CN101228269A - 用于生产治疗脓毒症的重组人活化蛋白c的、包含密码子优化的方法 - Google Patents

用于生产治疗脓毒症的重组人活化蛋白c的、包含密码子优化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生产活化蛋白C的重组方法。本发明涉及构建、转化、表达、纯化和生产重组人活化蛋白C的方法。包含与目的基因结合的控制元件的DNA构建体已经被公开。目的核酸序列已经密码子优化以允许在适宜的哺乳动物宿主细胞中表达。

Description

用于生产治疗脓毒症的重组人活化蛋白C的、包含密码子优化的方法
发明领域
本发明涉及一种生产活化蛋白C的重组方法。本发明涉及构建、转化、表达、纯化和生产重组人活化蛋白C的方法。包含与目的基因结合的控制元件的DNA构建体已经被公开。该目的核酸序列已经密码子优化以允许在适宜的哺乳动物宿主细胞中表达。
发明背景
Xigris(Drotrecogin alfa)是重组形式的人活化蛋白C。其是与源自人血浆的活化蛋白C具有相同氨基酸序列的丝氨酸蛋白酶。活化蛋白C是对感染进行全身应答的重要调节物并具有抗血栓、前纤维蛋白溶解(profibrinolytic)和抗炎症的特性。Drotrecogin alfa(活化的)是分子量大约55 KD的糖蛋白。蛋白C的前体形式含有前导肽(成熟蛋白中没有)、9个Gla残基的γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域、短螺旋疏水氨基酸堆叠、两个表皮生长因子(EGF)样结构域、轻链和重链之间的连接肽、激活肽，以及胰蛋白酶样SP结构域，其中催化三元体位于His-211，Asp-257和Ser-360。EGF-结构域的主要功能是提供蛋白-蛋白或者蛋白-细胞的相互作用。存在于EGF模体中的残基也表现出与不同激活剂和底物功能性地相互作用。另外，连接螺旋具有参与协调钙离子结合到EGF-I结构域的残基，该结构域被预测起到神经保护的作用。
翻译后修饰去掉了二肽Lys-156-Arg-157，因此该单链形式转变成由二硫键连接的双链分子。80％的酶原PC是这种形式。此外，氨基末端Gla结构域中谷氨酸残基的羧化，EGF-I结构域中Asp残基的羟化和糖基化是其它的翻译后事件。尽管在糖基化结构中存在一些不同，但RhAPC和源自人血浆的APC具有相同的糖基化位点。人APC具有四个天冬酰胺连接的N-糖基化位点。其唾液酸比其它血浆蛋白高5倍。
人APC具有四个天冬酰胺连接的N-糖基化位点。其岩藻糖比其它血浆蛋白高5倍，唾液酸高2倍。活化蛋白C通过抑制因子Va和VIIIa发挥作用。体外数据显示活化蛋白C通过其抑制纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)和限制活化的凝血酶激活的纤溶抑制物生成的能力而具有间接前纤维蛋白溶解活性。另外，体外数据显示了活化蛋白C可以通过抑制单核细胞产生人肿瘤坏死因子、阻断白细胞黏附到选择素、和将凝血酶-诱导的炎性应答限制在微血管内皮中而发挥抗炎症作用。
已经描述过一些在高等真核系统中表达重组蛋白的方法。CHO-K1，HEK293(和变种)细胞表达系统如今将其本身建立为哺乳动物蛋白表达所选择的主要系统。概述的方法适于将新合成的编码重组人Drotrecogin alfa的核酸序列转染到适宜的哺乳动物宿主中用于表达。
下面概述的方法适于生产具有生物活性的、重组可溶的重组活化人蛋白C。现有方法利用已建立的具有无活性人蛋白C酶原的互补DNA的人类细胞系，其分泌蛋白到发酵培养基。通过用α-凝血酶，胰蛋白酶，鲁氏喹蛇毒素因子X激活剂或者凝血酶和血栓调节蛋白的混合物裂解人蛋白C，使其被酶促活化而获得活化蛋白C，随后被纯化。然而，这些活化方法包括污染的风险，并且生产成本更高。本研究旨在通过掺入细胞相关的蛋白酶而直接从重组细胞中生产活化蛋白C。
这些蛋白酶可以位于细胞质或细胞器中或者位于细胞膜上，其可以在分泌期间或者分泌后立即裂解蛋白。因此，该策略已经被用于在从真核宿主细胞，即HEK293中分泌后直接生产重组活化蛋白C。
该重组的酶将被指明用于降低具有高死亡风险的严重脓毒症(即，与急性器官衰竭相关的脓毒症)成人患者的死亡率。
附图说明
图1是编码Drotrecogin alfa或Xigris的非优化型和密码子优化型DNA核苷酸序列的双序列比对。
图2是DROT cDNA和pcDNA3.1D/V5-His经凝胶纯化的限制性酶切片段。
图3是AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/Xigris假定克隆的限制性酶切分析。
图4是使用内切pcDNA3.1-DROT cDNA的酶对AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/Xigris克隆的限制性酶切分析。
图5是从头合成的pcDNA3.1-DROT(合成的Vigris)和Xigris基因已经确认的序列间的序列比对。
图6是从头合成的pcDNA3.1-DROT-Opt(合成的_Xigris-Opt)与Xigris-Opt基因已经确认的序列间的序列比对。
图7是pcDNA3.1DROT-/V5-His/Xigris cDNA的克隆#4和Xigris基因已经确认的序列间的序列比对。
图8是结构图：pcDNA3.1-DROT-D/V5-His/Xigris。
序列表
SEQ ID NO 1：活化蛋白C的核苷酸序列；
SEQ ID NO 2：活化蛋白C的经密码子优化的序列。
发明内容
本发明公开了包括与目的基因结合的控制元件的DNA构建体，其允许目的基因的表达。本发明的再一方面在于对从头合成的核酸进行密码子优化以允许其在哺乳动物细胞中表达。该密码子优化的序列被转化到适宜的哺乳动物细胞系中用于表达。
发明详细说明
实施例1
用于表达重组人蛋白C(活化的)的哺乳动物表达载体的设计已经被改良以提供4个N-连接的糖基化位点，其基于一种市售可得的载体(例如：分别来自Invitrogen或BD Biosciences的pcDNA或pIRES)，其被改良为包括下述特征：
(a)多克隆位点，用于插入包括其天然信号肽的人蛋白C的cDNA。
(b)表达载体的设计还提供了独立的(双顺反子)IRES介导的绿色荧光蛋白的共表达，其使得能使用荧光辅助细胞分选来快速筛选高效表达的转染子。
融合构建体的合成：
从头方法：
就合成rhAPC cDNA-构建体的编码区而言，进行一种从头方法以使得针对要使用的特定哺乳动物细胞而进行更好的密码子优化。合成的cDNA构建体的设计也包括例如以下特征：
○一段Kozak共有序列(GCCACC)，其后是起始密码子(ATG)以保证有效翻译；
○在cDNA的5’和3’端适宜的限制性位点以克隆到目的表达载体中。
人活化蛋白C的核苷酸序列已经由SEQ ID：1所表示。在rhAPC的编码DNA序列中的密码子，其已经作为密码子优化过程的一部分被改变以保证在诸如CHO K1和HEK 293的哺乳动物细胞系中最佳的重组蛋白表达。核酸经过密码子优化的序列已经由SEQ ID NO：2所描述。
核酸序列的优化序列已经由SEQ ID：2所表示。
图1描述了编码Drotrecogin alfa或Xigris的非优化型和密码子优化型的DNA核苷酸序列的密码子优化后的双序列比对。
实施例2
Drotreco gin alfa(DROT)cDNA在PCDNA3.1D/V5-HIS哺乳动物细胞特异的表达载体中的亚克隆。
利用自动DNA测序确认如上所示的从头合成的cDNA分子(DROT和DROT-Opt)的真实性之后，将DROT亚克隆到哺乳细胞特异的表达载体pcDNA3.1D/V5-His中，以产生转染用(transfection-ready)的构建体。下面给出具体步骤：
A、试剂和酶：
1、QIAGEN凝胶提取试剂盒和PCR纯化试剂盒。
2、pcDNA 3.1D/V5-His载体DNA(Invitrogen)。
酶                 U/μl    10x缓冲液
1、HindIII         10       缓冲液E
2、XhoI            10       缓冲液E
3、T4 DNA连接酶    40       连接酶缓冲液
B、载体和插入片段的限制性酶切：
方法：
使用下述DNA样品和限制酶：
DNA样品                     限制酶
Rxn#1 载体(用于Xigris克隆)  HindIII/XhoI
Rxn#2 pBSK/Xigris(#13)      HindIII/XhoI
限制性酶切反应：
组分          终浓度         Rxn#1      Rxn#2
水            -              4μl       4μl
10x缓冲液     1x             2μl       2μl
DNA           -              10μl      10μl
HindIII       0.5U           1μl       1μl
XhoI          0.5U           1μl       1μl
10xBSA        1x             2μl       2μl
终体积        20μl          20μl      20μl
混合反应物，颠倒并在37℃孵育2小时。通过琼脂糖凝胶电泳分析限制性酶切。观察到所期望的酶切类型。观察到被切下来的约1400bp的基因片段(对于Rxn#2)和载体(Rxn#1)约5.5kb的载体骨架片段。使用QIAGEN凝胶提取试剂盒，通过凝胶提取纯化约1400bp的DROT插入片段和约5.5kb被酶切的载体pcDNA3.1D/V5-His片段。在1％琼脂糖凝胶上检测1μl纯化的插入片段和载体片段。
图2表示了DROT cDNA和pcDNA3，1D/V5-His的经凝胶纯化的限制性酶切片段。
实施例3
C、pcDNA3.1D/V5-His骨架和DROT cDNA的连接：
预测了被酶切且纯化的载体和插入片段的DNA浓度(参考上述图7)和以下述方式建立连接：
组分             终浓度       Rxn#1(载体)     Rxn#2(载体+插入片段)
水               -            15μl           7μl
10xRxn缓冲液     1x           2μl            2μl
载体             ～50ng       2μl            2μl
插入片段         ～38ng       -               8μl
T4 DNA连接酶     40U          1μl            1μl
终体积           20μl        20μl           20μl
轻轻混合反应物，颠倒并在室温孵育2～3小时。将连接反应物转化DH10感受态细胞。
对在含有氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上所获得的菌落进行筛选并通过对所分离的质粒DNA的限制性酶切分析进行确认。
实施例4
D、pcDNA3.1DROT-/V5-His/Xigris假定克隆的限制性酶切分析：
从在含有氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上获得的菌落分别纯化质粒DNA并通过对所分离的质粒DNA的限制性酶切分析确认目的cDNA插入片段的存在。在图中表示了AVC1PpcDNA3，iD/v5-His/Xigris假定克隆的限制性酶切分析。
根据若干含有pcDNA3.1-DROT-D/V5-His/Xigris的假定克隆的限制性酶切后获得的结果，一些显示出目的限制性模式的克隆被选择用于进一步限制性酶切分析，其使用在内部裂解AVCIP-Xigris cDNA的限制酶以产生如下图9所示的不同大小的片段。
使用在内部裂解pcDNA3.1-DROT cDNA的酶对AVCiPpcDNA3，iD/V5-His/Xigris克隆进行限制性酶切分析。
基于已知的内部酶切位点的存在，大多数被选择用于限制性图谱分析的pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris克隆产生了所期望的片段大小，因此这些克隆进一步被DNA测序分析所确认。
实施例5
确认从头合成的cDNA分子的真实性。
利用DNA自动测序对由商业服务提供商所提供的从头合成的cDNA分子的真实性进行确认。
E、通过DNA测序确认已选择的pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris克隆：
通过DNA自动测序进一步确认作为限制性图谱分析的结果所选择的pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris克隆。
名称 引物说明 序列
T7测序引物 Invitrogen试剂盒引物 5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’
pcDNA3.1-DROT D/V5-His/Xigris克隆显示出与模板序列相同。
在图8中图示了DROT的图谱，其使用从头合成的pcDNA3.1-产生重组表达构建体。
实施例6
rhAPC融合构建体的保存和增殖：
编码rhAPC的cDNA构建体的保存和增殖在诸如Top10(Invitrogen)的标准细菌细胞系中进行。
实施例7
5、在HEK293细胞中瞬时/稳定的重组蛋白表达和上清液的产生：
a)使用人胚肾细胞(HEK293)进行rhAPC构建体的瞬时/稳定表达，其被剪切过的人腺病毒5(AD5)DNA所转化，是FDA批准进行工业应用的主要的哺乳动物细胞系。瞬时表达可用于检测构建体的表达和快速获得小量的重组蛋白。
b)或者，一种方法，其允许选择表现出快速地高效表达的大量细胞而不需要获得单个克隆。随后，使用标准方法产生表现出稳定且高效表达目的rhAPC蛋白的HEK293细胞。
按照FDA要求，在整个过程中使用的改良培养技术，其利用化学上明确的培养基(Sigma Aldrich)而不是含血清培养基。
实施例8
纯化过程的优化：
在根据以上提及的推荐的功能/结合分析法确认了可再现生物活性后，将努力优化纯化过程以使产率最大化。
因此，所述纯化方法包括下述下游系列(train)：
a、使用常规过滤和切向流过滤方法开始净化和浓缩；
b、超滤/透析过滤(基于切向流过滤)；
c、色谱(Chromo)步骤-I：使用针对活化蛋白C重链上活化位点的单克隆抗体或针对人蛋白C轻链的γ羧基谷氨酸结构域的钙依赖型抗体进行亲和色谱；
d、色谱步骤-II：使用EMD fractogel进行阴离子交换色谱；
e、色谱步骤-III：流经诸如cellufine sulfate的碱性阴离子交换剂以除去DNA和宿主蛋白；
f、除去病毒和无菌过滤；
g、除去内毒素；
h、制剂。
<110>Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd
Gengraine Technologies Pvt.Ltd，Avestha
Morawala Patell，Villoo
<120>用于生产治疗脓毒症的重组人活化蛋白C的、包含密码子优化的方法
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<151>2005-05-24
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<211>1374
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1374)
<400>1
atg tgg cag ctc aca agc ctc ctg ctg ttc gtg gcc acc tgg gga att   48
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1                5                    10                   15
tcc ggc aca cca gct cct ctt gac tca gtg ttc tcc agc agc gag cgt     96
Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg
             20                   25                  30
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gac ggc atc ggc agc ttc agc tgc gac tgc cgc agc ggc tgg gag ggc    384
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Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His
                 165                  170                 175
ccc gca gtg aag ttc cct tgt ggg agg ccc tgg aag cgg atg gag aag    576
Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys
             180                  185                 190
aag cgc agt cac ctg aaa cga cct cga ccg tcc cgg aaa cgc agg ctc    624
Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Leu
        195                  200                  205
att gat ggg aag atg acc agg cgg gga gac agc ccc tgg cag gtg gtc    672
Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val
    210                  215                  220
ctg ctg gac tca aag aag aag ctg gcc tgc ggg gca gtg ctc atc cac    720
Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His
225                  230                  235                  240
ccc tcc tgg gtg ctg aca gcg gcc cac tgc atg gat gag tcc aag aag    768
Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys
                 245                  250                 255
ctc ctt gtc agg ctt gga gag tat gac ctg cgg cgc tgg gag aag tgg    816
Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp
            260                  265                  270
gag ctg gac ctg gac atc aag gag gtc ttc gtc cac ccc aac tac agc     864
Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser
        275                  280                  285
aag agc acc acc gac aat gac atc gca ctg ctg cac ctg gcc cag ccc     912
Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro
    290                  295                  300
gcc acc ctc tcg cag acc ata gtg ccc atc tgc ctc ccg gac agc ggc     960
Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly
305                  310                 315                   320
ctt gca gag cgc gag ctc aat cag gcc ggc cag gag acc ctc gtg acg    1008
Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr
                 325                 330                  335
ggc tgg ggc tac cac agc agc cga gag aag gag gcc aag aga aac cgc    1056
Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg
             340                 345                  350
acc ttc gtc ctc aac ttc atc aag att ccc gtg gtc ccg cac aat gag    1104
Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu
        355                  360                  365
tgc agc gag gtc atg agc aac atg gtg tct gag aac atg ctg tgt gcg    1152
Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala
    370                  375                  380
ggc atc ctc ggg gac cgg cag gat gcc tgc gag ggc gac agt ggg ggg    1200
Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly
385                  390                  395                  400
ccc atg gtc gcc tcc ttc cac ggc acc tgg ttc ctg gtg ggc ctg gtg    1248
Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val
                 405                  410                 415
agc tgg ggt gag ggc tgt ggg ctc ctt cac aac tac ggc gtt tac acc    1296
Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr
            420                   425                 430
aaa gtc agc cgc tac ctc gac tgg atc cat ggg cac atc aga gac aag    1344
Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys
        435                  440                  445
gaa gcc ccc cag aag agc tgg gca cct tag                            1374
Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro
    450                  455
<210>2
<211>457
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile
1                5                    10                   15
Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg
             20                  25                    30
Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu
        35                   40                    45
Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys
    50                   55                   60
Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu
65                   70                   75                   80
Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro
                 85           90                           95
Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile
             100                 105                  110
Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly
        115                  120                  125
Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn
    130                  135                  140
Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys
145                  150                  155                  160
Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His
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Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys
            180                  185                  190
Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Leu
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Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val
    210                  215                  220
Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His
225                  230                  235                  240
Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys
                 245                  250                 255
Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp
             260                  265                 270
Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser
        275                  280                  285
Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro
    290                  295                  300
Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly
305                  310                  315                  320
Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr
                 325                 330                   335
Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg
             340                 345                  350
Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu
        355                  360                  365
Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala
    370                  375                   380
Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly
385                  390                  395                 400
Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val
                 405                  410                 415
Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr
             420                 425                  430
Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys
        435                  440                  445
Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro
    450                  455
<210>3
<211>457
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>肽
<222>(1)..(457)
<400>3
Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile
1                5                    10                   15
Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg
             20                  25                    30
Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu
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Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys
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Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu
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Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro
                 85                   90                   95
Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile
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Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly
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Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys
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Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys
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Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Leu
        195                  200                  205
Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val
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Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His
225                  230                  235                 240
Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys
                 245                  250                 255
Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp
            260                  265                  270
Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser
        275                  280                  285
Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro
    290                  295                  300
Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly
305                  310                  315                  320
Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr
                 325                 330                  335
Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg
            340                  345                  350
Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu
        355                  360                  365
Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala
    370                  375                  380
Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly
385                  390                  395                  400
ccc atg gtc gcc tct ttc cac ggc acc tgg ttc tta gtg gga ctg gtg    1248
Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val
                 405                  410                 415
tcc tgg ggc gaa ggc tgc ggg ctg ctc cac aac tac ggc gtg tac acc    1296
Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr
            420                  425                  430
aag gtt tca cgc tac ctg gat tgg atc cat gga cac atc cgc gac aaa    1344
Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys
        435                  440                  445
gag gct ccc cag aag tcc tgg gcc ccc tag                            1374
Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro
    450                  455

Claims (6)

1.一种制备具有体内生物活性的活化人蛋白C产物的方法，包括用编码SEQ ID：2核酸序列所编码的蛋白的合成DNA序列转化宿主细胞，和从所述宿主细胞或其生长培养基中分离所述产物的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述活化人蛋白C的经过密码子优化的核酸序列由SEQ ID：3表示。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞优选地选自细胞株HEK293。
5.一种制备具有体内生物活性的人重组活化蛋白C产物的方法，包括用FIG No：8的载体构建体转化宿主细胞，和从所述宿主细胞或其生长培养基中分离所述产物的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是哺乳动物细胞特异的表达载体，最优选如FIG NO：8所示的载体。
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