JP2011019529A - 肝細胞成長因子のｎ末端フラグメントを組み換え発現するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】肝細胞成長因子のα−鎖又はそのＮ末端フラグメント（ＮＫポリペプチド）を、微生物宿主細胞におけるＮＫポリペプチドをコードする核酸の発現、変性型の当該ＮＫポリペプチドを含む封入体の単離、封入体の可溶化、及び変性したＮＫポリペプチドの再生により産生するための方法。
【解決手段】当該核酸において、位置３３、３５及び３６のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも１つがＣＧＴであることを特徴とする方法は、発現量の向上をもたらす。
【選択図】なし
【解決手段】当該核酸において、位置３３、３５及び３６のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも１つがＣＧＴであることを特徴とする方法は、発現量の向上をもたらす。
【選択図】なし
Description
本発明は、肝細胞成長因子のＮ末端の４つのクリングルを含むフラグメントを組み換え発現するための方法に関する。
肝細胞成長因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，他,（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２（１９８４）１４５０−１４５９）により同定され精製されたポリペプチドである。肝細胞成長因子は細胞分散因子（ＳＦ）と同一であることが、更に見出された（Ｗｅｉｄｎｅｒ，Ｋ．Ｍ．，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８（１９９１）７００１−７００５）。ＨＧＦは、多くの細胞表現型の発達、例えば増殖、有糸分裂誘発、枝管（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｔｕｂｕｌｅ）の形成、そして腫瘍細胞の場合には、浸潤及び転移に関わる糖タンパク質である。このことに関しては、Ｓｔｕａｒｔ，Ｋ．Ａ．，他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８１（２０００）１７−３０）を参照されたい。
ラットＨＧＦ及びヒトＨＧＦの双方は、配列が決定され、クローニングされた（Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｋ．他,Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３（１９８９）９６７−９７３；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，他,Ｎａｔｕｒｅ３４２（１９８９）４４０−４４３；Ｓｅｋｉ，Ｔ．，他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７２（１９９０）３２１−３２７；Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｋ．，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（１９９０）３２００−３２０４；Ｏｋａｊｉｍａ，Ａ．，他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９３（１９９０）３７５−３８１）。
ＨＧＦは、ヒトプラスミノーゲンと高い類似性を有するタンパク質である（３８％のアミノ酸配列が同一）。ＨＧＦ及びプラスミノーゲンは双方とも、タンパク質分解によりプロセシングされてジスルフィド結合ヘテロ二量体となる一本鎖ポリペプチドとして合成される。ＨＧＦは、Ｎ末端ドメインの４つの連続したクリングルドメイン及びカルボキシ末端のプロテアーゼ様ドメインを含む。異なる切断ＨＧＦ変異体が、示されてきた。ＮＫ１は、示されている中で最も短いＨＧＦ変異体である。ＮＫ１は、アミノ酸３２〜２１０を含み、最初のクリングルドメインの後で切断されている（Ｌｏｋｋｅｒ，Ｎ．Ａ．，及び
Ｇｏｄｏｗｓｋｉ, ＰＪ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１９９３）１７１４５−１７１５０）。ＮＫ２は、Ｎ末端のアミノ酸末端及びクリングル１及びクリングル２から成り、選択的にスプライスされたＨＧＦｍＲＮＡの天然の産物である（Ｃｈａｎ，Ａ．Ｍ．，他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（１９９１）１３８２−１３８５）。ＨＧＦの重鎖の部分を含む更なるＨＧＦ変異体（アミノ酸１〜４９４、アミノ酸１〜４６３からのＨＧＦのアルファ−サブユニットを含む）は、Ｌｏｋｋｅｒ，Ｎ．Ａ．により示されている（ＥＭＢＯ Ｊ．１１（１９９２）２５０３−２５１０）。
Ｇｏｄｏｗｓｋｉ, ＰＪ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１９９３）１７１４５−１７１５０）。ＮＫ２は、Ｎ末端のアミノ酸末端及びクリングル１及びクリングル２から成り、選択的にスプライスされたＨＧＦｍＲＮＡの天然の産物である（Ｃｈａｎ，Ａ．Ｍ．，他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（１９９１）１３８２−１３８５）。ＨＧＦの重鎖の部分を含む更なるＨＧＦ変異体（アミノ酸１〜４９４、アミノ酸１〜４６３からのＨＧＦのアルファ−サブユニットを含む）は、Ｌｏｋｋｅｒ，Ｎ．Ａ．により示されている（ＥＭＢＯ Ｊ．１１（１９９２）２５０３−２５１０）。
ＨＧＦ／ＳＦのＮ末端ヘアピンドメイン及び４つのクリングルドメインから成る、ＮＫ４と呼ばれているＨＧＦ／ＳＦフラグメントは、ＨＧＦ／ＳＦとは全く異なった薬理学的特性を有し、そして結腸癌細胞の運動性及び浸潤へのＨＧＦ／ＳＦの作用に対するアンタゴニストであり、加えて腫瘍成長及び転移を抑制する血管形成阻害剤であることが、更に見出された（Ｐａｒｒ，Ｃ，他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５（２０００）５６３−５７０；Ｋｕｂａ，Ｋ．，他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０（２０００）６７３７−６７４３；Ｄａｔｅ，Ｋ．，他，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２０（１９９７）１−６；Ｄａｔｅ，Ｋ．，他，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７（１９８９）３０４５−３０５４）。
ＨＧＦのｃＤＮＡをＣＨＯ細胞において組み換え発現し、その後膵エラスターゼで消化することにより、ＮＫ４は技術水準（Ｄａｔｅ，Ｋ．，他，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２０（１９９７）１−６）に従い調製される。Ｎ末端ドメイン及びクリングル１、並びにＮ末端ドメイン及びクリングル１及び２をそれぞれコードする、ＨＧＦの２つの他のアイソフォーム（ＮＫ１及びＮＫ２）は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生された（Ｓｔａｈｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６（１９９７）７６３−７７２）。しかし、この方法では、ＨＧＦ由来のタンパク質は全タンパク質のたった約１０〜２０％の量となる。
本発明は、ＨＧＦのアルファ−鎖又はそのフラグメント（ＮＫポリペプチド）を、微生物宿主細胞における当該ＮＫポリペプチドをコードする核酸の発現、変性型の当該ＮＫポリペプチドを含む封入体の単離、封入体の可溶化、及び変性したＮＫポリペプチドの再生により産生するための方法であって、当該核酸において、位置３３、３５及び３６のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも１つがＣＧＴであることを特徴とする方法を提供する。
アミノ酸（ａａ）及びコドンの番号付けは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１４２１０に示されている配列に従っている。ここで、ａａ（アミノ酸）１〜３１はシグナル配列を示し、ａａ３２〜４９４はアルファ鎖を示し、ａａ１２８〜２０６はクリングル１を示し、ａａ２１１〜２８８はクリングル２を示し、ａａ３０５〜３８３はクリングル３を示し、ａａ３９１〜４６９はクリングル４を示す。
驚いたことに、位置３３、３５及び３６（コドン３３、３５及び３６はアルギニンをコードし、Ｍ７３２３９に従って番号付けをする）のＤＮＡ配列の少なくとも１つのコドンの変更が、約１００％又はそれ以上の発現収率の増加をもたらすことが見出された。Ｎ末端のメチオニンの開裂を向上させるために、アミノ酸３２のコドンを、ＧｌｎをコードするものからＳｅｒをコードするものに変えることが、更に好ましい。
本発明のＮＫポリペプチドは、ａａ３２〜４９４又はそのＮ末端フラグメント（常にａａ３２で始まる）、好ましくはフラグメントａａ３２〜４７８から成り、最も短いフラグメントはａａ３２〜２０７である。本発明の全てのＮＫポリペプチドは、実施例４の細胞分散試験における活性を示す。
本発明は更に、ａａ３２〜４９４から成るＮＫポリペプチド、又はａａ３２で始まるそのＮ末端フラグメント、好ましくはフラグメントａａ３２〜ｘ（ここで、ｘは２０７〜４７８の間の数であり、ｘは好ましくは２０７又は４７８である）をコードする核酸であって、位置３３、３５及び３６のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも１つがＣＧＴであることを特徴とする核酸を提供する。好ましくは、位置３３、３５及び３６の全てのコドンがＣＧＴである。
本発明の好ましい実施態様においては、タンパク質の均質性（Ｎ末端のメチオニンの開裂）を向上させるために、ａａ３２をグルタミンからセリンに変化させる。
所望のポリペプチドの終点に対応する位置で翻訳を止めるために、ＮＫポリペプチドをコードする核酸の終点に２つの翻訳終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ及び／又は及びＴＧＡ）を導入することが更に好ましい。
発明の詳細な説明
ヒトＨＧＦはジスルフィド結合したヘテロダイマーであり、アミノ酸Ｒ４９４とＶ４９５の間の開列により、４６３アミノ酸のα−サブユニットと２３４アミノ酸のβ−サブユニットに開裂することができる。α鎖のＮ末端は、メチオニン基で始まる３１アミノ酸により先行される。このセグメントは、３１アミノ酸のシグナル配列を含む。α鎖はアミノ酸３２で始まり、４つのクリングルドメインを含む。いわゆる「ヘアピンドメイン」は、アミノ酸７０〜９６から成る。クリングル１ドメインは、アミノ酸１２８〜２０６から成る。クリングル２ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸２１１〜２８８から成り、クリングル３ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸３０５〜３８３から成り、クリングル４ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸３９１〜４６９から成る。これらの配列にはバリエーションが存在し、本質的にＮＫポリペプチドの生物学的特性に影響を及ぼさない（特に、ＨＧＦに対するアンタゴニスト活性及び抗血管形成活性に影響を及ぼさない）。そのバリエーションは、例えばＷＯ９３／２３５４１号に記載されている。また、生物学的特性に影響を及ぼさない限り、ＮＫポリペプチドの長さは、２、３のアミノ酸の範囲内で変わり得る。
ヒトＨＧＦはジスルフィド結合したヘテロダイマーであり、アミノ酸Ｒ４９４とＶ４９５の間の開列により、４６３アミノ酸のα−サブユニットと２３４アミノ酸のβ−サブユニットに開裂することができる。α鎖のＮ末端は、メチオニン基で始まる３１アミノ酸により先行される。このセグメントは、３１アミノ酸のシグナル配列を含む。α鎖はアミノ酸３２で始まり、４つのクリングルドメインを含む。いわゆる「ヘアピンドメイン」は、アミノ酸７０〜９６から成る。クリングル１ドメインは、アミノ酸１２８〜２０６から成る。クリングル２ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸２１１〜２８８から成り、クリングル３ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸３０５〜３８３から成り、クリングル４ドメインはおおよそα鎖のアミノ酸３９１〜４６９から成る。これらの配列にはバリエーションが存在し、本質的にＮＫポリペプチドの生物学的特性に影響を及ぼさない（特に、ＨＧＦに対するアンタゴニスト活性及び抗血管形成活性に影響を及ぼさない）。そのバリエーションは、例えばＷＯ９３／２３５４１号に記載されている。また、生物学的特性に影響を及ぼさない限り、ＮＫポリペプチドの長さは、２、３のアミノ酸の範囲内で変わり得る。
ＮＫ１はＨＧＦ／ＳＦα−鎖のａａ３２から２０６〜２１０から成り、ＮＫ２はａａ３２から２８８〜３０５から成り、そしてＮＫ４はａａ３２から４４７（それぞれ、４６９〜４９４）から構成される。本発明の核酸によりコードされ且つ本発明の組み換え技術により産生することのできる更なるＮＫポリペプチドは、ＷＯ９３／２３５４１に記載され、例えば３２〜２０７、３２〜３０３、又は３２〜３８４である。ＮＫポリペプチドは、腫瘍成長、血管形成及び／又は転移の阻害をもたらすｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性を有する。
ＮＫ４ポリペプチドは、原核生物において組み換え手段により産生することができる。原核宿主細胞における発現では、核酸は当業者に良く知られた方法により適切な発現ベクターに組み込まれる。そのような発現ベクターは、好ましくは制御／誘導プロモーターを含む。次に、発現のために組み換えベクターを適切な宿主細胞、例えばＥ．コリに導入し、異種遺伝子の発現を可能にする条件下で形質転換細胞を培養する。発酵後に、変性したＮＫポリペプチドを含む封入体を単離する。
例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトミセス属（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又はバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が、原核宿主生物として適切である。ＮＫポリペプチドの産生のために、本発明のＮＫポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを通常の方法で原核生物に形質転換し、その後通常の方法で発酵させる。しかし、元のＮＫポリペプチドのＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ７３２３９）を用いたＥ．コリにおける発現量は非常に低い。
発現する遺伝子がシグナル配列を含まないため、封入体は細胞質中に見出される。これらの封入体は、例えば細胞溶解後の遠心分離により、他の細胞成分から分離される。
変性剤、例えば、好ましくはＤＤＴ（ジチオ−１，４−トレイトール）の存在するｐＨ７〜９の６Ｍグアニジン塩酸塩又は８Ｍ尿素／リン酸バッファー（好ましくは、０.１〜１.０Ｍ、例えば０.４Ｍの濃度）を添加することにより、封入体を溶解させた。この可溶化物を、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ（好ましくは、２〜２０ｍＭのグルタチオン）及び非変性濃度の変性剤（例えば、２Ｍのグアニジン塩酸塩又は４Ｍの尿素）又は好ましくはグアニジン塩酸塩若しくは尿素の代わりに約０.３〜１.０Ｍ、好ましくは約０.７Ｍの濃度のアルギニンの存在する、ｐＨ７〜９のリン酸バッファーに希釈する。再生は、好ましくは約４℃の温度で約４８〜１６０時間実施する。
技術水準によると、可溶化及び再生におけるＴＲＩＳバッファーの使用は、かなりの量（約５０％）の副産物を生じさせる。この副産物は、主にＧＳＨ修飾ＮＫポリペプチドから成るものとして発明者により同定されている。それとは反対に、驚いたことに、ｐＨの範囲が７〜９、好ましくは８〜９のリン酸カリウムバッファーの使用により、ＮＫポリペプチドの収量及び純度がかなり向上することが見出された。
再生が終了した後、好ましくはｐＨ７〜９のリン酸バッファー（好ましくは、０.１〜１.０Ｍ、例えば０.３Ｍの濃度）に対して少なくとも２４時間、好ましくは２４〜１２０時間、この溶液を透析した。
組み換え体の産生及び水不溶性変性ポリペプチド（封入体）の再生の後に、ＮＫポリペプチドを本発明の方法に従って精製することができ、好ましくはクロマトグラフィー法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫沈降、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動、選択的沈殿、電気泳動などによる。疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、好ましくはリン酸バッファーの存在下でｐＨ７〜９において、そして／或いは、ブチルセファロース又はフェニルセファロースを用いることにより、ＮＫポリペプチドを精製することが好ましい。
下記の実施例、参考文献、図及び配列表を、本発明の理解を助けるために提供し、本発明の真の範囲は添付した特許請求の範囲において記載する。本発明の精神から逸脱することなく、記載した方法における変更が可能であることが理解される。
配列の説明
配列番号１：ＨＧＦのα−鎖をコードするＤＮＡ配列及びアミノ酸配列、元の配列はＧｅｎＢａｎｋ Ｍ７３２３９に従っている（シグナル配列は含まない）
配列番号２：ＨＧＦのα−鎖のタンパク質配列
配列番号３：本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（Ｎ末端のメチオニンを含むアミノ酸配列、２つの終止コドンを含むＤＮＡ配列）
配列番号４：ＮＫ４のタンパク質配列
配列番号１：ＨＧＦのα−鎖をコードするＤＮＡ配列及びアミノ酸配列、元の配列はＧｅｎＢａｎｋ Ｍ７３２３９に従っている（シグナル配列は含まない）
配列番号２：ＨＧＦのα−鎖のタンパク質配列
配列番号３：本発明のＮＫ４をコードするＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（Ｎ末端のメチオニンを含むアミノ酸配列、２つの終止コドンを含むＤＮＡ配列）
配列番号４：ＮＫ４のタンパク質配列
実施例１
ＮＫポリペプチドの組み換え体の発現
ＨＧＦのアミノ酸位置３２〜４７８から成るＮＫ４ポリペプチドを、クローニング及び大腸菌における組み換え体の発現に用いた。ＤＮＡのソースとして用いた元のＤＮＡ配列については記載されている（データベース識別子「ｇｂ：Ｍ７３２３９」）。ＮＫ４をコードするＤＮＡ（配列番号：１）を増幅し、同時に変更するために、ＰＣＲを実施した。全ての方法を標準条件下で実施した。
ＮＫポリペプチドの組み換え体の発現
ＨＧＦのアミノ酸位置３２〜４７８から成るＮＫ４ポリペプチドを、クローニング及び大腸菌における組み換え体の発現に用いた。ＤＮＡのソースとして用いた元のＤＮＡ配列については記載されている（データベース識別子「ｇｂ：Ｍ７３２３９」）。ＮＫ４をコードするＤＮＡ（配列番号：１）を増幅し、同時に変更するために、ＰＣＲを実施した。全ての方法を標準条件下で実施した。
ＮＫ４の元のＤＮＡ配列との比較において、下記の変更を導入した：
− 真核生物のシグナルペプチド配列を除去し、ＮＫ４のアミノ酸位置３２の隣にＡＴＧ開始コドンを融合すること
− タンパク質産物（Ｍｅｔの含まれていない）の均質性を向上させるために、アミノ酸位置３２（配列番号：２における位置２）をＧｌｎからＳｅｒに置換すること
− Ｅ．コリにおける遺伝子発現を向上させるために、位置３３（ＡＧＧからＣＧＴ）、３５（ＡＧＡからＣＧＴ）、及び３６（ＡＧＡからＣＧＴ）におけるアミノ酸のコドンのＤＮＡ配列を変更すること
− ＰＣＲ産物のベクターへの挿入を容易にするために、位置４７７（ＡＴＡからＡＴＣ）及び４７８（ＧＴＣからＧＴＴ）におけるコドンのＤＮＡ配列を変更すること
− ＮＫ４タンパク質ドメインの終点に対応する位置で翻訳を止めるために、位置４７９（ＴＡＡ）及び４８０（ＴＡＧ）に２つの翻訳終止コドンを導入すること。
− 真核生物のシグナルペプチド配列を除去し、ＮＫ４のアミノ酸位置３２の隣にＡＴＧ開始コドンを融合すること
− タンパク質産物（Ｍｅｔの含まれていない）の均質性を向上させるために、アミノ酸位置３２（配列番号：２における位置２）をＧｌｎからＳｅｒに置換すること
− Ｅ．コリにおける遺伝子発現を向上させるために、位置３３（ＡＧＧからＣＧＴ）、３５（ＡＧＡからＣＧＴ）、及び３６（ＡＧＡからＣＧＴ）におけるアミノ酸のコドンのＤＮＡ配列を変更すること
− ＰＣＲ産物のベクターへの挿入を容易にするために、位置４７７（ＡＴＡからＡＴＣ）及び４７８（ＧＴＣからＧＴＴ）におけるコドンのＤＮＡ配列を変更すること
− ＮＫ４タンパク質ドメインの終点に対応する位置で翻訳を止めるために、位置４７９（ＴＡＡ）及び４８０（ＴＡＧ）に２つの翻訳終止コドンを導入すること。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｎＩＩで処理し、改変したｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）（Ｈｉｓ−ｔａｇ及びＤＨＦＲコード領域を除去）に連結した。この改変したｐＱＥベクターは、ＮｄｅＩ及びＢａｎＩＩで適切に処理した。発現用プラスミドであるｐＱＥ−ＮＫ４−Ｓｅｒ（プラスミドサイズは４４４７ｂｐ）のエレメントは、Ｔ５プロモータ／ｌａｃオペレータエレメント、ＮＫ４をコードする領域、ラムダｔ.ｏ.転写終結領域、ｒｒｎＢ Ｔ１転写終結領域、複製に関するＣｏｌＥ１起点、及びβ−ラクタマーゼをコードする配列である。
Ｅ．コリのコンピテントセル、例えば発現ヘルパープラスミドｐＵＢＳ５２０（ＥＰ０３７３３６５）を有するＥ．コリ株Ｃ６００を形質転換するために、ライゲーション反応を用いた。Ｅ．コリのコロニーを単離し、それらのプラスミドの制限酵素及び配列分析に関して特性を明らかにした。適切な抗生物質の存在するＬＢ培地において組み換え細胞を培養した後で、且つＩＰＴＧ（１ｍＭ）の添加により遺伝子発現を誘導した後に、ＮＫ４タンパク質含量を分析することにより、クローンの選択を実施した。細胞溶解物のタンパク質パターンをＰＡＧＥにより比較した。最も高い比率のＮＫ４タンパク質を示す組み換えＥ．コリのクローンを、産生方法用に選択した。標準条件下で発酵を実施し、封入体を単離した。収率：細胞の正味重量は１３０ｇ／ｌで、全タンパク質中のＮＫ４は３０〜４０％。
ＮＫ１及びＮＫ２は、類似の方法で組み換え技術により産生することができる。
実施例２
可溶化及び再生
６Ｍのグアニジン塩酸塩、ｐＨ８.５の０.１Ｍリン酸カリウム（１０ＭのＫＯＨを用いた滴定による）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０１ｍＭのＤＴＴを含むバッファーに、封入体を一晩溶解した。溶解したタンパク質の濃度を、ビウレット試験により決定し、最終的に室温で２５ｍｇ 全タンパク質／ｍｌの濃度に調節した。
可溶化及び再生
６Ｍのグアニジン塩酸塩、ｐＨ８.５の０.１Ｍリン酸カリウム（１０ＭのＫＯＨを用いた滴定による）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０１ｍＭのＤＴＴを含むバッファーに、封入体を一晩溶解した。溶解したタンパク質の濃度を、ビウレット試験により決定し、最終的に室温で２５ｍｇ 全タンパク質／ｍｌの濃度に調節した。
０.７Ｍのアルギニン、ｐＨ８.５の０.１Ｍリン酸カリウム（濃塩酸を用いた滴定による）、１０ｍＭのＧＳＨ、５ｍＭのＧＳＳＧ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファー中に、このＮＫ４可溶化物を希釈して０.４ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この再生試験試料を、４℃で２〜８日間インキュベートした。最大の再生効果を得た後、接線流濾過ユニット（ＭＷカットオフ：１０ｋＤａ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、１５ｌの体積の再生試験試料を３ｌにまで濃縮した。その後、少なくとも３×２４時間、最適には合計で５日間、ｐＨ８.０で０.３Ｍのリン酸カリウムを含む５０ｌのバッファーに対して３回透析をした。
実施例３
精製
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーにより、精製を実施した。
精製
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーにより、精製を実施した。
バッファー条件：
バッファーＡ：ｐＨ８.０の５０ｍＭ トリス
バッファーＢ：ｐＨ８.０の５０ｍＭ トリス、２Ｍ ＮａＣｌ
バッファーＡ：ｐＨ８.０の５０ｍＭ トリス
バッファーＢ：ｐＨ８.０の５０ｍＭ トリス、２Ｍ ＮａＣｌ
グラジエント：
５〜２５％ バッファーＢ、２カラム容積
２５〜６０％ バッファーＢ、１６カラム容積
６０〜１００％ バッファーＢ、０.７カラム容積
１００％ バッファーＢ、２カラム容積
５〜２５％ バッファーＢ、２カラム容積
２５〜６０％ バッファーＢ、１６カラム容積
６０〜１００％ バッファーＢ、０.７カラム容積
１００％ バッファーＢ、２カラム容積
１Ｍの硫酸アンモニウム／ｐＨ８.０の０.１Ｍリン酸カリウムを、その溶出した物質に添加し、４℃で一晩インキュベートした。サンプルを遠心分離し、上清をフェニルセファロースカラム（１５０ｍｌ）に充填した。１カラム容量の１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ８.０の５０ｍＭリン酸カリウムで、カラムを洗った。
溶出条件：
バッファーＡ：１Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ８.０の５０ｍＭリン酸カリウム
バッファーＢ：ｐＨ８.０の５０ｍＭリン酸カリウム、４０％のエチレングリコール
０〜１００％のバッファーＢ、２０カラム容量
バッファーＡ：１Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ８.０の５０ｍＭリン酸カリウム
バッファーＢ：ｐＨ８.０の５０ｍＭリン酸カリウム、４０％のエチレングリコール
０〜１００％のバッファーＢ、２０カラム容量
実施例４
活性の決定
ａ）細胞分散試験
ＭＤＣＫ細胞を、組織培養プレート中でサブコンフルエントに（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔｌｙ）成長させた。細胞をＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＧＦとＮＫ４との組み合わせにより処理した。これらの実験においては、ＨＧＦ誘導細胞の分散は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４の添加により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。
活性の決定
ａ）細胞分散試験
ＭＤＣＫ細胞を、組織培養プレート中でサブコンフルエントに（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔｌｙ）成長させた。細胞をＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＧＦとＮＫ４との組み合わせにより処理した。これらの実験においては、ＨＧＦ誘導細胞の分散は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４の添加により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。
ｂ）増殖試験
Ｎａｋａｍｕｒａ他（１９８９）に記載されているように、初代培養における成体ラット肝細胞のＤＮＡ合成を測定することにより、ＮＫ４によるＨＧＦの有糸分裂活性の阻害を決定した。これらの実験においては、ＨＧＦ誘導細胞の増殖は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４の添加により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。
Ｎａｋａｍｕｒａ他（１９８９）に記載されているように、初代培養における成体ラット肝細胞のＤＮＡ合成を測定することにより、ＮＫ４によるＨＧＦの有糸分裂活性の阻害を決定した。これらの実験においては、ＨＧＦ誘導細胞の増殖は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４の添加により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。
ｃ）浸潤試験
この試験においては、腫瘍細胞の浸潤能力を分析した。この試験は、ＨＴ１１５細胞を用いて、基本的にＡｌｂｉｎｉ，Ａ．，他（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７(１９８７)３２３９−３２４５）に記載の通りに行った。この場合も、ＨＧＦ誘導（１０ｎｇ／ｍｌ）細胞の浸潤は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。
この試験においては、腫瘍細胞の浸潤能力を分析した。この試験は、ＨＴ１１５細胞を用いて、基本的にＡｌｂｉｎｉ，Ａ．，他（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７(１９８７)３２３９−３２４５）に記載の通りに行った。この場合も、ＨＧＦ誘導（１０ｎｇ／ｍｌ）細胞の浸潤は、１０〜１０００倍モルの過剰のＮＫ４により、少なくとも９０％以上が阻害され、機能的活性を示した。
実施例５
ｉｎ ｖｉｖｏでの活性
ｉｎ ｖｉｖｏでの活性
Claims (4)
- 肝細胞成長因子のα−鎖又はそのＮ末端フラグメントをコードする核酸であって、当該核酸において、位置３３、３５及び３６のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも１つがＣＧＴであることを特徴とする核酸。
- 位置３３、３５及び３６のアミノ酸のコドンがＣＧＴであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
- 肝細胞成長因子のα−鎖又はそのＮ末端フラグメント（ＮＫポリペプチド）を、微生物宿主細胞における当該ＮＫポリペプチドをコードする核酸の発現、変性型の当該ＮＫポリペプチドを含む封入体の単離、封入体の可溶化、及び変性したＮＫポリペプチドの再生により産生するための方法であって、当該核酸において、位置３３、３５及び３６のコドンから成る群から選択されるアミノ酸のコドンの少なくとも１つがＣＧＴであることを特徴とする方法。
- 位置３３、３５及び３６のアミノ酸のコドンがＣＧＴであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
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