SK11652003A3

SK11652003A3 - PEG-konjugáty HGF-NK4

Info

Publication number: SK11652003A3
Application number: SK1165-2003A
Authority: SK
Inventors: Michael Brandt; Apollon Papadimitriou
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2004-05-04
Also published as: US20030012775A1; CA2438308A1; PA8540501A1; BR0207510A; JP2004521139A; MXPA03007130A; AU2002233354B2; CN1571679A; PL367402A1; HUP0400979A2; EP1389132A2; CZ20032511A3; RU2293574C2; EP1234583A1; MA26998A1; US7846896B2; BG108125A; GT200200038A; NO20033737D0; PE20020992A1

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka konjugátov N-terminálneho fragmentu rastového faktora hepacytov obsahujúceho štyri kringle domény (NK4) s polyetylén glykolom(PEG), ich farmaceutických preparátov, spôsobov prípravy a spôsobov použitia.

Doterajší stav techniky

Rastový faktor hepatocytov (HGF/ SF)je polypeptid identifikovaný a purifikovaný Nakamurou, T., et al. , Biochem. Biophys.Res. Commun. 22 (1984) 1450-1459. Ďalej bolo zistené, že rastový faktor hepatocytov je identický s rozptylovacim faktorom (SF), Weidner, K.M., et al. , Proc. Nad. Acad.Sci. USA (1991) 7001-7005. HGF je glykoproteín s molekulovou váhou zhruba 100 kDa, ktorý hrá rolu vo vývoji celej rady bunkových fenotypov zahŕňajúcich proliferáciu, mitogenéziu, tvorbu vetviacich kanálikov a v prípade nádorových buniek inváziu a metastázovanie. Prehľad problematiky viz Stuart, K.A., et al., International Journal of Experimental Pathology 81 (2000) 17-30. Potkaní HGF i ľudský HGF boli sekventované i klonované (Miayzawa, K.et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989)

967-973; Nakamura, T., et al., Náture 342(1989) 440-443; Seki, T., et al., Biochem. Biophys.Res.Comm. 172(1990) 321-327;

Tashiro, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 32003204; Okajima, A., et al., Eur. J. Biochem. 193 (1990) 375-381.

Farmakokinetické a farmakologické účinky HGF postrádajúce prvých päť N-terminálnych aminokyselín (dHGF) boli skúmané autormi Uematsu, Y., et al., J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131135. Bolo zistené, že sérové koncentrácie dHGF sa rýchlo znížili a preto ako spôsob podávania boli preferované infúzie proti bolusovým injekciám.

Patent U.S. Patent Č. 5, 977,310 popisuje HGF modifikovaný pomocou PEG. Tento HGF modifikovaný pomocou PEG má za podmienok v vivo predĺžené odbúravanie a rovnakú fyziologickú aktivitu ako HGF. Ale podlá patentu U.S. Patent č. 5,977,310 je možné predĺžiť polčas HGF len z 59,2 minút na 76,7 minút alebo respektíve 95,6 minút (viz príklad 5 patent U. S. Patent č. 5,977,310). Ďalej je v tomto patente navrhované, že molárne množstvo

PEG činidla môže byť vybrané z rozpätia od 5 do 100 násobnej molárnej váhy HGF. V prípade modifikujúcej amino skupiny preferované lyzínu alebo N-terminálneho molárne rozpätie PFG činidla konca proteína je od 10 do 25 násobku molekulovej váhy HGF. Molekulová bola zhruba kDa. Spôsoby pre váha pripojeného PEG reťazca syntéziu konjugátov zložených z PEG a polypeptidov, ako sú napríklad HGF, sú tiež popísané v patente WO 94/13322. Tieto konjugáty sú spolu spojené v napred definovaných pozíciách, pretože náhodná konjugácia vedie podľa autorov k začleneniu polymérnych častí do domény molekúl tak, že spôsobujú terapeutické alebo diagnosticky požadované aktivity. Molekuly môžu následne získať predĺžený polčas in vivo a v prípade héterologných bielkovín zníženú imunogenicitu, ale za cenu významnej alebo celej straty požadovaných biologických aktivít (viz napr. Kitamura, K., et al, Cancer Res. 51 (1991) 4310-4315; Maiti, P.K., at al. , Int.

J. Cancer Suppl. 3 (1988) 17-22. PEGylovaný IFN-α vykazuje napríklad len 7% účinnosť v porovnaní s nonPEGylovaným IFN-a (Bailon, P., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195-202.

Ďalej bolo zistené, že fragment HGF/SF označovaný NK4, zložený z N-terminálnej stočenej domény Štyroch kringle domén HGF/SF má farmaceulogické vlastnosti, ktoré sú celkom odlišné od vlastností HGF/SF a je antagonistom vplyvu HGF/SF na motilitu a inváziu nádorových buniek tlstého čreva a je naviac inhibítorom angiogenézie a potlačuje nádorový rast

a metastázovanie	(WO 93/23541;	Parr,	C., et al.,	Int.	J.
Cancer 85 (2000)	563-570; Kuba,	K. ,	et al.,Cancer	Res.	60
(2000)6737-6743;	Dáte, K. , et al.	, FEBS	Letters 420	(1997)	1-

6; Dáte, K., et al. , Oncogene 17 (1989) 3045-3054; Tomioka, D., et al., Cancer Res. 61 (2001) 7518-7524).

Ako vyplýva z práce autorov Kuba, K., et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743, musel byť NK4 vo zvieracích experimentoch pre detekciu účinku NK4 na pľúcne metastázy infudovaný kontinuálne po dobu dvoch týždňov.

Je známe, že pripojenie polymérov k určitým polypeptidom môže zvýšiť ich sérový polčas. Toto bolo zistené napríklad pre PEGylovaný Interleukín-6 (EP 0442724) alebo Interleukin-2 (WO 90/07938) a erytropoetín (WO 01/02017). Ale pripojený polyetylén glykolu a iných polymérov neviedlo nezbytne k predĺženiu ich sérového polčasu. Je známe napríklad, že konjugácia odlišných polyetylén glykolov k interleukinu-8, GCSF a iným interleukínom vedie k produkcii molekúl s horšenými vlastnosťami (Mehvar, R., J.Pharm. Pharm. Sci. 3(1) (2000) 125136. Výsledok PEGylácia polypeptidu je teda vysoko nepredvídateľná. Gaertner, H.F., Offord, R.E., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44 popisujú pripojenie PEGu k špecifickému miestu amino konca bielkovín. Gaertner et al. uvádzajú (ako už bolo zmienené v patente WO 94/13222, viz. vyššie), že PEGylácia predstavuje veľký problém pokial miesta pripojenia nemôžu byť presne kontrolované, pretože toto môže mať veľký dopad na stabilitu a funkciu proteina.

Francis, G.E., et al. , Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18, predkladajú prehľad PEGyláciu cytokinov a ďalších terapeutických bielkovín. Francis et al. uvádzajú, že u väčšiny metód PEGylácie bolo zaznamenané významné zníženie bioaktivity (typicky 20 - 95 %). Podľa Francise et. al. je

PEGylácia bielkovín vždycky založená na metóde pokusu a omylu a skutočne všetky parametry tiež PEGylácie môžu mať prekvapivo veľmi výrazný účinok na funkčnosť produktu. Tsutsumi, Y., et al. , Thromb. Haemost. 77 (1997) 168/173, popisujú PEGyláciu

Interleukínu -6. Podlá autorov Tsutsumi et al. bolo 54 % lyzínových amino skupín IL-6 spojené s PEG o molekulovej váhe 5 kDa na PEG skupinu. Tsutsumi et al. , v proc. Natl . Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553, popisujú chemickú modifikáciu immunotoxína pomocou PEGu. Pretože náhodná PEGylácia bola združená s výraznou stratou špecifickej cytotoxickej aktivity, uskutočnil Tsutsumi špecifickú PEGyláciu za použitia imunotoxínovej mutanty s jedným alebo dvomi cysteínmi naviac, pre pripojenie PEGu. Heinzerling, L., et al., ktoré sú použité

Dermatol. 201 pripojenie PEGu k Interferónu a s molekulovou váhou 5 kDa.

Tsutsumi, Y., et al. popisujú v J.Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 1006-1011, modifikáciu TNF-α pomocou PEGu, kde molekulová váha použitých PEGových skupín je opäť 5 kDa. Pretože aplikovaný PEGylovaný TNF-oc má molekulovú váhu aspoň 8 4 kDa (molekulová váha TNF-a je 17 kDa), je k TNF-α pripojené aspoň 13 5-kDa PEGových skupín.

PEGylácia bielkovín a následné farmakologické účinky sú tiež zhrnuté autorom Reddy, K.R., Ann. Pharmacotherapy 34 (2000)

915-923. Opäť je uvádzané, že PEGylácia terapeutických bielkovín musí byť hodnotená opatrne. Každý proteín je podlá autorov Reddy et al. odlišný, vyžaduje odlišnú optimalizáciu chemických podmienok a preto nemôže byť vplyv PEGylácie predpovedaný.

Cieľom predkladaného vynálezu bolo nájsť vylepšené polypeptidy s NK4 aktivitou a ich farmaceutické preparáty, ktoré môžu byť podané len ako niekoľko bolusových aplikácií za týždeň a/lebo vo velmi nízkych dávkach, ktoré sú schopné potlačiť nádorový rast, angiogenéziu a metastázovania.

^Sepd.3· vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje NK4 konjugáty zložené z NK4 kovalentne spojených s jednou polyetylén glykolovou (PEG) skupinou o zhruba 20-40 kDa (monoPEGylovaný NK4), prednostne cez ε-amino skupinu NK4 lyzínu alebo N-terminálnu amino skupinu. Najprednostnejšie je NK4 náhodne PEGylovaný na jednej amino skupine skupiny obsahujúcej ε-amino skupiny NK4 lyzín Nterminálnej amino skupiny. Prekvapivo bolo zistené, že monoPEGylovaný NK4 podlá vynálezu má lepšie vlastnosti, čo sa týka terapeutickej použiteľnosti NK4 alebo iných PEGylovaných NK4 .

Vynález ďalej zahŕňa . spôsob monoPEGylovaného NK4 podľa vynálezu.

Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické preparáty obsahujúce monoPEGylovaný NK4.

Vynález ďalej zahŕňa spôsoby prípravy farmaceutických preparátov obsahujúcich monoPEGylovaný NK4.

Vynález ďalej zahŕňa spôsoby liečenia ľudských nádorov (napr.

prostaty, pankreatu alebo tlstého čreva) monoPEGylovaného tým, že farmaceutický

NK4 je podané v jednej až účinné množstvo siedmi bolusových aplikáciách za týždeň pacientovi, ktorý tuto liečbu potrebuje.

Bolo prekvapivo zistené, že celé množstvo náhodne PEGylovaného NK4 podľa vynálezu, ktoré má byť podané behom liečby, je významne nižšie v porovnaní s aplikáciou nePEGylovaného NK4. Preto množstvo PEGylovaného NK4 používaného vo farmakologickej liečbe je zhruba 50 % alebo menej, prednostne zhruba 20 % alebo menej, najprednostnejšie zhruba .10 % alebo menej, než je vyžadované množstvo nePEGylovaného NK4.

Detailný popis vynálezu

Ľudský HGF je disulfidicky spojený heterodimér, ktorý môže byť štiepený v α-podjednotke 463 aminokyselín a β-podjednotke 234 aminokyselín štiepením medzi aminokyselinami R494 a V495. Nkonca α-reťazca predchádza 31 aminokyselín počínajúcich metióniovou skupinou. Tento segment zahŕňa signálnu aminokyselín, α-reťazec začína aminokyselinou 32 štyri kringle domény. Takzvaná „stočená doména sekvenciu a obsahuje sa skladá z aminokyselín 70-96. Približne platí, že kringle 1 doména sa skladá z aminokyselín 128-206. Kringle doména sa skladá aminokyselín doména sa skladá aminokyselín

305-383, kringle doména sa skladá aminokyselín

391-469 a-reťazca.

Existujú varianty týchto sekvencii v zásade neovplyvňujúcich biologické vlastnosti NK4 (najmä neovplyvňujú jeho antagonistické aktivity voči HGF a jeho antiangiogenné aktivity), a tieto varianty sú popísané napríklad v patentu WO 93/23541. Tiež dĺžka NK4 sa môže líšiť o niekoľko aminokyselín pokiaľ nie sú ovplyvnené jeho biologické vlastnosti.

NK4 je tvorený N-terminálnymi 447 aminokyselinami HGF/SFareťazca, ktorý zahŕňa vyššie zmieňanú doménu štyroch kringle domén. Môže byť pripravený rekombinantne, buď tvorbou rekombinatného ľudského HGF/SF a natrávenim elastázou (Dáte,

K. , FEBS Letters 420 (1997) 1-6 alebo rekombinantnou expresiou NK4 kódujúcou nukleové kyseliny v príslušnej hostiteľskej bunke, ako je napísané nižšie. NK4 glykoproteín má molekulovú váhu zhruba 57 kDa (52 kDa má samotná polypetidová časť) a má in vivo biologickú aktivitu spôsobujúcu inhibíciu nádorového rastu, angiogenézie a/lebo metastázovania.

„MonoPEGylovaný NK4, ak je tu tento termín používaný znamená, že NK4 má pripojenou kovalentne jednu plyetylén glykolovú skupinu s molekulovou váhou od 20 do 40 kDa. Skupina môže byť pripojená, prednostne náhodne, na odlišných miestach NK4 molekuly, ale prednostne na naj reaktívnejšich miestach, napr. lyzínovych postranných reťazciach N-terminálnej aminoskupiny. MonoPEGylovaný NK4 (ktorý je preto prednostne zmesou monoPEGylovených NK4 molekúl, PEGylovaných na odlišných miestach, ktoré sú ε-amino skupinami NK4 lyzínu N-terminálnej amino skupiny) je aspoň 90 % prípravok najprednostnejšie monoPEGylovaný NK4 je 92 % alebo viacej percentný prípravok. MonoPEGylované NK4 prípravky podľa vynálezu sú preto významne dostatočne homogenné, aby vykazovali výhody homogenného prípravku vo farmaceutickom použití.

Termín „významne homogénny, ako je tu používaný, znamená, že molekuly PEG-NK4 konjugátu, ktoré sú produkované, obsiahnuté alebo používané, sú len ty, ktoré majú pripojenú jednu PEG skupinu. Prípravok môže obsahovať nezreagovaný (t.j.

postrádajúci PEG skupinu), proteín. Ako bolo overené peptidovým mapováním a N-terminálnym sekvenovaním, jeden príklad uvedený nižšie poskytuje prípravok, ktorý je aspoň z 90 % monoPEG-NK4 konjugát a obsahuje najviac 2 % nezreagovaný proteín.

Molekuly PEG polyméru požívané podľa vynálezu majú molekulovú váhu zhruba od 20 do 40 kDa, pričom preferované sú PEG polyméry so zhruba 20,· 30 alebo 40 kDa (termín „molekulová váha, ako je tu používaný, znamená molekulovú váhu PEG; termín „zhruba ukazuje, že v uvedených prípravkoch, budú niektoré molekuly vážiť viacej a niektoré menej, než je uvádzaná molekulová váha).

Termín „PEG alebo PEG skupina podlá vynálezu znamená rezíduum obsahujúci polyetylén glykol) ako hlavnú súčasť. Taký PEG môže ďalej obsahovať chemické skupiny, ktoré sú nezbytné pre väzobné reakcie; ktorý vzniká z chemickej syntézy molekuly; alebo ktorý je dištančným prvkom pre optimálnu vzdialenosť molekuly. Naviac sa môže taký Peg skladať z jedného alebo viacej vedľajších reťazcov PEGu,

Molekuly PEGu z viacej než jedným ktoré sú spolu spojené.

PEG reťazcom, sú nazývané vetvené molekuly PEGu. Vetvené molekuly PEGu môžu byť pripravené napríklad pridaním polyetylén oxidu k rôznym polyolom, zahŕňajúcich glycerol, pentaerytriol a sorbitol.

Napríklad

PEG so vetvami môže s pentaerytriolu a etylén oxidu.

Vetvené molekuly PEGu sú popísané napríklad v patente EP-A

Č. 5,932,462. Zvlášť preferované

0473084 a patente US Patent sú molekuly PEGu s dvomi postrannými reťazcami primárnych aminoskupín

PEGu (PEG2) spojené (Monfardini, prostredníctvom

Bioconj ugate

Chem. 6 lyzínu al. , (1995)

62-69). Ako polyméry

PEGu molekuly, ako sú preferované lineárne polyméry PEGu s molekulovou váhou viacej než 30 s molekulovou váhou 20-30 kDa

PEG kDa najmä 40 kDa, sú preferované vetvené molekuly PEGu. Ako

PEG 40 kDa je najmä preferovaný PEG (PEG2).

Podľa vynálezu je poskytovaný spôsob tvorby významne homogenného monoPEGylovaného NK4. PEGylácia NK4 môže byť uskutočnená podľa spôsobu známym v obore, napríklad reakciou NK4 s elektrofilne aktívnymi molekulami PEGu (dodavatel: Shearwater Corp., USA, www.shearwatercorp.com). Preferované činidlá PEG sú napr. N-hydroxysukcinimidyl propionáty (PEG-SPA) alebo butanoáty (PEG-SBA) alebo vetvené N-hydroxysukcinimidy, ako sú napríklad mPEG2--NHS (Monfardini, C., et all., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Tieto metódy vedú k vzniku

NK4 polypeptidu, ktorý je náhodne PEGylovaný na ε-amino skupine NK4 lyzínu alebo na N-terminálnej amino skupine. Nie náhodne môže byť N-terminálne PEGylovaný NK4 produkovaný podľa patentu WO 94/01451.

V preferovanej forme vynálezu je uvedený NK4 kovalentne spojený do jednej poly (etylén glykolovej) skupiny so vzorcom.

-CO- (CH₂)_x- (OCH₂CH₂)_ra-OR s-CO (t.j. kabonyl) poly(etylén glykolovej) skupinou vytvárajúci amidovú väzbu s jednou z aminoskupín NK4; R je nižší alkyl: x je 2 alebo 3; m je od zhruba 450 do zhruba 950; n a m sú zvolené tak, že molekulová váha konjugátu mínus NK4 proteín je od zhruba 20 do 40 kDa. Ako amino skupina NK4 εamino skupiny NK4 lyzínu je dostupná (volná) aminoskupina. Špecifickejšie môžu byť vyššie uvedené konjugáty reprezentované vzorcom (I)

P-NHCO- (CH₂)_x- (OCH₂CH₂)_m-OR (I) kde P je skupina NK4 proteínu tu popísaná, (t. j. bez aminoskupiny alebo amino skupín, ktoré vytvárajú amidovú väzbu s karbonylom ako je uvedené vo vzorcu (I); kde R je nižší alkyl; x je 2 alebo 3; m je od zhruba 450 do zhruba 950 je zvolené tak, že molekulová váha konjugátu mínus NK4 proteín je od zhruba 20 do 40 kDa. Ako je tu používané, majú dané rozmedzie „m čisto orientačný význam. Rozmedzia „m sú určené v každom prípade a presne molekulovou váhou PEG skupiny.

V ďalšej prednostnej forme vynálezu je uvedený NK4 kovalentne spojený s jednou poly(etylén glykolovou) skupinou definovanou vzorcom (CH₂)yNHCO(OCH₂CH₂)nOR

kde y je 1 až 4 prednostne 4, n a p spolu sú zvolené tak, že molekulová váha konjugátu mínus NK4 proteín je od zhruba 20 do 40 kDa prednostne 40 kDa, n a p sa nelíši o viacej než 25 %, prednostne nie o viac než 10 %, na j prednostne j šie sú identické, a R je nižší alkyl.

Ako je tu používané, znamená „nižší alkyl lineárnu alebo vetvenú alkylovú skupinu majúcu od jedného do šiestich uhlíkových atómov (Ci-C₆ alkyl). Príklady nižších alkylových skupín zahŕňajú metyl, etyl, izopropyl. V schode s týmto vynálezom je R akýkoľvek nižší alkyl. Konjugáty, v ktorých je R metyl, sú preferované.

Symbol m reprezentuje počet etylén oxydových skupín (OCH₂CH₂) v poly(etylén oxidovej) skupine. Jednotlivá podjednotka PEG má molekulovú váhu zhruba 44 daltonov. Molekulová váha konjugátu (pri vylúčení molekulovej váhy NK4) teda závisí na počtu „m. V konjugátoch podlá tohto vynálezu je „m od zhruba 450 do zhruba 950 (odpovedajúci molekulovej váhe od zhruba 20 kDa do zhruba 40 kDa). Počet m je vybraný tak, že výsledný konjugát tohto vynálezu má fyziologickú aktivitu porovnateľnú s nemodifikovaným NK4, a táto aktivita môže reprezentovať rovnakú aktivitu, väčšiu aktivitu alebo len časť aktivity nemodifikovaného NK4. Molekulová váha „zhruba určitého čísla znamená, že je v rozumnom rozmedzí takého čísla, ako môže byť určené konvenčnými analytickými technikami. Číslo „m je vybraté tak, že molekulová váha každej poly(etylén glykolovej) skupiny kovalentno spojenej do NK4 proteínu je od zhruba 20 kDa do zhruba 40 kDa.

Zlúčenina definovaná vzorcom (I) môže byť pripravená napríklad zo známeho aktivovaného polymérneho materiálu:

v ktorom R a m sú. popísané vyššie, kondenzáciou zlúčeninou definovanou vzorcom II s NK4 proteínom. Zlúčeniny definované vzorcom (II), v ktorom x je 3, sú sukcinimidyl estéry alfanižšie alkoxymaslové kyseliny poly(etylén glykolu) (nižší alkoxy-PEG-SBA). Zlúčeniny definované vzorcom (II) v ktorých x je 2, sú sukcinimidyl estéry alfa-nižšie alkoxypropiónovej kyseliny poly(etylén glykolu) (nižšie alkoxy-PEG-SPA). Môže byť akýkoľvek konvenčný spôsob reakcie aktivovaného estéru s amínom za vzniku amidu. V reakcii popísanej vyššie, je sukcinimidyl estér s odstupujúcou skupinou spôsobujúcou vznik amidu. Použitie sukcinimidyl estérov, ako sú napríklad zlúčeniny definované vzorcom II, k tvorbe konjugátov s bielkovinami sú uvedené v patente U.S. Patent č. 5,672,662, vydaného 30. septembra 1997 (Harris, et al.).

Ľudský NK4 obsahuje 30 voľných ε-amino skupín 30 lyzínových rezíduí. Keď bolo PEGylačné činidlo skombinované zo zlúčeninou SBA definovanou vzorcom II, bolo zistené, že pri proteínovej koncentrácii zhruba 5-10 mg/ml, pri pH zhruba 7.0 až 8.0, pomere proteín:PEG zruba 1:3 a reakčnej teplote od 20-25°C bola produkovaná zmes mono-, di- a stopových množstvách triPEGylovaných zlúčenín. Keď bol pomer proteín:PEG zhruba 1:1 alebo 1:2 (napríklad prednostne zhruba 1:2 pre 30 kDa PEG-SBA a zhruba 1:5 pre 40 kDa PEG2-NHS), boli produkované primárne monoPEGylované zlúčeniny. Manipuláciou reakčných podmienok (napr. pomer činidiel pH, teplota, koncentrácia bielkoviny, čas reakcie, atd. ), môže byť optimalizované relatívne množstvo odlišných monoPEGylovaných zlúčenín. Podmienky sú typicky, ale vždy zhruba 8-12 mg/ml NK4 0,3 M fosforečnan draselný, pH 8, 25°C, reakčná doba 1 h. Za takýchto podmienok pri požití 30 kDa PEG-SBA (1:2, proteín:PEG), je výťažok zhruba 38 % monoPEGylovaného NK4.

MonoPEGylovaný NK4 môže byť tiež popísaných v patente WO 94/01451. spôsob prípravy rekombinantného produkovaný podľa

Patent WO 94/01451 spôsobov popisuj e terminálnou aminokyselinovou skupinou. Kroky metódy zahŕňajú polypeptidu s modifikovanou alfa-uhlíkovou reaktívnou vytvorenie rekombinantného polypeptidu a jeho ochranu jednou pridanými chrániacimi skupinami :

alebo viacerými na N-terminálnom biologicky alfa-amíne a C-terminálnom alfa-karboxyle.

byť potom podrobený reakcii s chemickou

Polypeptid môže chrániacou látkou, aby sa reťazec skupín, aby neboli potom naštiepený štiepiacim selektívne chránil postranný modifikované. Polypeptid je činidlom špecifickým pre biologické chrániace skupiny za vzniku nechránenej terminálnej aminokyselinovej alfa-uhlíkovej reaktívnej skupiny. Nechránená terminálna aminokyselinová alfa-uhlíková reaktívna skupina je modifikovaná chemicky modifikujúcou látkou. Postranný reťazec chráneného terminálne modifikovaného polypeptidu v jednej kópii je potom zbavený ochrany na skupinách postranného reťazca za vzniku terminálne modifikovaného rekombinantného polypeptidu o jednej kópii. Počet sekvenčných krokov v spôsobe sa môže líšiť, aby sa dosiahla selektívna modifikácia na N- a/lebo C-terminálnej aminokyseline polypeptidu.

Ďalšie preferované konjugáty podlá vynálezu obsahujú NK4 proteín, ktorý je kovalentne pripojený k nižšej-alkoxy poly(etylén glykolovej) skupine pomocou väzobnej skupiny definovanej vzorcom -C(O)-X-S-Ys C(0) väzobnej skupiny tvoriacu amidovú väzbu s amino skupinou NK4 (ako je zmienené vyššie, ε-amino skupina lyzínových rezíduí je dostupná), X is(CH₂)₂ —, alebo -CH₂ (O-CH₂-CH₂)k-, k je od 1 do 10, Y je alebo

priemerná molekulová váha polyetylén glykolovej) skupiny je od zhruba 2 0 kDa do zhruba 40 kDa a molekulová váha konjugátu je od zhruba 72 kDa do zhruba 92 kDa pri molekulovej váhe 52 kDa NK4 polypeptidu, alebo od 77 kDa do zhruba 97 kDa pri molekulovej váhe 57 kDa pre NK4 glykoproteín. Táto NK4 zlúčenina môže byť tiež reprezentovaná vzorcom (III).

P-NH-CO-X-S-Y- (OCH₂CH₂)_m-OR (III) kde R môže byť akýkoľvek nižší alkyl, ktorým je mienená lineárna alebo vetvená alkylová skupina majúca od jedného do šiestich uhlíkových atómov, ako sú napríklad metyl, etyl, izopropyl, atd. Preferovaný alkyl je metyl. X môže byť-(CH₂)_k-, alebo CH₂ (O-CH₂-CH₂)k-, kde k je od 1 do zhruba 10. Prednostne je k od 1 do zhruba 10, prednostne j šie je k 1 alebo 2. Na j prednostne j šie je X-(CH₂).

vo vzorci III je Y

viacej prednostne

Vo vzorci (III) je počet m vybratý tak, že výsledný konjugát tohto vynálezu má fyziologickú s nemodifikovaným

NK4, ktorá môže aktivitu porovnateľnú rovnakú reprezentovať aktivitu, väčšiu aktivitu alebo len časť nemodifikovaného NK4, m reprezentuje počet etylén aktivity oxydových reťazcov v PEG jednotke. Jednotlivá

PEG podjednotka PEG (OCH₂CH₂)- má molekulovú váhu zhruba 44 daltonov. Molekulová váha konjugátu (pri vylúčení molekulovej váhy NK4) teda závisí na počtu m. Molekulová váha „zhruba určitého čísla znamená, že je v rozumnom rozmedzí takého čísla, ako môže byť určené konvenčnými analytickými technikami. M je preto celé číslo v rozmedzí od zhruba 450 do zhruba 950 (čo odpovedá molekulovej váhe od zhruba 20 do zhruba 40 kDa). Prednostné NK4 bielkoviny definované vzorcom (III) sú reprezentované vzorcom:

Najprednostnejšie NK4 proteínové produkty sú reprezentované vzorcom:

Tieto NK4 bielkoviny môžu byť pripravené pomocou

a) kovalentnej reakcie voľnej amino skupiny, prednostne ε-amino skupiny lyzínu NK4 proteínu alebo N-terminálnej amino skupiny reprezentovanej vzorcom P-NH₂ s bifunkčným činidlom reprezentovaným vzorcom Z-CO-X-S-Q za vzniku medziproduktu s amidovou väzbou reprezentovaného vzorcom:

P-NH-CO-X-S-Q kde P je NK4 proteín bez amino skupiny, ktorá tvorí amidovú väzbu; Z je reaktívna skupina, napr. karboxylový-NHS estér; X je -(CH₂)_k- alebo -CH₂ (O-CH₂-CH₂)k-, kde k je z 1 do zhruba 10; Q je chrániaca skupina ako alkanoyl, napr. acetyl.

(b) kovalentnkovalentnou reakciou medziproduktu s amidovou väzbou z kroku (a) s aktivovaným polyetylén glykolovým derivátom reprezentovaným vzorcom W-[OCH₂CH₂]_m-OR za vzniku NK4 proteínového produktu reprezentovaného vzorcom:

v^x's'^Y+o^Mi^OftO kde i¥ je sulf hydrylová reaktívna forma Y; m je celé číslo v rozmedzí od zhruba 450 do zhruba 950; R je nižší alkyl; Y sú definované vyššie.

V tejto forme vynálezu je bifunkčné činidlo prednostne Nsukcinimidyl-S-acetyltiopropionát alebo N-sukcinimidyl-Sacetyltioacetát, Z je prednostne N-hydroxy-sukcinimid a aktivovaný polyetylén glykolový derivát W-[OCH₂CH₂]_m-OR je prednostne vybratý zo skupiny zloženej z jódo-acetyl-metoxyPEG, metoxy-PEG-vinylsulfonu a metoxy-PEG-maleimidu.

Detailnejšie môžu byť NK4 bielkoviny definované vzorcom (III) pripravené kovalentnou väzbou tiolovej skupiny s NK4 („aktivácia) a spojením výsledného aktivovaného NK4 proteínu s derivátom poly(etylén glykolu) (PEG). Prvý krok pre prípravu monoPEGylovaného NK4 podľa predkladaného vynálezu zahŕňa kovalentné pripojenie tiolovej skupiny prostredníctvom NH₂skupin NK4. Táto aktivizácia NK4 je uskutočnená s bifunkčnými činidlami, ktoré nesú chránenú triolovú skupinu a ďalšiu reaktívnu skupinu, ako sú napríklad aktívne estéry (napr. sukcinimidylestér), anhydridy, estéry sulfonových kyselín, halogenidy karboxylových kyselín a respektíve sulofonových kyselín. Tiolová skupina je chránená skupinami známymi v obore, napr. acetylovými skupinami. Tieto bifunkčné činidlá sú schopné reagovať s amino skupinami vytvorením amidovej väzby.

V prednostnej forme vynálezu je aktivácia amino skupinami uskutočnená reakciou s bifunkčnými činidlami majúcimi sukcinimidylovú skupinu. Bifunkčné činidlá môžu niesť odlišné dištančné prvky, napr. skupiny -(CH₂)_k- alebo -CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_kkde k je od 1 do zhruba 10, prednostne od 1 do zhruba 4, prednostnejšie 1 alebo 2, najprednostnejšie 1. Príklady týchto činidiel sú N-sukcinimidyl-S-acetyltiopropionát (SATP) a Nsukcinimidyl-S-acetyltioacetát (SATA)

O

Acetytioalkyl-karboxylový-NHS-estér , ako

or

NHS

Estér 2-(Acetyltio)- (etoxyj_k-kyseliny octovej s k definovaným vyššie.

Príprava bifunkčných činidiel je známa v obore. Prekurzory NHS-estérov 2-(acetyltio)- (etoxy)k-octovej kyseliny sú popísané v DE-3924705, zatial čo derivatizácia na acetyltio zlúčeninu je popísaná v publikácii March, J., Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376. SATA je komerčne dostupná (Molecular Probes, Eugene, OR, USA Pierce, Rockford, IL).

Pridanie len jednej tiolovej skupiny k NK4 molekule môže byť vybraté úpravou reakčných parametrov, t.j. koncentrácie proteínu (NK4) a pomeru proteín/bifunkčné činidlo.

Reakcia je uskutočnená napríklad vo vodnom pufre s pH 6,5-8,0, napr. v 10 alebo 100 mM fosforečnanu draselného, s alebo bez

300 mM NaCl, pH 7,3. Bifunkčné činidlo môže byť pridané v DMSO. Po ukončení reakcie, prednostne po 30 minútach, je reakcia zastavená pridaním lyzínu. Nadbytok bifunkčného činidla môže byť oddelený spôsobmi známymi v obore, napr. dialýzou alebo kolónovou filtráciou. Priemerný počet tiolových skupín pridaných k NK4 môže byť určený fotometrickými spôsobmi popísanými napríklad v publikácii Grasseti, D.R., Murray, J.F. v J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49.

Vyššie uvedená reakcia je nasledovaná kovalentným pripojením aktivovaného polyetylén glykolového (PEG) derivátu. Vhodné PEG deriváty sú aktivované PEG molekuly s priemernou molekulovou váhou od zhruba 20 do zhruba 40 kDa.

Aktivované PEG deriváty sú známe v obore a sú popísané napríklad v publikácii Morpurgo, M., et al. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363 ff pre PEG-vinylsulfón. Lineárny reťazec a vetvený reťazec PEG molekúl sú vhodné pre prípravu zlúčenín definovaných vzorcom 1. Príklady reaktívnych PEG činidiel sú jódo-acetyl-metoxy-PEG a metoxy-PEG-vinylsulfón:

/γΑΧ/Χ o o

Použitie týchto jódom aktivovaných látok je známe v obore a je popísané napr. Hermansonom, G.T., v časopise Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148.

Naj prednostnejšie sú PEG molekuly aktivované maleimidom za použitia (alkoxy-PEG-maleimidu), ako je napríklad metoxy-PEG19 maleimid (MW 20,000 až 40,000; Shearwater

Polymers, Inc. ).

Štruktúra alkoxy-PEG-maleimidu je or

a m definovanými vyššie, prednostne

s

Spojovacia reakcia in situ odštiepením pufre, napr. v 10 mM alkoxy-PEG-maleimidom tiolovej chrániacej fosforečnanu draselnom, sa uskutočňuje po skupiny vo vodnom 3000 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6.2. Odštiepením chrániacej uskutočnené napríklad hydroxylamínom v DMSO dobu zhruba 90 minút.

skupiny môže byť pri 25°C, pH 6.2 po

Pre PEG modifikáciu by mal byť molárny pomer aktivovaného NK4/alkoxy-PEG-maleimidu od zhruba 1:1 do zhruba 1:6. Reakcia môže byť zastavená pridaním cysteínu a reakciou zostávajúcich tiolových (-SH) skupín s N-metylmaleimidom alebo ďalšími vhodnými zlúčeninami schopnými vytvárať disulfidové väzby. Kvôli reakcii akýchkoľvek zostávajúcich aktívnych tiolových skupín s chrániacou skupinou, ako sú napríklad N-metylmaleimid alebo iná vhodná chrániaca skupina, môžu NK4 bielkoviny v konjugátoch podľa tohto vynálezu obsahovať takéto chrániace skupiny. Postup tu popísaný vedie obecne ku vzniku zmesi molekúl majúcich rôzne počty triolových skupín chránených odlišným počtom chrániacich skupín v závislosti na počte aktivovaných tiolových skupín na proteíne, ktoré neboli konjugované k PEG-maleimidu.

Zatiaľ čo N-metylmaleimid tvoria rovnaký typ kovalentnej väzby, ak je používaný na blokovanie zostávajúcich triolových skupín na PEGylovanom proteíne, disulfidovej zlúčeniny vedú k výmennej reakcii intermolekulárnej sulfidovej/disulfidovej väzby so spojením blokovacieho činidla disulfidickým mostíkom. Preferované blokovacie činidlá pre tento typ blokovacej reakcie sú oxydovaný glutation (GSSG), cysteín a cystamín. Zatiaľ čo cysteín nevnáša do PEGylovaného proteínu žiadny ďalší náboj, použitie blokovacieho činidla GSSG alebo cystamínu vedie k ďalšiemu negatívnemu alebo pozitívnemu náboj u.

Ďalšia purifikácia zlúčenín definovaných vzorcom (III), zahŕňajúci separáciu mono- z di-, tri- multi-PEGylovaných NK4 molekúl, môže byť uskutočnená spôsobmi známymi v obore, napr. stĺpcovou chromatografiou. Percento mono-PEG konjugátov môže byť kontrolované zhromaždením širších frakcií okolo elučného vrcholu k zníženiu percenta mono-PEG alebo užších frakcií k zvýšeniu percenta mono-PEG v preparáte. Zhruba 90 % mono-PEG konjugátov je dobrou rovnováhou výťažku a aktivity. Môžu byť požadované preparáty, v ktorých napríklad aspoň 92 % alebo aspoň 96 % konjugátov sú mono-PEG zlúčeniny. Vo forme tohto vynálezu je percento mono-PEG konjugátov od 90 do 96 %.

Farmaceutické vzorce spôsobov spôsoby preparátov, predkladaného vynálezu môžu byť formulované prípravu farmaceutických preparátov, známe osobe znalej oboru. Pre prípravu je monoPEGylovaný NK4 podľa vynálezu s farmaceutický prijateľným nosičom. Také sú pre sú

Zlúčeniny podľa podlá ktorých takých skombinovaný v zmesi prijateľné nosiče Pharmaceutical Sciences, popísané napríklad v

1990, Mack

18.

vydanie,

Remington' s

Publishing

Company, vydané autory

Oslo et al.

(napr. str.

Typické preparáty obsahujú vynálezu, napríklad od zhruba 0,1 s vhodným množstvom nosiča. Preparáty parenterálne.

účinné množstvo do

100 môžu

1435-1712). látky mg/ml, byť podlá spolu podané

Tento vynález ďalej poskytuje farmaceutické preparáty obsahujúce konjugáty tu popísané, v ktorých je percento monoPEG konjugátov prednostne aspoň 90 %, prednostnejšie aspoň 92 %.

Farmaceutické prípravky podľa vynálezu môžu byť pripravené podľa spôsobov známych v obore. Roztoky monoPEGylovaného NK4 sú zvyčajne dialyzované proti pufru zamýšľanému na použitie vo farmaceutickom preparáte a požadovaná finálna koncentrácia proteínu je upravená koncentráciou proteínu je upravená koncentráciou alebo nariedením.

Také farmaceutické preparáty môžu byť používané pre injekčné podanie a obsahujú účinné množstvo monoPEGylovaného NK4 spolu s farmaceutický prijateľnými riediacimi látkami, konzervačnými látkami, emulziíikačnými látkami, adjuvantnými látkami a/lebo nosičmi. Také preparáty zahŕňajú riediace látky rôznych pufrových zložiek (napr. arginín, acetát, fosfát), PH a iontovú silu, aditívne látky, ako sú napríklad detergenty a solubilizujúce látky (napr. Tween 80/polysorbát, pluronic F68, chlorid sodný, sulfát sodný), antioxidačné látky (napr.

kyselina askorbová, L-metionín) konzervačné látky benzyl alkohol), látky zvyšujúce objem (napr.

(timersol, sacharóza, manitol), začlenenie materiálu do konkrétneho prípravku polymérnych zlúčenín, ako sú napríklad kyselina polymliečna, polyglykolová, atd. Alebo do lipozómov. Takéto preparáty môžu ovplyvniť uvoľňovanie a odbúravanie monoPEGylovaného NK4 podľa vynálezu na základe štabilitného pomeru fyzikálneho stavu.

Dávkovanie a liekové koncentrácie

V štandardnom liečebnom protinádorovom režime sú pacienti typicky liečení dávkami v rozmedzí medzi 1 až 30 mg monoPEGylovaného NK4 na kg per day po určitú dobu trvajúcu od jedného dňa do zhruba 30 dní alebo dlhšie.

ako jedna denná subkutánna alebo i. v.

farmaceutického prípravku obsahujúceho

Liek je aplikovaný bolusová injekcia

0,1 až 100 mg monoPEGylovaného NK4 na ml. Táto liečba môže byť skombinovaná s akoukoľvek štandardnou (napr. chemoterapeutickou) liečbou aplikáciou monoPEGylovaného NK4 pred, behom alebo po štandardnej liečbe. Toto vedie k zlepšeniu výsledkov v porovnaniu so štandardnou liečbou samotnou.

V každom prípade je celkové množstvo podávaného PEGylovaného

NK4 podľa vynálezu významne nižšie než množstvo NK4 pre rovnakú liečbu.

Nasledujúce príklady, referencie a zoznam sekvencií sú poskytnuté, aby pomohli pochopiť predkladaný vynález, ktorého celý rozsah je uvedený v priložených patentových nárokoch. Rozumie sa, že v postupoch môžu byť uskutočnené modifikácie, hoci by došlo k odchýleniu od podstaty vynálezu.

Popis sekvencií

SEQ ID č. 1 ukazuje DNA a sekvenciu polypeptidov NK4,

SEQ ID č. 2 ukazuje sekvenciu polypeptidu NK4.

Popis obrázkov

Obr. 1 Inhibícia HGF-indukovanej poliferácie HUVEC pomocou NK4, 20 kDa-mono-PEG-NK4 a 30 kDa-mono-PEG-NK4.

Obr. 2 Inhibícia HGF-indukovanej HUVEC proliferácie pomocou

NK4 a 40 kDa-mono-PEG-NK4.

Obr. 3 Inhbícia bFGF-indukovanéj HUVEC proliferácie pomocou

NK4, 30 kDa-mono-PEG-NK4 a 40 kDa-mono-PEG-NK4.

Obr. 4 Krivka času-koncentrácie NK4, 30 kDa-monoPEG-NK4, 40 kDa-mono-PEG-NK4 v plazme po i.v. (Obr. 4A) alebo s.c. (Obr.4B) injekcii.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Rekombinantná tvorba NK4

NK4 pre terapeutické požitie môže byť produkovaný rekombinantnými spôsobmi za použitia bakteriálnych alebo eukaryotických expresných systémov. Vhodné eurokarytické expresné systémy sú napríklad upravené HeLa, BHK alebo prednostne CHO bunky. Bunky upravené pre NK4 produkciu sú kultivované vo vhodnom médiu. Ako inokulum pre 10 litrový fermentor je typicky používaná 1 až 5 litrová bunečná kultúra. Po 3 až 5 dňoch môže byť kultúra v 10 litrovom fermentore používaná ako inoculum pre 100 litrový fermentor. Po ďalších 3 až 5 dňoch fermentácie môže byť táto kultúra použitá ako inokulum pre 1000 litrový produkčný fermentor. Po 3 až 4 dňoch sú bunky odstránené filtráciou alebo centrifugáciou. Supernatant obsahujúci NK4 je sfiltrovaný, zobratý a spracovaný behom purifikácie. Purifikačný proces je popísaný v nasledujúcom príklade.

Príklad 2

Purifikácia

Heparín-Sepharosa sa skladá z guličiek Sepharosy, a k ich povrchu je kovalentne naviazaný heparin. Pretože NK4 vykazuje vysokú afinitu k heparínu, je zachycovaný na tejto kolóne a môže byť eluovaný vysokými koncentráciami soli, zatiaľ čo proteín kontaminujúcej látky a ďalšie nečistoty sa buď nevážia alebo sa eluujú pri nižších koncentráciách soli. Frakcie obsahujúce NK4 eluované pri zhruba 0,7 až 1,1 M NaCI v 50 mM Hepes pH 7,5 sú nahromadené a nanesené na hydroxyapatitovú kolónu. NK4 sa eluuje zhruba 0,4 až 0,7 M roztokom fosforečnanu draselného, pH 7,5. Výsledné frakcie sú významne bez kontaminujúcich bielkovín a môžu byť ďalej purifikované chromatografiou s S-Separosou.

Príklad 3

Produkcie monoPEGylovaného NK4

Pre PEGylačné reakcie bol použitý NK4 purifikovaný v schode s vyššie zmieneným postupom. Tri vyššie zmienené vhodné spôsoby sú popísané príkladom.

a) PEGylácie NK4 s mPEG-SBA

Alikvóty NK4 boli podrobené reakcii s metoxy-PEG-SBA (5 kDa pre porovnanie, 20 kDa a respektíve 30 kDa; Shearwater

Polymers, Inc., Huntsville Alabama. Reakcia bola uskutočnená pri pomere proteínu k činidlu medzi 1:1 a 1:5 po dobu zhruba 2 hod. pri izbovej teplote (pomer 1:2 je preferovaný, ak je

používaný 20 a 30 kDa PEG). Reakcia bola zastavená pridaním 10 mM Tris pufra alebo arginin HCI, pH 8, a vzorky boli analyzované pomocou SDS-PAGE alebo gélovou chromatografiou na kolóne so Superosou 6 (Pharmacia) za použitia 500 mmol/1 fosforečnanu sodného ako pufra, pH 6,8 pre ekvilibráciu a elúciu. Reakcia bola optimalizovaná zmenou pomeru bielkoviny k činidlu, pH, času a teplote, aby bol získaný prevážne monoPEGylovaný NK4.
Takéto podmienky	sú napríklad:
Koncentrácia NK4:	8-12 mg/ml
Pufor/pH:	0,3 M fosforečnan draselný, pH 8
Teplota:	2 5° C
Reakčný čas:	1 h
Molárne pomery (b	ielkovina:činidlo) : 1:2
Výťažok:
MonoPEGylovaný NK4: 38%
DiPEGylovaný NK4:	17%
NePEGylovaný NK4:	45%
b) PEGylácia NK4	s mPEG-SPA

Alikvóty NK4 (koncentrácia bielkoviny 8 až 12 mg/ml v 0,3 M fosforečnanu draselnom, pH 8) boli podrobené reakcii s metoxyPEG-SPA (5 kDa pre porovnanie a respektíve 20 kDa; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville Alabama). Reakcia bola uskutočnená pri pomere bielkoviny k činidlu 1:2 po dobu zhruba 2 h pri izbovej teplote. Reakcia bola zastavená pridaním 10 mM Tris pufra alebo arginín HCI a vzorky boli analyzované pomocou SDS

PAGE, HPLC s reverznou fázou alebo gélovou chromatografiou na kolóne so Superosou 6 (Pharmacia) za použitia 500 mmo/1 fosforečnanu draselného ako pufra, pH 6,8, pre ekvilibráciu a elúciu. Reakcia bola optimalizovaná zmenou pomeru proteínu k činidlu, pH, času a teplote, aby bol získaný prevážne monoPEGylovaný NK4, v porovnaní s di- a tri-PEGylovanom NK4.

C) PEGylácia NK4 s mPEG2-NHS

Táto PEGylácia bola uskutočnená, ako je popísané v Príklade 3c s výnimkou, že miesto PEG-SPA bol mPEG2-NHS (40 kDa PEG vetvený prostredníctvom lyzínoveho spojenia) používaný v molárnom pomere 1:5 (bielkovina:PEG činidlo).

Príklad 4

Izolácia monoPEGylovaného NK4

MonoPEGylovaný NK4 môže byť separovaný z nePEGylovaného, ditri-PEGylovaného NK4 uskutočnením preparatívnej gélovej chromatografie (napr. Superosa 6 alebo Superdex 200; Pharmacia)

500 mmol/1 fosforečnanu draselného ako pufra, pH 6,8 pre ekvilibráciu a elúciu, alebo ionexovú chromatografiu.

Purifikovaná bielkovina obsahuj e prevážne monoPEGylované molekuly. Frakcie boli zhromaždené a analyzované pomocou SDSPAGE a chromatografie na reverznej fáze.

Príklad 5

Molekulárna charakterizácia monoPEGylovaného NK4

a) Gélová chromatografia

MonoPEGylované molekuly sa eluujú gélovou chromatografiou skôr (napr. Superosa 6 alebo Superdex 200; Pharmacia; 500 mmol/1 fosforečnan draselný ako pufor, pH 6,8 pre ekvilibráciu a elúciu) v porovnaní s nemodifikovoanou formou. Toto je spôsobené zvýšeným hydrodynamickým polomérom molekuly.

b) SDS-PAGE

Pomocou SDS-PAGE sú molekulovej váhy. V bielkoviny separované podlá svojej dôsledku zvýšenia molekulovej váhy

PEGyláciou, monoPEGylovaný NK4 vzdialenosť vzdialenosť vykazuj e v porovnaní s nemodifikovaným je inverzne korelovaná s dĺžkou molekuly a počtom PEG skupín pripojených k NK4 molekule.

kratšiu migračnú

NK4 .

reťazca

Migračná

PEG časti

c) Peptidové mapovanie

Natrávenie monoPEGylovaného NK4 endo-proteínazami štepiacimi špecifické sekvencie (napr. LysC alebo trypsín) vedie k vytvoreniu charakteristickej peptidovej mapy. Výsledné peptidy môžu byť separované chromatografiou na reverznej fáze a analyzované hmotovou spektrometriou a/lebo N-terminálnou sekvenciou. To umožňuje určenie PEG-modifikovaných skupín v molekule NK4.

d) Chromatografia na reverznej fáze

MonoPEGylovaný NK4 môže byť tiež charakterizovaný chromatografiou na reverznej fáze. PEGylácia NK4 vedie k zmene retenčného času v porovnaní s nemodifikovaným NK4.

Príklad 6

Porovnanie monoPEGylovaného, nePEGylovaného a multiPEGylovaného NK4

V tomto príklade boli použité nePEGylovaný NK4, NK4 monoPEGylovaný s PEG 5 kDa, PEG 20 kDa, PEG 30 kDa, PEG 40 kDa a multiPEGylovaný NK4 (NK4 PEGylovaný s viacej než jedným PEG reťazcom).

a) Analýza rozptylu

MDC bunky boli takmer splývavo kultivované na doštičkách pre tkanivové kultúry. Bunky boli liečené s HGF (10 ng/ml) alebo s kombináciami HGF NK4. V týchto experimentoch bol rozptyl buniek indukovaných HGF inhibovaný pridaním 10 až 1000násobneho molárneho nadbytku NK4 vykazujúceho funkčnú aktivitu PEGylovaného NK4. Bolo zistené, že in vitro aktivita monoPEGylovaného 5 kDa-PRG-NK4, 20 kDa-PEG-NK4, 30 kDa-PEG-NK4 a 40 kDa-PEG-NK4 je podobná nePEGylovanému NK4. Bolo tiež zistené, že pridaním viacej než jedného reťazca PEG (20 až 40 kDa) vedie k významnej strate aktivity (Tabuľka 1).

Tabuľka 1. Skóre MDCK v analýze rozptylu

NK4 (kontrolný)	40 kDa-PEG-NK4	30 kDa-P0G-NK4
NK4 (uq/ml)	NK4	NK4	Mono- PEG	Di-PEG	Tri-PEG	Mono- PEG	Di a Tri-PEG	Tri- Tetra PEG	Penta- PEG
5,00	+ +	+ +	+ +	+	+ /-	++	+ +	+
1,67	+ +	+ +	+ +	+		+ +	+	+/-
0,56	+ +	+ +	+ +	+/-		+ +	+
0,19	+	+	+			+	+/-
0,06	+/-	+/-	+/-			+/-
0,02

20 kDa-PEG-N4K	5 kDa-PEG-NK4
NK4 (uq/ml)	Mono- PEG	Di- PEG	Tri-PEG	Mono- PEG	Di-PEG	Tri- PEG	Tetra- PEG	PentaPEG	Hexa- PEG	HeptaPEG
5,00	+ +	++	+	+ +	++	+ +	+ +	+
1,67	+ +	+	+	+ +	+ +	+ +	+ +	+
0,56	+ +	+	+/-	+ +	+ +	+	+	+/-
0,19	+	+/-		+	+	+	+/-
0,06	+/-			+/-	+/-					..
0,02					-				—

Bola testovaná relatívna účinnosť rôznych PEGylovaných foriem NK4 na inhibicii pomocou HGF (lOng/ml) indukovaného rozptylu MDCK buniek. ++ znamená úplná inhibícia, + znamená inhibícia, +/- znamená úplná inhibícia, - znamená žiadna inhibícia.

b) Test proliferácie HUVEC

Inhibícia mitogénej aktivity

HGF pomocou NK4 bola určená meraním proliferácie

HUVEC v kultúre, ako je popísané v publikácii Nakamura, T., et al., Náture 342 (1989) 440-43.

V týchto experimentoch bola bunková proliferácia indukovaná HGF inhibovaná pridaním 10 ž 1000 násobnom molárnom nadbytku NK4 vykazujúcom funkčnú aktivitu monoPEGylovaného NK4 (Obr. 1 a 2).

Test prolifikácie HUVEC bol alternatívne uskutočnený inhibíciou mitogénnej aktivity bFGF (bázický rastový faktor fibroblastov) pomocou NK4. Inhibícia bola určená zmeraním proliferácie buniek HUVEC v kultúre, ak je popísané v publikácii Kuba, K., et al., Cancer Res . 60 (2000) 6737-6743. V týchto experimentoch bola bunečná proliferácia indukovaná FGF inhibovaná pridaním 10 až 1000-násobného molárneho nadbytku NK4 vykazujúceho funkčnú aktivitu monoPEGylovaného NK4 (Obr. 3).

c) Test invazivity

V tomto teste je analyzovaný invazívny potenciál nádorových buniek. Test bol rovnako ako v publikácii Albíni, A., et al. (1987) za použitia buniek HT115. Bunečná invazivita indukovaná HGF (10 ng/ml)· mohla byť opäť inhibovaná pridaním 10 až 1000násobnom molárnom nadbytku NK4 vykazujúcom funkčnú aktivitu monoPEGylovaného NK4 (Obr. 3).

Príklad 7

Aktivita in vivo

Model: Ortotopický model SCID myši s ľudským pankreatickým nádorom Pane Tul (Alves, F., et al . , Pancreas 23 (2001) 227-235)

Liečba: Po 8 dňoch jedna denná aplikácia monoPEGylovaného NK4 po dobu 21 dni.

Dávky: 16 mg/kg/day mg/kg/day mg/kg/day

Placebo

Výsledok: Liečba monoPEGylovaným NK4 ukazuje na dávke závislé potlačenie rastu a metastázovania primárneho nádoru, zatiaľ čo v skupinách liečených placebom nie je patrný žiaden účinok.

Príklad 8

Farmaceutický preparát

Vhodné farmaceutické preparáty sú napríklad:

až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4

150 mM NAC1 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2 až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4

150 mM Nacl

0,01% Tween 80 alebo Tween 20 alebo pluronic F68 mM fosforečnanu sodného, PH 7,2 až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4 mM NaCl % mannitol mM fosforečnanu sodného, pH 7,2 až 30 mg/ml monoPEGylovaného NK4 mM NaCl

3% mannitol

0,01% Tween 80 alebo Tween 20 alebo pluronic F68 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2

Prípravky sú pripravené tak, že monoPEGylovaný NK4 je dialyzovaný proti vyššie uvedenému pufru (s alebo bez mannitolu).

Koncentrácia bielkoviny je upravená zakoncentrovaním alebo nariedeným pufrom. Z 10 % zásobného roztoku sú pridané detergent a NaCl.

Príklad 9

Farmakokinetická analýza NK4, 30 kDa-mono-PEG-NK4 a 40 kDamono-PEG-NK4.

Dospelé myši (4 na skupinu) boli liečené jednou i.v. alebo s.c.

bolusovou injekciou NK4, 30 kDa-mono-PEG-NK4 alebo 40 kDamono-PEG-NK4 (mg/kg v 0,25 ml injekčného objemu). V rôznych časových bodoch boli odebrané vzorky krvi, ktoré boli analyzované pomocou

ELISA testu na obsah NK4, 30 kDa-monoPEG-NK4 alebo 40 kDa-mono-PEG-NK4. Boli vyrátané krivky závislosti času na koncentrácii a sú uvedené na Obrázku 4.

Tieto údaje ukazujú, že 30 kDa-mono-PEG-NK4 a 40 kDa-mono-PEGNK4 majú významne lepšiu stabilitu in vivo, čo vedie k významne vyššiemu plazmatickému polčasu v porovnaní s nemodifikovaným NK4 .

Zoznam literatúry

Albíni, A., et al., Cancer Res. 47 (1987) 3239-3245

Alves, F., et al., Pancreas 23 (2001) 227-235

Bailon, P., Bioconjugate Chem. L2 (2001) 195-202

Dáte, K., et al., FEES Letters 420 (1997) 1-6

Dáte, K., et al., Oncogene 17 (1989) 3045-3054

EP O 442 724

EP-A O 473 084

Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol.68 (1998) 1-18

Gaertner, H.F.

Offord,

R.E., Biokonjugate Chem. 7 (1996) 38-44

Grasseti, D.R.

Murray,

J.F., J.Appl.

Biochem. Biotechnol. 119 (1967) 41-49

Heizerling, L.

Dermatol.201 (2000) 6737-6743

Hermanson, G.T., et al., Biokonjugate Techniques, Academic

Press, san Diego, (1996) 147-148

Kuba, K., et al., Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743

Maiti, P.K., et all., Int. J. Cancer Suppl. 3 (1988) 17-22

March, J., Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376

Mehvar, R., J.Pharm.Pharm. Sci. 3 (1) (2000) 125-136

Miyazawa, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989)

967-973 Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 6269

Morpurgo, M., et al., Bioconj. Chem,. 7 (1996) 363-368

Nakamura, T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 22 (1984)

L450-1459 Nakamura, T., et al., Náture 342 (1989) 440-443

Okajima, A., et al. , Eur. }. Biochem. L93 (1990) 375-381

Parr, C., et al., Int. J. Cancer 85 (2000) 563-570

Reddy, K.R., Ann. Pharmacotherapy 34 (2000) 915-923

Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie, 1990,

Mack Publishing Company, editori Oslo et al. , (napr. pp. L4351712)

Seki, T., et. al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 172 (1990) 321327

Stuart, K.A., et al. , International of Journal Experimental

Pathology 81 (2000) 17-30

Tashiro, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 32003204 Tomioka, D., et al. , Cancer Res. 61 (2001) 7518-7524

Tsutsumi, Y., et al., Thromb. Haemost. 77 (1997) 168-173

Tsutsumi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553

Tsutsumi, Y., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996) 10061011

Uematsu, Y., et al., J. Pharm. Sciences 88 (1999) 131-135

U. S.	Patent	Č.	5,672,662
U.S.	Patent	Č.	5,	932,	462
U. S.	Patent	Č.	5,	977	, 310
Weidner, K.	M. ,	et	al.	, Proc

Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)

7001-7005

WO 01/02017

WO 90/07938

WO 93/23541

WO 94/01451

WO 94/13322

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Konjugát obsahujúci N-terminálný fragment rastového faktoru hepatocytov (HGF/SF) zložený z vlásenkovej domény štyroch kringle oblasti α-reťazce či polyetylénovej glykolovej skupiny majúce celkovú molekulovú váhu od zhruba 20 do 40 kDa.
2. Konjugát podlá patentového nároku 1 vyznačujúci sa tým, že rečená polyetylén glykolová skupina má vzorec

-CO- (CH₂)x- (OCH₂CH₂)_mOR a uvedená -CO skupina tvorí amidovú väzbu s jednou z amino skupín uvedeného N-terminálneho fragmentu rastového faktoru hepatocytov, kde

X je 2 alebo 3;

m je od zhruba 450 do zhruba 950;

R je (Ci-Cg)alkyl.
3. Konjugát podľa patentového nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedená polyetylén glykolová skupina má vzorec (CHpyNHCOfOC^CH^nOR

Y^NHCO(OCH_aCl-ypOR a uvedená -CO skupina tvorí amidovú väzbu s jednou z amino skupín uvedeného N-terminálneho fragmentu rastového faktoru hepatocytov, kde y je 1 až 10;

n a p spolu sú od zhruba 450 do 950; a

R je (Ci-C₆) alkyl.
4. Konjugát podlá patentových nárokov 1 až 3 vyznačujúci sa tým, že uvedená polyetylén glykolová skupina má molekulovú váhu od zhruba 30 do 40 kDa.
5. Konjugát podľa patentových nárokov 1 až 4 vyznačujúci sa tým, že uvedená polyetylén glykolová skupina(y) je/sú monometoxypolyetylén glykolová skupina (y).
6. Farmaceutický preparát obsahujúci konjugát podlá patentových nárokov 1 až 3 a farmaceutický prijateľný nosič.
7. Postup prípravy farmaceutického preparátu podľa patentového nároku 6.
8. Použitie konjugátu podľa patentových nárokov 1 až 5 pre prípravu lieku užitočného v liečbe nádorov.
9. Spôsob liečby nádorových ochorení zahrnujúcich kroky podania farmaceutického preparátu podlá patentového nároku 6 pacientovi potrebujúcemu túto liečbu.

1/4 rH

M Λ

0 30 kDa-mono-PEG-NK4 □ 20 kDa-mono-PEG-NK4 a NK4