JP2010119393A

JP2010119393A - 肝細胞成長因子のｎ末端フラグメントを精製するための方法

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Publication number: JP2010119393A
Application number: JP2010019034A
Authority: JP
Inventors: Friederike Hesse; ヘッセ，フリーデリケ; Martin Lanzendoerfer; ランツェンデルファー，マルティン; Apollon Papadimitriou; パパディミトリョウ，アポロン; Jan Stracke; ストラッケ，ヤン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-03-03
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2010-06-03
Also published as: JP4511589B2; DE602005003929T2; CN1926150B; CA2558740A1; US7544493B2; ATE381576T1; EP1723171A1; US20070287827A1; CN1926150A; ES2297673T3; DE602005003929D1; WO2005095449A1; JP2007525219A; EP1723171B1

Abstract

【課題】肝細胞成長因子のＮ末端の４つのクリングルを含むフラグメント（ＮＫ４）の精製方法の提供。
【解決手段】ＮＫ４を、微生物宿主細胞におけるＮＫ４をコードする核酸の発現、変性型のＮＫ４を含む封入体の単離、封入体の可溶化及び変性したＮＫ４の再生により産生するための方法であって、ｐＨ７〜９でリン酸バッファー溶液中において可溶化及び再生を実施することを特徴とする方法は、高純度で且つ高収量のＮＫ４を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、肝細胞成長因子のＮ末端の４つのクリングルを含むフラグメント（ＮＫ４）を精製するための方法に関する。

肝細胞成長因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は、Nakamura, T.他（非特許文献１：Biochem. Biophys. Res. Commun. 22(1984)1450-1459）により同定され精製されたポリペプチドである。肝細胞成長因子は細胞分散因子（ＳＦ）と同一であることが、更に見出された（非特許文献２：Weidner, K. M.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991)7001-7005）。ＨＧＦは、多くの細胞表現型の発達、例えば増殖、有糸分裂誘発、枝管（branching tubule）の形成、そして腫瘍細胞の場合には、浸潤及び転移に関わる糖タンパク質である。このことに関しては、Stuart, K. A.他（非特許文献３：Int. J. Exp. Pathol. 81(2000)17-30）を参照されたい。

ラットＨＧＦ及びヒトＨＧＦの双方は、配列が決定され、クローニングされた（非特許文献４：Miyazawa, K.他、Biochem. Biophys. Res. Comm. 163(1989)967-973；非特許文献５：Nakamura, T.他、Nature 342(1989)440-443；非特許文献６：Seki, T.他、Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172(1990)321-327；非特許文献７：Tashiro, K.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990)3200-3204；非特許文献８：Okajima, A.他、Eur. J. Biochem. 193(1990)375-381）。

ＨＧＦ／ＳＦのＮ末端ヘアピンドメイン及び４つのクリングルドメインから成る、ＮＫ４と呼ばれているＨＧＦ／ＳＦフラグメントは、ＨＧＦ／ＳＦとは全く異なった薬理学的特性を有し、そして結腸癌細胞の運動性及び浸潤へのＨＧＦ／ＳＦの作用に対するアンタゴニストであり、加えて腫瘍成長及び転移を抑制する血管形成阻害剤であることが、更に見出された（非特許文献９：Parr, C.他、Int. J. Cancer 85(2000)563-570；非特許文献１０：Kuba, K.他、Cancer Res. 60(2000)6737-6743；非特許文献１１：Date, K.他、FEBS Lett. 420(1997)1-6；非特許文献１２：Date, K.他、Oncogene 17(1989)3045-3054）。

ＨＧＦのｃＤＮＡをＣＨＯ細胞において組み換え発現し、その後膵エラスターゼで消化することにより、ＮＫ４は技術水準（非特許文献１１：Date, K.他, FEBS Lett. 420(1997)1-6）に従い調製される。Ｎ末端ドメイン及びクリングル１、並びにＮ末端ドメイン及びクリングル１及び２をそれぞれコードする、ＨＧＦの２つの他のアイソフォーム（ＮＫ１及びＮＫ２）は、封入体経路でＥ．コリ（E. coli）において産生された（非特許文献１３：Stahl, S. J., Biochem. J. 326(1997)763-772）。Stahlによると、ＮＫ１又はＮＫ２の再生（naturation）は、２．５Ｍの尿素、５ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）及び１ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含む、ｐＨ７.５の１００ｍＭＴＲＩＳ／ＨＣｌ中において実施された。精製は、その後Superdex（登録商標）７５カラム上でＴＲＩＳバッファーを用いて実施された。発明者の調査によると、可溶化及び再生における技術水準に従ったＴＲＩＳバッファーの使用は、かなりの量（約５０％）の副産物を生じさせる。この副産物は、主にＧＳＨで修飾されたＮＫ４から成るものとして発明者により同定されている。

従って、この方法は、多量で且つ十分な純度（治療上の使用に関して）のＮＫ４の組み換え体の産生に対しては有用ではない。

Nakamura, T.他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 22(1984)1450-1459 Weidner, K. M.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991)7001-7005 Stuart, K. A.他、Int. J. Exp. Pathol. 81(2000)17-30 Miyazawa, K.他、Biochem. Biophys. Res. Comm. 163(1989)967-973 Nakamura, T.他、Nature 342(1989)440-443 Seki, T.他、Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172(1990)321-327 Tashiro, K.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990)3200-3204 Okajima, A.他、Eur. J. Biochem. 193(1990)375-381 Parr, C.他、Int. J. Cancer 85(2000)563-570 Kuba, K.他、Cancer Res. 60(2000)6737-6743 Date, K.他、FEBS Lett. 420(1997)1-6 Date, K.他、Oncogene 17(1989)3045-3054 Stahl, S. J., Biochem. J. 326(1997)763-772

本発明は、微生物宿主細胞におけるＮＫ４をコードする核酸の発現、変性型のＮＫ４を含む封入体の単離、封入体の可溶化、及びＧＳＨとＧＳＳＧの存在下における変性したＮＫ４の再生により、ＮＫ４を産生するための方法であって、リン酸バッファー溶液中でｐＨ７〜９において可溶化及び再生を実施することを特徴とする方法を提供する。

驚いたことに、ｐＨの範囲が７〜９、好ましくは８〜９のリン酸カリウムバッファーの使用により、ＮＫ４の収量及び純度がかなり向上することが見出された。

好ましくは、再生の後に、ＮＫ４をｐＨ７〜９のリン酸バッファーを用いて少なくとも２４時間透析する。好ましくは、ｐＨ７〜９のリン酸バッファーの存在下で疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製を実施する。ここで、クロマトグラフィーの材料としてブチルセファロース又はフェニルセファロースを使用することが特に好ましい。

再生動態、ヘパリンカラム、２８０ｎｍでの検出。再生効果。

ヒトＨＧＦはジスルフィド結合したヘテロダイマーであり、Ｒ４９４とＶ４９５のアミノ酸間での切断により、４６３アミノ酸のα−サブユニットと２３４アミノ酸のβ−サブユニットに切断することができる。α鎖のＮ末端は、メチオニン基で始まる３１アミノ酸により先行される。このセグメントは、３１アミノ酸のシグナル配列を含む。α鎖はアミノ酸３２で始まり、４つのクリングルドメインを含む。いわゆる「ヘアピンドメイン」は、アミノ酸７０〜９６から成る。クリングル１ドメインは、アミノ酸１２８〜２０６から成る。クリングル２ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸２１１〜２８８から成り、クリングル３ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸３０５〜３８３から成り、クリングル４ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸３９１〜４６９から成る。

本発明のＮＫ４は、好ましくはアミノ酸（ａａ）３２〜４９４又はそれらのＮ末端フラグメント（常にａａ３２で始まる）から成る。最も小さいフラグメントは、ａａ３２〜４７８である。生物学的特性に影響を及ぼさない限り、ＮＫ４の長さはこの範囲内で変わり得る。更に、これらの配列のバリエーションが存在し、本質的にＮＫ４の生物学的特性に影響を及ぼさない（特に、ＨＧＦに対するアンタゴニスト活性及び抗血管形成活性に影響を及ぼさない）。そのバリエーションは、例えば国際公開第９３／２３５４１号に記載されている。ＮＫ４の活性は、実施例４の細胞分散試験により測定する。

ＮＫ４は、組み換えにより（下記に説明するように、組み換えヒトＨＧＦ／ＳＦの産生及びエラスターゼによる消化（Date, K., FEBS Lett. 420(1997)1-6）、又は適切な宿主細胞におけるＮＫ４をコードする核酸の組み換え体の発現のいずれかにより）産生することができる。ＮＫ４糖タンパク質は、約５７ｋＤａ（ポリペプチド部分のみでは５２ｋＤａ）の分子量を有し、且つ腫瘍成長、血管形成及び／又は転移の阻害をもたらすin vivoでの生物活性を有する。

ＮＫ４ポリペプチドは、原核生物において組み換え手段により産生することができる。原核宿主細胞における発現では、核酸は当業者に良く知られた方法により適切な発現ベクターに組み込まれる。そのような発現ベクターは、好ましくは制御／誘導プロモーターを含む。次に、発現させるために組み換えベクターを適切な宿主細胞、例えばＥ．コリに導入し、異種遺伝子の発現を可能にする条件下で形質転換細胞を培養する。発酵後に、変性したＮＫ４を含む封入体を単離する。

例えば、エシェリキア属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、ストレプトミセス属（streptomyces）又はバシラス属（Bacillus）が、原核宿主生物として適切である。ＮＫ４ポリペプチドの産生のために、通常の方法で原核生物にベクター（ＮＫ４をコードするＤＮＡを含む）を形質転換し、その後通常の方法で発酵させる。しかし、元のＮＫ４のＤＮＡ配列（GenBank M73239）を用いたＥ．コリにおける発現量は非常に低い。驚いたことに、アミノ酸位置３３〜３６（コドン３３はアルギニンをコードし、Ｍ７３２３９に従って番号付けをする）をコードするＤＮＡ配列の少なくとも１つのコドンの変更が、２０％ポリペプチド又はそれ以上の発現量の増加をもたらすことが見出された。従って、本発明の更なる対象は、ＮＫ４をコードするＤＮＡを含む複製可能な発現ベクターの発現により、原核生物においてＮＫ４の組み換え体を産生するための方法である。ＮＫ４は、そのＤＮＡにおいて、位置３３、３４、３５及び３６でのコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも１つが、ＡＧＧからＣＧＴ（位置３３）、ＡＡＡからＡＡＡ（位置３４）、ＡＧＡからＣＧＴ（位置３５）、そして／或いはＡＧＡからＣＧＴ（位置３６）に変更していることを特徴とする。Ｎ末端のアルギニンの開裂を向上させるために、アミノ酸３２のコドンをＧｌｎをコードするものからＳｅｒをコードするものに変更することが、更に好ましい。

発現する遺伝子がシグナル配列を含まないため、封入体は細胞質において見られる。これらの封入体は、例えば細胞溶解後の遠心分離により、他の細胞成分から分離される。

変性剤、例えば、好ましくはＤＤＴ（ジチオ−１，４−トレイトール）の存在下でのリン酸バッファー（好ましくは、０.１〜１.０Ｍ、例えば０.４Ｍの濃度）中のｐＨ７〜９における６Ｍグアニジン塩酸塩又は８Ｍ尿素を添加することにより、封入体を溶解させた。可溶化物は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（好ましくは、２〜２０ｍＭのグルタチオン）の存在下におけるｐＨ７〜９のリン酸バッファー、及び非変性濃度（例えば、２Ｍのグアニジン塩酸塩又は４Ｍの尿素）の変性剤又は好ましくはグアニジン塩酸塩若しくは尿素の代わりに約０．３〜１．０Ｍ、好ましくは約０．７Ｍの濃度のアルギニンに希釈する。再生は、好ましくは約４℃の温度で約４８〜１６０時間実施する。

再生が終了した後、好ましくはｐＨ７〜９のリン酸バッファー（好ましくは、０．１〜１．０Ｍ、例えば０．３Ｍの濃度）に対して少なくとも２４時間、好ましくは２４〜１２０時間、この溶液を透析した。

組み換え体の産生及び水不溶性変性ポリペプチド（封入体）の再生の後に、ＮＫ４ポリペプチド又はそのフラグメントは、本発明の方法に従って、好ましくはクロマトグラフィー法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫沈降、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動、選択的沈殿、電気泳動などにより精製することができる。好ましくはｐＨ７〜９における、リン酸バッファーの存在下での疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、そして／或いは好ましくはブチルセファロース又はフェニルセファロースを用いることにより、ＮＫ４ポリペプチドを精製することが好ましい。

本発明の方法によると、ほんの少量のＮＫ４ポリペプチドはＧＳＨ付加化合物の形成により修飾される。ＮＫ４ポリペプチドの全量、すなわち他の細胞成分から分離した封入体の量（１００％に相当する）のうち、ＧＳＨで修飾されたＮＫ４の量は、０％〜５０％、好ましくは０％〜３５％、より好ましくは０％〜２０％である。

下記の実施例、参考文献、配列表及び図を、本発明の理解を助けるために提供し、本発明の真の範囲は添付した特許請求の範囲において記載する。本発明の精神から逸脱することなく、記載した手順を変更できることが理解される。

配列の説明
配列番号１：ＮＫ４をコードするＤＮＡ
配列番号２：ＮＫ４のポリペプチド配列

実施例１
ＮＫ４の組み換え体の発現
ＨＧＦのアミノ酸位置３２〜４７８のＮＫ４ドメインを、クローニング及び大腸菌における組み換え体の発現に用いた。ＤＮＡのソースとして用いた元のＤＮＡ配列については記載した（データベース識別子「ｇｂ：Ｍ７３２３９」）。ＮＫ４をコードするＤＮＡ（配列番号：１）を増幅し、同時に変更するために、ＰＣＲを実施した。全ての方法を標準条件下で実施した。

ＮＫ４の元のＤＮＡ配列との比較において、下記の変更を導入した：
− 真核生物のシグナルペプチド配列を除去し、ＮＫ４のアミノ酸位置３２の隣にＡＴＧ開始コドンを融合すること
− タンパク質産物（Ｍｅｔの含まれていない）の均質性を向上させるために、アミノ酸位置３２をＧｌｎからＳｅｒに置換すること
− Ｅ．コリにおける遺伝子発現を向上させるために、位置３３（ＡＧＧからＣＧＴ）、３５（ＡＧＡからＣＧＴ）、及び３６（ＡＧＡからＣＧＴ）におけるアミノ酸のコドンのＤＮＡ配列を変更すること
− ＰＣＲ産物のベクターへの挿入を容易にするために、位置４７７（ＡＴＡからＡＴＣ）及び４７８（ＧＴＣからＧＴＴ）におけるコドンのＤＮＡ配列を変更すること
− ＮＫ４タンパク質ドメインの終点に対応する位置で翻訳を止めるために、位置４７９（ＴＡＡ）及び４８０（ＴＧＡ）に２つの翻訳終止コドンを導入すること。

ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｎＩＩで処理し、改変したｐＱＥベクター（Qiagen）（Ｈｉｓ−ｔａｇ及びＤＨＦＲコード領域を除去）に連結した。この改変したｐＱＥベクターを、ＮｄｅＩ及びＢａｎＩＩで適切に処理した。発現用プラスミドであるｐＱＥ−ＮＫ４−Ｓｅｒ（プラスミドサイズは４４４７ｂｐ）のエレメントは、Ｔ５プロモータ／ｌａｃオペレータエレメント、ＮＫ４をコードする領域、ラムダｔ.ｏ.転写終結領域、ｒｒｎＢＴ１転写終結領域、複製に関するＣｏｌＥ１起点、及びβ−ラクタマーゼをコードする配列である。

Ｅ．コリのコンピテントセル、例えば発現ヘルパープラスミドｐＵＢＳ５２０（Brinkmann, U.他, Gene 85(1989)109-114）を有するＥ．コリ株Ｃ６００を形質転換するために、ライゲーション反応を用いた。Ｅ．コリのコロニーを単離し、それらのプラスミドの制限酵素及び配列分析に関して特性を明らかにした。適切な抗生物質の存在するＬＢ培地において組み換え細胞を培養した後であって、且つＩＰＴＧ（１ｍＭ）の添加により遺伝子発現を誘導した後にＮＫ４タンパク質含量を分析することにより、クローンの選択を実施した。細胞溶解物のタンパク質パターンをＰＡＧＥにより比較した。最も高い比率のＮＫ４タンパク質を示す組み換えＥ．コリのクローンを、産生方法用に選択した。標準条件下で発酵を実施し、封入体を単離した。

実施例２
最適化条件を用いた可溶化及び再生
６Ｍのグアニジン塩酸塩、ｐＨ８．５の０．１Ｍリン酸カリウム（１０ＭのＫＯＨを用いた滴定により）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１ｍＭのＤＴＴを含むバッファーに、封入体を一晩溶解した。溶解したタンパク質の濃度を、ビウレット試験により決定し、最終的に室温で２５ｍｇ全タンパク質／ｍｌの濃度に調節した。

０.７Ｍのアルギニン、ｐＨ８.５の０.１Ｍリン酸カリウム（濃塩酸を用いた滴定により）、１０ｍＭのＧＳＨ、５ｍＭのＧＳＳＧ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファー中に、このＮＫ４可溶化物を溶解して０.４ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この再生試験試料を、４℃で２〜８日間インキュベートした。１ｍｌのヘパリンセファロースカラムを用いた分析的アフィニティークロマトグラフィーにより、再生効果を測定した（再生動態については、図１を参照）。

バッファー条件：
バッファーＡ：ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス
バッファーＢ：ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス、２ＭのＮａＣｌ

グラジエント：
５〜２５％バッファーＢ、２カラム容積
２５〜６０％バッファーＢ、１６カラム容積
６０〜１００％バッファーＢ、０．７カラム容積
１００％バッファーＢ、２カラム容積

最大の再生効果を得た後、接線流濾過ユニット（ＭＷカットオフ：１０ｋＤａ、Sartorius）を用いて、１５ｌの体積の再生試験試料を３ｌにまで濃縮した。その後、少なくとも３×２４時間、最適には合計で５日間、ｐＨ８．０で０．３Ｍのリン酸カリウムを含む５０ｌのバッファーに対して３回透析をした。

ヘパリンセファロースクロマトグラフィーにより、精製を実施した（条件については、上記を参照）。ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸カリウム中の１Ｍの硫酸アンモニウムを、その溶出した物質に添加し、４℃で一晩インキュベートした。サンプルを遠心分離し、上清をフェニルセファロースカラム（１５０ｍｌ）に充填した。ｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸カリウム中の１カラム容量の１Ｍ硫酸アンモニウムで、カラムを洗った。

溶出条件：
バッファーＡ：１Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸カリウム
バッファーＢ：ｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸カリウム、４０％のエチレングリコール
０〜１００％のバッファーＢ、２０カラム容量

実施例３
リン酸カリウム及びトリスを用いた再生の比較
緩衝剤としてｐＨ７．５及びｐＨ８．５のリン酸カリウム又はトリス（双方とも濃塩酸を用いて滴定）を用いて、再生条件を分析した。溶解及び再生条件は実施例２に記載の通りであったが、再生バッファー中では０．１Ｍのトリス又は０．１Ｍのリン酸カリウムを用いた。透析についても実施例２に記載の通りに実施したが、０．１Ｍのトリス又は０．１Ｍのリン酸カリウム中で実施した。リン酸カリウムバッファー（Ｋ−Ｐ）は、トリスバッファーよりも顕著に高い再生収量をもたらした。再生収量は、細胞分散試験により活性ＮＫ４の量として測定した（図２を参照）。

実施例４
活性の決定
ａ）細胞分散試験
ＭＤＣＫ細胞を、組織培養プレート中でサブコンフルエントに（subconfluently）成長させた。細胞をＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＧＦとＮＫ４との組み合わせにより処理した。これらの実験においては、ＨＧＦ誘導細胞の分散は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４の添加により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。

ｂ）増殖試験
Nakamura, T.他（Nature 342(1989)440-443）に記載されているように、初代培養における成体ラット肝細胞のＤＮＡ合成を測定することにより、ＮＫ４によるＨＧＦの有糸分裂活性の阻害を決定した。これらの実験においては、ＨＧＦ誘導細胞の増殖は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４の添加により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。

ｃ）浸潤試験
この試験においては、腫瘍細胞の浸潤能力を分析した。この試験は、ＨＴ１１５細胞を用いて、基本的にAlbini, A.他（Cancer Res. 47 (1987)3239-3245）に記載の通りに行った。この場合も、ＨＧＦ誘導（１０ｎｇ／ｍｌ）細胞の浸潤は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４の添加により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。

実施例５
in vivoでの活性

Claims

肝細胞成長因子のＮ末端の４つのクリングルを含むフラグメント（ＮＫ４）を、微生物宿主細胞におけるＮＫ４をコードする核酸の発現、変性型のＮＫ４を含む封入体の単離、封入体の可溶化及び変性したＮＫ４の再生（naturation）により産生するための方法であって、リン酸バッファー溶液中でｐＨ７〜９において可溶化及び再生を実施することを特徴とする方法。
再生後に、ＮＫ４をｐＨ７〜９のリン酸バッファーで少なくとも２４時間透析する、請求項１に記載の方法。
再生後にｐＨ７〜９におけるリン酸バッファーの存在下での疎水性相互作用クロマトグラフィーによりＮＫ４を精製することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
クロマトグラフィーをブチルセファロース又はフェニルセファロース上で実施することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
ＧＳＨで修飾されたＮＫ４の量が全ＮＫ４の０％〜５０％であることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。
ＧＳＨで修飾されたＮＫ４の量が全ＮＫ４の０％〜２０％であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。