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Hintergrund der Erfindung
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Hepatozyten-Wachstumsfaktor
(HGF/SF) stellt ein von Nakamura, T., et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 22 (1984), 1450–1459,
identifiziertes und gereinigtes Polypeptid dar. Es wurde weiterhin
festgestellt, dass Hepatozyten-Wachstumsfaktor
mit Scatter-Faktor (SF) identisch ist, siehe Weidner, K. M., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 7001–7005. HGF stellt ein Glykoprotein
dar, welches an der Entwicklung zahlreicher zellulärer Phänotypen,
umfassend Proliferation, Mitogenese, Bildung verzweigter Kanäle, und
im Falle von Tumorzellen Invasion und Metastasierung, beteiligt
ist. Für
einen Statusüberblick
siehe Stuart, K. A., et al., Int. J. Exp. Pathol. 81 (2000), 17–30.
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Sowohl
Ratten-HGF als auch humanes HGF wurden sequenziert und kloniert
(Miyazawa, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989),
967–973;
Nakamura, T., et al., Nature 342 (1989), 440–443; Seki, T., et al., Biochem.
and Biophys. Res. Comm. 172 (1990), 321–327; Tashiro, K., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3200–3204; Okajima, A., et al.,
Eur. J. Biochem. 193 (1990), 375–381).
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Es
wurde weiterhin festgestellt, dass ein NK4 genanntes HGF/SF-Fragment,
welches aus der N-terminalen Haarnadeldomäne und den vier Kringeldomänen von
HGF/SF besteht, pharmakologische Eigenschaften aufweist, welche
sich von jenen des HGF/SF vollständig
unterscheiden, einen Antagonisten bezüglich des Einflusses von HGF/SF
auf die Beweglichkeit und Invasion von Kolonkrebszellen darstellt,
und zusätzlich
einen Angiogenese-lnhibitor darstellt, welcher Tumorwachstum und
Metastasierung unterdrückt
(Parr, C., et al., Int. J. Cancer 85 (2000), 563–570; Kuba, K., et al., Cancer
Res. 60 (2000), 6737–6743;
Date, K., et al., FEBS Lett. 420 (1997), 1–6; Date, K., et al., Oncogene
17 (1989), 3045–3054).
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NK4
wird gemäß dem Stand
der Technik (Date, K., et al., FEBS Lett. 420 (1997), 1–6) durch
rekombinante Expression von HGF-cDNA in CHO-Zellen und anschließenden Verdau
mittels pankreatischer Elastase hergestellt. Zwei andere Isoformen
von HGF (NK1 und NK2), welche für
die N-terminale Domäne
und Kringel 1 bzw. für
die N-terminale Domäne
und die Kringel 1 und 2 kodieren, wurden in E. coli mittels des
Einschlusskörperchen-Verfahrens
hergestellt (Stahl, S. J., Biochem. J. 326 (1997), 763–772). Gemäß Stahl
wurde eine Naturierung von NK1 oder NK2 in 100 mM TRIS/HCl pH 7.5
durchgeführt,
welches 2.5 M Harnstoff, 5 mM reduziertes Glutathion (GSH) und 1
mM oxidiertes Glutathion (GSSG) enthielt. Die Reinigung wurde anschließend, ebenfalls
unter Verwendung von TRIS-Puffer, unter Verwendung einer SuperdexTM 75-Säule
durchgeführt.
Die Verwendung von TRIS-Puffer
gemäß Stand
der Technik während
Solubilisierung und Naturierung führt gemäß den Untersuchungen der Erfinder
zu einer beträchtlichen
Menge (etwa 50%) an Nebenprodukten, welche gemäß den Erfindern hauptsächlich aus
GSH-modifiziertem
NK4 bestehen.
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Demzufolge
ist dieses Verfahren zur rekombinanten Herstellung von NK4 in beträchtlichen
Mengen und in ausreichender Reinheit (für eine therapeutische Verwendung)
nicht von Nutzen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von NK4 durch Exprimieren
einer für
NK4 kodierenden Nukleinsäure
in einer mikrobiellen Wirtszelle, Isolieren von Einschlusskörperchen,
welche das NK4 in denaturierter Form enthalten, Solubilisieren der
Einschlusskörperchen
und Naturieren des denaturierten NK4 in Gegenwart von GSH und GSSG
bereit, dadurch gekennzeichnet, dass das Solubilisieren und Naturieren
bei pH 7–9
in phosphatgepufferter Lösung
durchgeführt
werden.
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Es
wurde überraschenderweise
festgestellt, dass die Verwendung von Kaliumphosphatpuffer in einem pH-Bereich
zwischen 7 und 9, bevorzugt zwischen pH 8 und 9, zu einer beträchtlichen
Verbesserung der Ausbeute und Reinheit von NK4 führt.
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Bevorzugt
wird NK4 nach Naturierung für
mindestens 24 Stunden mit Phosphatpuffer pH 7–9 dialysiert. Die Reinigung
erfolgt bevorzugt mittels hydrophober Interaktionschromatographie
in Gegenwart von Phosphatpuffer pH 7–9, wobei die Verwendung von
Butyl- oder Phenylsepharose als chromatographisches Material besonders
bevorzugt ist.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Humanes
HGF stellt ein Disulfid-verknüpftes
Heterodimer dar, welches durch Spaltung zwischen den Aminosäuren R494
und V495 in eine α-Untereinheit
von 463 Aminosäuren
und eine β-Untereinheit
von 234 Aminosäuren
gespalten werden kann. Dem N-Terminus der α-Kette gehen 31 Aminosäuren voraus,
welche mit einer Methioningruppe beginnen. Dieser Abschnitt umfasst
eine Signalsequenz von 31 Aminosäuren.
Die α-Kette
beginnt bei Aminosäure
32 und enthält
vier Kringeldomänen.
Die sogenannte „Haarnadeldomäne" besteht aus den
Aminosäuren
70–96.
Die Kringeldomäne
1 besteht aus den Aminosäuren
128–206.
Die Kringeldomäne
2 besteht aus den Aminosäuren
211–288,
die Kringeldomäne
3 besteht aus den Aminosäuren 305–383, und
die Kringeldomäne
4 besteht in etwa aus den Aminosäuren
391–469
der α-Kette.
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Erfindungsgemäßes NK4
besteht bevorzugt aus den Aminosäuren
(aa) 32–494
oder einem N-terminalen Fragment hiervon (stets beginnend mit aa
32), wobei das kleinste Fragment aa 32-478 ist. Die Länge von
NK4 kann innerhalb dieses Bereichs variieren, solange seine biologischen
Eigenschaften nicht beeinflusst werden. Darüber hinaus gibt es Variationen
dieser Sequenzen, welche die biologischen Eigenschaften von NK4
im Wesentlichen nicht beeinflussen (insbesondere nicht seine antagonistische
Aktivität
gegenüber
HGF und seine antiangiogenetische Aktivität beeinflussen), wobei diese
Variationen beispielsweise in
WO
93/23541 beschrieben sind. Die Aktivität von NK4 wird mittels eines
Scatter-Assays gemäß Beispiel
4 gemessen.
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NK4
kann, wie nachfolgend beschrieben ist, entweder durch Herstellung
von rekombinantem humanem HGF/SF und Verdau mit Elastase (Date,
K., FEBS Lett. 420 (1997), 1–6)
oder durch rekombinante Expression einer für NK4 kodierenden Nukleinsäure in geeigneten
Wirtszellen rekombinant hergestellt werden. Das NK4-Glykoprotein weist
ein Molekulargewicht von etwa 57 kDa (52 kDa für den Polypeptidteil alleine)
auf und besitzt in vivo die biologische Aktivität, eine Hemmung von Tumorwachstum,
Angiogenese und/oder Metastasierung zu bewirken.
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Die
NK4-Polypeptide können
unter Verwendung rekombinanter Mittel in Prokaryoten hergestellt
werden. Zur Expression in prokaryotischen Wirtszellen wird die Nukleinsäure unter
Verwendung von Verfahren, welche dem Fachmann geläufig sind,
in einen geeigneten Expressionsvektor integriert. Ein derartiger
Expressionsvektor enthält
bevorzugt einen regulierbaren/induzierbaren Promoter. Zum Zwecke
der Expression wird der rekombinante Vektor anschließend in
eine geeignete Wirtszelle, wie beispielsweise E. coli, eingebracht, und
die transformierte Zelle wird unter Bedingungen kultiviert, welche
eine Expression des heterologen Gens gestatten. Nach Fermentation
werden Einschlusskörperchen
isoliert, welche denaturiertes NK4 enthalten.
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Escherichia,
Salmonella, Streptomyces oder Bacillus sind beispielsweise als prokaryotische
Wirtsorganismen geeignet. Zur Herstellung von NK4-Polypeptiden werden
Prokaryoten auf die übliche
Art und Weise mit dem Vektor transformiert, welcher die für NK4 kodierende
DNA enthält,
und werden anschließend
auf die übliche
Art und Weise fermentiert. Allerdings ist die Expressionsausbeute
in E. coli bei Verwendung der ursprünglichen DNA-Sequenz von NK4
(GenBank M73239) äußerst gering. Überraschenderweise
wurde festgestellt, dass eine Modifizierung mindestens eines der
Codons der DNA-Sequenz, welche für
die Aminosäurepositionen
33 bis 36 kodiert (Codon 33 kodiert für Arginin, Nummerierung gemäß M73239),
zu einer Erhöhung
der Expressionsausbeute an Polypeptid von 20% oder mehr führt. Demzufolge
sieht die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur rekombinanten
Herstellung von NK4 in Prokaryoten durch Exprimieren eines replizierbaren
Expressionsvektors, welcher eine für NK4 kodierende DNA enthält, vor,
dadurch gekennzeichnet, dass in der DNA mindestens eines der Aminosäurecodons
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Codons an den Positionen 33, 34, 35
und 36 eine Modifizierung von AGG zu CGT (Position 33), von AAA zu
AAA (Position 34), von AGA zu CGT (Position 35), und/oder von AGA
zu CGT (Position 36) aufweist. Es ist weiterhin bevorzugt, dass
das Codon für
Aminosäure
32 dahingehend verändert
ist, dass es, anstatt für
Gin zu kodieren, für
Ser kodiert, um die Abspaltung von N-terminalem Arginin zu verbessern.
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Einschlusskörperchen
finden sich im Cytoplasma, sobald das zu exprimierende Gen keine
Signalsequenz enthält.
Diese Einschlusskörperchen
werden von anderen Zellbestandteilen, beispielsweise mittels Zentrifugation,
nach der Zelllyse abgetrennt.
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Die
Einschlusskörperchen
werden durch Hinzufügen
eines Denaturierungsmittels, wie beispielsweise 6 M Guanidinium-Hydrochlorid
oder 8 M Harnstoff, bei pH 7–9
in Phosphatpuffer (bevorzugt in einer Konzentration von 0.1–1.0 M,
z. B. 0.4 M) bevorzugt in Gegenwart von DTT (Dithio-1,4-threitol)
solubilisiert. Das Solubilisat wird in Phosphatpuffer pH 7–9 in Gegenwart
von GSH/GSSG (bevorzugt 2–20
mM Glutathion) und einem Denaturierungsmittel in nicht-denaturierender
Konzentration (z. B. 2 M Guanidinium-Hydrochlorid oder 4 M Harnstoff),
oder bevorzugt Arginin in einer Konzentration von etwa 0.3 bis 1.0
M, bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0.7 M, anstelle von
Guanidinium-Hydrochlorid oder Harnstoff, verdünnt. Die Renaturierung wird
bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 4°C und für etwa 48 bis 160 Stunden durchgeführt.
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Nach
Beendigung der Naturierung wurde die Lösung, bevorzugt gegen Phosphatpuffer
pH 7–9
(bevorzugt in einer Konzentration von 0.1–1.0 M, z. B. 0.3 M), für mindestens
24 Stunden, bevorzugt für
24–120
Stunden, dialysiert.
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Das
NK4-Polypeptid und Fragmente hiervon können nach rekombinanter Herstellung
und Naturierung des wasserunlöslichen
denaturierten Polypeptids (Einschlusskörperchen) gemäß dem Verfahren
der Erfindung bevorzugt mittels chromatgraphischer Methoden, z.
B. Affinitätschromatographie,
hydrophober Interaktionschromatographie, Immunpräzipitation, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie,
Chromatofokussierung, isoelektrischer Fokussierung, selektiver Präzipitation,
Elektrophorese, oder dergleichen, gereinigt werden. Es ist bevorzugt,
NK4-Polypeptide mittels hydrophober Interaktionschromatographie,
bevorzugt bei pH 7–9,
in Gegenwart von Phosphatpuffer und/oder bevorzugt unter Verwendung
von Butyl- oder Phenylsepharose zu reinigen.
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Gemäß dem Verfahren
der Erfindung wird lediglich eine geringe Menge an NK4-Polypeptiden durch Bildung
von GSH-Addukten modifiziert. In Bezug auf die Gesamtmenge an NK4-Polypeptiden,
d. h. die Menge an Einschlusskörperchen,
welche von anderen Zellbestandteilen abgetrennt wurde (entspricht
100%), beträgt die
Menge an GSH-modifiziertem NK4 zwischen 0% und 50%, bevorzugt zwischen
0% und 35%, und stärker bevorzugt
zwischen 0% und 20%.
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Die
nachfolgenden Beispiele, Literaturstellen und Figuren sowie das
nachfolgende Sequenzprotokoll werden zur Unterstützung des Verständnisses
der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, deren wahrer Schutzumfang
in den beigefügten
Ansprüchen
dargelegt ist.
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Beschreibung der Figuren
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1 Kinetik
der Renaturierung, Heparin-Säule,
Detektion bei 280 nm
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2 Effizienz
der Renaturierung
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Beschreibung der Sequenzen
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- SEQ ID NO: 1 DNA, kodierend für NK4
- SEQ ID NO: 2 Polypeptidsequenz von NK4
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Beispiel 1
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Rekombinante Expression von NK4
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Die
NK4-Domäne
von Aminosäureposition
32 bis 478 von HGF wurde zur Klonierung und rekombinanten Expression
in Escherichia coli verwendet. Die ursprünglich als Quelle für DNA verwendete
DNA-Sequenz wurde beschrieben (Datenbankbezeichnung „gb:M73239"). Zur Amplifizierung
und gleichzeitigen Modifizierung der für NK4 kodierenden DNA (SEQ
ID NO: 1) wurde eine PCR durchgeführt. Alle Verfahren wurden unter
Standartbedingungen durchgeführt.
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Im
Vergleich zur ursprünglichen
DNA-Sequenz von NK4 wurden die nachfolgenden Modifikationen eingebracht:
- – Eliminierung
der eukaryotischen Peptidsignalsequenz und Fusion des ATG-Startcodons neben
Aminosäureposition
32 von NK4
- – Austausch
von Gin gegen Ser an Aminosäureposition
32 zur Verbesserung der Homogenität des Proteinprodukts (Met-frei)
- – Modifizierung
der DNA-Sequenz der Codons der Aminosäuren an den Positionen 33 (von
AGG zu CGT), 35 (von AGA zu CGT) und 36 (von AGA zu CGT) zur Verbesserung
der Genexpression in E. coli
- – Modifizierung
der DNA-Sequenz der Codons an den Positionen 477 (von ATT zu ATC)
und 478 (von GTC zu GTT) zur Vereinfachung der Insertion von PCR-Produkt in den Vektor
- – Einbringung
zweier Translationsstopcodons an den Positionen 479 (TAA) und 480
(TGA), um die Translation an einer Position entsprechend dem Ende
der NK4-Proteindomäne
zu beenden.
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Das
PCR-amplifizierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen
NdeI und BanII behandelt und in den modifizierten pQE-Vektor (Qiagen)
ligiert (Eliminierung des His-Tags sowie der für DHFR kodierenden Region),
welcher in geeigneter Weise mit NdeI und BanII behandelt worden
war. Die Elemente des Expressionsplasmids pQE-NK4-Ser (Plasmidgröße 4447
bp) sind das T5-Promoter/lac-Operator-Element, die
für NK4
kodierende Region, die Lambda t0-Transkriptionsterminationsregion,
die rrnB T1-Transkriptionsterminationsregion, der COlE1-Replikationsursprung,
sowie die für β-Lactamase
kodierende Sequenz.
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Die
Ligationsreaktion wurde zur Transformation E. coli-kompetenter Zellen,
z. B. des E. coli-Stammes C600, welcher das Expressionshilfsplasmid
pUBS520 beherbergt (Brinkmann, U., et al., Gene 85 (1989), 109–114), verwendet.
Kolonien von E. coli wurden isoliert und in Bezug auf Restriktion
und Sequenzanalyse ihrer Plasmide charakterisiert. Die Selektion
von Klonen wurde durch Analyse des NK4-Proteingehalts nach Kultivierung rekombinanter
Zellen in LB-Medium in Gegenwart geeigneter Antibiotika und nach
Induktion der Genexpression durch Hinzufügen von IPTG (1 mM) durchgeführt. Die
Proteinmuster der Zelllysate wurden mittels PAGE miteinander verglichen.
Der rekombinante E. coli-Klon, welcher den höchsten Anteil an NK4-Protein aufwies,
wurde für
den Herstellungsprozess ausgewählt.
Die Fermentation wurde unter Standartbedingungen durchgeführt, und
die Einschlusskörperchen
wurden isoliert.
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Beispiel 2
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Solubilisierung und Naturierung bei Verwendung
optimierter Bedingungen
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Einschlusskörperchen
wurden über
Nacht in einem Puffer, welcher 6 M Guanidinium-Hydrochlorid, 0.1 M Kaliumphosphat pH
8.5 (durch Titration mit 10 M KOH), 1 mM EDTA, 0.01 mM DTT enthielt,
gelöst.
Die Konzentration des gelösten
Proteins wurde unter Verwendung des Biuret-Assays bestimmt und schließlich auf
eine Konzentration von 25 mg Gesamtprotein/ml bei Raumtemperatur
eingestellt.
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Dieses
NK4-Solubilisat wurde in einem Puffer, welcher 0.7 M Arginin, 0.1
M Kaliumphosphat pH 8.5 (durch Titration mit konz. HCl), 10 mM GSH,
5 mM GSSG und 1 mM EDTA enthielt, auf eine Konzentration von 0.4
mg/ml verdünnt.
Dieser Renaturierungsassay wurde bei 4°C zwischen 2 und 8 Tagen inkubiert.
Die Effizienz der Renaturierung wurde mittels analytischer Affinitätschromatographie
unter Verwendung einer 1 ml Herparin-Sepharose-Säule gemessen (Kinetik der Renaturierung
siehe 1).
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Pufferbedingungen:
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- Puffer A: 50 mM Tris pH 8.0
- Puffer B: 50 mM Tris pH 8.0, 2 M NaCl
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| Gradient: |
5–25% |
Puffer
B, 2 Säulenvolumina |
| |
25–60% |
Puffer
B, 16 Säulenvolumina |
| |
60–100% |
Puffer
B, 0.7 Säulenvolumina |
| |
100% |
Puffer
B, 2 Säulenvolumina |
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Nachdem
die maximale Renaturierungseffizienz erhalten worden war, wurde
der Renaturierungsassay von einem Volumen von 151 unter Verwendung
einer Tangentialfluss-Filtrationseinheit (MW-Cutoff: 10 kDa, Sartorius)
auf 3 l aufkonzentriert. Anschließend wurde 3-mal gegen 50 l
Puffer, welcher 0.3 M Kaliumphosphat enthielt, bei pH 8.0 für mindestens
3 × 24
Stunden, optimalerweise für
eine Gesamtdauer von 5 Tagen, dialysiert.
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Die
Reinigung wurde mittels Heparin-Sepharose-Chromatographie durchgeführt (Bedingungen
siehe oben). Das eluierte Material wurde mit 1 M Ammoniumsulfat
in 0.1 M Kaliumphosphat pH 8.0 versetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Probe wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde auf eine Phenylsepharose-Säule (150
ml) geladen. Die Säule
wurde mit 1 Säulenvolumen
an 1 M Ammoniumsulfat in 50 mM Kaliumphosphat pH 8.0 gewaschen.
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Elutionsbedingungen:
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- Puffer A: 1 M Ammoniumsulfat, 50 mM Kaliumphosphat pH 8.0
- Puffer B: 50 mM Kaliumphosphat pH 8.0, 40% Ethylenglykol
- 0–100%
Puffer B, 20 Säulenvolumina
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Beispiel 3
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Vergleich
der Naturierung bei Verwendung von Kaliumphosphat und Tris Die Renaturierungsbedingungen
wurden unter Verwendung von Kaliumphosphat oder TRIS bei pH 7.5
und pH 8.5 (beide titriert mit konz. HCl) als Pufferreagenzien analysiert.
Die Solubilisierungs- und Renaturierungsbedingungen waren wie in
Beispiel 2 beschrieben, allerdings mit 0.1 M TRIS oder 0.1 M Kaliumphosphat
im Renaturierungspuffer. Die Dialyse wurde ebenfalls wie in Beispiel
2 beschrieben durchgeführt,
allerdings in 0.1 M TRIS oder in 0.1 M Kaliumphosphat. Der Kaliumphosphatpuffer
(K-P) führte
zu signifikant höheren
Renaturierungsausbeuten als TRIS-Puffer, gemessen mittels Scatter-Assay
als Menge an aktivem NK4 (siehe 2).
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Beispiel 4
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Bestimmung der Aktivität
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a) Scatter-Assay
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MDCK-Zellen
wurden in Gewebekulturplatten subkonfluent angezüchtet. Die Zellen wurden mit
HGF (10 ng/ml) oder mit Kombinationen von HGF und NK4 behandelt.
In diesen Experimenten wurde die HGF-induzierte Zellstreuung durch
Zugabe eines 10- bis
1000-fachen molaren Überschusses
an NK4 um mindestens 90% oder mehr gehemmt, was die funktionelle
Aktivität
zeigt.
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b) Proliferationsassay
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Die
Hemmung der mitogenen Aktivität
von HGF durch NK4 wurde durch Messung der DNA-Synthese von adulten,
in Primärkultur
befindlichen Rattenhepatozyten bestimmt, wie in Nakamura, T., et
al., Nature 342 (1989), 440–443
beschrieben. In diesen Experimenten wurde die HGF-induzierte Zellproliferation
durch Zugabe eines 10- bis 1000-fachen molaren Überschusses an NK4 um mindestens
90% oder mehr gehemmt, was die funktionelle Aktivität zeigt.
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c) Invasionsassay
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In
diesem Assay wird das invasive Potential von Tumorzellen analysiert.
Der Assay wurde im Wesentlichen wie in Albini, A., et al., Cancer
Res. 47 (1987), 3239–3245
beschrieben unter Verwendung von HT115-Zellen durchgeführt. Wiederum
konnte die HGF-induzierte (10 ng/ml) Zellinvasion durch einen 10-
bis 1000-fachen molaren Überschuss
an NK4 um mindestens 90% oder mehr gehemmt werden, was die funktionelle
Aktivität
zeigt.
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Beispiel 5
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Aktivität in vivo
| Modell: | Lewis-Lungenkarzinom-Nacktmaustumormodell |
| | 1 × 106 Lewis-Lungenkarzinomzellen wurden s. c.
in männliche |
| | Nacktmäuse (BALG/c
nu/nu) implantiert. |
| Behandlung: | Nach
4 Tagen, täglich
eine Verabreichung von pegyliertem NK4 über |
| | einen
Zeitraum von 2–4
Wochen |
| Dosis: | 1000 μg/Maus/Tag |
| | 300 μg/Maus/Tag |
| | 100 μg/Maus/Tag |
| | Placebo |
| Ergebnis: | Die
Behandlung mit NK4 zeigt eine dosisabhängige Unterdrückung |
| | von
primärem
Tumorwachstum und Metastasierung, wohingegen in |
| | den
mit Placebo behandelten Gruppen kein Effekt beobachtet wird. |
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Liste der Literaturstellen
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- Albini, A., et al., Cancer Res. 47 (1987), 3239–3245
- Brinkmann, U., et al., Gene 85 (1989), 109–114
- Date, K., et al., FEBS Lett. 420 (1997), 1–6
- Date, K., et al., Oncogene 17 (1989), 3045–3054
- Kuba, K., et al., Cancer Res. 60 (2000), 6737–6743
- Miyazawa, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989),
967–973
- Nakamura, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1984),
1450–1459
- Nakamura, T., et al., Nature 342 (1989), 440–443
- Okajima, A., et al., Eur. J. Biochem. 193 (1990), 375–381
- Parr, C., et al., Int. J. Cancer 85 (2000), 563–570
- Seki, T., et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990),
321–327
- Stahl, S. J., Biochem. J. 326 (1997), 763–772
- Stuart, K. A., et al., Int. J. Exp. Pathol. 81 (2000), 17–30
- Tashiro, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3200–3204 U.S. Patent Nr. 5,977,310
- Weidner, K. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991),
7001–7005 WO 93/23541
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