KR20080021682A

KR20080021682A - 패혈증 치료용 재조합 활성화 인간 단백질 ｃ의 제조를위한 코돈 최적화를 포함하는 방법

Info

Publication number: KR20080021682A
Application number: KR1020077029877A
Authority: KR
Inventors: 모라와라 빌루 파텔
Original assignee: 아베스타 겐그레인 테크놀로지스 피브이티 리미티드
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2008-03-07
Also published as: AP2007004253A0; CN101228269A; RU2007147432A; EP1888744A2; CA2609435A1; IL187477A0; WO2006126070A3; US20090068721A1; ZA200711006B; WO2006126070A2; JP2009502118A; MX2007014674A; BRPI0611376A2; AU2006250889A1

Abstract

본 발명은 활성화된 단백질 C 제조의 재조합 방법에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 활성화 인간 단백질 C의 구축, 형질전환, 발현, 정제 및 제조 방법에 관한 것이다. 목적 유전자와 연관된 제어 요소를 포함하는 DNA 구축물이 개시된다. 목적 핵산 서열은 적절한 포유류 숙주 세포에서의 발현을 허용하도록 코돈 최적화되었다.

Description

패혈증 치료용 재조합 활성화 인간 단백질 Ｃ의 제조를 위한 코돈 최적화를 포함하는 방법{A PROCESS COMPRISING CODON OPTIMIZATION FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT ACTIVATED HUMAN PROTEIN C FOR THE TREATMENT OF SEPSIS}

시그리스 (Xigris) (드로트레코긴 알파(Drotrecogin alfa))는 인간 활성화된 단백질 C의 재조합 형태이다. 이는 인간 혈장 유래의 활성화된 단백질 C와 동일한 아미노산 서열을 가진 세린 프로테아제이다. 활성화된 단백질 C는 감염에 대한 계통적 반응의 중요한 조절제이며, 항-트롬보성, 프로피브린용해성 (profibrinolytic) 및 항-염증성 성질을 갖는다. 드로트레코긴 알파 (활성화)는 분자량 약 55 kD 의 당단백질이다. 단백질 C 의 전구체 형태는 프리 프로 리더 펩티드 (pre pro leader peptide) (성숙 단백질에서는 결여), 9 Gla 잔기의 γ-카르복시글루타민산 (Gla) 도메인, 짧은 나선형 소수성 아미노산 스택 (stack), 2 개의 상피세포 성장 인자 (EGF)-유사 도메인, 경쇄 및 중쇄 사이의 연결 펩티드, 활성화 펩티드, 및 카탈리틱 트리아드 (catalytic triad)가 His-211, Asp-257 및 Ser-360 에 위치된 트립신-유사 SP 도메인을 포함한다. EGF-도메인의 주요 기능은 단백질-단백질 또는 단백질-세포 상호작용을 제공하는 것이다. EGF 모티프 중에 존재하는 잔기는 상이한 활성제 및 기질과 기능적으로 작용하는 것으로도 나타났다. 또한, 연결 나선은 신경보호 역할을 하는 것으로 생각되는 EGF-I 도메인에 결합된 칼슘 이온의 배위에 참여하는 잔기를 갖는다.

번역 후 변경은 디-펩티드 Lys-156-Arg-157을 제거하며, 따라서 단일 사슬 형태가 이황화 결합에 의해 연결된 2-사슬 분자로 전환된다. 80% 의 지모겐 PC (zymogen PC)가 이러한 형태이다. 아미노 말단 Gla 도메인에서 글루탐산 잔기의 카르복실화, EGF-I 도메인에서 Asp 잔기의 히드록실화 및 글리코실화는 기타 번역 후 일어나는 것이다. RhAPC 및 인간 혈장 유래 APC는, 글리코실화 구조에 일부 변화가 존재하기는 하지만, 동일한 글리코실화 자리를 갖는다. 인간 APC는 4 개의 아스파라긴 연결된 N-글리코실화 자리를 갖는다. 이는 기타 혈장 단백질에 비해, 5 배 더 높은 시알산을 갖는다.

인간 APC 는 4 개의 아스파라긴 연결된 N-글리코실화 자리를 갖는다. 이는 기타 혈장 단백질에 비해, 5 배 높은 푸코오스 및 2 배 더 높은 시알산을 갖는다. 활성화된 단백질 C는 인자 Va 및 VIIIa 를 저해함에 의해 영향력을 발휘한다. 시험관 내 시험 데이타는, 활성화된 단백질 C의 플라스미노겐 활성제 저해제-1 (PAI-1)의 저해 능력 및 활성화된 트롬빈-활성화가능한-피브린용해-저해제의 생성을 제 한함에 의해, 활성화된 단백질 C 이 간접적인 프로피브린용해 활성을 가진다는 것을 나타낸다. 추가적으로, 시험관 내 시험 데이타는, 활성화된 단백질 C가 단핵구에 의한 인간 종양 괴사 인자 제조를 저해함에 의해, 백혈구의 셀렉틴 (selectins)으로의 부착을 방해함에 의해, 그리고 트롬빈-유도된 염증 반응을 미세혈관의 내피세포 내에서 제한함에 의해 항-염증 효과를 발휘할 수 있다는 것을 나타낸다.

보다 높은 진핵 시스템에서 재조합 단백질의 발현을 위한 몇몇 방법이 설명되어 왔다. CHO-K1, HEK293 (및 변이체) 세포 발현 시스템은 이제 포유류 단백질 발현을 위한 유력한 시스템 선택으로서 확립되었다. 개괄된 절차는 재조합 인간 드로트레코긴 알파를 암호화하는 드 노보(de novo) 합성된 핵산 서열을 발현에 적합한 포유류 숙주 내로 형질감염하는데 적합하다.

하기 개괄된 절차는 생활성, 재조합 가용성 재조합 활성화된 인간 단백질 C의 제조에 적합하다. 현재 프로토콜은, 단백질을 발효 배지 내로 분비하는 비활성 인간 단백질 C 지모겐에 대한 상보적 DNA를 갖는 확립된 인간 세포주를 이용한다. 활성화된 단백질 C 를 수득하기 위해, 인간 단백질 C는 알파-트롬빈, 트립신, 러셀 독사 독 인자 X 활성제 또는 트롬빈 및 트롬보모듈린의 혼합물을 사용한 분열에 의해 효소적으로 활성화되고, 이어서 정제된다. 그러나, 이러한 활성화 과정은 오염의 위험이 있으며, 제조 비용이 더 높다. 본 연구의 목적은 활성화된 단백질 C 를, 세포-연관된 프로테아제의 포함에 의해 재조합 세포들로부터 직접 제조하는 것이다.

그러한 프로테아제는 세포질 또는 세포 소기관에 또는 분비 동안 또는 분비 즉시 단백질을 절단할 수 있는 세포막에 위치할 수 있다. 따라서, 상기 전략은 진핵성 숙주 세포, 즉 HEK293 으로부터, 분비 즉시 재조합 활성화된 단백질 C 를 제조하는데 사용되어 왔다.

재조합 효소는, 사망 위험이 큰 심한 패혈증 (즉, 급성 기관 손상과 관련된 패혈증)을 가진 성인 환자에서 사망률 감소의 용도로 이용될 것이다.

도면의 설명:

도 1. 드로트레코긴 알파 또는 시그리스를 암호화하는 DNA 뉴클레오티드 서열의 비-최적화 및 코돈-최적화된 형태의 짝 서열 정렬.

도 2. DROT cDNA 및 pcDNA3.1D/V5-His의 겔 정제된 제한효소 절단 단편

도 3. AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/Xigris 의 추정 클론의 제한효소 절단 분석

도 4. pcDNA3.1-DROT cDNA 를 내부적으로 절단하는 효소를 사용하는, AVCIPpcDNA3.1D/VS-His/Xigris 클론의 제한효소 절단 분석.

도 5. 시그리스 유전자의 확립된 서열과 드 노보 합성된 pcDNA3.1-DROT (syntheticXigris)의 서열 정렬.

도 6. 시그리스-Opt 유전자의 확립된 서열과 드 노보 합성된 pcDNA3.1-DROT-Opt (Synthetic_Xigris-Opt)의 서열 정렬.

도 7. 시그리스 유전자의 확립된 서열과 pcDNA3.1DROT-/V5-His/Xigris 클론 #4의 서열 정렬.

도 8. 구축물 맵: pcDNA3.1-DROT-D/V5-His/Xigris

서열 목록:

서열번호 1: 활성화된 단백질 C의 뉴클레오티드 서열

서열번호 2: 활성화된 단백질 C의 코돈 최적화된 서열

발명의 개요:

목적 유전자의 발현을 허용하는 목적 유전자와 연관된 제어 성분을 포함하는 DNA 구축이 개시된다. 본 발명의 또 다른 측면은, 포유류 세포에서의 발현을 허용하기 위한, 드 노보 합성된 핵산의 코돈 최적화이다. 상기 코돈-최적화된 서열은 발현에 적절한 포유류 세포주 내로 형질전환된다.

발명의 상세한 설명:

실시예 1:

재조합 인간 단백질 C (활성화된)의 발현을 위한 포유류 발현 벡터의 설계는 4 개의 N-연결된 글리코실화 자리를 수용하도록 변형되었으며, 시판되는 벡터들 (예: 각각, Invitrogen 또는 Biosciences 으로부터의 pcDNA 또는 pIRES) 중의 하나를 기재로 하고, 하기 특징들을 포함하도록 변형될 수 있다:

(a) 천연 신호 펩티드를 포함하는 인간 단백질 C cDNA의 삽입을 위한 다중 클로닝 자리.

(b) 발현 벡터의 설계는 또한 형광 보조 세포 분류를 이용하여 높게 발현되는 형질감염체의 신속한 스크리닝을 허용할 수 있는 녹색 형광 단백질의 독립적인 (bi-cistronic) IRES-매개 동시 발현을 고려할 수 있다.

융합 구축물의 합성:

드 노보 시도:

rhAPC cDNA-구축물의 코딩 영역의 합성 면에서, 드 노보 시도는 사용된 특정 포유류 세포에 대하여 보다 더 나은 코돈 최적화를 가능하도록 수행되어 왔다. 합성 cDNA 구축물의 설계는 다음과 같은 특징도 포함한다:

o 효율적인 번역을 보장하기 위한 코작 공통서열 (Kozak consensus sequence) (GCCACC)에 이은 개시 코돈 (ATG)

o 원하는 발현 벡터 내로의 클로닝을 위한 cDNA의 5' 및 3' 말단에서의 적절한 제한 자리.

인간 활성화된 단백질 C의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 1에 나타내었다. rhAPC 의 코딩 DNA 서열 중의 코돈은, CHO K1 및 HEK 293과 같은 포유류 세포주에서 최적의 재조합 단백질 발현을 보장하기 위한 코돈-최적화 과정의 부분으로서 변경되었다. 상기 핵산의 코돈 최적화된 서열을 서열번호 2에 나타내었다. 핵산 서열의 최적화된 서열을 서열번호 2 에 나타내었다.

드로트레코긴 알파 또는 시그리스를 암호화하는 DNA 뉴클레오티드 서열의 비-최적화 및 코돈-최적화된 형태의 코돈 최적화 후 짝 서열 정렬을 도 1 에 나타내었다.

실시예 2:

드로트레코긴 알파 ( DROT ) cDNA 의 PCDNA3 .1D/ V5 - HIS 포유류 세포-특이적 발현 벡터 내로의 서브클로닝

상기 나타낸 것과 같은, 자동화 DNA 서열결정에 의해 드 노보 합성된 cDNA 분자 (DROT 및 DROT-Opt)의 진정성 (authenticity)의 확인에 이어, DROT 를 포유류 세포-특이적 발현 벡터 pcDNA3.1D/V5-His 내로 서브클로닝하여 형질감염 준비된 구축물을 생성하였다. 사용된 과정의 상세한 내용은 아래에 설명된다:

A. 시약 및 효소:

1. QIAGEN 겔 추출 키트 및 PCR 정제 키트

2. pcDNA3.1D/V5-His 벡터 DNA (Invitrogen)

효소	U/μl	10x 버퍼
1. HindIII 2. XhoI 3. T4 DNA 리가아제	10 10 40	버퍼 E 버퍼 E 리가아제 버퍼

B. 벡터 및 인서트의 제한효소 절단:

● 과정

하기 DNA 샘플 및 제한 효소를 사용하였다:

DNA 샘플	제한 효소
Rxn #1 벡터 (시그리스 클로닝용) Rxn #2 pBSK/시그리스 (#13)	HindIII/XhoI HindIII/XhoI

● 제한 효소 절단 반응:

성분	최종 농도	Rxn#1	Rxn#2
물 10x 버퍼 DNA HindIII XhoI 10x BSA 최종 부피	- 1x - 0.5U 0.5U 1x 20μl	4μl 2μl 10μl 1μl 1μl 2μl 20μl	4μl 2μl 10μl 1μl 1μl 2μl 20μl

반응물을 혼합하고, 스핀 다운시키고 (spun down), 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 제한효소 절단을, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 예측된 절단 패턴이 나타났다. 약 1400 bp 의 유전자 단편의 탈락 (Rxn #2의 경우) 및 벡터의 경우 (Rxn #1) 약 5.5kb의 벡터 주쇄 단편이 나타났다. DROT 의 약 1400 bp 인서트 및 약 5.5 kb의 절단된 벡터 pcDNA3.1D/V5-His 단편을, QIAGEN 겔 추출 키트를 사용하는 겔 추출에 의해 정제하였다. 정제된 인서트 및 벡터 단편 1 μl 를 1% 아가로오스 겔 상에서 확인하였다.

DROT cDNA 및 pcDNA3.1D/V5-His의 겔 정제된 제한효소 절단된 단편을 도 2 에 나타내었다.

실시예 3

C. DROTcDNA 와 pcDNA3 .1D/ V5 - His 주쇄의 라이게이션 :

상기 절단 및 정제된 벡터 및 인서트 단편의 DNA 농도를 계산하고 (상기 도 7 참조), 라이게이션을 하기 방법으로 설정하였다:

성분	최종 농도	Rxn #1	Rxn # 2
물 10x Rxn 버퍼 벡터 인서트 T4 DNA 리가아제 최종 부피	- 1x ~50ng ~38ng 40U 20μl	15μl 2μl 2μl - 1μl 20μl	7μl 2μl 2μl 8μl 1μl 20μl

반응물을 부드럽게 혼합하고, 스핀다운시키고 상온에서 2-3 시간 동안 인큐베이션하였다. DH1O 컴피턴트 세포를 상기 라이게이션 반응물로 형질전환시켰다.

암피실린을 함유하는 L.B. 한천 플레이트 상에서 수득된 콜로니를 스크리닝하고 분리된 플라스미드 DNA의 제한효소 절단 분석에 의해 확인하였다.

실시예 4:

D. pcDNA3 .1 DROT -/ V5 - His / Xigris 의 추정 클론의 제한효소 절단 분석

암피실린을 함유하는 L.B 한천 플레이트 상에서 수득된 콜로니들로부터, 플라스미드 DNA를 개별적으로 정제하고, 원하는 cDNA 인서트의 존재를 분리된 플라스미드 DNA의 제한효소 절단 분석에 의해 확인하였다. AVC1PpcDNA3,1D/v5-His/Xigris의 추정적인 클론의 제한효소 절단 분석을 도에 나타내었다.

pcDNA3.1-DROT-D/V5-His/Xigris를 함유하는 몇몇 추정적인 클론의 제한효소 절단 후 수득된 결과에 따르면, 원하는 제한 패턴을 나타낸 클론들 중 일부를, AVCIP-시그리스 cDNA를 내부적으로 절단하여 하기 도 9 에 나타낸 것과 같은 다양한 크기의 단편을 생성하는 제한 효소를 사용하는 추가의 제한효소 절단 분석을 위해 선발하였다.

pcDNA3.1-DROT cDNA를 내부적으로 절단하는 효소를 사용하는 AVCiPpcDNA3, iD/V5-His/Xigris 클론의 제한효소 절단 분석.

제한 맵핑 분석을 위해 선발된 pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris 클론의 대부분은, 알려진 내부 제한 자리의 존재에 근거하여 예측된 단편 크기를 산출하였으며, 따라서 이들 클론을 DNA 서열결정 분석에 의해 더욱 확인하였다.

실시예 5:

드 노보 합성된 cDNA 분자의 진정성의 확인

상용 서비스 공급자에 의해 제공된 바에 따라, 드 노보 합성된 cDNA 분자의 진정성의 확인을, 자동화된 DNA 서열결정에 의해 수행하였다.

E. DNA 서열결정에 의한 pcDNA3 .1- DROT D/ V5 - His / Xigris 의 선발된 클론의 확인

제한 맵핑 분석의 결과로서 선발된 pcDNA3 .1- DROT D/ V5 - His / Xigris 클론을, 자동화 DNA 서열결정에 의해 추가적으로 확인하였다.

명명	프라이머의 설명	서열
T7 서열결정 프라이머	Invitrogen 키트 프라이머	5'TAATACGACTCACTATAGGG3'

pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris 클론은 주형 서열과 동일성을 나타내었다.

DROT의 맵은 도 8. 드 노보 합성된 pcDNA3.1-을 이용하여 만들어진 재조합 발현 구축물에 그림으로 나타내었다.

실시예 6

rhAPC 융합 구축물의 유지 및 증식:

rhAPC 를 암호화하는 cDNA 구축물의 유지 및 증식을 Top 10 (Invitrogen)과 같은 표준 세균 세포주에서 수행하였다.

실시예 7

5. HEK293 세포에서의 일시적인/ 안정한 재조합 단백질 발현 및 상층액의 제조:

a) rhAPC 구축물의 일시적인/ 안정한 발현을, 인간 배아 신장 세포 (HEK293)를 사용하여 수행하고, FDA 가 산업적 적용에 대해 허용한 주요한 포유류 세포주인 전단된(sheared) 인간 아데노바이러스 타입 5 (AD 5) DNA에 의해 형질전환하였다. 일시적 발현은 구축물의 발현의 확인 및 소량의 재조합 단백질의 신속한 수득에 유용하다.

b) 선택적으로, 높은 발현을 나타낸 세포의 거대 군집의 선발을, 개별적인 클론을 수득할 필요없이 신속하게 허용한 프로토콜. 이어서, 원하는 rhAPC 단백질의 안정하고 높은 발현을 나타낸 HEK293 세포를 표준 절차를 사용하여 개발하였다.

혈청-함유 배지에 반하여, 화학적으로 규정된 배양 배지 (Sigma Aldrich)을 사용하는 향상된 배양 기술을, 전체 과정 동안 FDA 요구사항을 준수하여, 이용하였다.

실시예 8.

정제 과정의 최적화:

전술한 추천된 기능적/결합 분석에 따른 재현성 있는 생활성의 확립에 이어, 수율을 최대화하기 위하여 정제 과정을 최적화하기 위해 노력할 것이다.

따라서, 정제 과정은 하기 일련의 다운스트림 과정을 포함할 수 있다:

a. 정상 및 접선 흐름 여과 절차를 이용한 초기 정화 및 농축

b. 한외 여과/투석 여과 (접선 흐름 여과에 기초)

c. 크로모(chromo) 단계 - I: 활성화된 단백질 C 의 중쇄 상에서 활성화 자리에 대한 모노클로날 항체 또는 인간 단백질 C 의 경쇄의 감마 카르복시 글루탐산 도메인에 대한 칼슘 의존 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피.

d. 크로모 단계 - II: EMD 프락토겔을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피

e. 크로모 단계 - III: DNA 및 숙주 세포 단백질 제거용 셀루파인 설페이트와 같은 플로 쓰루(flow through) 기재 음이온 교환기.

f. 바이러스 제거 및 멸균 여과

g. 내독소 제거

h. 제형화

SEQUENCE LISTING <110> Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd Gengraine Technologies Pvt.Ltd, Avestha Morawala Patell, Villoo <120> A process for production of recombinant activated human protein C for treatment of sepsis <130> 22-05-06 <150> 626/CHE/2005 <151> 2005-05-24 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1374 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1374) <400> 1 atg tgg cag ctc aca agc ctc ctg ctg ttc gtg gcc acc tgg gga att 48 Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile 1 5 10 15 tcc ggc aca cca gct cct ctt gac tca gtg ttc tcc agc agc gag cgt 96 Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg 20 25 30 gcc cac cag gtg ctg cgg atc cgc aaa cgt gcc aac tcc ttc ctg gag 144 Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu 35 40 45 gag ctc cgt cac agc agc ctg gag cgg gag tgc ata gag gag atc tgt 192 Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys 50 55 60 gac ttc gag gag gcc aag gaa att ttc caa 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Val Leu Pro 85 90 95 Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile 100 105 110 Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly 115 120 125 Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn 130 135 140 Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys 145 150 155 160 Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His 165 170 175 Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys 180 185 190 Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Leu 195 200 205 Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val 210 215 220 Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His 225 230 235 240 Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys 245 250 255 Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp 260 265 270 Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser 275 280 285 Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro 290 295 300 Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly 305 310 315 320 Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr 325 330 335 Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg 340 345 350 Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu 355 360 365 Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala 370 375 380 Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly 385 390 395 400 Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val 405 410 415 Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr 420 425 430 Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys 435 440 445 Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro 450 455 <210> 3 <211> 457 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(457) <400> 3 Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile 1 5 10 15 Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg 20 25 30 Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu 35 40 45 Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys 50 55 60 Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu 65 70 75 80 Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro 85 90 95 Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile 100 105 110 Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly 115 120 125 Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn 130 135 140 Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys 145 150 155 160 Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His 165 170 175 Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys 180 185 190 Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Leu 195 200 205 Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val 210 215 220 Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His 225 230 235 240 Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys 245 250 255 Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp 260 265 270 Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser 275 280 285 Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro 290 295 300 Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly 305 310 315 320 Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr 325 330 335 Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg 340 345 350 Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu 355 360 365 Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala 370 375 380 Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly 385 390 395 400 Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val 405 410 415 Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr 420 425 430 Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys 435 440 445 Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro 450 455 <210> 4 <211> 1374 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1374) <400> 4 atg tgg cag ctg aca tcc ctg ctg ctg ttc gtg gct acg tgg ggc atc 48 Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile 1 5 10 15 tcg ggc acc cct gcc ccg ctg gac agc gtg ttc tcc tcc agt gag cgt 96 Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg 20 25 30 gcc cac cag gtc ctg cgg atc cgc aag cgg gcg aat tcc ttt ctc gaa 144 Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu 35 40 45 gag ctc cga cac tcg tca ctc gag cgg gag tgt atc gag gag atc tgc 192 Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys 50 55 60 gac ttc gaa gag gct aag gaa atc ttc cag aac gtg gat gac acc ctg 240 Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu 65 70 75 80 gcg ttc tgg agc aag cac gtc gac ggc gac cag tgt ctg gtg ctc cct 288 Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro 85 90 95 cta gag cac ccc tgt gcc tca ctc tgc tgc ggc cac ggt aca tgc atc 336 Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile 100 105 110 gat ggc atc ggc tcg ttc tcc tgc gat tgc agg tca ggc tgg gag ggg 384 Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly 115 120 125 aga ttc tgc cag cgt gag gtg tcg ttc ctg aac tgt tcc ctg gac aat 432 Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn 130 135 140 ggc ggg tgt acc cac tac tgc ctc gag gaa gtg ggc tgg aga cgc tgt 480 Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys 145 150 155 160 tcc tgc gcc ccc ggc tac aag ctg ggc gat gac ctg ctc cag tgc cac 528 Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His 165 170 175 cca gca gtt aag ttt ccc tgt ggc cgc cct tgg aag aga atg gag aag 576 Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys 180 185 190 aag cgc tcg cac ctc aag agg ccg cgc ccc tcc cgc aaa cgc cgc ctc 624 Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Leu 195 200 205 atc gac ggc aag atg acc cgg cgc ggc gac tcc cct tgg cag gtg gtc 672 Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val 210 215 220 ctg ctg gac tcc aag aag aag ctg gcc tgc gga gcc gtg ctg atc cac 720 Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His 225 230 235 240 ccc tcc tgg gtc ctg aca gcc gcc cac tgc atg gac gag tcg aag aag 768 Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys 245 250 255 ctc cta gtt agg ctg ggt gag tac gac ctc cgc cgt tgg gag aag tgg 816 Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp 260 265 270 gag ctc gac ctg gat att aag gag gtc ttc gtg cac cct aac tac agt 864 Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser 275 280 285 aag tcg acc aca gac aac gat ata gcg ctt ctc cat ttg gcc cag cca 912 Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro 290 295 300 gct acc ctg tcc cag acc atc gtg cca atc tgc ctc ccc gac tcg ggc 960 Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly 305 310 315 320 ctg gct gag agg gag ctc aac cag gcc ggg cag gag acc ctg gtc acc 1008 Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr 325 330 335 ggg tgg ggc tac cac tcc tcc cgg gag aag gaa gct aag agg aac cgc 1056 Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg 340 345 350 acc ttt gtg ctg aat ttc atc aag att cct gtc gtg cct cac aac gag 1104 Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu 355 360 365 tgt tcg gaa gtg atg tca aac atg gtc tcc gag aat atg ctc tgc gcc 1152 Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala 370 375 380 ggc att ctg ggg gac cgc cag gat gct tgc gag ggg gat tcc ggg ggt 1200 Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly 385 390 395 400 ccc atg gtc gcc tct ttc cac ggc acc tgg ttc tta gtg gga ctg gtg 1248 Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val 405 410 415 tcc tgg ggc gaa ggc tgc ggg ctg ctc cac aac tac ggc gtg tac acc 1296 Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr 420 425 430 aag gtt tca cgc tac ctg gat tgg atc cat gga cac atc cgc gac aaa 1344 Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys 435 440 445 gag gct ccc cag aag tcc tgg gcc ccc tag 1374 Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro 450 455 <210> 5 <211> 457 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile 1 5 10 15 Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg 20 25 30 Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu 35 40 45 Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys 50 55 60 Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu 65 70 75 80 Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro 85 90 95 Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile 100 105 110 Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly 115 120 125 Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn 130 135 140 Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys 145 150 155 160 Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His 165 170 175 Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys 180 185 190 Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Leu 195 200 205 Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val 210 215 220 Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His 225 230 235 240 Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys 245 250 255 Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp 260 265 270 Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser 275 280 285 Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro 290 295 300 Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly 305 310 315 320 Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr 325 330 335 Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg 340 345 350 Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu 355 360 365 Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala 370 375 380 Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly 385 390 395 400 Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val 405 410 415 Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr 420 425 430 Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys 435 440 445 Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro 450 455

Claims

서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질을 암호화하는 합성 DNA 서열로 숙주 세포를 형질전환하고, 상기 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 생성물을 분리하는 단계를 포함하는, 생체 내 생물학적으로 활성인 활성화된 인간 단백질 C 생성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 활성화된 인간 단백질 C를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열이 서열번호 3에 표시된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 바람직하게는 균주 HEK293 으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
도 8의 벡터 구축물로 숙주 세포를 형질전환하고, 숙주 세포 또는 그의 성장 배지로부터 생성물을 분리하는 단계를 포함하는 생체 내 생물학적으로 활성인 인간 재조합 활성화된 단백질 C 생성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 포유류 세포 특이적인 발현 벡터이고, 가장 바람직하게는 도 8에 나타낸 것과 같은 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.