해 피브린으로 단백분해 절단되고, 이어서 상처 부위에서 가교결합하여 응괴를 형성한다.
본 명세서에 사용된 "지혈"은 기관이나 신체 부위에서의 출혈 또는 혈류의 정지를 의미한다. 지혈이란 용어는 혈관 상해 후 혈액 손실을 방지하는 혈괴화부터 조직 수복 후 혈괴의 후속 용해까지의 전 과정을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "응고(clotting)" 또는 "응고작용(coagulation)"은 불용성 피브린 응괴의 형성 또는 혈액의 응고인자가 응고 캐스캐이드에서 상호작용하여, 최종적으로 불용성 피브린 응괴를 형성시키는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "프로테아제"는 공유 펩티드 결합의 가수분해를 촉매화하는 효소이다. 이 명칭은 자이모겐 형태 및 이의 활성화된 단일쇄, 이중쇄 및 다중쇄 형태를 포함한다. 분명히 말하면, 프로테아제에 대한 언급은 모든 형태를 의미한다. 프로테아제는 활성 부위의 촉매 활성 및 표적 기질의 펩티드 결합을 절단하는 기전에 따라서, 예컨대 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 트레오닌 및 메탈로-프로테아제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 세린 프로테아제 또는 세린 엔도펩티다제는 이 효소의 활성 부위에 세린 잔기의 존재를 특징으로 하는 펩티다제 부류를 의미한다. 세린 프로테아제는 체내의 광범위한 기능, 예컨대 혈액 응고 및 염증에 관여할 뿐만 아니라, 원핵생물 및 진핵생물에서 소화 효소로서 기능한다. 세린 프로테아제에 의한 절단 기전은 세린에 의한 표적화된 펩티드 결합의 친핵성 공격에 기초한다. 아스파테이트 또는 금속과 결합된 시스테인, 트레오닌 또는 물 분자 역시 이 역할을 할 수 있다. 세린, 히스티딘 및 아스파테이트의 정렬된 측쇄는 대부분의 세린 프로테아제에 공통적인 촉매성 3인조를 형성한다. 세린 프로테아제의 활성 부위는 폴리펩티드 기질이 결합하는 틈(cleft)으로 형성되어 있다.
본 명세서에 사용된 "제 IX 인자" 또는 FIX 폴리펩티드는 임의의 제 IX 인자 폴리펩티드를 의미하며, 예를 들어, 재조합으로 제조된 폴리펩티드, 합성 제조된 폴리펩티드, 및 이에 제한되지 아니하나 간 및 혈액을 포함하는 세포 또는 조직으로부터 추출되거나 분리된 제 IX 인자 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 아니한다. 제 IX 인자에 대해 호환가능하게 사용되는 대체 명칭에는 제 9 인자, 크리스마스 인자, 혈장 트롬보플라스틴 성분 (PTC), 제 IX 응고 인자, 및 제 IX 혈청 인자를 포함한다. 제 IX 인자에 대한 약어는 FIX 및 F9 를 포함한다. 제 IX 인자는, 인간 및 비-인간 기원의 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 종들 유래 관련 폴리펩티드를 포함한다. 인간 제 IX 인자 (hFIX)는 제 IX 인자, 대립유전자 변이체 이소형 (예를 들어, T148A 또는 T412P 돌연변이를 갖는 대립 유전자 변이체 (서열번호 20 또는 325)), 핵산 유래 합성 분자, 인간 조직 및 세포로부터 분리된 단백질 및 이들의 변형된 형태를 포함한다. 비-변형된 성숙한 인간 제 IX 인자 폴리펩티드의 예는 비-변형된 야생형 천연 제 IX 인자 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 폴리펩티드), 및 프로펩티드 및/또는 시그널 펩티드를 포함하는 비-변형된 야생형 전구체 제 IX 인자 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 2에 제시된 서열을 갖는 전구체 FIX 폴리펩티드)를 포함한다. 당업자는 성숙한 제 IX 인자 폴리펩티드 (서열번호 3)의 관련된 위치가 전구체 FIX 폴리펩티드 서열번호 2와 비교하여 46개 아미노산 잔기들에서 상이하며, 이것이 시그널 펩티드 및 프로펩티드 서열을 포함하는 제 IX 인자 폴리펩티드라는 것을 인식할 수 있다. 따라서, 서열번호 3의 제1 아미노산 잔기는 서열번호 2의 47번째 아미노산 잔기에 "상응한다".
"제 IX 인자"라는 용어는 또한, 소위 IXa (FIXa)로 불리는, 잔기 132C 와 289C 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 FIX 경쇄 (서열번호 2의 아미노산 47-191 및 서열번호 3의 아미노산 1-145 에 상응함) 및 FIX 중쇄 (서열번호 2의 아미노산 227-461 및 서열번호 3의 아미노산 181-415에 상응함)를 포함하는, 제 IX 인자 폴리펩티드의 활성화된 형태(서열번호 3에 제시된 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응)를 포함한다. FIXa 는 성숙한 FIX 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 3에 지시된 것)로부터 아미노산 잔기 R145 및 R180 뒤 단백분해 절단에 의해 생성된다. 단백분해 절단은 예를 들어 활성화된 제 XI 인자 (FXIa) 또는 조직 인자/활성화된 제 VII 인자 (TF/VIIa) 복합체에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드는 예를 들어 화학적 변형 또는 번역후 변형에 의해 추가로 변형될 수 있다. 그러한 변형들은 글리코실화, 페길화, 알부민화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화, 포스포릴화, 및 당 분야에 알려진 다른 폴리펩티드 변형들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
제 IX 인자는 인간 및 비-인간 종들을 포함한 임의의 종 유래 제 IX 인자를 포함한다. 비-인간 기원의 FIX 폴리펩티드는 비제한적으로 쥐, 개, 고양이, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 물고기, 래닌(ranine) 및 다른 영장류 제 IX 인자 폴리펩티드를 포함한다. 비-인간 기원의 FIX 폴리펩티드의 예는 예를 들어 침팬지 (Pan troglodytes, 서열번호 4), 레서스 원숭이 (Macaca mulatta, 서열번호 5), 마우스 (Mus musculus, 서열번호 6), 랫트 (Rattus norvegicus, 서열번호 7), 기니아 피그 (Cavia porcellus, 서열번호 8), 돼지 (Sus scrofa, 서열번호 9), 개 (Canis familiaris, 서열번호 10), 고양이 (Felis catus, 서열번호 11), 토끼 (Oryctolagus cuniculus , 서열번호 12), 닭 (Gallus gallus, 서열번호 13), 암소 (Bos Taurus, 서열번호 14), 양 (Ovis aries, 서열번호 15), 개구리 (Xenopus tropicalis, 서열번호 16), 제브라피시 (Danio rerio, 서열번호 17), 일본 복어 (Takifugu rubripes, 서열번호 18)를 포함한다.
FIX 폴리펩티드에 대한 언급은 또한 전구체 폴리펩티드 및 단일쇄 또는 이중쇄인 성숙한 FIX 폴리펩티드, 활성을 갖는 말단절단형을 포함하고, 서열번호 2에 제시된 전구체 폴리펩티드 또는 그의 성숙형 (서열번호 3)과 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하여, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 암호화되는 변이체 및 다른 변이체들을 포함한다. 서열번호 75-272 및 326-417 및 이들의 변이체들과 같은 변형된 FIX 폴리펩티드들이 포함된다. 또한, FIX 폴리펩티드의 FVIIIa 결합, 제 X 인자 결합, 인지질 결합 및/또는 응혈 활성과 같은 FIX 의 하나 이상의 활성을 유지하는 것들이 포함된다. 활성을 유지함으로써, 유지되는 활성의 수준이 탐지가능한 효과를 나타내기에 충분한 한, 상기 활성은 야생형 FIX와 비교하여 변경, 예컨대 감소 또는 증가될 수 있다. FIX 폴리펩티드는 비제한적으로 조직-특이적 이소형 및 그의 대립유전자 변이체, 핵산의 번역에 의해 제조되는 합성 분자, 재조합적 방법을 통한 더 짧은 폴리펩티드들의 결찰을 포함하는 합성법과 같은 화학적 합성에 의해 생성되는 단백질, 인간 및 비-인간 조직 및 세포로부터 분리된 단백질, 키메릭 FIX 폴리펩티드 및 이들의 변형된 형태를 포함한다. FIX 폴리펩티드는 또한 전장의 성숙한 폴리펩티드의 하나 이상의 활성 (필요하다면 활성화시)을 유지하기 위하여 충분한 길이이거나 적절한 영역을 포함하는 FIX 의 절편 또는 부분을 포함한다. FIX 폴리펩티드는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함할 수 있다. 그러한 변형들은 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화, 포스포릴화, 및 당 분야에 알려진 다른 폴리펩티드 변형들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된, 상응하는 잔기는 정렬된 유전자좌에서 나타나는 잔기를 의미한다. 관련 또는 변이체 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 정렬(aligned)된다. 이러한 방법은 일반적으로 정합수(matches)를 최대화하고, 수동 정렬 이용 및 이용가능한 다수의 정렬 프로그램(예컨대, BLASTP) 이용 및 당업자에게 공지된 기타 방법의 이용과 같은 방법을 포함한다. 폴리펩티드 서열의 정렬을 통해, 당업자는 가이드로서 보존된 동일 아미노산 잔기들을 사용하여 상응하는 잔기들을 확인할 수 있다. 예를 들어, 제 IX 인자 폴리펩티드들의 서열을 정렬함으로써, 당업자는 가이드로서 보존된 동일 아미노산 잔기들을 사용하여 상응하는 잔기들을 확인할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3(성숙한 제 IX 인자)의 아미노산 위치 1(Y1)의 티로신은 서열번호 2의 아미노산 위치 47(Y47)의 티로신에 상응한다. 다른 예에서, 상응하는 영역이 확인될 수 있다. 예를 들어, Gla 도메인은 서열번호 3의 아미노산 위치 Y1부터 V46, 서열번호 2의 아미노산 위치 Y47부터 V92 에 상응한다. 또한, 당업자는 인간 서열과 비-인간 서열 간에 상응하는 아미노산 잔기들을 찾기 위한 가이드로서 보존된 아미노산 잔기를 이용할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3(인간)의 아미노산 잔기 Q11 및 P74 는 서열번호 14(소)의 R11 및 Q74 에 상응한다. 또한, 상응하는 위치는 단백질 구조의 컴퓨터 가상 정렬을 이용한 구조적 정렬에 기초할 수 있다. 다른 예에서, 상응하는 영역이 확인될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 아미노산 치환에 관하여, 동일하다 함은, 다른 제 IX 인자 폴리펩티드에서 상응하는 위치에서 서열번호 3의 참조 아미노산 위치의 동일한 치환을 의미한다. 예를 들어, 서열번호 3에서 아미노산 잔기 R318의 티로신의 치환에 관하여 동일한 치환은 서열번호 14에서 아미노산 잔기 R319의 티로신의 치환이다(예를 들어, 도 3 참조). 예를 들어 서열번호 3에서 아미노산 잔기 E410의 아스파라긴의 치환에 관하여 동일한 치환은 서열번호 366에서 아미노산 잔기 S410의 아스파라긴의 치환이다. 동일한 아미노산의 치환에 대한 언급은, 치환된 잔기로부터 상응하는 위치에서 다른 아미노산 잔기의 치환을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 "전구영역(proregion)", "프로펩티드" 또는 "전구서열(prosequence)"은 절단되어 성숙 단백질을 생산하는 영역 또는 분절을 의미한다. 이것은 촉매 기구를 은폐하여 촉매 중간체의 형성을 방지하여(즉, 기질 결합 부위를 입체적으로 차단하여) 단백분해 활성을 억제하는 기능을 하는 분절을 포함할 수 있다. 전구영역은 성숙한 생물학적 활성 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열이며 수개의 아미노산만큼 작을 수도 있고, 또는 다중도메인 구조일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 "성숙 제 IX 인자"는 시그널 서열과 전구펩티드 서열이 없는 FIX 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로, 시그널 서열은 소포체(ER)-골지 경로를 통하여 분비되기 위하여 단백질을 겨냥하며 번역되는 동안 ER로 삽입됨에 따라 절단된다. 프로펩티드 서열은 일반적으로 단백질의 번역후 변형에서 작용하며 세포로부터 단백질이 분비되기 전에 절단된다. 따라서, 성숙 FIX 폴리펩티드는 일반적으로 분비된 단백질이다. 일 예에 따르면, 성숙 인간 FIX 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시되어 있다. 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1-28에 상응하는 서열번호 3이 시그널 서열이 없고, 또한 서열번호 2의 아미노산 잔기 29-46에 상응하는 프로펩티드 서열이 없다는 점에서 서열번호 2에 제시된 전구체 폴리펩티드와 다르다. 성숙 FIX 폴리펩티드에 관한 언급은 단일-가닥 자이모겐 형태 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 따라서, 성숙 FIX 폴리펩티드에 관한 언급은 또한 이황화 결합으로 이어진 중쇄 및 경쇄를 함유하는 이중-가닥 형태(서열번호 2의 아미노산 192-226에 상응하는 활성화 펩티드가 없음)를 의미한다.
본 명세서에 사용된, FIX에 관하여 "야생형" 또는 "천연"은 자연계에 사람 및 다른 동물을 비롯한 유기체 내에 존재하는 대립유전자 변이체를 포함한 천연 또는 자연 발생의 FIX 유전자에 의해 암호화된 FIX 폴리펩티드를 의미한다. 종에 관한 언급없이 야생형 제 IX 인자에 대한 언급은 임의의 종의 야생형 제 IX 인자를 포함시킴을 의도한다. 야생형 FIX 폴리펩티드 중에는 암호화된 전구체 폴리펩티드, 이의 절편, 및 이의 프로세싱된 형태, 예컨대 시그널 펩티드가 없는 성숙 형태뿐만 아니라 이의 임의의 번역전 또는 번역후 프로세싱된 형태 또는 변형된 형태가 포함된다. 또한, 천연 FIX 폴리펩티드 중에는 글리코실화, 카르복실화 및 히드록실화에 의한 변형을 포함하나, 이에 국한되지 않는, 번역후 변형된 형태가 포함된다. 또한, 천연 FIX 폴리펩티드에는 단일-가닥 및 이중-가닥 형태가 포함된다. 예를 들어, 사람은 천연 FIX를 발현한다. 예시적 야생형 사람 FIX의 아미노산 서열은 서열번호 2 및 3 및 이의 대립유전자 변이체에 제시되어 있다. 침팬지(Pan troglodytes, 서열번호 4), 리서스 마카크(Macaca mulatta, 서열번호 5), 마우스(Mus musculus, 서열번호 6), 랫트(Rattus norvegicus, 서열번호 7), 기니피그(Cavia porcellus, 서열번호 8), 돼지(Sus scrofa, 서열번호 9), 개(Canis familiaris, 서열번호 10), 고양이(Felis catus, 서열번호 11), 토끼(Oryctolagus cuniculus, 서열번호 12), 닭(Gallus gallus, 서열번호 13), 소(Bos taurus, 서열번호 14), 양(Ovis aries, 서열번호 15), 개구리(Xenopus tropicalis, 서열번호 16), 제브라피쉬(Danio rerio, 서열번호 17), 일본 복어(Takifugu rubripes, 서열번호 18)를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 다른 동물들도 천연 FIX를 생산한다.
본 명세서에 사용된, 종 변이체는 마우스 및 사람과 같이 다른 포유동물 종을 포함하는, 다른 종들 간의 폴리펩티드 변이체를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 대립유전자 변이체는 동일 종의 구성원들 간에 단백질 변형을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 스플라이싱 변이체는 1종이 넘는 mRNA를 초래하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차등 프로세싱에 의해 생성된 변이체를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 자이모겐은 활성화 절단과 같은 성숙화 절단을 포함하는 단백분해 절단, 및/또는 다른 단백질(들) 및/또는 보조인자(들)과 복합체 형성에 의해 활성화되는 프로테아제를 의미한다. 자이모겐은 단백분해 효소의 불활성 전구체이다. 이러한 전구체는 일반적으로 활성형보다 더 크지만, 반드시 더 크지는 않다. 세린 프로테아제를 참고로 하면, 자이모겐은 촉매적 및 자가촉매적 절단을 포함하는 특이적 절단에 의해, 또는 활성 효소를 생성하는 활성화 보조인자의 결합에 의해 활성 효소로 전환된다. 예를 들어, 자이모겐은 일반적으로 단일-가닥 형태로 존재한다. 자이모겐은 일반적으로 불활성이고, 하나 이상의 단백분해 부위에서 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 성숙 활성 폴리펩티드로 전환되어 이중-가닥와 같은 다중쇄 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 따라서, 자이모겐은 활성화제의 작용에 의해 단백분해 효소로 전환되는 효소적 불활성 단백질이다. 절단은 자가활성화에 의해 달성될 수 있다. 다수의 응고 단백질은 자이모겐이고; 이들은 불활성이지만, 혈관 손상 후 응고계의 개시 시에 절단되어 활성화된다. FIX에 관하여, FIX 폴리펩티드는 프로테아제, 예컨대 활성화된 FXI 인자(FXIa) 또는 FVIIa(TF와 결합하여)에 의하여 절단되어 FIX의 이중-가닥 형태(FIXa)를 형성하기 전까지 혈장에 자이모겐으로 존재한다.
본 명세서에 사용된, 활성화 서열은 활성 프로테아제를 형성하기 위한 활성화 절단 또는 성숙화 절단에 필요한 부위인, 자이모겐 내의 아미노산 서열을 의미한다. 활성화 서열의 절단은 자가촉매적으로 또는 활성화 파트너에 의해 촉매될 수 있다.
본 명세서에 사용된 활성화 절단은 성숙화 절단의 한 종류로서, 완전한 효소 활성의 발달에 필요한 입체형태 변화를 유도한다. 이것은 절단으로 키모트립신의 Asp194와 같은 프로테아제의 보존적 영역과 상호작용하는 새로운 N-말단이 생성되어 활성에 필요한 입체형태 변화를 유도하는 세린 프로테아제 등의 고전적 활성화 경로이다. 활성화는 프로테아제의 다중쇄 형태를 생성시킬 수 있다. 일부 경우에, 프로테아제의 단일-가닥 형태는 단백분해 활성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된, "활성화된 제 IX 인자" 또는 "FIXa"는 FIXa 폴리펩티드의 임의의 이중-가닥 형태를 의미한다. 이중-가닥 형태는 일반적으로 단백분해 절단으로부터 초래되지만, 합성하여 생산할 수도 있다. 따라서, 활성화된 제 IX 인자는 응고 촉진 활성이 낮은 자이모겐 유사 이중-가닥 형태, FVIIIa 및 FX에 결합 시에 나타나는 완전 활성화된 형태, 및 완전 활성화된 이중-가닥 형태로 존재하거나 완전 활성화된 형태로 입체형태 변화를 겪는 돌연변이 형태를 포함한다. 예를 들어, FIX 폴리펩티드의 단일-가닥 형태(예, 서열번호 3 참조)는 성숙 FIX 폴리펩티드의 아미노산 잔기 R145와 R180 뒤에서 단백분해적으로 절단된다. 이황화 결합(서열번호 3의 FIX의 아미노산 잔기 132C와 289C 사이)에 의해 함께 유지된, 절단 산물인 FIX 중쇄 및 FIX 경쇄는 이중-가닥 활성화된 FIX 효소를 형성한다. 단백분해 절단은 예컨대 활성화된 제 XI 인자(FXIa), 및 TF와 복합체를 이룬 활성화된 제VIIa 인자(FVIIa) 에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 FIX 폴리펩티드의 "성질"은 3차원 구조, pI, 반감기, 입체형태 및 이러한 다른 물리적 특성과 같은 물리적 또는 구조적 성질을 의미한다.
본 명세서에 사용된, FIX 폴리펩티드의 "활성"은 제 IX 인자 폴리펩티드에 의해 나타나는 임의의 활성을 의미한다. 이러한 활성은 시험관내 및/또는 생체 내에서 검사될 수 있고, 응고 또는 응혈 활성, 응혈촉진 활성, 단백분해 또는 촉매 활성, 예컨대 제 X 인자(FX) 활성화; 항원성(항-FIX 항체에 결합하는 능력 또는 항-FIX 항체에 결합하기 위해 폴리펩티드와 경쟁하는 능력); 제VIIIa 인자 또는 제 X 인자에 결합하는 능력; 및/또는 인지질에 결합하는 능력을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 활성은 공인된 분석법을 사용해서 시험관내 또는 생체 내에서 평가할 수 있으며, 그 예로는 시험관내 또는 생체 내에서의 응고 측정이 있다. 이러한 분석법의 결과는 폴리펩티드가 생체 내 폴리펩티드의 활성과 상관성이 있을 수 있는 활성을 나타낸다는 것을 시사하며, 여기서 생체 내 활성은 생물학적 활성으로 지칭될 수도 있다. FIX의 변형 형태의 기능성 또는 활성을 측정하는 분석법은 당업자에게 공지되어 있다. FIX 폴리펩티드의 활성을 평가하는 분석법의 예로는 응혈 활성을 평가하는 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 분석법 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석법, 또는 촉매 활성이나 단백분해 활성을 평가하는 합성 기질을 사용하는 발색법이 포함된다.
본 명세서에 사용된, "적어도 하나의 활성을 나타낸다" 또는 "적어도 하나의 활성을 유지한다"는 동일한 조건 하 및 동일한 형태의 비변형 FIX 폴리펩티드와 비교했을 때 변형 FIX 폴리펩티드가 나타내는 활성을 의미한다. 예를 들어, 이중-가닥 형태의 변형 FIX 폴리펩티드는 이중-가닥 형태의 비변형 FIX 폴리펩티드와 동일한 실험 조건 하에 비교되고, 여기서 두 폴리펩티드 간에 유일한 차이는 연구 중인 변형이다. 다른 예에 따르면, 단일-가닥 형태의 변형 FVII 폴리펩티드는 단일-가닥 형태의 비변형 FVII 폴리펩티드와 동일한 실험 조건 하에 비교되며, 여기서 두 폴리펩티드 간에 유일한 차이는 연구 중인 변형이다. 일반적으로, 동일한 형태의 비변형 FIX 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 유지하거나 나타내는 변형 FIX 폴리펩티드는, 변형 FIX 폴리펩티드가 생체 내 투여되었을 때 응혈촉진 치료제로서 치료학적으로 효과적일 정도로 충분한 양의 활성을 유지한다. 일반적으로, 응혈촉진제로서 치료 효능을 유지하는 변형 FIX 폴리펩티드에서, 유지되는 활성의 양은, 응혈촉진제로서 치료 효능을 나타내는 동일한 형태의 비변형 FIX 폴리펩티드의 활성의 약 또는 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상이다. 응혈촉진제로서 치료 효능을 유지하는데 필요한 활성의 양은 필요하다면 실험적으로 측정될 수 있다. 일반적으로 활성의 0.5% 내지 20%, 0.5% 내지 10%, 0.5% 내지 5%의 유지는 생체 내 응혈촉진제로서 치료 효능을 유지하는데 충분하다.
변형 FIX 폴리펩티드에 의해 나타나거나 유지되는 활성은 임의의 활성, 예컨대 응고 또는 응혈 활성, 응혈촉진 활성, 단백분해 또는 촉매 활성, 예컨대 제 X 인자(FX) 활성화를 위한 활성; 항원성(항-FIX 항체에 결합하는 능력 또는 항-FIX 항체에 결합하기 위해 폴리펩티드와 경쟁하는 능력); 제VIIIa 인자 또는 제 X 인자에 결합하는 능력; 및/또는 인지질에 결합하는 능력을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 경우에, 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 증가된 활성을 보유할 수 있다. 일부 경우에, 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 감소된 활성을 보유할 수 있다. 양 폴리펩티드가 동일한 형태인, 변형 FIX 폴리펩티드의 활성은 비변형 폴리펩티드의 활성 백분율의 임의의 수준일 수 있으며, 예컨대 문제의 변형을 함유하지 않는 폴리펩티드에 비해 1%의 활성, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 활성을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 변형 FIX 폴리펩티드는 동일한 형태의 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 증가되거나 감소된 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 이는 비변형 FIX 폴리펩티드 활성의 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%의 활성을 유지할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 활성의 변화는 비변형 FIX 보다 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 또는 그 이상 크다. 유지되어야 하는 특정 수준은 폴리펩티드의 의도된 용도의 함수로서, 실험적으로 결정될 수 있다. 활성은 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 시험관내 또는 생체 내 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "응고 활성" 또는 "응혈 활성" 또는 "응혈촉진 활성"은 응고를 달성하는 폴리펩티드의 능력을 의미한다. 응혈 활성을 평가하는 분석법은 당업자에게 공지되어 있고, 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 분석법 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석법을 포함한다.
본 명세서에 사용된, FIX에 관한 "촉매 활성" 또는 "단백분해 활성"은 기질의 단백분해 절단을 촉진하는 FIX 단백질의 능력을 의미하며, 상호교환해서 사용된다. 이러한 활성을 평가하는 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, FIX의 단백분해 활성은 Mes-D-CHD-Gly-Arg-AMC와 같은 발색성 기질을 사용하여 측정할 수 있으며, 여기서 기질의 절단은 흡광도로 모니터하며 기질 가수분해 속도는 선형 회귀법으로 측정한다.
본 명세서에 사용된, 도메인(보통 3개 이상, 일반적으로 5개 또는 7개 또는 그 이상의 아미노산의 서열)은 분자의 다른 부분과 구조적 및/또는 기능적으로 상이하고 식별할 수 있는, 단백질 또는 암호화 핵산과 같은 분자의 일부를 의미한다. 예를 들어, 도메인은 하나 이상의 구조 모티프로 구성된 단백질 내에서 독립적으로 접힌 구조를 형성할 수 있고/있거나 단백분해 활성과 같은 기능적 활성에 의하여 인식되는 폴리펩티드 사슬의 부분을 포함한다. 단백질은 하나 또는 하나보다 많은 독특한 도메인을 보유할 수 있다. 예를 들어, 도메인은 그 안의 서열과 관련 패밀리 구성원과의 상동성, 예컨대 프로테아제 도메인 또는 gla 도메인을 정의하는 모티프와의 상동성을 통해 확인하거나, 정의하거나 또는 구별할 수 있다. 다른 예에 따르면, 도메인은 기능에 따라, 예컨대 단백분해 활성, 또는 생체분자와의 상호작용 능력, 예컨대 DNA 결합, 리간드 결합 및 이량체화 등에 따라 구별될 수 있다. 도메인은 독립적으로 생물학적 기능이나 활성을 나타낼 수 있어, 이 도메인 단독으로 또는 다른 분자와 융합되어 단백분해 활성 또는 리간드 결합 등과 같은 활성을 수행할 수 있다. 도메인은 아미노산의 선형 서열 또는 아미노산의 비선형 서열일 수 있다. 많은 폴리펩티드는 다수의 도메인을 함유한다. 이러한 도메인은 공지되어 있고 당업자에 의해 확인될 수 있다. 본 발명의 예증을 위해, 정의들이 제공되지만, 명칭으로 특정 도메인을 인식하는 것은 당해 기술분야에 공지된 것임을 잘 알고 있을 것이다. 필요하면, 도메인의 확인을 위해 적당한 소프트웨어를 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 프로테아제 도메인은 프로테아제의 촉매적으로 활성인 부분이다. 프로테아제의 프로테아제 도메인에 대한 언급은 임의의 이 단백질들의 단일-가닥, 이중-가닥 및 다중쇄 형태를 포함한다. 단백질의 프로테아제 도메인은 단백분해 활성에 필요한 상기 단백질의 모든 필수 성질, 예컨대 촉매 중심을 함유한다. FIX와 관련하여, 프로테아제 도메인은 키모트립신/트립신 패밀리 프로테아제 도메인들과 상동성 및 구조적 특징, 예컨대 촉매 3인조를 공유한다. 예를 들어, 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에서, 프로테아제 도메인은 아미노산 위치 181 내지 412에 상응한다.
본 명세서에 사용된, 감마-카르복시글루타메이트(Gla) 도메인은 비타민 K 의존적 단백질과 같은 단백질의 부분을 의미하는 것으로서, 이 부분은 모든 글루타메이트 잔기가 그런 것은 아니지만, 일반적으로 대부분의 글루타메이트 잔기가 비타민 K 의존적 카르복실화에 의해 Gla를 형성하는 글루타메이트 잔기의 번역후 변형을 함유한다. Gla 도메인은 칼슘 이온의 고친화도 결합 및 음하전성 인지질에 대한 결합을 담당한다. 일반적으로, Gla 도메인은 비타민 K 의존적 단백질의 성숙 형태의 N-말단 끝에서 시작해서 보존적 방향족 잔기로 끝난다. 성숙 FIX 폴리펩티드에서 Gla 도메인은 서열번호 3에 제시된 예시적 폴리펩티드의 아미노산 위치 1 내지 46에 상응한다. Gla 도메인은 공지되어 있고, 이들의 유전자좌는 특정 폴리펩티드에서 확인할 수 있다. 다양한 비타민 K 의존적 단백질의 Gla 도메인은 서열, 구조적 및 기능성 상동성을 공유하는데, 세포 표면 막에 존재하는 음하전성 인지질과 상호작용을 매개하는 소수성 패치 내에 N-말단 소수성 잔기의 클러스터링을 포함한다. 다른 Gla 함유 폴리펩티드의 예로는 FVII, FX, 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 기질 Gla 단백질, 성장-정지-특이적 단백질 6(Gas6) 및 단백질 Z를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된, 상피성장인자(EGF) 도메인(EGF-1 또는 EGF-2)은 상피성장인자(EGF) 서열의 특정 30 내지 40개 아미노산 부분과 서열 상동성을 공유하는 단백질의 부분을 의미한다. EGF 도메인은 이황화 결합에 관여하는 것으로(EGF에서) 밝혀진 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. EGF 도메인의 주요 구조는 이중-가닥 베타 시트와 그 다음 C-말단 짧은 이중-가닥 시트까지의 루프이다. FIX는 2개의 EGF 도메인, EGF-1 및 EGF-2를 함유한다. 이 도메인들은 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치 47 내지 83과 84 내지 125에 각각 상응한다.
본 명세서에 사용된, "비변형 폴리펩티드" 또는 "비변형 FIX" 및 이의 문법적 변형어들은 본 명세서에 제공된 변형을 위해 선택된 출발 폴리펩티드를 의미한다. 출발 폴리펩티드는 폴리펩티드의 자연 발생의 야생형일 수 있다. 또한, 출발 폴리펩티드는 천연 야생형 이소형과 상이하게 변경 또는 변이될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 본 발명에서 생산되는 후속 변형된 폴리펩티드에 대하여 출발 비변형 폴리펩티드라고 지칭된다. 따라서, 비변형 참조 단백질에 비해 특정 활성이나 성질의 목적한 증가 또는 감소를 보유하도록 변형된 당업계에 공지된 기존 단백질들이 출발 비변형 폴리펩티드로 선택되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단일 아미노산 변화에 의해 천연 형태로부터 변형되어, 글리코실화의 변경을 위한 아미노산 잔기 또는 잔기들의 변화와 같이 목적한 성질의 증가 또는 감소를 갖고 있는 단백질은 동일한 성질 또는 다른 성질을 추가 변형시키기 위한, 본 명세서에서 비변형으로 불리기도 하는 표적 단백질일 수 있다. 당업계에 공지된 변형 FIX 폴리펩티드의 예로는, 예컨대 Schuettrumpf 등, (2005) Blood 105(6):2316-23; Melton 등, (2001) Blood Coagul . Fibrinolysis 12(4):237-43; Cheung 등, (1992) J. Biol. Chem . 267:20529-20531; Cheung 등, (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 93:11068-11073; Hopfner 등, (1997) EMBO J. 16:6626-6635; Sichler 등, (2003) J. Biol . Chem . 278:4121-4126; Begbie 등, (2005) Thromb . Haemost . 94(6):1138-47; Chang, J. 등, (1998) J. Biol . Chem . 273(20):12089-94; Yang, L. 등, (2002) J. Biol . Chem . 277(52):50756-60; Yang, L. 등, (2003) J. Biol . Chem . 278(27):25032-8; 미국 특허번호 5969040, 5621039, 6423826, 7125841, 6017882, 6531298, 미국 특허출원공개번호 20030211094, 20070254840, 20080188414, 2008000422, 20080050772, 20080146494, 20080050772, 20080187955, 20040254106, 20050147618, 20080280818, 20080102115, 20080167219 및 20080214461, 및 국제특허공개번호 WO2007112005, WO2007135182, WO2008082613, WO2008119815, WO2008119815, WO2007149406, WO2007112005 및 WO2004101740에 기술된 임의의 FIX 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에 사용된, "변형 제 IX 인자 폴리펩티드" 및 "변형 제 IX 인자"는 비변형 제 IX 인자 폴리펩티드와 비교했을 때 하나 이상의 아미노산 차이를 보유하는 FIX 폴리펩티드를 의미한다. 하나 이상의 아미노산 차이는 하나 이상의 아미노산 교체(치환), 삽입 또는 결실과 같은 아미노산 돌연변이이거나, 또는 전체 도메인의 삽입 또는 결실일 수 있고, 그리고 이의 임의의 조합일 수 있다. 일반적으로, 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드와 비교했을 때 1차 서열에 하나 이상의 변형을 보유한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드와 비교했을 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50개 이상의 아미노산 차이를 보유할 수 있다. 생성된 폴리펩티드가 천연 FIX 폴리펩티드와 관련된 적어도 하나의 FIX 활성, 예컨대 촉매 활성, 단백분해 활성, FVIIIa 결합 능력 또는 인지질 결합 능력을 나타내는 한, 임의의 변형이 고려될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "항트롬빈 III(AT-III)" 또는 "AT-III"는 세린 프로테아제 저해제(서핀(serpin))이다. AT-III은 464개 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 단백질(서열번호 21)로서 합성되고 분비되는 동안 절단되어 432개 아미노산의 성숙 항트롬빈(서열번호 22)을 방출한다.
본 명세서에 사용된, "헤파린"은 항응혈 성질을 보유하는 직쇄의 고도로 설페이트화된 글리코사미노글리칸의 이질적인 군을 의미한다. 헤파린은 AT-III 에 결합하여 AT-III /헤파린 복합체를 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "AT-III 및/또는 헤파린에 대한 내성 증가"는 비변형 FIX 폴리펩티드와 같은 참조 폴리펩티드에 비해 AT-III 단독, 헤파린 단독 및/또는 AT-III/헤파린 복합체의 저해 효과에 대한, 변형 FIX 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드의 감소된 감수성의 임의의 양을 의미한다. AT-III, 헤파린 및/또는 AT-III/헤파린 복합체에 대한 내성 증가는 AT-III, 헤파린 및/또는 AT-III 복합체와 변형 FIX 폴리펩티드의 결합을 평가하여 분석할 수 있다. 또한, 내성 증가는 AT-III, 헤파린 또는 AT-III/헤파린 복합체의 존재 하에 FIX 폴리펩티드의 촉매 또는 응혈 활성의 저해를 계측하여 분석할 수도 있다. 저해제에 대한 폴리펩티드의 결합 또는 저해제에 의한 폴리펩티드의 효소 활성의 저해를 측정하는 분석법은 당업계에 공지되어 있다. AT-III 또는 AT-III/헤파린 복합체와 같은 공유 저해제에 대해서는 2차 저해 속도 상수를 계측할 수 있다. 헤파린과 같은 비공유 저해제에 대해서는, ki를 계측할 수 있다. 또한, BIAcore 바이오센서 기구와 같은 표면 플라즈마 공명 또한, 하나 이상의 정의된 조건을 이용하여 AT-III, 헤파린 또는 AT-III/헤파린 복합체에 대한 FIX 폴리펩티드의 결합 계측에 사용될 수 있다. 그러나, AT-III 또는 AT-III/헤파린 복합체와 같은 공유 저해제에 대해서는 오로지 결합속도(on-rate)를 BIAcore를 사용해서 계측할 수 있으며; 헤파린과 같은 비공유 저해제에 대해서는 결합속도(on-rate) 및 분해속도(off-rate) 모두를 계측할 수 있다. AT-III/헤파린의 FIX 응혈 활성 등의 저해 효과를 측정하는 분석법 역시 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AT-III/헤파린의 존재 또는 부재 하에 변형 FIX 폴리펩티드의 이의 기질인 FX를 절단하는 능력을 계측할 수 있고, 이 반응을 AT-III/헤파린이 저해하는 정도가 결정될 수 있다. 이를, 비변형 FIX 폴리펩티드가 AT-III의 존재 또는 부재 하에 기질 FX를 절단하는 능력과 비교할 수 있다. 대안적으로, FIX 폴리펩티드의 2차 저해 속도 상수는 계측될 수 있으며 비변형 FIX 폴리펩티드의 이차 저해 속도 상수와 비교될 수 있다. 이차 저해 속도 상수를 비교할 때, 저해에 대한 내성의 증가는 이차 저해 속도 상수의 감소를 의미한다. AT-III 및/또는 헤파린에 대한 내성 증가를 나타내는 변형 폴리펩티드는 예컨대 비변형 폴리펩티드에 비해 각각 AT-III, 헤파린, 및/또는 AT-III/헤파린 복합체의 효과에 대하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 내성 증가를 나타낸다.
본 명세서에 사용된, 보조인자는 다른 특정 단백질 또는 분자에 결합하여 활성 복합체를 형성하는 단백질 또는 분자를 의미한다. 일부 예에 따르면, 보조인자에 대한 결합은 최적의 단백분해 활성에 필요하다. 예를 들어, FVIIIa는 FIXa의 보조인자이다. FIXa에 대한 FVIIIa의 결합은 FIXa의 기질인, FX에 대한 단백분해 활성을 증가시키는 입체형태 변화를 유도한다.
본 명세서에 사용된, 글리코실화 위치는 탄수화물 잔기가 부착될 수 있는 폴리펩티드 내의 아미노 위치를 의미한다. 일반적으로, 글리코실화된 단백질은 탄수화물 잔기의 부착을 위한 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 아스파라긴 또는 세린을 함유한다.
본 명세서에 사용된, 천연 글리코실화 위치는 야생형 폴리펩티드에서 탄수화물 잔기가 부착되는 아미노산의 위치를 의미한다. FIX에는 6개의 천연 글리코실화 위치가 있으며; 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치와 상응하는, N157 및 N167의 2개의 N-글리코실화 위치, S53, S61, T159, T169, T172 및 T179의 6개의 O-글리코실화 위치가 있다.
본 명세서에 사용된, 비천연 글리코실화 위치는 야생형 폴리펩티드에는 없는 변형 폴리펩티드에서 탄수화물 잔기가 부착되는 아미노산 위치를 의미한다. 비천연 글리코실화 위치는 FIX 폴리펩티드에 아미노산 치환에 의하여 도입될 수 있다. O-글리코실화 위치는 예를 들어, 세린 또는 트레오닌의 천연 잔기의 아미노산 치환에 의하여 만들어질 수 있다. N-글리코실화 위치는 예를 들어, Xaa가 프롤린이 아닌, Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys 모티프 확립에 의하여 생성될 수 있다. 아미노산 변형에 의한 이러한 공통 서열의 생성에는 예를 들어, 천연 아미노산 잔기의 아스파라긴으로의 단일 아미노산 치환, 천연 아미노산 잔기의 세린, 트레오닌 또는 시스테인으로의 단일 아미노산 치환, 또는 천연 아미노산 잔기의 아스파라긴으로의 제1 아미노산 치환 및 천연 아미노산 잔기의 세린, 트레오닌 또는 시스테인으로의 제2 아미노산 치환을 포함하는 이중 아미노산 치환이 관여될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "글리코실화 수준의 증가" 및 이의 임의의 문법적인 변형은, 참조 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 폴리펩티드에 연결된 탄수화물의 증가된 양을 의미한다. 상기 탄수화물은 N-결합, O-결합, C-결합 또는 임의의 다른 결합에 의하여 부착될 수 있다. 글리코실화의 수준은 비변형 폴리펩티드의 글리코실화 수준에 비해 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상으로 증가할 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화 수준(즉, 탄수화물의 양)의 측정 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 탄수화물 함량 또는 글리코실화의 수준은 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피, 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE), 순차적 엑소글라이코시다아제 소화, 질량 분석, NMR, 겔 전기영동 또는 당업계에 공지되었거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의하여 평가될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "생물학적 활성"은 화합물, 조성물 또는 다른 혼합물의 생체 내 투여 시에 초래되는 생리학적 반응 또는 화합물의 생체 내 활성을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료 효과 및 약제학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 이러한 활성을 검사하거나 사용하도록 설계된 시험관내 시스템에서 관찰할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적에서, FIX 폴리펩티드의 생물학적 활성은 응혈 활성을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 약동학적 성질은, 체내 FIX 폴리펩티드와 같은, 약물 또는 약품의 작용, 특히 약물이 신체에 의하여 흡수, 분배, 대사, 및 제거되는 속도와 관련된 성질을 의미한다. 약동학은 다양한 파라미터로 평가될 수 있다. 이는 제거율, 분포 용적, 생체 내 회수율, 총 변형 FIX 폴리펩티드의 생체 내 노출, 혈청 반감기, 및 평균 공명시간(MRT)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 폴리펩티드의 약동학적 성질은 예컨대, 인간 또는 동물 모델에 폴리펩티드 투여 및 다양한 시점에서의 체내 FIX의 양 평가와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 제거율, 분포 용적, 생체 내 회수율, 총 변형 FIX 폴리펩티드의 생체 내 노출, 혈청 반감기, 및 평균 공명시간(MRT)과 같은 다양한 파라미터는, 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 계산을 사용하여 평가된다.
본 명세서에 사용된, "개선된 약동학적 성질"은 예를 들어, 비변형 FIX 폴리펩티드에 비하여 폴리펩티드, 예컨대 변형 FIX 폴리펩티드의 약동학적 성질의 바람직한 변화를 의미한다. 상기 변화는 증가 또는 감소일 수 있다.
본 명세서에 사용된, 제거율은 약제, 예를 들어 폴리펩티드의 대상체의 투여에 뒤따르는 신체로부터의 제거를 의미한다. 제거율은 실시예 6에 기재된 것과 같은, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 마우스에 FIX 폴리펩티드를 투여하는 분석법이 수행될 수 있으며, 신체로부터 폴리펩티드의 제거율은 혈장의 FIX의 양을 다양한 시점에서 측정하고 제거율을 투여량 / AUC 0- inf로 계산하여 평가될 수 있다. 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 변형 FIX 폴리펩티드의 개선된 제거율은 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 변형 FIX 폴리펩티드의 제거율의 감소를 의미한다. 변형 FIX 폴리펩티드의 제거율은 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 감소할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 평균 공명 시간(MRT)은 투여된 후 체내에서 FIX 폴리펩티드가 체류하는 시간의 양을 의미한다. MRT는 실시예 6에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 마우스에 FIX 폴리펩티드를 투여하는 분석법이 수행될 수 있으며, 폴리펩티드의 MRT는 혈장의 FIX의 양을 다양한 시점에서 측정하고, AUC0 -last가 곡선 아래 총 면적이고 AUMC0 -last가 첫번째 모멘트-대-시간 곡선 아래의 총 면적인, AUMC0 -last/AUC0 -last로 MRT를 계산하여 평가될 수 있다. 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 변형 FIX 폴리펩티드의 MRT는 비변형 FIX 폴리펩티드에 대한 변형 FIX 폴리펩티드의 MRT의 증가를 의미한다. 변형 FIX 폴리펩티드의 MRT는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상으로 증가할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 생체 내 회수율은 투여된 FIX 폴리펩티드의 총량에 관하여 투여되고 일정 기간 후 혈액 순환에서 탐지 가능한 FIX 폴리펩티드의 백분율을 의미한다. 생체 내 회수율은 실시예 6에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 마우스에 FIX 폴리펩티드를 투여하는 분석법이 수행될 수 있으며, 폴리펩티드의 생체 내 회수율은 Cmax에서 혈장의 FIX의 양을 계측하고, 이를 투여된 FIX의 양과 비교하여 평가될 수 있다. 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 변형 FIX 폴리펩티드의 생체 내 회수율은 비변형 FIX 폴리펩티드에 대한 변형 FIX 폴리펩티드의 생체 내 회수율의 증가를 의미한다. 변형 FIX 폴리펩티드의 생체 내 회수율은 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상으로 증가할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 혈장 반감기(t1/2)는 FIX 폴리펩티드의 제거 반감기, 또는 FIX 폴리펩티드의 혈장 농도가 투여된 후 최초 또는 최대 농도의 반에 도달하는 시간을 의미한다. 혈장 반감기에 대한 언급은 α-, β-, 및/또는 γ-상인 동안의 혈장 반감기를 포함한다. 혈장 반감기는 실시예 6에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 마우스에 FIX 폴리펩티드를 투여하는 분석법이 수행될 수 있으며, 폴리펩티드의 혈장 반감기는 다양한 시점에서 혈장 내의 FIX의 양을 계측하여 평가될 수 있다. 예를 들어, T1/ 2β는 혈장 FIX 농도-대-시간 곡선의 로그 선형 플롯의 마지막 상(terminal phase) 동안 음의 기울기로 나누어져 -ln2로 계산된다. 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 변형 FIX 폴리펩티드의 혈장 반감기는 비변형 FIX 폴리펩티드에 대한 변형 FIX 폴리펩티드의 혈장 반감기의 증가를 의미한다. 변형 FIX 폴리펩티드의 혈장 반감기는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상으로 증가할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 생체 내 노출은 투여된 FIX 폴리펩티드의 농도-시간 곡선 하의 혈장 영역 또는 AUC에 관하여, 투여 후 순환 혈액 중의 FIX 폴리펩티드의 양을 의미한다. 생체 내 노출은 실시예 6에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 마우스에 FIX 폴리펩티드를 투여하는 분석법이 수행될 수 있으며, 폴리펩티드의 생체 내 회수율은 다양한 시점에서 혈장의 FIX의 양(즉, AUC)을 계측하고, 이를 투여된 FIX의 양과 비교하여 평가될 수 있다. 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 변형 FIX 폴리펩티드의 개선된 생체 내 노출은 비변형 FIX 폴리펩티드에 대한 변형 FIX 폴리펩티드의 생체 내 노출의 증가를 의미한다. 변형 FIX 폴리펩티드의 생체 내 노출은 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상으로 증가할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 분포 용적은 투여된 FIX 폴리펩티드의 혈장 및 체내 나머지 간의 분포를 의미한다. 이는 폴리펩티드의 양이 균일하게 분배되어 혈장에서 관찰된 폴리펩티드의 농도를 생성하기 위해 필요한 부피로 정의된다. 분포 용적은 실시예 6에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 정상 상태(steady state) 분포 용적(MRT*Cl로 계산됨)인 Vss, 및 최종 제거 상수(β)에 기초한 분포 용적(Cl/(ln2/T½β로 계산됨)인 Vz는, 마우스에 FIX 폴리펩티드를 투여하여, 다양한 시점에서 혈장 내 FIX의 농도를 측정하는 분석법으로 평가될 수 있다. 단백질의 제거 메커니즘과 안전성 프로파일에 따라, 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 변형 FIX 폴리펩티드의 분포 용적은 변형 FIX 폴리펩티드의 분포 용적의 증가 또는 감소를 의미할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드가 복수의 구획에 분포된 경우, 변형 FIX 폴리펩티드의 감소된 분포 용적은 비변형 FIX 폴리펩티드와 비교하여 관심있는 구획 내(예컨대, 혈관외 구획에 대한 혈관 구획)에서의 현저하게 증가된 약물 노출 및 활성에 기여할 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, 약물 안전성이 Cmax 에 의해 제한된 경우 다른 구획 내로의 재분배(예를 들어, 내피 세포 표면에 결합 내)는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 관심있는 구획 내에서의 보다 긴 최종 반감기 및/또는 작용의 지속시간 및 월등한 안전성 프로파일에 기여할 수 있다. 변형 FIX 폴리펩티드의 분포 용적은 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%로 감소할 수 있다. 다른 예시에서, 변형 FIX 폴리펩티드의 분포 용적은 비변형 FIX 폴리펩티드의 분포 용적의 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상으로 증가한다.
본 명세서에 사용된 "평가하는"이란 용어 및 이의 문법적 변형어는 폴리펩티드의 활성의 절대값을 수득한다는 점에서, 또한 활성의 수준을 시사하는 지수, 비율, 백분율, 가시적 또는 다른 값을 수득한다는 점에서 정량적 및 정성적 측정을 포함하는 것으로 의도된다. 평가는 직접 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에 의한 기질 절단의 검출은 산물을 직접 계측하여 수행할 수도 있고, 또는 절단된 기질의 최종 활성을 측정하여 간접적으로 계측할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "키모트립신 번호매김"은 서열번호 19의 성숙 소 키모트립신 폴리펩티드의 아미노산 번호매김을 의미한다. 제 IX 인자의 프로테아제 도메인과 같은 다른 프로테아제의 프로테아제 도메인은, 키모트립신을 이용하여 정렬될 수 있다. 이러한 경우에, 키모트립신의 아미노산에 상응하는 제 IX 인자의 아미노산에는 키모트립신의 아미노산 번호매김이 주어진다. 상응하는 위치는 수동 정렬을 이용하는 당업자에 의한 이러한 정렬을 통해 또는 입수할 수 있는 다수의 정렬 프로그램(예, BLASTP)을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 상응하는 위치는 단백질 구조의 컴퓨터 모의 정렬 등을 통한 구조적 정렬을 기반으로 할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산이 공지의 서열의 아미노산에 상응한다는 언급은 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 이용하여 동일성 또는 상동성(보존적 아미노산이 정렬되는 경우)을 최대화하도록 공지의 서열과 폴리펩티드의 정렬 시에 확인된 아미노산을 의미한다. 서열번호 3에 제시된 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치 181 내지 415의 상응하는 키모트립신 번호는 표 1에 제시한다. 서열번호 3에 제시된 서열에 상대적인 아미노산 위치는 정상 폰트이고, 이 위치에 있는 아미노산 잔기는 진한 글씨이며, 상응하는 키모트립신 번호는 이탤릭체이다. 예를 들어, 성숙 제 IX 인자(서열번호 3) 과 성숙 키모트립신(서열번호 19)의 정렬 시, 제 IX 인자의 아미노산 위치 181에 있는 발린(V)에는 키모트립신 번호매김 V16이 주어진다. 후속 아미노산들은 이에 따라서 번호가 매겨진다. 일 예에 따르면, 성숙 제 IX 인자(서열번호 3)의 아미노산 위치 213에 있는 글루탐산(E)은 키모트립신 번호매김에 기초한 아미노산 위치 E49에 상응한다. 잔기가 프로테아제에 존재하지만 키모트립신에는 존재하지 않는 경우에는, 이 아미노산 잔 기에는 문자 표시가 주어진다. 예를 들어, 키모트립신 번호매김에 의한 A95a 및 A95b는 성숙 제 IX 인자 서열(서열번호 3)에 관한 번호매김에 의해서는, 각각, A261 및 A262에 상응한다.
표 1. 제 IX 인자의 키모트립신 번호매김
Figure 112017042341398-pat00001
Figure 112017042341398-pat00002
본 명세서에 사용된 핵산은 DNA, RNA 및 이의 유사체, 예컨대 펩티드 핵산(PNA) 및 이의 혼합물을 포함한다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 형광 또는 방사능표지와 같은 검출가능한 표지 등으로 선택적으로 표지된, 프로브 또는 프라이머에 관한 것일 때에는, 단일-가닥 분자가 고려된다. 이러한 분자들은 일반적으로 이들의 표적이 라이브러리의 탐침 또는 프라이밍을 위한 통계적으로 고유한 수 또는 낮은 카피수(보통 5 미만, 일반적으로 3 미만)일 정도의 길이이다. 일반적으로, 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 동일하거나 상보성인 서열의 적어도 14개, 16개 또는 30개의 인접 뉴클레오티드를 함유한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본 명세서에 사용된, 펩티드는 2 내지 40개 아미노산 길이인 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 본원에 제시된 다양한 아미노산 서열에서 나타나는 아미노산은 이들의 공지된 3문자 또는 1문자 약어(표 2)에 따라 확인된다. 다양한 핵산 절편에서 나타나는 뉴클레오티드는 당업계에 통상적으로 사용되는 표준 1문자 명칭으로 나타낸다.
본 명세서에 사용된 "아미노산"은 아미노기와 카르복시산기를 함유하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 2개 이상의 아미노산을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해, 아미노산은 20개의 천연발생의 아미노산, 비천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 보유하는 아미노산)를 포함한다.
문헌[J.Biol.Chem., 243: 3552-3559(1968)]에 기술되고 37 C.F.R§§1.821-1.822에 채택된 표준 폴리펩티드 명명법을 준수하여, 아미노산 잔기의 약어는 표 2A에 제시한 바와 같다:
표 2A - 대응표
Figure 112017042341398-pat00003
본 명세서에 상투적인 문구로 나타낸 아미노산 잔기의 모든 서열은 왼쪽에서 오른쪽 배향으로 통상적인 아미노-말단에서 카르복시-말단 방향을 나타낸다. 또한, "아미노산 잔기"란 어구는 대응표(표 2)에 열거된 아미노산 및 본원발명에 참고인용된 37 C.F.R.§§1.821-1.822에 언급된 바와 같은 변형된 및 특이적 아미노산을 포함하는 것으로 광범위하게 정의된다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열 중 시작이나 말단에 줄표는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열에 대한 펩티드 결합 또는 NH2와 같은 아미노 말단 기 또는 COOH와 같은 카르복시 말단 기에 대한 펩티드 결합을 나타낸다는 것을 유의해야 한다.
본 명세서에 사용된 "천연 발생의 아미노산"은 폴리펩티드에서 나타나는 20개의 L-아미노산을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "비천연 아미노산"은 표 2에 열거된 자연 발생의 아미노산 중 하나가 아닌, 아미노 기와 카르복시산 기를 함유하는 유기 화합물을 의미한다. 따라서, 비천연 발생의 아미노산은 예를 들어 20개의 자연 발생의 아미노산 외에 다른 아미노산 또는 다른 아미노산의 유사체를 포함하며, 예컨대 아미노산의 D-이소스테레오머(isostereomer)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 비천연 아미노산의 예는 당업자에게 공지되어 있고 변형 제 IX 인자 폴리펩티드에 포함될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 생성되는 단백질이 FIX의 활성을 나타내는 것이면, 보존적 아미노산 치환은 임의의 폴리펩티드 또는 이의 도메인에서 이루어질 수 있다. 예컨대 표 2B에서 제시된 보존적 아미노산 치환은, 단백분해 활성을 제거하지 않는 것들이다. 적합한 아미노산의 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있으며 일반적으로 생성 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않고 이루어진다. 당업계의 숙련된 기술자는, 보통, 폴리펩티드의 비 필수적인 영역에서의 단일 아미노산 치환은 실질적으로 생물학적 활성을 변경시키지 아니함을 인식한다(예를 들어, 문헌 [Watson 등, Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224] 참조). 정의에 또한 포함되는 것은, MTSP의 촉매 활성 절편, 특히 단일-가닥 프로테아제 부분이다. 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 하기의 표 2B에 제시된 것들에 따라서 이루어진다.
표 2B
Figure 112017042341398-pat00004
기타의 치환 또한 허용되며 실험적으로 또는 공지된 보존적 치환에 의거하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 DNA 구축물은 단일-가닥 또는 이중-가닥인 선형 또는 원형의 DNA 분자로서, 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA 분절을 함유한다. DNA 구축물은 사람 조작의 결과로서 존재하고 조작된 분자의 클론 및 다른 카피를 포함한다.
본 명세서에 사용된 DNA 분절은 특정 속성을 보유하는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절은 5'에서 3' 방향으로 판독할 때 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드 또는 플라스미드 절편과 같은 더 긴 DNA 분자의 부분이다.
본 명세서에 사용된 폴리뉴클레오티드란 용어는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일-가닥 또는 이중-가닥 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고 자연 출처에서 분리하거나, 시험관내에서 합성하거나 또는 자연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드(약어 "nt") 또는 염기쌍(약어 "bp")으로 제시된다. 뉴클레오티드란 용어는 상황에 따라 단일-가닥 분자 및 이중-가닥 분자에 사용된다. 이 용어가 이중-가닥 분자에 적용될 때 총 길이를 나타내는데 사용되고 염기쌍이란 용어와 동등한 것으로 이해되어야 할 것이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2 가닥은 길이가 약간 다를 수 있어 그 말단들이 어긋날 수 있다; 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드가 쌍을 이룰 수는 없다. 이러한 짝이 없는 말단은 일반적으로 길이가 20개 뉴클레오티드를 초과하지 않을 것이다.
본 명세서에 사용된 "1차 서열"은 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 두 단백질 또는 핵산 간의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 간의 관련도를 의미한다. 유사성은 잔기의 서열과 이 안에 함유된 잔기의 동일성 및/또는 상동성의 정도를 기초로 할 수 있다. 단백질 또는 핵산 간에 유사성 정도를 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 서열 간에 동일성의 최대 수준을 산출하는 방식으로 정렬된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 변하지 않은 정도를 의미한다. 또한, 아미노산 서열의 정렬, 및 어느 정도까지는 뉴클레오티드 서열의 정렬은 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보존적 차이 및/또는 빈번한 치환을 감안할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기의 이화학적 성질을 보존하는 것이다. 정렬은 전체적(서열의 전 길이에 걸쳐 모든 잔기를 포함하는 비교된 서열의 정렬) 또는 국소적(가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열 일부의 정렬)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "상동성" 및 "동일성"이란 용어는 상호교환적으로 사용되지만, 단백질의 상동성은 보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 확인하기 위해, 아미노산 서열은 최고 수준의 정합이 수득되도록 정렬된다(예컨대, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조).
본 명세서에 사용된, "서열 동일성"은 검사 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 간에 비교 시에 동일한 아미노산(또는 뉴클레오티드 염기)의 수를 의미한다. 상동인 폴리펩티드는 소정의 수의 동일한 또는 상동성인 아미노산 잔기를 의미한다. 상동성은 동일한 잔기뿐만 아니라 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 서열 동일성은 각 공급업체에서 확립된 디폴트 갭 패널티(default gap penalty)가 사용된 표준 정렬 알고리즘 프로그램으로 측정할 수 있다. 상동인 핵산 분자는 소정의 수의 동일한 또는 상동성인 뉴클레오티드를 의미한다. 상동성은 동일한 잔기 외에 암호화된 아미노산을 변화시키지 않는 치환(즉, "침묵 치환")을 포함한다. 실질적으로 상동성인 핵산 분자는 일반적으로 중간 엄중도 또는 높은 엄중도에서 당해의 전체 길이의 핵산 분자의 적어도 약 70%, 80% 또는 90%를 따라 혼성화하거나 또는 핵산의 길이를 따라 전체가 혼성화한다. 또한, 혼성화하는 핵산 분자 중의 코돈 대신에 축퇴성 코돈을 함유하는 핵산 분자도 고려된다. (단백질의 상동성을 측정하기 위해, 동일한 아미노산 외에 보존적 아미노산이 정렬될 수 있다; 이러한 경우에 동일성 %와 상동성 %는 다르다). 임의의 두 핵산 분자가 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "동일성"인 뉴클레오티드 서열(또는 임의의 두 폴리펩티드가 아미노산 서열을 가짐)을 보유하는지는 피어슨 등(Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988))에서와 같은 디폴트 파라미터를 사용하는 "FAST A" 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 알고리즘을 이용해서 측정할 수 있다(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), 및 Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)를 포함한다). 예를 들어, 국립 생명공학정보센터(NCBI) 데이터베이스의 BLAST 기능은 동일성을 측정하는데 사용할 수 있다. 다른 상업적인 또는 대중이 이용가능한 프로그램으로는 DNAStar "MegAlign" 프로그램 (Madison, WI) 및 위스콘신 대학 유전자 컴퓨터 그룹(University of Wisconsin Genetics Computer Group) (UWG) "Gap" 프로그램 (Madison WI))을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 상동성 또는 동일성 백분율은 예컨대 GAP 컴퓨터 프로그램(예, Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), 스미드와 워터만[Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]에 의해 개정됨)을 사용하여 서열 정보를 비교하여 측정할 수 있다. 간략히 설명하면, GAP 프로그램은 유사한 정렬 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 두 서열 중 더 짧은 서열의 기호의 총 수로 나누어 유사성을 정의한다. GAP 프로그램의 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 행렬(동일물에 대해서는 1의 값, 비동일물에 대해서는 0의 값을 포함함) 및 그리브스코브 등(Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986))의 가중 비교 행렬 [Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 기술되어 있음]; (2) 각 갭에 대해 3.0의 벌점 및 각 갭의 각 기호에 대해 추가 0.10 벌점; 및 (3) 말단 갭에 대해서는 무벌점을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "동일성"이란 용어는 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 간의 비교를 나타낸다. 1가지 비제한적 예에서, "~에 적어도 90% 동일한"은 참조 폴리펩티드에 대해 90 내지 100%의 동일성 %를 의미한다. 90% 수준 또는 그 이상의 동일성은 예시적 목적으로 가정해보면 100개의 아미노산의 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 길이를 비교할 때, 시험 폴리펩티드의 아미노산 중 10%(즉, 100개 중 10개) 이하가 참조 폴리펩티드의 아미노산과 상이하다는 사실을 나타낸다. 이와 유사하게 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 간에도 비교할 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 서열의 전 길이를 따라 무작위로 분포된 점 돌연변이로서 나타날 수도 있고, 또는 허용될 수 있는 최대 수까지, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 다양한 길이로 하나 이상의 위치에서 응집되어 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상동성 또는 동일성 수준이 약 85 내지 90% 이상일 때는, 이 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트와 무관해야 하고; 이러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 관계없이 쉽게 평가될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"이란 용어는 관련 기술분야의 숙련된 자가 이해하는 바와 같이 상황에 따라 달라지지만, 당업자라면 쉽게 평가할 수 있는 것임은 물론이다.
본 명세서에 사용된, 정렬된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 상응하는 위치를 정렬시키기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 보통, 50% 또는 그 이상의 동일성으로 관련이 있는 2 이상의 서열이 정렬된다. 정렬된 서열 세트는 상응하는 위치에 정렬된 2 이상의 서열을 의미하고 게놈 DNA 서열과 정렬된 EST 및 다른 cDNA와 같은 RNA 유래의 정렬 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "특이적으로 혼성화한다"는 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자(예, 올리고뉴클레오티드)의 상보성 염기쌍 형성에 의한 어닐링을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 시험관 내 및 생체 내 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성 등에 익숙하다. 시험관내 혼성화와 특히 관련이 있는 파라미터로는 또한 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성물 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄중도에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 세척 조건의 예는 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 중간 엄중도에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 등가의 엄중도 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특정 용도에 적당한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위해 상기 파라미터를 쉽게 조정할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 분리 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 생물학적 활성부는 실질적으로 세포성 물질 또는 단백질이 유래된 세포 또는 조직의 기타 불순 단백질이 실질적으로 없는, 또는 화학 합성되었을 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제조물은 이러한 순도를 평가하기 위해 당업자가 사용하는 표준 분석방법, 예컨대 박층크로마토그래피(TLC), 겔전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등으로 측정했을 때 쉽게 검출할 수 있는 불순물이 없는 것으로 보이면 실질적으로 제거된 것으로 결정될 수 있고, 또는 추가 정제에 의해 물질의 단백분해 및 생물학적 활성과 같은 이화학적 성질의 검출가능한 변화가 없을 정도로 충분히 순수한 것으로 결정될 수 있다. 거의 화학적으로 순수한 화합물을 생산하는 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 하지만, 거의 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 이러한 경우에, 추가 정제는 화합물의 불활성을 증가시킬 수도 있을 것이다.
세포성 물질이 실질적으로 없는 이란 용어는 세포성 성분이 분리된 세포의 세포성 성분으로부터 단백질이 분리되거나, 또는 단백질이 재조합 생산된, 단백질 제조물을 포함한다. 일 양태에 따르면, 세포성 물질이 실질적으로 없는 이란 용어는 프로테아제외 단백질(불순 단백질이라 불리기도 함)이 약 30%(건조중량 기준) 미만인, 일반적으로 프로테아제외 단백질이 약 20% 미만 또는 프로테아제외 단백질이 10% 또는 프로테아제외 단백질이 약 5% 미만인, 프로테아제 단백질 제조물을 포함한다. 프로테아제 단백질 또는 이의 활성부가 재조합 생산된 경우에는, 배양 배지가 실질적으로 없어야 하고, 즉 배양 배지가 프로테아제 단백질 제조물 용적의 약 20%, 10% 또는 5% 이하여야 한다.
본 명세서에 사용된, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 이란 용어는 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화물질로부터 단백질이 분리된, 프로테아제 단백질의 제조물을 포함한다. 이 용어는 화학적 전구체 또는 프로테아제외 화학물질 또는 성분이 약 30%(건조중량 기준), 20%, 10%, 5% 또는 그 이하인 프로테아제 단백질의 제조물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 재조합 DNA 방법을 사용하는 재조합법에 의한 생산은 클로닝된 DNA에 의해 암호화된 단백질을 발현시키기 위한 분자생물학의 공지된 방법의 사용을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 벡터(또는 플라스미드)는 이종 핵산을 이의 발현 또는 복제를 위해 세포 내로 도입시키는데 사용되는 독립된 구성요소를 의미한다. 벡터는 보통 에피솜성을 유지하지만, 게놈의 염색체 내로 유전자 또는 이의 일부를 통합시키도록 설계될 수 있다. 또한, 인공 염색체, 예컨대 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터도 고려한다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된, 발현은 핵산이 mRNA로 전사되어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 핵산이 게놈 DNA에서 유래된다면, 발현은 적당한 진핵생물 숙주 세포 또는 유기체가 선택된다면 프로세싱, 예컨대 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 발현 벡터는 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열과 작동가능하게 결합된 DNA를 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 추가의 분절로는 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있고, 경우에 따라 하나 이상의 복제 오리진, 하나 이상의 선택성 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA에서 유래되거나, 이 둘 모두의 구성요소를 함유할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입 시에 클로닝된 DNA를 발현시키는 재조합 DNA 또는 RNA 작제물, 예컨대 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 기타 벡터를 의미한다. 적당한 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 진핵생물 세포 및/또는 원핵생물 세포에서 복제할 수 있고 에피솜성을 유지하거나 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스 벡터는 외인성 유전자를 세포내로 전이시키기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 결합된 유전자조작된 바이러스(비히클 또는 셔틀로서)이다.
본 명세서에 사용된, 아데노바이러스는 사람에서 상기도 감염 및 결막염을 유발하는 DNA 함유 바이러스 그룹의 임의의 바이러스를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 나출형 DNA는 백신 및 유전자요법에 사용될 수 있는 히스톤이 없는 DNA를 의미한다. 나출형 DNA는 형질전환 또는 형질감염이라는 처리가 된 유전자 전이 동안 세포에서 세포로 전달되는 유전자 물질이다. 형질전환 또는 형질감염에서, 수용체 세포에 의해 흡수되는 정제된 또는 나출형 DNA는 수용체 세포에게 새로운 특징 또는 표현형을 제공할 것이다.
본 명세서에 사용된, DNA 분절에 관한 것일 때, 실시가능하게 또는 작동가능하게 결합된 이란 분절들이 의도된 목적을 위해 협력하여 기능하도록 분절들이 배열되어 있음을 의미하며, 예컨대 전사는 프로모터에서 시작하여 암호화 분절을 통해 터미네이터로 진행된다.
본 명세서에 사용된, 단백질의 활성 또는 유전자 또는 핵산의 발현을 조절하는 제제는 단백질의 활성을 감소 또는 증가시키거나 또는 다른 방식으로 변경시키고, 또는 일부 방식에서는 세포 내에서 핵산의 발현을 상향조절 또는 하향조절하거나 또는 다른 방식으로 변경시킨다.
본 명세서에 사용된 "키메릭 단백질" 또는 "융합 단백질"은 다른 폴리펩티드에 작동가능하게 결합된 폴리펩티드를 의미한다. 본 명세서에 제공된 키메릭 또는 융합 단백질은 하나 이상의 FIX 폴리펩티드 또는 이의 일부, 및 전사/번역 조절 시그널, 시그널 서열, 국재화를 위한 태그, 정제를 위한 태그, 면역글로불린 G 도메인의 일부 및/또는 표적화제 중 어느 하나 이상을 위한 하나 이상의 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 키메릭 FIX 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 내인성 도메인 또는 영역이 다른 폴리펩티드로 교환된 것을 포함한다. 이러한 키메릭 또는 융합 단백질은 재조합 수단에 의해 융합 단백질로 생산된 것, 화학적 수단, 예컨대 설프하이드릴 그룹에 대한 커플링 등의 화학적 커플링에 의해 생산된 것, 및 임의의 다른 방법으로 생산된 것을 포함하며, 이로써 적어도 하나의 폴리펩티드(즉, FIX) 또는 이의 부분이 링커(들)를 통해 다른 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 결합된다.
본 명세서에 사용된, 융합 단백질에 대해 언급할 때의 작동가능하게 결합된 이란 서로 프레임내 융합된 프로테아제 폴리펩티드와 프로테아제외 폴리펩티드를 의미한다. 프로테아제외 폴리펩티드는 프로테아제 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 표적화제는 세포 표면 수용체와 같은 세포 표면 분자에 특이적 결합을 제공하고, 몇몇 경우에는 결합된 접합체 또는 이의 부분을 내재화시킬 수 있는 단백질 또는 이의 유효부와 같은 임의의 잔기이다. 또한, 표적화제는 접합체의 친화도 분리 또는 정제; 표면에 대한 접합체의 부착; 또는 접합체 또는 접합체를 함유하는 복합체의 검출 등을 촉진하거나 용이하게 하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된, 분자의 유도체 또는 유사체는 분자 유래의 부분 또는 이 분자의 변형 버전을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "질환 또는 장애"는 감염, 후천적 병태, 유전자 상태를 포함한, 이에 국한되지 않는 원인이나 병태에서 야기되고 식별가능한 증상들을 특징으로 하는 유기체의 병리학적 상태를 의미한다. 본 명세서에서 당해의 질환 및 장애는 응고를 수반하는 것, 예컨대 응고 단백질에 의해 매개되는 것 및 응고 단백질이 병인 또는 병리에 역할을 하는 것이다. 또한, 질환 및 장애는 혈우병에서와 같이 단백질의 부재에 의해 유발되는 것을 포함하고, 특히 본 발명의 대상은 응고 단백질의 결함 결핍으로 인해 응고가 일어나지 않는 장애이다.
본 명세서에 사용된 "응혈원(응혈촉진제)"은 혈액 응고를 촉진하는 모든 물질을 의미한다.
본 발명에 사용된, "항응혈제"는 혈액 응고를 저해하는 모든 물질을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "혈우병"은 혈액 응고인자의 결핍으로 인해 유발된 출혈 장애를 의미한다. 혈우병은 예컨대 응고 인자의 부재, 발현 감소 또는 기능 감소 등의 결과일 수 있다. 가장 일반적인 혈우병 종류는 혈우병 A로서, 제 VIII 인자의 결핍으로 인해 나타난다. 두번째로 가장 일반적인 혈우병 종류는 혈우병 B이며, 이는 제 IX 인자의 결핍으로 인해 나타난다. FXI 결핍증으로도 불리는 혈우병 C는 혈우병의 가볍고 덜 일반적인 형태이다.
본 명세서에 사용된, "선천적 혈우병"은 유전되는 혈우병 종류를 의미한다. 선천적 혈우병은 응고 인자의 생산이 없거나, 감소되거나, 비기능성인 응고 인자 유전자의 돌연변이, 결실, 삽입 또는 기타 변형으로부터 나타난다. 예를 들어, 제 VIII 인자 및 제 IX 인자와 같은 응고 인자 유전자의 유전성 돌연변이는 각각 선천적 혈우병, 혈우병 A 및 B를 초래한다.
본 명세서에 사용된 "후천적 혈우병"은 FVIII을 불활성화시키는 자가항체의 생산으로부터 성인기에 발생하는 혈우병의 종류를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "출혈 장애"는 출혈을 저지하는 능력이 감소된 대상체의 상태를 의미한다. 출혈 장애는 선천적 또는 후천적일 수 있고, 응고 경로의 결함이나 결핍, 혈소판 활성의 결함이나 결핍 또는 혈관 결함 등으로부터 초래될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "후천적 출혈 장애"는 간 질환, 비타민 K 결핍증 또는 쿠마딘(와파린) 또는 다른 항응혈 요법과 같은 병태에 의해 유발되는 응고 결핍으로부터 초래되는 출혈 장애를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 질환 또는 병태를 보유한 대상체를 "치료하는"이란 폴리펩티드, 조성물 또는 본 명세서에 제공된 기타 산물이 대상체에 투여되는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 치료제, 치료 요법, 방사선보호제, 또는 화학치료제는 당업자에게 공지된 백신을 비롯한 통상의 약물 및 약물 치료제를 의미한다. 방사능치료제는 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 치료는 병태, 장애 또는 질환의 증상들이 호전되거나, 다른 방식으로 유리하게 변경되는 모든 방식을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료법 및/또는 치유를 포함한다. 또한, 치료는 본 명세서에 제공된 조성물의 모든 약제학적 사용을 포함한다. 또한, 치료는 본 명세서에 제공된 변형 FIX 및 조성물의 임의의 약제학적 사용을 포함한다.
본 발명에 사용된, 약제학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여와 같은 치료에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상들의 호전은, 영구적 또는 일시적, 지속적 또는 일과성 여부에 관계없이, 조성물 또는 치료제의 투여에 기인할 수 있는 또는 그 투여와 관련이 있을 수 있는 증상들의 임의의 완화를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 방지 또는 예방은 질환이나 병태가 발생할 위험을 감소시키는 방법을 의미한다. 예방은 질환이나 병태의 발생 위험의 감소 및/또는 질환의 증상이나 진행의 악화 방지 또는 질환의 증상이나 진행의 악화 위험의 감소를 포함한다.
본 명세서에 사용된 특정 질환을 치료하기 위한 화합물 또는 조성물의 유효량은 그 질환과 관련이 있는 증상을 호전시키거나, 일부 방식에서는 저감시키기에 충분한 양이다. 이러한 양은 단일 투여량으로 투여될 수 있고, 또는 요법에 따라 투여될 수 있어, 효과적이다. 이 양은 질환을 치유할 수 있지만, 통상 질환의 증상을 호전시키기 위해 투여한다. 보통, 증상의 원하는 호전을 달성하기 위해서는 반복 투여가 필요하다.
본 명세서에 사용된, "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 용량"은 적어도 치료 효과를 나타내기에 충분한, 제제, 화합물, 물질 또는 화합물을 함유하는 조성물을 의미한다. 유효량은 질환이나 장애의 증상을 예방하거나, 치유하거나, 호전시키거나, 정지시키거나 또는 부분적으로 정지시키는데 필요한 치료제의 양이다.
본 명세서에 사용된, 치료되는 "환자" 또는 "대상체"는 사람 및/또는 비-사람 동물, 예컨대 포유동물을 포함한다. 포유동물은 영장류, 예컨대 사람, 침팬지, 고릴라 및 원숭이; 가축 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 돼지, 염소, 소; 및 설치류, 예컨대 마우스, 랫트, 햄스터 및 저빌을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 조합은 두 항목 간에 또는 그 이상의 항목 간에 임의의 연합을 의미한다. 연합은 공간적일 수 있고, 또는 공통 목적을 위한 2 이상의 항목의 사용을 의미하기도 한다.
본 명세서에 사용된, 조성물은 2 이상의 산물 또는 화합물(예, 제제, 변조인자, 조절인자 등)의 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성 또는 비수성 제형 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "제조품"은 제조되어 판매되는 제품이다. 본 명세서을 통해 사용된 바와 같이, 이 용어는 포장물품에 함유된 변형 프로테아제 폴리펩티드 및 핵산을 내포하기 위한 것이다.
본 명세서에 사용된, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 모든 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 젤, 로션, 크림의 형태인 조성물 및 이러한 다른 조성물을 내포한다.
본 명세서에 사용된, "키트"는 포장된 조합물을 의미하며, 경우에 따라 조합물의 구성요소를 사용하여 방법을 실행하는 시약 및 다른 산물 및/또는 성분을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 변형 프로테아제 폴리펩티드 또는 핵산 분자와 생물학적 활성 또는 성질의 평가, 진단 및 투여를 포함하나, 이에 국한되지 않는 목적을 위한 다른 항목을 함유하는 키트가 제공된다. 키트는 경우에 따라 사용 지침서를 포함한다.
본 명세서에 사용된, 항체는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역으로 구성된 Fab 단편과 같은 항체 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 수용체는 특정 리간드에 대한 친화도를 보유하는 분자를 의미한다. 수용체는 자연 발생의 분자 또는 합성 분자일 수 있다. 또한, 수용체는 당업계에서 항리간드로 불리기도 한다.
본 명세서에 사용된, 동물은 모든 동물, 예컨대 사람, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 래트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류, 및 기타 동물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 비-사람 동물은 고찰되는 동물로서 사람을 제외한다. 본 발명에 제공된 프로테아제는 임의의 급원, 동물, 식물, 원핵생물 및 진균류 유래의 프로테아제이다.
본 명세서에 사용된 유전자요법은 이 요법이 추구하는 장애 또는 병태를 보유한 포유동물, 특히 사람의 특정 세포, 표적 세포 내로 DNA와 같은 이종 핵산의 전이를 수반한다. DNA와 같은 핵산은 선택된 표적 세포 내로 직접 또는 벡터나 다른 전달 비히클 등을 통해, DNA와 같은 이종 핵산이 발현되어, 이로 인해 암호화된 치료 산물이 생산되도록 하는 방식으로 도입된다. 대안적으로, DNA와 같은 이종 핵산은 일부 방식에서는 치료 산물을 암호화하는 DNA의 발현을 매개할 수 있거나, 또는 일부 방식에서는 치료 산물의 발현을 직접 또는 간접적으로 매개하는 펩티드 또는 RNA와 같은 산물을 암호화할 수 있다. 또한, 유전자요법은 핵산이 도입되는 세포 또는 포유동물에 의해 생성되는 유전자 산물을 보충하거나 결함 유전자를 교체하는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 도입된 핵산은 포유동물 숙주에서 정상적으로 생산되지 않거나, 치료학적 유효량으로 또는 치료학적으로 유용한 시간에 생산되지 않는 프로테아제 또는 변형 프로테아제와 같은 치료 화합물을 암호화할 수 있다. 치료 산물을 암호화하는 DNA와 같은 이종 핵산은 병에 걸린 숙주의 세포 내로 도입되기 전에 변형되어 그 산물 또는 이의 발현을 증강시키거나 또는 다른 방식으로 변경시킬 수 있다. 또한, 유전자요법은 유전자 발현의 저해제, 억제제 또는 다른 변조인자(modulator)의 전달을 수반할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 이종 핵산은 이 핵산이 발현되는 세포에 의해 정상적으로는 생체 내에서 생산되지 않거나, 또는 이 세포에 의해 생산되지만 다른 유전자좌에 있거나 다르게 발현되거나, 또는 전사, 번역 또는 다른 조절성 생화학 과정에 영향을 미쳐 DNA와 같은 내인성 핵산의 발현을 변조시키는 매개인자를 매개하거나 암호화하는 핵산이다. 이종 핵산은 일반적으로 이 핵산이 도입되는 세포에 대해 내인성인 것이 아니라, 다른 세포에서 수득되거나 합성 제조된 것이다. 이종 핵산은 내인성일 수 있으나, 다른 유전자좌에서 발현되거나, 그 발현이 변경된 핵산이다. 이러한 핵산은 반드시 그렇지는 않지만, 일반적으로 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않거나 또는 이 핵산이 발현되는 세포에서와 같은 방식으로 생산되지 않는 RNA 및 단백질을 암호화한다. 이종 핵산, 예컨대 DNA는 또한 이질(foreign) 핵산, 예컨대 DNA라 부를 수도 있다. 따라서, 이종 핵산 또는 이질 핵산은 게놈에서 발현되는 상응하는 핵산 분자, 예컨대 DNA와 정확한 배향 또는 위치에 존재하지 않는 핵산 분자를 포함한다. 또한, 다른 유기체 또는 종 유래의 핵산 분자라고 부를 수도 있다(즉, 외인성).
당업자가 핵산이 발현되는 세포에 대해 이종성이거나 이질성인 것으로 인식하거나 생각할 수 있는 DNA와 같은 모든 핵산은 본 명세서에서 이종 핵산에 포함되며, 이종 핵산은 내인적으로 발현되기도 하는 외인적으로 첨가된 핵산을 포함한다. 이종 핵산의 예로는 추적할 수 있는 마커 단백질, 예컨대 내약물성을 부여하는 단백질을 암호화하는 핵산, 항암제, 효소 및 호르몬과 같이 치료학적 유효 물질을 암호화하는 핵산, 및 항체와 같이 다른 종류의 단백질을 암호화하는 DNA와 같은 핵산을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이종 핵산에 의해 암호화된 항체는 이종 핵산이 도입된 세포 표면에서 분비되거나 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 유전자 요법의 치료학적 유효 산물은 이종 핵산, 보통 DNA에 의해 암호화된 산물로서, 숙주에 핵산 도입 시에 질환을 치유하거나, 선천적 또는 후천적 질환의 증상, 징후를 호전시키거나 제거하는 산물이 발현된다. 또한, RNAi 및 안티센스와 같은 생물학적 활성 핵산 분자도 포함된다.
본 명세서에 사용된, 폴리펩티드가 언급된 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진"이란 언급은 전체 길이의 폴리펩티드 중 언급된 부분, 또는 이의 단편만이 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 폴리펩티드는 경우에 따라, 일반적으로 다른 급원 유래의 추가의 아미노산을 포함하거나, 또는 다른 폴리펩티드에 삽입될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 하나를 뜻하는 어형은 다른 분명한 언급이 없는 한 복수의 관련물을 포함한다. 예를 들어, "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 보유하는 화합물을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 범위 및 양은 "약" 특수값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 또한, 정확한 양도 포함된다. 따라서, "약 5개 염기"는 "약 5개 염기"와 "5개 염기"를 의미한다.
본 명세서에 사용된, "임의의" 또는 "임의로"는 후술되는 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않으며, 이 표현은 그러한 사건이나 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의로 치환된 그룹은 그룹이 치환되거나 치환되지 않은 것임을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 임의의 보호 그룹, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는 다른 표시가 없는 한 통용되는 용법, 공식 약어 또는 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(Biochem. 11: 1726 (1972) 참조)에 따른다.
B. 지혈 작용 및 그 안의 제 IX 인자의 역할
변형 FIXa 폴리펩티드 및 이들의 촉매적 활성 절편을 포함하는 변형 제 IX 인자(FIX)가 본원에서 제공된다. 제 IX 인자 폴리펩티드는 지혈의 조절 및 과정에 역할을 수행하며, 따라서 치료제로 사용될 수 있다. 약제학 과학에 있어 임상적 용도를 위한 치료적 단백질, 예컨대 FIX 효과적 전달은 큰 도전이다. 일단 혈류에서, 이러한 단백질은, 신장에서의 (사구체) 여과 또는 혈액에서의 단백분해와 같은, 단백질의 제거를 위한 일반적인 경로를 사용하는 제거뿐 아니라 대사가 관여된, 짧은 시간 동안 서로 다른 생리적인 과정에 의하여 지속적으로 순환계로부터 소실된다. 일단 관강 위장관에 들어가면, 이러한 단백질은 관강 프로테아제에 의하여 지속적으로 소화된다. 후자는 정맥 주입에 있어 치료제로 사용되는 단백질의 반감기에 영향을 미치는 제한적 과정이 될 수 있다. 게다가, 혈중 저해제들이 치료 단백질의 활성을 특별히 저해할 수 있다. 예를 들어, 항트롬빈(AT-III), 헤파린, 및 AT-III/헤파린 복합체는, FIX의 응혈 활성을 저해할 수 있다. 개선된 약동학적 및 약역학적 성질, 증가된 촉매활성, 및/또는 증가된 저해제에 대한 내성을 포함하는, 개선된 성질을 가지는 FIX의 보다 효과적인 변이체가 요구된다.
본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는, 증가된 혈청 반감기와 같은 개선된 약동학적 성질; 항트롬빈 III(AT-III), 헤파린 및 와 AT-III/헤파린 복합체와 같은 저해제에 대한 증가된 내성; 증가된 촉매 활성; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 개선된 성질을 나타낸다. 따라서, 증가된 응고 활성을 가지는 변형 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 따라서, 이러한 폴리펩티드는 지혈 조절을 위한 치료제와 같은 다양한 용도와 이용가능성을 가진다. 하기 논의는 응고 과정 및 이 과정에 있어 제 IX 인자의 역할의 검토를, 제 IX 인자 및 이의 변형에 대한 논의에 앞서 제공한다.
지혈은 혈관계 상해로부터 초래되는 출혈을 기원으로 하는 생리학적 기전이다. 정상 지혈은 세포 성분과 가용성 혈장 단백질에 의존적이고, 최종적으로 혈전 형성으로 이어지는 일련의 시그널링 사건들을 수반한다. 응고는 혈관에 상해가 일어나고 내피 세포가 손상된 후 빠르게 개시된다. 응고의 1차 단계는 혈소판이 활성화되어 상해 부위에 지혈전(hemostatic plug)을 형성한다. 2차 지혈은 이어서 혈장 응고 인자를 수반하고, 이 인자는 단백분해 캐스캐이드에서 작용하여 혈소판전을 강화시키는 피브린 가닥을 형성시킨다.
혈관 상해 시에, 직접 상해 부위로의 혈액 흐름은 혈관 수축에 의해 제한되어 내피하의 결합 조직 상에 새로 노출된 섬유원성 교원섬유(fibrillar collagen)에 혈소판이 부착하도록 한다. 이러한 부착은 상해 3초 내에 내피에 결합하여, 혈소판 부착과 응집을 촉진하는 폰빌레브란트 인자(vWF)에 의존적이다. 응집된 혈소판의 활성화는 ADP, ATP, 트롬복산 및 세로토닌을 비롯한 다양한 인자들을 분비시킨다. 또한, 부착 분자, 피브리노겐, vWF, 트롬보스폰딘 및 피브로넥틴도 방출된다. 이러한 분비는 혈소판의 추가의 부착 및 응집, 증가된 혈소판 활성화 및 혈관 수축, 혈액 응고 효소 복합체의 어셈블리를 위한 플랫폼으로서 작용하는 혈소판 표면에 대한 음이온성 인지질의 노출을 촉진한다. 이 혈소판들은 형태를 변화시켜 위족(pseudopodia) 형성을 야기하고, 이는 추가로 다른 혈소판들에 대한 응집을 촉진하여 이완 혈소판전(loose platelet plug)을 초래한다.
펩티다제(응고 캐스캐이드)의 응고 캐스캐이드는 동시에 개시된다. 응고 캐스캐이드는 단백분해 절단을 포함하는 일련의 활성화 사건을 수반한다. 이러한 캐스캐이드에서, 세린 프로테아제의 불활성 단백질(자이모겐이라고도 함)은 하나 이상의 펩티드 결합의 절단에 의해 활성 프로테아제로 전환되고, 그 다음 이 캐스캐이드의 다음 자이모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로서 작용하여, 최종적으로 피브린의 가교결합에 의해 응괴 형성을 초래한다. 예를 들어, 캐스캐이드는 트롬빈(프로트롬빈의 절단으로부터)과 같은 활성화된 분자를 생성하고, 이는 추가로 혈소판을 활성화시키고 피브리노겐의 절단으로부터 피브린을 생성시키기도 한다. 그 다음, 피브린은 혈소판전 주위에 가교결합 중합체를 형성시켜 응괴를 안정화시킨다. 상해의 수복 시에, 피브린은 주요 성분이 플라스미노겐과 조직형 플라스미노겐 활성인자(tPA)인 피브린용해계에 의해 분해된다. 상기 단백질들은 모두 중합하는 피브린 내로 혼입되어 서로 상호작용하여 플라스민을 생성하고, 이것은 그 다음 피브린에 작용하여 사전형성된 응괴를 용해한다. 응괴 형성 동안, 응고인자 저해제가 혈액을 통해 순환하여 상해 부위 너머까지 응괴 형성을 방해한다.
상해부터 응괴 형성 및 이어 피브린용해까지 상기 계의 상호작용은 이하에 설명한다.
1. 혈소판 부착 및 응집
혈액의 응고는 정상 상태 하에서는 능동적으로 우회된다. 혈관 내피는 혈관확장을 지지하고 혈소판 부착과 활성화를 저해하며, 응고를 억제하고 피브린 절단을 증강시키고 항염증성 특성이 있다. 혈관 내피 세포는 혈소판 응집을 저해하고 혈관을 확장시키는 산화질소(NO) 및 프로스타사이클린(prostacylin)과 같은 분자를 분비한다. 이러한 분자들의 방출은 가용성 구아닐레이트 사이클라제(sGC) 및 cGMP 의존적 단백질 키나제 I(cGKI)을 활성화시키고 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 수준을 증가시켜, 혈관벽 내의 평활근의 이완을 유발한다. 더욱이, 내피세포는 혈소판으로부터 방출된 ADP를 아데닌 뉴클레오티드 혈소판 저해제로 전환시켜 혈소판 활성화 및 응집을 제어하는 CD39와 같은 세포 표면 ADPase를 발현한다. 또한, 내피는 피브린용해 캐스캐이드의 효소들을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 내피세포는 모두 응괴 제거를 촉진하는, 조직형 및 우로키나제 플라스미노겐 활성인자의 분비뿐만 아니라 플라스미노겐(아넥신 II) 및 우로키나제의 수용체들의 발현을 통해 플라스민의 생성을 직접 촉진한다. 혈전유발성 조절의 마지막 층에서, 내피세포는, 트롬빈 및 다른 응고 인자의 항트롬빈 III 저해의 반응속도론을 증가시키는 헤파란 설페이트를 생산하여 응고 캐스캐이드를 저해하는데 있어서 능동적인 역할을 한다.
하지만, 급성 혈관 외상 하에서는 혈관수축신경 기전이 우세하고, 내피는 사실상 혈전유발성, 응혈촉진성 및 염증유발성이 된다. 이것은 혈관 평활근 세포의 수축을 유인하는 혈관 평활근 세포 상의 ADP, 세로토닌 및 트롬복산의 직접 작용; 및 내피 확장제, 즉 아데노신, NO 및 프로스타사이클린의 감소에 의해 달성된다(Becker, Heindle 등, 2000). 울혈 혈전의 형성을 야기하는 내피 기능 변화의 주요 동기는 혈액과 세포외 기질(ECM) 성분 사이에 내피 세포 장벽의 상실이다(Ruggeri(2002) Nat Med 8: 1227-1234). 혈행 혈소판은 내피 병변 영역을 식별하고 구별하여, 노출된 내피하층에 부착한다. 이들과 다양한 혈전형성성 기질 및 국소 발생 또는 방출된 작용제(agonist)와의 상호작용은 혈소판 활성화를 초래한다. 이러한 과정은 처리 2단계, 즉 1) 부착: 1차적으로 표면에 대한 구속(tethering), 및 2) 응집: 혈소판-혈소판 유착으로 표현된다(Savage 등(2001) Curr Opin Hematol 8: 270-276).
혈소판 부착은 혈행 혈소판이 세포 표면상의 교원섬유 결합 단백질과의 상호작용, 및 또한 내피에 존재하는 vWF와의 상호작용을 통해 노출된 교원섬유에 결합할 때 개시된다. vWF 단백질은 내피에 의해 2가지 방향; 즉 기저측쪽(basolateral)으로, 그리고 혈류 내로 분비되는, 다양한 크기의 다량체 구조이다. 또한, vWF는 제 VIII 인자에 결합하며, 이는 제 VIII 인자의 안정화 및 혈행 중에서의 생존에 중요하다.
혈소판 부착 및 후속 활성화는 vWF가 A1 도메인을 통해 GPIb(혈소판 당단백질 수용체 복합체 GPIb-IX-V의 일부)에 결합할 때 달성된다. vWF와 GPIb 간의 상호작용은 전단력에 의해 조절되어, 전단 응력의 증가는 이에 상응하는 vWF의 GPIb에 대한 친화도를 증가시킨다. VLA-2로서 백혈구 상에 알려져 있는 인테그린 α1β2는 혈소판 상의 주요 교원섬유 수용체이며, 이 수용체를 통한 참여는 혈소판 활성화에 기여하는 세포내 시그널을 생성한다. α1β2를 통한 결합은 저친화도(lower-affinity) 교원섬유 수용체, GP VI의 참여를 촉진한다. 이는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 일부이며, 혈소판 활성화의 가장 강력한 세포내 시그널을 생성하는 수용체이다. 혈소판 활성화는 트롬복산 A2로 전환되는 아데노신 디포스페이트(ADP)를 방출시킨다.
또한, 혈소판 활성화는 인테그린 αIIbβ3으로도 알려진, 혈소판 당단백질 IIb-IIIa(GP IIb-IIIa) 수용체의 표면 발현을 야기한다. GP IIb-IIIa 수용체는 이 수용체를 통해 혈소판을 결합시키는 피브리노겐 분자에 의하여 혈소판을 서로 부착시킨다(즉, 응집). 이것은 결과적으로 상해 부위에 혈소판전을 형성시켜 추가의 혈액 손실의 방지를 돕는 한편, 손상된 혈관 조직은 혈소판전 주위에 안정화 피브린 메쉬의 형성 및 응고 캐스캐이드를 개시시키는 인자들을 방출한다.
2. 응고 캐스캐이드
응고 경로는 각 효소가 자이모겐 또는 불활성 형태로 혈장에 존재하는 단백분해 경로이다. 자이모겐의 절단은 전구체 분자로부터 활성 형태를 방출시키기 위해 조절된다. 이 경로는 활성화 과정을 통제하는 일련의 양성 및 음성 피드백 루프로서 작용하고, 여기서 궁극적 목표는 가용성 피브리노겐을 피브린으로 전환시켜 응괴를 형성시킬 수 있는 트롬빈을 생산하는 것이다. 응고 인자 및 다른 단백질들은 응고의 내인성, 외인성 또는 공통 경로 중 하나 이상을 통해 혈액 응고에 참여한다. 이하에 논의되는 바와 같이, 이러한 경로들은 서로 연결되어 있고, 혈액 응고는 세포계 활성화 모델을 통해 일어나는 것으로 생각되고 있다.
역사적으로, 트롬빈의 생성은 3가지 경로, 즉 활성화된 제 X 인자(FXa) 생성의 대체 경로를 제공하는 내인성(이 경로의 모든 성분들이 혈장에 내인성임을 암시한다) 및 외인성(이 경로의 하나 이상의 성분들이 혈장에 외인성임을 암시한다) 경로, 및 트롬빈을 형성시키는 마지막 공통 경로로 분류되었다(도 1). 이 경로들은 응고를 수행하는 상호연결되고 상호의존적인 과정에 함께 참가한다. 이 경로들을 설명하는 세포-기반 응고 모델이 개발되었다(도 2)(Hoffman 등(2001) Thromb Haemost 85: 958-965). 이 모델에서, "외인성" 및 "내인성" 경로들은 다른 세포 표면, 즉 조직인자(TF) 보유 세포 및 혈소판에서 각각 실시된다. 응고 과정은 독특한 단계들, 즉 개시, 증폭 및 전파로 분리되고, 이 과정 동안 외인성 및 내인성 경로는 다양한 단계에서 기능하여 응괴 형성에 충분한 양의 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는데 필요한 트롬빈을 대량으로 생산한다.
a. 개시
FVII는 응고 캐스캐이드의 개시를 담당하는 응고 인자인 것으로 생각되고 있고, 상기 개시는 TF와의 상호작용에 의존적이다. TF는 평활근 세포, 섬유아세포, 단핵구, 림프구, 과립구, 혈소판 및 내피세포와 같은 다양한 세포에 의해 발현되는 막관통 당단백질이다. 골수성 세포 및 내피 세포는 이들이 염증유발성 사이토카인 등에 의해 자극될 때에만 TF를 발현한다. 하지만, 평활근 세포 및 섬유아세포는 구성적 방식으로 TF를 발현한다. 따라서, 이 세포들이 일단 조직 상해 후에 혈류와 접촉하게 되면, 응고 캐스캐이드는 혈장 내의 제 VII 인자 또는 FVIIa와 TF의 결합에 의해 빠르게 개시된다. TF/FVIIa 복합체는 TF에 FVIIa의 직접 결합을 통해, 또는 TF에 FVII의 결합 후, FXa, FIXa, FXIIa 또는 FVIIa 자체와 같은 혈장 프로테아제에 의한 FVII의 FVIIa로의 후속 활성화를 통해 형성될 수 있다. TF/FVIIa 복합체는 응고의 "외인성 경로"로 알려진 것에서 소량의 FX를 FXa로 활성화시키는 TF 보유 세포에 고착된 상태를 유지한다.
또한, TF/FVIIa 복합체는 소량의 FIX를 FIXa로 절단한다. FXa는 이의 보조인자 FVa와 결합하여 TF 보유 세포 상에서 복합체를 또한 형성하고, 그 후 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킬 수 있다. 하지만, 생산된 소량의 트롬빈은 완전한 응고에 필요한 피브린 형성을 지지하는 데에는 부족하다. 또한, 임의의 활성 FXa 및 FIXa는 항트롬빈 III(AT-III) 및 다른 서핀류(serpin)에 의해 혈행 중에서 저해되고, 이에 대해서는 이하에 더 상세하게 논의된다. 이것은 보통 혈행 중의 응괴 형성을 방해할 수 있다. 하지만, 상해의 존재 하에서 혈관구조에 손상은 이 트롬빈 형성 부위에서 혈소판 응집 및 활성화를 야기하여, 응고 시그널을 증폭시킨다.
b. 증폭
증폭은 트롬빈이 혈소판에 결합하여 혈소판을 활성화시킬 때 일어난다. 활성화된 혈소판은 이의 알파 과립으로부터 FV를 방출하고, 이는 트롬빈에 의해 FVa로 활성화된다. 또한, 트롬빈은 혈소판 막 상의 FVIII/vWF 복합체로부터 FVIII을 방출 및 활성화시키고, FXI을 FXIa로 절단한다. 이 반응들은 표면에 FVa, FVIIIa 및 FIXa를 보유하는 활성화된 혈소판을 생성시키고, 이는 전파 단계동안 트롬빈을 대량 생성시키는 단계가 된다.
c. 전파
응고의 전파는 상해 부위에서 다수의 혈소판 표면에서 일어난다. 전술한 바와 같이, 활성화된 혈소판은 표면에 FXIa, FVIIIa 및 FVa를 보유한다. 여기서 외인성 경로가 실행된다. FXIa는 FIX를 FIXa로 활성화시키고, 그 다음 FVIIIa와 결합할 수 있다. 이 과정은 TF 보유 세포 상의 TF/FVIIa 복합체에 의한 FIX의 절단을 통해 생성되는 소량의 FIXa 외에, 보조인자인 FVIIIa, 칼슘 및 적합한 인지질 표면과 결합한 복합체로서 대량의 FXIa를 생성시킨다. 이 복합체는 테나아제 또는 Xase 복합체로 불리우며, 제 X 인자(FX)를 제Xa인자(FXa)로 절단하여 활성화한다. FXa 분자는 FVa에 결합하여, 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 프로트롬비나제 복합체를 생성시킨다. 트롬빈은 양성 피드백 루프에서 작용하여 훨씬 더 많은 혈소판을 활성화시키고, 다시 증폭 단계에서 설명한 과정들을 개시시킨다.
곧, 적당한 복합체를 갖는 충분한 수의 활성화된 혈소판이 존재하여, 피브리노겐으로부터 충분한 양의 피브린을 생성하기에 충분히 많은 트롬빈 폭발을 일으켜 지혈성 피브린 응괴를 형성한다. 피브리노겐은 혈장에 가용성인 이량체이고, 트롬빈에 의해 절단될 때 피브리노펩티드 A와 피브리노펩티드 B를 방출한다. 피브리노펩티드 B는 그 다음 트롬빈에 의해 절단되고, 이러한 제2 단백분해 절단에 의해 형성된 피브린 단량체는 자발적으로 불용성 겔을 형성한다. 중합된 피브린은 비공유 및 정전기력에 의해 함께 유지되고, 트롬빈에 의한 FXIII의 절단에 의해 생성된 아미드교환 효소 제XIIIa 인자(FXIIIa)에 의해 안정화된다. 또한, 트롬빈은 TAFI를 활성화시켜, 응괴 표면에서의 플라스민 생성을 저감시켜 피브린용해를 저해한다. 또한, 트롬빈은 그 자체가 응괴 구조 내로 혼입되어 더욱 안정화된다. 이러한 불용성 피브린 응집물(응괴)은 응집된 혈소판(혈전)과 함께 손상된 혈관을 차단하고 추가의 출혈을 방지한다.
3. 응고의 조절
응고 동안, 캐스캐이드는 응괴 형성을 더욱 저해하기 위해 구성적이며 자극된 과정에 의해 조절된다. 조절은 a)피브린 응괴 형성에 의해 조직의 허혈을 제한하고, b)조직 상해 부위에만 응괴 형성을 국재화시켜 광범위한 혈전증을 방지하는데 중요하다.
조절은 여러 저해 분자들의 작용에 의해 달성된다. 예를 들어, 항트롬빈 III(AT-III) 및 조직인자 경로 저해제(TFPI)는 구성적으로 작업하여 응고 캐스캐이드의 인자들을 저해한다. TPFI는 주로 FXa 및 FVIIa/TF 복합체를 저해한다. 반면, 세린 프로테아제 저해제(서핀)인 AT-III은, 주로 트롬빈, FIXa 및 FXa를 저해한다. AT-III에 의한 이들 응고 인자의 저해는, AT-III에 결합하여 저해 반응을 가속화 하는 활성화 형태학적 변화를 유도하는 헤파린에 의하여 크게 증강된다. 헤파린 또한 AT-III에 독립적인 방법으로 FIXa/FVIIIa 복합체의 활성을 저해할 수 있다(Yuan 등, (2005) Biochemistry 44:3615-3625). 혈소판 활성화를 통해 자극되는 추가의 인자인 단백질 C는 단백분해 절단 및 FVa와 FVIIIa의 불활성화를 통해 응고를 조절한다. 단백질 S는 단백질 C의 활성을 증강시킨다. 또한, 응고 저해에 기여하는 다른 인자는 트롬빈 수용체로서 작용하고 혈관 내피 세포에 의해 생성되는 필수 막단백질 트롬보모둘린(thrombomodulin)이다. 트롬보모둘린에 대한 트롬빈의 결합은 트롬빈 응혈촉진 활성을 저해하고, 또한 단백질 C 활성화에 기여한다.
또한, 피브린 응괴의 파괴인 피브린용해는 응고를 조절하는 기전을 제공한다. 응괴 중의 가교결합된 피브린 다량체는 세린 프로테아제인 플라스민에 의해 가용성 폴리펩티드로 부서진다. 플라스민은 이의 불활성 전구체 플라스미노겐으로부터 생성될 수 있고, 2가지 방식, 즉 피브린 응괴 표면에 있는 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA)와의 상호작용 및 세포 표면에 있는 우로키나제 활성인자(uPA)와의 상호작용에 의해 피브린 응괴 부위로 동원된다. 제1 기전은 혈관 내의 응괴의 용해를 담당하는 주요 기전인 것으로 나타난다. 제2 기전은 응괴 용해를 매개할 수는 있지만 조직 재형성, 세포 이동 및 염증에 주요 역할을 할 수 있다.
또한, 응괴 용해는 2가지 방식으로 조절된다. 첫째, 효과적인 플라스민 활성화 및 피브린용해는 응괴 표면에 또는 세포막 위에 형성된 복합체에서만 일어나는 반면, 혈액에 유리 상태인 단백질은 비효과적 촉매로서 빠르게 불활성화된다. 둘째, 플라스미노겐 활성인자 및 플라스민은 플라스미노겐 활성인자에 작용하는 플라스미노겐 활성인자 저해제 1형(PAI-1) 및 PAI-2와 같은 분자 및 플라스민을 불활성화시키는 α2-안티플라스민 및 α2-마크로글로불린과 같은 분자들에 의해 불활성화된다. 정상적인 상황에서, 응고와 피브린용해 간에 시기적절한 균형은 혈관상해 후 효과적인 응괴 형성 및 제거를 야기하고, 동시에 불필요한 혈전성 또는 출혈 에피소드를 예방한다.
C. 제 IX 인자(FIX) 구조 및 기능
개선된 활성 또는 기능을 가지는 변형 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. FIX는 응고 캐스캐이드에 관여하는 폴리펩티드이다. 응고 캐스캐이드에서 FIX의 역할은 이의 구조 및 활성화의 메커니즘과 관련이 있다. 본원에서 제공되는 변형 FIX 폴리펩티드에 의한 응고의 조절 또한 이의 구조 및 활성화 메커니즘과 연관된 것으로도 이해된다. 이러한 특징은 비변형 FIX 폴리펩티드와 동일할 수 있다. 다른 경우에 있어, 이러한 특징은 본원에서 제공된 FIX 폴리펩티드에서 변형될 수 있어, 변경되거나 개선된 활성 또는 성질을 가지는 폴리펩티드를 형성시킨다. 예를 들어, FIX 폴리펩티드의 변형은 FIX 폴리펩티드의 하나 이상의 활성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 야생형 FIX 폴리펩티드에 비해 증가된 글리코실화 수준을 나타내는 변형 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 따라서 생체 내 분석을 사용하여 시험될 때, 변형 FIX 폴리펩티드는 야생형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 약동학적 성질, 예컨대 감소된 제거율 및 증가된 혈청 반감기를 나타낼 수 있다. 또한 AT-III, 헤파린 및 AT-III/헤파린 복합체와 같은 저해제에 대한 증가된 내성; 및/또는 증가된 촉매 활성을 나타내는 변형 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 따라서, 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 치료적 성질을 나타내는 변형 FIX 폴리펩티드가 제공된다. FIX 폴리펩티드 및 변형 FIX 폴리펩티드의 구조적 및 기능적인 특징의 요약이 하기에 기재되어 있다.
제 IX 인자는 비타민 K-의존적 세린 프로테아제이며 지혈에 있어 중요한 응고인자이다. 이는 간에서 단일-가닥 자이모겐으로 합성되며 응고 캐스캐이드의 일부로서 활성화되기 전까지 이러한 불활성 상태로 혈액을 순환한다. FXIa 또는 TF/FVIIa 복합체에 의하여 FIX 자이모겐이 활성화 FIX(FIXa)로 활성화되면, FIXa는 보조인자인 FVIIIa와 결합한다. 형성된 FIXa/FVIIIa 복합체는 FX에 결합하여 FXa로 활성화시켜, 상기 기재된 응고 캐스캐이드를 계속하여 지혈작용을 확립한다. FIX의 혈중 농도는 대략 4-5 ㎍/mL이며, 반감기는 대략 18-24 시간이다.
크리스마스 병 또는 제 IX 인자 결핍증으로도 알려진 혈우병 B는, FIX 유전자 내 임의의 하나 이상의 다양한 변이로부터 초래되는 FIX의 기능저하 또는 FIX 부족으로 인하여 초래된다. 혈우병 B는 혈우병 A보다 덜 퍼져있지만, 재발성 관절 출혈(recurrent joint bleed)이 활액 분비 비대, 활막, 연골, 및 뼈의 파괴하여 만성적 통증을 초래하는 만성 활액막염, 관절 강직, 및 심한 진행성 관절 손상(progressive severe joint damage)으로 인한 활동의 제한으로 이어질 수 있다는 점에서 여전히 중요한 질환이다. 재발성 근육 출혈(recurrent muscle bleed) 또한 급성 통증, 부종, 및 움직임의 제한을 만들 수 있으며, 다른 곳의 출혈은 병적 상태 및 사망률에 기여할 수 있다. 치료는 일반적으로 재조합 FIX(rFIX) 대체 요법(replacement therapy)에 의한다. 활성화시 증가된 응고 활성을 가지도록 설계되고, 제 IX 인자 요법에 적합한 질환 또는 상태, 예컨대 혈우병 B에 대한 개선된 치료제로 사용될 수 있는 변형 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다.
1. FIX 구조
사람 FIX 유전자는 X 염색체에 위치하며 8개의 엑손이 있으며 대략 34 kb의 길이를 가진다. 인간 FIX 전사체는 2803개 뉴클레오티드이며 짧은 5' 비번역 영역, 1383개 뉴클레오티드의 오픈리딩 프레임(정지 코돈을 포함한다) 및 3' 비번역 영역을 함유한다. 1383개 뉴클레오티드 오픈리딩 프레임(또는 FIX mRNA; 서열번호 1)은 제 IX 인자 폴리펩티드가 세포 분비 경로를 향하게 하는 28 아미노산 N-말단 시그널 펩티드(서열번호 2의 아미노산 1-28)를 함유하는 461 아미노산 전구체 폴리펩티드(Swiss-Prot 기탁번호 P00740; 서열번호 2)를 암호화한다. 또한 소수성 시그널 펩티드, FIX 전구체 폴리펩티드는 또한, 절단되었을 때, FIXa로 활성화되기 전까지 혈액 중에 자이모겐으로서 순환하는, 415 아미노산 성숙 폴리펩티드(서열번호 3)를 방출하는 18 아미노산 프로펩티드(서열번호 2의 아미노산 29-46)를 함유한다. 시그널 펩티드 및 프로펩티드 외에도, FIX 전구체는 또한 이하의 분절 및 도메인을 함유한다: Gla 도메인(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 1-46에 상응하는, 서열번호 2의 아미노산 47-92), 상피 성장인자(EGF)-유사 도메인 1(EGF1; 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 47-83에 상응하는, 서열번호 2의 93-129), EGF2(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 84-125에 상응하는, 서열번호 2의 130-171), 경쇄(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 1-145에 상응하는, 서열번호 2의 47-191), 활성화 펩티드(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 146-180에 상응하는, 서열번호 2의 192-226), 중쇄(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 181-415에 상응하는, 서열번호 2의 227-461) 및 세린 프로테아제 도메인(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 181-413 에 상응하는, 서열번호 2의 227-459).
프로트롬빈, 제 VII 및 제 X 응고 인자, 및 단백질 C, S, 및 Z와 같은 다른 비타민 K-의존적 단백질과 마찬가지로, FIX의 Gla 도메인은 칼슘이온의 존재 하에서 세포의 인지질 막과 결합하는 막 결합 모티프(motif)이다. 비타민 K-의존적 단백질은 이러한 단백질의 Gla 도메인 내에 클러스터를 이루는 아미노산인 γ-카르복시글루탐산의 번역후 합성을 위하여 비타민 K를 요구한다. FIX Gla 도메인은 12개의 글루탐 잔기(glutamic residue)를 가지며, 이들 각각은 잠재적인 카르복실화 위치에 해당한다. 따라서, 이들의 다수는 카르복실화에 의해 변형되어 γ-카르복시글루탐산 잔기를 생산한다. FIX Gla 도메인 내에는, 높고 낮은 친화력 모두를 가지는 총 8개의 Ca2 + 결합 부위가 있으며, 칼슘이온이 자리하는 경우, Gla 도메인의 정상적인 접힘을 촉진하여 FIX 폴리펩티드의 소수성 잔기를 노출하여 지질 이중층 내에 삽입되어 막에 대한 결합이 달성된다.
Gla 도메인 외에, 상기 FIX 폴리펩티드는 또한 2개의 EGF-유사 도메인을 함유한다. 각각의 EGF-유사 도메인은 EGF 단백질에서 관찰되는 것과 동일한 패턴으로 각각의 도메인에서 3개의 이황화 결합을 형성하는 6개의 고도로 보존된 시스테인 잔기를 함유한다. 제1 EGF-유사 도메인(EGF1)은 칼슘-결합 EGF 도메인으로서, 높은 친화성의 Ca2 + 결합 부위를 함유하여(Rao 등, (1995) Cell 82:131-141), 칼슘 이온이 자리하는 경우, 분자가 정상적으로 접히도록 기여하고 생물학적 활성을 촉진시킨다. 제2 EGF 도메인(EGF2)은 칼슘 결합 부위를 함유하지 않는다.
FIX의 세린 프로테아제 도메인, 또는 촉매 도메인은 FIXa의 단백분해 활성을 담당하는 도메인이다. 다른 세린 프로테아제와 같이, FIX는 H221, D269 및 S365(키모트립신 번호매김으로 H57, D102 및 S195에 상응함)로 구성된 세린 프로테아제 촉매 3인조(catalytic triad)를 함유한다.
성숙 FIX의 FIXa로의 활성화는, 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 단백질의 아미노산 146-180에 상응하는 활성화 펩티드를 방출하는, R145-A146 결합 및 R180-V181 결합(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드와 관련된 번호매김)의 단백분해 절단에 의하여 달성된다. 따라서, 활성화 후, FIXa는 두 개의 사슬; 경쇄 및 중쇄로 구성된다. 경쇄는 Gla 도메인, EGF1 및 EGF2 도메인을 함유하며, 중쇄는 프로테아제 도메인을 함유한다. 두 개의 사슬은 C132 및 C289 사이의 단일 이황화 결합에 의하여 서로 결합되어 있다.
2. FIX 번역후 변형
제 IX 인자 전구체 폴리펩티드는 광범위한 번역후 변형을 거쳐 혈액으로 분비되는 성숙 자이모겐이 된다. 이러한 번역후 변형은 γ-카르복실화, β-히드록실화, 시그널 펩티드 및 프로펩티드의 절단, O- 및 N-결합 글리코실화, 황화 및 인산화를 포함한다. N-말단 시그널 펩티드는, 폴리펩티드를 소포체(ER)로 향하게 한 후 절단된다. 세포로부터의 분비 직전에, 프로펩티드는 프로세싱 프로테아제, 예컨대, 절단 위치 전에 네개의 아미노산 내의 적어도 두개의 아르기닌 잔기를 인식하는 PACE/퓨린 등에 의하여 절단된다.
단일 효소인, 비타민 K-의존성 감마-카르복실라아제는, ER에서의 FIX의 γ-카르복실화를 촉매한다(Berkner (2000) J. Nutr. 130:1877-80). 카르복실화 반응에서, γ-카르복실라아제는 FIX 프로펩티드에 결합하며 폴리펩티드의 Gla 도메인의 글루탐산 잔기(즉, Glu에서 γ-카르복시글루타밀 또는 Gla로)의 γ-탄소의 두번째 카르복실화를 촉매한다. 모든 글루탐산 잔기가 γ-카르복실화된 것이라면, FIX는 12개의 Gla 잔기를 함유하며, 처음의 10개는 다른 비타민 K-의존성 단백질의 상동 위치에 있다. FIX의 Gla 도메인은 이후 단계적으로 클러스터 내의 모든 글루타메이트를 카르복실화 한 후 기질을 방출한다(Morris 등. 1995; Berkner 2000; Stenina 등. 2001).
FIX는 또한 부분적으로 β-히드록실화되어 있다. 이러한 변형은, EGF1의 D64(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에 상응함)의 β-탄소를 히드록실화하는 디옥시제나아제에 의하여 수행된다. 인간 FIX 폴리펩티드의 대략 1/3이 β-히드록실화 된 것이다. 비록 D64가 FIX의 EGF1 도메인의 Ca2+ 결합 부위에 높은 친화성에 기여하나, 이 잔기의 히드록실화는 Ca2 + 결합이나, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 듯하다(Derian 등, (1989) J. Biol. Chem. 264:6615-6618, Sunnerhagen 등, (1993) J. Biol. Chem. 268: 23339-23344). 추가적인 번역후 변형은 155 위치 티로신의 술폰화, 및 158 위치의 세린 잔기의 인산화를 포함한다. 이러한 제 IX 인자의 번역후 변형은 FIX의 생체 내 회수율(recovery)에 기여하는 것으로 시사되었다(Kaufman (1998) Thromb. Haemost. 79:1068-1079, 미국 등록특허번호 7,575,897).
FIX는 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드의 N157 및 N167에 상응하는 활성화 펩티드의 아스파라긴 잔기에 N-결합 글리코실화되어 있다. 번역후 변형은 또한, 위치 61의 세린 잔기가 O-결합 사당류(tetrasaccharide)를 함유하는데 반하여, 위치 53(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에 상응함)의 세린 잔기가 O-결합 이당류 및 삼당류를 갖도록 한다. (Nishimura 등, (1989) J Biol. Chem. 264:20320-20325, Harris 등, (1993) Biochemistry 32:6539-6547). 게다가, 아미노산 위치 159 및 169(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에 상응함)의 트레오닌 잔기는 O-글리코실화 된다(Agarwala 등, (1994) Biochemistry 33:5167-5171). 아미노산 위치 172 및 179의 트레오닌 잔기 또한 O-글리코실화 될 수 있다.
3. FIX 활성화
제 IX 인자는 단백분해 절단에 의하여 활성화되기까지는 주로 최소한의 단백분해 활성을 가지는 자이모겐으로 순환한다. 활성화는 TF/FVIIa 복합체 또는 제 XIa 인자에 의하여 달성될 수 있다. TF/FVIIa에 의한 활성화는 내인성 경로를 통하는 반면, FXIa에 의한 활성화는 상기 기재된, 외인성 경로를 통한다. 활성화 과정은 처음의 Arg145-Ala146 결합의 절단에 뒤이어, Arg180-Val181 결합이 절단되는 순차적인 것으로 나타난다(Schmidt 등 (2003) Trends Cardio. Med. 13:39-45). 단백분해 절단에 의해, 아미노산 위치 132 및 289(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에 상응하는 번호매김)의 두 개의 시스테인 사이의 이황화 결합으로 서로 결합한 경쇄(서열번호 3의 아미노산 위치 1-145에 상응함) 및 중쇄(서열번호 3의 아미노산 위치 181-415에 상응함)를 함유하는 이중-가닥 FIXa 분자를 형성하는, 활성화 펩티드가 방출된다.
FX의 적어도 두 개의 엑소사이트(exosite)는 TF/FVIIa 복합체의 TF 결합에 의한 FIX/TF/FVIIa 삼중 복합체 형성에 관여하는 것으로 나타난다(Chen 등, (2002) Thromb. Haemost. 88:74-82). 연구는 FIX의 EGF1 도메인이 TF/FVIIa 복합체에 의한 FIX 활성화에 필요하다는 점을 시사한다. 예를 들어, FIX의 EGF1 도메인의 G48(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에 관함) 변이는 TF/FVIIa에 의한 이의 활성화를 감소시킨다(Wu 등, (2000) Thromb. Haemost. 84:626-634). 나아가, FIX의 EGF1 도메인은 TF/FVIIa 복합체의 TF와의 상호작용을 보여왔다(Zhong 등, (2002) J. Biol. Chem 277:3622). 그러나, 반면에 EGF1 도메인은 FXIa에 의한 FIX 활성화에 필요한 것으로 나타나지 않는다. Gla 도메인은 또한 TF/FVIIa 복합체에 결합, 및 그에 따르는 활성화에 관여한다. FIX의 Gla 도메인은, FX와 같이 TF의 동일한 영역에 상호 작용하며, 이 또한 TF/FVIIa 복합체에 의하여 활성화된다(Kirchhofer 등, (2000) Biochem. 39:7380-7387).
활성화 펩티드의 절단 및 방출에 뒤이어, V181(서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에 상응함; 키모트립신 번호매김에 의하여 V16)에 새로운 아미노 말단이 생산된다. 활성화 펩티드의 방출은 V181의 아미노기가 활성 부위에 삽입되어 D364의 측쇄 카르복실레이트와 염다리를 형성하는 입체형태의 변화를 촉진한다. 상기 변화는 S365의 히드록실 측쇄를 이의 기질 FX의 절단 위치를 가수분해할 수 있는 반응성 종(reactive species)으로 전환하는 것으로서, 자이모겐 상태가 활성 상태로 전환되기 위해서 이러한 변화가 필요하다. 활성화된 FIXa 폴리펩티드는, 최대한의 촉매 활성을 가지는 FIXa 폴리펩티드를 생산하기 위하여 FVIIIa와의 결합에 의하여 추가적인 형태학적 변화가 유도되기 전까지는, 자이모겐 유사 형태로 남아있다.
4. FIX 기능
FIX는 응고 경로에서 중요한 역할을 수행하며 FIX 활성의 결핍 또는 부재는 혈우병 B를 초래한다. 일단 FIX가 FIXa로 활성화되면, FIXa는 차례로 응고에 필요한 대량의 FX를 FXa로 활성화시키도록 기능한다. 그러기 위해, FIXa는 반드시 이의 보조인자인 제 VIIIa 인자에 결합하여, 내인성 테나아제(tenase) 복합체로도 불리는, FIXa/FVIIIa 복합체를 활성화된 혈소판의 인지질 표면에 형성해야 한다. FIX의 Gla 도메인 및 EGF2 도메인은 모두 인지질에 대한 안정적인 결합에 중요하다. FIXa/FVIIIa 복합체는 이후 FX에 결합하여 응고 인자를 절단하여 FIXa를 형성한다.
FIXa는 이의 보조인자 FVIIIa 및 생리적 기질 FX가 부재하는 경우 사실상 불활성이다. 실험적 연구는 이것이 주로 99-루프에 기인할 수 있다고 나타낸다. FIXa가 보조인자에 결합하지 않은 경우, Y177은 99-루프를 불활성 입체형태로 잠그며, 여기서 Y99 및 K98(키모트립신 번호매김으로, 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드의 Y266 및 K265 에 상응함)의 측쇄가 기질 결합을 방해한다. FVIIIa의 FIXa로의 결합은 이를 열고 이 자이모겐 유사 입체형태를 방출하여, 이어서 FX는 FIXa/FVIIIa 복합체와 결합하여 열린 99-루프를 재배열하고, 그후 활성 부위 틈(cleft)에 결합하는 것이 가능해진다(Sichler 등, (2003) J. Biol. Chem. 278:4121-4126). 인지질로의 FIXa의 결합 및 Ca2+의 존재는 반응을 더 증강시킨다.
FIXa/FVIIIa 상호작용에 있어 여러 모델이 제안된바 있다(예를 들어, Autin 등, (2005) J. Thromb . Haemost . 3:2044-2056, Stoilova-McPhie 등, (2002) Blood 99: 1215-1223, Bajaj 등, (2001) J. Biol . Chem. 276:16302-16309, Schmidt 등, (2003) Trends Cardiovasc . Med . 13:39-45 참조). FIXa는 FVIIIa에 FIXa 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인이 관여하는 상호작용으로 결합한다. FVIIIa는 세 개의 비공유 결합 사슬: A1, A2 및 A3-C1-C2로 구성되는 이형이량체이다. A3-C1-C2는 또한 경쇄로 언급된다. FIXa의 프로테아제 도메인은 FVIIIa의 A2 서브유닛과 상호 작용하는 것으로 나타난다. 연구는 FIXa의 293-나선(helix)(키모트립신 번호매김으로 126-나선), 330-나선(키모트립신 번호매김으로 162-나선) 및 N346 (키모트립신 번호매김으로 (N178))이 FVIIIa의 A2 서브유닛과의 상호작용에 관여하는 것을 시사한다. FIXa의 EGF1/EGF2 도메인은 FVIIIa의 A3 서브유닛과 상호 작용한다. 나아가, FIXa의 Gla 도메인이 FVIIIa의 C2 도메인과 상호작용하는 것이 가정된다. 칼슘 이온 및 인지질 또한 FIXa 및 FVIIIa의 결합에 기여한다. 예를 들어, 인지질의 존재는 FIXa의 FVIIIa와의 결합을 대략 2000배 증가시킨다(Mathur 등, (1997) J. Biol . Chem. 272:). FIXa/FVIIIa 복합체에 의한 FX의 결합에 뒤이어, FIXa의 프로테아제 도메인(또는 촉매 도메인)은 FXa를 형성하기 위한 FX의 R194-I195 절단을 담당한다.
FIXa의 활성은 상기 언급된 바와 같이, 저해 분자, 예컨대 AT-III/헤파린 복합체 및 다른 제거 메커니즘, 예컨대 저밀도 지단백 수용체-관련 단백질(LRP)에 의하여 조절된다. LRP는 간, 뇌, 태반 및 폐를 포함하는 다양한 조직에서 발현되는 막 당단백질이다. LRP는 광범위한 단백질과 결합하며 FIXa 이외에도, 아포리포단백질, 리파아제, 프로테이나아제, 프로테이나아제-저해 복합체 및 매트릭스 단백질을 포함하나, 이에 국한되지 않는 광범위한 단백질 및 복합체와 결합한다. FIX의 자이모겐 또는 불활성 형태는 LRP에 결합하지 않는다. 그보다는, 활성화에 의해, LRP-결합 부위가 노출된다(Neels 등, (2000) Blood 96:3459-3465). 이 결합 부위는 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드의 잔기 342 내지 346에 걸친 프로테아제 도메인의 루프 내에 위치한다(Rohlena 등, (2003) J. Biol. Chem. 278:9394-9401).
5. 생물약제로써 FIX
제 IX 인자는 혈액 응고 과정에 필수적으로 관여하며, 이의 활성화된 형태(FIXa)로, 이는 FVIIIa와 테나아제(tenase) 복합체를 형성하며 FX를 FXa로 활성화한다. 인지질, 칼슘 및 FVa와 접합한 FXa는, 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하여 차례로 피브리노겐을 피브린 단량체로 절단하여 단단한 메쉬 응괴의 형성을 촉진한다. 다수의 연구는 외인성 FIX가 혈우병 환자에 있어 혈액 응고를 촉진하는 능력을 입증했다. 예를 들어 FIX가 부족한 혈우병 B 환자들은, 외인성 FIX를 이용한 대체 요법에 의하여 치료될 수 있다. 초기의 대체 요법은 MonoNine® 제 IX 인자 및 Alpha-nine-SD® 제 IX 인자로 판매되는 치료제와 같은 혈장 정제 FIX를 이용하였다. 혈장 정제 FIX 복합체 치료제는, FX 및 낮은 수준의 FVII와 정제된 농축 FIX인 Bebulin® VH; FII, FX 및 낮은 양의 FVII와 정제된 농축 FIX인 Konyne® 80(Bayer); FIX와 함께 FII, FVII, 및 FX를 함유하는 수집된 정상 사람 혈장(pooled normal human plasma)으로부터 가열 처리된 제품인 PROPLEX® T(Baxter International); 및 Profilnine SD®(Alpha Therapeutic Corporation)를 포함하여 이미 사용된 바가 있다. 보다 최근에는, 그러나, 인간 재조합 제 IX 인자(BeneFIX® 제 IX 응고 인자 (재조합), Wyeth)가 혈우병 B 환자의 수술 세팅(surgical setting)에서의 출혈을 방지하고 제어하는 것을 포함하는, 출혈 사건을 방지하고 제어할 용도로 허가되었다. BeneFIX® 제 IX 응고 인자(재조합)는 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 가지며 혈장-유래된 제 IX 인자의 Ala148 대립형질 형태와 동일하다. 따라서, 서열번호 3에 제시된 야생형 FIX 폴리펩티드에 비해, BeneFIX® 제 IX 응고 인자(재조합)는 T148A 돌연변이를 함유한다.
응혈원으로의 용도에 추가하여, FIX의 불활성 형태, 또는 촉매 활성이 감소된 형태는 항응혈제로, 예컨대 혈전증 질환 및 상태의 치료에 사용될 수 있다.
일반적으로, FIX는 정맥 주사로 투여되나, 또한 경구, 전신, 구강, 경피, 근육내 및 피하로 투여될 수 있다. FIX는 단일 또는 복수회로 투여될 수 있다. 일반적으로, 복수 투여는 FIX로 응고를 달성하기 위한 치료 요법에서 사용된다.
하기에서 논의되는 바와 같이, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 또한 비변형 또는 야생형 또는 다른 치료학적으로 활성 FIX 폴리펩티드가 사용되는 것으로 공지된 임의의 치료 또는 약학적 방법에 사용될 수 있다. 이러한 용도, 방법 및 과정에, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 야생형 또는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 성질을 나타낸다.
D. 변형된 FIX 폴리펩티드
변형 제 IX 인자 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. FIX 폴리펩티드는 야생형 또는 비변형 FIX 폴리펩티드의 1차 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환(대체)에 의하여 변형될 수 있다. 결과적인 변형 폴리펩티드는 비변형 또는 야생형 FIX 폴리펩티드에 비해 개선된 성질 또는 활성을 나타낸다. 예를 들어, 변형 FIXa 폴리펩티드 및 변형 제 IX 인자 및 제IXa인자 폴리펩티드의 절편을 포함하는 변형 제 IX 인자 폴리펩티드는, 변경된 번역후 변형, 예컨대 하이퍼글리코실화를 포함하는 변경된 글리코실화, 및/또는 감소된 포스포릴화 또는 설페이트화와 같은 변경된 포스포릴화 또는 설페이트화; AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 증가된 내성; LRP에 대한 감소된 결합; 증가된 촉매 활성; 제거율의 감소 및 생체 내 혈청 반감기의 증가를 포함하는, 개선된 약동학적 성질; 증가된 응혈 활성; 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 일반적으로, 변형 FIX 폴리펩티드는 응혈촉진 활성을 나타낸다. 따라서, 이들의 단일-가닥 자이모겐 형태로부터 보조인자 FVIIIa 와 결합하여 뒤이은 활성화에 따른 증가된 응혈 활성을 나타내는 변형 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이러한 변형 FIX 폴리펩티드는 불충분한 응고로 특징지어지는 질환 또는 상태, 예컨대 혈우병 B 등이 있는 환자에 투여될 수 있다.
일부 예에서, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는, 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 AT-III, 헤파린 및 AT-III/헤파린 복합체를 포함하는 저해제에 대하여 증가된 내성을 나타낸다. 이러한 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 증가된 응혈 활성을 나타낼 수 있다. 추가적인 실시예에서, 본원에서 제공된 변형 제 IX 인자 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 대하여 변경된 번역후 변형, 예컨대 변경된 글리코실화 수준 및/또는 변경된 글리코실화의 종류를 나타낸다.
일부 예에서, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 증가된 글리코실화를 나타낸다. 따라서, 하이퍼글리코실화된 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 변형 FIX 폴리펩티드는 탄수화물 잔기에 결합된 적어도 하나의 비천연 글리코실화 위치(즉, 비변형 또는 야생형 FIX 폴리펩티드에서 발견되지 않는 글리코실화 위치)의 혼입으로 인해 증가된 글리코실화를 나타낼 수 있다. 이러한 변형 FIX 폴리펩티드는 감소된 제거율 및 증가된 혈청 반감기를 포함하는, 생체 내 개선된 약동학적 성질을 나타낼 수 있다. 비천연 글리코실화 위치의 도입 및 이어지는 탄수화물 잔기는 하나 이상의 다른 단백질과 FIX 폴리펩티드의 상호 작용을 입체적으로 방해하여 변형 FIX 폴리펩티드의 활성을 보다 개선할 수 있다. 예를 들어, 글리코실화 위치는, 탄수화물 잔기가 이 위치에 부착되어 AT-III/헤파린 복합체와 변형 FIX 폴리펩티드의 상호 작용을 입체적으로 방해하도록 도입되어, AT-III/헤파린에 대한 내성이 증가된 폴리펩티드가 되게 할 수 있다. 이는 순환계로부터 폴리펩티드의 제거율을 보다 감소시킬 수 있다. 따라서, 만일 탄수화물 잔기가 또한 다른 단백질(들), 예컨대 AT-III/헤파린 복합체와의 상호 작용을 입체적으로 방해한다면, 새로운 글리코실화 위치 도입의 효과는 몇 배가 될 수 있다.
예를 들어, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 대하여 하나 이상의 비천연 글리코실화 위치를 도입하는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 비천연 글리코실화 위치가 도입될 수 있다. 도입될 수 있는 글리코실화 위치는 N-글리코실화 위치, O- 글리코실화 위치, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 따라서, 글리코실화를 촉진하는 세포에서 생산된 경우, 또는 시험관내 글리코실화에 뒤이어, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는, 천연 글리코실화 위치(예를 들어, 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드의 S53, S61, N157, N167, T159, T169, T172 및 T179에 상응하는 천연 글리코실화 위치)에 결합한 탄수화물 잔기뿐 아니라, 각각이 서로 다른 비천연 글리코실화 위치에 결합한 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 탄수화물 잔기를 함유할 수 있다. 특별한 예시에서, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 N-글리코실화 위치를 함유한다. 따라서, 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 증가된 N-글리코실화 수준을 나타낼 수 있다.
증가된 글리코실화를 갖는 변형 FIX 폴리펩티드는 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해, 예를 들어, 증가된 용해도, 증가된 AT-III/헤파린 내성, 증가된 혈청 반감기, 감소된 면역원성 및/또는 증가된 응혈제 활성을 또한 나타낼 수 있다. 이러한 변형 FIX 폴리펩티드는 출혈 장애 또는 사건, 예컨대 혈우병 또는 상해의 치료에 사용될 수 있으며, 여기서 FIX 폴리펩티드는 혈액 응고를 촉진하는 기능을 할 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 제공된 증가된 글리코실화를 나타내는 변형 FIX 폴리펩티드는, 또한 단백질을 불활성화, 또는 대부분 불활성화시키는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는, 그러므로, 증가된 항응혈 활성을 나타낼 수 있으며 혈전증 상황, 상태 또는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 그러나 일반적으로, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 응혈원이다.
본 명세서에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 또한 다른 활성 및/또는 성질을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변형 FIX 폴리펩티드의 일부는 촉매 활성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 함유한다. 다른 예에서, 변형 FIX 폴리펩티드는 포스포릴화, 설페이트화, 히드록실화 및/또는 글리코실화를 감소시키는 하나 이상의 변형을 함유한다. 추가적인 예에서, 변형 FIX 폴리펩티드는 FIX 및 LRP 사이의 상호 작용을 방해하는 변형을 함유한다. LRP에 대한 FIX의 결합을 방해하여, 순환계로부터의 FIX 제거율을 감소시킬 수 있다. 따라서, LRP에 대한 FIX의 결합을 감소시키는 변형은 생체 내 FIX의 약동학적 성질을 개선할 수 있다.
서열번호 2에 제시된 서열을 갖는 전구체 FIX 폴리펩티드, 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드, 또는 서열번호 2 또는 3에 제시된 FIX 폴리펩티드와 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 가지는 FIX 폴리펩티드를 포함하는 임의의 FIX 폴리펩티드(예를 들어, 비변형 또는 야생형 FIX 폴리펩티드)에서, 본원에서 기재된 아미노산 치환과 같은 변형, 예컨대 하나 이상의 비천연 글리코실화 위치를 도입하는 변형, 또는 저해제에 대한 내성을 증가시키는 변형들이 만들어질 수 있다. 본원에서 언급되는 아미노산 잔기는 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드의 번호매김에 관한 것이다. 임의의 형태, 예컨대 전구체, 성숙 또는 다른 활성 형태의 다른 FIX 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 잔기를, 서열번호 3을 갖는 다른 FIX 서열의 정렬(alignment)에 의하여 확인하는 것은, 당업자의 수준 이내이다(예를 들어, 도3 참조). 본원에서 제공된 임의의 아미노산 치환은 치환 아미노산 잔기와 다르거나 동일하지 않은 상응하는 아미노산 잔기에서 이루어질 수 있다. 본원에서 제공된 바와 같이 임의의 결과적인 변형 FIX 폴리펩티드의 활성 또는 성질을 시험하는 것은 당업자의 수준 내에 해당한다.
예를 들어, 변형, 예컨대 아미노산 치환은 임의의 종간, 대립유전자 또는 변형 변이체에서, 예컨대 당업계에 기재된 것들과 같이 이루어질 수 있다. FIX의 대립유전자 변이체는 T148A 및 T412P를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 제공된 임의의 아미노산 치환은 T148A 및 T412P 돌연변이를 함유하는 제 IX 인자일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환과 같은 변형은, 서열번호 325 또는 서열번호 20에 제시된 FIX 폴리펩티드에서 이루어질 수 있다. 예시적인 본원의 변형을 위한 종간 변이체는 각각 서열번호 4-18에 제시된 서열을 가지는, 침팬지, 리서스 마카크, 마우스, 래트, 기니피그, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 닭, 소, 양, 개구리, 제브라피쉬 및 일본 복어로부터의 FIX 폴리펩티드를 포함하는, 인간 및 비인간 폴리펩티드를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. FIX 폴리펩티드의 변형은, 폴리펩티드의 1차 서열의 변형 및 1차 서열에서가 아닌 변형을 포함하는, 당업계에서 기술된 것들과 같은, 다른 변형을 또한 함유하는 FIX 폴리펩티드에 이루어질 수 있다(예를 들어, 본 명세서에서 기재된 아미노 변형이 이루어질 수 있는 예시적인 변형 FIX 폴리펩티드를 기재하는 섹션 D. 6참조).
다른 예에서, 아미노산 치환과 같은 변형은, FIX 폴리펩티드의 임의의 활성 절편, 예컨대 서열번호 2 또는 서열번호 3의 활성 절편, 또는 당업계에 기술된 바와 같이 종간, 대립유전자 또는 변형 변이체의 활성 절편에 이루어질 수 있다. 활성 절편은 본 명세서에 기술된 아미노산 치환과 같은, 아미노산 변형을 함유하는 폴리펩티드의 촉매적 활성 도메인 또는 이들의 촉매적 활성 부분을 함유하는 인접한 아미노산 서열을 함유한다. 활성 단편은 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 3에 제시된 FIX 폴리펩티드의 성숙 형태의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 활성을 나타낸다.
FIX 폴리펩티드의 변형은 또한 서로 다른 FIX 폴리펩티드의 잡종인 폴리펩티드의 변형 및 공지된 폴리펩티드의 서열에 기초하여 당업계에 공지된 다른 방법에 의하여 재조합적으로 제조 또는 합성 또는 구축된 합성 FIX 폴리펩티드인 폴리펩티드의 변형을 또한 포함한다. 예를 들어, 제 FVII인자(FVII) 및 제 X 인자(FX)를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 다른 응고 인자 패밀리 멤버와의 FIX의 정렬에 기초하여 패밀리 멤버 중의 상동 도메인이 쉽게 확인된다. 상응하는 패밀리 멤버의 아미노산 서열을 사용하여 FIX 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 또는 도메인 전체가 치환된, FIX 폴리펩티드의 키메라 변이체가 구축될 수 있다. 추가적으로, 키메라 FIX 폴리펩티드는 서로 다른 종의 아미노산 서열을 사용하여 인간 FIX 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 또는 도메인 전체가 치환된 것을 포함한다. 이러한 키메라 단백질은 본 명세서의 출발, 비변형 FIX 폴리펩티드로 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 출발, 비변형 참조 폴리펩티드 변형은 아미노산 치환 또는 대체, 아미노산의 첨가 또는 결실, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 변형 FIX 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상의 변형된 위치를 갖는 것들을 포함한다. 일부 예에서, FIX의 하나의 활성 또는 성질을 변경하기 위하여 이루어진 변형은 또한, 또는 대신에, 하나 이상의 다른 활성 또는 성질에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 저해제에 대한 내성의 증가를 위해 만든 변형은 또한, 또는 대신에, 촉매 활성을 증가시킬 수 있다. 다른 예에서, 새로운 글리코실화 위치를 도입하기 위하여 만든 변형은 또한 저해제에 대한 증가된 내성 및/또는 증가된 촉매 활성을 초래할 수 있다. 추가적인 예에서, LRP에 대한 결합을 감소시키기 위하여 만든 변형은 또한, 또는 대신에, AT-III/헤파린과 같은 저해제에 대한 내성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 비록 본 명세서에서 기재된 변형이 일반적으로 FIX 활성 또는 성질에 이들이 의도한 영향과 관련하여 기재되어 있으나, 본 명세서에서 기재된 임의의 변형은, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 변형과 함께, 다른, 예측되지 않은, 활성 또는 성질의 변화를 초래할 수 있다고 이해된다.
본원에서 제공된 임의의 변형은 임의의 다른 당업자에게 공지된 변형과 결합될 수 있다. 일반적으로, 결과적인 변형 FIX 폴리펩티드는 이것이 이중-가닥 형태인 경우 증가된 응고 활성을 나타낸다. 변형의 결과로서 변경될 수 있는 활성 또는 성질은 응고 또는 응혈 활성; 응혈촉진 활성; 단백분해 또는 촉매 활성 예컨대 제 X 인자(FX) 활성화 효과; 항원성(항 FIX 항체에 결합하는 폴리펩티드와 결합 또는 경쟁하는 능력); FVIIIa, 항트롬빈 III, 헤파린 및/또는 제 X 인자에 결합하는 능력; 인지질에 결합하는 능력; 삼차원적 구조; pI; 및/또는 입체구조를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드들 중에 포함되는 것은 항트롬빈 III(AT-III)에 증가된 내성, 헤파린에 증가된 내성, 변경된 글리코실화, 예컨대 증가된 글리코실화, 증가된 촉매 활성, 및 개선된 약동학적 성질, 예컨대 i) 감소된 제거율, ii) 변경된 분포 용적, iii) 증강된 생체 내 회수율, iv) 증강된 생체 내 총 단백 노출(즉, AUC), v) 증가된 혈청 반감기(α-, β-, 및/또는 γ-상), 및/또는 vi) 증가된 평균 공명 시간(MRT)을 갖는 것들이다.
일부 예에서, 변형은 FIX 폴리펩티드의 둘 이상의 성질 또는 활성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 변형은 비변형 FIX 폴리펩티드에 대하여 변형 FIX 폴리펩티드의 증가된 AT-III 내성 및 증가된 촉매 활성을 야기할 수 있다. 다른 예에서, 비천연 N-글리코실화 위치를 도입함에 따라서, 적절한 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 발현되는 경우 폴리펩티드의 글리코실화 수준을 증가시킬 수 있는 변형 또한, 변형 FIX 폴리펩티드의 비변형 FIX 폴리펩티드에 비해 증가된 촉매 활성을 야기할 수 있다. 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드 각각의 성질 및 활성에 대하여 분석하여 변형의 효과의 범주를 확인할 수 있다. 이러한 분석법은 당업계에 공지되어 있으며 하기에 기재된다. 일반적으로, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드의 성질 및/또는 활성의 변화는, FVIIIa에 대한 결합 및/또는 FX의 활성화 및 결합을 포함하나, 이에 국한되지 않는, 다른 FIX 활성 또는 성질을 보유하면서 만들어진다. 따라서, 본원에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드는 야생형 또는 출발형(starting form)의 FIX 폴리펩티드와 비교하여 FVIIIa 결합 및/또는 FX 결합 및 활성화를 보유한다. 일반적으로, 이러한 활성은 야생형 또는 출발 단백질과 비교하여 실질적으로 불변한다(1%, 5% 또는 10% 미만으로 변함). 다른 예에서, 변형 FIX 폴리펩티드의 활성은 야생형 또는 출발 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가 또는 감소한다. 활성은 시험관내 또는 생체 내로 평가될 수 있으며, 예를 들어 성숙, 야생형 천연 FIX 폴리펩티드(서열번호 3), 야생형 전구체 FIX 폴리펩티드(서열번호 2), 또는 당업계에 공지된 출발 물질로 사용되는 임의의 다른 FIX 폴리펩티드와 같은, 비변형 FIX 폴리펩티드와 비교될 수 있다.
본원에서 제공된 변형은 당업자에게 일반적인 것과 같은 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 만들어질 수 있다. 임의의 업계에 공지된 목표 단백질 내의 임의의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이에 영향을 주는 방법이 적용될 수 있다. 방법은 암호화하는 핵산 분자의 표준 위치-지정 돌연변이 생성법(site-directed mutagenesis), 또는 고체상 폴리펩티드 합성 방법을 포함한다.
폴리펩티드의 1차 서열 상의, 또는 1차 서열에서가 아닌 다른 변형들도 또한 탄수화물 잔기의 첨가, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 잔기의 첨가, Fc 도메인의 첨가, 혈청 알부민 및/또는 다른 단백질의 첨가를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 변형 FIX 폴리펩티드, 또는 이들의 콘쥬게이트(conjugate)에 포함될 수 있다. 예를 들어, 이러한 추가적인 변형은 안정성 또는 단백질의 반감기를 증가시키기 위하여 만들어질 수 있다.
결과적인 변형 FIX 폴리펩티드는 단일-가닥 자이모겐 폴리펩티드인 것들과 이중-가닥 자이모겐유사 폴리펩티드인 것들(즉, 보조인자 FVIIIa에 결합하지 않은 FIXa 폴리펩티드)을 포함한다. 본원에서 제공된 단일-가닥 폴리펩티드인 임의의 변형 FIX 폴리펩티드는 변형 FIXa(즉, 이중-가닥 형태)를 생산하도록 활성화될 수 있다. 변형 FIX 폴리펩티드의 활성은 일반적으로 이의 이중-가닥 형태에서 나타난다.
1. 아미노산 치환의 예시
서열번호 3의 번호매김에 대한 잔기의 번호매김으로 본 명세서의 하기에서 기재되는 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 이와 동일한 아미노산 치환이 다른 FIX 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 잔기에서 이루어질 수 있다(예를 들어, 상응하는 아미노산 잔기의 확인의 예증에 대한 도 3 참조). 아미노산 치환은 변경된 글리코실화(예를 들어, 비천연 글리코실화 위치의 삽입 또는 천연 글리코실화 위치의 제거), 증가된 AT-III 및/또는 헤파린에 대한 내성, 증가된 촉매 활성, 감소된 LRP 결합을 부여하거나/하고 번역후 변형을 변경한다. 결과적인 변형 FIX 폴리펩티드는 예를 들어, 개선된 약역학적 또는 약동학적 활성으로 인하여, 개선된 치료 효능을 나타낸다.
특히, 본원의 하기에서 제공된 변형 FIX 폴리펩티드의 아미노산 치환의 비제한적인 예시들은 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드에 관한 번호매김으로 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기 155, 318, 338, 343, 403 및/또는 410(각각 키모트립신 번호매김으로 아미노산 잔기 [155], 150, 170, 175, 233 및/또는 240에 상응함)에 있다. 다른 FIX 폴리펩티드의 155, 318, 338, 343, 403 및/또는 410 중 임의의 것에 상응하는 잔기는 서열번호 3과 서열 정렬에 의하여 결정될 수 있다(예를 들어, 도3 참조). 본원에서 제공된 서열번호 3과 관련한 번호매김으로 155, 318, 338, 343, 403 및/또는 410 중 임의의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 본원의 다른 부분에서 기재된 바와 같이 다른 FIX 폴리펩티드에서 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 이는 또한 본원에서 제공되는 임의의 다른 아미노산 치환에 상응하는 잔기가 본원에서 예증된 바와 같이 다른 FIX 폴리펩티드에서 또한 확인될 수 있는 것으로 이해된다(예를 들어, 도3).
특히, 본원에서는 아미노산 잔기 Y155에서 티로신의 치환(Y155F), Y155L, Y155H, R318A, R318Y, R318E, R318F, R318W, R318D, R318I, R318K, R318L, R318M, R318N, R318S, R318V, R318Y, R338A, R338E, T343R, T343E, T343D, T343F, T343I, T343K, T343L, T343M, T343Q, T343S, T343V, T343W, T343Y, R403A, R403E, E410Q, E410S, E410N, E410A, E410D, 또는 보존적 아미노산 치환(예를 들어, 표 2B 참조)이 본원에서 제공된다. 일부 예에서, 아미노산 치환은 Y155F, R318Y, R318E, R338E, T343R, R403E 및/또는 E410N 또는 이들의 보존적 아미노산 치환이다.
예를 들어, 본 명세서의 자료로 보여지는 바와 같이, 서열번호 3에 관하여 R318 위치(키모트립신 번호매김으로 150)의 아미노산 치환은 AT-III/헤파린 복합체에 의한 저해에 대한 내성을 부여한다. R338 위치(키모트립신 번호매김으로 R170)의 아미노산 치환은 또한 AT-III/헤파린 복합체에 의한 저해에 대한 내성을 부여한다. 이러한 관점에서, 아미노산 위치 R338은 시험관 내 응고 분석에서 5-10 배의 강화된 응고 활성을 나타내는 것으로 보고된 자연 돌연변이(R170L)의 위치이다(국제특허공개번호 WO 2010029178). 기재된 바와 같은 분석법은 정제된 단백질 대신 조건화 배지에서 수행되었으며 단백질 농도는 ELISA 분석을 사용하여 측정되었다. 그 결과, 이 자료들은 야생형 비교 표본(wildtype comparator preparation)에 비하여 R338L(R170L) 제제에서 활성 물질의 더 높은 비율 또는 응고 분석에서 활성이 있는 오염 물질의 더 높은 수준을 나타낼 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서에서 나타나는 바와 같이, 위치 338(170)의 A, E 및 L을 함유하는 변형에 의하여FX 활성화의 3.5 내지 4배의 효능 증가가 있다. 본 명세서에서 발견된 바와 같이, 또한 R338E 돌연변이는, 보조인자 FVIIIa에 대하여 2배 강화된 결합뿐 아니라, 헤파린/AT-III 복합체에 의한 저해에 대하여 대략 88배의 내성을 나타낸다.
342-345 위치(키모트립신 번호매김으로 174-177)로부터 FIX 내로의 4 아미노산 트롬빈 루프 교환(swap) 돌연변이는, FIXa의 sLRP로의 결합을 감소시킨다고 보고되었다(Rohlena 등, (2003) J. Biol. Chem. 9394-9401 참조). T343 위치(키모트립신 번호매김으로 T175)의 잔기의 돌연변이는 FIX의 약동학적(PK) 성질에 있어 임의의 현저한 효과를 부여하지 않았다. 그러나 본원에서 T343R(키모트립신 번호매김으로 T175R) 돌연변이는, 약 3.1의 지수로 FX를 활성화시키는 촉매 효능을 증가시키며, 헤파린/AT-III 복합체에 대한 내성을 대략 5.6배 정도로 만들고, 대략 1.6배의 지수로 FVIIIa에 대한 친화력을 증가시키는 것이 발견되었다.
본 명세서에서 보여지는 바와 같이 또한, R403(키모트립신 번호매김으로 R233) 위치의 돌연변이는 헤파린/AT-III 복합체에 의한 저해에 대한 내성을 부여한다. E410(키모트립신 번호매김으로 E240) 위치에서의 돌연변이, 예컨대 E410N는 현저한, 지금까지는 관찰되지 아니한, FX를 활성화하기 위한 1.3 내지 2.8배의 촉매 효능의 증가를 일으킨다.
또한 이에 나타나는 바와 같이, R338 및 T343(키모트립신 번호매김으로 R170 및 T175)에서 돌연변이, 특히 R338E 및 T343R에서 보조인자 FVIII에 대한 결합이 강화되는 상승작용이 있다. 상승작용은 또한 R338 및 E410 위치(키모트립신 번호매김으로 R170 및 E240)에서 돌연변이, 특히 R338E 및 E410N 사이에서 관찰된다. 각각의 단일 돌연변이 단독으로 각각 1.6 내지 2.2 배로 결합을 강화한 반면, 본 명세서에서 예증된, 두 개의 이중 돌연변이 R338E/T343R 및 R338E/E410N는, 24 내지 28배의 FVIIIa에 대한 개선된 결합을 나타낸다.
하기 기재와 같이 변경된 성질 또는 활성을 부여하는 것으로 발견된 본원에서 제공된 FIX 폴리펩티드 내의 다른 예시적인 아미노산 치환은 서열번호 3에 관하여 1, 5, 53, 61, 64, 85, 103, 104, 105, 106, 108, 148, 157, 158, 159, 167, 169, 172, 179, 202, 203, 204, 205, 228, 239, 241, 243, 247, 249, 251, 257, 259, 260, 262, 284, 293, 312, 314, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 333, 342, 345, 346, 392, 394, 400, 412, 또는 413 중 임의의 아미노산 잔기 또는 상응하는 아미노산 잔기에 있을 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 FIX 폴리펩티드 내의 예시적인 아미노산 치환은 또한 서열번호 3에 제시된 서열을 가지는 성숙 FIX 폴리펩티드에서 Y1N, K5A, S53A, S61A, S61C, S61D, S61E, S61F, S61G, S61I, S61K, S61L, S61P, S61R, S61V, S61W, S61Y, D64A, D64C, D64F, D64H, D64I, D64L, D64M, D64N, D64P, D64R, D64S, D64T, D64W, D85N, A103N, D104N, N105S, N105T, K106N, K106S, K106T, V108S, V108T, T148A, N157D, N157E, N157F, N157I, N157K, N157L, N157M, N157Q, N157R, N157V, N157W, N157Y, S158A, S158D, S158E, S158F, S158G, S158I, S158K, S158L, S158M, S158R, S158V, S158W, S158Y, T159A, N167D, N167Q, N167E, N167F, N167G, N167H, N167I, N167K, N167L, N167M, N167P, N167R, N167V, N167W, N167Y, T169A, T169D, T169E, T169F, T169G, T169I, T169K, T169L, T169M, T169P, T169R, T169S, T169V, T169W, T169Y, T172A, T172D, T172E, T172F, T172G, T172I, T172K, T172L, T172M, T172P, T172R, T172S, T172V, T172W, T172Y, T179A, V202M, V202Y, D203N, D203M, D203Y, D203F, D203H, D203I, D203K, D203L, D203R, D203V, D203W, A204M, A204Y, A204F, A204I, A204W, F205S, F205T, K228N, E239A, E239S, E239R, E239K, E239D, E239F, E239I, E239L, E239M, E239N, E239T, E239V, E239W, E239Y, T241N, H243S, H243T, K247N, N249S, N249T, I251S, H257F, H257E, H257D, H257I, H257K, H257L, H257M, H257Q, H257R,H257S, H257V, H257W, H257Y, N260S, A262S, A262T, Y284N, K293E, K293A, R312A, R312Y, R312L, R312C, R312D, R312E, R312F, R312I, R312K, R312L, R312M, R312P, R312Q, R312S, R312T, R312V, R312W, R312Y, F314N, H315S, K316M, K316D, K316F, K316H, K316I, K316L,K316M, K316R, K316S, K316T, K316V, K316W, K316Y, G317N, S319N, A320S, L321N, L321S, L321T, R333A, R333E, F342I, F342D, F342E, F342K, F342L, F342M, F342S, F342T, F342V, F342W, F342Y, Y345A, Y345T, N346D, N346Y, N346E, N346F, N346H, N346I, N346K, N346L, N346M, N346Q, N346R, N346T, N346V, N346W, K392N, K394S, K394T, K400A, K400E, K400C, K400D, K400F, K400G, K400L, K400M, K400P, K400S, K400T, K400V, K400Y, T412A, T412V, T412C, T412D, T412E, T412F, T412G, T412I, T412M, T412P, T412W, T412Y, K413N 또는 상응하는 아미노산 잔기 위치에서의 동일한 치환을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
예를 들어, 본원에서 제공되는 변형(예컨대, 아미노산 치환)에 의하여 변경되는 예시적인 성질 및 활성은 하기에 기재된다.
a. 변경된 글리코실화
본원에서 제공되는 변형된 제 IX 인자 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 변경된 글리코실화 수준 및/또는 글리코실화의 변경된 유형을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 글리코실화를 나타낸다. 그러므로, 본원에 기술되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중에는 과글리코실화된 FIX 폴리펩티드가 있다.
i. 글리코실화의 장점
다수의 포유류 단백질은 다양한 수의 탄수화물 쇄로 글리코실화되는데, 각 탄수화물 쇄는 상이한 탄수화물 구조를 가질 수 있다. 이러한 탄수화물은 단백질의안정성, 가용성, 활성, 혈청 반감기 및 면역원성에 있어서 중요한 역할을 가질 수 있다. 그러므로, 단백질의 성질 및 활성은 글리코실화의 양 및/또는 유형을 조정함으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화는 단백질의 안정성, 가용성을 증가시키고, 면역원성을 감소시킴으로써 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이는 치료적 폴리펩티드의 경우 특히 관심있는 것인데, 이는 치료적 단백질의 증가된 가용성, 혈청 반감기 및 안정성이 증가된 치료적 효율을 야기할 수 있다.
올리고당류는 인식, 신호 전달 및 접착과 같은 세포내 및 세포간 사건에 있어서 중요하다. 탄수화물은 또한 분비된 단백질의 접힘을 보조한다. 글리코실화 부위는 글리코시드 결합을 통해서 단당류 및 올리고당류의 부착을 위한 부위를 제공함으로써, 폴리펩티드가 생산될 때, 예를 들어, 글리코실화가 가능한 진핵 세포 내에서, 글리코실화되도록 한다. 단백질 글리코실화에는 몇 개의 유형이 있다. N-연결된 및 O-연결된 글리코실화가 주된 종류(class)들인데, 여기에서 아스파라긴 잔기, 또는 세린 또는 트레오닌 잔기가 각각 변형된다. 다른 글리칸의 유형은, 글리코사미노글리칸 및 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커를 포함한다. GPI 앵커가 단백질을 소수성 지질 앵커에 글리칸 쇄를 통해서 부착되는 반면, 글리코사미노글리칸은 세린의 히드록시 산소에 부착된다. C-글리코실화는 또한 공통 서열인 Trp-X-X-Trp에서 발생할 수 있는데, 상기 서열 내의 첫번째 트립토판 잔기의 인돌 측쇄는 α-만노피라노실 기(Furrnanek 외 (2000) Acta Biochim . Pol . 47:781-789)으로 변형된다.
잠재적인 글리코실화 부위의 존재는, 그러나, 그 부위가 ER 내에서 번역후 프로세싱 동안에 글리코실화될 것이라는 점을 보장하지 않는다. 더 나아가, 글리코실화의 수준은 글리칸 구조가 다양할 수 있는 것과 같이, 임의의 주어진 부위에서 다양할 수 있다. 특정 부위의 글리코실화의 수준 및 유형의 차이는, 적어도 부분적으로, 잠재적인 글리코실화 부위 주위의 서열 문맥 및 이차적 구조 때문일 수 있다.
O-연결된 글리코실화는 N-아세틸갈락토사민과 같은 당 단위의, 세린, 트레오닌, 히드록시라이신 또는 히드록시프롤린 잔기의 히드록실기를 통한 부착과 관련된다. 이는 한 개의 단당류의 부착에 의해 개시되고, 그 후 다른 것들이 추가되어 성숙한 O-글리칸 구조가 형성된다. O-글리코실화가 세린, 트레오닌 및 프롤린 잔기의 비율이 높은 서열에서 더 가능성이 높음에도 불구하고, O-글리코실화를 위한 모티프는 알려진 것이 없다. 더 나아가, 이차적 구조 요소, 예컨대 연장된 β 턴(turn)이 또한 O-글리코실화를 촉진할 수 있다. O-글리코실화는 공통 핵심 구조를 결여한다. 대신에, 글리칸의 몇몇 유형은 O-N-아세틸갈락토사민(O-GalNAc), O-N-아세틸글루코사민(O-GlcNAc), O-푸코스(O-fucose) 및 O-글루코스(O-glucose)를 포함하는 선택된 O-글리코실화 부위에 부착될 수 있다.
O-글리코실화와 대조적으로, N-연결된 글리코실화 공통 서열 모티프는 잘 특징지어져 있다. N-연결된 글리코실화 동안, 14-잔기 올리고당류는 Asn-X-Ser/Thr/Cys 공통 모티프 내의 아스파라긴 잔기로 이동되는데, 여기에서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산이다. 글리코실트랜스퍼라제는 그 후 효소적으로 당류를 절단해 다듬고 추가적인 당 단위를 만노스 잔기에 부착한다. 공통 모티프에 인접한 서열이 또한 글리코실화가 공통 서열에서 발생하는지 여부에 영향을 줄 수 있다. 그러므로, Asn-X-Ser/Thr/Cys 공통 서열의 존재는 요구되지만 N-연결된 글리코실화가 발생하기 위해 반드시 충분한 것은 아니다. 일부 예에서, 인접한 서열의 변화는 예전에 없었던 공통 모티프에서의 글리코실화를 야기한다(Elliot 외, (2004) J. Bio1. Chem. 279:16854-16862).
N-연결된 올리고당류는 GlcNAc2Man3의 공통 핵심 구조를 공유한다. 포유류의 N-연결된 당류의 주된 유형에는 세 가지가 있다: 고-만노스 올리고당류, 복합체 올리고당류 및 혼성 올리고당류. 고-만노스 올리고당류는 필수적으로 몇 개의 만노스 잔기와 함께 두 개의 N-아세틸글루코사민을 함유한다. 일부 예에서, 최종 N-연결된 고-만노스 올리고당류는 이것이 단백질에 부착되기 전에 전구체 올리고당류만큼 많은 만노스 잔기를 함유한다. 복합체 올리고당류는 핵심 구조 내에 두 개 이상의 N-아세틸글루코사민을 포함하여, 거의 많은 수의 만노스, N-아세틸글루코사민 및 푸코스 당류를 함유할 수 있다.
글리코실화는 단백질의 단백분해를 감소시킴으로써 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있고 열 분해, 변성화제에의 노출, 산소 자유 라디칼에 의한 손상, 및 pH의 변화로부터 단백질을 보호할 수 있다. 글리코실화는 또한 표적 단백질이 세포 표면 수용체를 포함하는 다른 단백질에 대한 결합과 관련될 수 있는 제거(clearance) 기전을 회피하도록 할 수 있다. 탄수화물의 시알산 구성요소는 특히 단백질의 혈청 반감기를 향상시킬 수 있다. 시알산 모이어티는 매우 친수성이고 표적 단백질의 소수성 잔기를 방어할 수 있다. 이는 가용성을 증가시키고 단백질의 응집 및 침전을 감소시킨다. 감소된 응집은 단백질에 일어나는 면역 반응의 가능성을 감소시킨다. 더 나아가, 탄수화물은 면역계로부터 면역원성 서열을 방어할 수 있고, 탄수화물 모이어티에 의해 차지된 공간의 부피는 면역계에 의해 조사되는 이용가능한 표면적을 감소시킬 수 있다. 이 성질들은 표적 단백질의 면역원성의 감소로 이어질 수 있다.
치료적 폴리펩티드의 글리코실화의 수준 및/또는 유형의 변형은 폴리펩티드의 생체내 활성에 영향을 줄 수 있다. 글리코실화의 수준을 증가시킴으로써, 재조합 폴리펩티드는 증가된 혈청 반감기, 감소된 혈청 제거율 및 감소된 면역원성으로 더 안정하게 될 수 있다. 이는 폴리펩티드의 생체내 활성을 증가시켜, 비슷한 치료적 효과를 달성하기 위한 감소된 투여량 및/또는 투여 빈도를 야기할 수 있다. 예를 들어, 다베포에틴 알파(Darbepoetin alfa (DA))라고 불리는 재조합 인간 에리스로포이에틴(rHuEPO)의 과글리코실화된 형태는 증가된 생체내 활성 및 연장된 작용의 지속 기간을 갖는다. 과글리코실화된 DA 폴리펩티드의 증가된 탄수화물 및 시알산 함량은 비변형된 rHuEPO보다 3배 더 큰 혈청 반감기를 야기한다. 이 증가된 혈청 반감기는 증가된 생체이용가능성 및 감소된 제거율을 야기하며, 이는 더 낮은 투여 빈도 및/또는 더 낮은 투여량을 허용할 수 있는데, 이는 증가된 환자의 편의, 유해 효과의 감소된 위험 및 개선된 환자 순응과 관련된다.
ii. 변경된 글리코실화를 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드의 예
본원은 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 변경된 글리코실화를 나타내도록 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 변형된 FIX 폴리펩티드는, 예컨대 비-천연 글리코실화 부위의 혼입 또는 천연 글리코실화 부위의 결실에 의해, 각각 증가된 또는 감소된 글리코실화를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 비-천연 N-글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 비-천연 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환(들)(또는 교환(들)), 삽입(들) 또는 결실(들), 또는 이들의 임의의 조합에 의해 도입될 수 있는데, 여기에서 아미노산 치환(들), 삽입(들) 및/또는 결실(들)은 글리코실화 모티프 Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys의 확립을 야기하고, 여기에서 Xaa는 프롤린이 아니다. 다른 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수의 글리코실화 부위를 가질 수 있고, 전형적으로 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수준의 글리코실화를 야기한다. 추가적인 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 야생형 FIX와 동일한 수준의 글리코실화를 나타내지만, 상이한 유형의 글리코실화를 나타낸다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 동일한 수의 글리코실화 부위 및 동일한 수준의 글리코실화를 나타낼 수 있지만, 상이한 유형의 글리코실화, 예컨대, 예를 들어, 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 N- 및 O- 글리코실화의 상이한 상대적인 양을 가질 수 있다.
(a) 비-천연 글리코실화 부위(들)의 도입
특정 예에서, 비-천연 N-글리코실화 부위는 아미노산 치환에 의해 도입된다. 일부 예에서, 아미노산 치환에 의한 비-천연 N-글리코실화 부위의 창조(creation)는 단 한 개의 아미노산 치환을 요구한다. 예를 들어, 만약 비변형된 FIX 폴리펩티드가 Gly-Ala-Ser 서열을 함유한다면, N-글리코실화 부위는 글리신의 아스파라긴으로의 단일 아미노산 치환에 의해, Asn-Ala-Ser N-글리코실화 모티프를 창조하도록, 창조될 수 있다. 또 다른 예에서, 만약 비변형된 FIX 폴리펩티드가 Asn-Trp-Met 서열을 함유한다면, N-글리코실화 부위는 메티오닌의 시스테인(또는 트레오닌 또는 세린)으로의 단일 아미노산 치환에 의해 창조될 수 있다. 다른 예에서, 아미노산 치환에 의한 비-천연 N-글리코실화 부위의 창조는 하나 이상의 아미노산 치환을 요구한다. 예를 들어, 만약 비변형된 FIX 폴리펩티드가 Gly-Arg-Phe 서열을 함유한다면, N-글리코실화 부위는 Asn-Arg-Ser/Thr/Cys N-글리코실화 모티프를 창조하도록 두 개의 아미노산 치환에 의해 창조될 수 있다: 글리신의 아스파라긴으로의 아미노산 치환, 및 페닐알라닌의 시스테인(또는 트레오닌 또는 세린)으로의 아미노산 치환. 그러므로, 당업자는 하나 또는 그 이상의 비-천연 N-글리코실화 부위를 FIX 폴리펩티드 내의 임의의 위치에 도입할 수 있다.
비-천연 글리코실화 부위가 FIX 폴리펩티드 내로 도입되어 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드가 생성되도록 하는 위치는 전형적으로 그 위치에 연결된 임의의 탄수화물 모이어티가 FIX 폴리펩티드의 구조, 작용 및/또는 응혈 촉진 활성을 불리하게 방해하지 않도록, 또는 비-천연 글리코실화 부위를 도입하기 위해 폴리펩티드에 만들어진 아미노산 변형이 그 FIX 폴리펩티드의 구조, 작용 또는 활성을 불리하게 방해하지 않도록 선택된다. 따라서, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드가 야생형 또는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 활성의 적어도 하나를 유지하는 한, 비-천연 글리코실화 부위는 FIX 폴리펩티드의 임의의 위치 내로 도입될 수 있다. 역으로, 하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위는 FIX와 저해 분자의 상호작용과 관련될 수 있는 부위에서(at sites) 변형된 FIX 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 신규한 글리코실화 부위에 연결된 탄수화물 모이어티는 저해 분자와 변형된 FIX 간의 상호작용을 입체구조적으로 방해할 수 있다. 이러한 입체구조적 방해는 증가된 응혈 활성을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드를 야기할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 함유된 비-천연 글리코실화 부위에 연결된 탄수화물 모이어티는 변형된 FIX와 AT-III/헤파린 복합체의 상호작용을 입체구조적으로 방해할 수 있다. 이는 AT-III/헤파린의 저해적 효과에 대한 변형된 FIX 폴리펩티드의 증가된 내성을 야기할 수 있다.
그러므로, 비-천연 글리코실화 부위는, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드가 야생형 또는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 유지하는 한 Gla 도메인, EGF1 도메인, EGF2 도메인, 활성화 펩티드 및/또는 프로테아제 도메인 내로 도입될 수 있다. 다른 예에서, 비-천연 글리코실화 부위는 EGF2 도메인 또는 프로테아제 도메인 내로 도입된다. 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 활성을 적어도 하나 유지한다. 일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 촉매 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 FX에 대한 결합 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 FVIIIa에 대한 결합 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 일부 분석 및/또는 일부 조건하에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 단백질과 비교하여 증가된 활성을 나타낼 수 있다(예컨대, 생체내에에서의 약력학적 활성 및/또는 ATIII/헤파린 또는 혈장의 존재하에서의 촉매 활성).
표 3은 서열번호 3에 기재된 것과 같은 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는 예시적인 아미노산 치환의 비-제한적인 예를 제공하는데, 이는 비-천연 N-글리코실화 부위를 도입함으로써 글리코실화 수준을 증가시키기 위해 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함된다. 이러한 돌연변이와 관련하여, 첫 번째 아미노산(1글자 축약)은 치환되는 아미노산에 상응하고, 번호는 서열번호 3과 관련된 성숙한 FIX 폴리펩티드 서열 내의 위치에 상응하고, 두 번째 아미노산(1글자 축약)은 그 위치에서 첫 번째 아미노산을 치환하도록 선택된 아미노산에 상응한다. 돌연변이에 대한 아미노산 위치는 또한 적절한 경우 (즉, FIX 프로테아제 도메인 내에 위치한 경우) 키모트립신 번호매김 방법에 의해 언급된다. 변형된 아미노산 위치가 상응하는 키모트립신 번호를 갖고 있지 않은 경우 (즉, 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 위치 181 내지 415 내가 아닌, 및 상기 표 1에 기재되지 않는 경우), 위치는 성숙한 FIX 번호매김을 사용하여 괄호 내에 기재된다. 예를 들어, A103N은 상응하는 키모트립신 번호를 갖고 있지 않고 키모트립신 번호매김으로 언급할 때는 A[103]N으로 기재된다. 하기 표 3에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열 식별자(서열번호)가 확인된다. 또한 변형에 의해 생성되는 비-천연 글리코실화 부위의 위치가 표 3에서 확인된다.
일부 예에서, 단 하나의 아미노산 치환이 비-천연 N-글리코실화 부위를 창조하기 위해 요구된다. 예를 들어, 위치 85(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는)의 아스파르트산(Asp, D)은 아스파라긴(Asn, N)으로 치환되어 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치 85에서 EGF2 도메인 내의 비-천연 글리코실화 부위를 생성할 수 있다. 또 다른 예에서, 위치 251(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는)의 이소루이신(Ile, I)은 세린(Ser, S)으로 치환되어 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드 내의 아미노산 위치 249에서 프로테아제 도메인 내의 비-천연 N-글리코실화 부위를 생성할 수 있다. 다른 예에서, 두 개의 아미노산 치환이 신규한 글리코실화 부위를 창조하는데 요구된다. 예를 들어, 위치 103(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX의 번호매김에 기초한)의 알라닌(Ala, A)은 아스파라긴(Asn, N)으로 치환되고, 위치 105의 아스파라긴(Asn, N)은 세린(Ser, S)으로 치환될 수 있고, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드 내의 아미노산 위치 103에서 EGF2 도메인 내의 비-천연 N-글리코실화 부위를 창조할 수 있다. 또 다른 예에서, 위치 241의 트레오닌(Thr, T)은 아스파라긴으로 치환되고 위치 243의 히스티딘(His, H)은 세린으로 치환되어 아미노산 위치 243에서 프로테아제 도메인내의 비-천연 N-글리코실화 위치를 창조한다.
표 3.
Figure 112017042341398-pat00005
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 두 개 또는 그 이상의 비-천연 N-글리코실화 부위의 도입을 야기하는 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 표 3에 기재된 변형은 조합되어 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 비-천연 N-글리코실화 부위를 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드를 야기할 수 있다. 표 3에 기재되는 임의의 두 개 또는 그 이상의 변형이 조합될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중에는 각각 아미노산 위치 104 및 208(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는 번호매김)에서 두 개의 비-천연 글리코실화 부위를 갖는 FIX 폴리펩티드를 야기하는 아미노산 치환 D104N/KI06S/K228N을 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 포함된다. 또 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 치환 D85N/K247N/N249S/K392N/K304S를 함유하여 각각 아미노산 위치 85, 247 및 392(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는 번호매김)에서의 3개의 비-천연 글리코실화 부위를 갖는 FIX 폴리펩티드를 야기할 수 있다. 표 4는 두 개 또는 그 이상의 비-천연 N-글리코실화 부위를 갖는 예시적인 FIX 폴리펩티드를 기술한다.
표 4.
Figure 112017042341398-pat00006
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위, 예컨대 하나 또는 그 이상의 비-천연 N-글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 그러므로, 글리코실화를 용이하게 하는 세포 내에서 발현될 때, 또는 당업계에 잘 알려진 시험관내 기술을 사용하여 글리코실화될 때, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 수준의 글리코실화를 나타낼 수 있다. 글리코실화의 수준은 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 글리코실화 수준과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 도입하기 위한 본원에서 기술된 변형은 본원에서 기술된 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 도입하는 하나 또는 그 이상의 변형은 저해제, 예컨대 AT-III 및/또는 헤파린에 대한 내성을 증가시키고, 촉매 활성을 증가시키고, 내재적 활성을 증가시키고, 인지질에 대한 결합을 증가시키고, LRP에 대한 결합을 감소시키고/감소시키거나 약동학적 및/또는 약력학적 성질을 향상시키는 변형과 조합될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 함유하고 변경된 글리코실화, 예컨대 증가된 수준의 글리코실화를 갖는 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는, FIX의 적어도 하나의 활성, 예컨대 예를 들어 그것의 기질인 FX에 대한 촉매 활성을 유지한다. 전형적으로, 본원에 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드에 의해 나타나는 촉매 활성의 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 증가된 수준의 글리코실화는 변이체에 다음 성질들의 하나 또는 그 이상을 부여함으로써 변형된 FIX 폴리펩티드의 약력학적 성질을 개선시킬 수 있다: 비변형된 FIX와 비교하여 i) 감소된 제거율, ii) 변경된 분포 용적, iii) 향상된 생체내 회수율, iv) 향상된 생체내 총 단백질 노출(즉, AUC), v) 증가된 혈청 반감기(α, β, 및/또는 γ 상), 및/또는 vi) 증가된 평균 공명 시간(MRT). 변경된 글리코실화를 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드의 응혈 활성은 생체내 또는 시험관내에서의 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 응고 활성과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
(b) 천연 글리코실화 부위의 제거
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수의 글리코실화 부위를 가질 수 있다. 전형적으로, 글리코실화 부위의 수의 감소는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수준의 글리코실화를 야기한다. 제거될 수 있는 천연 글리코실화 부위는, 예를 들어, 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX의 위치 157 및 167에 상응하는 아미노산 위치의 천연 N-글리코실화 부위, 및 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX의 위치 53, 61, 159, 169, 172 및 179에 상응하는 아미노산 위치의 천연 O-글리코실화 부위를 포함한다.
임의의 하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위는 아미노산 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들), 또는 이의 임의의 조합에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 Asn/Xaa/Ser/Thr/Cys 모티프(여기서 Xaa는 프롤린이 아님)를 파괴하도록 만들어질 수 있어, 이에 의해 위치 157 또는 167에서 N-글리코실화 위치를 제거할 수 있다. 다른 예에서, O-글리코실화 부위는, 예컨대 위치 53 또는 61의 세린 잔기의 아미노산 치환 또는 결실에 의해, 또는 위치 159 또는 169의 트레오닌 잔기의 아미노산 치환 또는 결실에 의해 제거된다. 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 유지한다. 일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 촉매 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 FX에 대한 결합 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 FVIIIa에 대한 결합 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 일부 분석 및/또는 일부 조건하에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX와 비교하여 향상된 성질을 나타낼 수 있다(예컨대 증가된 생체내 회수율, 생체내의 증가된 AUC, 및/또는 생체내의 감소된 제거율을 포함하나 이에 제한되지 않는다).
표 5는 천연 N-글리코실화 부위를 제거하거나 없앰으로써 글리코실화 수준을 감소시키도록 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함되는, 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는, 예시적인 아미노산 치환의 비-제한적인 예를 제공한다. 하기 표 5에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열식별자(서열번호)가 확인된다.
표 5.
Figure 112017042341398-pat00007
하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 제거하기 위한 본원에서 기술되는 변형은 본원에서 기술되거나 당업계에 알려진 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 제거하는 하나 또는 그 이상의 변형은 비-천연 글리코실화 부위를 도입하고, AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 내성을 증가시키고, 촉매 활성을 증가시키고, 내재적 활성을 증가시키고, 인지질에 대한 결합을 증가시키고, 또는 약동학적 및/또는 약력학적 성질을 개선시키는 변형과 조합될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 제거한 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 FIX의 적어도 하나의 활성, 예컨대 예를 들어 그것의 기질인 FX에 대한 촉매 활성을 유지한다. 전형적으로, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드에 의해 나타난 촉매 활성의 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 일부 예에서, 변경된 글리코실화를 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드의 응혈 활성은 생체내 또는 시험관내에서 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 응혈 활성과 비교하여 적어도 약 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
b. AT-III 및 헤파린에 대한 내성 증가
FIX의 활성은 응고 과정의 조절의 일부로서 혈액 내의 인자들에 의해 저해될 수 있다. 그러므로, 본원에서 AT-III 및 헤파린을 포함하는 저해제의 저해 효과에 대한 증가된 내성을 나타내는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 헤파린에 대한 감소된 결합 친화력 및/또는 AT-III 단독 및/또는 AT-III/헤파린 복합체에 의한 저해에 대한 감소된 이차 반응속도 상수를 나타낸다. 추가적인 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 AT-III 단독, 또는 헤파린 단독에 대한 증가된 내성을 나타낸다. 그러므로, 본원에서 AT-III, AT-III/헤파린 복합체 및/또는 헤파린에 대해 증가된 내성을 나타내는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
i. AT-III
항트롬빈 III(항트롬빈 또는 AT-III으로도 알려진)는 중요한 항응혈 서핀(serpin, 세린 프로테아제 저해제)이다. AT-III은 464 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 단백질(서열번호 21)로서 합성된다. 분비 과정에서 32 잔기 신호 펩티드는 절단되어 432 아미노산의 성숙한 인간 항트롬빈(서열번호 22)을 생성한다. 58 kDa AT-III 당단백질은 혈액 내를 순환하고 세린 프로테아제 저해제(서핀)으로 기능하여 응고계의 다수의 세린 프로테아제를 저해한다. AT-III이 또한 FXIa, FXIIa 및 더 낮은 정도로, FVIIa의 활성을 저해하는 것으로 보여짐에도 불구하고, AT-III의 주요 타겟은 트롬빈, 제 Xa 인자 및 제 IXa 인자이다.
AT-III의 작용은 글리코사미노글리칸, 예컨대 임상에서 항응고제로서 널리 사용되는 다양한 조직-유래 헤파린 또는 천연적으로 발생하는 헤파란 설페이트에 의해 크게 향상된다. 전형적으로 이차 분자의 결합 없이도 효과적인 기타 서핀과 달리, 헤파린 부재시 표적 응고 인자와 AT-III의 반응은 몹시 느리다. 헤파린 부재시, AT-III의 반응성 루프 서열이 느린 반응성의 결정 요인을 제공한다. AT-III의 반응성 루프 중심 내의 보존된 P2-P1' 잔기의 돌연변이는, 예를 들어, 헤파린의 부재시에 프로테아제와의 AT-III의 상호작용에 영향을 주나 헤파린 존재시에는 그렇지 않다.
AT-III은 반응성 중심 루프의 구조적(conformational) 변화를 유도하는 헤파린 내의 고유의 오당류 서열에 매우 특이적인 방식으로 결합한다. 이러한 구조(conformation) 내에서, AT-III의 반응성 중심 루프는 세린 프로테아제의 반응성 부위와 더 효율적으로 상호작용할 수 있고 저해가 일어나게 할 수 있다. 증거는 헤파린의 AT-III에 대한 결합은 FIXa, 트롬빈 및 FXa의 AT-III과의 상호작용을 촉진하는 신규한 엑소사이트(exosite)를 생성한다는 것을 암시한다. 위치 253의 티로신 및 위치 255의 글루탐산은, 예를 들어, 헤파린 결합에 의해 생성되고, AT-III 단독과 함께 관찰된 저해와 비교하여 AT-III에 의한 FIXa의 빠른, 증가된 저해를 촉진하는 AT-III 상의 엑소사이트의 중심적 결정요인으로 보였다(lzaguirre 외, (2006) J Bio Chem 281 :13424-13432).
돌연변이 연구는 또한 제 IXa 인자의 어느 잔기가 AT-III/헤파린과의 상호작용과 관련이 있는지에 대해 일부 가르침을 주었다. 예를 들어, 성숙한 FIX 폴리펩티드의 위치 318(키모트립신 번호매김에 의해 위치 150에 상응하는)의 아르기닌의 변형은 이 AT-III/헤파린의 돌연변이체의 반응성을 33배 내지 70배 감소시킨다(Yang, L. 외, (2003) J Biol . Chem .278(27):25032-8). FIXa 돌연변이체 및 AT-III 간의 반응성의 장애는 AT-III이 헤파린에 결합하지 않은 경우에는 뚜렷하지 않으나, 성숙한 FIXa 폴리펩티드의 위치 318의 아르기닌과 AT-III 간의 상호작용은 AT-III이 헤파린-활성화된 구조 내에 있을 때 영향을 받는다는 것을 가리킨다.
ii. 헤파린
헤파린은 상기 논의된 바와 같이 내재적 테나아제 복합체(intrinsic tenase complex)내에서 AT-III 의존적 방식 및 AT-III 비의존적 방식 둘 다로 FIXa의 활성을 저해할 수 있다. 연구는 헤파린에 의한 FIXa 활성의 AT-III 비의존적 억제가 FVIIIa-FIXa 상호작용을 파괴하는 FIXa 상의 엑소사이트에 대한 올리고당류의 결합의 결과임을 가리킨다(Yuan 외, (2005) Biochem . 44:3615-3625, Misenheimer 외, (2007) Biochem . 46:7886-7895, Misenheimer 외, (2010) Biochem . 49:9977-10005). 헤파린 결합 엑소사이트는 제 IXa 인자 프로테아제 도메인 내에, 위치 338(키모트립신 번호매김에 의해 위치 170에 상응하는)의 아르기닌으로부터 적어도 위치 403(키모트립신 번호매김에 의해 위치 233에 상응하는)의 아르기닌으로 연장된 전기적 양성 영역(electroposive region)에 있다. 이 엑소사이트는 FIXa와 그것의 보조인자, FVIIIa의 상호작용에 결정적인 FIXa의 영역과 겹친다. 그러므로, 헤파린의 FIXa에 대한 결합은 FIXa와 FVIIIa의 상호작용을 저해하여 내재적 테나아제 활성을 감소시킨다.
iii. AT-III 및 헤파린에 대한 증가된 내성을 갖는 FIX 폴리펩티드의 예
변형은 AT-III, 헤파린 및/또는 AT-III/헤파린 복합체에 대한 그것의 내성을 증가시키는 FIX 폴리펩티드에 만들어질 수 있다. 일반적으로, 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드는 FIX 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 유지한다. 전형적으로, 이러한 변형은 FIXa와 AT-III, 헤파린 및/또는 AT-III/헤파린 복합체의 상호작용과 관련된 FIX 폴리펩티드의 임의의 위치의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어, AT-III 단독과 변형된 FIXa 폴리펩티드의 상호작용의 감소된 속도, AT-III/헤파린 복합체에 대한 변형된 FIXa 폴리펩티드의 상호작용의 감소된 속도 및/또는 변형된 FIXa 폴리펩티드의 헤파린 단독에 대한 감소된 결합 친화력을 야기할 수 있다. 일부 예에서, 변형(들)은 하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 도입한다. 신규한 글리코실화 부위에 연결된 탄수화물 모이어티는 변형된 FIX와 AT-III/헤파린 복합체의 상호작용을 입체구조적으로 방해하여, AT-III/헤파린에 대한 저해 효과에 대해 변형된 FIX 폴리펩티드의 증가된 내성을 야기할 수 있다. 변형된 FIXa 폴리펩티드는 그러므로 내재적 테나아제 활성에 대하여 AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린의 천연적 저해 효과에 대한 증가된 내성을 나타낸다. 적절한 시험관내 분석, 또는 생체내에서, 예컨대 응혈 촉진 치료제로서 대상체에 투여된 다음, 평가되었을 때, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다.
하기 본원에서 기술되는 바와 같이, 당업자는 경험적으로 또는 논리적으로 AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린에 대해 증가된 내성을 나타내는 변형된 FIXa 폴리펩티드를 설계할 수 있다. 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드는 변형된 FIX 폴리펩티드가 AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린에 대해 증가된 내성을 나타내는지 여부를 결정하기 위해 당업자에게 알려진 분석으로 시험될 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 일반적으로, AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린에 대해 증가된 내성을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드는 헤파린에 대한 감소된 결합 및/또는 감소된 친화력 및/또는 AT-III 및/또는 AT-III/헤파린과의 상호작용의 감소된 속도를 나타낼 것이다. 전형적으로, 이러한 분석은 FIX의 활성화된 형태(FIXa)로, 보조인자, FVIIIa 및 인지질의 존재 또는 부재하에서 수행된다.
본원에서 AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린에 대해 증가된 내성을 나타내는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드 변이체는 아미노산 위치 202, 203, 204, 205, 228, 239, 257, 260, 293, 312, 316, 318, 319, 321, 333, 338, 342, 346, 400, 403 또는 410(키모트립신 번호매김에 의해, 아미노산 위치 38, 39, 40, 41 , 63, 74, 92, 95, 126, 143, 145, 148, 150, 151, 153, 165, 170, 174, 178, 230, 233 및 240에 각각 상응하는)의 하나 또는 그 이상에서 변형되어 있다. 이들 아미노산 잔기는 예컨대 아미노산 치환, 결실, 또는 교환에 의해 변형될 수 있다. 확인된 잔기는 임의의 또 다른 아미노산으로 치환되거나 교환될 수 있다. 대안적으로, 아미노산 삽입은 표적 아미노산 잔기의 구조(conformation) 또는 표적 아미노산 잔기 근처의 단백질 구조를 변경시키는데 사용될 수 있다.
임의의 아미노산 잔기는 확인된 위치에서 내인성 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 전형적으로, 치환 아미노산은 이것이 FIX 및 AT-III 또는 헤파린 간의 상호작용을 방해하도록 선발된다. 예를 들어, 변형은 아미노산 위치 260, 293, 333, 338, 346, 400 및 410(키모트립신 번호매김에 의해, 아미노산 위치 95, 126, 165, 170, 178, 230, 233 및 240에 각각 상응하는)에서 만들어져 FIX 폴리펩티드와 헤파린의 상호작용을 방해할 수 있다. 다른 예에서, 변형은 아미노산 위치 203, 204, 205, 228, 239, 312, 314, 316, 318, 319, 321 및 342(키모트립신 번호매김에 의해, 아미노산 위치 39, 40, 41, 63, 74, 143, 145, 148, 150, 151, 153 및 174에 각각 상응하는)에서 만들어져 FIX 폴리펩티드와 AT-III의 상호작용을 방해한다.
일부 예에서, 신규한 글리코실화 부위는 아미노산 치환에 의해 도입된다. 신규한 글리코실화 부위에 연결된 탄수화물 모이어티는 변형된 FIX와 AT-III/헤파린 복합체의 상호작용을 입체구조적으로 방해하여, 변형된 FIX 폴리펩티드의 AT-III/헤파린의 저해 효과에 대한 증가된 내성을 야기할 수 있다. 예를 들어, 위치 410(키모트립신 번호매김에 의해 위치 240에 상응하는)의 글루탐산(Glu, E)은 아스파라긴(Asn, N)으로 치환되어 위치 410에 신규한 글리코실화 부위를 도입할 수 있다. 다른 예에서, 위치 239(키모트립신 번호매김에 의해 위치 74에 상응하는)의 글루탐산(Glu, E)은 아스파라긴(Asn, N)으로 치환되어 위치 239에 신규한 글리코실화 부위를 도입한다. At-III/헤파린에 대한 내성을 증가시키기 위해 신규한 글리코실화 부위를 도입하는 기타 돌연변이는, 예를 들어 D203N/F205T, R318N/A320S, N260S 및 F314N/K316S (키모트립신 번호매김에 의해 D39N/F41T, R150N/A152S, N95S 및 F145N/K148S에 상응하는)를 포함한다.
AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린에 대한 내성을 증가시키기 위해 만들어지는 변형의 다른 예에서, 위치 202(키모트립신 번호매김에 의해 위치 38에 상응하는)의 발린 잔기가 메티오닌(Met, M) 또는 티로신(Tyr Y)으로 치환되고; 위치 203(키모트립신 번호매김에 의해 위치 39에 상응하는)의 아스파르트산(Asp, D)은 메티오닌(Met, M) 또는 티로신(Tyr, Y)으로 치환되고; 위치 204(키모트립신 번호매김에 의해 위치 40에 상응하는)의 알라닌(Ala, A)은 메티오닌(Met, M) 또는 티로신(Tyr, Y)으로 치환되고; 위치 239(키모트립신 번호매김에 의해 위치 74에 상응하는)의 글루탐산은 세린(Ser, S), 알라닌(Ala, A), 아르기닌(Arg, R) 또는 라이신(Lys, K)으로 치환되고; 위치 257(키모트립신 번호매김에 의해 위치 92에 상응하는)의 히스티딘은 페닐알라닌(Phe, F), 티로신(Tyr, Y), 글루탐산(Glu, E) 또는 세린(Ser, S)으로 치환되고; 위치 293(키모트립신 번호매김에 의해 위치 143에 상응하는)의 라이신(Lys, K)은 알라닌(Ala, A) 또는 글루타민(Gln, Q)으로 치환되고; 위치 312(키모트립신 번호매김에 의해 위치 143에 상응하는)의 아르기닌(Arg, R)은 알라닌(Ala, A) 또는 글루타민(Gln, Q)으로 치환되고; 위치 316(키모트립신 번호매김에 의해 위치 148에 상응하는)의 라이신은 아스파라긴(Asn, N), 알라닌(Ala, A), 글루탐산(Glu, E), 세린(Ser, S), 또는 메티오닌(Met, M)으로 치환되고; 위치 318(키모트립신 번호매김에 의해 위치 150에 상응하는) 아르기닌(Asn, R)은 알라닌(Ala, A), 글루탐산(Glu, E), 티로신(Tyr, Y), 페닐알라닌(Phe, F) 또는 트립토판(Trp, W)으로 치환되고; 위치 333(키모트립신 번호매김에 의해 위치 165에 상응하는)의 아르기닌(Arg, R)은 알라닌(Ala, A) 또는 글루탐산(Glu, E)으로 치환되고; 위치 338(키모트립신 번호매김에 의해 위치 170에 상응하는)의 아르기닌(Arg, R)은 알라닌(Ala, A) 또는 글루탐산(Glu, E)으로 치환되고; 위치 400(키모트립신 번호매김에 의해 위치 230에 상응하는)의 라이신(Lys, K)은 알라닌(Ala, A) 또는 글루탐산(Glu, E)으로 치환되고/치환되거나; 위치 403(키모트립신 번호매김에 의해 위치 233에 상응하는) 아르기닌(Arg, R)은 알라닌(Ala, A), 글루탐산(Glu, E) 또는 아스파르트산(Asp, D)으로 치환된다.
본원에서 티로신이거나 이의 보존적 아미노산 치환인, 잔기 R318에서 또는 318에 상응하는 FIX 폴리펩티드 내의 잔기에서의 아미노산 치환, 예컨대 R318Y를 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 티로신에 대한 보존적 아미노산 잔기는, 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한 본원에서 글루탐산이거나 이의 보존적 아미노산 치환인, 잔기 R403에서 또는 403에 상응하는 FIX 폴리펩티드 내의 잔기에서의 아미노산 치환, 예컨대 R403E를 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 글루탐산에 대한 보존적 아미노산 잔기는 아스파르트산(D)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
추가적인 구현예에서, 조합 돌연변이체가 생성될 수 있다. 이러한 조합 돌연변이체 중에는 아미노산 위치 202, 203, 204, 257, 239, 293, 312, 316, 318, 333, 338, 400, 403 및 410(키모트립신 번호매김에 의해, 아미노산 위치 38, 39, 40, 74, 92, 126, 143, 148, 150, 165, 170, 230, 233 및 240에 각각에 상응하는)에서 두 개 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 조합 돌연변이체가 포함된다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 확인된 위치의 2, 3, 4, 5 또는 그 이상에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 그러므로, 변형된 폴리펩티드는 AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린의 저해 효과에 대해 변형된 FIX 폴리펩티드의 증가된 내성을 야기할 수 있는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 돌연변이를 나타낼 수 있다. AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린의 저해 효과에 대해 변형된 FIX 폴리펩티드의 내성을 증가시키기 위한 본원에서 기술되는 임의의 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 조합될 수 있다.
표 6은 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는, 확인된 잔기에서의 예시적인 아미노산 치환의 비-제한적인 예를 제공한다. 예시적인 조합 돌연변이가 이들 중에 포함된다. 언급된 바와 같이, 이러한 FIX 폴리펩티드는 AT-III, AT-III/헤파린, 및/또는 헤파린에 대한 내성을 증가시키기 위해 설계되고, 그러므로 ATIII, 헤파린/ATIII, 헤파린, 혈장, 혈청 또는 혈액을 포함하는 생체내, 생체외 또는 시험관내 분석에서 증가된 응혈 활성을 갖는다. 이러한 돌연변이와 관련하여, 첫 번째 아미노산(1글자 축약)은 치환되는 아미노산에 상응하고, 번호는 서열번호 3과 관련된 성숙한 FIX 폴리펩티드 서열 내의 위치에 상응하고, 두 번째 아미노산(1글자 축약)은 그 위치에서 첫 번째 아미노산을 치환하도록 선택된 아미노산에 상응한다. 돌연변이에 대한 아미노산 위치는 또한 키모트립신 번호매김 방법에 의해 언급된다. 하기 표 6에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열식별자(서열번호)가 확인된다.
표 6.
Figure 112017042341398-pat00008
AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 내성을 증가시키기 위한 본원에서 기술되는 변형은 본원에서 기술된 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다. 예를 들어, AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 내성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 변형은 비-천연 글리코실화 부위를 도입하고, 하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 제거하고, 하나 또는 그 이상의 천연 설페이트화, 인산화 또는 히드록실화 부위를 제거하고, 촉매 활성을 증가시키고, 내재적 활성을 증가시키고, 인지질에 대한 결합을 증가시키고, 또는 약동학적 및/또는 약력학적 성질을 향상시키는 변형과 조합될 수 있다. 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 전형적으로 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다.
생체내 또는 시험관내에서의 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 친화력, 저해 정도, 저해에 대한 이차 반응속도 상수와 비교하여, AT-III 단독, AT-III/헤파린 복합체 및/또는 헤파린 단독에 대한 증가된 내성을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드는 헤파린에 대한 친화력, 특이적 조건하에서 저해 정도, 또는 ATIII 또는 헤파린/ATIII에 의한 저해에 대한 이차 반응 속도 상수는 적어도 약 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 감소를 나타낼 수 있다. 그러므로, 변형된 FIX 폴리펩티드는 AT-III 단독, AT-III/헤파린 복합체 및/또는 헤파린 단독에 대해 비변형된 FIX 폴리펩티드에 의해 나타내어지는 내성의 적어도 또는 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상인 증가된 내성을 나타낼 수 있다. 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드의 AT-III, AT-III/헤파린 복합체 및/또는 헤파린에 대한 증가된 내성은 또한 AT-III, AT-III/헤파린 복합체 및/또는 헤파린, 혈액, 혈장, 또는 혈청의 존재하에서 생체내 또는 시험관내에서 증가된 응고 활성 또는 응고 활성의 개선된 지속이 나타날 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드의 응고 활성은 생체내 또는 시험관내에서 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 응고 활성과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다. AT-III, 헤파린/AT-III 복합체, 및/또는 헤파린에 대한 내성을 증가시키는 변형을 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 비변형된 FIXa와 비교하여 향상된 치료 지수를 나타낼 수 있다.
c. 촉매 활성을 증가시키기 위한 돌연변이
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX와 비교하여 폴리펩티드의 촉매 활성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 FVIIIa에 대한 친화력이 증가되도록, 변형은 FIX와 그것의 보조인자, FVIIIa와의 상호작용과 관련되는 아미노산에 만들어질 수 있는데, 이에 의해 FVIIIa가 포화 농도에서 존재하지 않는 조건하에 FX에 대한 증가된 활성을 나타낼 수 있다. 보조인자 FVIIIa의 존재 및/또는 부재하에, FX의 활성화를 위한 변형된 FIX 폴리펩티드의 활성 또는 촉매 효율은, 비변형된 폴리펩티드의 활성 또는 촉매 효율과 비교하여 증가되도록, 변형은 또한 FIX 폴리펩티드의 프로테아제 도메인에 만들어질 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드에 포함될 수 있는 예시적인 변형은 위치 259, 265, 345, 410 및 412(키모트립신 번호매김에 의해 94, 98, 177, 240 및 242에 상응하는)의 아미노산 치환을 포함한다. 이들 위치의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있다. 일부 예에서, 위치 259의 티로신은 페닐알라닌으로 치환되고; 위치 265의 라이신은 트레오닌으로 치환되고; 및/또는 위치 345의 티로신은 트레오닌으로 치환된다. 추가적인 예에서, 위치 410의 글루탐산은 글루타민, 세린, 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환된다. 일 예에서, 위치 412의 트레오닌은 발린 또는 알라닌으로 치환된다.
상기 언급된 변형은 단지 예시적인 것이다. 본원에 기술된 다수의 다른 변형은 또한 증가된 촉매 활성을 야기한다. 예를 들어, 저해제, 예컨대 AT-III 및/또는 헤파린에 대한 내성을 증가시키기고, 하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 제거하고, 하나 또는 그 이상의 천연 설페이트화, 인산화 또는 히드록실화 부위를 제거하고, 내재적 활성을 증가시키고, 인지질에 대한 결합을 증가시키고, LRP에 대한 결합을 감소시키고/감소시키거나, 약동학 및/또는 약력학적 성질을 개선시키기 위하여 FIX 폴리펩티드 내로 도입되는 변형은, 또한 증가된 활성을 나타내는 변형된 FIX 폴리펩티드를 야기할 수 있다.
표 7은 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는, 확인된 잔기의 예시적인 아미노산 치환의 비-제한적인 예를 제공한다. 이러한 돌연변이와 관련하여, 첫 번째 아미노산(1글자 축약)은 치환되는 아미노산에 상응하고, 번호는 서열번호 3과 관련하여 성숙한 FIX 폴리펩티드 서열 내의 위치에 상응하고, 두 번째 아미노산(1글자 축약)은 그 위치에서 첫 번째 아미노산을 치환하도록 선택된 아미노산에 상응한다. 돌연변이를 위한 아미노산 위치는 또한 키모트립신 번호매김 방법에 의해 언급된다. 하기 표 7에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열식별자(서열번호)가 확인된다.
표 7.
Figure 112017042341398-pat00009
촉매 활성을 증가시키기 위한 본원에서 기술된 변형은 본원에 기술되거나 당업계에 알려진 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다. 예를 들어, 촉매 활성을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 변형은 AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 내성을 증가시키고, 비-천연 글리코실화 부위를 도입하고, 하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 제거하고, 하나 또는 그 이상의 천연 설페이트화, 인산화 또는 히드록실화 부위를 제거하고, 내재적 활성을 증가시키고, 인지질에 대한 결합을 증가시키고, 또는 약동학적 및/또는 약력학적 성질을 개선시키는 변형과 조합될 수 있다. 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 전형적으로 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다.
증가된 촉매 활성을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드는 생체내 또는 시험관내에서 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 촉매 활성과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상의 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드의 증가된 촉매 활성은 또한 증가된 응고 활성, 응고 활성의 지속 및/또는 향상된 치료 지수를 나타낼 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드의 응고 활성은 생체내 또는 시험관내에서 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 응고 활성과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상 증가될 수 있다.
d. LRP 결합을 감소시키기 위한 돌연변이
FIXa는 간, 뇌, 태반 및 폐를 포함하는 다양한 조직에서 발현되는 막 당단백질인 저밀도 지단백 수용체-관련 단백질(LRP)에 결합함으로써 전신 순환으로부터 제거될 수 있다. 그러므로, 본원에서 LRP에 대해 감소된 결합을 나타내는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 이는 예를 들어 i) 감소된 제거율, ii) 변경된 분포 용적, iii) 향상된 생체내 회수율, iv) 향상된 시험관내의 총 단백질 노출(즉, AUC), v) 증가된 혈청 반감기(α, β, 및/또는 γ 상), 및/또는 vi) 증가된 평균 공명 시간(MRT)을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드의 향상된 약동학적 성질을 야기할 수 있다. 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드는 증가된 응혈 활성을 나타낼 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 LRP-결합 부위 내에 하나 또는 그 이상의 변형을 함유할 수 있다. 이 결합 부위는 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 프로테아제 도메인 횡단 잔기(protease domain spanning residue) 342 내지 346의 내의 루프 내에 위치하도록 상정된다. 예컨대 아미노산 치환, 삽입 또는 결실에 의한, 위치 342 내지 346(키모트립신 번호매김에 의해 위치 174 내지 178에 상응하는)의 잔기의 하나 또는 그 이상의 변형은 변형된 FIX 폴리펩티드 및 LRP 간의 상호작용을 방해하여 감소된 결합 친화력을 야기할 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드의 LRP에 대한 결합은 당업자에게 알려진 분석을 사용하여 시험될 수 있다(예컨대 Rohlena 외, (2003) J. Biol. Chem. 278:9394-9401 참조). 최종적인 향상된 약동학적 성질은 또한 하기 기술되는 것들을 포함하여 잘 알려진 생체내 분석을 사용하여 시험될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는 예시적인 변형은 위치 343, 344, 345 및 346 (키모트립신 번호매김에 의해 175, 176, 177 및 178에 상응하는)의 아미노산 치환을 포함한다. 이 위치의 아미노산은 임의의 다른 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있다. 일부 예에서, 위치 343의 트레오닌은 글루타민, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌으로 치환되고; 위치 344의 페닐알라닌은 이소루이신으로 치환되고; 위치 345의 티로신은 트레오닌, 알라닌 또는 알라닌으로 치환되고; 및/또는 위치 346의 아스파라긴은 아스파르트산 또는 티로신으로 치환된다. 임의의 하나 또는 그 이상의 이들 예시적인 아미노산 치환은 서로 조합되거나 본원에 기술되는 임의의 다른 변형과 조합될 수 있다.
본원에서 아르기닌이거나 이의 보존적 아미노산 치환인, 잔기 T343에서 또는 343에 상응하는 FIX 폴리펩티드 내의 잔기에서의 아미노산 치환, 예컨대 T343R을 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 아르기닌에 대한 보존적 아미노산 잔기는 라이신(K)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
표 8은 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는, 확인된 잔기의 예시적인 아미노산 치환의 비-제한적인 예를 제공한다. 이러한 돌연변이와 관련하여, 첫 번째 아미노산(1글자 축약)은 치환되는 아미노산에 상응하고, 번호는 서열번호 3과 관련된 성숙한 FIX 폴리펩티드 서열내의 위치에 상응하며, 두 번째 아미노산(1글자 축약)은 그 위치에서 첫 번째 아미노산을 치환하기 위해 선택된 아미노산에 상응한다. 돌연변이에 대한 아미노산 위치는 또한 키모트립신 번호매김 방법으로도 언급된다. 하기 표 8에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열식별자(서열번호)가 확인된다.
표 8.
Figure 112017042341398-pat00010
LRP에 대한 결합을 감소시키는 본원에서 기술된 변형은 본원에 기술된 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다. 예를 들어, LRP에 대한 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 변형은 AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 내성을 증가시키고, 촉매 활성을 증가시키고, 비-천연 글리코실화 부위를 도입하고, 하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 제거하고, 하나 또는 그 이상의 천연 설페이트화, 인산화 또는 히드록실화 부위를 제거하고, FVIIIa의 존재 및/또는 부재하에 활성을 증가시키고, 인지질에 대한 결합을 증가시키고, 또는 약동학적 및/또는 약력학적 성질을 개선시키는 변형(들)과 조합될 수 있다. 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 전형적으로 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다.
LRP에 대한 감소된 결합을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드는 시험관내에서 LRP에 대한 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 결합과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상의 감소를 나타낼 수 있다. 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드에 의한 LRP에 대한 감소된 결합은 예컨대 i) 감소된 제거율, ii) 변경된 분포 용적, iii) 향상된 생체내 회수율, iv) 향상된 생체내 총 단백질 노출(즉, AUC), v) 증가된 혈청 반감기(αγ, β, 및/또는 γ상), 및/또는 vi) 증가된 평균 공명 시간(MRT)과 같은 개선된 약동학적 성질을 야기할 수 있다. 더 나아가, 이러한 변경은 증가된 응혈 활성, 응고 활성의 지속 및/또는 향상된 치료 지수를 야기할 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드의 응고 활성은 생체내 또는 시험관내에서 비변형된 또는 야생형 FIX 폴리펩티드의 응고 활성과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상 증가될 수 있다.
e. 번역후 변형을 변경시키기 위한 다른 돌연변이(들)
야생형 FIX는 포유류 세포 내 발현에 있어서 후번역적으로 변형된다. 제 IX 인자 전구체 폴리펩티드는 혈액 내로 분비되는 성숙한 자이모겐(zymogen)이 되도록 대규모의 번역후 변형을 거친다. 이러한 번역후 변형은 γ-카르복실화, β-히드록실화, O- 및 N-연결된 글리코실화, 설페이트화 및 인산화를 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 글리코실화의 수준은, 예를 들어, 신규한 비-천연 글리코실화 부위의 도입 및/또는 천연 글리코실화 부위의 제거에 의해 변경될 수 있다. 유사하게, 다른 번역후 변형은 예컨대 γ-카르복실화, β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위의 도입 및/또는 제거에 의해 변경될 수 있다.
임의의 하나 또는 그 이상의 천연 γ-카르복실화, β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위가, 예컨대 아미노산 치환 또는 결실에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 비변형된 FIX 폴리펩티드는 Gla 도메인 내의 12개의 글루탐산 잔기(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX의 위치 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 및 40에 상응하는)의 임의의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이들 잔기는 전형적으로 야생형 FIX 내에서는 γ-카르복실화 되어 γ-카르복시글루타밀화(또는 Gla)된다. 그러므로, 예컨대 아미노산 치환 또는 결실에 의한 글루탐산 잔기의 제거는, 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 변형된 FIX 폴리펩티드의 γ-카르복실화의 수준을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 야생형 FIX 내에서 정상적으로 β-히드록실화되는, 위치 64의 아스파르트산 잔기는, 예컨대 아미노산 치환 또는 결실에 의해 제거될 수 있다. 제거될 수 있는 추가적인 번역후 변형 부위는, 예를 들어, 야생형 FIX 내에서 전형적으로 설페이트화되는, 위치 155의 티로신 및 야생형 FIX 내에서 전형적으로 인산화되는, 위치 158의 세린 잔기를 포함한다.
다른 예에서, 비-천연 번역후 변형 부위는, 예컨대 아미노산 치환 또는 삽입에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 글루탐산 잔기는 Gla 도메인 내로 도입될 수 있다. 이러한 글루탐산 잔기는 예를 들어, 포유동물 세포 내에서의 변형된 FIX 폴리펩티드에서의 발현에 있어서, γ-카르복실화되어 γ-카르복시글루타밀화(또는 Gla)될 수 있다. 유사하게, 하나 또는 그 이상의 비-천연 β-히드록실화, 설페이트화 또는 인산화 부위가 도입될 수 있다.
제거되는 천연 번역후 변형 부위의 하나 또는 그 이상을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 예컨대 γ-카르복실화, β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위를 포함하는 하나 또는 그 이상의 번역후 변형 부위를 제거하도록 변형된 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 유지한다. 일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 촉매 활성의 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드의 FVIIIa에 대한 결합 활성의 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 일부 분석에서 및/또는 일부 조건하에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 단백질과 비교하여 증가된 활성(예컨대 생체내에서 증가된 약력학적 활성, 및/또는 AT-III/헤파린 또는 혈장의 존재하에서의 활성)을 나타낼 수 있다.
본원에서 페닐알라닌이거나 이의 보존적 아미노산 치환인, 잔기 Y155에서 또는 155에 상응하는 FIX 폴리펩티드 내의 잔기에서의 아미노산 치환, 예컨대 Y155F를 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
예를 들어, 페닐알라닌에 대한 보존적 아미노산 잔기는 메티오닌(M), 루이신(L) 또는 티로신(Y)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
표 9는 각각 위치 64, 155 및 158에서 천연 β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위를 제거하기 위한 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함되는, 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치에 상응하는, 예시적 아미노산 치환의 비-제한적인 예를 제공한다. 하기 표 9에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열식별자(서열번호)가 확인된다.
표 9.
Figure 112017042341398-pat00011
β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위를 제거하기 위한 본원에서 기술되는 변형은 본원에서 기술된 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타낸다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 천연 β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위를 제거하기 위한 하나 또는 그 이상의 변형은 AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 내성을 증가시키고, 글리코실화를 변경시키고, 예컨대 글리코실화를 증가시키고, 촉매 활성을 증가시키고, 내재적 활성을 증가시키고, 인지질에 대한 결합을 증가시키고, 또는 약동학적 및/또는 약력학적 성질을 개선시키는 변형과 조합될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 천연 β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위를 제거하는 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 FIX의 적어도 하나의 활성, 예컨대 예를 들어, 그것의 기질인 FX에 대한 촉매 활성, 또는 보조 인자인 FVIIIa에 대한 결합을 유지한다. 전형적으로, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드에 의해 나타나는 촉매 활성의 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다. 일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 응혈 활성은 생체내 또는 시험관내에서 비변형된 또는 야생형의 FIX 폴리펩티드의 응혈 활성과 비교하여 적어도 약 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상 증가된다.
2. 조합 변형
하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 함유하거나, 제거된 하나 또는 그 이상의 천연 글리코실화 부위를 갖거나, 제거된 하나 또는 그 이상의 천연 β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위를 갖거나, 또는 야생형 FIX 폴리펩티드와 비교하여 AT-III, AT-III 및/또는 헤파린과 같은 저해제에 대한 증가된 내성을 야기할 수 있는 변형을 갖는 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는, 또한 다른 변형을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 도입하는 변형을 함유하고 또한 FIX와 저해제, 예컨대 AT-III, AT-III/헤파린 복합체 및/또는 헤파린 간의 상호작용을 방해하는 변형을 함유한다. 다른 예에서, 하나 또는 그 이상의 천연 β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화 부위를 제거하는 변형은 저해제에 대한 내성을 증가시키는 변형, 및/또는 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 도입하는 변형과 조합될 수 있다. 그러므로, 상기 표 3-9에 기재된 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 상기 표 3-9에 기재된 임의의 다른 돌연변이와 조합될 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 중에는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 글리코실화, 예컨대 N-글리코실화; AT-III, AT-III/헤파린 및/또는 헤파린에 대한 증가된 내성; 감소된 β-히드록실화, 설페이트화 및/또는 인산화; 및/또는 증가된 촉매 활성을 나타내는 것들이 포함된다.
더 나아가, 본원에서 제공되는 임의의 변형된 FIX 폴리펩티드는 임의의 하나 또는 그 이상의 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 추가적인 변형은 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 변경된 성질 및/또는 활성을 야기한다. 전형적으로, 이러한 추가적인 변형은 그 자체가 변형된 폴리펩티드의 증가된 응혈 활성 및/또는 폴리펩티드의 증가된 안정성을 야기하는 것들이다. 그러므로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 전형적으로 증가된 응혈 활성을 나타낸다.
추가적인 변형은, 예를 들어, 당업계에 알려진 임의의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 전형적으로 FIX 폴리펩티드의 응혈 활성 및/또는 안정성을 증가시키는 임의의 것을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 변형된 FIX 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 추가적인 아미노산 변형을 함유할 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드는 야생형 또는 비변형된 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성, 예컨대 예를 들어, 촉매 활성, 또는 보조 인자, FVIIIa에 대한 결합을 유지한다.
1차 서열의 추가적인 변형이 FIX 폴리펩티드에 만들어져 번역후 변형에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 상기 기술된 것들 및 그 외의 것들을 포함하는, 예컨대 미국 특허 공개 번호 20080280818에 기술된 비-천연 O-연결된 또는 S-연결된 글리코실화 부위, 또는 국제 특허 공개 번호 W020091300198 및 W02009137254에 기술된 비-천연 글리코실화 부위를 포함하는, 비-천연 글리코실화 부위를 함유할 수 있다.
다른 예에서, FIX 폴리펩티드 서열에 그것과 다른 인자, 분자 및 단백질과의 상호작용이 변경되도록 추가적인 변형이 만들어질 수 있다. 예를 들어, FX에 대한 변형된 FIX 폴리펩티드의 친화력 및/또는 결합이 증가될 수있도록 제 X 인자와의 상호작용과 관련된 아미노산 잔기가 변형될 수 있다. 다른 변형은 FVIIIa, 헤파린, 항트롬빈 III 및 인지질과의 상호작용과 관련된 아미노산의 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드의 구조(conformation) 또는 접힘을 변경시키는 추가적인 변형이 또한 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드에 만들어질 수 있다. 이들은, 예를 들어, 신규한 이황화 결합이 형성되도록 하나 또는 그 이상의 아미노산의 시스테인으로의 치환, 또는 α-나선 구조를 안정화시키는 변형을 포함하고, 이로 인해 변형된 FIX 폴리펩티드에 증가된 활성을 부여한다.
변형은 모이어티, 예컨대 변형된 FIX 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위해 작용하는 것에 뒤이어 연결될 수 있는 아미노산 잔기를 도입하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(국제 특허 공개 번호 WO2009140015)과 같은 중합체에 컨주게이션을 용이하기 위해 시스테인 잔기가 도입될 수 있다. FIX 폴리펩티드의 안정성은 또한 잠재적인 단백분해 부위를 변형시킴으로써, 예컨대 잠재적인 단백분해 부위를 제거함으로써, 변경될 수 있고, 이에 의해 변형된 FIX 폴리펩티드의 프로테아제에 대한 내성을 증가시킬 수 있다(예컨대 미국 특허 공개 번호 20080102115 참조).
추가적으로, 변형된 FIX 폴리펩티드가 인지질막에 대해 증가된 결합 및/또는 친화력을 보이도록, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 내인성 Gla 도메인 내에 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하거나, 다중의 아미노산의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 내인성 Gla 도메인의 전부 또는 일부가 이종성 Gla 도메인의 전부 또는 일부로 치환될 수 있다. 다른 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 내인성 Gla 도메인에서의 결실, 또는 정상적으로 감마-카르복실화된 위치에서의 치환을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 아미노산 치환은 추가적인, 잠재적인 감마-카르복실화 부위를 도입하기 위해 만들어질 수 있다.
다음 섹션은 FIX 폴리펩티드의 증가된 안정성 및/또는 응혈 활성에 영향을 주기 위한 당업계에 기술된 예시적인 변형의 비-제한적인 예를 기술한다. 상기 논의된 바와 같이, 이러한 변형은 또한 본원에서 제공되는 임의의 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 추가적으로 포함될 수 있다. 하기 언급된 아미노산 위치는 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응한다. 상응하는 돌연변이는 다른 FIX 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 대립유전자, 종 또는 스플라이스 변이체 내에 만들어질 수 있다.
a. 활성을 증가시키기 위한 변형
일 예에서, 제 X 인자를 향한 증가된 촉매 활성이 야기되도록 추가적인 변형이 본원에서 제공되는 변형된 제 IX 인자 폴리펩티드에 만들어질 수 있다. 예를 들어, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드가 FVIIIa에 대해 증가된 친화력을 가지도록,변형은 이것의 보조 인자, FVIIIa와의 상호작용과 관련된 아미노산에 만들어질 수 있고, 이로 인해 FVIIIa가 포화되지 않은 조건하에서 FX를 향한 증가된 활성을 나타낼 수 있다. 기질인 FX의 활성화에 있어서, 비변형된 FIXa 폴리펩티드 또는 FIXa/FVIIIa 복합체의 활성과 비교하여, FIXa 폴리펩티드 및/또는 FIXa/FVIIIa 복합체의 촉매 효율을 증가시키는 변형이 FIX 내에 만들어질 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 내재적 활성을 증가시키기 위한 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드에 포함될 수 있는 추가적인 변형의 예는 Hopfner 외, (1997) EMBO J. 16:6626-6635; Kolkman 외, (2000) Biochem . 39:7398-7405; Sichler 외, (2003) J. Biol . Chem . 278:4121-4126; Begbie 외, (2005) Thromb.Haemost. 94(6):1138-47; 미국 특허 번호 6531298 및 미국 특허 공개번호 20080167219 및 20080214461에 기술된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 변형된 FIX 폴리펩티드의 증가된 내재적 활성을 야기할 수 있는 당업계에 기술된 예시적인 아미노산 변형의 비-제한적인 예는 V86A, V86N, V86D, V86E, V86Q, V86G, V86H, V86I, V86L, V86M, V86F, V86S, V86T, V86W, V86Y, Y259F, A261K, K265T, E277V, E277A, E277N, E277D, E277Q, E277G, E277H, E277I, E277L, E277M, E277F, E277S, E277T, E277W, E277Y, R338A, R338V, R338I, R338F, R338W, R338S, R338T, Y345F, I383V, E388G의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 치환 Y259F/K265T, Y259F/K265T/Y345F, Y259F/A261K/K265T/Y345F, Y259F/K265T/Y345F/I383V/E388G 또는 Y259F/A261K/K265T/Y345F/I383V/E388G을 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 활성화 펩티드(△155-177)를 제거하는 변형을 함유할 수 있는데 (예컨대 Begbie 외, (2005) Thromb . Haemost . 94(6):1138-47 참조), 이러한 변형은 생체내에서 활성을 증가시키고 또한 제거율을 감소시킬 수 있다.
b. 인지질에 대한 결합력을 증가시키거나 콜라겐에 대한 결합을 감소시키기 위한 변형
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 인지질에 대한 친화력을 증가시키기 위한 하나 또는 그 이상의 추가적인 변형을 함유할 수 있다. FIX의 응혈 활성은 인지질, 예를 들어 활성화된 혈소판의 표면상에 발현된 것들(인지질)에 대한 폴리펩티드의 결합 및/또는 친화력을 증가시킴으로써 향상될 수 있다. 이는, 예를 들어, 내인성 FIX Gla 도메인을 변형시킴으로써 성취될 수 있다. 변형은, 포스파티딜세린 및 다른 음성적으로 대전된 인지질에 대한 증가된 결합능을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드를 야기하는 FIX 폴리펩티드의 Gla 도메인의 하나 또는 그 이상의 위치에서 아미노산 치환에 의해 영향을 받을 수 있다. 인지질 결합 및/또는 친화력을 증가시키고, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드에 만들어질 수 있는 추가적인 변형의 예는, 미국 특허 번호 6,017,882에 기술된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 위치 11, 12, 29, 33 및/또는 34(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는)에서의 하나 또는 그 이상의 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형의 예시는 아미노산 치환 K5I, K5L, K5F, K5E, Q11E, Q11D, R16E, R29F 및/또는 N34E, N34D, N34F, N34I, N34L, T35D 및 T35E이다.
또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 콜라겐에 대한 친화력을 감소시키기 위한 하나 또는 그 이상의 추가적인 변형을 함유할 수 있다. FIX의 응혈 활성은 내피세포상의 세포외 기질의 표면상에 존재하는 콜라겐 IV에 대한 폴리펩티드의 결합 및/또는 친화력을 감소시킴으로써 향상될 수 있다. 콜라겐 IV에 대한 감소된 결합은 변형된 FIX 폴리펩티드의 증가된 순환 및, 따라서, 생체내 증가된 응혈 활성을 야기할 수 있다. 이는, 예를 들어, 콜라겐 IV와의 상호작용에 책임이 있는 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 잔기 3 내지 11에서 FIX Gla 도메인을 변형시킴으로써 성취될 수 있다(Cheung 외, (1992) J. Biol . Chem. 267:20529-20531; Cheung 외, (1996) Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 93: 11068-11073). 변형은 콜라겐 IV에 대한 감소된 결합능을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드를 야기하는 FIX 폴리펩티드의 Gla 도메인 내의 하나 또는 그 이상의 위치에서의 아미노산 치환에 의해 이루어질 수 있다. 인지질 결합 및/또는 친화력을 증가시키고 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드에 만들어질 수 있는 추가적인 변형의 예는, Schuettrumpf 외, (2005) Blood 105(6):2316-23; Melton 외, (2001) Blood Coagul . Fibrinolysis 12(4):237-43; 및 Cheung 외, (1996) Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A . 93:11068-11073에 기술된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 치환 K5A 및/또는 V10K을 함유할 수 있다.
c. 저해제에 대한 내성을 증가시키기 위한 추가의 변형
추가적인 변형은 저해제에 대한 변형된 FIX 폴리펩티드의 내성을 증가시킴으로써, 예컨대, 예를 들어 항트롬빈 III(AT-III)/헤파린에 의한 저해에 의해, FIX 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 변형에 포함될 수 있다. 전형적으로, 이는 AT-III, 헤파린 또는 AT-III/헤파린 복합체와의 상호작용과 관련된 하나 또는 그 이상의 잔기를 변형시킴으로써 성취될 수 있다. 이러한 변형의 예시는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,125,841; 미국 특허 공개 번호 20040110675; 국제 특허 공개 번호 WO2002040544; Chang, J. 외, (1998) J. Biol . Chem . 273(20):12089-94; Yang, L. 외, (2002) J. Biol . Chem . 277(52):50756-60; Yang, L. 외, (2003) J. Biol . Chem. 278(27):25032-8; Rohlena 외, (2003) J. Biol . Chem . 278(11):9394-401; Sheehan 외, (2006) Blood 107(10):3876-82; Buyue 외, (2008) Blood 112:3234-3241에 기술된 것들을 포함한다. AT-III 및/또는 헤파린에 의한 저해를 감소시키기 위해 포함될 수 있는 변형의 비-제한적인 예는, 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드의 아미노산 위치 R252, H256, H257, K265, H268, K293, R318, R333, R338, K400, R403, K409 또는 K411에 상응하는 아미노산 위치에서의 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드는 아미노산 치환 R252A, H257A, H268A, K293A, R318A, R333A, R338A, K400A, R403A, R403E 및/또는 K411A을 함유할 수 있다.
d. 글리코실화를 변경하기 위한 추가의 변형
상기 기술된 것들 이외에, 변형은 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 변형된 FIX 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키기 위해 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 변형된 FIX 폴리펩티드 내로 하나 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 도입하는 하나 또는 그 이상의 변형을 함유할 수 있다. 그러므로, 적절한 시스템에서 발현되었을 때, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 변경된 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 글리코실화, 예컨대 증가된 N-글리코실화 또는 증가된 O-글리코실화를 나타낸다.
FIX 폴리펩티드의 글리코실화 프로파일을 변경시키기 위한 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는 추가적인 변형의 예는 국제 공개 출원 번호 WO2009130198, WO2009051717 및 WO2009137254에 기술된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 글리코실화를 증가시키기 위한 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는 예시적인 변형은, Y1N, Y1N + S3T, S3N + K5S/T, G4T, G4N + L6S/T, K5N + E7T, L6N + E8T, E7N + F9T, F9N +Q11S/T, V10N+G12S/T, Q11N + N13T, G12N + L14S/T, L14N + R16T, E15T, E15N + E17T; R16N +C18S/T, M19N + E21T; E20N + K22T, K22N, S24N + E26T; F25N + E27T; E26N + A28T; E27N + R29T; A28N + E30T; R29N+V31S/T, E30N + F32T; V31N + E33T; F32N + N34T, E33N, T35N + R37S/T, E36T; E36N; R37N, T39N + F41S/T, E40N + W42T, F41N + K43S/T, W42N +Q44S/T, K43N + Y45T; Q44N + V46S/T, Y45N + D47T, V46N +G48S/T, D47N + D49S/T, G48N + Q50S/T, D49N +C51S/T, Q50N + E52S/T, E52N + N54T, S53N + P55S/T, C56S/T, L57N + G59S/T, G59N + S61T; G60S/T, S61N + K63S/T, K63N + D65S/T, D65N + N67S/T, I66N + S68S/T, Y69S/T, Y69N +C71S/T, S68N + E70S/T, E70N+W72S/T, W72N + P74S/T, P74N+G76S/T, F75N, G76N + E78T, E78N + K80T, F77T, F77N+G79S/T, G79N + N81S/T, K80N+C82S/T, E83S/T, E83N + D85S/T, L84N+V86S/T, D85N, V86A, V86N +C88S/T, T87N+N89S/T, I90N + N92S/T, K91S/T, I90N + N92S/T, K91N + G93S/T, R94S/T, R94N + E96S/T, K100N, A103S/T, S102N + D104S/T, A103N + N105S/T, D104N + K106S/T, V107S/T, K106N+V108S/T, V108N+V110S/T, S111N, E113N+Y115S/T, G114N + R116S/T, R116N + A118S/T, E119N +Q121S/T, K122S/T, Q121N + S123S/T, K122N + C124S/T, S123N + E125S/T, E125N + A125S/T, P126N + V128S/T, A127N + P129T, V128N + F130S/T, P129N + P131S/T, F130N+C132S/T, R134N, V135N+V137S/T, S136N, S138N, V137N + Q139T; Q139N, T140N + L142S/T, S141N + L143S/T, K142N, A146N + A148S/T, E147N + V149S/T, T148N + F150S/T, V149N + P151S/T, F150N + D152S/T, P151N+V153S/T, D152N + D154S/T, V153N+Y155S/T, D154N+V156S/T, Y155N + N157S/T, V156N, S158N + E160S/T, T159N+A161S/T, E160N + E162S/T, A161N, E162N +I164S/T, T163N + L165S/T, I164N + D166S/T, L165N + N167S/T, D166N + I168S/T, I168N+Q170S/T, T169N, Q170N, S171N + Q173S/T, T172N, Q173N + F175S/T, S174N + N176S/T, F175N + D177S/T, F178S/T, D177N, D177E, F178N + R180S/T, T179N+V181S/T, R180N+V182S/T, G183 + E185S/T, G184N + D186T, E185N+A187S/T, D186N + K188S/T, A187N + P189T, K188N+G190S/T, P189N +Q181S/T, G200N + V202T, K201N + D203S/T, K201T, V202N+A204S/T, D203N + F205S/T, E213N +W215S/T, K214T, V223T, E224N + G226S/T, T225N+V227S/T, G226N + K228S/T, V227N + I229T, K228N, H236N + I238T; I238N + E240T; E239N, E240N + E242S/T, E242N, T241N + H243S/T, H243N + E245S/T, K247N + N249S/T, V250N + R252T, I251S/T, I251N + I253S/T, R252N + I254S/T, I253N + P255S/T, P255N + H257S/T, H257N + Y259S/T, N260S/T, A262S/T, A261N + I263S/T, A262N + N264S/T, I263N + K265S/T, K265N + N267S/T, A266N + H268S/T, D276N + P278S/T, P278N+V280S/T, E277N + L279S/T, V280N + N282S/T, Y284S/T, S283N+V285S/T, Y284N, D292N + K294S/T, K293N+Y295S/T, E294N, F299S/T, I298N + L300S/T, K301N+G303S/T, F302N, G303N +G305S/T, S304N+Y306S/T, Y306N +S308S/T, R312N + F314S/T, V313N + H315T, F314N + K316S/T, H315N + G317S/T, K316N + R138S/T, G317N, R318N+A320S/T, S319N + L321S/T, A320N + V322T, L321N + L323S/T, V322N+Q324S/T, Y325N + R327S/T, R327N + P329S/T, P329N+V331S/T, L330N + D332S/T, D332N + A334S/T, R333N, A334N + C336S/T, T335N + L337S/T, L337N, R338N, S339N + K341T, T340N + F342T; K341N, F342N + I344S/T, T343N + Y345S/T, Y345N + N347S/T, M348S/T, G352N + H354T, F353N, F353N + E355T, H354N + G356S/T, H354V, H354I, E355T, E355N+G357S/T, G356N + R358T, G357N + D359S/T, R358N, Q362N + D364S/T, V370N; T371V; T371I; E372T, E372N + E374S/T, E374N, G375N, W385N + E387T; G386N + E388T, E388N+A390S/T, A390N + K392T, M391N+G393S/T, K392N + K394S/T, K392V, G393T, G393N + Y395S/T, K394N + G396S/T, R403N + V405S/T, I408S/T, K409N + K411S/T, E410N, K411N + K413S/T, 및 K413N을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
e. 프로테아제에 대한 내성을 증가시키기 위한 변형
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 프로테아제에 대한 폴리펩티드의 증가된 내성을 야기하는 추가적인 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 잠재적인 단백분해 절단(cleavage) 부위를 제거하는 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 따라서 프로테아제에 대해 더욱 내성이 될 수 있어, 이에 의해 변형된 폴리펩티드의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있다.
프로테아제에 대한 내성을 증가시키기 위해 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는 추가적인 변형의 예는 미국 특허 공개 번호 20080102115 및 국제 공개 출원 번호 WO2007149406에 기술된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 프로테아제 내성을 증가시키기 위한 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는 예시적인 변형은, Y1H, Y1I, S3Q, S3H, S3N, G4Q, G4H, G4N, K5N, K5Q, L6I, L6V, E7Q, E7H, E7N, E8Q, E8H, E8N, F9I, F9V, V10Q, V10H, V10N, G12Q, G12H, G12N, L14I, L14V, E15Q, E15H, E15N, R16H, R16Q, E17Q, E17H, E17N, M19I, M19V, E20Q, E20H, E20N, E21Q, E21H, E21N, K22N, K22Q, S24Q, S24H, S24N, F25I, F25V, E26Q, E26H, E26N, E27Q, E27H, E27N, A28Q, A28H, A28N, R29H, R29Q, E30Q, E30H, E30N, V31Q, V31H, V31N, F32I, F32V, E33Q, E33H, E33N, T35Q, T35H, T35N, E36Q, E36H, E36N, R37H, R37Q, T38Q, T38H, T38N, T39Q, T39H, T39N, E40Q, E40H, E40N, F41I, F41V, W42S, W42H, K43N, K43Q, Y45H, Y45I, V46Q, V46H, V46N, D47N, D47Q, G48Q, G48H, G48N, D49N, D49Q, E52Q, E52H, E52N, S53Q, S53H, S53N, P55A, P55S, L57I, L57V, N58Q, N58S, G59Q, G59H, G59N, G60Q, G60H, G60N, S61Q, S61H, S61N, K63N, K63Q, D64N, D64Q, D65N, D65Q, I66Q, I66H, I66N, S68Q, S68H, S68N, Y69H, Y69I, E70Q, E70H, E70N, W72S, W72H, P74A, P74S, F75I, F75V, G76Q, G76H, G76N, F77I, F77V, E78Q, E78H, E78N, G79Q, G79H, G79N, K80N, K80Q, E83Q, E83H, E83N, L84I, L84V, D85N, D85Q, V86Q, V86H, V86N, T87Q, T87H, T87N, I90Q, I90H, I90N, K91N, K91Q, N92Q, N92S, G93Q, G93H, G93N, R94H, R94Q, E96Q, E96H, E96N, F98I, F98V, K100N, K100Q, S102Q, S102H, S102N, A103Q, A103H, A103N, D104N, D104Q, K106N, K106Q, V107Q, V107H, V107N, V108Q, V108H, V108N, S110Q, S110H, S110N, T112Q, T112H, T112N, E113Q, E113H, E113N, G114Q, G114H, G114N, Y115H, Y115I, R116H, R116Q, L117I, L117V, A118Q, A118H, A118N, E119Q, E119H, E119N, K122N, K122Q, S123Q, S123H, S123N, E125Q, E125H, E125N, P126A, P126S, A127Q, A127H, A127N, V128Q, V128H, V128N, P129A, P129S, P131A, P131S, G133Q, G133H, G133N, R134H, R134Q, V135Q, V135H, V135N, S136Q, S136H, S136N, V137Q, V137H, V137N, S138Q, S138H, S138N, T140Q, T140H, T140N, S141Q, S141H, S141N, K142N, K142Q, L143I, L143V, T144Q, T144H, T144N, R145H, R145Q, A146Q, A146H, A146N, E147Q, E147H, E147N, T148Q, T148H, T148N, V149Q, V149H, V149N, P151A, P151S, D152N, D152Q, V153Q, V153H, V153N, D154N, D154Q, Y155H, Y155I, V156Q, V156H, V156N, S158Q, S158H, S158N, T159Q, T159H, T159N, E160Q, E160H, E160N, A161Q, A161H, A161N, E162Q, E162H, E162N, T163Q, T163H, T163N, I164Q, I164H, I164N, L165I, L165V, L165Q, L165H, D166N, D166Q, I168Q, I168H, I168N, T169Q, T169H, T169N, S171Q, S171H, S171N, T172Q, T172H, T172N, S174Q, S174H, S174N, F175I, F175V, F175H, D177N, D177Q, F178I, F178V, F178H, T179Q, T179H, T179N, R180H, R180Q, V181Q, V181H, V181N, V182Q, V182H, V182N, G183Q, G183H, G183N, G184Q, G184H, G184N, E185Q, E185H, E185N, D186N, D186Q, A187Q, A187H, A187N, K188N, K188Q, P189A, P189S, G190Q, G190H, G190N, F192I , F192V, F192IH, P193A, P193S, W194S, W194H, W194I, V196Q, V196H, V196N, V197Q, V197H, V197N, L198I, L198V, L198Q, L198H, N199Q, N199S, G200Q, G200H, G200N, K201N, K201Q, V202Q, V202H, V202N, D203N, D203Q, A204Q, A204H, A204N, F205I, F205V, G207Q, G207H, G207N, G208Q, G208H, G208N, S209Q, S209H, S209N, I210Q, I210H, I210N, V211Q, V211H, V211N, E213Q, E213H, E213N, K214N, K214Q, W215S, W215H, I216Q, I216H, I216N, V217Q, V217H, V217N, T218Q, T218H, T218N, A219Q, A219H, A219N, A220Q, A220H, A220N, V223Q, V223H, V223N, E224Q, E224H, E224N, T225Q, T225H, T225N, G226Q, G226H, G226N, V227Q, V227H, V227N, K228N, K228Q, I229Q, I229H, I229N, T230Q, T230H, T230N, V231Q, V231H, V231N, V232Q, V232H, V232N, A233Q, A233H, A233N, G234Q, G234H, G234N, E235Q, E235H, E235N, I238Q, I238H, I238N, E239Q, E239H, E239N, E240Q, E240H, E240N, T241Q, T241H, T241N, E242Q, E242H, E242N, T244Q, T244H, T244N, E245Q, E245H, E245N, K247N, K247Q, R248H, R248Q, V250Q, V250H, V250N, I251Q, I251H, I251N, R252H, R252Q, I253Q, I253H, I253N, I254Q, I254H, I254N, P255A, P255S, Y259H, Y259I, A261Q, A261H, A261N, A262Q, A262H, A262N, I263Q, I263H, I263N, K265N, K265Q, Y266H, Y266I, D269N, D269Q, I270Q, I270H, I270N, A271Q, A271H, A271N, L272I, L272V, L273I, L273V, E274Q, E274H, E274N, L275I, L275V, D276N, D276Q, E277Q, E277H, E277N, P278A, P278S, L279I, L279V, V280Q, V280H, V280N, L281I, L281V, S283Q, S283H, S283N, Y284H, Y284I, V285Q, V285H, V285N, T286Q, T286H, T286N, P287A, P287S, I288Q, I288H, I288N, I290Q, I290H, I290N, A291Q, A291H, A291N, D292N, D292Q, K293N, K293Q, E294Q, E294H, E294N, Y295H, Y295I, T296Q, T296H, T296N, I298Q, I298H, I298N, F299I, F299V, L300I, L300V, K301N, K301Q, F302I, F302V, G303Q, G303H, G303N, S304Q, S304H, S304N, G305Q, G305H, G305N, Y306H, Y306I, V307Q, V307H, V307N, S308Q, S308H, S308N, G309Q, G309H, G309N, W310S, W310H, G311Q, G311H, G311N, R312H, R312Q, V313Q, V313H, V313N, F314I, F314V, K316N, K316Q, G317Q, G317H, G317N, R318H, R318Q, S319Q, S319H, S319N, A320Q, A320H, A320N, L321I, L321V, V322Q, V322H, V322N, L323I, L323V, Y325H, Y325I, L326I, L326V, R327H, R327Q, V328Q, V328H, V328N, P329A, P329S, L330I, L330V, V331Q, V331H, V331N, D332N, D332Q, R333H, R333Q, A334Q, A334H, A334N, T335Q, T335H, T335N, L337I, L337V, R338H, R338Q, S339Q, S339H, S339N, T340Q, T340H, T340N, K341N, K341Q, F342I, F342V, T343Q, T343H, T343N, I344Q, I344H, I344N, Y345H, Y345I, M348I, M348V, F349I, F349V, A351Q, A351H, A351N, G352Q, G352H, G352N, F353I, F353V, E355Q, E355H, E355N, G356Q, G356H, G356N, G357Q, G357H, G357N, R358H, R358Q, D359N, D359Q, S360Q, S360H, S360N, G363Q, G363H, G363N, D364N, D364Q, S365Q, S365H, S365N, G366Q, G366H, G366N, G367Q, G367H, G367N, P368A, P368S, V370Q, V370H, V370N, T371Q, T371H, T371N, E372Q, E372H, E372N, V373Q, V373H, V373N, E374Q, E374H, E374N, G375Q, G375H, G375N, T376Q, T376H, T376N, S377Q, S377H, S377N, F378I, F378V, L379I, L379V, T380Q, T380H, T380N, G381Q, G381H, G381N, I382Q, I382H, I382N, I383Q, I383H, I383N, S384Q, S384H, S384N, W385S, W385H, G386Q, G386H, G386N, E387Q, E387H, E387N, E388Q, E388H, E388N, A390Q, A390H, A390N, M391I, M391V, K392N, K392Q, G393Q, G393H, G393N, K394N, K394Q, Y395H, Y395I, G396Q, G396H, G396N, I397Q, I397H, I397N, Y398H, Y398I, T399Q, T399H, T399N, K400N, K400Q, V401Q, V401H, V401N, S402Q, S402H, S402N, R403H, R403Q, Y404H, Y404I, V405Q, V405H, V405N, W407S, W407H, I408Q, I408H, I408N, K409N, K409Q, E410Q, E410H, E410N, K411N, K411Q, T412Q, T412H, T412N, K413N, K413Q, L414I, L414V, T415Q, T415H, 및 T415N (번호매김은 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응함)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
f. 면역원성을 감소시키기 위한 변형
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드에 대한 추가적인 변형은 단백질로부터 하나 또는 그 이상의 T 세포 에피토프의 활성에 있어서의 상당한 감소 또는 제거, 즉 폴리펩티드의 탈면역화를 야기하는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 변형을 포함할 수 있다. 임의의 MHC 클래스 II 리간드 내의 특정한 위치에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형은 대상체, 예컨대 인간 대상체에 치료제로서 투여될 때 감소된 면역원성을 갖는 탈면역화된 FIX 폴리펩티드를 야기할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20040254107에 개시된 임의의 하나 또는 그 이상의 변형은 면역원성을 감소시키기 위한 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다.
FIX 폴리펩티드의 감소된 면역원성에 기여할 수 있는 예시적인 아미노산 변형은 다음 변형의 임의의 하나 또는 그 이상에 상응하는 임의의 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함한다: Y1A, Y1C, Y1D, Y1E, Y1G, Y1H, Y1K, Y1N, Y1P, Y1Q, Y1R, Y1S, Y1T, S3T, L6A, L6C, L6D, L6E, L6G, L6H, L6K, L6N, L6P, L6Q, L6R, L6S, L6T, L6M, F9A, F9C, F9D, F9E, F9G, F9H, F9K, F9N, F9P, F9Q, F9R, F9S, F9T, F9I, F9M, F9W, V10A, V10C, V10D, V10E, V10G, V10H, V10K, V10N, V10P, V10Q, V10R, V10S, V10T, V10F, V10I, V10M, V10W, V10Y, Q11A, Q11C, Q11G, Q11P, G12D, G12E, G12G, G12H, G12K, G12N, G12P, G12Q, G12R, G12S, G12T, N13A, N13C, N13G, N13H, N13P, N13T, L14A, L14C, L14D, L14E, L14G, L14H, L14K, L14N, L14P, L14Q, L14R, L14S, L14T, L14F, L14I, L14M, L14V, L14W, L14Y, E15D, E15H, E15P, R16A, R16C, R16G, R16P, R16T, E17A, E17C, E17G, E17P, E17T, C18D, C18E, C18G, C18H, C18K, C18N, C18P, C18Q, C18R, C18S, C18T, M19A, M19C, M19D, M19E, M19G, M19H, M19K, M19N, M19P, M19Q, M19R, M19S, M19T, M19F, M19I, M19M, M19V, M19W, M19Y, E20A, E20C, E20G, E20P, E20T, E21A, E21C, E21G, E21P, K22H, K22P, K22T, S24H, S24P, F25A, F25C, F25D, F25E, F25G, F25H, F25K, F25N, F25P, F25Q, F25R, F25S, F25T, F25I, F25M, F25W, F25Y, E26A, E26C, E26G, E26P, E27A, E27C, E27G, E27H, E27P, E27S, E27T, A28C, A28D, A28E, A28G, A28H, A28K, A28N, A28P, A28Q, A28R, A28S, A28T, R29A, R29C, R29G, R29P, E30D, E30H, E30P, V31A, V31C, V31D, V31E, V31G, V31H, V31K, V31N, V31P, V31Q, V31R, V31S, V31T, V31F, V31I, V31W, V31Y, F32A, F32C, F32D, F32E, F32G, F32H, F32K, F32N, F32P, F32Q, F32R, F32S, F32T, E33H, E33N, E33P, E33Q, E33S, E33T, T35A, T35C, T35G, T35P, F41A, F41C, F41D, F41E, F41G, F41H, F41K, F41N, F41P, F41Q, F41R, F41S, F41T, F41M, F41W, F41Y, W42A, W42C, W42D, W42E, W42G, W42H, W42K, W42N, W42P, W42Q, W42R, W42S, W42T, K43A, K43C, K43G, K43P, Q44P, Q44T, Q44, Y45A, Y45C, Y45D, Y45E, Y45G, Y45H, Y45K, Y45N, Y45P, Y45Q, Y45R, Y45S, Y45T, V46A, V46C, V46D, V46E, V46G, V46H, V46K, V46N, V46P, V46Q, V46R, V46S, V46T, V46F, V46I, V46M, V46W, V46Y, D47A, D47C, D47G, D47H, D47P, D47T, G48D, G48E, G48P, G48T, D49H, D49P, D49Q, D49T, Q50A, Q50C, Q50D, Q50G, Q50H, Q50P, Q50T, C51D, C51E, C51G, C51H, C51K, C51N, C51P, C51Q, C51R, C51S, C51T, E52P, E52T, S53A, S53C, S53G, S53H, S53P, S53T, N54H, N54P, N54T, L57A, L57C, L57D, L57E, L57G, L57H, L57K, L57N, L57P, L57Q, L57R, L57S, L57T, L57F, L57I, L57M, L57W, L57Y, G60C, G60D, G60H, G60P, G60T, C62D, C62H, C62P, K63T, D65H, D65T, I66A, I66C, I66D, I66E, I66G, I66H, I66K, I66N, I66P, I66Q, I66R, I66S, I66T, I66M, I66W, I66Y, Y69A, Y69C, Y69D, Y69E, Y69G, Y69H, Y69K, Y69N, Y69P, Y69Q, Y69R, Y69S, Y69T, C71H, C71P, W72A, W72C, W72D, W72E, W72G, W72H, W72K, W72N, W72P, W72Q, W72R, W72S, W72T, W72I, W72Y, F75A, F75C, F75D, F75E, F75G, F75H, F75K, F75N, F75P, F75Q, F75R, F75S, F75T, F77A, F77C, F77D, F77E, F77G, F77H, F77K, F77N, F77P, F77Q, F77R, F77S, F77T, L84A, L84C, L84D, L84E, L84G, L84H, L84K, L84N, L84P, L84Q, L84R, L84S, L84T, L84M, L84W, L84Y, V86A, V86C, V86D, V86E, V86G, V86H, V86K, V86N, V86P, V86Q, V86R, V86S, V86T, I90A, I90C, I90D, I90E, 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Y115G, Y115H, Y115K, Y115N, Y115P, Y115Q, Y115R, Y115S, Y115T, Y115M, Y115W, R116P, R116T, L117A, L117C, L117D, L117E, L117G, L117H, L117K, L117N, L117P, L117Q, L117R, L117S, L117T, A118D, A118E, A118H, A118K, A118N, A118P, A118Q, A118R, A118S, A118T, N120D, N120H, N120P, Q121T, S123H, S123T, V128A, V128C, V128D, V128E, V128G, V128H, V128K, V128N, V128P, V128Q, V128R, V128S, V128T, F130A, F130C, F130D, F130E, F130G, F130H, F130K, F130N, F130P, F130Q, F130R, F130S, F130T, V135A, V135C, V135D, V135E, V135G, V135H, V135K, V135N, V135P, V135Q, V135R, V135S, V135T, V135W, V135Y, V137A, V137C, V137D, V137E, V137G, V137H, V137K, V137N, V137P, V137Q, V137R, V137S, V137T, V137M, V137W, V137Y, S138H, S138T, T140D, T140H, S141T, K142H, K142P, L143A, L143C, L143D, L143E, L143G, L143H, L143K, L143N, L143P, L143Q, L143R, L143S, L143T, L143F, L143I, L143M, L143V, L143W, L143Y, R145H, R145P, R145T, A146P, A146T, T148H, T148P, V149A, V149C, V149D, V149E, V149G, V149H, V149K, V149N, V149P, V149Q, V149R, 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K411A, K411C, K411G, K411I, K411P, K411T, K411V, K411W, K411Y 또는 K413T, 서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는 번호매김을 가짐.
g. 조합 변형의 예
본원에서 비변형된 FIX 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 성질 또는 활성에 영향을 주도록 설계된 두 개 또는 그 이상의 변형을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드가 제공된다. 일부 예에서, 두 개 또는 그 이상의 변형이 FIX 폴리펩티드의 두개 또는 그 이상의 성질 또는 활성을 변경한다. 변형은 글리코실화, AT-III에 대한 내성, AT-III/헤파린에 대한 내성, 헤파린에 대한 내성, 촉매 활성, LRP에 대한 결합, 내재적 활성, 인지질 결합 및/또는 친화력, 프로테아제에 대한 내성, 반감기 및 FVIIIa 및 FX와 같은 다른 인자 또는 분자와의 상호작용의 하나 또는 그 이상이 변경되도록 만들어질 수 있다. 전형적으로, 최종적인 변형된 FIX 폴리펩티드가 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성, 응혈 활성의 증가된 지속, 및/또는 향상된 치료 지수를 갖도록 두 개 또는 그 이상의 변형이 조합된다. 변형은 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 두 개 또는 그 이상의 변형을 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드의 증가된 응혈 활성, 응혈 활성의 증가된 지속, 및/또는 향상된 치료 지수는 출발 또는 비변형된 FIXa 폴리펩티드의 활성과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상만큼 증가될 수 있다.
하나, 두 개 또는 그 이상의 활성 또는 성질을 변경시키기 위한 비변형된 FIX 폴리펩티드 내로 도입되는 두 개 또는 그 이상의 변형을 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 예컨대 위치 203에 비-천연 글리코실화를 도입하기 위한 아미노산 치환 D203N 및 F205T과 같은, 비-천연 글리코실화 부위를 1차 서열 내로 혼입함으로써 글리코실화를 증가시키기 위한 변형, 및 R338E(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는 잔기)와 같은 AT-III/헤파린에 대한 내성을 증가시키기 위한 변형을 함유할 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 표 3-9에 기재되는 것들로부터만 선택된 두 개 또는 그 이상의 변형을 가질 수 있다. 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 변형된 FIX 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 변형은 표 3-9에 기재되는 것들로부터 선택되고 하나 또는 그 이상의 변형은 표 3-9에 기재되지 않는 추가적인 변형, 예컨대 예를 들어 당업계에 기술된 변형인, 두 개 또는 그 이상의 변형을 함유한다. 일부 예에서, 하나 또는 그 이상의 추가적인 변형은 상기 섹션 D.3.a-f에 기재되는 것들, 예컨대 증가된 촉매 활성, 저해제에 대한 증가된 내성, 혈소판 및 인지질에 대한 증가된 친화력 및/또는 결합, 증가된 프로테아제 내성, 감소된 면역원성을 야기하는 것들, 및 PEG 모이어티와 같은 모이어티에 대한 컨주게이션을 용이하게 하는 것들로부터 선택될 수 있다.
표 10에서 비-제한적 예시 조합 변형이 제공된다. 이들 예시적 조합 변형은 AT-III에 대한 증가된 내성, AT-III/헤파린에 대한 증가된 내성, 헤파린에 대한 증가된 내성, 증가된 촉매 활성 및 변경된 글리코실화를 포함하나 이에 제한되지 않는 FIX 폴리펩티드의 두 개 또는 그 이상의 활성 또는 성질을 변경하도록 설계된 두 개 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 이러한 조합 변형을 함유하는 변형된 FIX 폴리펩티드는 증가된 응혈 활성, 응혈 활성의 증가된 지속, 및/또는 향상된 치료 지수를 가질 수 있다. 하기 표 10에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열식별자(서열번호)가 확인된다.
표 10.
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Figure 112017042341398-pat00014
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3. 컨주게이트 및 융합 단백질
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드 또는 중합체와 같은 다른 모이어티와 컨주게이션되거나 융합될 수 있다. 일부 예에서, 컨주게이션 또는 융합은 혈청 반감기를 증가시키도록 이루어질 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드에 융합될 수 있는 예시적인 폴리펩티드는, 혈청 알부민, Fc, FcRn 및 트랜스페린(예컨대, Sheffield, W.P. 외, (2004) Br. J. Haematol. 126(4):565-73; 미국 특허 공개 번호 20050147618; 국제 특허 공개 번호 WO2007112005 및 WO2004101740 참조)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜(페길화(PEG)) 또는 시알릴 모이어티와 같은 중합체, 또는 천연 또는 당 중합체와 같은 다른 이러한 중합체에 컨주게이션될 수 있다. 일 예에서, 폴리펩티드는 다른 문헌(Zambaux 외, (1998) J. Protein Chem. 17(3):279-84)에 기술된 바와 같은, 덱스트란에 컨주게이션된다. PEG 또는 PEG 유도체의 공유결합적 부착(컨주게이션)에 의한 폴리펩티드의 변형(즉, "페길화(PEGylation)")의 다양한 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대 US20060104968, US5672662, US6737505 및 US 20040235734 참조). 페길화를 위한 기술은, 특수화된 링커 및 커플링 화학(예컨대 Harris, Adv . Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002 참조), 다중의 PEG 모이어티의 단일 컨주게이션 부위에 대한 부착(예컨대 분지화된 PEG의 사용을 통해서; 예컨대 Veronese 외, Bioorg. Med . Chem . Lett . 12:177-180, 2002 참조), 부위-특이적 페길화 및/또는 모노-페길화(예컨대 Chapman 외, Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조), 부위-지향성(site-directed) 효소적 페길화(예컨대 Sato, Adv . Drug Deliv . Rev., 54:487-504, 2002 참조), 및 당페길화(미국 특허 공개 번호 20080050772, 20080146494, 20080050772, 20080187955 및 20080206808)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 당업계에 기술된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생산할 수 있다(예컨대 미국 2006/0104968 참조). 그러므로, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 미국 특허 번호 5,969,040, 5,621,039, 6,423,826, 미국 특허 공개 번호 20030211094, 20070254840, 20080188414, 2008000422, 20080050772, 20080146494, 20080050772, 20080187955 및 20080206808, 국제 특허 공개 번호 WO2007112005, WO2007135182, WO2008082613, WO2008119815, WO2008119815에 기술된 것과 같은 임의의 방법을 사용하여, 당페길화를 포함하여 페길화될 수 있다.
일부 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 또 다른 모이어티에 대한 컨주게이션을 용이하게 하는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 중합체에 대한 컨주게이션이 용이하게 하도록 시스테인 잔기는 FIX 폴리펩티드 내에 혼입될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적인 아미노산 치환 변형은 D47C, Q50C, S53C, L57C, I66C, N67C, S68C, E70C, W72C, P74C, K80C, L84C, V86C, N89C, I90C, K91C, R94C, K100C, N101C, S102C, A103C, D104C, N105C, K106C, V108C, E114C, R116C, E119C, N120C, Q121C, S123C, E125C, P129C, S138C, T140C, S141C, K142C, A146C, E147C, E162C, T163C, I164C, L165C, D166C, N167C, I168C, T169C, Q170C, S171C, T172C, Q173C, S174C, F175C, N176C, D177C, F178C, T179C, R180C, E185C, D186C, K188C, P189C, K201C, V202C, D203C, E224C, T225C, K228C, E239C, E240C, T241C, H243C, K247C, N249C, R252C, H257C, N260C, A261C, A262C, I263C, K265C, E277C, F314C, R318C, L321C, K341C, E372C, E374C, M391C, K392C, N406C, K413C 및 T415C(서열번호 3으로 기재되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에 상응하는)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
E. FIX 폴리펩티드의 제조
FIX의 변형된 FIX 폴리펩티드, 또는 이의 도메인을 포함하는 FIX 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현에 대해 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 희망되는 유전자를 암호화하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 당업계에 이용가능한 임의의 방법이 예컨대 세포 또는 조직 공급원으로부터, 예컨대 예를 들어, 간으로부터의, FIX 폴리펩티드 또는 기타 비타민-K 폴리펩티드를 암호화하는 전장(즉, 전체 코딩 영역을 아우르는) cDNA 또는 지노믹 DNA 클론을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 본원에 기술되는 바와 같이, 예컨대 부위-지향성 돌연변이 생성에 의해 조작될 수 있다.
FIX는 핵산 분자를 클로닝 및 분리하기 위한 당업계에 알려진 임의의 이용가능한 방법을 사용하여 클로닝 또는 분리될 수 있다. 이러한 방법은 핵산의 PCR 증폭 및 핵산 혼성 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함하는라이브러리의 스크리닝을 포함한다.
핵산의 증폭을 위한 방법은 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 분리하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함한다. 핵산 함유 물질은 FIX-암호화 핵산 분자가 분리될 수 있는 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포 추출물, 조직 추출물(예컨대 간으로부터), 액체 시료(예컨대 혈액, 혈청, 타액), 건강 및/또는 병적 대상체로부터의 시료가 증폭 방법에서 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발 물질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 프라이머는 FIX-암호화 분자를 증폭하기 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 FIX가 생성되는 것으로부터 발현된 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 프라이머는 FIX 아미노산 서열의 역-번역(back-translation)에 기초하여 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성되는 핵산 분자는 시퀀싱될 수 있고 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 확인될 수 있다.
추가적인 뉴클레오티드 서열이 벡터, 예를 들어 단백질 발현 벡터 또는 핵심 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 증폭을 위해 디자인된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적을 위해 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커 서열을 포함하는 FIX-암호화 핵산 분자에 결합될 수 있다.
더 나아가, 기능적 DNA 요소를 특정하는추가적인 뉴클레오티드 서열은 FIX-암호화 핵산 분자에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는, 세포내 단백질 발현을 용이하게 하도록 설계된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하도록 설계된 분비 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단백질 결합 영역을 특정하는 서열과 같은 추가적인 뉴클레오티드 서열도 또한 FIX-암호화 핵산 분자에 연결될 수 있다. 이러한 영역은 특이적인 표적 세포 내로 FIX의 흡수를 용이하게 하기 위한 서열, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자의 약동학을 향상시키기 위한 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
확인되고 분리된 핵산은 적절한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 다수의 벡터-숙주 시스템이 사용될 수 있다. 잠재적인 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않으나, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 반드시 양립가능해야만 한다. 이러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jol1a, CA)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 클로닝 벡터의 삽입은, 예를 들어, DNA 단편을 상보적인 접착성 말단을 갖는 클로닝 벡터 내로 라이게이션함으로써 성취될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 이루어질 수 있다. 만약 클로닝 벡터 내에 DNA를 단편화할 상보적 제한 부위가 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 희망되는 임의의 부위가 뉴클레오티드 서열(링커)을 DNA 말단에 라이게이션함으로써 생산될 수 있다; 이들 라이게이션된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 암호화하는 특이적인 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안적인 방법에서, 절단된 벡터 및 FIX 단백질 유전자는 동중합적 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 유전자 서열의 다수 복제물이 생성되도록, 숙주 세포 내로, 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 및 초음파천공을 통해 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, 분리된 FIX 단백질 유전자, cDNA, 또는 합성된 DNA 서열의을 혼입하는 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환하는 것은 유전자의 복수의 카피의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 유전자는 형질전환체를 성장시키고, 재조합 DNA 분자를 형질전환체로부터 분리하고, 필요시, 삽입된 유전자를 분리된 재조합 DNA로부터 회수함으로써, 대량으로 수득될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 또는 그 이상의 FIX 단백질의 재조합 발현을 위하여, FIX 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 부분을 함유하는 핵산이 적절한 발현 벡터, 즉, 삽입되는 단백질 암호화 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 구성요소(element)를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 벡터의 예는 임의의 포유동물 발현 벡터, 예컨대, 예를 들어, pCMV이다. 필요한 전사 및 번역 시그널은 또한 FIX 유전자를 위한 천연(native) 프로모터, 및/또는 그들의 인접 영역(flanking region)들에 의해 공급될 수 있다.
또한, FIX 또는 변형된 FIX를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵생물 및 원핵생물 세포를 포함하고, 벡터는 본원에 사용되기에 적합한 임의의 벡터이다.
벡터를 함유하는, 내피 세포(endothelial cell)를 포함한 원핵생물 및 진핵생물 세포가 제공된다. 이러한 세포는 세균 세포, 효모 세포, 진균 세포, 아르키아(Archea), 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함한다. 상기 기술된 세포를, 암호화된 FIX 단백질이 상기 세포에 의해 발현되는 조건하에서 성장시키고, 발현된 FIX 단백질을 수거함으로써, FIX 또는 이의 변형된 FIX 단백질을 생산하는데 사용한다. 본원의 목적하에, FIX는 배지내로 분비될 수 있다.
일 구현예에서, FIX 활성을 갖고, FIX 폴리펩티드의 모두 또는 일부를 함유하는 핵산의 서열, 또는 이의 다중 카피를 함유하는 벡터가 제공된다. 또한, 상기 벡터는 세포 내에서 FIX 폴리펩티드 또는 이의 변형된 FIX 폴리펩티드를 발현되도록 또는 FIX 단백질이 분비 단백질로서 발현되도록 선택될 수 있다. FIX가 발현될 때, 핵산은 분비 시그널, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) α-교배 인자(mating factor) 시그널 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산, 또는 천연(native) 시그널 서열에 연결되어 있다.
다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 암호화 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예를 들어, 백시니아(vaccinia) 바이러스, 아데노바이러스 및 기타 바이러스)로 감염된 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물; 또는 박테리오파아지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현 요소는 그들의 강도 및 특이성에 있어 다양하다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소 중 어느 하나의 것이 사용될 수 있다.
벡터에 DNA 단편을 삽입하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법은 적절한 전사/번역 조절 시그널 및 단백질 암호화 서열을 함유하는 키메라 유전자를 함유하는 발현 벡터의 작제에 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA와 합성 기술 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. FIX 폴리펩티드 또는 변형된 FIX 폴리펩티드, 또는 이의 도메인, 유도체, 단편 또는 동족체(homolog)를 암호화하는 핵산 서열은 상기 유전자 또는 이의 단편들이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현되도록 제2 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 FIX 단백질의 유전자들에 대해 천연적이지 않다. 사용될 수 있는 프로모터는 SV40 초기 프로모터 (Bernoist and Chambon, Nature 290: 304-310(1981)), 라우스 육종 바이러스의 3' 장쇄 말단 반복체 내에 함유된 프로모터 (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); 원핵 발현 벡터, 예컨대, 베타-락타마제 프로모터 (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); 문헌 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980)에 기재된 것들 참조; 노팔린 신타제 프로모터를 함유하는 식물 발현 벡터 (Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) 또는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카복실라제의 프로모터 (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); 효모 및 기타 진균류로부터의 프로모터 요소, 예컨대, Gal4 프로모터, 알콜 탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼린 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 형질전환 동물내에서 사용되어온 하기 동물 전사 조절 영역: 췌장 선포 세포내에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역 (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역 (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), 림프양세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프양세포 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 조절 영역 (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역 (Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역 (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), 골수 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역 (Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), 근섬유에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Sani, Nature 314:283-286 (1985)), 및 시상하부의 고나도트로프에서 활성인 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, FIX 폴리펩티드 또는 변형된 FIX 폴리펩티드, 또는 이의 도메인, 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 결합된 프로모터, 하나 이상의 복제 오리진(origins of replication), 및 임의로, 하나 이상의 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. FIX 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터 및 시스템은 널리 공지된 피치아 벡터(예를 들면, Invitrogen, San Diego, CA에서 입수가능), 특히 암호화된 단백질의 분비를 위해 디자인된 것들을 포함한다. 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 예시적 플라스미드 벡터로는 예컨대 pCMV가 포함된다. 이.콜라이(E. coli) 세포의 형질전환을 위한 예시적 플라스미드 벡터로는, 예를 들면, pQE 발현 벡터 (Qiagen, Valencia, CA; 당해 시스템을 기술하는 Qiagen 발간된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는, 이.콜라이 내에서 재조합 단백질의 엄격하게 조절된 고수준 발현을 제공하는 파아지 T5 프로모터 (이.콜라이 RNA 폴리머라제에 의해 인지됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제 모듈, 효율적 번역을 위한 합성 리보솜 결합 부위(RBS II), 6XHis 태그 암호화 서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, 복제의 ColE1 오리진, 및 앰피실린 내성을 부여하기 위한 베타-락타마제 유전자를 갖는다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C- 말단 어느 하나에 6xHis 태그의 배치를 가능케 한다. 이러한 플라스미드에는 pQE 32, pQE 30, 및 pQE 31을 포함하며, 이는 모든 세개의 판독 프레임에 대한 다중 클로닝 부위를 제공하고 N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 위해 제공된다. 이.콜라이 세포의 형질전환을 위한 다른 예시적 플라스미드 벡터에는, 예를 들면, pET 발현 벡터 (미국 특허 제4,952,496호 참조; NOVAGEN, Madison, WI에서 입수가능; 당해 시스템을 기술하는 Novagen 간행 문헌 또한 참조)를 포함한다. 이러한 플라스미드에는, T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 이.콜라이 lac 오퍼레이터, 및 lac 리프레서 유전자를 함유하는 pET 11a; T7 프로모터, T7 터미네이터, 및 이.콜라이 ompT 분비 시그널을 함유하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼으로 정제하는데 사용하기 위한 His-TagTM 리더 서열, 컬럼 상에서 정제 후 절단시킬 수 있는 트롬빈 절단 부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 터미네이터를 함유하는, pET15b 및 pET19b (NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
2. 발현 시스템
FIX 폴리펩티드(변형된 및 비변형된)는 시험관내 및 생체내 방법을 비롯한 단백질 생산을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있으며, 그 예로는 FIX를 암호화하는 핵산 분자의 숙주 세포, 숙주 동물 내로의 도입 및 시험관내 FIX를 암호화하는 핵산 분자로부터의 발현이 포함된다. FIX 및 변형된 FIX 폴리펩티드는 투여 및 치료에 필요한 FIX 폴리펩티드의 필요한 함량 및 형태를 생산하는데 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주는 원핵생물 및 진핵생물 유기체, 예컨대, 이.콜라이, 효모, 식물, 곤충 세포, 인간세포주 및 형질전환 동물(transgenic animal)을 포함하는 포유동물 세포를 포함한다. 발현 숙주는 그들의 단백질 생산 수준뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역후 변형의 종류가 다를 수 있다. 발현 숙주의 선택은 이러한 인자 및 기타 인자들, 예컨대 조절 및 안전성 문제, 생산비용 및 정제의 필요와 방법 등을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
진핵생물 숙주에서의 발현은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리아(Pichia pastoria)와 같은 효모, 드로소필라 세포 및 레피도프테란 세포와 같은 곤충 세포, 담배, 옥수수, 쌀, 조류(algae) 및 렘나(lemna)와 같은 식물 및 식물 세포에서의 발현을 포함할 수 있다. 발현용 진핵생물 세포로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 어린 햄스터 신장(BHK) 세포와 같은 포유동물 세포주도 또한 포함한다. 진핵생물 발현 숙주는 또한 형질전환 동물에서의 생산, 예컨대 혈청, 젖 및 난(egg)에서의 생산을 포함한다. 야생형 FIX 폴리펩티드를 생산하기 위한 형질전환 동물은 당업계에 공지되어 있고(미국 특허 공개번호 2002-0166130호 및 2004-0133930호) 본원의 변형된 FIX 폴리펩티드의 생산을 위해 개조될 수 있다.
FIX의 발현을 위해 당업자에게 공지되어 있고 많은 발현 벡터들이 이용가능하다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받는다. 이러한 선택은 당업자의 기술 수준 안에 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터 및 임의로 인핸서, 번역 시그널 및 전사 및 번역 종결 시그널을 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 허용하는 선별 마커를 가진다. 일부 경우에, 복제 오리진은 세포에서 벡터의 카피수를 증폭시키는데 사용될 수 있다.
FIX 또는 변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 단백질 융합체로서 사용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 융합은 폴리펩티드에 추가의 기능성을 부가하기 위해 생성될 수 있다. 융합 단백질의 예로는, 시그널 서열, 국재화(localization) 등을 위한 태그, 예컨대 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그, 예컨대 GST 융합, 및 단백질 분비 및/또는 막 연합의 유도용 서열을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
일 구현예에서, FIX 폴리펩티드 또는 변형된 FIX 폴리펩티드는 활성형으로 발현될 수 있고,이로써 활성화는 분비 후 폴리펩티드 활성화된 제 XI 인자(polypeptide activated factor XI; FXIa)의 배양에 의해 달성된다. 다른 예에서, 프로테아제는 불활성 자이모겐 형태로 발현된다.
FIX 폴리펩티드의 생산 방법은 FIX 폴리펩티드의 생산에 도움을 줄 수 있는 하나 이상의 추가의 이종(heterologous) 폴리펩티드의 공동발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩티드는 FIX의 번역후 프로세싱에 기여할 수 있다. 폴리펩티드의 예로는 폴리펩티드 서열과 같은 FIX 전구체 서열의 절단에 도움을 주는 펩티다제, 및 글리코실화, 하이드록실화, 카르복실화 또는 인산화와 같은 FIX 폴리펩티드의 변형에 관여하는 효소를 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. FIX와 함께 공동발현될 수 있는 예시적 펩티다제는 FIX 프로펩티드 서열의 절단을 돕는 PACE/푸린(또는 PACE-SOL)이다. FIX 폴리펩티드의 카르복실화에 도움을 주는 단백질의 예는 비타민 K 의존적 γ-카르복실라제에 의한 보조인자로서 이용되는 환원된 비타민 K를 생산하는 와파린-감수성 효소 비타민 K 23-에폭사이드 리덕타제(VKOR)이다(Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36) 31603-31607). 이 효소의 서브유닛, VKORC1은 변형 FIX 폴리펩티드와 공동발현되어 γ-카르복실화를 증가시킬 수 있다. 하나 이상의 추가의 폴리펩티드는 FIX 폴리펩티드와 동일한 발현 벡터로부터 또는 다른 벡터로부터 발현될 수 있다.
a. 원핵생물세포 발현
원핵생물, 특히 이.콜라이는 다량의 FIX를 생산하는 시스템을 제공한다(예를 들어, Platis et al.(2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30; 및 Khalizzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69 참조). 이.콜라이의 형질전환은 당업자에게 공지된 간단하고 신속한 기술이다. 이.콜라이를 위한 발현 벡터는 숙주 세포에 약간의 독성을 나타내는 단백질의 발현 및 높은 수준의 단백질 발현의 유도에 유용한 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절 λPL 프로모터를 포함한다.
FIX는 이.콜라이의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 세포질은 환원성 환경이고, 이것은 일부 분자에 대해 불용성 봉입체의 형성을 초래할 수 있다. 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올과 같은 환원제 및 변성제(예를 들어, 예컨대, 구아니딘-HCl 및 우레아)는 단백질의 재용해에 사용될 수 있다. 대안적인 시도는, 산화 환경과 샤페로닌(chaperonin) 유사 및 이황화 이소머라제를 제공하여 가용성 단백질의 생산을 야기하는 세균의 주변세포질 공간에서의 FIX의 발현이다. 전형적으로, 리더 서열은 단백질을 주변세포질 공간으로 유도하는, 발현될 단백질에 융합된다. 그 다음, 리더는 주변세포질 내의 시그널 펩티다제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적화 리더 서열의 예로는 펙테이트 리아제 유전자 유래의 pelB 리더 및 알칼리 포스파타제 유전자 유래의 리더를 포함한다. 일부 경우에, 주변세포질 발현은 발현된 단백질의 배양 배지로의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 빠르고 간단히 정제할 수 있게 한다. 분비되지 않은 단백질은 주변세포질로부터 삼투 용해에 의한 수득할 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우에 단백질은 불용성이 될 수 있고, 가용화 및 리폴딩을 촉진하기 위해 변성제와 환원제를 사용할 수 있다. 또한, 유도 및 성장 온도는 발현 수준 및 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 25℃ 내지 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 또한, 발현 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 돌연변이를 사용할 수도 있다. 전형적으로, 세균은 아글리코실화(비당화) 단백질을 생산한다. 따라서, 본원에서 제공되는 과글리코실화된(과당화된) FIX 폴리펩티드의 생산을 위하여, 글리코실화는 숙주 세포로부터 정제 후에 시험관내에서 부가될 수 있다.
b. 효모
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 FIX를 위한 유용한 발현 숙주이다(예컨대, Skoko et al.(2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3): 257-65 참조). 효모는 에피솜 복제 벡터에 의해 또는 상동 재조합(homologous recombination)을 통한 안정한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유전자 발현을 조절하기 위해 유도성 프로모터가 사용된다. 이러한 프로모터의 예로는 GAL1, GAL7, 및 GAL5 및 CUP1과 같은 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 종종 형질전환된 DNA의 선택과 유지를 위한 선별 마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이고, Bip 및 단백질 이황화물 이소머라제와 같은 샤페로닌과의 공동발현은 발현 수준 및 용해도를 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 사카로마이세스 세레비지에 유래의 효모 교배형 알파-인자 분비 시그널과 같은 분비 시그널 펩티드 융합체 및 Aga2p 교배 부착 수용체 또는 아르술라 아데노니보란스(Arxula adeninivorans) 글루코아밀라제와 같은 효모 세포 표면 단백질과의 융합체를 사용하여 분비되도록 유도될 수 있다. 프로테아제 절단 부위(예컨대, Kex-2 프로테아제)는 분비 경로를 이탈할 때 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거하도록 조작될 수 있다. 또한, 효모는 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화할 수 있다.
c. 곤충 및 곤충 세포
특히 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하는 곤충 및 곤충 세포는, FIX 또는 이의 변형된 형태와 같은 폴리펩티드의 발현에 유용하다(예컨대, Muneta et al.(2003) J.Vet.Med.Sci. 65(2): 219-23 참조). 혈림프절에서의 발현을 비롯하여 곤충 세포 및 곤충 유충은 단백질의 높은 수준을 발현하고 고등 진핵생물이 사용하는 번역후 변형의 대부분을 할 수 있다. 배큘로바이러스는 안정성을 개선시키고 진핵생물 발현의 조절 염려를 감소시키는 제한적인 숙주 범위를 가진다. 전형적으로, 발현 벡터는 고도의 발현 수준을 위한 배큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터와 같은 프로모터를 이용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 캘리포니카 핵다면증 바이러스(AcNPV), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 핵다면증 바이러스(BmNPV) 및 곤충 세포주, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 유래의 Sf9, 슈달레티아 유니펑타(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus)(DpN1)를 포함한다. 높은 수준의 발현을 위해, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열은 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 인접 하류(immediately downstream)에 융합된다. 포유동물 분비 시그널은 곤충 세포에서 정확하게 프로세싱되고 발현된 단백질을 배양 배지로 분비시키는데 사용될 수 있다. 또한, 세포주 슈달레티아 유니펑타(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유동물 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 생산한다.
곤충 세포의 대안적인 발현 시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 슈니더(Schnieder) 2(S2) 및 Kc 세포(드로소필라 멜라노가스터) 및 C7 세포(아에데스 알보픽터스(Aedes albopictus))가 발현을 위해 사용될 수 있다. 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터는 카드뮴 또는 구리를 이용한 중금속 유도의 존재 하에 높은 발현 수준을 유도하는데 사용될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 네오마이신 및 하이그로마이신과 같은 선별 마커의 사용에 의해 유지된다.
d. 포유동물 세포
포유동물 발현 시스템은 FIX 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있다. 발현 작제물(construct)은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염에 의해, 또는 리포좀, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접 DNA 전이에 의해, 그리고 전기침투(electroporation) 및 미량주사(microinjection)과 같은 물리적 수단에 의해 포유동물 세포로 전이될 수 있다. 포유동물 세포의 발현 벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역 개시 서열(코작 컨센서스 서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. 이러한 벡터들은 종종 높은 발현 수준을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예컨대 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 장말단 반복체를 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포 종류에서 활성적이다. 조직 및 세포형 프로모터 및 인핸서 영역도 역시 발현을 위해 사용될 수 있다. 예시적 프로모터/인핸서 영역은 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방암 바이러스, 알부민, 알파-태아단백, 알파 1-항트립신, 베타-글로빈, 미엘린 염기성 단백질, 미오신 경쇄-2 및 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별 마커는 발현 작제물을 보유한 세포를 선택하고 유지시키는데 사용될 수 있다. 선별 마커 유전자의 예로는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 데아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포 표면 시그널링 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와의 융합은 세포 표면에 활성 상태의 단백질을 직접 발현시킬 수 있다.
많은 세포주는 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 및 닭과 햄스터 세포를 비롯한 포유동물의 발현에 유용하다. 세포주의 예로는 BHK(즉, BHK-21 세포), 293-F, CHO, CHO 발현(CHOX; 엑셀유전자(Exce11gene)), Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비형) 및 다른 골수종 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 세포주는 세포 배양배지로부터 분비 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 쉽게 적응한다. 이러한 한 예는 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham et al.,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84: 332-42)이다. 혈장-유래 FIX와 같은 유사한 구조 및 번역후 변형을 나타내는 재조합 FIX 폴리펩티드의 발현은 당업계에 공지되어 있다. 비타민 K 의존적 단백질 발현을 최적화하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 배양 배지에 비타민 K의 보충 또는 비타민 K 의존적 γ-카르복실라제의 공동발현(Wajih et al., J.Biol.Chem. 280(36) 31603-31607)은 FIX 폴리펩티드와 같은 비타민 K 의존적 단백질의 번역후 변형에 도움을 줄 수 있다.
e. 식물
형질전환 식물 세포 및 식물은 FIX의 발현에 사용될 수 있다. 발현 작제물은 전형적으로 직접 DNA 전이, 예컨대 및 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질 내로 PEG 매개 전이, 및 아그로박테리움 매개의 형질전환을 이용하여 식물 내로 전이된다. 발현 벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 인자 및 번역 조절 인자를 포함할 수 있다. 발현 벡터와 형질전환 기술은 일반적으로 쌍떡잎식물 숙주, 예컨대 아라비돕시스 및 담배와 외떡잎식물숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 간에 나누어진다. 발현에 사용되는 식물 프로모터의 예로는 꽃양배추 모자이크 바이러스 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 리보스 비스포스페이트 프로모터 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은 선별 마커는 종종 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물 세포는 세포, 결집체(캘러스 조직)로서 배양물에서 유지되거나 또는 완전 식물로 재생될 수 있다. 식물은 포유동물 세포보다 다른 글리코실화 패턴을 갖기 때문에, 이는 이들 숙주에서 FIX를 생산하기 위한 선택에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 형질전환 식물 세포는 단백질을 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다(예컨대, Mayfield et al.(2003) PNAS 100:438-442 참조). 식물은 포유동물 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지기 때문에, 이는 이들 숙주에서 FIX를 생산하는 선택에 영향을 미칠 수 있다.
2. 정제
숙주 세포로부터 FIX 폴리펩티드를 정제하는 방법은 선택된 숙주 세포와 발현 시스템에 의존한다. 분비 분자인 경우, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현인 경우, 세포는 용해되고 이 추출물로부터 단백질이 정제된다. 형질전환 식물 및 동물과 같은 형질전환 유기체가 발현에 사용될 때에는, 조직 또는 기관을 출발 물질로서 사용하여 용해된 세포 추출물을 제조한다. 또한, 형질전환 동물 생산은 수집될 수 있는 젖이나 난에서의 폴리펩티드의 생산을 포함할 수 있고, 필요하다면 단백질은 더 추출될 수 있고 당업계의 표준 방법을 사용해서 더 정제될 수 있다.
FIX는 SDS-PAGE, 크기 분별 및 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 킬레이트 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, FIX 폴리펩티드는 하기 실시예 1에서 기술된 바와 같은 음이온교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. FIX 폴리펩티드를 정제하는 방법의 예는 기능성 Gla 도메인을 보유하는 임의의 폴리펩티드의 결합과 이어서 칼슘의 존재 하에 용출을 허용하는 이온교환 컬럼을 이용하는 방법이다. 또한, 이 제제(preparation)의 효율과 순도를 개선시키기 위해 친화성 정제 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, FIX를 결합시키는 항체, 수용체 및 다른 분자는 친화성 정제에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 정제는 또한 가용성 TF(sTF) 친화성 컬럼을 사용하여 증강될 수도 있다(Maun et al.(2005) Prot Sci 14: 1171-1180). 또한, 발현 작제물은 단백질에 대해 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6과 같은 친화성 태그를 부가하도록 조작되어, 각각 myc 항체, 글루타티온 수지, 및 Ni-수지로 친화성 정제될 수 있다. 순도는 겔 전기영동 및 염색과 분광분석 기술을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 평가될 수 있다.
FIX 폴리펩티드는 불활성 형태(자이모겐 형태)이도록 발현 및 정제될 수 있거나, 또는 대안적으로 발현된 프로테아제는 자가촉매작용 등에 의해 활성형으로 정제될 수 있다. 예를 들어, R145 및 R180 후에 단백분해 절단을 통해 활성화된 FIX 폴리펩티드는 시험관내에서 제조될 수 있다(즉, FIXa; 이중쇄 형태). FIX 폴리펩티드는 먼저 포유동물 세포에서의 생산 및 그 다음 정제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 본원에 기술된 임의의 생산방법으로 제조될 수 있다. 활성 프로테아제 형태, FIXa로의 절단은 제 XIa 인자와 함께 배양에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, 이는 칼슘 및 인지질의 존재 하에서 수행된다.
3. 융합 단백질
변형된 FIX 폴리펩티드 및 하나 이상의 다른 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질도 또한 제공된다. 이러한 융합 단백질을 적당한 경로를 통해 투여하기 위해 제형화한 약제학적 조성물도 제공된다. 융합 단백질은 변형된 FIX 폴리펩티드 및 제제, 예컨대 항체 또는 이의 단편, 성장인자, 수용체, 리간드, 및 FIX 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하고, 상기 폴리펩티드를 표적화된 세포 또는 조직으로 유도하는 등에 의해 FIX 폴리펩티드의 약력학적 성질을 변경시키고/변경시키거나 FIX 폴리펩티드의 발현 또는 분비를 증가시키기 목적의 다른 제제를 임의의 순서대로 연결시켜 제조한다. 전형적으로, 임의의 FIX 융합 단백질은 비융합 FIX 폴리펩티드와 비교하여 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 응혈 활성, 예컨대 비융합 폴리펩티드와 비교하여 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 응혈 활성을 유지한다.
다른 폴리펩티드와 FIX 폴리펩티드의 결합은 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 실시될 수 있다. 일 예에서, 결합은 이종이작용기제(heterobifunctional agent) 또는 티올 결합 또는 다른 이러한 결합과 같은 화학적 결합에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 융합은 재조합 수단에 의해 달성될 수도 있다. FIX 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드의 융합은 FIX 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 이루어질 수 있다. 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드와 함께 융합 단백질에 사용될 수 있는 폴리펩티드의 비제한적 예로는 예컨대 GST(글루타티온 S-트랜스퍼라제) 폴리펩티드, 면역글로불린 G 유래의 Fc 도메인 또는 이종 시그널 서열을 포함한다. 융합 단백질은 세포들에 의한 단백질의 흡수에 도움을 주는 이.콜라이 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 추가 성분을 함유할 수 있다(국제 PCT 출원번호 WO01/32711 참조).
융합 단백질은 표준 재조합 기술로 생산할 수 있다. 예를 들면, 다른 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 단편은, 예를 들면, 연결(liagtion)을 위한 평활-말단(blunt-ended) 또는 스태거-말단(stagger-ended), 적합한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화분해(digestion), 바람직하지 않은 접합, 및 효소 연결을 피하기 위해 적합한, 알카리성 포스파타제 처리로서 점착성 말단의 충전(filling-in)을 사용하여 통상적인 기술에 따라 프레임내로 함께 연결될 수 있다. 또다른 구현예에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술로 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적 오버행을 생성시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992 참조). 또한, 융합 모이어티(예를 들면, GST 폴리펩티드)를 이미 암호화하고 있는 다수의 발현 벡터는 상업적으로 입수가능하다. FIX 암호화 핵산은 융합 모이어티가 프로테아제 단백질에 인프레임식으로 연결되도록 이러한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
4. 폴리펩티드 변형
변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된(또는 나출(naked)) 폴리펩티드 사슬 또는 번역후 변형된 폴리펩티드로서 제조될 수 있다. 일부 응용예에서, 번역후 변형 또는 다른 화학적 변형없이 변형된 FIX를 "나출" 형태로 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 나출 폴리펩티드 사슬은 FIX를 번역후 변형시키지 않는 적합한 숙주 내에서 제조될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 시험관내 시스템에서 화학적 폴리펩티드 합성을 이용하여 제조할 수도 있다. 다른 응용예에서, 특정 변형이 바람직할 수 있다. 특히, 본원의 목적을 위하여, 과글리코실화된 FIX 폴리펩티드를 생산하기 위한 변형된 FIX 폴리펩티드의 글리코실화가 바람직하다. 이러한 글리코실화는 적절한 발현 시스템, 예컨대, 포유동물 발현 시스템를 이용하는 생체내, 시험관내(예를 들어, Mikami et al. (2006) J.Biotechnol. 127:65-78 참조), 또는 예를 들어, FIX 폴리펩티드는 원핵 세포에서 발현되고 효소 트랜스글리코실화(예를 들어, Schwarz et a1. (2010) Nature Chem. Biol. 6:264-266 참조)를 이용하는 시험관내에서 더 변형되는 생체내 및 시험관내 방법의 조합으로 수행될 수 있다. 추가적으로, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 카르복실화, 하이드록실화, 인산화, 또는 다른 공지된 변형을 비롯한 특정 변형이 바람직할 수 있다. 변형은 시험관내에서 이루어지거나, 또는 이러한 변형을 생산하는 적당한 숙주에서 변형된 FIX를 생산하여 이루어질 수 있다.
5. 뉴클레오티드 서열
FIX 또는 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 본원에서 제공된다. 핵산 분자는 임의의 암호화된 FIX 폴리펩티드의 대립유전자 변이체 또는 스플라이싱 변이체를 포함한다. 본원에서 제공되는 핵산 분자의 예는 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 것, 예컨대 서열번호 75-272 중 임의의 서열번호에 제시된 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 것이다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 핵산 분자는 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 핵산의 전장의 적어도 70%를 따라 중간 또는 높은 엄중도(stringency) 조건 하에 하이브리드하거나 또는 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 99% 서열 동일성을 가진다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 핵산 분자는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열과 적어도 또는 적어도 약 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 99% 서열 동일성을 가진다. 또다른 구현예에서, 핵산 분자는 본원에서 제공되는 임의의 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 축퇴성 코돈 서열을 갖는 것을 포함할 수 있다.
F. 변형된 FIX 폴리펩티드의 활성 평가
FIX 폴리펩티드의 활성 및 성질은 시험관내 및/또는 생체내에서 평가될 수 있다. 이러한 평가의 분석법은 당업자에게 공지되어 있고, 시험된 활성과 치료학적 및 생체내 활성에 대한 결과를 상호관련짓는 것으로 알려져 있다. 일 예에서, FIX 변이체는 비변형된 및/또는 야생형 FIX와 비교하여 평가될 수 있다. 이러한 분석법은 FVIIIa, 인지질 및/또는 칼슘의 존재 또는 부존재 하에서 수행될 수 있다. 시험관내 분석법은 당업자에 알려진 임의의 실험실 분석법(laboratory assay), 예컨대 예를 들어, 응고 분석법(coagulation assay), 결합 분석법, 단백질 분석법, 및 분자 생물학 분석법을 포함하는 세포-기반 분석법(cell-based assay)을 포함한다. 생체내 분석법은 인간에 대한 투여뿐만 아니라 동물 모델에서의 FIX 분석법을 포함한다. 일부 경우에, 생체내 FIX의 활성은 혈액, 혈청, 또는 다른 체액을 분석 결정인자(assay determinats)에 대해 평가하여 결정될 수 있다. FIX 변이체, 예컨대 본원에서 제공되는 것들은, 또한 활성 또는 성질, 예컨대 치료 효과를 평가하기 위해 생체내에서 시험될 수 있다.
전형적으로, 본원에서 기술된 분석법은 FIX의 이중쇄 활성회된 형태, 즉, FIXa에 관한 것이다. R145 및 R180 후에 단백분해 절단을 통해 활성화된 FIX 폴리펩티드는 시험관내에서 제조될 수 있다. FIX 폴리펩티드는 포유동물 세포의 생산 후 정제를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 본원에서 기술된 임의의 생산 방법에 의해 먼저 제조될 수 있다. FIX 폴리펩티드의 FIX 활성 프로테아제로의 절단은 활성화된 제 XI 인자(FXIa)와 함께 배양함으로써 달성될 수 있다. 활성화된 폴리펩티드는 본원에서 기술된 FIX 활성을 측정하기 위한 임의의 분석법에 이용될 수 있다. 이러한 분석법은 또한 단일쇄 자이모겐 형태와 함께 수행될 수 있다. 이러한 형태는 전형적으로 FIX의 응혈 활성에 요구되는 단백분해(proteolytic) 또는 촉매 활성을 나타내지 않기 때문에, 예를 들어 단일쇄 자이모겐 FIX 폴리펩티드는 음성 대조군으로 제공될 수 있다. 또한, 이러한 분석법은 또한 FIX 활성을 증대시킬 수 있는, 보조인자, 예컨대 FVIIIa, 및 다른 분자, 예컨대 인지질 및/또는 칼슘의 존재하에서 수행될 수 있다.
1. 시험관내 분석법
시험관내 분석법의 예로는 폴리펩티드 변형 및 활성을 평가하는 분석법들을 포함한다. 변형은 글리코실화, γ-카르복실화 및 다른 번역후 변형을 평가하는 시험관내 분석법, 단백질 분석법 및 당업계에 공지된 입체형태(구조) 분석법(conformational assay)을 사용하여 평가될 수 있다. 활성에 대한 분석법은 다른 응고 인자, 예컨대, FVIIIa 및 제 X 인자와 FIX의 상호작용의 측정, FIX 폴리펩티드의 단백분해 활성을 측정하는 단백분해 분석법, 포스파티딜세린 및 다른 인지질에 대한 FIX 폴리펩티드의 결합 및/또는 친화력을 결정하는 분석법, 및 FIX 폴리펩티드가 응고에 미치는 영향을 결정하는 세포 기반 분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 농도는 당업계에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 그 예로는 효소면역측정법(ELISA), SDS-PAGE; 브래드포드, 로우리, BCA 방법; UV 흡광도, 및 다른 정량가능한 단백질 표지 방법, 예컨대 면역학적, 방사성, 형광 방법 및 관련 방법(이에 국한되지 않는다)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
FIX 폴리펩티드의 절단 또는 FIX 프로테아제 활성에 의해 생산된 산물을 포함하는, 단백분해 반응의 절단 산물의 평가는 발색원성 기질 절단, HPLC, SDS-PAGE 분석, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학, 면역침전, NH2-말단 서열분석(sequencing) 및 단백질 표지화를 포함하나, 이에 제한되지 않는 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 변형된 FIX 폴리펩티드의 구조적 성질도 평가될 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드의 X선 결정학, 핵자기공명(NMR), 및 저온전자 현미경(cryoelectron microscopy)(크라이오-EM)은 FIX 폴리펩티드의 3차원 구조 및/또는 FIX 폴리펩티드의 다른 성질, 예컨대 Ca2 + 또는 보조인자 결합을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
또한, FIX 분해의 존재 및 정도는 표준 기술, 예컨대 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 전기영동된 FIX를 함유하는 시료의 웨스턴 블롯팅에 의해 측정될 수 있다. 프로테아제에 노출된 FIX 폴리펩티드는 변형된 FIX 폴리펩티드의 절단 부위의 위치 또는 변화를 결정하기 위해 말단 서열분석으로 처리될 수도 있다.
a. 글리코실화
FIX 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 글시코실화의 존재에 대해 평가될 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 매우 다양한 방법, 예컨대 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피(Townsend et al., (1991) Glycobiology 1: 139-147), 또는 형광단 보조의 탄수화물 전기영동(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis; FACE)(Kurnar et al., (1996) Biotechnol. Appl. Biochem. 24:207-214.), 순차 엑소글리코시다제 소화분해(sequential exoglycosidase digestion)(Watzlawick et al., (1992) Biochemistry 31:12198-12203; Tyagarajan et al., (1996) Glycobiology, 6:83-93), 질량분석법(Gillece-Castro et a1., (1990) Meth. Enzyrnol. 193: 689-712; Duffin et al., (1992) Anal. Chem. 64:1440-1448; Papac et a1., (1 997) in Techniques in Glycobiology (Townsend R.R. 및 Hotchkiss A.T. eds. Marcel Decker, Inc., New York, pp. 33-52; Fu et al., (1994) Carbohydr. Res. 261: 173-186) 및 NMR((Fu et al., (1994) Carbohydr. Res. 261:173-186)를 이용하여, 이들의 효소적으로 또는 화학적으로 방출된 탄수화물 풀(pool)로부터 특징지어질 수 있다.
예를 들어, 화학적 방출(chemical release)는 무수 하이드라진과의 배양에 의해 당단백질로부터 N-연결된 및 O-연결된 글리칸을 방출시키는 하이드라진분해에 의해 이루어질 수 있다. 효소적 방출은 원래 글리코실화된 Asn 잔기를 Asp로 가수분해하면서 폴리펩티드로부터 비변경된 대부분의 일반적 N-연결 탄수화물을 제거하는 엔도글리코시다제 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGase F)에 의해 이루어질 수 있다. FIX 폴리펩티드의 하이드라진분해 또는 엔도글리코시다제 처리는 형광단 또는 발색단 표지로 태그화될 수 있는 환원성 말단을 생성한다. 표지화된 FIX 폴리펩티드는 형광단 보조의 탄수화물 전기영동(FACE)에 의해 분석될 수 있다. 글리칸을 위한 형광 태그는 또한 단당류 분석, HPLC에 의한 복합 글리코실화 패턴의 핑거프린팅 또는 프로파일링에 사용될 수 있다. 예시적 HPLC 방법으로는 친수성 상호작용 크로마토그래피, 전자 상호작용, 이온교환, 소수성 상호작용, 및 크기배제 크로마토그래피를 포함한다. 글리칸 프로브의 예로는, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘(AA-Ac) 및 2-아미노벤조산(2-AA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 탄수화물 모이어티는 글리코실화된 FIX 폴리펩티드를 인식하는 특정 항체의 사용을 통해 검출할 수도 있다.
일 방법에서, 질량분석(mass spectrometry)은 위치 특이적 탄수화물 이형성(heterogeneity)를 평가하는데 이용된다. 이는 수집된 HPLC-분획의 매트릭스 보조 레이져 탈착 이온화 질량분석(Sutton et al., (1994) Anal. Biochem. 218:34-46; Ploug et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:13933-13943), 또는 전자분무이온화 질량분석(LC/ESIMS)와 직접적으로 커플링된 역상 HPLC(Huddleston et al., (1993) Anal. Chem. 65:877-884; Medzihradsky et al., (2008) Methods Mol. Biol. 446:293-316 참조)을 포함한다. 일 예에서, 잠재적인(potential) N-글리코실화 부위, 예컨대 Asn-X-Ser/Thr/Cys 모티프 내의 아스파라긴 잔기에서의 글리코실화는 LC/ESIMS에 의해 평가된다. FIX 폴리펩티드 내의 잠재적인 N-글리코실화 부위는 확인될 수 있고, 단백분해 효소는 개별적인 펩티드 상의 이들 부위를 분리하게 선택될 수 있다. 소화분해 혼합물(digestion mixture)는 그리고 나서, LC/ESIMS, 충돌 활성화(collisional activation)(33)에 의해 진단 탄수화물 이온(diagnostic carbohydrate ion)을 생성하는 방법으로 분석된다. 이들 진단 탄수화물 이온은, 예를 들어, 각각 N- 아세틸헥소사민(acetylhexosamine), 뉴라민(시알)산, 헥소실-N-아세틸헥소사민, 및 시알릴-헥소실-N아세틸헥소사민(sialyl-hexosyl-Nacetylhexosamine)의 존재를 가르키는 m/z 204, 274 및 292, 366, 및 657에서 특징적인(characteristic) 비환원 말단 옥소니움(oxonium) 이온을 포함한다. 선택적인 이온 모니터링(SIM)에 의해 이들 이온의 존재를 확인하는 것 이외에, LC/ESIMS 방법은 또한 펩티드를 가르키는데 이용될 수 있고, 따라서, 잠재적인-N-글리코실화 부위가 탄수화물을 함유하는 분자량을 평가하기 위한 펩티드를 분석한다.
b. 다른 번역후 변형
FIX 폴리펩티드는 글리코실화 이외의 번역후 변형의 존재에 대해 평가될 수 있다. 이러한 분석법은 당 분야에 공지되어 있고, 예컨대 글리코실화, 하이드록실화 및 카르복실화를 측정하는 분석법을 포함한다. β-하이드록실화를 측정하는 예시적 분석법은 알칼리 가수분해로 처리된 FIX 폴리펩티드의 역상 HPLC 분석을 포함한다(Przysiecki et al.(1987) PNAS 84: 7856-7860). FIX 폴리펩티드의 카르복실화 및 γ-카르복실화는 다른 비타민 K-의존적 폴리펩티드(예컨대, Harvey et al., J Biol Chem 278: 8363-8369, Maun et al., Prot Sci 14: 1171-1180 참조)에 대해 기술된 바와 같은, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) 분석과 함께 질량분석을 사용하여 평가될 수 있다. 번역후 γ-카르복실레이트 변형을 담당하는 카르복실라제와 FIX 폴리펩티드를 함유하는 프로펩티드(pro-FIX)와의 상호작용이 또한 평가될 수 있다. 플루오레세인-표지된 프로(pro)-FIX 폴리펩티드와 카르복실라제의 배양 후 해리 상수(Kd)는 결합된 카르복실라제의 양을 비등방성(anisotropy)으로 결정함으로써 측정할 수 있다(Lin et al.(2004) J Biol Chem 279: 6560-6566). 카르복실화를 측정하는 다른 예시적 분석법은 알칼리 가수분해로 처리된 FIX 폴리펩티드의 역상 HPLC 분석을 포함한다(Przysiecki et al.(1987) PNAS 84: 7856-7860).
인산화를 측정하는 예시적 분석법은 인산화-세린(phospho-serine) 및/또는 -티로신 아미노산 잔기에 대한 또는 세린-인산화된 FIX 폴리펩트드에 대한 인산특이적(phosphospecific) 항체의 사용을 포함한다. FIX 폴리펩티드를 생산하는 세포의 32P 대사적(metabolic) 표지는 또한 인산화를 평가하는데 사용될 수 있고, 여기서 표지된 폴리펩티드는 정제되고 방사성(radioactive) 인산염의 혼입(incorporation)에 대하여 분석될 수 있다. 티로신 황산화(설페이트화)를 위한 예시적 분석법은 FIX 폴리펩티드를 생산하는 세포의 35S 표지를 포함한다. 이러한 방법에서, 세포는 35S-S2S04 또는 35S-메티오닌과 함께 배양되고, 35S의 혼입이 35S-메티오닌 시료에 대해 정규화됨으로써 결정된다.
c. 단백분해 활성
변형된 FIX 폴리펩티드는 합성 기질 및 이들의 자연적 기질, 제 X 인자 모두에 대한 단백분해 활성에 대해 시험될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드의 활성형(FIXa)이 전형적으로 이 분석에 이용된다. 합성 기질, 예컨대 CH3S02-LGR-pNA 펩티드를 이용하는 분석법이 FIXa 폴리펩티드의 효소적 절단 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. FIXa의 존재 하에서 CH3S02-LGR-pNA 펩티드의 가수분해는 절단 반응 시료로부터 p-니트로아닐린(pNA)의 생산을 평가함으로써 측정될 수 있다. 시료 내 pNA의 양은 405nm에서의 시료의 흡광도에 비례하고 따라서 FIXa 시료 내 단백분해 활성의 정도(extent)를 가르킨다. FIXa 절단 활성을 평가하는데 사용될 수 있는 추가적 예시적 형광원성 기질은 Mes-d-CHD-Gly-Arg-AMC (Pefafluor FIXa10148) 및 H-d-Leu-PHG-Arg-AMC (Pefafluor FIXa3688)를 포함하나, 이에 제한되지 않고, 여기서 절단은 AMC의 방출에 의해 평가되고, 형광원성 에스테르 기질인 4-메틸움벨리페릴 p'-구아니디노벤조에이트(4-methylumbelliferyl p'- guanidinobenzoate; MUGB)는 절단이 4-메틸움벨리페론 형광단(4-MU)의 방출에 의해 평가된다(예를 들어, 실시예 3 참조). FIXa 촉매 활성을 향상시키는 분자, 예컨대 에틸렌 글리콜이 이러한 분석법에 사용될 수 있다(Sturzebecher et al. (1997) FEBS Lett. (412) 295-300).
FIXa의 단백분해 활성은 예컨대 하기 실시예 4에서 기술된 바와 같은, 제 X 인자(FX)의 활성화된 제 X 인자(FXa)로의 변환(conversion)을 측정함으로써 평가될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드를 포함하는, FIXa의 폴리펩티드는 FVIIIa, 인지질 소포(vesicle)(포스파티딜세린 및/또는 포스파티딜콜림) 및 Ca2+ 존재하에서 FX 폴리펩티드와 함께 배양될 수 있고, FXa를 생산하기 위한 FX의 절단은 형광원성 기질, 예컨대 Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC), 또는 발색원성 기질, FXa에 의해 특이적으로 절단되는 예컨대 S2222 또는 S2765 (Chromogenics AB, Molndal, Sweden)을 사용하여 측정될 수 있다.
d. 응고 활성
FIX 폴리펩티드는 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 응고 활성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 일부 분석법은 2단계 응고 분석법(Leibman et al.,(1985) PNAS 82: 3879-3883); 프로트롬빈 시간 분석법(외인성 경로에서 FIXa의 TF-독립적 활성을 측정할 수 있는 PT); PT 시험의 변형인 분석법; 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(FIXa의 TF 독립적 활성을 측정할 수 있는 aPTT); 활성화된 응고 시간(ACT); 재석회화된 활성화된 응고 시간; Lee-White 응고 시간; 또는 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography) (TEG) (Pusateri et al. (2005) Critical Care 9:S15-S24)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 변형된 FIX 풀리펩티드의 응고 활성은 FIX가 FIX 결핍 혈장으로 희석되고, 프로트롬빈 시간 시약(인지질 및 칼슘과 재조합 TF) (예컨대 Dade Behring에서 Innovin™으로 입수용이한 것)과 혼합되는 PT 기반 분석법으로 결정될 수 있다. 응괴(clot) 형성은 광학적으로 검출되고 응괴에 대한 시간은 결정되고 FIX 결핍 혈장 단독물과 비교된다. 예컨대 하기에 기술된 바와 같은, 동물 모델에 있어서의 응고 분석법은 또한 FIX 폴리펩티드의 응고 활성을 평가하기 위하여 수행될 수 있다.
e. 다른 단백질 및 분자와 결합 및/또는 그에 의한 저해
저해 분석법은 FIX 저해제, 예컨대, 예를 들어, 항트롬빈 III(AT-III), 헤파린, AT-III/헤파린 복합체, p-아미노베즈아미딘(p-aminobenzamidine), 세린 프로테아제 저헤제, 및 FIX-특이적 항체에 대한 변형된 FIX 폴리펩티드의 내성(resistance)을 측정하는데 사용될 수 있다. 다른 저해제에 대한 저해의 평가는 또한 시험될 수 있고, 다른 세린 프로테아제 저해제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 저해는 FVIIIa와 함께 및/또는 FVIIIa 없이 전배양된(preincubated) FIX 폴리펩티드와 저해제를 배양함으로써 평가될 수 있다. FIX의 활성은 그리고 나서 상기 기술된 임의의 하나 이상의 활성 또는 응고 분석법을 이용하여 측정될 수 있고, 저해제에 의한 저해는 저해제와 함께 배양하지 않은 FIX 폴리펩티드의 활성과 저해제와 함께 배양된 FIX 폴리펩티드의 활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, AT-III/헤파린에 의한 변형된 FIX폴리펩티드의 저해는 하기 실시예 5에서 기술한 바와 같이 평가될 수 있다. AT-III/헤파린 복합체에 의한 야생형 FIXa 또는 FIXa 변이체의 저해는 AT-III/헤파린을 FIXa와 함께 배양하고 소분자 기질, Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC (Pefafluor FIXa; Pentapharm)에 대한 FIXa의 촉매 활성을 측정함으로써 평가된다. 이러한 평가는 FVIIIa의 존재 또는 부존재 하에서 수행될 수 있다.
FIX 폴리펩티드는 또한 다른 응고 인자 및 저해제에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어 보조인자, 예컨대 FVIIIa, 기질, 예컨대 FX 및 FIX, 및 저해제, 예컨대 항트롬빈 III 및 헤파린과의 FIX 직접 및 간접 상호작용은 당업계에 공지된 임의의 결합 분석법, 예컨대 면역침전, 컬럼 정제, 비환원성 SDS-PAGE, BIAcore® 분석법, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 형광 공명 에너지 전이(FRET), 형광 편광(FP), 등온적정 열계량법(ITC), 원형 광이색성(CD), 단백질 단편 상보 분석법(PCA), 핵자기공명(NMR) 분광분석법, 광산란, 침강 평형, 소구역 겔 여과 크로마토그래피, 겔 지연(retardation), 파(Far)-웨스턴 블롯팅, 형광 편광, 하이드록실-라디칼 단백질 풋프린팅, 파지 디스플레이, 및 다양한 이중 하이브리드 시스템 등(이에 국한되지 않는다)을 사용하여 평가할 수 있다.
e. 인지질 친화력
포스파티딜세린(PS) 및 다른 인지질에 대한 변형된 FIX 폴리펩티드 결합 및/또는 친화력은 당업계에 공지된 분석법을 이용해서 결정될 수 있다. 유기 용매 중의 고순도 인지질(예컨대, 공지된 농도의 소의 PS 및 난(egg) 포스파티딜콜린(PC), 시그마 등에서 시판되고 있음)은 작은 단층 인지질 소포(small unilamellar phospholipid vesicle)를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 PS/PC 소포에 대한 FIX 폴리펩티드 결합은 입사광에 대해 90°에서의 상대적 광산란을 통해 결정될 수 있다. PC/PS 단독일 때 및 PC/PS/FIX와 함께일 때의 광산란의 강도는 해리 상수를 결정하기 위해 계측된다(Harvey et al., J. Biol. Chem. 278: 8363-8369). BIAcore 바이오센서 기구에서와 같은 표면 플라즈마 공명은 또한 인지질 막에 대한 FIX 폴리펩티드의 친화력을 측정하는데 사용될 수 있다(Sun et al. Blood 101: 2277-2284).
2. 비-인간 동물 모델
비-인간 동물 모델은 변형된 FIX 폴리펩티드의 활성 및 안정성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 동물은 질환 또는 상태의 모델로서 사용될 수 있다. 비-인간 동물은 FIX 변이체를 투여하기 전에 질환 및/또는 표현형 유도 물질을 주입하여 질환 진행(disease progression)에 대한 영향을 모니터링할 수 있다. 유전자 모델도 또한 유용하다. 마우스와 같은 동물은 하나 이상의 유전자의 과잉발현, 과소발현 또는 녹아웃(knock-out)에 의해 질환 또는 상태를 모방하는 동물이 생성될 수 있다. 이러한 동물은 당업계에 공지된 형질전환 동물 생산 기술 또는 자연발생 또는 유도된 돌연변이 종을 사용하여 생성될 수 있다. FIX와 관련된 질환의 유용한 비-인간 동물 모델의 예로는, 출혈성 장애 모델, 특히 혈우병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 비-인간 동물 모델은 야생형 FIX 폴리펩티드와 비교하여 FIX 변이체의 활성을 모니터하는데 사용될 수 있다.
또한, 동물 모델은 변형 FIX 폴리펩티드의 안정성, 반감기, 제거율(클리어언스, clearance), 및 다른 약동학적(pharmacokinetic) 및 약력학적(pharmacodynamic) 성질을 모니터하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 변형된 FIX 폴리펩티드를 비교하고, 나아가 비-인간 동물 및 인간 시험을 위한 용량(dose) 및 투여 요법을 계산하는데 유용하다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 마우스의 꼬리 정맥으로 주입될 수 있다. 그 다음, 주입 후 시점들(예컨대, 분, 시간 및 일 뒤에)마다 혈액 시료를 채취하고, ELSIA 또는 방사선면역측정법(radioimmunoassay)에 의해 FIXa 활성 및 단백질 농도에 대한 특정 시점에서의 혈청 또는 혈장을 모니터링하는 것에 의한 것과 같이 변형된 FIX 폴리펩티드의 약동학적 및 약력학적 성질이 평가된다(예를 들어, 실시예 6 참조). 혈액 시료는 또한 aPTT 분석법과 같은 방법으로 응고 활성에 대해 시험될 수 있다(예를 들어, 실시예 6 참조).
변형된 FIX 폴리펩티드는 혈우병 동물 모델을 사용하여 치료 효과에 대하여 시험될 수 있다. 비제한적인 일 예에서, 마우스와 같은 동물 모델이 사용될 수 있다. 혈우병 마우스 모델은 당업계에서 이용될 수 있고, FIX 결핍 마우스(예컨대 하기 실시예 7에서 이용된 것) 및 돌연변이 FIX 폴리펩티드를 발현하는 마우스를 포함하고, 변형된 FIX 폴리펩티드를 시험하는데 이용될 수 있다(Wang et al., (1997) PNAS 94:11563-11566; Lin et al., (1997) Blood 90:3962-3966; Kundu et al., (1998) Blood 92: 168-174; Sabatino et al., (2004) Blood 104(9):2767-2774; 및 Jin et al., (2004) Blood 104:1733-1739; 또한 실시예 7 참조).
FIX 결핍의 다른 모델은 결함이 있는 FIX를 생산하거나 간 절제술을 받았던 혈우병에 걸린 개를 포함한다(Evans et al., (1989) PNAS 86:10095; Mauser et al., (1996) Blood 88:3451; 및 Kay et al., (1994) PNAS 91:2353-2357).
3. 임상 분석
많은 분석법이 임상적 용도를 위한 FIX의 활성을 평가하는데 이용가능하다. 이러한 분석법으로는, 응고, 단백질 안정성 및 생체내 반감기의 평가, 및 표현형 분석법을 포함할 수 있다. 표현형 분석법 및 FIX 치료의 치료 효과를 평가하는 분석법은 FIX의 혈액 수준의 평가(예컨대, 체질량지수(BMI)에 대해 보정한, 투여전 및 투여 후의 시점들, 예컨대 1차 투여후, 최종 투여 직후 및 시점들 사이 등에서의 혈청 FIX의 측정), 비변형된 및/또는 야생형 FIX 또는 위약(placebo)으로 치료된 대상체와 비교하여 경시적으로 증상의 개선을 포함하는 FIX 치료에 대한 표현형 반응을 포함한다. FIX 활성을 평가하는 임상적 분석의 예로는 예컨대 Franchini et al., (2005) Thromb Haemost. 93(6):1027-1035; Shapiro et al., (2005) Blood 105(2):518-525; 및 White et al., (1997) Thromb. Haemost. 78(1):261-265에서 발견될 수 있다. 환자는 출혈, 외상 또는 수술 처치와 같은 급성 사건에 대한 반응으로 투여 후, 통상적인 투여 또는 반복 투여의 일정 시간 동안 정기적인 모니터를 받을 수 있다.
G. 제형화 및 투여
출혈성 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 조성물은 본원에서 기술된 바와 같은 제 IX 인자의 치료적으로 유효량을 함유한다. FIX 폴리펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 유도체의 유효 농도는 전신, 국부 또는 국소 투여를 위한 적합한 약제학적 담체 또는 비히클과 혼합된다. 화합물은 선택된 장애를 치료하는데 효과적인 양으로 포함된다. 조성물 내에 활성 화합물의 농도는 활성 화합물의 흡수, 불활성화, 배출 속도, 투여량 계획, 및 투여되는 함량 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 기타 요인들에 따라 달라질 것이다.
본원에서 제공되는 화합물의 투여에 적합한 약제학적 담체 또는 비히클은 특정 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 담체를 포함한다. 또한, 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드의 치료학적으로 유효량을 포함하는 약제학적 조성물은 투여 직전에 멸균수 등에 의해 재구성되는 동결건조 분말로 제공될 수도 있다.
1. 제형화
변형된 FIX를 함유하는 약제학적 조성물은 폴리펩티드의 선택 양과 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 혼합함으로써 임의의 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 담체 또는 부형제의 선택은 투여 직업의 기술 범위 안에 있고, 다수의 매개변수에 의존될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 투여 방식(즉, 전신, 경구, 비강, 폐, 국소, 국부, 또는 임의의 다른 방식) 및 치료되는 장애를 포함한다. 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 단일 투여량(직접) 투여용으로 또는 희석이나 기타 변형용으로 제형화될 수 있다. 제형들 내의 화합물의 농도는 투여 시에 의도한 치료에 유효한 양을 전달하는데 유효한 농도이다. 전형적으로, 조성물은 단일 투여량 투여용으로 제형화된다. 조성물을 제형화하기 위해, 화합물 또는 이의 혼합물의 중량 분획이 치료되는 상태가 경감되거나 개선되는 유효 농도로 선택된 비히클에 용해, 현탁, 분산 또는 그렇지 않으면 혼합된다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 이중쇄 FIXa 단백질로 대상체에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 제형화 전에 당업계에 공지된 임의의 방법으로 활성화될 수 있다. 예를 들어, FIX는 FXIa, 예컨대 비드 상에 고정화된 FXIa와의 배양에 의해 활성화될 수 있다. FIXa 단백질의 완전 활성화 및 정확한 폴딩을 보장하도록 이러한 공정들에 칼슘이 포함될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 단일쇄 단백질로서 투여용으로 제형화될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 단일쇄 및 이중쇄 형태가 자가활성화를 제거하거나 제어하도록 매질을 적당히 선택함으로써 임의의 비율로 약제학적 조성물에 포함되도록 제형화될 수 있다.
화합물은 미크론 형태 또는 다른 적합한 형태로 현탁될 수 있고, 또는 더욱 가용성인 활성 산물로 유도체화될 수 있다. 최종적인 혼합물(resulting mixture)의 형태는 의도된 투여 방식 및 선택된 담체 또는 비히클 내에 있어서의 화합물의 용해도를 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 최종 혼합물은 용액, 현탁액, 유탁액(elixir) 및 기타 이러한 혼합물이고, 비수성 또는 수성 혼합물, 크림, 젤, 연고, 유탁액, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 발포제(foam), 에어로졸, 관주제(irrigation), 스프레이, 좌약, 붕대, 또는 전신, 국부 또는 국소 투여용으로 적합한 임의의 다른 제형으로 제형화될 수 있다. 근육내, 비경구 또는 관절내 투여와 같은 국소 내부 투여를 위하여, 폴리펩티드는 수성계 매질, 예컨대 등장성으로 완충된 식염수에서 현탁 용액으로서 제형화될 수 있거나 내부 투여용으로 의도된 생체적합성의 지지체 또는 생체결합제(bioadhesive)와 조합된다. 유효 농도는 표적 상태를 개선시키기에 충분한 농도로, 경험적으로 결정될 수 있다. 조성물을 제형화하기 위해, 화합물의 중량 분획은 표적 상태를 경감 또는 개선되도록 유효 농도로, 선택 비히클 내에 용해, 현탁, 분산 또는 그렇지 않으면 혼합된다.
일반적으로, 약제학적으로 허용되는 조성물은 동물과 인간에 사용하기 위해 공인된 약전에 따라 제조되거나, 또는 규제기구의 승인을 고려하여 제조된다. 약제학적 조성물은 이소폼(isoform)과 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제, 또는 비히클과 같은 담체를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유계, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 비롯한 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유 및 참깨유 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 또한, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도 액체 담체로서, 특히 주입가능한 용액으로서 이용될 수 있다. 조성물은 활성 성분과 함께 다음을 함유할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토스, 슈크로스, 디칼슘 포스페이트, 또는 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검, 예컨대 검 아카시아, 젤라틴, 글루코스, 몰라세스, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로스 및 이의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 기타 당업자에게 공지된 결합제. 적합한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 및 에탄올을 포함한다. 요구된다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 소듐 시트레이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올레이트 및 기타 이러한 제제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 정제, 환제, 캡슐, 분말 형태 및 서방성(sustained release) 제형일 수 있다. 또한, 치료 화합물과 적합한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 등의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다. 조성물은 통상의 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세라이드와 함께 좌약으로서 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 표준 담체, 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 및 기타 이러한 제제를 포함할 수 있다. 경구 투여용 제제는 또한 프로테아제 저해제, 예컨대 바우만-버크(Bowman-Birk) 저해제, 컨주게이트된 바우만-버크 저해제, 아프로티닌 및 카모스태트(camostat)와 함께 적합하게 제형화될 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌[E.W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 정제된 형태인 화합물의 치료학적으로 유효량과 대상체 또는 환자에게 적절한 투여 형태를 제공하기 위한 담체의 적합한 양을 함유할 것이다.
제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 예를 들어, 변형된 FIX는 주입에 의한(예컨대, 볼루스 주사(bolus injection) 또는 연속 주사에 의한) 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주입가능한 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 유탁액과 같은 형태일 수 있다. 또한, 멸균 주입가능한 제제는 1,4-부탄디올 내의 용액과 같은 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 내의 멸균 주입가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 멸균된 고정유(fixed oil)는 통상적으로 용매 또는 현탁용 매질로서 이용된다. 이러한 목적을 위하여, 임의의 상표의 고정유가 이용될 수 있으며, 그 예로는 합성 모노- 및 디-글리세라이드, 지방산(예컨대, 올레산), 자연발생의 식물유, 예컨대 참깨유, 코코넛유, 땅콩유, 면실유, 및 기타 오일, 또는 합성 지방산 비히클, 예컨대 에틸 올레이트 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 완충액, 보존제, 항산화제, 및 적합한 성분은 필요할 때 혼입될 수 있거나, 또는 대안적으로, 제형에 포함될 수 있다.
폴리펩티드는 조성물 내에 유일한 약제학적 활성 성분으로 제형화될 수 있거나 또는 다른 활성 성분과 조합될 수 있다. 폴리펩티드는 항체와 같은 표적화제에 컨주게이션 등에 의해 전달을 위해 표적화할 수 있다. 조직 표적화된 리포좀을 포함하는 리포좀 현탁액은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로서 적합할 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형은 미국 특허 번호 4,522,811에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 리포좀 전달은 피브로넥틴으로 변형된 리포좀 및 콜라겐 젤과 같은 약제학적 기질을 포함하는 서방성 제형을 포함할 수 있다(예컨대, Weiner et al.(1985) J. Pharm. Sci. 74(9): 922-5 참조). 본원에서 제공되는 조성물은 전달을 용이하게 위한 하나 이상의 보강제, 예컨대 불활성 담체, 또는 콜로이드성 분산계를 더 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 불활성 담체의 대표적인 비제한적 예는 물, 이소프로필 알콜, 기체성 플루오로카본, 에틸 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 프로필렌글리콜, 겔생산성 물질, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 스퍼마세티, 소르비탄 모노올레이트, 메틸셀룰로스 뿐만 아니라 이의 2 이상의 적합한 조합물로부터 선택될 수 있다.
활성 화합물은 치료받는 대상체에 바람직하지 않은 부작용을 일으킴이 없이 치료학적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체 내에 포함된다. 치료학적으로 유효 농도는 본원에 제공되는 분석법과 같은 공지된 시험관 내 및 생체내 시스템에서 화합물을 시험하여 경험적으로 결정될 수 있다.
a. 용량
투여되는 치료제의 정확한 양 또는 용량은 특정 FIX 폴리펩티드, 투여 경로 및 다른 고려사항, 예컨대 질환의 중증도 및 대상체의 체중 및 일반적인 상태에 의존한다. 치료제의 국소 투여는 전형적으로 임의의 전신 투여방식보다 적은 투여량을 요구할 것이지만, 몇몇 경우에 치료제의 국소 농도는 전신 투여 시에 안전성이 달성될 수 있는 농도보다 국소 투여 후의 농도가 더 높을 수도 있다. 필요하다면, 특정 투여량 및 기간, 그리고 치료 프로토콜은 경험적으로 결정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 및 천연 FIX 폴리펩티드의 예시적 용량은 적당한 투여량을 결정하기 위한 출발점으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, rFIXa로 활성화된 재조합 FIX(rFIXa) 폴리펩티드, BeneFIX® 제 IX 인자는 다양한 용량에서 예방적 및 수술적 세팅 뿐만 아니라 혈우병 치료를 위한 혈우병 B를 갖는 환자에 투여했다. 재조합 FIX를 이용한 치료의 투여량 및 기간은 제 IX 인자 결핍의 중증도, 출혈의 위치 및 정도, 및 환자의 임상적 상태, 나이 및 제 IX 인자의 회수율(recovery)에 의존한다. 예를 들어, 중증의(severe) 혈우병 B(FIX 활성 < 1 IU/dL; 정상 활성의 1%(여기서, 1 IU는 정상, 혼주 혈장(normal, pooled plasma)의 1mL 내에 제 IX 인자의 활성을 나타낸다))를 갖는 환자는 중도의(moderate)(1-5 IU/dL의 FIX 활성; 정상 활성의 1-5%) 혈우병 B를 갖는 환자, 또는 온화한(mild)(5 초과 내지 40 미만 IU/mL의 FIX 활성; 정상 활성의 5% 초과 내지 40% 미만) 혈우병 B을 갖는 환자 보다 더 수혈된(transfuse) FIX를 요구할 것이다. BeneFIX® 제 IX 인자의 초기의 추정된(initial estimated) 용량은 다음 공식을 사용하여 결정될 수 있다: 필요한 유닛(Units) = 체중(kg) × 희망되는(desired) 제 IX 인자 증가 (IU/dL 또는 정상의 %) × 상호의 관찰된 회수율(IU/dL 당 IU/kg). 성인 및 소아(< 15세) 환자를 갖는 임상적 연구에서, 체중 킬로그램 당 BeneFIX의 1 IU는 다음과 같이 제 IX 인자의 순환 활성(circulating activity)를 증가시켰다: 성인: 0.8 ± 0.2 IU/dL [0.4 내지 1.2 IU/dL 범위]; 소아: 0.7 ± 0.3 IU/dL [0.2 내지 2.1 IU/dL 범위]. 따라서, 성인 환자를 위해: 필요한 제 IX 인자 IU의 수 (IU) = 체중(kg) × 희망되는 제 IX 인자 증가(% 또는 IU/dL) × 1.3(IU/dL 당 IU/kg), 및 소아 환자를 위해: 필요한 제 IX 인자 IU의 수 (IU) = 체중(kg) × 희망되는 제 IX 인자 증가(% 또는 IU/dL) × 1.4(IU/dL 당 IU/kg).
표 11는 다양한 출혈 에피소드에 대하여 사용된 전형적 용량을 열거한다.
표 11.
Figure 112017042341398-pat00017
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 천연 재조합 FIX와 비교하여 감소된 투여량 및/또는 감소된 빈도에서 유효할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 덜 빈번한 투여 간격, 예컨대 24 시간, 36 시간, 48 시간, 60 시간 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 다른 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드의 더 적은 용량이 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드는 응고를 달성하도록 단지 한 번만 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 변형된 FIX의 투여량은 천연 FIX와 비교하여 감소된다. 예를 들어, 투여량은 약 1 IU/kg, 2 IU/kg, 3 IU/kg, 4 IU/kg, 5 IU/kg, 6 IU/kg, 7 IU/kg, 8 IU/kg, 9 IU/kg, 10 IU/kg, 20 IU/kg, 30 IU/kg, 40 IU/kg or 50 IU/kg, 60 IU/kg, 70 IU/kg, 80 IU/kg, 90 IU/kg, 또는 100 IU/kg 미만일 수 있다. 치료의 기간, 용량 및 주입 사이의 간격은 출혈의 중증도 및 치료에 대한 환자의 반응에 따라 달라질 것이며, 이에 따라서 조정될 수 있다. 비변형된 FIX와 비교하여 변형된 FIX의 활성 수준 및 반감기와 같은 요인들은 투여량 결정시에 고려될 수 있다. 특정 투여량 및 요법은 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 비변형된 FIX 폴리펩티드보다 더 긴 반감기를 나타내는 변형된 FIX 폴리펩티드는 비변형된 FIX 폴리펩티드보다 더 낮은 용량 및/또는 더 적은 빈도로 투여될 수 있다. 유사하게, 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응혈 활성을 나타내는 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하는 치료 효과를 위해 필요한 투여량은 빈도와 함량이 감소될 수 있다. 구체적인 투여량과 요법은 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
b. 제형
약제학적 치료적으로 활성 화합물 및 이의 유도체는 전형적으로 단위 투여형 또는 다중 투여형으로 제형화되고 투여된다. 제형은 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 유도체를 적합한 함량으로 함유하는 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 경구 용액 또는 현탁액 및 수중유 유탁액이 포함되나, 이에 제한되지 않는 투여형으로 인간과 동물에게 투여하기 위해 제공될 수 있다. 각 단위 용량은 필요한 약제학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께 희망하는 치료 효과를 나타내기에 충분한 소정의 함량의 치료학적으로 활성 화합물을 함유한다. 단위 용량 형태의 예로는 앰플 및 주사기 및 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 일부 예에서, 단위 용량은 투여 전에 재구성되는 동결건조 분말로 제공된다. 예를 들어, FIX 폴리펩티드는 주입을 위한 단일 용량 용액으로 제조하기 위해 적합한 용액에 의해 재구성되는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 일부 실시예에 서, 동결건조된 분말은 FIX 폴리펩티드와 추가 성분, 예컨대 염을 함유할 수 있으며, 이에 따라 멸균 증류수로 재구성 시에 완충 용액 또는 식염수 용액 내에서 FIX 폴리펩티드로 수득된다. 단위 용량 형태는 분획 또는 이의 다중 형태로 투여될 수 있다. 다중 용량 형태는 분리된 단위 용량 형태로 투여될 단일 용기 내에 포장된 복수의 동일한 단위 투여형이다. 다중 용량 형태의 예로는 바이엘(vial), 정제 또는 캡슐의 병 또는 파인트 또는 갤론 병이 포함된다. 따라서, 다중 용량 형태는 포장으로 분리되어 있지 않은 다중 단위 용량이다.
2. 변형된 FIX 폴리펩티드의 투여
본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드(즉, 활성 화합물)는 체액 또는 다른 조직 시료와 같은 혼합물을 FIX 폴리펩티드와 접촉시켜 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체외로 화합물을 투여할 때, 대상체 유래의 체액 또는 조직 시료는 튜브 또는 필터, 예컨대 예를 들어, 바이패스 기구 내의 튜브 또는 필터 상에 코팅된 FIX 폴리펩티드와 접촉될 수 있다. 생체내 투여될 때, 활성 화합물은 액체, 반액체 또는 고체 형태로 임의의 적합한 경로, 예컨대 경구, 비강, 폐, 비경구, 정맥내, 피내, 피하, 관절내, 대조내(intracisternally), 안내, 뇌실내, 경막내, 근육내, 복강내, 기관지내 또는 국부로 투여될 수 있을 뿐만 아니라 이의 임의의 2 이상의 조합물로 투여될 수 있고, 각 투여 경로에 적합한 방식으로 제형화된다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 1회 또는 1회 이상, 예컨대 2회, 3회, 4회, 또는 치료 효과를 달성하는데 필요한 임의의 횟수로 투여될 수 있다. 다중 투여는 임의의 경로 또는 경로의 조합을 통해 실시될 수 있고, 매시간마다, 매 2시간마다, 매 3시간마다, 매 4시간마다 또는 그 이상마다 투여될 수 있다.
가장 적합한 투여 경로는 치료받는 질환 상태, 예컨대 출혈성 장애의 위치에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, FIX 폴리펩티드는 투여(주입) 시간을 약 2 내지 5분으로 하여 정맥내 볼루스 주사로 투여될 것이다. 다른 예에서, FIX의 바람직한 혈액 수준은 혈장 수준에 의해 확인되는 바와 같이 활성제의 연속 주입에 의해 유지될 수 있다. 물론, 주치의는 독성이나 골수, 간, 신장 기능이상으로 인해 치료를 종결하거나, 중단하거나 또는 낮은 투여량으로 조정하는 방법과 시기를 알고 있을 것이다. 이와 반대로, 주치의는 임상 반응이 적절하지 않다면(독성 부작용은 배제), 더 높은 수준으로 치료를 조정하는 방법 및 시기도 또한 알고 있을 것이다. 다른 예에서, 출혈성 장애의 위치는 FIX 제형이 대체 경로를 통해 투여되고 있음을 시사할 수도 있다. 예를 들어, 국소 투여, 예컨대 뇌 내로의 투여(예컨대, 뇌실내)는 이 영역에 출혈이 있는 환자에게 실시될 수 있다. 유사하게, 관절 내 출혈의 치료를 위하여, 치료제의 관절 내로의 주입에 의한 국소 투여(즉, 관절내, 정맥내 또는 피하 방식)가 이용될 수 있다. 다른 예에서, 치료제의 피부로의 국부 투여, 예컨대 크림, 젤 또는 연고로 제형화된 경우의 투여, 또는 흡입에 의한 폐로의 투여 또는 기관지내로의 투여는 출혈이 이 부위에 국한적일 때 적절할 것이다.
변형된 FIX 폴리펩티드가 데포(depot) 제제로 제형화되어야 하는 경우, 지속성(long-acting) 제형이 이식에 의해(예컨대, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주입에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 치료 화합물은 적합한 중합체 재료 또는 소수성 재료(예컨대, 허용가능한 오일 내의 유탁액으로서) 또는 이온교환수지로 제형화되거나, 또는 난용성(sparingly soluble) 유도체, 예컨대 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
요구하다면, 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 포함할 수 있는 패키지, 키트 또는 디스펜서 기구에 제공될 수 있다. 예를 들어, 패키지는 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 함유한다. 팩 또는 디스펜서 기구는 투여 지시서를 동반할 수 있다. 활성제를 함유하는 조성물은 패키징재(packaging material), 본원에서 제공되는 제제, 및 상기 제제가 제공되는 장애를 나타내는 라벨을 함유하는 제조품으로 포장될 수 있다.
3. 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 투여(유전자 치료)
또한, 유전자 요법에 적합한 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터 및 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 조성물이 제공된다. 단백질 전달 대신에, 핵산은 생체내로, 예컨대 전신 또는 다른 경로로, 또는 생체외로, 예컨대 림프구를 포함하는 세포의 제거(removal), 여기에 핵산의 도입, 및 숙주 또는 양립가능한 수용체(compatible recipient)로의 재도입에 의해 투여될 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드는 핵산 분자의 발현에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 생체외 기술 및 직접 생체내 발현을 포함하여, 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자로서 투여될 수 있다. 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 분리된 핵산 서열은 추가 조작을 위해 벡터에 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이의 발현 또는 복제를 위해 이종 DNA를 세포내로 도입시키는데 사용되는 분리된 구성요소를 의미한다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자의 기술범위 내에 포함된다.
암호화 핵산 분자의 발현에 의한 변형된 FIX 폴리펩티드의 투여 방법은 재조합 벡터의 투여를 포함한다. 벡터는 복제 오리진의 포함 등에 의한 에피솜성을 유지하도록 설계될 수 있거나, 또는 세포 내 염색체 내로 통합되도록 설계될 수 있다. 또한, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비바이러스성 벡터를 이용하는 생체외 유전자 발현 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 변형된 FIX 폴리펩티드를 발현하도록 조작될 수 있으며, 예컨대 이는 변형된 FIX 폴리펩티드 암호화 핵산을 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 게놈 위치에 통합시키거나 또는 상기 핵산을 게놈 위치의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 통합시켜 실시할 수 있다. 이러한 세포는 그리고나서 치료를 요하는 환자와 같은 대상체에게 국소 투여되거나 또는 전신 투여될 수 있다.
바이러스 벡터는 예컨대 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 및 유전자 요법용으로 사용될 수 있도록 설계된 다른 것들을 포함한다. 벡터는 에피솜 형태를 유지할 수 있거나, 또는 치료되는 대상체의 염색체 내로 통합될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 치료를 요하는 대상체에게 투여되는 바이러스에 의해 발현될 수 있다. 유전자 요법에 적합한 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스 및 상기 언급된 다른 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 기술은 당업계에 공지되어 있고, 아데노바이러스 생산 및 투여 방법도 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 혈청형(serotype)은 예를 들어, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC, Rockville, MD)로부터 입수가능하다. 아데노바이러스는 생체외에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 세포는 치료를 요하는 환자로부터 분리되고, 변형된 FIX 폴리펩티드를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 형질도입된 세포는 적합한 배양 기간 후에 대상체에게 국소적으로 및/또는 전신으로 투여된다. 대안적으로, 변형된 FIX 폴리펩티드 발현성 아데노바이러스 입자는 분리되고, 대상체의 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 개선시키기에 치료학적으로 효과적인 양으로 전달하기 위해 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 제형화한다. 전형적으로, 아데노바이러스 입자는 대상체 체중 1kg당 입자 1 내지 1014개 범위, 일반적으로 대상체 체중 1kg당 입자 106 또는 108 개 내지 1012 개 사이의 범위의 용량으로 전달된다. 일부 상황에서, 핵산 공급원에 세포를 표적화하는 제제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적세포에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, FIX는 특정 세포 유형으로 전달되도록 표적화될 수 있다. 예를 들어, FIX 폴리펩티드를 암호화하는 아데노 바이러스 벡터는 간세포와 같이 비분열성 세포에서 안정한 발현용으로 사용될 수 있다(Margaritis et al.(2004) J Clin Invest 113: 1025-1031). 다른 예에 서, FIX 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터는 후속 전달을 위해 분리된 세포 내로 도입될 수 있다. FIX의 발현 및 전달을 위한 추가의 세포 유형으로는 섬유아세포 및 내피 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
핵산 분자는 인공 염색체 및 다른 비바이러스성 벡터 내로 도입될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 ACES(Lindenbaum et al., (2004) Nucleic Acids Res. 32(21):e172 참조)는 이소폼을 암호화하고 발현하도록 조작될 수 있다. 간략히 설명하면, 포유동물 인공 염색체(MAC)는 유전자 정보의 대형 페이로드(payload)를 세포 내로 자율 복제성 비통합 형식으로 도입시키는 수단을 제공한다. MAC 중에서 독특한, 포유동물 위성 DNA 기반의 인공 염색체 발현(ACE)은 서로다른 종의 세포주에서 재현가능하게(reproducibly) 새로(de novo) 제조될 수 있고, 숙주 세포의 염색체로부터 용이하게 정제될 수 있다. 정제된 포유동물 ACE는 그리고나서 다양한 수용체(recipient) 세포주에 재도입될 수 있고, 여기서 ACE 시스템을 사용한 선택 압력의 부재 하에 연장된(extended) 기간 동안 안정하게 유지되었다. 이러한 시도를 사용하여, 하나 또는 두개의 유전자 표적의 특이적인 부하가 LMTK(-) 및 CHO 세포에서 달성되었다.
변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 도입시키는 또 다른 방법은 효모 인공 염색체(YAC) 내에 클로닝된 완전 아데노바이러스 게놈(Ad2; Ketner et al. (1994) PNAS 91: 6186-6190) 및 YAC 클론 내의 특정 영역을 표적화하는 아데노바이러스 서열, 관심있는 유전자를 위한 발현 카세트 및 양성 및 음성 선별 마커를 함유하는 플라스미드를 출발 물질로 사용하는 효모의 2단계 유전자 교체 기술이다. YAC는 큰 유전자의 혼입을 허용하기 때문에 특히 유익하다. 이러한 시도는 포유동물 세포 또는 전체 동물로 유전자 전이를 하기 위해 임의의 설명된 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 보유하는 아데노바이러스 기반 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다.
핵산은 세균 세포, 특히 약독화된 세균과 같은 세포로 도입되거나 또는 바이러스 벡터로 도입되거나, 또는 리포좀과 같은 비히클에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 리포좀이 이용될 때에는, 엔도시토시스(endocytosis)와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이, 예를 들어, 특정 세포 종류에 지향성인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 사이클링에서 내재화를 일으키는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 표적화 및/또는 흡수(uptake)를 촉진하는데 사용될 수 있다.
생체외 및 생체내 방법에서, 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 적합한 공여체(donor) 또는 치료되는 대상체 유래인 세포 내로 도입된다. 치료 목적으로 핵산이 도입될 수 있는 세포로는, 예컨대 치료될 질환 또는 상태에 적절한 임의의 바람직한 입수가능한 세포 종류를 포함하며, 그 예로는 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예컨대 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립세포; 다양한 줄기 또는 선조 세포, 특히 조혈 줄기 또는 선조 세포, 예컨대 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아간, 및 이의 다른 공급원에서 수득된 줄기 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
생체외 치료에서, 치료받는 대상체와 양립가능한 공여체 유래의 세포 또는 세포를 치료해야 하는 대상체 유래의 세포를 제거하고, 이들 분리된 세포에 핵산을 도입시키고, 변형된 세포를 대상체에 투여한다. 치료는 직접 투여, 예컨대 예를 들어, 다공성 막에 캡슐화하여 환자에게 이식하는 투여(예컨대, 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조, 각각 전문이 참조로서 인용됨)를 포함한다. 핵산을 시험관내에서 포유동물 세포 내로 전이시키기에 적합한 기술에는 리포좀 및 양이온성 지질(예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol) 전기침투, 미량주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘 침전법의 사용을 포함한다. DNA 전달 방법은 생체내에서 변형된 FIX 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 핵산의 리포좀 전달 및 나출 DNA 전달, 예컨대 전기침투, 초음파 및 인산 칼슘 전달 등과 같은 국소 및 전신 전달을 포함한다. 다른 기술로는 미량주사, 세포융합, 염색체 매개의 유전자 전이, 미세세포 매개의 유전자 전이 및 스페로플라스트(spheroplast) 융합을 포함한다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 생체내 발현은 추가 분자를 발현시키기 위해 연결될 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드의 발현은 조작된 바이러스에서와 같은 세포독성 산물의 발현과 연결될 수 있고, 또는 세포 독성 바이러스에서 발현될 수 있다. 이러한 바이러스는 치료 효과의 표적인 특정 세포 종류에 대해 표적화될 수 있다. 발현된 변형된 FIX 폴리펩티드는 바이러스의 세포 독성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 생체내 발현은 세포 특이적 또는 조직 특이적 프로모터와 같은 특정 조절 서열에 변형된 FIX 폴리펩티드 암호화 핵산 분자를 작동가능하게 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 변형된 FIX 폴리펩티드는 표적 세포 종류 및/또는 조직에서 특이적으로 감염 및/또는 복제되는 벡터로부터 발현될 수도 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드 발현을 선택적으로 조절하기 위해 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 조절가능한 발현 시스템의 예는 독시사이클린-유도성 유전자 발현시스템으로, 이는 재조합 FIX 발현을 조절하는데 사용된 바 있다(Srour et al., (2003) Thromb. Haemost. 90(3): 398-405).
나출 핵산으로서 또는 벡터, 인공 염색체, 리포좀 및 다른 비히클 내의 핵산 분자는 전신 투여, 국부 투여, 국소 투여 및 다른 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 전신 및 생체내 투여 시에, 핵산 분자를 함유하는 비히클 또는 핵산 분자는 세포에 대해 표적화될 수 있다.
또한, 투여는 전형적으로 세포 또는 조직을 표적으로 하는 세포 또는 벡터의 투여 등에 의해 직접적일 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 및 증식성 세포는 변형된 FIX 폴리펩티드의 생체내 발현을 위해 표적화된 세포일 수 있다. 또한, 변형된 FIX 폴리펩티드의 생체내 발현에 사용되는 세포는 환자 자신의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 환자로부터 제거된 후, 변형된 FIX 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산을 도입시키고, 그리고나서 주입 또는 접종(engraftment) 등으로 환자에게 투여될 수 있다.
H. 치료 용도
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 및 핵산 분자는 비변형된 FIX가 사용되는 임의의 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 선청성 및 후천성 출혈성 장애, 예컨대, 혈우병을 포함하는 출혈성 장애의 치료를 위한 응혈원(procoagulant)으로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 그러므로, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 출혈성 장애를 치료하는데 사용되는 응혈원이다. 다른 특정예에서, 그런데, 변형된 FIX폴리펩티드는 항응혈제(anticoagulant)로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들의 기질, FX에 대한 촉매 활성의 결여를 야기하는 하나 이상의 변형을 또한 함유하는 과글리코실화된 변형된 FIX 폴리펩티드는 혈전성 장애(thrombotic disorder)를 치료하기 위한 항응혈제로서 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 단독으로 또는 다른 제제와의 조합으로 치료 활성을 가진다. 본원에서 제공되는 변형된 폴리펩티드는 치료 활성을 유지하지만 변형된 성질, 예컨대, 개선된 약동학적 및 약력학적 성질, 저해제에 대한 증가된 내성 및/또는 개선된 촉매 활성을 나타내도록 설계된다. 이러한 변형된 성질 및 활성, 예를 들어, 폴리펩티드의 치료적 유효성을 개선시킬 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 및 암호화 핵산 분자는 비변형된 FIX가 사용되는 임의의 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이 섹션은 예시적 용도 및 투여 방법을 제공한다. 이들 설명된 치료법은 오로지 예시적이며, 변형된 FIX 폴리펩티드의 적용을 제한하지 않는다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 FIX를 사용하는 진단 방법뿐만 아니라 다양한 치료 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 이하에 설명되고 열거된 생리학적 및 의학적 상태의 치료 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 동일한 효과를 달성하기 위하여 더 낮은 투여량, 더 지속된 치료 효과 및 투여 및 치료에 있어서의 다른 개선을 포함하는, 야생형 FIX와 비교하여 생체내 활성 및 치료 효과의 개선을 나타낼 수 있다.
본원에서 기술된 변형된 FIX 폴리펩티드는 비현형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 개선된 약동학적 및 약력학적 성질, 증가된 효소 활성, 저해제에 대한 증가된 내성 및/또는 증가된 응혈 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들어, 선천성 출혈성 장애 및 후천성 출혈성 장애를 포함하는 출혈성 장애의 치료를 위한 응혈원으로서 사용될 수 있다. 일부 예에서, 비-천연(non-native) 글리코실화 부위를 가진 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 응고를 저해하는 변형된 FIX 폴리펩티드를 야기하는 변형을 함유하여, 변형된 FIX 폴리펩티드가 항-응혈제이고 예를 들어, 혈전성 질환 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 더 오래 지속되고, 더 안정한 치료제를 전달하는데 사용될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하는 치료적 개선의 예는, 더 낮은 투여량, 더 적은 및/또는 더 적은 투여 빈도, 감소된 부작용 및 증가된 치료 효과를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
전형적으로, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 응혈원이고, 선천성 출혈성 장애 및 후천성 출혈성 장애를 포함하는 출혈성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 치료를 위해 다른 변형된 및 비변형된 FIX 폴리펩티드가 사용되어온 치료 방법에 사용하기 위해 의도된다. 단독 또는 다른 제제, 예컨대 다른 응혈원와 조합하여 변형된 FIX 폴리펩티드로 치료될 수 있는 예시적 질환 및 장애는 혈액 응고 장애, 혈액병, 출혈성 장애, 혈우병, 특히 혈우병 B 및 외상 및 수술과 관련된 출혈을 포함하는 후천성 혈액 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, FIX 폴리펩티드에 의해 치료될 출혈은 기관, 예컨대 뇌, 내이 영역(inner ear region), 눈, 간, 폐, 종양 조직, 위장관에서 발생한다. 다른 실시예에서, 출혈이 출혈성 위염(hemorrhagic gastritis) 및 다량의 자궁 출혈(uterine bleeding)와 같이 분산된다(diffuse).
출혈성 장애, 예컨대 혈우병을 갖는 환자는 종종 발치를 포함하는 수술, 또는 외상 동안에 출혈 및 과도한 출혈에 대한 위험이 있다. 이러한 환자는 종종 변형된 FIX 폴리펩티드로 치료될 수 있는 급성 혈관절증(acute haemarthroses) (관절 내 출혈), 만성 혈우병성 관절증(hemophilic arthropathy), 혈종, (예건대, 근육, 복막뒤, 설하선 및 인두뒤), 다른 조직 내 출혈, 혈뇨(신장관 유래의 출혈), 중추신경계 출혈, 위장 출혈(예컨대, UGI 출혈)을 가진다. 따라서, 일부 실시예에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대상체의 외상 또는 수술, 또는 저하된 혈소판의 수 또는 활성으로 인한 출혈 에피소드를 치료하는데 사용될 수 있다. 수술을 받은 환자에 대한 예시적 방법은 출혈을 방지하는 치료 및 수술 전, 수술 중 또는 수술 후 치료를 포함한다.
전형적으로 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드가 비변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 개선된 응혈 활성을 나타냄에도 불구하고, 일부 예에서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 하나 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 함유할 수 있고, 또한 기능적 펩티다제 활성이 결여될 수 있다. 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드는 혈액 응고를 저해하기 위한 치료 방법에 사용될 수 있다(미국 특허 번호 6,315,995 참조). 혈액 응고를 저해하는 변형된 FIX 폴리펩티드는 허혈성 및 혈전성 장애를 위한 항응혈제 치료 방법에 사용될 수 있다. 과다한 응고의 증가된 위험, 예컨대 심정맥 혈전증(DVT) 또는 표재정맥 혈전증(SVT)을 가지는 수술 환자에서, 항응혈제인 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 수술에 있어서 과다한 응고를 예방하기 위해 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 치료는 FIX 단독으로 수행된다. 일부 경우에서, FIX는 치료될 상태 또는 질환에 의해 요구되는 바와 같이 항응고 인자(anticoagulation factor)와 함께 투여된다.
변형된 FIX 폴리펩티드를 이용한 질환 및 상태의 치료는 주입, 폐, 경구 및경피 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는 본원에서 기술된 바와 같은 적합한 제형을 이용하여 임의의 투여 경로에 의해 실시될 수 있다. 필요하다면, 특정 투여량및 기간 및 치료 프로토콜이 경험적으로 결정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 및 천연 FIX 폴리펩티드의 예시적 용량, 예컨대 상기 기술된 바와 같은 BeneFIX® 제 IX 응고 인자(재조합)의 권고된 투여량은 적절한 투여량을 결정하기 위한 시점으로서 이용될 수 있다. 과글리코실화되고 생체내에서 증가된 반감기를 가지거나, 또는 저해제에 대한 증가된 내성을 가지거나, 또는 증가된 촉매 활성을 가지는 변형된 FIX 폴리펩티드는 감소된 투여량 및/또는 빈도로 실시될 수 있다. 비변형된 FIX 폴리펩티드를 위한 투여량 및 투여 요법은 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드를 위한 투여량을 결정하기 위한 지침으로서 이용될 수 있다. 인자, 예컨대 비변형된 FIX와 비교하여 변형된 FIX의 반감기 및 활성 수준은 이러한 결정을 하는데 이용될 수 있다. 특정 투여량 및 요법은 경험적으로 결정될 수 있다.
투여량 수준 및 요법은 공지된 투여량 및 요법을 기초로 결정될 수 있고, 필요하다면 변형된 폴리펩티드의 성질의 변화를 기초로 추정될 수 있고/있거나 다양한 인자를 기초로 경험적으로 결정될 수 있다. 이러한 인자는 개인의 체중, 일반적 건강, 나이, 사용된 특정 화합물의 활성, 성별, 식이, 투여 시간, 배출율, 약물 병용, 질환의 중증도 및 경과(course), 질환에 대한 환자의 기질(disposition) 및 치료 의사의 판단을 포함한다. 활성 성분인 폴리펩티드는 전형적으로 약제학적으로 유효한 담체와 함께 조합된다. 단일 투여형 또는 다중 투여형을 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 함량은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 의존하여 다양할 수 있다.
혈액 응고 시간에 대한 FIX 폴리펩티드의 효과는 전혈 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT), 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 활성화된 응고 시간(ACT), 재석회화 활성화된 응고 시간, 또는 리-화이트(Lee-White) 응고 시간을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 응고 시험을 이용하여 모니터될 수 있다.
환자 상태가 개선되자마자, 화합물 또는 조성물의 유지량(maintenance dose)이 투여될 수 있고, 필요하다면; 투여량, 투여 형태, 또는 투여 빈도, 또는 이의 조합은 변형될 수 있다. 일부 경우에서, 대상체는 질환 증상의 임의의 재발을 기초로 한 또는 계획된 투여량을 기초로 한 장기간 상의 간헐 치료를 필요로할 수 있다. 다른 경우에, 추가적 투여는 출혈, 외상, 또는 수술 처치(surgical procedure)와 같은 급성 사건에 대한 반응으로 필요로 할 수 있다.
혈우병
혈우병은 하나 이상의 혈액 응고 인자의 결함(deficiency)에 의해 야기되는 출혈성 장애이다. 이것은 조직 손상 부위에서의 혈액 응고를 형성하는 감소된 능력에 의해 특징화될 수 있다. 선천성 X-연관된 혈우병은 각각 FVIII 및 FIX에 있어서의 결함에 의해 야기된, 혈우병 A 및 혈우병 B, 또는 크리스마스 질환을 포함한다. 혈우병 A는 남성 10,0000명 중 1명의 비율로 발생하고, 혈우병 B는 남성 50,000명 중 1명의 비율로 발생한다.
혈우병을 가지는 환자는 외상에 대한 반응으로 또는 저절로 일어날 수 있는 재발성 관절 및 근육 출혈을 겪을 수 있다. 출혈은 중증의 급성 통증, 제한된 움직임(restrict movement)을 야기할 수 있고, 활액 분비 비대(synovial hypertrophy)를 포함하는 2차 합병증(secondary complication)을 초래할 수 있다. 게다가, 관절에 있어서의 재발성 출혈은 관절 손상, 활막(synovium), 연골(cartilage) 및 뼈 파괴를 야기할 수 있는 만성 활액막염(synovitis)을 야기할 수 있다.
본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드 및 본원에서 제공되는 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 혈우병과 관련된 출혈 상태의 치료를 포함하는 혈우병에 대한 치료에 이용될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 예를 들어, 자발적 방혈 에피소드(spontaneous bleeding episode)를 조절 또는 예방하거나 외상 또는 수술 처치에 대한 반응으로 출혈을 조절 또는 예방하는데 이용될 수 있다.
본원의 변형된 FIX 폴리펩티드는 개선된 약동학적 및 약력학적 성질, 예컨대 개선된 혈청 반감기, 저해제에 대한 증가된 내성, 증가된 효소 활성, 및/또는 증가된 응혈 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 더 오래 지속되게 전달하는데 이용될 수 있거나, 그렇지 않으면 혈우병을 위한 개선된 치료법으로 이용될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하는 치료적 개선의 예는 예를 들어, 더 낮은 투여량, 더 적은 및/또는 더 적은 투여 빈도, 감소된 부작용, 및 증가된 치료 효과를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
변형된 FIX 폴리펩티드는 예를 들어, 동물 모델을 이용함로써, 치료적 유효성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, FIX-결핍 마우스, 또는 혈우병에 대한 임의의 다른 공지의 질환 모델은 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하여 치료될 수 있다. 질환 증상의 진행 및 표현형은 변형된 FIX 폴리펩티드의 효과를 평가하기 위해 모니터된다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 비변형된 FIX를 이용하는 대조군 및/또는 위약 대조군과 비교하여 생체내 유효성을 평가하기 위하여 대상체, 예컨대 임상 시험 뿐만 아니라 동물 모델에 투여될 수 있다.
a. 혈우병 B
혈우병 B는 FIX 치료제의 투여와 함께 효과적으로 관리될 수 있다. 중증의 혈우병 B를 갖는 환자는 FIX 활성 < 1IU/dL(정상 활성의 1%)을 가지고, 중도의 혈우병을 갖는 환자는 1-5 IU/dL의 FIX 활성(정상 활성의 1-5%)을 가지며, 온화한 혈우병 B를 갖는 환자는 5 초과 내지 40 미만 IU/mL의 FIX 활성(정상 활성의 5% 초과 내지 40% 미만)을 가진다. 적절한 양의 FIX를 이용한 특정 출혈 에피소드의 치료 및/또는 적절한 예방 치환 요법(prophylactic replacement therapy)와 함께, 환자는 종종 정상 수명(life span)을 달성할 수 있다. FIX의 투여는 수술, 외상 동안, 발치 동안의 출혈을 조절하는 것을 도울 수 있거나, 혈관절증, 혈뇨, 점막 피부의 출혈, 예컨대 코피 또는 위장관 출혈, 골막하의(subperiosteal) 뼈 또는 연조직에 있어서 낭포성 장애(cystic lesion), 또는 신경계 합병증, 예컨대 두개강내 출혈(intracranial bleeding), 척추관 출혈(spinal canal bleeding)을 야기하는 혈종과 관련된 출혈을 완화(경감)시키는 것을 도울 수 있다. 혈우병을 갖는 환자의 사망은 종종 중추 신경계에 있어서의 출혈의 결과이다. 혈우병 환자에 있어서의 다른 심각한 합병증은 응고 인자 치료법 및 질환에 대한 저해제의 발달(development)을 포함한다.
혈우병 B 환자에 있어서의 FIX 유전자의 가장 빈번한 변경(alteration)은 점 돌연변이, 특히 미스센스 돌연변이(missense mutation)이다. 확인된 FIX 돌연변이의 대부분은 종종 진화론적으로 보존된 아미노산에 영향을 미치는 FIX 유전자의 코딩 영역 내 아미노산 잔기에서 발생된다. 혈우병의 중증도는 돌연변이의 성질(nature)에 의존된다. 코딩 영역 내 돌연변이는 프로테아제 활성, 보조 인자 결합, 시그널 펩티드 또는 프로펩티드의 절단, 번역후 변경, 및 FIX의 이들의 활성형으로의 절단의 저해의 변경을 포함하는 FIX 폴리펩티드의 다수의 서로다른 성질 또는 활성에 영향을 미칠 수 있다. 다른 유형의 점 돌연변이는 불안정한 끝을 자른(unstable truncated) FIX 폴리펩티드를 생산하는 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 및 말단 이탈된(terminally aberrant) FIX 분자를 야기하는 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation)(작은 결실 및 삽입)를 포함한다. 또한, FIX 점 돌연변이는 몇몇 응고 제 IX 인자의 감소된 전사를 야기하는, 몇몇 특이적 유전자 조절 단백질에 대한 인식 서열을 방해할 수 있는 프로모터 영역내에서 발견될 수 있다. 전사 이상의 결과로서 감소된 FIX은 소위 혈우병 B 레이든(Leyden)으로 불린다. 프로모터 영역 내 예시적 돌연변이는 안드로겐 수용체에 의해 FIX 전사의 조절에 영향을 미치는 HNF-4 결합 부위의 방해를 포함한다. 혈우병의 이 유형의 중증도는 FIX 전사 결함을 부분적으로 완화(경감)하고 사춘기 동안 증가하는 혈액 내 안드로겐 수준에 의해 지배된다(Kurachi et al. (1995)). 다른 미스센스 뉴클레오티드 변화는 제 IX 인자 1차 전사체의 프로세싱에 영향을 미친다. 예를 들어, 일부 돌연변이는 잠재 스플라이스 접합(cryptic splice junction)을 생산시킬 수 있고 스플라이오솜(spliceosome)의 조립을 방해할 수 있는 진화론적으로 보존된 공여-스플라이스(GT), 및 수용체-스플라이스(AG) 컨센서스 서열에서 발생된다. 혈우병의 일부 중증 경우(약 10%)는 FIX 유전자에 있어서의 대구모 결실과 함께 제시된다.
FIX 결함, 및 따라서 혈우병 B의 치료, 대부분은 종종 FIX의 재조합 형태, 정제된 혈장 FIX 제제 또는 정제된 혈장 농축물(concentrate)를 포함하는 FIX의 투여를 포함한다. 따라서, 유사하게, 본원의 변형된 FIX 폴리펩티드, 및 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 혈우병 B의 치료를 위해 이용될 수 있다. 본원의 변형된 FIX 폴리펩티드는 개선된 약동학적 및 약력학적 성질, 예컨대 개선된 혈청 반감기, 저해제에 대한 증가된 내성, 증가된 효소 활성, 및/또는 증가된 응혈 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 혈우병을 위한 개선된 치료제을 전달하는데 이용될 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하는 치료적 개선의 예는 예를 들어, 더 낮은 투여량, 더 적은 및/또는 더 적은 투여 빈도, 감소된 부작용, 및 증가된 치료 효과를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
b. 혈우병 A
혈우병의 전체 경우의 약 85%를 차지하는 혈우병 A는 X 염색체 상의 제 VIII 인자 유전자에 있어서의 돌연변이(들)로 인해 야기되어 FVIII 단백질의 결함 또는 기능이상으로 이어진다. 전형적으로, 천연 FIX 폴리펩티드는 응고에 영향을 주기위한 효소 활성에 FVIIIa가 필요하기 때문에, 재조합 FIX 폴리펩티드, 예컨대 BeneFIX® 제 IX 응고 인자(재조합), 또는 혈장-정제된 FIX 폴리펩티드를 포함하는 천연 FIX 폴리펩티드를 이용한 혈우병 A의 치료는 권고되지 않는다. 그런데, FIX 내재성 활성(intrinsic activity)을 증가시키기 위하여 하나 이상의 변형을 함유하는 예컨대 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 FIX 폴리펩티드는 혈우병 B의 치료에 이용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 FVIII-독립적 활성을 가지고, 따라서 혈우병 A 환자에 있어서 응혈제로서 기능할 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 변형된 FIX 폴리펩티드, 예컨대 하나 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 도입하거나 제거하기 위한 하나 이상의 변형, 및/또는 AT-III 및/또는 헤파린에 대한 내성을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형을 함유하고, 또한 FVIIIa의 부존재 시 변형된 FIX 폴리펩티드의 활성을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형을 함유하는 것은 혈우병 A를 갖는 환자에 있어서의 출혈 에피소드를 치료하는데 사용될 수 있다.
이들이 FVIIIa-독립적 방식으로 작용할 수 있도록 FIX 폴리펩티드의 내재성 활성을 증가시키기 위한 변형은 상기 및 다른 곳에서 기술되고(예를 들어, Hopfner et al., (1997) EMBO J. 16:6626-6635; Kolkman et al., (2000) Biochem . 39:7398-7405; Sichler et al., (2003) J. Biol . Chem 278:4121-4126; Begbie et al., (2005) Thromb Haemost . 94(6):1138-47, 미국 특허 번호 6,531,298 및 미국 특허 공개 번호 20080167219 및 20080214461 참조), 아미노산 치환 V86A, V86N, V86D, V86E, V86Q, V86G, V86H, V86I, V86L, V86M, V86F, V86S, V86T, V86W, V86Y, Y259F, A261K, K265T, E277V, E277A, E277N, E277D, E277Q, E277G, E277H, E277I, E277L, E277M, E277F, E277S, E277T, E277W, E277Y, R338A, R338V, R338I, R338F, R338W, R338S, R338T, Y345F, I383V 및 E388G를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 치환 Y259F/K265T, Y259F/K265T/Y345F, Y259F/A261K/K265T/Y345F, Y259F/K265T/Y345F/I383V/E388G 또는 Y259F/A261K/K265T/Y345F/I383V/E388G를 함유할 수 있고, 증가된 내재성 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 변형된 FIX 폴리펩티드는 따라서 혈우병 A의 치료에 이용될 수 있다.
J. 병용 요법
본원에서 기술된 임의의 변형된 FIX 폴리펩티드 및 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 다른 생물제제, 소분자 화합물 및 수술을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 치료 제제 또는 처치와 함께, 전에, 간헐적으로, 또는 후속(subsequent to)으로 투여될 수 있다. FIX가 지시되거나 사용되었고 다른 제제 및 치료가 이용가능한, 상기 예시된 모든 것을 포함하는 임의의 질환 또는 상태를 위하여, FIX는 이와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드는 유사하게 사용될 수 있다. 치료될 질환 또는 상태에 의존하여, 예시적 병용은 다른 혈장 정제된 또는 재조합 응고 인자, 응혈원, 항응혈제, 항-응고 항체, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 헤파린, 헤라피노이드(heparinoid), 헤파린 유도체, 헤파린 유사 약물, 쿠마린(coumarin), 예컨대, 와파린(warfarin) 및 쿠마린 유도체와의 병용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 응혈원 성질을 가지는 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하는 병용 요법에 이용될 수 있는 추가적인 응혈원은 비타민 K, 비타민 K 유도체, 다른 응고 인자, 및 단백질 C 저해제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항응혈 성질을 가지는 본원에서 제공되는 변형된 FIX 폴리펩티드를 이용하는 병용 요법에 이용될 수 있는 추가적인 항응혈제는 β2 아드레날린 수용체 길항제(β2 adrenoreceptor antagonist), 신경펩티드 V2 길항제, 프로스타사이클린 유사체, 트롬복산 합성효소(thromboxane synthase) 제해제, 칼슘 작용제(calcium agonist), 엘라스타제 저해제, 비스테로이드성 항염증 분자, 트롬빈 저해제, 리폭시게나아제 저해제, FVIIa 저해제, FXa 저해제, 포스포디에스테라아제 III 저해제, 피브리노겐, 비타민 K 길항제, 및 당단백질 IIb/IIIa 길항제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
K. 제조품 및 키트
변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 이의 유도체 또는 생물학적 활성 부분을 위한 변형된 FIX 폴리펩티드의 약제학적 화합물은 포장재, FIX-매개 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 약제학적 조성물, 및 변형된 FIX 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 FIX-매개 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 것임을 지시하는 라벨을 함유하는 제조품으로서 포장될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재를 함유한다. 약제학적 산물의 포장에 사용되기 위한 포장재는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 이들의 전체가 각각 본원에서 참고인용되는 미국 특허 5,323,907, 5,033,252 및 5,052,558를 참조한다. 약제학적 포장재의 예로는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이엘, 용기, 주사기, 병, 및 선택된 제형과 투여 및 치료의 의도된 방식에 적합한 임의의 포장재를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. FIX-매개 질환 또는 장애를 위한 다양한 치료와 같이 임의의 본원에서 제공되는 화합물 및 조성물의 제형의 다양한 어레이가 고려된다.
변형된 FIX 폴리펩티드 및 핵산 분자 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 본원에서 기술된 약제학적 조성물 및 투여를 위한 물품(item)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 FIX가 주사기, 흡입기, 투여량 컵, 점적기 또는 도포기와 같은 투여용 기구와 함께 공급될 수 있다. 키트는, 임의적으로, 투여량, 투여 요법 및 투여의 방식을 위한 지시를 포함하는 적용(application)을 위한 지시를 포함한다. 키트는 또한 본원에서 기술된 약제학적 조성물 및 진단을 위한 물품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 대상체의 FIX 조절된 시스템 또는 FIX의 농도, 함량 또는 활성을 측정하기 위한 물품을 포함할 수 있다.
본 발명은 개선된 치료적 성질을 갖도록 설계된 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
도면 1은 응고 캐스캐이드를 묘사한다. 이 도면은 FXa 의 독립적 생성에 대한 내인성 경로 및 외인성 경로와 이 경로들이 공통 경로로 수렴되어 응괴 형성을 위한 트롬빈과 피브린을 생성함을 나타낸다. 이 경로들은 상호연관성이 있다. 이 도면은 자이모겐이 하나 이상의 펩티드 결합의 절단에 의해 활성화된 프로테아제로 전환되는 활성화 캐스캐이드에 관여하는 분자의 순서를 나타낸다. 활성화된 프로테아제는 이어서 캐스캐이드에서 다음 자이모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로서 작용하여, 최종적으로는 응괴를 형성시킨다.
도면 2는 세포 기반 응고 모델을 묘사한다(예컨대, Hoffman 등 (2001) Thromb Haemost 85: 958-965). 이 도면은 TF-보유 세포 상에 존재하는 TF/FVIIa 복합체에 의한 FX의 FXa로의 활성화에 의해 응고 개시가 달성되어 FXa/FVa에 의한 활성화 후 소량의 트롬빈이 생성되는, 3 상으로 분리된 응고 사건들을 묘사한다. 트롬빈이 혈소판에 결합하여 혈소판을 활성화시킬 때 증폭이 일어나고, 이 증폭은 적당한 응고인자의 충분한 양의 활성화를 개시시켜 FVIIIa/FIXa 및 FVa/FXa 복합체를 형성시킨다. 응고 전파가 상처 부위에 있는 다수의 활성화된 혈소판의 표면에서 발생하여, 피브리노겐으로부터 상처 부위에 응괴를 형성시키기에 충분한 피브린을 생성시키기에 충분히 많은 폭발적인 트롬빈 생성을 야기한다.
도면 3은 종 변이체 및 변형된 제 IX 인자 폴리펩티드를 포함한, 다양한 제 IX 인자 폴리펩티드들(서열번호:2-5, 14, 20, 172, 267, 247, 325, 346-347, 360, 365-366, 406)의 정렬이다. 또한, 돌연변이 V86A/E277A/R338A 를 포함하는 미국특허 7,700,734호 유래 서열번호 6, 및 미국특허 7,125,841호 유래 서열번호 2가 포함된다. "*" 는 상기 정렬에서 모든 서열들에 동일한 행의 잔기 또는 뉴클레오티드를 나타내며, ":" 은 보존적 치환이 관찰된 것을 나타내며, "." 은 반-보존적 치환이 관찰된 것을 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같이, 서열번호 3의 위치들에 상응하는 잔기들은 서열번호 3과의 정렬에 의해 결정될 수 있다. Y155, R318, R338, T343, R403 및 E410 에 상응하는 잔기들을 박스된 글씨로 나타내었다.
이하 실시예는 단지 예시하기 위한 목적으로 포함되고, 본 발명의 범위를 제한되지 않도록 의도되지 않는다.
L. 실시예
실시예 1. 제 IX 인자 폴리펩티드의 클로닝 및 발현
A. FIX 유전자 클로닝
461개 아미노산의 인간 FIX 전구체 폴리펩티드(P00740; 서열번호 1에 제시된)를 암호화하는 핵산은 신장 인자-1α(EF-1α) 코어 프로모터 및 R 분절 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV) 타입 1 장말단 반복의 U5 서열(R-U5')을 포함하는, 합성 프로모터(composite promoter), hEF1-HTLV를 함유하는, 포유동물 발현 벡터인 pFUSE-hIgG1-Fc2(pFUSE로서 여기에서 약어된)에 클로닝했다. In-Fusion CF Dry-Down PCR 클로닝 키트(Clontech)가 공급자(supplier)에 의해 특정된 조건에 따라 사용되었다.
융합 공정(In-Fusion process)을 위하여, 인간 면역글로불린 1(hIgG1) Fc 부분 없는 플라스미드 pFUSE는 pFUSE-Acc-F1 정방향 프라이머(forward primer): GTGCTAGCTGGCCAGACATGATAAG(서열번호 24) 및 pFUSE-Acc-R3 역방향 프라이머(reverse primer): CATGGTGGCCCTCCTTCGCCGGTGATC(서열번호 25)를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)를 이용하여 선형화되었고(linearized), 수용체 DNA(Acceptor DNA)로서 이용되었다. FIX의 전장 코딩 서열은 FIX-wtsp-Invivo-F1 정방향 프라이머: CGAAGGAGGGCCACCATGCAGCGCGTGAACATGATC(서열번호 26) 및 FIX-Invivo-R1 역방향 프라이머: TGTCTGGCCAGCTAGCACTTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCC(서열번호 27)와 함께, 주형으로서 인간 FIX cDNA(Origene)을 이용하는 PCR에 의해 증폭되었다. 상기 제시된 두 개의 FIX 공여(donor) 증폭 프라이머를 위하여 FIX 'ATG' 개시 및 'TAA' 종결 코돈의 상보적 서열이 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 서열에 있어서 밑줄이 쳐진다. 18개의 뉴클레오티드(18-nt) 길이의 상동 영역(homology region)인 융합(In-Fusion)을 위한 비-어닐링 5’ 프라이머 말단(tail)는 진한 글씨(bold)로 나타내었다. 표준 PCR 반응 및 열순환 조건은 제조업자에 의해 권고된 바와 같이, Phusion High Fidelity 마스터 믹스 키트(New England Biolabs)와 함께 이용되었다. 수용체 및 공여 PCR 산물 모두는 그리고나서 DpnI 제한 효소로 소화분해되어 이.콜라이(E. coli)-유래 dam 메틸화된 PCR 주형 배경(백그라운드; background)가 제거되었다. 그들은 그리고 나서 함께 혼합되었고, 융합 반응(In-Fusion reaction)은 공급자에 의해 특정된 조건을 이용하여 진행되었다(run). 반응 혼합물은 이.콜라이 XL1블루 슈퍼컴페턴트 세포(supercompetent cell)(Stratagene) 내로 형질전환되었다. 콜로니가 25 ppm 제오신(Zeocin)이 보충된 2xYT 한천 플레이트(agar plate) 상에서 선택되었다. 플라스미드 DNA가 선택된 클론으로부터 분리되었고, 정확한 클로닝을 확인하도록 서열분석되었다(sequenced).
B. FIX 변이체의 제조
FIX 변이체는 새로 합성되는 DNA에 설계된 돌연변이를 혼입시키기 위한 프라이머로서 작용하는 특이적으로 설계된 올리고뉴클레오타이드와 함께, 제조자의 지시에 따라 QuikChange Lightning 부위 지시된 돌연변이유발(Site-Directed Mutagenesis) 키트(Stratagene)을 이용하여 제조되었다. 희망하는(desired) 돌연변이를 포함하는 상보적 프라이머는, 주형으로서 클로닝된 FIX cDNA 서열을 함유하는 정제된, 이중 가닥 초나선형 pFUSE 플라스미드 DNA를 이용하여 사이클링동안 신장시켰다. 프라이머의 신장은 새로 합성된 가닥 내로 관심있는 돌연변이를 혼입을 야기하였고, 스태거드 닉(staggered nick)을 갖는 돌연변이된 플라스미드가 야기되었다. 증폭 후에, 돌연변이유발 산물은 Dpn I 제한 효소로 소화분해되어 이.콜라이 유래의 pFUSE DNA의 dam-메틸화된 모 가닥이 제거되었다. DNA는 그리고나서 XL1블루 슈퍼컴페턴트 세포(Stratagene)으로 형질전환되었고, 이어서 25 ppm 제오신이 보충된 2xYT 한천 플레이트 상에서 선택되었다. 플라스미드 DNA가 선택된 클론으로부터 분리되었고, FIX 유전자 상에 목적한(desired) 위치(들)에 돌연변이(들)의 혼입을 확인하기 위해 서열분석되었다.
FIX 변이체를 제조하기 위해 사용된 각각의 상보적 프라이머 쌍 유래의 올리고뉴클레오타이드 중 하나의 뉴클레오타이드 서열은 표 12에서 제공된다. 치환된 아미노산을 암호화하는 3개의 뉴클레오티드 서열은 대문자(uppercase)로 나타낸다. 예를 들어, 치환 A103N/N105S(키모트립신 번호매김 시 A[103]N/N[105]S; 서열번호 77)를 함유하는 FIX 변이체를 제조하기 위해, A103N/N105S - 정방향 프라이머(Forward primer), 및 A103N/N105S - 정방향 프라이머에 상보적인 프라이머가 9-bp 'GCTgatAAC' 야생형 서열을 9-bp 'AATgatAGC' 돌연변이 서열로 교체시키는데 이용되었다(변화된 3개의 뉴클레이타이드은 대문자로 나타낸다).
하기 표 12는 FIX 돌연변이유발을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제시한다. 3개의(triplet) 돌연변이는 대문자로 나타내고, 프라이머 명칭은 상기 프라이머를 이용한 돌연변이 유발의 결과로서 생산된, 키모트립신 번호 매김에 의한, 돌연변이에 상응한다.
표 12.
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Figure 112017042341398-pat00019
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하기 표 13은 서열번호 3에 제시된 성숙 FIX 폴리펩티드와 비교한 번호 매김, 및 또한 키모트립신 번호 매김을 이용하여 나타낸 돌연변이를 갖는, 생산된 FIX 변이체를 열거한다.
표 13. FIX 변이체
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C. FIX 폴리펩티드의 발현 및 정제
야생형 및 변이체 FIX 폴리펩티드는 CHO-발현(CHOX) 세포(Excellgene)에서 발현되었다. CHO 발현(CHOX) 세포(Excellgene)는 DM204B 완전 배지(Irvine Scientific)에서 유지되었고, 생산 종 배양(production seed culture)을 접종하는데 이용되었다. 종 배양은 동일한 배지에서 약 1.4 x 107 생존세포(vc)/mL까지 성장되었고, 접종밀도가 1.2 x 106 vc/mL가 되도록 약 100 mL가 약 1.0 L의 DM204B 완전 배지에 접종되는데 사용되었다. 이 배양물은 3일 동안 형질감염 날에 13-16 x 106 vc/mL에 도달되도록 성장되었다. 형질감염 복합체는 FIX 플라스미드 DNA(3.2 mg)을 폴리에틸렌이민 "MAX"(PEI - 20.5 mg(Polysciences))와 혼합되고 무혈청 TfMAX2 형질감염 배지(Mediatech)로 1.0L로 희석됨으로써 형성되었다. 이 혼합물은 그리고나서 1.0 L 생산 배지(production culture)에 첨가되었다. 1.0 L 분취량(aliquot)의 세포에 형질감염 혼합물을 더한 것이 2 x 3 L baffled Fernback 플라스크에 나뉘어 졌고, 원래 그대로의(crude) FIX를 수확하기 전에 4일 동안 발현되도록 하였다. 배양 상청액은 그리고 나서 여과에 의해 수확되었고 FIX가 정제되었다.
10 L 또는 그 이상의 더 큰 스케일 배양이 웨이브 생물배양기(WAVE bioreactor)(GE Healthcare)에서 생산되었다. 20 L 웨이브 백(wave bag)이 약 400 mL의 종 배양물과 함께 접종되었고, 상기 설명된 바와 같이, 접종밀도가 1.2 x 106 vc/mL가 되도록 4.6 L의 DM204B 완전 배지와 함께 성장되었다. 세포가 3일 후 13-16 x 106 vc/mL의 세포 밀도에 도달되도록 하기 위해 웨이브 생물배양기는 20 L가 37 ℃에서 6°의 회동각(rocking angle), 25 rpm의 동요율(rocking rate)으로 세트되었다. 16 mg의 FIX 플라스미드 DNA 및 102.5 mg의 PEI가 혼합되어 형질감혐 복합체를 형성하였는데, 상기 형질감염 복합체는 초기 파종(seeding) 후 3일, 웨이브 생물배양기 상의 배양물에 첨가하기 전에 5.0 L의 TfMAX2 내에서 희석되었다. 형질감염 복합체에 TfMAX 배지를 더한 것이 웨이브 백에 첨가되는 동안, 웨이브 생물배양기의 회동각은 8°, 온도는 33 ℃로 세트되었고, 이에 반해 다른 세팅은 동일하게 유지되었다. 배양물은 원래 그대로의 FIX를 수확하기 전에 4일 동안 발현되도록 하였다. 웨이브 백의 내용물은 CUNO 심층여과기(depth filter)를 통해 배양 상청액을 수확하기 전에 4 ℃에서 3시간 동안 놔두도록(settle) 하였고 그리고 나서 FIX가 정제되었다.
FVII 폴리펩티드는 기능성 Gla 도메인을 보유한 FVII 폴리펩티드가 흡착하는 Capto Q 칼럼(GE Healthcare)이용하여 정제되었고, 이어서 칼슘 용출 단계가 수행되었다. 전형적으로, EDTA(10 mM), 트리스(25 mM, pH 8.0), 및 트윈-80(0.001%)는 형질감염된 세포로부터 배양 상청액에 첨가되었다. 시료는 완충액 B(25 mM 트리스 pH 8, 1 M NaCl, 0.001% 트윈-80)로 미리 평형화시킨 Capto Q 칼럼(GE Healthcare) 상에 로드되었고, 이어서 완충액 A(25 mM 트리스 pH 8, 0.15 M NaCl, 0.001% 트윈-80)로 평형화시켰다. 시료 로딩 완료 즉시, 칼럼은 20 칼럼 부피에 대하여 14% 완충액 B(86% 완충액 A)로 세척되었다. 풀(pool)로서 수집되었는 FIX 폴리펩티드를 용출되도록 완충액 C(25 mM 트리스 pH 8, 0.2 M NaCl, 0.001% 트윈-80, 10 mM CaCl2)가 그리고 나서 칼럼에 적용되었다.
용출된 풀은 Q 세파로오스 HP 칼럼(GE Healthcare)를 이용하여 더 정제되었다. 시료는 2 부피의 완충액 D(25 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트윈-80)로 희석함에 의한 적용을 위해 준비되었다. 희석된 시료는 완충액 F(25 mM 트리스 pH 8, 1 M NaCl, 2.5 mM CaCl2, 0.001% 트윈-80)로 미리 평형화시킨 Q 세파로오스 HP 칼럼 상에 로드되었고, 이어서 완충액 E(25 mM 트리스 pH 8, 2.5 mM CaCl2, 0.001% 트윈-80)를 적용하였다. 4 % 완충액 F(96% 완충액 E)로 세척한 후, 4-40 % 완충액 F로부터의 농도구배(gradient)는 칼럼에 적용되었고, 분획이 수집되었다. FIX 폴리펩티드를 함유하는 분획이 그리고나서 풀되었다(수집되었다; pooled).
D. 글리코실화된 폴리펩티드를 위한 풍부화를 위한 정제
변형된 FIX 폴리펩티드의 글리코실화 정도는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용하여 추정되었다. 과글리코실화는 변형된 FIX 폴리펩티드의 이동 패턴을 야생형 FIX, Benefix® 응고 FIX와의 비교에 의해 평가되었다. 야생형 폴리펩티드에 비해, 더 높은 겉보기 분자량(apparent molecular weight)을 나타내는, 효소의 과글리코실화된 형태는 더 느리게 이동되었다. 240 위치에서 비-천연 N-글리코실화 부위를 도입하는 E240N 돌연변이를 함유하는 돌연변이가 단지 부분적으로 글리코실화되었다(약 20% 글리코실화)는 것이 관찰되었다. 과글리코실화 형태를 위한 풍부화를 위하여, 상기 기술된 정제 공정의 변형이 수행되었다.
정제의 첫 번째 단계는 상기 기술된 바와 같이, Capto Q 칼럼을 이용하여 수행되었다. 이 칼럼으로부터의 용출된 풀은 2 부피의 용출액 D(상기와 같은)로 희석되었고 시료는 완충액 F(상기와 같은)로 미리 평형화시킨 헤파린 세파로오스 칼럼 상에 로드되었고, 이어서 완충액 E(상기와 같은)를 적용하였다. 칼럼은 그리고 나서 0 %로부터 70 % 농도 구배의 완충액 F와 함께 전개되었고, 분획이 수집되었다. E410N 변이체의 과글리코실화된 형태는 약 35 % 완충액 F로 칼럼으로부터 용출되었고, 이에 반해 비-과글리코실화된 형태는 약 50 % 완충액 F로 칼럼으로부터 용출되었다. 각각의 수집된 풀은 상기 기술된 바와 같이 Q 세파로오스 칼럼 상에 정제되었다. 이 방법에 의해 E410N 변이체의 약 80 % 과글리코실화된 형태를 함유하는 풀이 수득되었다. 과글리코실화 정도는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동의 시각적 검사에 의해 추정되었다.
실시예 2. 활성 부위 적정제 플루오레세인-모노-p'- 구아니디노벤조에이트 (Fluorescein-mono- p'- guanidinobenzoate; FMGB )를 사용한 촉매적 활성 프로테아제(FⅩa) 농도의 결정 및 FⅩ의 활성화
촉매적 활성이 될 수 있는 FⅩ의 원액(Stock) 내 제X 인자(FX)의 농도가 결정되었다. 이 FⅩ의 원액은 그리고나서 FⅩ에 대한 FⅨ 변이체의 촉매적 활성을 계산하기 위해 후속 연구에 사용되었다. FⅩ에서 FⅩa로의 활성화 후 활성 부위 적정 분석법이 몇 개의 작은 변형과 함께, 형광원성 에스테르 기질인 플루오레세인-모노-p'-구아니디노벤조에이트(Fluorescein-mono-p'-guanidinobenzoate; FMGB)를 사용하여 Bock et al.(Archives of Biochemistry and Biophysics (1989) 273:375-388)에 기재에 따라 필수적으로 수행되었다. FMGB는 FⅩa와 쉽게 반응하지만 FⅩ 또는 비활성 프로테아제와 반응하지 않아, 탈아실화가 촉매 작용에 대해 특히 느리고 속도 제한이며 FMGB의 농도가 포화인 조건 하에서 효과적으로 안정한 아실-효소 중간체를 형성한다. 이러한 조건 하에서, FⅩa 프로테아제는 단일 촉매적 전환(Catalytic turnover)를 겪어 플루오레세인 형광단을 방출한다. 형광의 초기 분출(burst)이 플루오레세인 형광단의 외부 농도 표준 곡선에 대해 검정될 때, 활성 부위의 농도가 계산될 수 있다.
A. FⅩ에서 FⅩa로의 활성화
촉매적 활성이 될 수 있는 원액 용액 내 Russell's Viper Venom을 이용한 FⅩ 시료의 활성화에 이은 FMGB를 이용한 활성 FⅩ(FⅩa)의 적정에 의해 결정되었다. FⅩ 자이모겐 원액은 배경 FⅩa 활성을 감소하기 위하여 DFP(다이이소프로필플루오로포스페이트)와 EGR-cmk로 공급업체에 의해 먼저 전처리되었다. FⅩa 활성 반응은 100 mM 트리스, 50 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, 0.1% PEG 8000, pH8.1을 함유하는 반응 버퍼 내 50 - 100 ul의 최종 부피 내에 10 uM FⅩ(A280 흡광도 및 1.16의 흡광계수에 기초함)의 최종 농도로 준비되었다. 활성은 37℃에서 45 - 60분의 활성 시간 동안(완전한 활성을 나타내기 위하여 매 15분 마다 시료를 모으고 Spectrafluor FⅩa 형광 기질의 절단 증가를 측정하는 것에 미리 결정됨) 5ug/mL(100uL 반응물 당 98ug/mL 희석액의 5uL 또는 50uL 반응물 당 98ug/mL 희석액의 2.5 uL)의 최종 농도가 되도록 Russell's Viper Venom((RVV-Xase; Heamatologic Technologies, Inc.)의 첨가에 의해 시작되었다. 반응은 100 mM 트리스, 50 mM 염화나트륨, 5 mM, 100 mM EDTA, 0.1% PEG 8000, pH 8.1를 함유하는 퀀칭 버퍼(quench buffer)의 1/10 부피로 퀀칭된다.
B. 활성 부위 적정
활성 부위 적정 분석법은 연속적인 교반 하에 0.4 cm × 1 cm 석영 큐벳 내에서 1ml 반응 부피로 수행되었다. 반응물은 30 mM Hepes, 135 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA 및 0.1% PEG 8000, pH7.4을 함유하는 분석 버퍼 내에 갓 활성된 FⅩa의 100 - 400 nM과 5 uM FMGB를 함유하였다. FMGB는 건조 중량을 기초로 DMF 내 0.01 M의 원액 농도로 준비되었고 농도는 인산 완충 식염수(PBS) pH7.2에서 19,498 M- 1 cm-1 의 흡광 계수를 사용하여 452 nm 파장에서 흡광 분석기에 의해 확인되었다. 분석법은 1×분석 버퍼 1 ml에 1 mM FMGB(5uM 최종 농도)의 5ul 첨가하고 ~100 - 400 nM의 최종 농도가 되도록 FⅩa의 첨가 전 ~150 - 200 초 동안 FMGB의 배경 가수분해를 먼저 측정함으로써 시작되었다. 반응의 분출기(burst phase)에서 플루오레세인 형광단의 방출은 추가적으로 3600 초 동안 이어졌다.
FⅩa에 의한 FMGB의 촉매 작용 후에 방출되는 플루오레세인의 양은 유리 플루오레세인의 표준 곡선을 사용하여 결정되었다. 플루오레세인 표준 용액은 DMF 내 ~70 - 150 mM의 원액 농도로 갓 준비되었으며 정확한 농도는 0.1 N 수산화나트륨에서 89,125 M-1cm-1의 흡광 계수를 사용하여 496nm의 표준 조건 하에서 흡광 분석기에 의해 확인되었다. 유리 플루오레세인의 표준 곡선은 20 nM 단계로 260 - 300 nM의 최종 농도까지 1×분석 버퍼 내로 흡광-검정 플루오레세인 표준의 적정에 의해 준비되었다.
데이터 분석을 위하여, 반응물 소량은 Graphpad Prism 소프트웨어 패키지로 들여왔고, 배경 가수 분해의 기여는 전형적으로 전체 형광 분출의 5% 미만인 자발적인 FMGB 가수분해의 초기 측정된 속도의 외삽법에 의해 곡선으로부터 감산했다. 보정된 곡선은 ΔFluorescence = Amp(1-e -kt )+Bt 식의 선형 요소(탈아실화의 느린 속도에 대해 설명함)를 보유하는 일차 지수 식에 일치했다. 여기서, Amp = 전술한 포화 검정 조건 하에 분출기의 진폭이고, k는 아실-효소 형성에 대해 관찰된 1차 속도 상수이고 B는 FMGB의 완전한 전환과 연관된 벌크 속도 상수이다. 활성 FⅩa 프로테아제의 농도는 플루오레세인 표준 곡선에 진폭에 대한 적합 파라미터의 비교에 의해 계산되었다. 다중 분석법에 의한 값은 측정되었고, 평균을 냈고, 표준 편차가 결정되었다. 제제에서 활성 FⅩa의 양은 FⅨa에 의해 활성될 수 있는 원액 제제 내 FⅩ의 농도를 직접적으로 나타낸다. 이 활성 부위의 적정된 값은 간접 분석법, 예컨대 하기 실시예 4에 기술된 보조인자-의존적 분석법에 사용되는 FⅩ의 농도를 계산할 때 사용된다.
실시예 3. 활성 부위 적정제 4- 메틸움벨리페릴 -p'- 구아니디노벤조에이트 (4-methylumbelliferyl- p'- guanidinobenzoate; MUGB )를 사용한 촉매적 활성 프로테아제(FⅨa) 농도의 결정 및 FⅨ의 활성화
촉매적 활성을 될 수 있게 하는 FⅨ 자이모겐의 원액 용액 내 제Ⅸ 인자(FⅨ)의 농도는 제ⅩⅠa 인자(FⅩⅠa; Heamatologic Technologies, Inc.)로, FⅨ 변이체를 포함하는 FⅨ 시료의 활성화에 이어서, 4-메틸움벨리페릴-p'-구아니디노벤조에이트(4-methylumbelliferyl-p'-guanidinobenzoate; MUGB)로 활성 제Ⅸ 인자 (FⅨa)의 적정에 의해 결정되었다.
A. FⅨ에서 FⅨa로의 활성화
FⅨ 폴리펩티드 제제 내 전체 단백질 농도는 각각의 변이체에 대해 특이적인 흡광 계수를 사용하여 A280 흡광도에 의해 결정되었다(즉: ε280 = Tyr 잔기의 수 × 1490 + Trp 잔기의 수 × 5500 + Cys 잔기의 수 × 125). FⅨ에서 FⅨa로의 활성 반응은 100 mM 트리스, 50 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘, 0.1% PEG 8000, pH8.1을 함유하는 반응 버퍼 내 200-500 ul의 최종 부피 내에 10 uM FⅨ의 최종 농도로 준비되었다. 활성화는 37℃에서 60분의 활성 시간 동안 20 nM의 최종 농도로 FⅩⅠa 또는 비오틴화된(biotinylated) FⅩⅠa의 첨가에 의해 시작되었다. 60분의 활성 시간은 매 15분 마다 시료를 수집하고 SDS-PAGE에 의한 전체 절단에 대해 분석함으로써 완전한 활성을 나타내도록 사전 결정되었다.
활성 반응에 사용된 유리 FⅩⅠa 또는 비오틴화된 FⅩⅠa은, 각각의 촉매적 FⅩⅠa의 95 ~ 97% 초과로 제거하는, 동등한 결과를 생성하는 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 시료로부터 제거되었다. 유리 FⅩⅠa를 제거하는데 사용되는 첫 번째 방법에서, FⅩⅠa로 시작되는 활성 반응은 37 ℃에서 60분 동안 50 nM의 최종 농도로 항-FⅩⅠa 단일클론 항체(Abcam 20377)과 혼합되었다. 유리 FⅩⅠa의 항체 포획에 이어 상온에서 추가적으로 120분 동안 25% 부피: 부피의 최종 농도로 세척된 단백질 G Dynal 비드 (30 mg/mL; Invitrogen)의 추가가 이어졌다. Dynal 비드는 제조사의 지시서에 따라 용액으로부터 제거되었다. 비오틴화된 FⅩⅠa의 제거에 사용되는 두 번째 방법에서, 비오틴화된 FⅩⅠa를 사용한 활성 반응물은 상온에서 60분 동안 10 % 부피: 부피의 최종 농도로 Streptavidin Dynal 비드 (10 mg/mL; Invitrogen)와 혼합되었다. Dynal 비드는 제조사의 지시서에 따라 용액으로부터 제거되었다. FⅩⅠa의 제거 후에, 활성화된 FⅨa 시료의 전체 단백질 농도는 각각의 변이체에 특이적인 흡광 계수를 사용하여 A280 흡광도에 의해 결정되었다(상기 기재된 바와 같음).
B. FⅨa의 활성 부위 적정
활성화된 원액 용액 내 촉매적 활성 FⅨa의 농도는 형광원성 에스테르 기질인 4-메틸움벨리페릴-p'-구아니디노벤조에이트(MUGB)로 FⅨa 시료 적정에 의해 결정되었다. 원리 적정 분석법은 FⅨa와 MUGB의 더 느린 반응성을 설명하는 몇 개의 작은 변형과 함께 Payne et al. (Biochemistry (1996) 35:7100-7106)에 기재된 바에 따라 필수적으로 수행되었다. MUGB는 FⅨa와 쉽게 반응하지만 FⅨ 또는 비활성 프로테아제와 반응하지 않아, 탈아실화가 촉매 작용에 대해 특히 느리고 속도 제한이며 MUGB의 농도가 포화인 조건 하에서 효과적으로 안정한 아실-효소 중간체를 형성한다. 이러한 조건 하에서, FⅨa 프로테아제는 단일 촉매적 전환(Catalytic turnover)를 겪어 4-메틸움벨리페론 형광단(methylumbelliferone fluorophore; 4-MU)을 방출한다. 형광의 초기 분출이 4-MU 형광의 외부 농도 표준 곡선에 대해 검정될 때, 활성 부위의 농도가 계산될 수 있다.
분석법은 50 mM Hepes, 100 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘 및 0.1% PEG 8000, pH7.6을 포함하는 분석 버퍼와 함께 연속 교반 하에 0.4 cm × 1 cm 석영 큐벳 내 1ml 반응 부피로 수행되었다. MUGB는 건조 중량을 기초로 DMSO에 0.04 M의 원액 농도로 준비되었고 DMSO에 2 mM의 실시 농도로 희석되었다. 적정 분석법은 1× 분석 버퍼 내 8 uM의 최종 농도가 되도록 2 mM MUGB의 4 ul를 첨가하고 FⅩⅠa의 제거 후에 활성 반응에 대해 결정된 전체 단백질 농도를 기초로 100 - 200 nM의 최종 농도로 FⅨa 또는 FⅨa 변이체의 첨가 전에 ~200 - 300 초 동안 MUGB의 배경 가수분해를 먼저 측정함으로써 시작되었다. 반응의 분출기에서 4-MU 형광의 방출은 초기 분출과 다음 정상 상태기(subsequent steady state phase)로부터 충분한 데이터를 얻기 위하여 총 2시간 동안 지속되었다.
FⅨa에 의한 MUGB의 촉매 작용 후에 방출된 4-MU의 양은 4-MU의 표준 곡선을 사용하여 결정되었다. 4-MU 표준 용액은 DMSO 내 0.5 M의 원액 농도로 준비되었고 농도는 pH 9.0의 50 mM의 트리스 버퍼에서 19,000 M- 1 cm- 1 의 흡광 계수를 사용하여 360 nm 파장에서 흡광 분석기에 의해 확인되었다. 유리 4-MU의 표준 곡선은 20 nM 단계로 260 - 300 nM의 최종 농도까지 1× 분석 버퍼 내 흡광-검정 4-MU의 적정에 의해 준비되었다.
데이터 분석을 위하여, 반응물 소량은 Graphpad Prism 소프트웨어 패키지로 들여왔고, 배경 가수 분해의 기여는 전형적으로 전체 형광 분출의 5% 미만인 자발적인 MUGB 가수분해의 초기 측정된 속도의 외삽법에 의해 곡선으로부터 감산했다. 보정된 곡선은 ΔFluorescence = Amp(1-e -kt )+Bt 식의 선형 요소(탈아실화의 느린 속도에 대해 설명함)를 보유하는 일차 지수 식에 일치했다. 여기서, Amp = 전술한 포화 검정 조건 하에 분출기의 진폭이고, k는 아실-효소 형성에 대해 관찰된 1차 속도 상수이고 B는 FMGB의 완전한 전환과 연관된 벌크 속도 상수이다. 활성 FⅨa 프로테아제의 농도는 4-MU 표준 곡선에 진폭에 대한 적합 파라미터의 비교에 의해 계산되었다. 다중 분석법에 의한 값은 측정되었고, 평균을 냈고, 표준 편차가 결정되었다. 활성화될 수 있는 원액 용액 내 FⅨ 자이모겐의 농도는 완전히 활성화된 시료(활성 FⅨa의 농도/ FⅨa의 총 농도)에 대하여 실험적으로 결정된 분율 활성 값과 FⅨ 자이모겐의 A280 결정된 총 농도의 곱에 의해 결정된다.
실시예 4. 이의 기질, 제 Ⅹ 인자에 대한 FⅨa의 촉매적 활성의 결정
기질, 제 Ⅹ 인자(FⅩ)에 대한 FⅨa 변이체의 촉매적 활성은, 합성된 기질 Spectrafluor FXa에 대해, FⅨa에 의한 활성화 시 생성되는 FⅩa의 활성에 대해 분석함으로써 형광원성 분석법에서 간접적으로 평가되었다. FⅩ 농도 범위는 활성 프로테아제(FⅨa)의 농도를 적어도 1000배 이상 초과하는 기질 프로테아제(FⅩ)에서 운동 속도 상수를 계산하기 위하여 사용되었다. 요약하자면, 활성화된 및 활성 부위의 적정된 FⅨa는 재조합 FⅧ, 인지질 비히클 및 알파-트롬빈(FⅧ에서 FⅧa로 활성시키기 위한)를 가지는 칼슘 함유 버퍼를 내에서 배양되어 테나스 복합체(Tenase; Xase)를 형성하였다. 알파-트롬빈의 활성은 분석법 개시에 앞서 높은 특이성의 트롬빈 저해제, 히루딘의 첨가에 의해 퀀칭될 수 있다. FⅨa 변이체(Xase 복합체의 부분으로서)는 분석법을 시작하기 위하여 다양한 농도의 FⅩ 및 형광 기질, Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC)과 그 뒤에 혼합되었다. FⅩ에 의한 Spectrafluor FXa의 촉매 작용 후에 유리 형광단, AMC(7-아미노-4메틸쿠마린)의 방출은 그리고 나서 일정 기간동안 연속적으로 평가되었고, FⅨa 변이체의 운동 속도 상수가 결정되었다.
A. 분석법 프로토콜
인지질과 FⅧa 존재 하에 FⅨa에 의한 FⅩ 활성화의 운동 속도를 평가하는 분석법을 위하여, 재조합 FⅧ((Kogenate FS®; Bayer healthcare)는 제조자의 지시서에 따라 제공된 희석액의 5ml에 먼저 재현탁되었다. FⅧ의 몰 농도는 그리고나서 163.6kDa의 분자량 및 1.567 mg-1 mL cm-1의 흡광 계수를 사용하여 280 nm의 흡광도에 의해 결정되었다. FⅨ 변이체는 상기 실시예 1-3에 기술된 바와 같이 발현되었고, 정제되었고, 활성화 되었고, 활성 부위 적정되었다. FⅨa 변이체는 그리고 나서 1× 버퍼 A(20 mM Hepes/150 mM 염화나트륨/5 mM 염화칼슘/0.1% BSA/0.1% PEG-8000, pH 7.4)의 200 uL 부피 내에 16 pM의 농도로 순차적으로 희석되었다. 인지질 및 FⅨa의 존재 하에 FⅧ의 FⅧa로의 활성화를 위한 제제에서, 알파-트롬빈(Heamatologic Technologies, Inc.) 및 히루딘(American Diagnostica)은 각각 64 nM 및 640 nM로 1×버퍼 A의 1.0ml 부피에 희석되었다. 재구성된 FⅧ은 갓 재현탁된 인지질(75% 포스파티딜 콜린 (PC)/25% 포스타티딜 세린 (PS); PS/PC 비히클 ~120 nm의 직경; Avanti Polar Lipids) 267 uM를 함유하는 1×버퍼 A의 10 ml 부피 내 267 nM의 농도로 더 희석되었다. FⅧ는 16 pM 야생형 FⅨa 또는 FⅨa 변이체 희석액의 100 ul 및 64 nM 알파-트롬빈 용액의 50 uL와 상기 FⅧ/PC/PS 용액의 600 uL를 섞어주고, 25 ℃에서 15분간 배양됨에 의해 FⅧa로 활성화되었다. 활성 반응은 그 뒤에 FⅩ 활성을 위한 운동 분석법을 개시하기 전에 5분간 25 ℃에서 상기 640 nM 히루딘 용액의 50 uL 첨가에 의해 후에 퀀칭되었다. 800 uL Xase 복합체 용액 내 시약의 최종 농도는 하기와 같았다: 2 pM FⅨa 변이체, 200 nM FⅧa, 200 uM PC/PS 비히클, 4 nM 알파-트롬빈 (저해됨) 및 40 nM 히루딘.
각각의 Xase 복합체 용액(FⅨa/FⅧa/인지질/Ca2 +)의 총 25 uL는 미리 정의된 플레이트 맵(4 FⅨa 변이체/플레이트)에 따라 96-well half-area black 분석 플레이트 내에 분주되었다. 900 nM 활성 부위 적정된 용액과 DFP/EGR-cmk 처리된 FⅩ(상기 실시예 2 참조)는 1.0 mM Spectrafluor Xa 기질을 함유하는 1×버퍼 A 5.6 mL 내에 준비되었다. 이는 4 분석법에 대한 적절한 부피와 시험된 FⅩ의 가장 높은 농도를 나타내었다. FX/Spectrafluor Xa 용액은 그리고 나서 1.0 mM Spectrafluor Xa를 포함하는 1×버퍼 A 2.5 mL의 최종 부피로 8-channel deep-well 폴리프로필렌 플레이트에 1.8 배로 순차적으로 희석되어, 900 nM, 500 nM, 277.8 nM, 154.3 nM, 85.7 nM, 47.6 nM, 25.6 nM 및 0 nM FX의 최종 희석액이 야기되었다. 대체적인 몇 분석법에서, FX/Spectrafluor Xa 용액은 그리고 나서 1.0 mM Spectrafluor Xa를 함유하는 1×버퍼 A 2.5 mL의 최종 부피로 12- channel deep-well 폴리프로필렌 플레이트 내 1.5 배로 순차적으로 희석되어, 900 nM, 600 nM, 400 nM, 266.7 nM, 177.8 nM, 118.5 nM, 79.0 nM, 52.7 nM, 35.1 nM, 23.4 nM, 15.6 nM 및 0 nM FX의 최종 희석액이 야기되었다. 분석법 반응은 각각의 FⅨa 변이체(Xase 복합체)의 25 uL를 함유하는 4개의 분석 플레이트에 FX/Spectrafluor Xa 희석액 25 uL를 분배하도록 프로그램된 BioMek FX의 액체 핸들링 시스템을 사용하여 전형적으로 시작되었다. 분석법 내 시약의 최종 농도는 다음과 같다: 1 pM FⅨa, 100 uM FⅧa, 100 mM PC/PS 비히클, 0.5 mM Spectrafluor Xa, 2 nM 알파-트롬빈 (저해됨), 20 nM 히루딘 및 0 nM 내지 450 nM의 FX 희석액. 반응물은 37 ℃에서 30분간 SpectraMax의 형광 플레이트 리더로 모니터되었다. 유리 AMC의 표준 곡선은 0 uM 내지 100 uM의 AMC를 포함하는 용량 범위를 사용하여 다음의 데이터 분석 계산 내 RFU에서 uM로 변경을 위한 전환인자로서 역할을 하였다.
B. 데이터 분석
FⅨa에 의한 FX의 촉매 작용의 정상 상태 역학을 결정하는데 사용되는 모든 식은 "Zymogen-Activation Kinetics: Modulatory effects of trans-4-(aminomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid and poly-D-lysine on plasminogen activation" in Petersen, et al. (1985) Biochem. J. 225:149-158 참고문헌 내 기재된 바를 기초로 하였다. 개요 A(하기 참조)에 기재된 시스템의 정상상태 역학에 대한 이론은 생산물의 포물선 축적을 나타내는 식(1)의 표현에 의해 기술된다.
개요 A:
Figure 112017042341398-pat00028
개요 A의 메커니즘에 따르면, a0은 활성화 프로테아제(FⅨa), Z0은 자이모겐(FX)의 농도, k a 및 K z 는 활성 효소(FXa)에 대한 자이모겐의 활성체 촉매화 전환에 대한 k cat 및 KM을 나타내며, 여기서 k e 및 K s 는 주어진 시간 t 동안 FXa에 의한 기질의 생산물로의 전환에 대한 k cat 및 K M 을 나타낸다:
식 (1)
Figure 112017042341398-pat00029
경과 곡선(progress curve)의 분석을 위해, 식 (1)은 형광원성 기질의 FXa 가수분해의 정상상태 운동이 화합물 상수 k 2에 의해 대체되고 독립적으로 결정되는 식 (2)의 형태로 재구성되었다.
식 (2)
Figure 112017042341398-pat00030
1×버퍼 A 내 Spectrofluor FXa 상에서 FXa의 활성은 146.4 s-1의 k cat 값과 313.0 uM의 K M 을 가지도록 독립적으로 결정되었다. 식 (3)으로 이러한 값의 치환은 90 s-1의 K 2 보정 인자를 주었다.
식 (3)
Figure 112017042341398-pat00031
FⅨa 촉매적 활성의 정도를 결정하기 위하여, SoftMax Pro application (Molecular Devices)에 의해 수집된 미가공 데이터는 .XML 파일 또는 .TXT 파일로 전송되었다. 추가적인 비-선형 데이터 분석은 XLfit4, 마이크로소프트 엑셀 스프레드시트 환경(IDBS Software) 내 통계적 분석 및 자동 곡선 맞춤을 위한 소프트웨어 패키지(IDBS Software)로 또는 XE Runner 데이터 분석 모듈을 사용하는 ActivityBase 소프트웨어 패키지(IDBS Software) 내에서 직접적으로 수행되었다. 빈 스프레드시트는 Vmax 및 K M 에 적합한 값을 산출하기 위한 식 (4)에 의해 주어진 표준 직각 쌍곡선(예: 미하엘리스-멘텐의 식)의 기능에 대해 각각의 FX 농도에서 측정된 FⅨa 변이체의 포물선 반응 속도(uM/초2)에 자동적으로 맞출 수 있도록 설정되었다.
식 (4)
Figure 112017042341398-pat00032
측정된 FⅨa 변이체에 대한 k cat 값은 그리고 나서 식 (5)에 의해 Vmax(uM/초2)에 대한 적합한 값으로부터 계산되었다.
식 (5)
Figure 112017042341398-pat00033
특이성 상수 k cat /K M 은 K M 의 적합한 값 및 상기 식 (5)의 평가로부터 나오는 계산된 k cat 으로부터 직접적으로 계산되었다.
표 14 - 19는 분석된 FⅨa 변이체 각각에 대한 촉매적 활성을 나타낸다. 또한 분석된 것은 재조합 야생형 FⅨa (Catalyst Biosciences WT로 명명됨; 상기 실시예 1에 기재된 방법으로 제조), 혈장 정제된 FⅨa (Haematologic Technologies, Inc.), 및 BeneFIX®(제 Ⅸ 응고 인자 (재조합); Wyeth)이었다. 표 14 - 15는 촉매적 활성에 대한 운동 상수, k cat/K M (M-1s- 1), 및 야생형에 대한 활성 페센트로 표현된 결과를 나타내며, 여기서, 활성은 촉매적 활성, 이것의 기질, FX에 대한 각각의 FⅨa 변이체 k cat/K M (M-1s- 1)이다. 개별적인 속도 상수 k cat 및 K M은 각각 표 16 - 17 및 표 18 - 19에 제공된다. 표 15, 17 및 19는 추가적인 FⅨa 변이체에 대한 데이터를 반영하며 표14, 16 및 18의 FⅨa 변이체에 대한 추가적인 실험적 복제물(n)을 포함하도록 계산된 새로운 전체 평균을 제공한다. FⅨa 변이체의 활성이 야생형 FⅨa와 비교되는 경우, 이는, 활성에 있어서의 어떠한 차이가 변이의 결과이고, 예를 들어 다른 발현 시스템과 관련된 번역 후 변형에 있어서의 차이의 결과가 아님을 확신할 수 있도록 변이체 FⅨa 폴리펩티드에 사용된 동일조건으로 사용하여 발현 및 정제된 재조합 야생형 FⅨa 폴리펩티드와 비교되었다. 그러므로, 비교를 위해 사용되는 야생형 FⅨa 폴리펩티드는 실시예 1(Catalyst Biosciences WT FIX 폴리펩티드)에 기재된 서열번호 1로 제시되는 FⅨ 유전자 클론으로부터 생성되고 서열번호 3으로 제시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로서 CHOX 세포에서 발현되는 재조합 야생형 FⅨa이었다. 표준편차(S.D.), 변동 계수(퍼센트로써; %CV) 및 수행된 분석의 수(n)는 또한 각각의 동역학 매개 변수로 제공된다.
FⅨa 변이체의 관찰된 촉매적 활성은 Xase 활성이 관찰되지 않은 몇몇 변이체(예: FⅨa-F314N/H315S, FⅨa-G317N, FⅨa-R318N/A320S 및 FⅨa-K400E/R403E)로부터 야생형 FⅨa와 비교하여 FX의 활성에 대해 k cat/K M 가 10 배 이상 증가한 것까지의 범위였다. 몇몇 변이체들은 야생형 FⅨa와 비교하여 주목할만한 증가된 촉매적 활성을 보여주었으며, FⅨa-R338E, FⅨa-R338A, FⅨa-T343R, FⅨa-E410N, 및 이들의 조합, 예컨대 촉매적 활성에 있어서 가장 크게 증가된 것 중 일부를 보여주는 FⅨa-R318Y/R338E/E410N, FⅨa-R318Y/R338E/R402E/E410N, FⅨa-R318Y/R338E/T343R/R402E/E410N, FⅨa-R318Y/R338E/T343R/E410N 및 FⅨa-R338E/T343R을 포함하였다. 비록 단일 또는 다중의 추가적인 글리코실화 부위를 가지는 몇몇 FⅨa 변이체들은 야생형 활성에 가깝거나(예: FⅨa-I251S, FⅨa-D85N/I251S, FⅨa-K63N, FⅨa-K247N/N249S 및 FⅨa-K63N/ K247N/N249S) 다른 돌연변이와 조합되었을 때 증가된 활성을 보여주고 있지만(예: FⅨa-K247N/N249S/R338E/T343R/R403E 및 FⅨa- K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N), 다른 변이체들은 감소된 촉매적 활성을 보여주었다. 증가된 촉매적 활성은 k cat 또는 K M 또는 가장 많은 경우 이들 매개변수 모두가 증가되었기 때문이다.
표14. FⅨa 변이체의 촉매적 활성( k cat / K M )
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BHK-21 세포에서 제조됨; * E410N의 80% 글리코실화 형태
표15. FⅨa 변이체의 촉매적 활성( k cat / K M )
Figure 112017042341398-pat00041
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Figure 112017042341398-pat00050
BHK-21 세포에서 제조됨; * E410N의 80% 글리코실화 형태
표16. FⅨa 변이체의 촉매적 활성( k cat )
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BHK-21 세포에서 제조됨; * E410N의 80% 글리코실화 형태
표17. FⅨa 변이체의 촉매적 활성( k cat )
Figure 112017042341398-pat00058
Figure 112017042341398-pat00059
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Figure 112017042341398-pat00066
BHK-21 세포에서 제조됨; * E410N의 80% 글리코실화 형태
표 18. FⅨa 변이체의 촉매적 활성( K M )
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Figure 112017042341398-pat00073
BHK-21 세포에서 제조됨; * E410N의 80% 글리코실화 형태
표 19. FⅨa 변이체의 촉매적 활성( K M )
Figure 112017042341398-pat00074
Figure 112017042341398-pat00075
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BHK-21 세포에서 제조됨; * E410N의 80% 글리코실화 형태
실시예 5. 항트롬빈/헤파린 복합체에 의한 FⅨa의 저해 결정
항트롬빈/헤파린 복합체(AT-Ⅲ/헤파린)에 의한 야생형 FⅨa 또는 FⅨa 변이체의 저해는 소분자 기질, Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC (Pefafluor FⅨa; Pentapharm)에 대한 FⅨa의 촉매적 활성에 대한 AT-Ⅲ/헤파린의 다양한 농도에 의한 저해 수준을 측정함으로써 평가되었다. 분석법의 사전 정의된 조건 하에 FⅨ 변이체의 촉매적 활성의 50%를 저해(IC50)하는데 요구되는 AT-Ⅲ의 몰 농도에 상응하는 K 0.5 값은 각각의 시험된 FⅨa 변이체에 대하여 결정되었다. 저해 반응은 낮은 분자량의 헤파린(LMWH; Calbiochem) 또는 미분획된 전장 헤파린(UFH; Calbiochem)의 존재하에 수행되었고, 후자(미분획된 전장 헤파린 의미)는 저해 속도 증가의 원인이 되는 변형된 프로토콜 조건을 요구했다. 또한 AT-Ⅲ/UFH 복합체에 의한 야생형 FⅨa 또는 FⅨa 변이체의 저해에 대한 겉보기 2차 반응 속도 상수(k app )는 또한 AT-Ⅲ/UFH 복합체와의 배양 시간을 다양하게 하는 변형된 프로토콜을 사용하여 직접적으로 평가되었다.
A. 항트롬빈/LMWH 복합체에 의한 FⅨa 저해
LMWH의 존재 하에 저해 반응을 위하여, AT-Ⅲ/LMWH(최종 2uM LMWH)의 200 nM 용액은 1×버퍼 A(50 mM 트리스, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 염화칼슘, 0.01% Tween-20, pH 7.4)의 1.2ml 부피 내 LMWH 2 uM의 용액 내로 혈장 정제된 인간 AT-Ⅲ의 20 uL 원액의 희석에 의해 준비되었다. 이 AT-Ⅲ/LMWH 용액은 분석법에 가장 높은 농도로 사용하기 위한 것이었다. AT-Ⅲ/LMWH 용액은 상온에서 적어도 30분 이상 배양되었고 그 후 2 uM LMWH가 함유된 1×버퍼 A 400 uL의 최종 부피로 96 deep-well 폴리프로필렌 플레이트에 1.5 배로 순차적으로 희석하여 200 nM, 133.3, nM 88.9 nM, 59.3 nM, 39.5 nM, 26.3 nM, 17.6 nM 및 0 nM (예: A-H 열)의 희석액을 야기하였다. 총 25 uL는 모든 칼럼(즉, 1 - 12)을 채우기 위해 96-well V-bottom 저장 플레이트의 그들의 각각의 열 내로 분주되었다. FⅨa 변이체는 처음 1×버퍼 A에 100 nM로 희석되었다. 그 후, 각각의 100 nM FⅨa 변이체의 36 uL는 1×버퍼 A의 2.0 mL 내 1.8 nM의 농도로 희석되었고 그 뒤 이 용액 60 uL는 사전 정의된 플레이트 맵(플레이트 당 4 FIXa 변이체)에 따라 96-well V-bottom 저장 플레이트 내로 분주되었다.
분석 반응은 각각의 FⅨa 변이체에 대해 전체 2개의 복제된 분석 플레이트의 웰 당 AT-III/LMWH의 각각의 희석액의 25 uL를 함유하는 플레이트 내로 FⅨa 용액 25 uL에 대하여 분배하도록 프로그램된 BioMek FX 액체 핸들링 시스템을 사용하여 개시되었다. 최종 저해 분석법 조건은: 00.9 nM FIXa 및 1 uM LMWH 내 0 내지 100 nM 범위의 AT-III 희석액이었다. 반응물의 25 uL 분액(aliquoat)이 분석법 버퍼 B (50 mM Tris, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 염화칼슘, 0.01% Tween-20, pH 7.4, 60% 에틸렌 글리콜) 내 웰 당 1.6 mM의 Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC 25 uL를 포함하는 96-well black half-area 플레이트에 BioMek FX에 의해 이송되기 전에 저해반응물은 1분간 상온에서 (~25℃) 더 배양되었다. 5 mg/mL의 최종 농도에서 폴리브렌(헥사디메스린 브로마이드)는 AT-III/LMWH 반응을 퀀칭하도록 버퍼 B 내에 첨가되었다. FⅨa의 잔여 활성은 25 ℃에서 형광 리더기로 60분 동안 기질 절단의 초기 속도에 따라 평가되었다. 잔여 활성의 결정을 위한 최종 분석법 조건은 50 mM 트리스, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 염화칼슘, 0.01% Tween-20, pH 7.4 내에 0.45 nM FⅨa 변이체, 0.8 mM Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC, 30% 에틸렌 글리콜 및 5 mg/mL 폴리브렌이었다.
FⅨa 또는 FⅨa 변이체에 대한 AT-Ⅲ/LMWH에 의한 저해 정도를 결정하기 위하여, SoftMax Pro application (Molecular Devices)에 의해 수집된 미가공 데이터는 .XML 파일로 전송시켰다. 추가적인 비-선형 데이터 분석은 XLfit4, 마이크로소프트 엑셀 스프레드시트 환경 내 통계적 분석 및 자동 곡선 맞춤을 위한 소프트웨어 패키지(IDBS Software) 또는 XE Runner 데이터 분석 모듈을 사용하는 ActivityBase 소프트웨어 패키지(IDBS Software) 내에서 직접적으로 수행되었다. Template는 AT-Ⅲ 희석액 시리즈, FⅨa에 대한 AT-Ⅲ의 비율 및 각각의 실험적 AT-Ⅲ의 농도에서 각각의 FⅨa 복제물에 대한 Vi/Vo 비율을 계산하기 위해 사용되었다. 빈 스프레드시트는 AT-Ⅲ 희석액 시리즈, FⅨa에 대한 AT-Ⅲ의 비율 및 각각의 실험적 AT-Ⅲ의 농도에서 각각의 FⅨa 복제물에 대한 Vi/Vo 비율을 계산하기 위해 사용되었다. 잔여 FⅨa 활성(Vi/Vo 로 표현됨) 대 AT-Ⅲ 농도의 비-선형 회귀 분석은 ((C+(Amp*(1-(X/(K 0.5+X))))) 형태의 쌍곡선 저해 식 및 XLfit4를 사용하여 처리되었다; 여기서, C = 오프셋 (분석법의 과정 동안 100 % 저해에 도달하지 않은 데이터 세트의 외삽을 허용하기 위해 0으로 고정시킴), Amp = 분석법 조건 하에 반-최고치 저해(half-maximal inhibition)를 위해 요구되는 AT-Ⅲ의 농도에 상응하는 K 0.5 및 적합의 진폭이다. 몇몇 FⅨa 변이체에 대하여, AT-Ⅲ/LMWH는 AT-Ⅲ의 가장 높은 시험된 농도에서 총 프로테아제 활성의 10 - 15 %보다 적게 저해했고, 이는 표준 스크리닝 조건 하에서 상기 분석법에 대한 검출의 상한을 나타낸다. 10% 미만의 최대 저해를 갖는 변이체는 그러므로 999 nM의 더 낮은 제한 K 0.5 값이 지정되었고 대부분의 경우 보고된 값보다 훨씬 큰 값의 AT-Ⅲ 내성을 가질 것으로 기대되었다.
표 20은 AT-Ⅲ/LMWH를 사용하여 수행된 분석법의 결과를 제공한다. 결과는 적합된 K 0.5 매개변수 및 그들의 적합된 K 0.5 값(K 0.5 변이체/ K 0.5 야생형)의 비율로 표현되는 야생형 FⅨa와 비교된 각각의 변이체에 대한 AT-Ⅲ 내성의 정도의 표현 모두로서 나타내진다. FⅨa 변이체의 K 0. 5 매개 변수가 야생형 FⅨa와 비교되는 경우, 이는, 활성에 있어서의 어떠한 차이가 변이의 결과이고, 예를 들어 다른 발현 시스템과 관련된 번역 후 변형에 있어서의 차이의 결과가 아님을 확신할 수 있도록 변이체 FⅨa 폴리펩티드에 사용된 동일조건으로 사용하여 발현 및 정제된 재조합 야생형 FⅨa 폴리펩티드와 비교되었다. 그러므로, 비교를 위해 사용되는 야생형 FⅨa 폴리펩티드는 실시예 1 (즉, Catalyst Biosciences WT FⅨ 폴리펩티드)에 기재된 서열번호 1로 제시되는 FⅨ 유전자 클론으로부터 생성되고 서열번호 3으로 제시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로서 CHOX 세포에서 발현되는 재조합 야생형 FⅨa이었다. 몇몇 FⅨa 변이체들은 야생형 FⅨa(Catalyst Biosciences WT FⅨ)와 비교되어 AT-Ⅲ에 대한 20배 이상 증가된 내성을 보여주었다. 예를 들어, FⅨa-R318A/R403A, FⅨa-R318E/R340E, FⅨa-R318A, FⅨa-R318E, FⅨa-K400E, FⅨa-R338E/R403E 및 FⅨa-K400A/R403A는 AT-Ⅲ에 대하여 상당한 저항성을 보여준 그룹 중에 있다.
표 20. AT-Ⅲ/LMWH에 의한 FⅨa 변이체의 저해
Figure 112017042341398-pat00083
* 999 mM의 K 0. 5 값은 분석법 조건 하에 10% 이하 저해를 갖는 그들 변이체들에 대한 하한값을 가리킨다.
B. 항트롬빈/UFH 복합체에 의한 FⅨa 변이체의 저해
추가적인 실험은 작은 변형과 함께 상기 기재된 동일 분석법을 사용하여 AT-Ⅲ/UFH(미분획된 전장 헤파린)에 의한 FⅨa의 저해를 평가하도록 수행되었다. 전장, 미분획된의 헤파린(Calbiochem)이 더 긴 헤파린 체인(Olson et al. (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939 참조 )에 의해 제공되는 "주형" 효과로 저해 반응의 증가된 속도에 FⅨa 변이체 돌연변이가 미치는 영향을 관찰하기 위해 낮은 분자량의 헤파린(LMWH)이 대신 사용되었다.
UFH의 존재 하에 저해 반응을 위하여, AT-Ⅲ/UFH(최종 1 uM UFH) 70 nM, 600 nM, 2000 nM, 6000 또는 10000 nM 용액이 1×버퍼 A(50 mM 트리스, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 염화칼슘, 0.01% Tween-20, pH 7.4)의 1.4ml 부피 내 과량의 UFH(2 내지 20 uM) 용액 내로의 혈장 정제된 인간 AT-Ⅲ의 20 uL 원액의 희석에 의해 준비되었다. AT-Ⅲ/UFH 용액은 또한 1 uM UFH를 함유하는 1×버퍼 A 460 uL의 최종 부피로 96 deep-well 폴리프로필렌 플레이트에 1.5 배로 순차적으로 희석되기 전에 상온에서 30분간 배양되었다. 변형된 분석법을 위한 AT-Ⅲ의 최종 희석액은 AT-Ⅲ의 시작 농도에 의존하였고 70 nM - 0 nM, 600 nM - 0 nM, 100 nM - 0 nM 또는 5000 nM - 0 nM (즉, A-H 열) 범위이었다. 표준 조건 하에 AT-Ⅲ 저해에 대해 증가된 내성을 보이는 이러한 변이체는 AT-Ⅲ의 더 높은 농도를 사용하여 더 시험되었다. 각각의 AT-Ⅲ 희석액의 총 35 uL는 모든 컬럼(즉, 1 - 12)을 채우기 위해 96-well V-bottom 저장 플레이트의 그들의 각각의 열 내로 분주되었다. FⅨa 변이체는 처음 1×버퍼 A 내에 100 nM로 희석되었다. 그 후, 각각의 100 nM FⅨa 변이체의 15 uL는 1×버퍼 A의 2.0ml 내 0.6 nM의 농도로 희석되었고 그 뒤 이 용액의 70 uL는 동일한 사전정의된 플레이트 맵(플레이트 당 4 FⅨa 변이체)에 따라 96-well V-bottom 저장 플레이트 내로 분주되었다.
분석 반응은 각각의 FⅨa 변이체에 대해 전체 2개의 복제된 분석 플레이트의 웰 당 AT-Ⅲ/헤파린의 각각의 희석액의 35 uL를 함유하는 플레이트 내로 FⅨa 용액 35 uL에 대하여 분배하도록 프로그램된 BioMek FX 액체 핸들링 시스템을 사용하여 개시되었다. 최종 저해 분석법 조건은: 과량으로 헤파린이 남을 수 있도록 가장 높은 AT-Ⅲ의 농도에 의존하는 1 uM 내지 10 uM 범위의 UFH 내 35 nM - 0 nM, 300 nM - 0 nM, 1000 nM - 0 nM, 3000 nM - 0 nM 또는 5000 nM - 0 nM 범위의 AT-Ⅲ 희석액 및 0.3 nM FⅨa이었다. 시작 반응은 40 uL 분액이 분석법 버퍼 C(50 mM 트리스, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 염화칼슘, 0.01% Tween-20, pH 7.4, 82% 에틸렌글리콜 및 5 mg/mL 폴리브렌) 내 웰 당 2.5 mM의 Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC 20 uL를 포함하는 96-well black half-area 플레이트에 BioMek FX에 의해 이송되기 전에 반응물은 10초 간 상온에서 (~25℃) 더 배양된 것이다. 5 mg/mL의 최종 농도에서 폴리브렌(헥사디메스린 브로마이드)는 AT-Ⅲ/UFH 반응을 퀀칭하도록 버퍼 C에 첨가된다. FⅨa의 잔여 활성은 25 ℃에서 형광 리더기로 60분 동안 기질 절단의 초기 속도에 따라 평가되었다. 잔여 활성의 결정을 위한 최종 분석법 조건은 50 mM 트리스, 100 mM 염화나트륨, 10 mM 염화칼슘, 0.01% Tween-20, pH 7.4 내에 0.2 nM FⅨa 변이체, 0.83 mM Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC, 30% 에틸렌 글리콜 및 5 mg/mL 폴리브렌이었다. 데이터 분석은 AT-Ⅲ/LMWH 저해 분석법에 대해 상기 기술된 바와 같이 수행되었다.
LMWH로 발견된 바와 같이, AT-Ⅲ/UFH가 AT-Ⅲ의 가장 높은 시험된 농도에서 FⅨa 변이체 다수에 대해 총 프로테아제 활성을 10 - 15 % 보다 적게 저해했고, 따라서 표준 스크리닝 조건하에 분석법에 대한 검출의 상한을 나타낸다. 그러므로, 10% 미만의 최대 저해를 갖는 변이체는 그러므로 999 nM의 더 낮은 제한 K 0.5 값이 지정되었고 대부분의 경우 보고된 값보다 훨씬 큰 값의 AT-Ⅲ 내성을 가질 것으로 기대되었다. 999 nM의 K 0.5 값이 초기에 주어졌던 몇몇 FⅨa 변이체들은, 더 높은 농도에서 재시험되었고, 측정법의 민감도를 확장하였고 AT-Ⅲ 내성의 명확한 수준을 제공하였다. 만약, 이러한 변이체들이 여전히 최고 높은 시험 AT-Ⅲ 농도(1000 nM 내지 5000 nM)에서 최대 저해가 10 % 미만의 최대 저해를 유지하였다면, 9999 nM의 더 낮은 하한 K 0.5 값이 지정되었고, 따라서 이러한 변이체들은 보고된 값보다 훨씬 큰 AT-Ⅲ 내성을 가질 것으로 기대되었다.
표 21 - 22는 AT-Ⅲ/UFH를 사용하여 수행된 분석법 결과를 제공한다. 표 22는 추가적인 FⅨa 변이체에 대한 데이터를 반영하며 표 21 내 FⅨa 변이체에 대한 추가적인 실험 복제물(n)을 포함하도록 계산된 새로운 전체 평균을 제공한다. 결과는 적합된 K 0.5 매개변수 및 그들의 적합된 K 0.5 값(K 0.5 변이체/ K 0.5 야생형)의 비율로 표현되는 야생형 FⅨa와 비교된 각각의 변이체에 대한 AT-Ⅲ 내성의 정도의 표현 모두로서 나타내진다. 몇몇 FⅨa 변이체는 야생형 FⅨa와 비교하여 AT-Ⅲ에 대한 100 내지 500배 이상의 증가된 내성을 보여주었다. 예를 들어, FⅨa-R318A/R403A, FⅨa-R318A, FⅨa-R318Y, FⅨa-R338A/R403A FⅨa-D203N/F205T/R318Y, FⅨa-R318Y/R338E/R403E, FⅨa- R318Y/R338E/R403E, FⅨa-R318Y/R338E/E410N, R318Y/R338E/T343R/N346Y/R403E/E410N 및 FⅨa-R318Y/R403E/E410N는 AT-Ⅲ에 대해 상당히 증가된 저항성을 보여주는 그룹 중에 있다.
표 21. AT-Ⅲ/UFH에 의한 FⅨa 변이체 저해
Figure 112017042341398-pat00084
Figure 112017042341398-pat00085
Figure 112017042341398-pat00086
Figure 112017042341398-pat00087
Figure 112017042341398-pat00088
Figure 112017042341398-pat00089
* 999nM의 K 0.5 값은 표준 분석법의 조건 하에 10% 이하 저해를 갖는 그들 변이체들에 대한 하한 값을 가르킨다 (35 nM - 0 nM AT-Ⅲ)
* WT k cat/K M(실시예 4, 표 14 참조)의 50 % 초과를 가지고 999 nM의 K 0.5 값이 초기에 주어진 변이체는 더 높은 AT-Ⅲ 농도에서 재측정되었고, 분석법의 민감도를 확장하였다.
* 9999 nM의 K 0.5 값은 확장된 민감도 분석법의 조건하에 10% 이하 저해를 갖는 그들 변이체들에 대한 하한 값을 가르킨다.(1000 nM - 0 nM AT-Ⅲ 및 5000 - 0 nM AT-Ⅲ)
표 22. AT-Ⅲ/UFH에 의한 FⅨa 변이체 저해
Figure 112017042341398-pat00090
Figure 112017042341398-pat00091
Figure 112017042341398-pat00092
Figure 112017042341398-pat00093
Figure 112017042341398-pat00094
Figure 112017042341398-pat00095
* 999nM의 K 0.5 값은 표준 분석법의 조건 하에 10% 이하 저해를 갖는 그들 변이체들에 대한 하한 값을 가르킨다 (35 nM - 0 nM AT-Ⅲ)
* WT k cat/K M(실시예 4, 표 14 참조)의 50 % 초과를 가지고 999 nM의 K 0.5 값이 초기에 주어진 변이체는 더 높은 AT-Ⅲ 농도에서 재측정되었고, 분석법의 민감도를 확장하였다.
* 9999 nM의 K 0.5 값은 확장된 민감도 분석법의 조건하에 10% 이하 저해를 갖는 그들 변이체들에 대한 하한 값을 가르킨다.(1000 nM - 0 nM AT-Ⅲ 및 5000 - 0 nM AT-Ⅲ)
C. 항트롬빈 / UFH 복합체에 의한 FIX의 저해에 대한 2차 속도 상수( k app )의 결정
적은 변형을 가진 상기 실시예 5B에서 기술된 것과 동일한 검정법을 이용하여 AT-Ⅲ/UFH에 의한 FIXa 변이체의 저해에 대한 2차 속도 상수(k app)를 측정하기 위한 추가적인 실험을 수행하였다. 이 방법은 기존의 경쟁적 운동 또는 불연속적 방법보다 동시에 많은 변이체에 대한 2차 속도 상수를 평가하는데 더 적합하다(예컨대, Olson 등.(2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939 참고).
UFH의 존재 하에서의 저해 반응에 대하여, AT-Ⅲ/UFH 1000nM 용액을 1.0mL 부피의 1x 완충액A(50mM Tris, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01% 트윈-20, pH 7.4) 내 과량의 UFH(2μM) 용액 내에 정제된 인간 혈장 AT-Ⅲ(molecular Innovations) 20μM 스톡을 희석하여 준비하였다. AT-Ⅲ/UFH 용액들을 실온으로 30분 동안 배양 후 2μM UFH를 포함하는 최종 부피 500㎕ 1x 완충액 A를 가진 96 깊은-웰 폴리프로필렌 플레이트에 2.0 배 연속 희석하였다. 변형된 k app 검정을 위한 AT-Ⅲ의 최종 희석액 범위는 500nM-0nM(즉, 열 A-H)였다. 각 AT-Ⅲ 희석액의 총 35㎕를 96-웰 V-바닥 저장 플레이트(bottom storage plate)의 그들 각각의 열로 분취하여 모든 칼럼(즉 1-12)을 채웠다. FIXa 변이체들을 처음에 1x 완충액 A에서 100nM로 희석시켰다. 그 후, 각 100nM FIXa 변이체 50㎕을 2.5mL 1x 완충액 A에서 2.0nM 농도로 희석하였고, 그 다음 이 용액의 70㎕를 상기와 같이 동일하게 미리 결정된 플레이트 맵에 따라 96-웰 V-바닥 저장 플레이트에 분취하였다(플레이트 당 4 FIXa 변이체).
각 FIXa 변이체에 대한 총 두 개의 복제 검정 플레이트를 위하여 웰 당 각각 35μL의 AT-Ⅲ/UFH 희석액을 포함하는 플레이트 35μL FIXa 용액을 배분하도록 프로그램된 BioMek FX 액체 핸들링 시스템을 이용하여 검정 반응을 개시하였다. 최종 저해 검정 조건은: 1μM UFH 내 1.0nM FIXa 및 500nM 부터 0nM 범위 AT-Ⅲ 희석액이므로 헤파린이 과량으로 남았다. 저해 반응은 예상되는 저해 속도 상수에 따라 실온(~25℃)에서 다양한 시간 동안 더 배양 및 조정되어, 검정 내 AT-Ⅲ의 가장 높은 농도(500nM)에서 90% 초과(> 90%) 저해에 도달할 수 있었다. 전형적인 배양시간은 각각의 변이체, 또는 변이체의 클래스(class)에 대해 특이적으로 결정되었으나 일반적으로 표 23내 서술된 배양시간에 따랐다.
표 23. 예상되는 k app 값에 기초한 검정 배양 시간
Figure 112017042341398-pat00096
바람직한 배양시간에 따라 반응의 40㎕ 분취물이 검정 완충액 C(50mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01% 트윈-20, pH 7.4, 82% 에틸렌 글리콜 및 5 mg/mL 폴리브렌) 내 웰 당 2.5 mM의 Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC을 20㎕ 포함하는 96-웰 블랙 하프-영역 플레이트로 BioMek FX 에 의해서 이동되었다. 5mg/ml 최종 농도에서 폴리브렌(Polybrene)(헥사디메스린 브로마이드(hexadimethrine bromide))이 AT-Ⅲ/UFH 반응을 종결하기 위하여 완충액 C에 첨가되었다. FIXa의 잔여 활성이 기질 절단 초기 속도에 따라 25℃로 설정된 형광 리더 내에서 60분 동안 평가되었다. 잔여 활성의 결정을 위한 최종 검정 조건들은 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01% 트윈-20, pH 7.4 내 0.67nM FIXa 변이체, 0.83mM Mesyl-D-CHG-Gly-Arg-AMC, 30% 에틸렌 글리콜 및 5mg/mL 폴리브렌이였다. K 0. 5 값 계산을 위한 데이터 분석이 실시예 B 내 AT-Ⅲ/UFH 억제 검정에 대하여 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 ActivityBase 소프트웨어 패키지 및 XE 러너 데이터 분석 모듈(IDBS 소프트웨어)를 이용하여 수행되었다. 가(psuedo)-1차 조건 하의 실시예 5B 내에 설명된 검정법 설정을 이용하고, 다양한 배양 시간에서 시험하였기 때문에, 하기 방정식을 이용한 AT-Ⅲ(k app)에 의한 저해에 대한 분명한 이차 속도 상수 계산이 가능하다.
t1/ 2 (분석 시간에 의하여 정의됨)에서의 K 0.5 = [AT-Ⅲ]에 대한 적합 값(fit value)이 주어지면, 모든 필요한 값들을 이용하여 k obs 및 따라서 AT-Ⅲ에 의한 주어진 FIXa 변이체 저해에 대한 k app 계산이 가능하다. 계산된 k app 값은 저해 화학양론(S.I; stoichiometry of inhibition)의 임의의 잠재적 변화의 영향을 고려하지 않으며, 이 값은 전형적으로 문헌에서 보고되는 것의 반영으로 본 계산에서 1.2 상수로 주어진다(예컨대 Olson 등. (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939 참조).
표 24는 AT-Ⅲ/UFH를 사용하여 수행된 이차 속도 검정의 결과를 제공한다. 결과는 적합화된(fitted) k app 파라미터로서 및 그들의 적합화된 k app 값의 비율로서 표현되는 야생형 FIXa와 비교한 각각의 변이체에 대한 AT-Ⅲ 내성의 정도의 표시(k app 야생형/ k app 변이체)로서 나타내었다. 여러 FIXa 변이체들은 야생형 FIXa와 비교하여 AT-Ⅲ에 대하여 10,000-20,000 배 이상 증가된 내성을 보였다. 예를 들어, FIXa-R318A, FIXa-R318Y, FIXa-R338A/R403A, FIXa-R318Y/R338E/R403E, FIXa- R318Y/R338E/R403E, FIXa-K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E, FIXa- R318Y/R338E/R403E, FIXa-K228N/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, FIXa- R318Y/R338E/E410N 및 FIXa- R318Y/R338E/R403E/E410N 들은 AT-Ⅲ에 뚜렷한 내성을 보이는 그룹에 속한다.
표 24. AT-Ⅲ/UFH에 의한 저해에 대한 이차 속도 상수
Figure 112017042341398-pat00098
Figure 112017042341398-pat00099
Figure 112017042341398-pat00100
Figure 112017042341398-pat00101
Figure 112017042341398-pat00102
Figure 112017042341398-pat00103
실시예 6. FIXa 폴리펩티드의 약동학 및 약력학의 분석
FIXa 변이체 폴리펩티드의 약동학(PK) 및 약력학(PD) 성질이 정맥투여 후 다양한 시점에서 마우스 혈장 내 변이체 FIX의 양 측정에 의하여 평가되었다. 두가지 검정법이 혈장 내 FIXa 정량화에 사용되었다. ELISA가 약동학 성질을 평가하기 위하여 마우스 혈장 내 총 FIX 단백질의 정량화를 위해 사용되었고, FIX-의존적 응고 검정법(FIX-감소된(FIX-depleted)) 혈장을 이용한 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정을 혈장 내 FIX 폴리펩티드의 응고 활성 정량화에 사용하여 약력학 성질을 평가하였다.
동물. 챨스 리버 실험실(Hollister, CA)에서 공급받은 수컷 CD-1 마우스들(30-40gm)을 처치 전 적어도 3일 동안 격리시켰다. 연속 PK 연구를 위하여, 수컷 CD01 마우스들(30-37gm)에 내재 경정맥 캐뉼라를 장착시켰다. 여과 수돗물 및 음식은 PD 또는 PK 실험에 이용되기 전에 자유식으로 이용가능하였다.
A. 투여량 및 혈액 수집
마우스(시점당 N=3)들에 FIX 폴리펩티드를 정맥주사로(PK 연구를 위하여 ~1.4 mg/kg 그리고 PD 연구를 위하여 ~400 IU/kg, 투여 부피 2ml/kg) 꼬리 정맥을 통하여 투여하였다. 투여 후 적절한 시간에, 동물들을 마취시키고 말단 심장 천자를 이용하여 시트르산염을 포함하는 주사기로 혈액을 뽑았다(0.5-1mL). 불충분한 양의 단백질이 이용가능한 몇개의 실험에서, 오직 총 4-6 마리의 동물이 시차를 둔 시점에서의 연속 출혈을 위해 사용되었고, 두 마리의 마우스가 초과 혈액 부피 제거 없이 모든 시점에서의 수집을 위하여 각각 전체 시간 과정에 사용되었다. 적은 양의 혈액 일차 제거에 의하여 혈액이 절제된 의식있는 동물에서 0.9% 생리식염수(saline)를 포함하는 0.1mL 주사기로 채취되었다. 0.1M의 시트르산나트륨 4.5㎕을 포함하는 주사기를 그 후 부착하였고, 0.05mL 혈액을 주사기로 회수하였으며 혈액을 1.5mL 튜브로 이동시켰다. 초기 주사기를 재부착하였고 생리식염수 0.07mL를 캐뉼라를 통해 넣어주었다. 캐뉼라는 과정이 반복될 때, 다음 시점까지 뚜껑이 덮어져 있었다. 모든 연구를 위하여, 혈액 샘플들은 수집 15분 내로 원심분리되었고(9000 rpm, 8 분, 4℃), 혈장이 제거되었으며 즉시 액체 질소 내에서 급속 동결되었고, 분석이 진행되는 동안 동결(-70℃) 저장되었다.
A. PK 평가
시트르산염화 혈액 샘플들이 투여 후 1440분까지 다양한 시간(즉, 투여전, 2, 4, 10, 30, 60, 120, 240, 360, 480, 960 및 1440분)에서 종결 실험을 위한 심장 천자 또는 연속 실험을 위한 유치카테터(indwelling catheter)에 의해 수집되었다. rFIX의 혈장 농도가 검출 및 캡처 항체들(#FIX-EIA, Affinity Biologicals, Ancaster, ON)의 정합 쌍을 활용한 제 IX인자 특이적 ELLISA를 이용하여 결정되었다. 간단하게, FIX에 대하여 친화도 정제된 다클론 항체가 플레이트의 웰 상에 코팅되었다. 플레이트들은 세척되었고 FIX를 포함하는 혈장 샘플이 적용되었다. 혈장 샘플들은 플레이트 상에서 1:750 및 1:1500으로 희석되었다. 결합되지 않는 물질들의 제거를 위한 플레이트 세척 후에, FIX에 대한 과산화효소 컨쥬게이트된 검출 항체가 포획된 FIX에 대한 결합을 위하여 플레이트에 추가되었다. 결합되지 않은 컨쥬게이티드된 항체 제거를 위한 플레이트 세척 후에, 과산화효소 활성이 화학발광 기질과 함께한 배양에 의하여 발현되었으며 EnVision 플레이트 리더 상의 425nM에서 읽혀졌다. 표준 곡선은 전체농도 범위에 걸쳐 선형이였고, 0.82pg/ml 부터 30ng/ml의 농도에 걸쳐있었다. FIX 변이체 자체가 항체 친화도에서의 차이를 제거하기 위한 표준 커브를 위하여 사용되었다. 각각의 샘플은 두 개의 분리된 검정 플레이트 상에서 측정되었고, 표준 곡선의 범위 내 그들의 측정값은 혈장 샘플 내 FIX 변이체의 농도 계산에 사용되었다.
PD 평가. rFIX의 혈장 약력학 활성이 활성된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정법 및 FIX 결핍 인간 혈장(STACLOT C.K. PREST kit, Diagnostica Stago, Asnieres, France)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 정량화되었다. 간단하게, aPTT 검정법은 세팔린(cephalin)(혈소판 대체물) 및 활성화제(카올린(kaolin))의 존재 내에서 혈장의 칼슘재침착(recalcification)을 수반한다. FIX 결핍 인간 혈장의 사용시, aPTT 검정법은 FIX에 특이적이다. aPTT 검정법이 제조자의 제품 삽입물에 기술된 바에 따라 수행되었다. 간단하게, 시트르산염 혈액 샘플이 PK 평가를 위해 기술된 동일한 시점에서 수집되었다. 혈장 샘플들은 0.1% 소 혈청 알부민(Probumin, Millipore, Billerica, MA)을 포함하는 Tris 완충된 생리식염수 내에서 1:100으로 희석되었다. 희석된 혈장 또는 표준품은 FIX 결핍 인간 혈청 및 세팔린/카올린 시약과 조합되었고 180 초 동안 배양되었다. 응고가 칼슘(CaCl2)의 첨가에 의하여 개시되었다. 초 단위 응고 시간이 STArt4 기기(Diagnostica Stago, Asnieres, France)를 이용하여 측정되었다. rFIX의 알려진 농도로부터 만들어진 표준 곡선을 이용하여, 혈장 FIX 농도가 log 농도 VS. lot 시간 표준 곡선 플롯으로부터 내삽되었고, 그 후 배경 FIX 활성(투여 전 동물 유래)가 감산되었다. 제 IX 인자 활성에 대한 정량화의 하한은 ~10ng/mL이다.
PD 및 PK 데이터 분석. rFIX 변이체들을 이용한 마우스 연구로부터 PD(aPTT) 및 PK(ELISA) 파라미터들이 WinNonLin(v5.1, Pharsight Corp., Mountain View, CA)내 비구획된 분석을 이용하여 계산되었다. rFIX 변이체들의 PD 및 PK는 모두 뚜렷한 2차 지수적 혈장 감소를 따랐다. 시험된 각 변이체에 대한 선택 파라미터가 PD에 대한(aPTT 검정법을 이용) 표 25 및 PK(ELISA 검정법을 이용)에 대한 표 26-27 내에 제공되었다. 표 26은 추가적 FIXa 변이체에 대한 데이터를 반영하고 표 26 내의 FIXa 변이체에 대한 추가적 실험적 반복(n)을 포함하기 위하여 계산된 새로운 전체 평균을 제공한다. PD 파라미터는 반감기(종결, 분), MRT(MRT0 - inf, 분), 곡선하 면적(AUC; Area under the curve)0-최종(분.㎍/mL)/투여량(mg/kg); 최대 농도(Cmax; (㎍/mL)/ 투여량(㎍/kg), Vd(mL/kg) 및 제거율(Cl, mL/분/kg)을 포함한다.
약동학 파라미터 계산에 사용되는 정의 및 식
혈장 반감기(혈장 FIX 농도-대-시간 프로파일의 종결 상 동안의 FIX 폴리펩티드의 반감기; T½B(혈장 FIX 농도-대-시간 곡선의 로그-선형 플롯의 종결 상 동안의 음수 기울기에 의해 나눠진 -ln2 로 계산됨); MRT0 - 최종 은 체 내 FIX 폴리펩티드 잔기 평균 시간; AUMC 0-최종 /AUC 0-최종으로 계산되고, 상기 AUMC0 - 최종 은 차후에 기술하는 바와 같이, 일차 모멘트-대-시간(moment-versus-time) 곡선 하 및 AUC의 총 영역)이고; AUC0 - last /투여량은 [AUC(0-t)]으로 계산되고, 상기 t는 IV 투여량(mg/kg)에 의해 나눠진 FIX 폴리펩티드의 측정가능한 혈장 농도를 가진 마지막 시점이고; AUC0 - inf/투여량은 [AUC(0-t) + Ct/(ln2/T½B]로 계산되고, 상기 t는 IV 투여량(mg/kg)에 의해 나눠진 FIX 폴리펩티드의 측정가능한 혈장 농도를 가진 마지막 시점이고; Cmax/투여량(mg/kg 당 ug/mL), 상기 Cmax 는 최대로 측정된 혈장 FIX 농도에 상응하는 투여 후 시간 ; Cl은 (투여량/ AUC 0- inf)와 같이 계산된 전신 제거율이며; Vss 는 분포의 항정 상태(steady state) 용적이고; MRT*Cl와 같이 계산되고; 그리고 V z 는 종결 제거 상수(terminal elimination constant)(β) 에 기초한 분포의 용적이며; Cl/(ln2/T½B)와 같이 계산된다.
표 25. aPTT 검정법에 의해 평가된 FIX 변이체의 PD 성질
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표 26. ELISA에 의해 평가된 FIX 변이체의 PK 성질
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*E410N의 80% 글리코실화 형태
표 27. ELISA 에 의해 평가된 FIX 변이체의 PK 성질
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실시예 7. FIX 폴리펩티드 응혈촉진 활성( procoagulant activity)의 생체 내 평가
FIX이 결핍된 마우스(FIX-/- 마우스)를 이용한, 혈우병 B의 마우스 모델을 FIX 폴리펩티드의 응혈촉진 활성을 평가하기 위하여 설정하였다. 마우스들을 FIX 폴리펩티드로 처리하였고 20분 후 혈액 손실양을 FIX 폴리펩티드의 응혈촉진 활성의 결정을 위하여 측정하였다.
A. 야생형 FIX 응혈촉진 활성의 생체 내 평가
수컷 FIX-/- 마우스를 케타민(ketamine)/자일라진(xylazine) 칵테일(생리식염수 내 45 mg/ml 및 3.6 mg/ml)의 복강내 투여에 의하여 마취시켰고 가열된 플랫폼(39℃)에 체온이 떨어지지 않게 하기 위해서 위치시켰다. 수술실은 82℉ 온도로 유지하였다. 꼬리 절단 10 분 전에 꼬리를 10mL의 예열된 PBS(pre-warmed PBS) 내에 침지시켰다(15mL 원심 분리 튜브; 39℃).
7 내지 15 마리의 마우스에 재조합 인간 FIX(Benefix® 제 IX 응고인자(재조합), Wyeth) 또는 Benefix® 제 IX 응고인자(재조합)의 것과 동일한 완충액(0.234% 염화나트륨, 8 mM L-히스티딘, 0.8% 수크로오스, 208 mM 글리신, 0.004% 폴리소르베이트 80)에서 희석된 변형된 FIX 폴리펩티드를 단회 주입으로 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 마우스의 음성 대조군은 완충액만을 주었다. 주입을 거른 경우, 그 동물은 연구에서 제외시켰다.
FIX 폴리펩티드 또는 완충액의 주입은 꼬리 절단 5분 전에 이루어졌다. 꼬리 절단은 면도날을 이용하여 꼬리 말단 5mm에 이루어졌으며 혈액을 20분 기간 동안 PBS로 모았다. 수집 기간의 마지막에, 총 혈액 손실이 평가되었다. 수집 튜브들이 혼합되었고 각 샘플의 1ml 분취물을 얻었으며 헤모글로빈 함량을 분석하였다. 트리톤 X-100이 멸균수 내에 1/4로 희석되었고 100㎕가 용혈을 유발하기 위하여 1mL 샘플에 추가되었다. 샘플의 흡광도를 그 후 546nm의 파장에서 측정하였다. 혈액 손실양을 계산하기 위하여, 흡광도를 PBS에서 희석되고 상기와 같이 트리톤 X 100를 이용하여 용혈된 알려진 부피의 뮤린(murine) 혈액의 546nm에서의 흡광도 측정에 의하여 생성된 표준 곡선에 대하여 읽었다. 값들은 평균± SEM 으로 표현하였다.
1. 야생형 FIX 응혈 활성을 평가하는 투여량 반응 연구
0.03, 0.1, 0.3 및 1mg/kg에서 Benefix® 제 IX 응고인자(재조합)의 응고 활성을 평가하기 위한 투여량 반응 연구가 FIX-/- 마우스에서 수행되었다. 본 실험에서, 완충액-단독군 내 혈액 손실인 835.42±4.55㎕은 0.1, 0.3 및 1mg/kg에서 Benefix® 제IX 응고인자(재조합) 처리에 의해 현저하게 감소되었다(558.59±56.63㎕, 415.81±66.72㎕ 및 270.75±57.48㎕까지; Kruskal-Wallis에 이어 Dunn's post test 사용 p<0.05). 0.03mg/kg의 가장 낮은 투여량 시험에서의 값은 731.66±59.16㎕ 였다. 비-선형 회귀법을 사용하여 계산된 ED50 값을 하기 표 28에 나타내었다.
2. FIXa - R318Y / R338E / R403E / E410N , FIXa - R318Y / R338E / E410N 및 FIXa -Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N 의 응혈 촉진 활성을 평가하는 투여량 반응
다른 투여량에서 FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410N(키모트립신 번호 매김에 의한 R150Y/R170E/R233E/E240N), FIXa-R318Y/R338E/E410N(키모트립신 번호 매김에 의한 R150Y/R170E/E240N) 및 FIXa-Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N(키모트립신 번호 매김에 의한 Y[155]F/K82N/N84S/R150Y/R170E/R233E/E240N)의 응혈 촉진 활성이 평가된 투여량 반응 연구들이 실시되었다.
FIXa - R318Y / R338E / R403E / E410N의 처리는 완충액 단독 대조군(811.45 ±26. 63 ㎕ ; Kruskal - Wallis에 이어 Dunn's post test 사용 p < 0.05)과 비교하여 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 및 1 mg /kg에서 현저한 혈액 손실 저해 결과를 나타내었다(각각 434.65±73.75㎕, 497.28±50.92㎕, 230.81±39.67㎕, 261.94±58.79㎕ 및 251.56±41.81㎕). 0.003 mg/kg까지의 투여량 감소는 혈액 손실 값이 대조군 수준에 가깝게 786.83±44.39㎕가 되도록 하였다.
FIXa - R318Y / R338E / E410N의 처리는 또한 완충액 단독 대조군(845.14±23. 63 ㎕ ; Kruskal - Wallis에 이어 Dunn's post test 사용 p< 0.05)과 비교하여 0.03, 0.1, 0.3 및 1mg/kg에서 현저한 혈액 손실 저해 결과를 나타내었다(각각 571.67±50.45㎕, 425.42±43.65㎕, 263.47±42.66㎕ 및 78.19±13.42㎕). 0.001 mg/kg로의 투여량 감소는 혈액 손실 값이 대조군 수준에 가깝게 776.16±53.72㎕가 되도록 하였다.
FIXa - Y155F / K247N / N249S / R318Y / R338E / R403E / E410N의 처리는 시험된 돌연변이의 가장 현저한 혈액 손실 저해 결과를 나타내었다: 완충액 단독 대조군(851.38±44.25㎕; Kruskal - Wallis에 이어 Dunn's post test 사용 p < 0.05)과 비교하여 0.01, 0.03 및 0.1mg/kg에서 각각 460.03±74.60㎕, 393.48±75.16㎕ 및 157.28±28.89. 비-선형 회귀법을 사용하여 계산된 ED 50 값을 하기 표 28에 나타내었다.
표 28.
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3. 야생형 FIX 응혈 촉진 활성을 평가하는 지속시간 반응
0.5 mg/kg에서 Benefix ® 제 IX 응고인자(재조합) 효과의 지속시간을 평가하기 위하여 연구를 FIX -/- 마우스에서 수행하였다. 마우스들에 꼬리 절단 48시간, 24시간, 16시간, 8시간, 4시간, 2시간, 30 분 및 5분 전에 정맥 내로 투여하였다. 본 실험에서, 대조군 유래의 저해는 대조군이 0% 저해로 설정된 곳으로 결정하였다. 혈액 손실의 저해는 5분, 30분, 2, 4, 8, 16, 24 및 48시간에 각각 비히클 대조군으로부터 59.7±11.9%, 48.25±12.84%, 57.74±9.10%, 56.04±8.46%, 32.09±7.92%, 12.94±7.33%, 38.75±11.47% 및 0.64±11. 3% 였다(평균 및 SEM , n= 8-33 마우스, 3번의 실험 유래).
4. FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410N 응혈 촉진 활성을 평가하는 지속시간 반응
0.5mg/kg에서 FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410N 효과의 지속시간 평가를 위한 연구를 FIX-/- 마우스에서 수행하였다. 마우스들에 꼬리 절단 96시간, 72시간, 48시간, 32시간, 24시간, 16시간, 8시간, 4시간, 2시간, 30 분 및 5 분전에 정맥 내로 투여하였다. 본 실험에서, 대조군 유래의 저해는 대조군이 0% 저해로 설정된 곳으로 결정되었다. 혈액 손실의 저해는 5분, 30분, 2, 4, 8, 16, 24, 48, 72 및 96시간에 각각 비히클 대조군으로부터 93.26±2.04%, 96.30±3.70%, 85.86±6.52%, 69.4±9.92%, 89.05±3.69%, 78.48±8.71%, 63.33±6.70%, 47.97±10.07%, 3.1±8.22%, -13.52±10.59% 및 -12.82±7.31% 였다(평균 및 SEM, n= 8-45 마우스, 4번의 실험 유래).
FIX-/- 마우스에 대한 참고사항:
마우스의 FIX 넉아웃 콜로니가 수컷 FIX 넉아웃 마우스 유래의 동결-보존 정자를 이용한 시험관 내 수정에 의해서 생성되었다. 모든 자손들은 FIX 넉아웃 대립형질을 포함하는 동물들을 선택하기 위한 PCR-기반 프로토콜을 이용하여 유전자형 분석되었다. 이들 동물 및 그들의 자손(PCR-기반 유전자형 분석 후)의 추가적인 교배는 PCR에 의하여 확인된 것과 같이 FIX 넉아웃 동물들(즉, FIX 유전자는 X 염색체상에 있으므로 반접합성 수컷 및 동형접합성 암컷)을 생산하였다. 이 초기 FIX 콜로니의 모든 구성원의 유전자형의 PCR 확인 후, 적법한 넉아웃 동물들은 오직 넉아웃 자손만을 생산할 수 있으므로 모든 콜로니 자손의 PCR 확인을 중단하였다. 그러나, 콜로니 유래의 "은퇴번식자들(Retired breeders)" 들은, 여러가지 상황에서 유전자형 분석하였다. 모든 콜로니 자손의 유전자형 분석이 중단된 약 7개월 후, 은퇴번식자들의 유전자형 분석은 콜로니 내 비-넉아웃(또는 야생형) 동물의 존재를 명확히 나타내었다. 이러한 결과에 기초하여, 넉아웃 콜로니의 모든 구성원들을 유전자형 분석하였고 임의의 비-넉아웃 동물들을 확인하고 콜로니로부터 제거하였다. 콜로니 유전자형 분석의 결과 19% 수컷 마우스들이 야생형으로 그리고 4%의 수컷 동물들이 부족한 DNA 제제 때문에 불명확한 것으로 나타났다. 야생형 및 "불명확한" 수컷(및 암컷)들은 모두 콜로니로부터 제거되었다.
따라서, FIX 넉아웃 콜로니는 어떤 시점에 하나 이상의 비-넉아웃 동물들로 감염되었고, 이에 따라 비-넉아웃 동물의 작은 분획을 포함하고, 이는 콜로니 내 19-23% 사이의 수컷이 야생형 FIX 유전자를 포함할 때까지의 시간에 걸쳐 증가되었다(생체 내 실험은 수컷 마우스만을 사용함). 본 출원에서 생성되어 보고된 FIX 데이터에 대하여, 시험관 내 데이터의 전부는 영향을 받지 않았다. 생체 내 데이터에 대하여, 상기 감염이 모든 화합물에 유사하게 영향을 주며, 따라서 변이체의 순위 순서 또는 BeneFIX에 대한 그들의 비교 중 어느 하나에도 영향을 주지 않는 것이 가정되고 기대된다. 감염된 동물들이 이미 내인성 FIX를 가지고 있기 때문에, 그들은 실제 혈우병 동물보다 효능 및 지속시간 실험에서 더 적은 혈액을 손실했고, 외인성 FIX의 투여로부터 훨씬 적은 이익을 얻었으며, 그러므로 모든 화합물에 대하여 데이터의 "퍼짐(spread)" 또는 가변성이 증가되었다. 감염은 또한 모든 화합물이 그들이 실제로 그런 것보다 약간 적은 강함을 나타내도록 할 수 있었고, 그러나 그들의 BeneFIX에 대한 비율이 바뀌지는 않았다(즉, 우리의 선도 분자들의 효능 및 지속시간 장점들은 영향을 받지 않았다).
B. 야생형 FIX 응혈촉진 활성의 생체 내 평가- 새로운 콜로니 데이터
하기에 기술된 데이터는 새로운 콜로니로부터 유래하고, 상기 기술된 확인된 FIX -/- 마우스로부터 개조되었다. 마우스는 번식자(breeders)로 사용되기 전에 유전자형분석에 의하여 이중 확인되었다. 하기 기술된 모든 데이터들은 부모가 이중 확인된 번식 유니트로부터 태어난 마우스들로부터 나왔다. 모든 치환 번식자들은 또한 새로운 번식 유니트의 개시전에 FIX -/-로서 이중 확인되었다.
수컷 FIX-/- 마우스들을 케타민(ketamine)/자일라진(xylazine) 칵테일(생리식염수 내 45 mg/ml 및 3.6 mg/ml)의 복강내 투여에 의해서 마취시켜고 가열된 플랫폼(39℃)에 체온이 떨어지지 않게 하기 위해서 위치시켰다. 수술실은 82℉ 온도로 유지시켰다. 꼬리 절단 10분 전에 꼬리를 10mL의 예열된 PBS 내에 침지시켰다(15mL 원심 분리 튜브; 39℃). 7 내지 15 마리의 마우스에 재조합 인간 FIX(Benefix® 제 IX 응고인자(재조합), Wyeth) 또는 Benefix® 제 IX응고인자(재조합)의 것과 동일한 완충액(0.234% 염화나트륨, 8 mM L-히스티딘, 0.8% 수크로오스, 208 mM 글리신, 0.004% 폴리소르베이트 80)에서 희석된 변형된 FIX 폴리펩티드가 단회 주입으로 꼬리 정맥을 통해 주입되었다. 마우스의 음성 대조군은 완충액만을 주었다. 주입을 거른 경우, 그 동물은 연구에서 제외하였다.
FIX 폴리펩티드 또는 완충액의 주입은 꼬리 절단 5분 전에 이루어졌다. 꼬리 절단은 면도날을 이용하여 꼬리 말단 5mm에 이루어졌으며 혈액을 20분 기간 동안 PBS로 모았다. 수집 기간의 마지막에, 총 혈액 손실이 평가되었다. 수집 튜브들이 혼합되었고 각 샘플의 1ml 분취물을 얻었으며 헤모글로빈 함량을 분석하였다. 트리톤 X-100이 멸균수 내 1/4로 희석되었고 100㎕가 용혈을 유발하기 위하여 1mL 샘플에 추가되었다. 샘플의 흡광도를 그 후 546nm의 파장에서 측정하였다. 혈액 손실양을 계산하기 위하여, 흡광도를 PBS에서 희석되고 상기와 같이 트리톤 X 100를 이용하여 용혈된 알려진 부피의 뮤린 혈액의 546nm에서의 흡광도 측정에 의하여 생성된 표준 곡선에 대하여 읽었다. 값들은 평균± SEM 으로 표현하였다.
1. FIX 응혈 활성을 평가하는 투여량 반응 연구
FIX-/- 마우스 내 다양한 투여량에서 Benefix® 제 IX 응고인자(재조합) 및 FIX 폴리펩티드의 응혈 활성을 평가하기 위하여 투여량 반응 연구가 수행되었다. 본 실험의 ED50 값은 비-선형 회귀법을 사용하여 계산되었고 하기 표 29에 나타내었다.
표 29. 투여 반응 ED 5 값
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Figure 112017042341398-pat00123
2. 야생형 FIX 응혈 활성을 평가하는 지속시간 반응
0.5mg/kg에서 Benefix® 제 IX 응고인자(재조합) 효과의 지속시간 평가를 위한 연구를 FIX-/- 마우스 내에서 수행하였다. 마우스들에 꼬리 절단 48시간, 32시간, 24시간, 16시간, 8시간, 4시간, 2시간 및 5 분전에 정맥 내로 투여하였다. 본 실험에서, 대조군 유래의 저해는 대조군이 0% 저해로 설정된 곳으로 결정하였다. 혈액 손실의 저해는 5분, 2, 4, 8, 16, 24, 32 및 48시간에 각각 비히클 대조군으로부터 68.6±5.8%, 64±6.98%, 54.7±6.13%, 43.4±6.86%, 13.7±5.53%, 24.9±6.11%, 11.7±4.88% 및 5.6±4.17% 였다(평균 및 SEM, n= 10-35 마우스, 3번의 실험 유래).
3. FIX 폴리펩티드 응혈촉진 활성을 평가하는 지속시간 반응
0.5mg/kg에서 FIX-폴리펩티드 효과의 지속시간 평가를 위한 연구를 FIX-/- 마우스 내에서 수행하였다. 마우스들에 꼬리 절단 72시간, 48시간, 32시간, 24시간, 16시간, 8시간, 5 분전 또는 꼬리 절단 72시간, 48시간, 1시간 전에 정맥 내로 투여하였다. 본 실험에서, 대조군 유래의 저해는 대조군이 0% 저해로 설정된 곳으로 결정되었다. 혈액 손실의 저해는 %저해(평균 및 SEM)로 표 30에 나타내었다.
표 30. 혈액 손실의 저해
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실시예 8. 보조인자 , 제 Ⅷa 인자에 대한 FIXa의 기능적 보조인자 결합( K D-app )의 결정
기질, 제 X 응고인자(FX)의 존재 또는 포화에서의 보조인자 인자 Ⅷa(FⅧa)에 대한 FIXa 변이체들의 기능적 보조인자 결합(K D-app)을 합성 기질 Spectrafluor FXa 상의 FIXa에 의한 활성화에 따라 생성된 FXa의 활성 분석에 의한 형광분석(fluorogenic assay)에서 간접적으로 평가하였다. FⅧa 농도의 범위가 명백한 운동 속도 상수(K D-app)의 계산을 위해서 사용되었고 여기서 보조인자(FⅧa)는 활성 프로테아제(FIXa)의 농도에 대하여 적어도 1000-배 이상 과량이 되었다. 실험은 실시예 4(기질, 인자 X에 대한 FIXa의 촉매적 활성의 결정)에 기술된 검정법의 변형으로 설계되었고, 다양한 농도에서 상기 보조인자(FⅧa)는 기질, FX의 포화 수준을 가진 촉매적 활성 평가 전에 테나아제(tenase)(Xase)복합체 형성 인지질 소낭(vesicles)의 존재 하에 FIXa와 함께 전배양되었다. 요약하면, 활성화된 및 활성 위치 적정된 FIXa를 인지질 소낭을 가진 칼슘-포함 완충액 내에서 배양하는 동안, 별도로 재조합 FⅧ는 알파-트롬빈으로 (FⅧa로) 활성화시켰다. 그 후, 알파-트롬빈의 활성은 높은 특이적 트롬빈 저해제인, 히루딘의 첨가에 의하여 종결시키고, 상기 검정법을 개시하였다. 이어서, FIXa 변이체들은 다양한 농도의 FⅧa와 함께 혼합하여 Xase 복합체를 형성시키고, 이어서 포화 농도의 FX 및 형광 기질 Spectrafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC)과 함께 혼합하여 상기 검정법을 개시하였다. FXa에 의한 Spectrafluor FXa의 촉매 작용에 따른 자유 형광단, AMC(7-아미노-4-메틸쿠마린)의 방출이 다음 기간 동안 지속적으로 평가되었고, 그리고 FIXa 변이체들의 운동 속도 상수가 결정되었다.
A. 검정법 프로토콜
다양한 FⅧa 농도 및 인지질의 존재 하에 FIXa에 의한 FX 활성의 운동 속도 평가 검정법을 위하여, 재조합 FⅧ(Kogenate FS®; Bayer healthcare)가 첫번째로 1ml의 상기 제공된 희석액 내에서 재현탁되었다. FⅧ의 몰 농도가 그 후 1.567 mg-1 mL cm- 1 의 흡광계수를 이용한 280nm에서의 흡광 및 분자량 163.6 kDa에 의하여 결정되었다. FIX 변이체들이 상기 실시예 1-3 내 기술된 바와 같이 발현되고, 정제되고, 활성화되고 그리고 활성 부위 적정되었다. FIXa 변이체들은 그 후 연속적으로 1mL 부피의 1x완충액 A(20mM Hepes/150 mM NaCl/5 mM CaCl2/0.1% BSA/0.1% PEG-8000, pH 7.4) 내에서 8pM 농도로 희석(4x)되었다. 인지질의 존재 하 FⅧ의 FⅧa로의 활성화를 위한 제제에서, 알파-트롬빈(Heamatologic Technologies, Inc.) 및 히루딘(American Diagnostica)은 1x 완충액 A 내에서 제조자의 스톡 농도 1:100으로부터 각각 희석되었다. 재구성된 FⅧ는 신선한 재현탁된 인지질 400μM(75% 포스파티딜콜린(PC)/ 25% 포스파티딜세린(PS); PS/PC 소낭 직경 ~120nm ; Avanti Polar Lipids)을 포함하는 1.6mL 부피의 1x 완충액A 내에서 1600nM 농도(최고 투여 용량의 4x)까지 추가로 희석되었다. FⅧ는 최종 농도 15nM 알파-트롬빈 용액과 상기 FⅧ/PC/PS 용액의 혼합에 의하여 FⅧa로 활성화한 후, 25℃에서 15분 배양하였다. 활성화 반응은 25℃에서 5분 동안 최종 농도 150nM까지의 히루딘의 첨가에 의해서 연속적으로 종결시킨 후, 400μM PC/PS 소낭들을 포함하는 1x 완충액 A내로 최종 부피 0.5mL의 활성화된 FⅧa를 가진 12-채널 깊은-웰 폴리프로필렌 플레이트 내 1.5-배의 연속 희석(dilution series)을 개시하였다. FⅧa의 최종 농도(4x)는 12-점 검정법(point assay)에 대하여 1600 nM, 1066.7 nM, 711.1 nM, 474.1 nM, 316.1 nM, 210.7 nM, 140.5 nM, 93.6 nM, 62.43 nM, 41.6 nM. 27.8 nM 및 0 nM 또는 2-배 연속 희석을 이용한 대체 8-점 검정법에 대하여; 1600 nM, 600 nM, 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM 및 0 nM 였다. FⅧa 연속 희석은 그 뒤 미리 정의된 플레이트 지도(4 FIXa 변이체들/플레이트)에 따라 96-웰 절반-영역 블랙 검정법(half-area black assay) 플레이트 내에서 4x FIXa 희석액(12.5μL 각각)과 함께 1:1로 혼합되었고 Xase 복합체를 형성하기 위하여 25℃에서 15분 동안 다양한 농도의 FⅧa와 함께 전배양되었다. 최종 2x 용액(25μL)들은 하기와 같다: 4 pM FIXa 변이체, 1600-0 nM FⅧa, 200μM PC/PS 소낭, 7.5 nM 알파-트롬빈(저해됨) 및 75 nM 히루딘.
활성 부위 적정되고 DFP/EGR-cmk 처리된 FX 1000nM 용액(2x)(상기 실시예 2 참조)이 4 검정법을 위하여 충분한 부피로 제공하는 1.0mM Spectrafluor Xa 기질을 포함하는 1x 완충액 A 20mL 내 준비되었다. 이것은 실시예 4, 표 16에서 보고된 K M 의 적어도 5-20배 이상인 FX의 2x 포화 농도를 나타낸다. 검정법 반응은 25㎕의 각 FIXa 변이체 및 FⅧa 희석액(Xase 복합체들)을 포함하는 4 검정법 플레이트로의 FX/Spectrafluor Xa 희석액 25㎕ 조제를 위하여 프로그램된 BioMek FX 액체 핸들링 시스템을 이용하여 전형적으로 개시되었다. 이 검정법에서의 시약의 최종 농도는 다음과 같다: 2pM FIXa, 400-0nM FⅧa, 100μM PC/PS 소낭, 0.5 mM Spectrafluor Xa, 3.8nM 알파-트롬빈(저해됨), 38nM 히루딘 및 500nM의 FX. 반응은 SpectraMax 형광 플레이트 리더(fluorescence plate reader)내에서 37℃, 30분 동안 관찰되었다. 유리 AMC의 표준 곡선은 0μM 부터 100μM AMC에 걸치는 투여 범위를 사용한 연속적인 데이터 분석 계산에서 μM까지의 RFU에 대한 전환계수(conversion factor)로서 제공되었다.
B. 데이터 분석
촉매적 활성에 기초한 FⅧa에 대한 FIXa 변이체들의 기능적 친화도를 결정하기 위하여, SoftMax Pro application(Molecular Devices)을 가지고 수집한 미가공 데이터들은 TXT 파일로 내보내었다. 추가로 비-선형 데이터 분석들이 XE 러너 데이터 분석 모듈(IDBS 소프트웨어)를 이용한 ActivityBase 소프트웨어 패키지 내에서 직접적으로 수행되었다. 데이터 분석은 본질적으로 약간의 수정과 함께 실시예 4B 내에 기술하였다. Abase 템플리트는 Vmax 및 K D-app에 대한 적합값을 얻기 위하여 방정식(1)에 주어진 표준 직사각형 쌍곡선(rectangular hyperbola)(즉, Michaelis Menten 방정식)의 함수에 각 FⅧa 농도에서 시험된 FIXa 변이체들의 포물선 반응 속도(parabolic reaction velocities )(μM/sec2)가 자동적으로 적합하도록 설정하였다.
방정식(1)
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표 31은 분석된 각각의 FIXa 변이체에 대한 기능적 친화도(K D-app)를 제시한다. 또한 재조합 야생형 FIXa(Catalyst Biosciences WT라고 말함; 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 생성됨), 혈장 정제 FIXa(Haematologic Technologies, Inc.), 및 BeneFIX®(제 IX응고인자 (재조합); Wyeth)를 분석하였다. 표 XX는 친화도에 대한 운동 상수, K D-app (nM) 및 또한 FIXa 변이체의 기능성 친화도와 비교하여 야생형 FIXa의 기능적 친화도의 비율로서 표시되는 결과를 나타내며, 상기 각각의 FIXa 변이체의 기능적 친화도는 기질, FX의 활성화에 대한 K D-app (nM)값에 의하여 정의된다. FIXa 변이체의 활성과 야생형 FIXa를 비교하는 경우, 활성에서의 어떤 차이가 돌연변이(들)의 결과이며 예를 들어, 다른 발현 시스템과 연관된 번역후 변형의 차이의 결과가 아님을 보장하기 위하여 변이체 FIXa 폴리펩티드에 대하여 사용되는 동일한 조건을 이용하여 발현되고 정제된 재조합 야생형 FIXa 폴리펩티드와 비교하였다. 그러므로, 비교를 위하여 사용되는 야생형 FIXa 폴리펩티드는 실시예 1에 기술된 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드로서 서열번호 1에 제시된 FIX 유전자의 클로닝으로부터 생성되고 CHOX 세포로부터 발현되는 재조합 야생형 FIXa이다(즉, Catalyst Biosciences WT FIX 폴리펩티드). 표준 편차(S.D), 변이 계수(coefficient of variation)(백분율; %CV) 및 수행된 검정법 수(n)가 또한 제공된다.
몇 개의 변이체들은 K D-app 에서 야생형 친화도와 유사하거나 미미한 증가(예컨대 FIXa-R318Y/R338E 및 FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410N)를 보이는 반면 여러 변이체들은 K D-app에서 6-10배 이상의 증가를 갖는 기능적 친화도의 뚜렷한 증가를 보였다. R338E, T343R 및 E410N 돌연변이의 조합을 가진 변이체들이 기능적 친화도에서 가장 큰 증가를 보였다. 예를 들어, FIXa-R338E/T343R, FIXa-R318Y/R338E/T343R/E410N, FIXa-R318Y/R338E/E410N, FIXa- Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, FIXa-R338E/E410N 및 FIXa-K228N/247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410N들이 이러한 군이다.
표 31. FIXa 변이체의 기능적 보조인자 친화도( K D-app )
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실시예 9. 혈우병 B 혈장에서의 FIX 변이체의 응고 활성의 결정
FIX 변이체들의 응고 활성이 제조자의 지시에 따라 1% 미만(<1%) 응고 활성을 갖는 단일 공여자 유래의 인간 혈우병 B 혈장(George King Bio-Medical, Inc., Overland Park, Kansas)에서의 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정법에 의해서 결정되었다. 요약하면, aPTT 검정법은 정제된 인지질(혈소판 대체물) 및 활성화제(카올린 및 설파타이드)의 혼합물의 존재 하에 혈장의 칼슘재침착을 포함한다. aPTT 검정법은 기본적으로 100 nM, 10 nM 또는 1nM FIX 변이체의 최종 농도로 혈우병 B 혈장 내에 첨가된 FIX 변이체를 이용하여 제조자의 제품 삽입물에 기술된 Dapttin®TC aPTT 시약(Technoclone GmbH, Vienna, Austria)을 이용하여 수행되었다. 요약하면, FIX 변이체들은 활성 부위 적정된 자이모겐 농도(실시예 2)에 기초하여 1x 완충액 A(20 mM Hepes/150 mM NaCl/0.5% BSA, pH 7.4)내에서 1μM 까지 희석되었다. FIX 변이체들은 그 후 직접적으로 시트르산염화된 인간 혈우병 B 혈장(George King Bio-Medical)내에 100 nM, 10 nM 및 1 nM까지 연속적으로 희석되었다. 혈장 내 100㎕ 부피의 각 FIX 희석액들은 100㎕의 Dapttin®TC aPTT 시약과 함께 혼합되고 180초 동안 37℃에서 배양되었다. 응고는 25mM 칼슘(Diagnostica Stago, Asnieres, France) 100㎕ 첨가에 의하여 개시되었다. 초단위 응고 시간은 STArt4 기기(Diagnostica Stago, Asnieres, France)를 이용하여 측정되었다. 각 실험은, 전형적으로 5% 미만(<5%) CV를 보이는 두 개의 독립 응고 시간 측정값의 평균을 나타낸다.
표 32는 분석된 각 FIX 변이체에 대한 응고 활성을 제시한다. 또한 재조합 야생형 FIX(Catalyst Biosciences WT라고 말함; 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 생성됨), 및 BeneFIX®(제 IX 응고인자(재조합); Wyeth)이였다. 표 XX는 3개의 시험된 FIX 농도 각각에서 응고까지의 시간으로 표시되는 결과를 나타낸다: 100nM, 10 nM 및 1 nM, 상기 각각의 FIX 농도는 수집된 정상 혈장(PNP; pooled normal plasma)내 FIX 정상 농도의 ~100%, ~10% 및 ~1% 를 나타낸다. 동일한 분석 조건 하에서, 100% PNP는 31.3±2.0 초의 응고 시간을 보였으나, 반면 혈우병 B 혈장 내 PNP의 10% 및 1% 희석액에 대한 응고 시간은 각각 42.7±1.7 및 55.0±4.7초였다(n=4). 본 분석에 사용된 혈우병 B 혈장에 대한 응고까지의 시간은 83.2±9.2초(n=5)로 평가되었다. 많은 수의 시험된 변이체들은 응고 시간이 야생형 FIXa와 비교하여 유사하거나 약간 연장되는 것을 입증하였고, 상기 비교를 위하여 사용되는 야생형 FIXa 폴리펩티드는 실시예 1에 기술된 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드로서 CHOX 세포로부터 발현되는 재조합 야생형 FIXa이다(즉, Catalyst Biosciences WT FIX 폴리펩티드). 반면에, 여러 개의 변이체들은 현저한 응고 시간 감소를 보였다. 이 군의 변이체들은 FIXa-R318Y/R338E/T343R, FIXa-R318Y/R338E/E410N, FIXa-R338E/T343R/E410N, FIXa-R318Y/R338E/T343R/E410N, FIXa-K247N/N249S/R338E/T343R/E410N 및 FIXa-K228N/247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410N이다.
표 32. 혈우병 B 혈장에서의 FIX 변이체의 응고 활성(aPTT).
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당업계의 숙련된 자에게는 변형이 명백하므로, 본 발명은 부속된 청구의 범위에 의해서만 한정되는 것으로 생각되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Catalyst Biosciences, Inc. Madison, Edwin Thanos, Christopher Blouse, Grant Ellsworth <120> MODIFIED FACTOR IX POLYPEPTIDES AND USES THEREOF <130> 33328.04918.WO02/4918PC <140> Not yet assigned <141> Herewith <150> 61/456,298 <151> 2010-11-03 <160> 417 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1383 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Factor IX mRNA <400> 1 atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60 ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120 ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt 180 gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240 actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300 ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360 tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420 tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480 tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540 gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600 tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660 tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720 caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780 tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840 gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900 cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960 ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020 tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080 cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140 acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200 gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260 gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320 tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380 act 1383 <210> 2 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Precursor Factor IX <400> 2 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175 Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380 Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460 <210> 3 <211> 415 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature Factor IX <400> 3 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 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220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Asp Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415 <210> 417 <211> 415 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Factor IX R403D <400> 417 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Asp Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415

Claims (40)

  1. 서열번호 3에 기재된 서열로 구성되는 성숙 FIX 폴리펩티드에서 아미노산 치환 R338E/T343R을 포함하거나 또는 비-변형된 FIX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 동일한 치환을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드로서,
    상기 상응하는 아미노산 잔기는 서열번호 3의 폴리펩티드와 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 서열배열(alignment)에 의해 확인되고;
    상기 비-변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 20 또는 325 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 구성되고;
    서열번호 3 및 20은 성숙 FIX의 서열을 기재하고 있고, 서열번호 2 및 325는 전구체 FIX의 서열을 기재하고 있으며;
    상기 변형된 FIX 폴리펩티드는 변형 F342I/T343R/Y345T를 포함하지 않고;
    상기 변형된 FIX 폴리펩티드는 하기 중 임의의 하나 또는 그 이상 또는 조합:
    a) Y1N, Y1N + S3T, S3N + K5S/T, G4T, G4N + L6S/T, K5N + E7T, L6N + E8T, E7N + F9T, F9N + Q11S/T, V10N + G12S/T, Q11N + N13T, G12N + L14S/T, L14N + R16T, E15T, E15N + E17T; R16N + C18S/T, M19N + E21T; E20N + K22T, K22N, S24N + E26T; F25N + E27T; E26N + A28T; E27N + R29T; A28N + E30T; R29N + V31S/T, E30N + F32T; V31N + E33T; F32N + N34T, E33N, T35N + R37S/T, E36T; E36N; R37N, T39N + F41S/T, E40N + W42T, F41N + K43S/T, W42N + Q44S/T, K43N + Y45T; Q44N + V46S/T, Y45N + D47T, V46N + G48S/T, D47N + D49S/T, G48N + Q50S/T, D49N + C51S/T, Q50N + E52S/T, E52N + N54T, S53N + P55S/T, C56S/T, L57N + G59S/T, G59N + S61T; G60S/T, S61N + K63S/T, K63N + D65S/T, D65N + N67S/T, I66N + S68S/T, Y69S/T, Y69N + C71S/T, S68N + E70S/T, E70N + W72S/T, W72N + P74S/T, P74N + G76S/T, F75N, G76N + E78T, E78N + K80T, F77T, F77N + G79S/T, G79N + N81S/T, K80N + C82S/T, E83S/T, E83N + D85S/T, L84N + V86S/T, D85N, V86A, V86N + C88S/T, T87N + N89S/T, I90N + N92S/T, K91S/T, I90N + N92S/T, K91N + G93S/T, R94S/T, R94N + E96S/T, K100N, A103S/T, S102N + D104S/T, A103N + N105S/T, D104N + K106S/T, V107S/T, K106N + V108S/T, V108N + V110S/T, S111N, E113N + Y115S/T, G114N + R116S/T, R116N + A118S/T, E119N + Q121S/T, K122S/T, Q121N + S123S/T, K122N + C124S/T, S123N + E125S/T, E125N + A125S/T, P126N + V128S/T, A127N + P129T, V128N + F130S/T, P129N + P131S/T, F130N + C132S/T, R134N, V135N + V137S/T, S136N, S138N, V137N + Q139T; Q139N, T140N + L142S/T, S141N + L143S/T, K142N, A146N + A148S/T, E147N + V149S/T, T148N + F150S/T, V149N + P151S/T, F150N + D152S/T, P151N + V153S/T, D152N + D154S/T, V153N + Y155S/T, D154N + V156S/T, Y155N + N157S/T, V156N, S158N + E160S/T, T159N + A161S/T, E160N + E162S/T, A161N, E162N + I164S/T, T163N + L165S/T, I164N + D166S/T, L165N + N167S/T, D166N + I168S/T, I168N + Q170S/T, T169N, Q170N, S171N + Q173S/T, T172N, Q173N + F175S/T, S174N + N176S/T, F175N + D177S/T, F178S/T, D177N, D177E, F178N + R180S/T, T179N + V181S/T, R180N + V182S/T, G183 + E185S/T, G184N + D186T, E185N + A187S/T, D186N + K188S/T, A187N + P189T, K188N + G190S/T, P189N + Q181S/T, G200N + V202T, K201N + D203S/T, K201T, V202N + A204S/T, D203N + F205S/T, E213N + W215S/T, K214T, V223T, E224N + G226S/T, T225N + V227S/T, G226N + K228S/T, V227N + I229T, K228N, H236N + I238T; I238N + E240T; E239N, E240N + E242S/T, E242N, T241N + H243S/T, H243N + E245S/T, K247N + N249S/T, V250N + R252T, I251S/T, I251N + I253S/T, R252N + I254S/T, I253N + P255S/T, P255N + H257S/T, H257N + Y259S/T, N260S/T, A262S/T, A261N + I263S/T, A262N + N264S/T, I263N + K265S/T, K265N + N267S/T, A266N + H268S/T, D276N + P278S/T, P278N + V280S/T, E277N + L279S/T, V280N + N282S/T, Y284S/T, S283N + V285S/T, Y284N, D292N + K294S/T, K293N + Y295S/T, E294N, F299S/T, I298N + L300S/T, K301N + G303S/T, F302N, G303N + G305S/T, S304N + Y306S/T, Y306N + S308S/T, R312N + F314S/T, V313N + H315T, F314N + K316S/T, H315N + G317S/T, K316N + R138S/T, G317N, R318N + A320S/T, S319N + L321S/T, A320N + V322T, L321N + L323S/T, V322N + Q324S/T, Y325N + R327S/T, R327N + P329S/T, P329N + V331S/T, L330N + D332S/T, D332N + A334S/T, R333N, A334N + C336S/T, T335N + L337S/T, L337N, R338N, S339N + K341T, T340N + F342T; K341N, F342N + I344S/T, T343N + Y345S/T, Y345N + N347S/T, M348S/T, G352N + H354T, F353N, F353N + E355T, H354N + G356S/T, H354V, H354I, E355T, E355N + G357S/T, G356N + R358T, G357N + D359S/T, R358N, Q362N + D364S/T, V370N; T371V; T371I; E372T, E372N + E374S/T, E374N, G375N, W385N + E387T; G386N + E388T, E388N + A390S/T, A390N + K392T, M391N + G393S/T, K392N + K394S/T, K392V, G393T, G393N + Y395S/T, K394N + G396S/T, R403N + V405S/T, I408S/T, K409N + K411S/T, E410N, K411N + K413S/T, 및 K413N에 상응하는 아미노산 치환 중에서 선택되는 글리코실화 부위를 도입하는 변형;
    b) S53A, S61A, N157D, N157Q, T159A, N167D, N167Q, T169A, T172A, 및 T179A에 상응하는 치환 중에서 선택되는 글리코실화 부위를 제거하는 치환;
    c) R252A, H257A, H268A, K293A, R318A, R333A, R338A, K400A, R403A, R403E, K411A, R312Q, R312A, R312Y, R312L, V202M, V202Y, D203M, D203Y, A204M, A204Y, K400A/R403A, K400E/R403E, R403A, R403E, R403D, K400A, K400E, K293E, K293A, R333A, R333E, R333S, R338A, R338E, R338L, R338A/R403A, R338E/R403E, K293A/R403A, K293E/R403E, K293A/R338A/R403A, K293E/R338E/R403E, R318A/R403A, R318E/R403E, R318Y/R338E/R403E, R318Y/R338E, R318N/A320S, K316N, K316A, K316E, K316S, K316M, E239N, E239S, E239A, E239R, E239K, H257F, H257Y, H257E, H257S, E410N, N260S, F314N/K316S, Y1H, Y1I, S3Q, S3H, S3N, G4Q, G4H, G4N, K5N, K5Q, L6I, L6V, E7Q, E7H, E7N, E8Q, E8H, E8N, F9I, F9V, V10Q, V10H, V10N, G12Q, G12H, G12N, L14I, L14V, E15Q, E15H, E15N, R16H, R16Q, E17Q, E17H, E17N, M19I, M19V, E20Q, E20H, E20N, E21Q, E21H, E21N, K22N, K22Q, S24Q, S24H, S24N, F25I, F25V, E26Q, E26H, E26N, E27Q, E27H, E27N, A28Q, A28H, A28N, R29H, R29Q, E30Q, E30H, E30N, V31Q, V31H, V31N, F32I, F32V, E33Q, E33H, E33N, T35Q, T35H, T35N, E36Q, E36H, E36N, R37H, R37Q, T38Q, T38H, T38N, T39Q, T39H, T39N, E40Q, E40H, E40N, F41I, F41V, W42S, W42H, K43N, K43Q, Y45H, Y45I, V46Q, V46H, V46N, D47N, D47Q, G48Q, G48H, G48N, D49N, D49Q, E52Q, E52H, E52N, S53Q, S53H, S53N, P55A, P55S, L57I, L57V, N58Q, N58S, G59Q, G59H, G59N, G60Q, G60H, G60N, S61Q, S61H, S61N, K63N, K63Q, D64N, D64Q, D65N, D65Q, I66Q, I66H, I66N, S68Q, S68H, S68N, Y69H, Y69I, E70Q, E70H, E70N, W72S, W72H, P74A, P74S, F75I, F75V, G76Q, G76H, G76N, F77I, F77V, E78Q, E78H, E78N, G79Q, G79H, G79N, K80N, K80Q, E83Q, E83H, E83N, L84I, L84V, D85N, D85Q, V86Q, V86H, V86N, T87Q, T87H, T87N, I90Q, I90H, I90N, K91N, K91Q, N92Q, N92S, G93Q, G93H, G93N, R94H, R94Q, E96Q, E96H, E96N, F98I, F98V, K100N, K100Q, S102Q, S102H, S102N, A103Q, A103H, A103N, D104N, D104Q, K106N, K106Q, V107Q, V107H, V107N, V108Q, V108H, V108N, S110Q, S110H, S110N, T112Q, T112H, T112N, E113Q, E113H, E113N, G114Q, G114H, G114N, Y115H, Y115I, R116H, R116Q, L117I, L117V, A118Q, A118H, A118N, E119Q, E119H, E119N, K122N, K122Q, S123Q, S123H, S123N, E125Q, E125H, E125N, P126A, P126S, A127Q, A127H, A127N, V128Q, V128H, V128N, P129A, P129S, P131A, P131S, G133Q, G133H, G133N, R134H, R134Q, V135Q, V135H, V135N, S136Q, S136H, S136N, V137Q, V137H, V137N, S138Q, S138H, S138N, T140Q, T140H, T140N, S141Q, S141H, S141N, K142N, K142Q, L143I, L143V, T144Q, T144H, T144N, R145H, R145Q, A146Q, A146H, A146N, E147Q, E147H, E147N, T148Q, T148H, T148N, V149Q, V149H, V149N, P151A, P151S, D152N, D152Q, V153Q, V153H, V153N, D154N, D154Q, Y155H, Y155I, V156Q, V156H, V156N, S158Q, S158H, S158N, T159Q, T159H, T159N, E160Q, E160H, E160N, A161Q, A161H, A161N, E162Q, E162H, E162N, T163Q, T163H, T163N, I164Q, I164H, I164N, L165I, L165V, L165Q, L165H, D166N, D166Q, I168Q, I168H, I168N, T169Q, T169H, T169N, S171Q, S171H, S171N, T172Q, T172H, T172N, S174Q, S174H, S174N, F175I, F175V, F175H, D177N, D177Q, F178I, F178V, F178H, T179Q, T179H, T179N, R180H, R180Q, V181Q, V181H, V181N, V182Q, V182H, V182N, G183Q, G183H, G183N, G184Q, G184H, G184N, E185Q, E185H, E185N, D186N, D186Q, A187Q, A187H, A187N, K188N, K188Q, P189A, P189S, G190Q, G190H, G190N, F192I, F192V, F192IH, P193A, P193S, W194S, W194H, W194I, V196Q, V196H, V196N, V197Q, V197H, V197N, L198I, L198V, L198Q, L198H, N199Q, N199S, G200Q, G200H, G200N, K201N, K201Q, V202Q, V202H, V202N, D203N, D203Q, A204Q, A204H, A204N, F205I, F205V, G207Q, G207H, G207N, G208Q, G208H, G208N, S209Q, S209H, S209N, I210Q, I210H, I210N, V211Q, V211H, V211N, E213Q, E213H, E213N, K214N, K214Q, W215S, W215H, I216Q, I216H, I216N, V217Q, V217H, V217N, T218Q, T218H, T218N, A219Q, A219H, A219N, A220Q, A220H, A220N, V223Q, V223H, V223N, E224Q, E224H, E224N, T225Q, T225H, T225N, G226Q, G226H, G226N, V227Q, V227H, V227N, K228N, K228Q, I229Q, I229H, I229N, T230Q, T230H, T230N, V231Q, V231H, V231N, V232Q, V232H, V232N, A233Q, A233H, A233N, G234Q, G234H, G234N, E235Q, E235H, E235N, I238Q, I238H, I238N, E239Q, E239H, E239N, E240Q, E240H, E240N, T241Q, T241H, T241N, E242Q, E242H, E242N, T244Q, T244H, T244N, E245Q, E245H, E245N, K247N, K247Q, R248H, R248Q, V250Q, V250H, V250N, I251Q, I251H, I251N, R252H, R252Q, I253Q, I253H, I253N, I254Q, I254H, I254N, P255A, P255S, Y259H, Y259I, A261Q, A261H, A261N, A262Q, A262H, A262N, I263Q, I263H, I263N, K265N, K265Q, Y266H, Y266I, D269N, D269Q, I270Q, I270H, I270N, A271Q, A271H, A271N, L272I, L272V, L273I, L273V, E274Q, E274H, E274N, L275I, L275V, D276N, D276Q, E277Q, E277H, E277N, P278A, P278S, L279I, L279V, V280Q, V280H, V280N, L281I, L281V, S283Q, S283H, S283N, Y284H, Y284I, V285Q, V285H, V285N, T286Q, T286H, T286N, P287A, P287S, I288Q, I288H, I288N, I290Q, I290H, I290N, A291Q, A291H, A291N, D292N, D292Q, K293N, K293Q, E294Q, E294H, E294N, Y295H, Y295I, T296Q, T296H, T296N, I298Q, I298H, I298N, F299I, F299V, L300I, L300V, K301N, K301Q, F302I, F302V, G303Q, G303H, G303N, S304Q, S304H, S304N, G305Q, G305H, G305N, Y306H, Y306I, V307Q, V307H, V307N, S308Q, S308H, S308N, G309Q, G309H, G309N, W310S, W310H, G311Q, G311H, G311N, R312H, R312Q, V313Q, V313H, V313N, F314I, F314V, K316N, K316Q, G317Q, G317H, G317N, R318H, R318Q, S319Q, S319H, S319N, A320Q, A320H, A320N, L321I, L321V, V322Q, V322H, V322N, L323I, L323V, Y325H, Y325I, L326I, L326V, R327H, R327Q, V328Q, V328H, V328N, P329A, P329S, L330I, L330V, V331Q, V331H, V331N, D332N, D332Q, R333H, R333Q, A334Q, A334H, A334N, T335Q, T335H, T335N, L337I, L337V, R338H, R338Q, S339Q, S339H, S339N, T340Q, T340H, T340N, K341N, K341Q, F342I, F342V, T343Q, T343H, T343N, I344Q, I344H, I344N, Y345H, Y345I, M348I, M348V, F349I, F349V, A351Q, A351H, A351N, G352Q, G352H, G352N, F353I, F353V, E355Q, E355H, E355N, G356Q, G356H, G356N, G357Q, G357H, G357N, R358H, R358Q, D359N, D359Q, S360Q, S360H, S360N, G363Q, G363H, G363N, D364N, D364Q, S365Q, S365H, S365N, G366Q, G366H, G366N, G367Q, G367H, G367N, P368A, P368S, V370Q, V370H, V370N, T371Q, T371H, T371N, E372Q, E372H, E372N, V373Q, V373H, V373N, E374Q, E374H, E374N, G375Q, G375H, G375N, T376Q, T376H, T376N, S377Q, S377H, S377N, F378I, F378V, L379I, L379V, T380Q, T380H, T380N, G381Q, G381H, G381N, I382Q, I382H, I382N, I383Q, I383H, I383N, S384Q, S384H, S384N, W385S, W385H, G386Q, G386H, G386N, E387Q, E387H, E387N, E388Q, E388H, E388N, A390Q, A390H, A390N, M391I, M391V, K392N, K392Q, G393Q, G393H, G393N, K394N, K394Q, Y395H, Y395I, G396Q, G396H, G396N, I397Q, I397H, I397N, Y398H, Y398I, T399Q, T399H, T399N, K400N, K400Q, V401Q, V401H, V401N, S402Q, S402H, S402N, R403H, R403Q, Y404H, Y404I, V405Q, V405H, V405N, W407S, W407H, I408Q, I408H, I408N, K409N, K409Q, E410Q, E410H, E410N, K411N, K411Q, T412Q, T412H, T412N, K413N, K413Q, L414I, L414V, T415Q, T415H, 및 T415N에 상응하는 치환 중에서 선택되는 내인성 저해제에 대한 내성을 증가시키는 치환;
    d) T412A, T412V, E410Q, E410S, E410A, E410D, Y259F/K265T/Y345T, V86A, V86N, V86D, V86E, V86Q, V86G, V86H, V86I, V86L, V86M, V86F, V86S, V86T, V86W, V86Y, Y259F, A261K, K265T, E277V, E277A, E277N, E277D, E277Q, E277G, E277H, E277I, E277L, E277M, E277F, E277S, E277T, E277W, E277Y, R338A, R338V, R338I, R338F, R338W, R338S, R338T, Y345F, I383V, E388G, Y259F/K265T, Y259F/K265T/Y345F, Y259F/A261K/K265T/Y345F, Y259F/K265T/Y345F/I383V/E388G 및 Y259F/A261K/K265T/Y345F/I383V/E388G에 상응하는 치환 중에서 선택되는 촉매 활성을 증가시키는 치환;
    e) N346D, N346Y, T343R, T343E, T343D, T343Q, F342I, Y345A, Y345T, T343R/Y345T, T343R/N346D 및 T343R/N346Y에 상응하는 치환 중에서 선택되는 저밀도 리포단백질 수용체-관련 단백질(LRP) 결합을 증가시키는 치환;
    f) D64N, D64A, Y155F, Y155H, Y155Q, T155L, S158A, S158D 및 S158E에 상응하는 치환 중에서 선택되는 천연 β-히드록실화 부위를 제거하는 치환; 및
    g) Y1A, Y1C, Y1D, Y1E, Y1G, Y1H, Y1K, Y1N, Y1P, Y1Q, Y1R, Y1S, Y1T, S3T, L6A, L6C, L6D, L6E, L6G, L6H, L6K, L6N, L6P, L6Q, L6R, L6S, L6T, L6M, F9A, F9C, F9D, F9E, F9G, F9H, F9K, F9N, F9P, F9Q, F9R, F9S, F9T, F9I, F9M, F9W, V10A, V10C, V10D, V10E, V10G, V10H, V10K, V10N, V10P, V10Q, V10R, V10S, V10T, V10F, V10I, V10M, V10W, V10Y, Q11A, Q11C, Q11G, Q11P, G12D, G12E, G12G, G12H, G12K, G12N, G12P, G12Q, G12R, G12S, G12T, N13A, N13C, N13G, N13H, N13P, N13T, L14A, L14C, L14D, L14E, L14G, L14H, L14K, L14N, L14P, L14Q, L14R, L14S, L14T, L14F, L14I, L14M, L14V, L14W, L14Y, E15D, E15H, E15P, R16A, R16C, R16G, R16P, R16T, E17A, E17C, E17G, E17P, E17T, C18D, C18E, C18G, C18H, C18K, C18N, C18P, C18Q, C18R, C18S, C18T, M19A, M19C, M19D, M19E, M19G, M19H, M19K, M19N, M19P, M19Q, M19R, M19S, M19T, M19F, M19I, M19M, M19V, M19W, M19Y, E20A, E20C, E20G, E20P, E20T, E21A, E21C, E21G, E21P, K22H, K22P, K22T, S24H, S24P, F25A, F25C, F25D, F25E, F25G, F25H, F25K, F25N, F25P, F25Q, F25R, F25S, F25T, F25I, F25M, F25W, F25Y, E26A, E26C, E26G, E26P, E27A, E27C, E27G, E27H, E27P, E27S, E27T, A28C, A28D, A28E, A28G, A28H, A28K, A28N, A28P, A28Q, A28R, A28S, A28T, R29A, R29C, R29G, R29P, E30D, E30H, E30P, V31A, V31C, V31D, V31E, V31G, V31H, V31K, V31N, V31P, V31Q, V31R, V31S, V31T, V31F, V31I, V31W, V31Y, F32A, F32C, F32D, F32E, F32G, F32H, F32K, F32N, F32P, F32Q, F32R, F32S, F32T, E33H, E33N, E33P, E33Q, E33S, E33T, T35A, T35C, T35G, T35P, F41A, F41C, F41D, F41E, F41G, F41H, F41K, F41N, F41P, F41Q, F41R, F41S, F41T, F41M, F41W, F41Y, W42A, W42C, W42D, W42E, W42G, W42H, W42K, W42N, W42P, W42Q, W42R, W42S, W42T, K43A, K43C, K43G, K43P, Q44P, Q44T, Q44, Y45A, Y45C, Y45D, Y45E, Y45G, Y45H, Y45K, Y45N, Y45P, Y45Q, Y45R, Y45S, Y45T, V46A, V46C, V46D, V46E, V46G, V46H, V46K, V46N, V46P, V46Q, V46R, V46S, V46T, V46F, V46I, V46M, V46W, V46Y, D47A, D47C, D47G, D47H, D47P, D47T, G48D, G48E, G48P, G48T, D49H, D49P, D49Q, D49T, Q50A, Q50C, Q50D, Q50G, Q50H, Q50P, Q50T, C51D, C51E, C51G, C51H, C51K, C51N, 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G393H, G393K, G393N, G393P, G393Q, G393R, G393S, G393T, Y395A, Y395C, Y395D, Y395E, Y395G, Y395H, Y395K, Y395N, Y395P, Y395Q, Y395R, Y395S, Y395T, Y398A, Y398C, Y398D, Y398E, Y398G, Y398H, Y398K, Y398N, Y398P, Y398Q, Y398R, Y398S, Y398T, K400H, V401A, V401C, V401D, V401E, V401G, V401H, V401K, V401N, V401P, V401Q, V401R, V401S, V401T, V401F, V401I, V401M, V401W, V401Y, S402A, S402C, S402G, S402P, R403A, R403C, R403G, R403P, R403T, Y404A, Y404C, Y404D, Y404E, Y404G, Y404H, Y404K, Y404N, Y404P, Y404Q, Y404R, Y404S, Y404T, V405A, V405C, V405D, V405E, V405G, V405H, V405K, V405N, V405P, V405Q, V405R, V405S, V405T, V405W, V405Y, N406F, N406H, N406I, N406L, N406P, N406W, N406Y, W407D, W407E, W407F, W407H, W407I, W407K, W407N, W407P, W407Q, W407R, W407S, W407T, W407Y, I408D, I408E, I408H, I408K, I408N, I408P, I408Q, I408R, I408S, I408T, K409F, K409H, K409I, K409P, K409T, K409V, K409W, K409Y, E410H, K411A, K411C, K411G, K411I, K411P, K411T, K411V, K411W, K411Y 또는 K413T에 상응하는 치환 중에서 선택되는 면역원성을 감소시키는 치환;
    중에서 선택되는 5개까지의 추가적인 아미노산 치환을 포함하고;
    상기 변형된 FIX 폴리펩티드는 상기 변형을 포함하지 않는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 개선된 적어도 하나의 FIX 활성 또는 성질을 나타내고; 및
    상기 활성 또는 성질은 증가된 응혈 활성인, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  2. 비-변형된 FIX 폴리펩티드에서 아미노산 치환을 포함하는 변형된 FIX 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 치환은 서열번호 3에 제시된 서열로 구성되는 성숙한 FIX 폴리펩티드에서 R318Y, R318E, R318F 또는 R318W에 상응하거나, 비-변형된 FIX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 동일한 치환이며,
    상응하는 아미노산 잔기들은 서열번호 3의 폴리펩티드와 비-변형된 FIX 폴리펩티드의 서열배열(alignment)에 의해 확인되며;
    상기 비-변형된 FIX 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 20 또는 325 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 구성되고;
    서열번호 3 및 20은 성숙 FIX의 서열을 기재하고 있고, 서열번호 2 및 325는 전구체 FIX의 서열을 기재하고 있으며;
    상기 변형된 FIX 폴리펩티드는 하기 중 임의의 하나 또는 그 이상 또는 조합:
    a) Y1N, Y1N + S3T, S3N + K5S/T, G4T, G4N + L6S/T, K5N + E7T, L6N + E8T, E7N + F9T, F9N + Q11S/T, V10N + G12S/T, Q11N + N13T, G12N + L14S/T, L14N + R16T, E15T, E15N + E17T; R16N + C18S/T, M19N + E21T; E20N + K22T, K22N, S24N + E26T; F25N + E27T; E26N + A28T; E27N + R29T; A28N + E30T; R29N + V31S/T, E30N + F32T; V31N + E33T; F32N + N34T, E33N, T35N + R37S/T, E36T; E36N; R37N, T39N + F41S/T, E40N + W42T, F41N + K43S/T, W42N + Q44S/T, K43N + Y45T; Q44N + V46S/T, Y45N + D47T, V46N + G48S/T, D47N + D49S/T, G48N + Q50S/T, D49N + C51S/T, Q50N + E52S/T, E52N + N54T, S53N + P55S/T, C56S/T, L57N + G59S/T, G59N + S61T; G60S/T, S61N + K63S/T, K63N + D65S/T, D65N + N67S/T, I66N + S68S/T, Y69S/T, Y69N + C71S/T, S68N + E70S/T, E70N + W72S/T, W72N + P74S/T, P74N + G76S/T, F75N, G76N + E78T, E78N + K80T, F77T, F77N + G79S/T, G79N + N81S/T, K80N + C82S/T, E83S/T, E83N + D85S/T, L84N + V86S/T, D85N, V86A, V86N + C88S/T, T87N + N89S/T, I90N + N92S/T, K91S/T, I90N + N92S/T, K91N + G93S/T, R94S/T, R94N + E96S/T, K100N, A103S/T, S102N + D104S/T, A103N + N105S/T, D104N + K106S/T, V107S/T, K106N + V108S/T, V108N + V110S/T, S111N, E113N + Y115S/T, G114N + R116S/T, R116N + A118S/T, E119N + Q121S/T, K122S/T, Q121N + S123S/T, K122N + C124S/T, S123N + E125S/T, E125N + A125S/T, P126N + V128S/T, A127N + P129T, V128N + F130S/T, P129N + P131S/T, F130N + C132S/T, R134N, V135N + V137S/T, S136N, S138N, V137N + Q139T; Q139N, T140N + L142S/T, S141N + L143S/T, K142N, A146N + A148S/T, E147N + V149S/T, T148N + F150S/T, V149N + P151S/T, F150N + D152S/T, P151N + V153S/T, D152N + D154S/T, V153N + Y155S/T, D154N + V156S/T, Y155N + N157S/T, V156N, S158N + E160S/T, T159N + A161S/T, E160N + E162S/T, A161N, E162N + I164S/T, T163N + L165S/T, I164N + D166S/T, L165N + N167S/T, D166N + I168S/T, I168N + Q170S/T, T169N, Q170N, S171N + Q173S/T, T172N, Q173N + F175S/T, S174N + N176S/T, F175N + D177S/T, F178S/T, D177N, D177E, F178N + R180S/T, T179N + V181S/T, R180N + V182S/T, G183 + E185S/T, G184N + D186T, E185N + A187S/T, D186N + K188S/T, A187N + P189T, K188N + G190S/T, P189N + Q181S/T, G200N + V202T, K201N + D203S/T, K201T, V202N + A204S/T, D203N + F205S/T, E213N + W215S/T, K214T, V223T, E224N + G226S/T, T225N + V227S/T, G226N + K228S/T, V227N + I229T, K228N, H236N + I238T; I238N + E240T; E239N, E240N + E242S/T, E242N, T241N + H243S/T, H243N + E245S/T, K247N + N249S/T, V250N + R252T, I251S/T, I251N + I253S/T, R252N + I254S/T, I253N + P255S/T, P255N + H257S/T, H257N + Y259S/T, N260S/T, A262S/T, A261N + I263S/T, A262N + N264S/T, I263N + K265S/T, K265N + N267S/T, A266N + H268S/T, D276N + P278S/T, P278N + V280S/T, E277N + L279S/T, V280N + N282S/T, Y284S/T, S283N + V285S/T, Y284N, D292N + K294S/T, K293N + Y295S/T, E294N, F299S/T, I298N + L300S/T, K301N + G303S/T, F302N, G303N + G305S/T, S304N + Y306S/T, Y306N + S308S/T, R312N + F314S/T, V313N + H315T, F314N + K316S/T, H315N + G317S/T, K316N + R138S/T, G317N, R318N + A320S/T, S319N + L321S/T, A320N + V322T, L321N + L323S/T, V322N + Q324S/T, Y325N + R327S/T, R327N + P329S/T, P329N + V331S/T, L330N + D332S/T, D332N + A334S/T, R333N, A334N + C336S/T, T335N + L337S/T, L337N, R338N, S339N + K341T, T340N + F342T; K341N, F342N + I344S/T, T343N + Y345S/T, Y345N + N347S/T, M348S/T, G352N + H354T, F353N, F353N + E355T, H354N + G356S/T, H354V, H354I, E355T, E355N + G357S/T, G356N + R358T, G357N + D359S/T, R358N, Q362N + D364S/T, V370N; T371V; T371I; E372T, E372N + E374S/T, E374N, G375N, W385N + E387T; G386N + E388T, E388N + A390S/T, A390N + K392T, M391N + G393S/T, K392N + K394S/T, K392V, G393T, G393N + Y395S/T, K394N + G396S/T, R403N + V405S/T, I408S/T, K409N + K411S/T, E410N, K411N + K413S/T, 및 K413N에 상응하는 아미노산 치환 중에서 선택되는 글리코실화 부위를 도입하는 변형;
    b) S53A, S61A, N157D, N157Q, T159A, N167D, N167Q, T169A, T172A, 및 T179A에 상응하는 치환 중에서 선택되는 글리코실화 부위를 제거하는 치환;
    c) R252A, H257A, H268A, K293A, R318A, R333A, R338A, K400A, R403A, R403E, K411A, R312Q, R312A, R312Y, R312L, V202M, V202Y, D203M, D203Y, A204M, A204Y, K400A/R403A, K400E/R403E, R403A, R403E, R403D, K400A, K400E, K293E, K293A, R333A, R333E, R333S, R338A, R338E, R338L, R338A/R403A, R338E/R403E, K293A/R403A, K293E/R403E, K293A/R338A/R403A, K293E/R338E/R403E, R318A/R403A, R318E/R403E, R318Y/R338E/R403E, R318Y/R338E, R318N/A320S, K316N, K316A, K316E, K316S, K316M, E239N, E239S, E239A, E239R, E239K, H257F, H257Y, H257E, H257S, E410N, N260S, F314N/K316S, Y1H, Y1I, S3Q, S3H, S3N, G4Q, G4H, G4N, K5N, K5Q, L6I, L6V, E7Q, E7H, E7N, E8Q, E8H, E8N, F9I, F9V, V10Q, V10H, V10N, G12Q, G12H, G12N, L14I, L14V, E15Q, E15H, E15N, R16H, R16Q, E17Q, E17H, E17N, M19I, M19V, E20Q, E20H, E20N, E21Q, E21H, E21N, K22N, K22Q, S24Q, S24H, S24N, F25I, F25V, E26Q, E26H, E26N, E27Q, E27H, E27N, A28Q, A28H, A28N, R29H, R29Q, E30Q, E30H, E30N, V31Q, V31H, V31N, F32I, F32V, E33Q, E33H, E33N, T35Q, T35H, T35N, E36Q, E36H, E36N, R37H, R37Q, T38Q, T38H, T38N, T39Q, T39H, T39N, E40Q, E40H, E40N, F41I, F41V, W42S, W42H, K43N, K43Q, Y45H, Y45I, V46Q, V46H, V46N, D47N, D47Q, G48Q, G48H, G48N, D49N, D49Q, E52Q, E52H, E52N, S53Q, S53H, S53N, P55A, P55S, L57I, L57V, N58Q, N58S, G59Q, G59H, G59N, G60Q, G60H, G60N, S61Q, S61H, S61N, K63N, K63Q, D64N, D64Q, D65N, D65Q, I66Q, I66H, I66N, S68Q, S68H, S68N, Y69H, Y69I, E70Q, E70H, E70N, W72S, W72H, P74A, P74S, F75I, F75V, G76Q, G76H, G76N, F77I, F77V, E78Q, E78H, E78N, G79Q, G79H, G79N, K80N, K80Q, E83Q, E83H, E83N, L84I, L84V, D85N, D85Q, V86Q, V86H, V86N, T87Q, T87H, T87N, I90Q, I90H, I90N, K91N, K91Q, N92Q, N92S, G93Q, G93H, G93N, R94H, R94Q, E96Q, E96H, E96N, F98I, F98V, K100N, K100Q, S102Q, S102H, S102N, A103Q, A103H, A103N, D104N, D104Q, K106N, K106Q, V107Q, V107H, V107N, V108Q, V108H, V108N, S110Q, S110H, S110N, T112Q, T112H, T112N, E113Q, E113H, E113N, G114Q, G114H, G114N, Y115H, Y115I, R116H, R116Q, L117I, L117V, A118Q, A118H, A118N, E119Q, E119H, E119N, K122N, K122Q, S123Q, S123H, S123N, E125Q, E125H, E125N, P126A, P126S, A127Q, A127H, A127N, V128Q, V128H, V128N, P129A, P129S, P131A, P131S, G133Q, G133H, G133N, R134H, R134Q, V135Q, V135H, V135N, S136Q, S136H, S136N, V137Q, V137H, V137N, S138Q, S138H, S138N, T140Q, T140H, T140N, S141Q, S141H, S141N, K142N, K142Q, L143I, L143V, T144Q, T144H, T144N, R145H, R145Q, A146Q, A146H, A146N, E147Q, E147H, E147N, T148Q, T148H, T148N, V149Q, V149H, V149N, P151A, P151S, D152N, D152Q, V153Q, V153H, V153N, D154N, D154Q, Y155H, Y155I, V156Q, V156H, V156N, S158Q, S158H, S158N, T159Q, T159H, T159N, E160Q, E160H, E160N, A161Q, A161H, A161N, E162Q, E162H, E162N, T163Q, T163H, T163N, I164Q, I164H, I164N, L165I, L165V, L165Q, L165H, D166N, D166Q, I168Q, I168H, I168N, T169Q, T169H, T169N, S171Q, S171H, S171N, T172Q, T172H, T172N, S174Q, S174H, S174N, F175I, F175V, F175H, D177N, D177Q, F178I, F178V, F178H, T179Q, T179H, T179N, R180H, R180Q, V181Q, V181H, V181N, V182Q, V182H, V182N, G183Q, G183H, G183N, G184Q, G184H, G184N, E185Q, E185H, E185N, D186N, D186Q, A187Q, A187H, A187N, K188N, K188Q, P189A, P189S, G190Q, G190H, G190N, F192I, F192V, F192IH, P193A, P193S, W194S, W194H, W194I, V196Q, V196H, V196N, V197Q, V197H, V197N, L198I, L198V, L198Q, L198H, N199Q, N199S, G200Q, G200H, G200N, K201N, K201Q, V202Q, V202H, V202N, D203N, D203Q, A204Q, A204H, A204N, F205I, F205V, G207Q, G207H, G207N, G208Q, G208H, G208N, S209Q, S209H, S209N, I210Q, I210H, I210N, V211Q, V211H, V211N, E213Q, E213H, E213N, K214N, K214Q, W215S, W215H, I216Q, I216H, I216N, V217Q, V217H, V217N, T218Q, T218H, T218N, A219Q, A219H, A219N, A220Q, A220H, A220N, V223Q, V223H, V223N, E224Q, E224H, E224N, T225Q, T225H, T225N, G226Q, G226H, G226N, V227Q, V227H, V227N, K228N, K228Q, I229Q, I229H, I229N, T230Q, T230H, T230N, V231Q, V231H, V231N, V232Q, V232H, V232N, A233Q, A233H, A233N, G234Q, G234H, G234N, E235Q, E235H, E235N, I238Q, I238H, I238N, E239Q, E239H, E239N, E240Q, E240H, E240N, T241Q, T241H, T241N, E242Q, E242H, E242N, T244Q, T244H, T244N, E245Q, E245H, E245N, K247N, K247Q, R248H, R248Q, V250Q, V250H, V250N, I251Q, I251H, I251N, R252H, R252Q, I253Q, I253H, I253N, I254Q, I254H, I254N, P255A, P255S, Y259H, Y259I, A261Q, A261H, A261N, A262Q, A262H, A262N, I263Q, I263H, I263N, K265N, K265Q, Y266H, Y266I, D269N, D269Q, I270Q, I270H, I270N, A271Q, A271H, A271N, L272I, L272V, L273I, L273V, E274Q, E274H, E274N, L275I, L275V, D276N, D276Q, E277Q, E277H, E277N, P278A, P278S, L279I, L279V, V280Q, V280H, V280N, L281I, L281V, S283Q, S283H, S283N, Y284H, Y284I, V285Q, V285H, V285N, T286Q, T286H, T286N, P287A, P287S, I288Q, I288H, I288N, I290Q, I290H, I290N, A291Q, A291H, A291N, D292N, D292Q, K293N, K293Q, E294Q, E294H, E294N, Y295H, Y295I, T296Q, T296H, T296N, I298Q, I298H, I298N, F299I, F299V, L300I, L300V, K301N, K301Q, F302I, F302V, G303Q, G303H, G303N, S304Q, S304H, S304N, G305Q, G305H, G305N, Y306H, Y306I, V307Q, V307H, V307N, S308Q, S308H, S308N, G309Q, G309H, G309N, W310S, W310H, G311Q, G311H, G311N, R312H, R312Q, V313Q, V313H, V313N, F314I, F314V, K316N, K316Q, G317Q, G317H, G317N, R318H, R318Q, S319Q, S319H, S319N, A320Q, A320H, A320N, L321I, L321V, V322Q, V322H, V322N, L323I, L323V, Y325H, Y325I, L326I, L326V, R327H, R327Q, V328Q, V328H, V328N, P329A, P329S, L330I, L330V, V331Q, V331H, V331N, D332N, D332Q, R333H, R333Q, A334Q, A334H, A334N, T335Q, T335H, T335N, L337I, L337V, R338H, R338Q, S339Q, S339H, S339N, T340Q, T340H, T340N, K341N, K341Q, F342I, F342V, T343Q, T343H, T343N, I344Q, I344H, I344N, Y345H, Y345I, M348I, M348V, F349I, F349V, A351Q, A351H, A351N, G352Q, G352H, G352N, F353I, F353V, E355Q, E355H, E355N, G356Q, G356H, G356N, G357Q, G357H, G357N, R358H, R358Q, D359N, D359Q, S360Q, S360H, S360N, G363Q, G363H, G363N, D364N, D364Q, S365Q, S365H, S365N, G366Q, G366H, G366N, G367Q, G367H, G367N, P368A, P368S, V370Q, V370H, V370N, T371Q, T371H, T371N, E372Q, E372H, E372N, V373Q, V373H, V373N, E374Q, E374H, E374N, G375Q, G375H, G375N, T376Q, T376H, T376N, S377Q, S377H, S377N, F378I, F378V, L379I, L379V, T380Q, T380H, T380N, G381Q, G381H, G381N, I382Q, I382H, I382N, I383Q, I383H, I383N, S384Q, S384H, S384N, W385S, W385H, G386Q, G386H, G386N, E387Q, E387H, E387N, E388Q, E388H, E388N, A390Q, A390H, A390N, M391I, M391V, K392N, K392Q, G393Q, G393H, G393N, K394N, K394Q, Y395H, Y395I, G396Q, G396H, G396N, I397Q, I397H, I397N, Y398H, Y398I, T399Q, T399H, T399N, K400N, K400Q, V401Q, V401H, V401N, S402Q, S402H, S402N, R403H, R403Q, Y404H, Y404I, V405Q, V405H, V405N, W407S, W407H, I408Q, I408H, I408N, K409N, K409Q, E410Q, E410H, E410N, K411N, K411Q, T412Q, T412H, T412N, K413N, K413Q, L414I, L414V, T415Q, T415H, 및 T415N에 상응하는 치환 중에서 선택되는 내인성 저해제에 대한 내성을 증가시키는 치환;
    d) T412A, T412V, E410Q, E410S, E410A, E410D, Y259F/K265T/Y345T, V86A, V86N, V86D, V86E, V86Q, V86G, V86H, V86I, V86L, V86M, V86F, V86S, V86T, V86W, V86Y, Y259F, A261K, K265T, E277V, E277A, E277N, E277D, E277Q, E277G, E277H, E277I, E277L, E277M, E277F, E277S, E277T, E277W, E277Y, R338A, R338V, R338I, R338F, R338W, R338S, R338T, Y345F, I383V, E388G, Y259F/K265T, Y259F/K265T/Y345F, Y259F/A261K/K265T/Y345F, Y259F/K265T/Y345F/I383V/E388G 및 Y259F/A261K/K265T/Y345F/I383V/E388G에 상응하는 치환 중에서 선택되는 촉매 활성을 증가시키는 치환;
    e) N346D, N346Y, T343R, T343E, T343D, T343Q, F342I, Y345A, Y345T, T343R/Y345T, T343R/N346D 및 T343R/N346Y에 상응하는 치환 중에서 선택되는 저밀도 리포단백질 수용체-관련 단백질(LRP) 결합을 증가시키는 치환;
    f) D64N, D64A, Y155F, Y155H, Y155Q, T155L, S158A, S158D 및 S158E에 상응하는 치환 중에서 천연 β-히드록실화 부위를 제거하는 치환; 및
    g) Y1A, Y1C, Y1D, Y1E, Y1G, Y1H, Y1K, Y1N, Y1P, Y1Q, Y1R, Y1S, Y1T, S3T, L6A, L6C, L6D, L6E, L6G, L6H, L6K, L6N, L6P, L6Q, L6R, L6S, L6T, L6M, F9A, F9C, F9D, F9E, F9G, F9H, F9K, F9N, F9P, F9Q, F9R, F9S, F9T, F9I, F9M, F9W, V10A, V10C, V10D, V10E, V10G, V10H, V10K, V10N, V10P, V10Q, V10R, V10S, V10T, V10F, V10I, V10M, V10W, V10Y, Q11A, Q11C, Q11G, Q11P, G12D, G12E, G12G, G12H, G12K, G12N, G12P, G12Q, G12R, G12S, G12T, N13A, N13C, N13G, N13H, N13P, N13T, L14A, L14C, L14D, L14E, L14G, L14H, L14K, L14N, L14P, L14Q, L14R, L14S, L14T, L14F, L14I, L14M, L14V, L14W, L14Y, E15D, E15H, E15P, R16A, R16C, R16G, R16P, R16T, E17A, E17C, E17G, E17P, E17T, C18D, C18E, C18G, C18H, C18K, C18N, C18P, C18Q, C18R, C18S, C18T, M19A, M19C, M19D, M19E, M19G, M19H, M19K, M19N, M19P, M19Q, M19R, M19S, M19T, M19F, M19I, M19M, M19V, M19W, M19Y, E20A, E20C, E20G, E20P, E20T, E21A, E21C, E21G, E21P, K22H, K22P, K22T, S24H, S24P, F25A, F25C, F25D, F25E, F25G, F25H, F25K, F25N, F25P, F25Q, F25R, F25S, F25T, F25I, 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G375H, S377A, S377C, S377G, S377P, F378A, F378C, F378D, F378E, F378G, F378H, F378K, F378N, F378P, F378Q, F378R, F378S, F378T, F378W, L379A, L379C, L379D, L379E, L379G, L379H, L379K, L379N, L379P, L379Q, L379R, L379S, L379T, L379I, L379M, L379W, L379Y, T380A, T380C, T380G, T380P, G381D, G381E, G381H, G381K, G381N, G381P, G381Q, G381R, G381S, G381T, I382A, I382C, I382D, I382E, I382G, I382H, I382K, I382N, I382P, I382Q, I382R, I382S, I382T, I382M, I382W, I382Y, I383A, I383C, I383D, I383E, I383G, I383H, I383K, I383N, I383P, I383Q, I383R, I383S, I383T, S384A, S384C, S384G, S384P, W385A, W385C, W385D, W385E, W385G, W385H, W385K, W385N, W385P, W385Q, W385R, W385S, W385T, W385M, E387A, E387C, E387G, E387H, E387P, E387T, E388H, E388N, E388P, E388Q, E388T, A390C, A390D, A390E, A390G, A390H, A390K, A390N, A390P, A390Q, A390R, A390S, M391A, M391C, M391D, M391E, M391G, M391H, M391K, M391N, M391P, M391Q, M391R, M391S, M391T, M391F, M391I, M391W, M391Y, K392A, K392C, K392G, K392P, G393C, G393D, G393E, G393H, G393K, G393N, G393P, G393Q, G393R, G393S, G393T, Y395A, Y395C, Y395D, Y395E, Y395G, Y395H, Y395K, Y395N, Y395P, Y395Q, Y395R, Y395S, Y395T, Y398A, Y398C, Y398D, Y398E, Y398G, Y398H, Y398K, Y398N, Y398P, Y398Q, Y398R, Y398S, Y398T, K400H, V401A, V401C, V401D, V401E, V401G, V401H, V401K, V401N, V401P, V401Q, V401R, V401S, V401T, V401F, V401I, V401M, V401W, V401Y, S402A, S402C, S402G, S402P, R403A, R403C, R403G, R403P, R403T, Y404A, Y404C, Y404D, Y404E, Y404G, Y404H, Y404K, Y404N, Y404P, Y404Q, Y404R, Y404S, Y404T, V405A, V405C, V405D, V405E, V405G, V405H, V405K, V405N, V405P, V405Q, V405R, V405S, V405T, V405W, V405Y, N406F, N406H, N406I, N406L, N406P, N406W, N406Y, W407D, W407E, W407F, W407H, W407I, W407K, W407N, W407P, W407Q, W407R, W407S, W407T, W407Y, I408D, I408E, I408H, I408K, I408N, I408P, I408Q, I408R, I408S, I408T, K409F, K409H, K409I, K409P, K409T, K409V, K409W, K409Y, E410H, K411A, K411C, K411G, K411I, K411P, K411T, K411V, K411W, K411Y 또는 K413T에 상응하는 치환 중에서 면역원성을 감소시키는 치환;
    중에서 선택된 6개까지의 추가적인 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하고;
    상기 변형된 FIX 폴리펩티드는 활성형에서, 변형을 포함하지 않는 비-변형된 FIX 폴리펩티드와 비교하여 개선된 적어도 하나의 FIX 활성 또는 성질을 나타내며; 및
    상기 활성 또는 성질은 AT-Ⅲ의 저해 효과에 대한 증가된 저항성인, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    치환 R318Y/R338E/T343R을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 잔기 E410 또는 비-변형된 FIX 폴리펩티드에서 410에 상응하는 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 N 또는 S인 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 N인 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 3 또는 20에 기재된 서열로 구성되는 성숙 FIX 폴리펩티드의 잔기 403 또는 서열번호 2 또는 325의 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 치환은 E인 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 3 또는 20에 기재된 서열로 구성되는 성숙 FIX 폴리펩티드에서 아미노산 치환 R318Y, R338E, T343R, R403E 및 E410N을 포함하거나, 또는 서열번호 2 또는 325의 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에서 동일한 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 폴리펩티드에서 아미노산 치환 R318Y/R338E/T343R을 포함하고, 비-변형된 FIX 폴리펩티드가 서열번호 2, 3, 20 또는 325 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, R318Y/R338E/T343R, R338E/T343R, R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, Y155F/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, D104N/K106S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, R318Y/R338E/T343R/N346Y/R403E/E410N, R318Y/R338E/T343R/N346D/R403E/E410N, R318Y/R338E/T343R/R403E, Y155F/R318Y/R338E/T343R/R403E, R318Y/R338E/T343R/E410N, Y155F/R318Y/R338E/T343R/E410N, R338E/T343R/R403E/E410N, Y155F/R338E/T343R/R403E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, N260S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, Y155F/N260S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, Y155F/K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N, Y155F/R338E/T343R/R403E, R338E/T343R/R403E, Y155F/R338E/T343R/R403E/E410S, Y155F/N260S/R338E/T343R/R403E, Y155F/I251S/R338E/T343R/R403E, R318Y/R338E/T343R/R403E/E410S, R338E/T343R/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E, K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E, Y155F/K247N/N249S/R338E/T343R/R403E/E410N, K247N/N249S/R338E/T343R/R403E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R338E/T343R, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/E410N, Y155F/K247N/N249S/R338E/T343R/R403E, K247N/N249S/R338E/T343R/R403E, Y155F/K247N/N249S/R338E/T343R/E410N, K247N/N249S/R338E/T343R/E410N, Y155F/R318Y/R338E/T343R, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R, K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R, Y155F/R338E/T343R/E410N, R338E/T343R/E410N, Y155F/R338E/T343R/E410N, R338E/T343R/E410N 또는 K228N/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/T343R/E410N, Y155F/R318Y/R338E/R403E, R318Y/R338E/R403E, R318Y/R338E/E410N, K228N/R318Y/E410N, R318Y/R403E/E410N, D203N/F205T/R318Y/E410N, A103N/N105S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/R318Y/R338E/E410N,I251S/R318Y/E410N/R338E, D104N/K106S/I251S/R318Y/R338E/E410N, A103N/N105S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, A103N/N105S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/R318Y/R338E/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R338E/E410N, Y155F/R318Y/R338E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/E410N, R318Y/R338E/R403E/E410S, R318Y/R338E/R403E/E410N/T412V, R318Y/R338E/R403E/E410N/T412A, R318Y/R338E/R403E/T412A, R318Y/R338E/E410S, R318Y/R338E/T412A, R318Y/R338E/E410N/T412V, D85N/K228N/R318Y/R338E/R403E/E410N, N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N, Y155F/R318Y/R338E/N346D/R403E/E410N, K247N/N249S/T343R/R403E/E410N, K247N/N249S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N,　Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E, D104N/K106S/Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, D104N/K106S/K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/K228N/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410N, Y155F/K247N/N249S/N260S/R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/R338E/N346Y/R403E/E410N,　 R318Y/R338E/Y345A/R403E/E410N, K228N/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N, R318Y/R338E/Y345A/N346D/R403E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E, K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E, Y155F/K247N/N249S/R318Y/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/R403E/E410N,　R318Y/T343R/R403E/E410N, Y155F/R318Y/T343R/R403E/E410N,　Y155F/K228N/I251S/R318Y/R338E/R403E/E410N,　Y155F/K247N/N249S/R318Y/R403E, Y155F/K247N/N249S/R318Y/E410N,　Y155F/K247N/N249S/R318Y/T343R/R403E/E410N, K247N/N249S/R318Y/T343R/R403E/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/T343R/R403E, K247N/N249S/R318Y/T343R/R403E, Y155F/K247N/N249S/R318Y/T343R/E410N, K247N/N249S/R318Y/T343R/E410N, Y155F/R318Y/T343R/R403E, Y155F/R318Y/T343R/E410N, Y155F/K247N/N249S/R318Y/T343R, K247N/N249S/R318Y/T343R/E410N, K228N/K247N/N249S/R318Y/T343R/R403E/E410N 또는 Y155F/R318Y/R403E/E410N 중에서 선택된 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, 아미노산 치환 R318Y/R338E/T343R, R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N 또는 R318Y/R338E/T343R/E410N을 포함하는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  12. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기의 서열이 서열번호 267, 330, 331, 334, 336, 345-348, 353, 354, 357-360, 366, 368, 369, 378, 379, 393, 394, 397, 398 및 405-407 중 어느 하나에 기재된 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  13. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기의 서열이 서열번호 394에 기재된 아미노산 잔기의 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  14. 제1항에 있어서, 성숙 폴리펩티드이고, 비-변형된 FIX 폴리펩티드가 서열번호 3 또는 20에 기재된 서열로 구성되는 FIXa 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  15. 제1항에 있어서, 이중쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, 단일쇄 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  17. 제1항에 있어서, 활성화된 것임을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  18. 제1항에 있어서, 과글리코실화된 것임을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  19. 제1항에 있어서, 1차 서열만이 변형된 것임을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  20. 제1항에 있어서, 변형된 FIX 폴리펩티드가 글라이코실화, 카르복실화, 히드록실화, 설페이트화, 포스포릴화, 알부민화 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티에 컨쥬게이트된 것임을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  21. 제1항에 있어서, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 변형만을 포함하고, 상기 변형이 아미노산 치환, 삽입 또는 결실인 것을 특징으로 하는, 변형된 FIX 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 변형된 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  23. 제22항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 벡터가 원핵생물 벡터, 바이러스 벡터 또는 진핵생물 벡터인 것을 특징으로 하는, 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 벡터가 포유동물 벡터인 것을 특징으로 하는, 벡터.
  26. 제23항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 아데노-관련-바이러스, 레트로바이러스, 헤르피스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 및 사이토메갈로바이러스 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  27. 제23항의 벡터를 포함하는 분리된 세포.
  28. 제27항에 있어서, 진핵생물 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  29. 제28항에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  30. 제27항의 세포를 배양 조건하에서 배양하여 암호화된 변형된 FIX 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및 선택적으로 상기 FIX 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는, 변형된 FIX 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  31. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 변형된 FIX 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는, 혈액 응고 장애, 혈액 장애, 출혈성 장애, 혈우병 및 출혈 장애 중에서 선택되는 질환 또는 상태 치료용 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 경구, 비강, 폐, 구강, 경피, 피하, 십이지장내, 장, 비경구, 정맥내 또는 근육내 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 피하 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  34. 제31항에 있어서, FIX가 활성형 FIX(FIXa)인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  35. 제31항에 있어서, 치료되는 질환 또는 상태가 혈우병인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 혈우병이 혈우병 B인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  37. 제22항의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는, 혈액 응고 장애, 혈액 장애, 출혈성 장애, 혈우병 및 출혈 장애 중에서 선택되는 질환 또는 상태 치료용 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 혈우병 치료용인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  39. 제23항의 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는, 혈액 응고 장애, 혈액 장애, 출혈성 장애, 혈우병 및 출혈 장애 중에서 선택되는 질환 또는 상태 치료용 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 혈우병 치료용인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.













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