JP4511589B2 - 肝細胞成長因子のn末端フラグメントを精製するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、微生物宿主細胞におけるNK4をコードする核酸の発現、変性型のNK4を含む封入体の単離、封入体の可溶化、及びGSHとGSSGの存在下における変性したNK4の再生により、NK4を産生するための方法であって、リン酸バッファー溶液中でpH7〜9において可溶化及び再生を実施することを特徴とする方法を提供する。
ヒトHGFはジスルフィド結合したヘテロダイマーであり、R494とV495のアミノ酸間での切断により、463アミノ酸のα−サブユニットと234アミノ酸のβ−サブユニットに切断することができる。α鎖のN末端は、メチオニン基で始まる31アミノ酸により先行される。このセグメントは、31アミノ酸のシグナル配列を含む。α鎖はアミノ酸32で始まり、4つのクリングルドメインを含む。いわゆる「ヘアピンドメイン」は、アミノ酸70〜96から成る。クリングル1ドメインは、アミノ酸128〜206から成る。クリングル2ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸211〜288から成り、クリングル3ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸305〜383から成り、クリングル4ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸391〜469から成る。
配列番号1:NK4をコードするDNA
配列番号2:NK4のポリペプチド配列
NK4の組み換え体の発現
HGFのアミノ酸位置32〜478のNK4ドメインを、クローニング及び大腸菌における組み換え体の発現に用いた。DNAのソースとして用いた元のDNA配列については記載した(データベース識別子「gb:M73239」)。NK4をコードするDNA(配列番号:1)を増幅し、同時に変更するために、PCRを実施した。全ての方法を標準条件下で実施した。
− 真核生物のシグナルペプチド配列を除去し、NK4のアミノ酸位置32の隣にATG開始コドンを融合すること
− タンパク質産物(Metの含まれていない)の均質性を向上させるために、アミノ酸位置32をGlnからSerに置換すること
− E.コリにおける遺伝子発現を向上させるために、位置33(AGGからCGT)、35(AGAからCGT)、及び36(AGAからCGT)におけるアミノ酸のコドンのDNA配列を変更すること
− PCR産物のベクターへの挿入を容易にするために、位置477(ATAからATC)及び478(GTCからGTT)におけるコドンのDNA配列を変更すること
− NK4タンパク質ドメインの終点に対応する位置で翻訳を止めるために、位置479(TAA)及び480(TGA)に2つの翻訳終止コドンを導入すること。
最適化条件を用いた可溶化及び再生
6Mのグアニジン塩酸塩、pH8.5の0.1Mリン酸カリウム(10MのKOHを用いた滴定により)、1mMのEDTA、0.01mMのDTTを含むバッファーに、封入体を一晩溶解した。溶解したタンパク質の濃度を、ビウレット試験により決定し、最終的に室温で25mg 全タンパク質/mlの濃度に調節した。
バッファーA:pH8.0の50mMトリス
バッファーB:pH8.0の50mMトリス、2MのNaCl
5〜25% バッファーB、2カラム容積
25〜60% バッファーB、16カラム容積
60〜100% バッファーB、0.7カラム容積
100% バッファーB、2カラム容積
バッファーA:1Mの硫酸アンモニウム、pH8.0の50mMリン酸カリウム
バッファーB:pH8.0の50mMリン酸カリウム、40%のエチレングリコール
0〜100%のバッファーB、20カラム容量
リン酸カリウム及びトリスを用いた再生の比較
緩衝剤としてpH7.5及びpH8.5のリン酸カリウム又はトリス(双方とも濃塩酸を用いて滴定)を用いて、再生条件を分析した。溶解及び再生条件は実施例2に記載の通りであったが、再生バッファー中では0.1Mのトリス又は0.1Mのリン酸カリウムを用いた。透析についても実施例2に記載の通りに実施したが、0.1Mのトリス又は0.1Mのリン酸カリウム中で実施した。リン酸カリウムバッファー(K−P)は、トリスバッファーよりも顕著に高い再生収量をもたらした。再生収量は、細胞分散試験により活性NK4の量として測定した(図2を参照)。
活性の決定
a)細胞分散試験
MDCK細胞を、組織培養プレート中でサブコンフルエントに(subconfluently)成長させた。細胞をHGF(10ng/ml)又はHGFとNK4との組み合わせにより処理した。これらの実験においては、HGF誘導細胞の分散は、10〜1000倍モルの過剰のNK4の添加により、少なくとも90%以上が阻害され、機能的活性を示した。
Nakamura,T.,他(Nature 342(1989)440−443)に記載されているように、初代培養における成体ラット肝細胞のDNA合成を測定することにより、NK4によるHGFの有糸分裂活性の阻害を決定した。これらの実験においては、HGF誘導細胞の増殖は、10〜1000倍モルの過剰のNK4の添加により、少なくとも90%以上が阻害され、機能的活性を示した。
この試験においては、腫瘍細胞の浸潤能力を分析した。この試験は、HT115細胞を用いて、基本的にAlbini,A.,他(Cancer Res.47(1987)3239−3245)に記載の通りに行った。この場合も、HGF誘導(10ng/ml)細胞の浸潤は、10〜1000倍モルの過剰のNK4の添加により、少なくとも90%以上が阻害され、機能的活性を示した。
Claims (8)
- 肝細胞成長因子のN末端の4つのクリングルを含むフラグメント(NK4)を、微生物宿主細胞におけるNK4をコードする核酸の発現、変性型のNK4を含む封入体の単離、封入体の可溶化及び変性したNK4の再生(naturation)により産生するための方法であって、10mM還元型グルタチオン及び5mM酸化型グルタチオンの存在下、リン酸バッファー溶液中でpH7〜9において可溶化及び再生を実施するとともに、再生を4℃の温度で48〜160時間実施することを特徴とする方法。
- 再生後に、NK4をpH7〜9のリン酸バッファーで少なくとも24時間透析する、請求項1に記載の方法。
- 再生後にpH7〜9におけるリン酸バッファーの存在下での疎水性相互作用クロマトグラフィーによりNK4を精製することを特徴とする、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- クロマトグラフィーをブチルセファロース又はフェニルセファロース上で実施することを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 全NK4の0%〜50%が還元型グルタチオンで修飾されることを特徴とする、請求項1〜請求項4のいずれか一項に記載の方法。
- 全NK4の0%〜20%が還元型グルタチオンで修飾されることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- リン酸バッファーの濃度が0.1〜1.0Mである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 可溶化をジチオ−1,4−トレイトールの存在下で行なう、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
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