ES2321928T3 - Nuevo uso de eritropoyetina en enfermedades cardiacas. - Google Patents
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Abstract
El uso de la proteína eritropoyetina en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de trastornos de la distribución de hierro en enfermedades cardíacas.
Description
Nuevo uso de eritropoyetina en enfermedades
cardíacas.
La presente invención se refiere a un nuevo uso
de eritropoyetina, especialmente para el tratamiento de trastornos
de la distribución de hierro en las enfermedades cardíacas.
Se conocen diversas enfermedades en las cuales
el metabolismo de hierro no es normal. En una anemia, no se puede
formar suficiente sangre debido a una falta general de hierro en el
cuerpo. Otra condición metabólica relacionada con el hierro es la
hemocromatosis, en la cual la concentración total de hierro en el
cuerpo es mayor que la normal, lo que conduce a diversas
condiciones tales como, por ejemplo, la destrucción de órganos.
Los trastornos de la distribución de hierro
difieren de la anemia y la hemocromatosis descritas anteriormente
debido a que la concentración total de hierro en el cuerpo es
normal. Por un lado, el hierro es acumulado en diversos órganos y
puede conducir a daños y aún destrucción de esos órganos. Por otro
lado, el uso del hierro que está presente en cantidades normales en
la formación de sangre se encuentra deteriorado, llevando a efectos
secundarios que se pueden comparar con los relacionados con la
anemia.
Hasta ahora no se sabía que los pacientes que
padecen de enfermedades cardíacas tienen una alta probabilidad de
ser afectados por trastornos de la distribución de hierro. Los
trastornos de la distribución de hierro pueden ser diagnosticados
mediante diversos parámetros que se usan comúnmente en el
diagnóstico del estado del hierro. En base a las mediciones de
ferritina y del receptor de transferrina soluble es posible evaluar
si la concentración total de hierro en un paciente que padece de
enfermedades cardíacas es normal. Si es éste el caso, entonces una
concentración disminuida de hemoglobina en los reticulocitos es un
indicador de trastornos de la distribución de hierro. Otro
indicador es una concentración elevada continua/prolongada de la
proteína reactiva C (CRP) en pacientes que padecen de enfermedades
cardíacas y que presentan una concentración de hierro total normal.
Un método para diagnosticar trastornos de la distribución de hierro
ha sido descrito por P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf,
R. Roeddiger, informe presentado en la ACC/CSCC, Reunión Anual, 29
de julio - 2 de agosto, 2001, Chicago,
Illinois.
Illinois.
Hasta ahora no se ha sugerido ningún tratamiento
para pacientes con enfermedades cardíacas que padecen de trastornos
de la distribución de hierro. El problema subyacente a la presente
invención es por lo tanto proveer un tratamiento para los
trastornos de la distribución de hierro en las enfermedades
cardíacas para minimizar o suprimir las desventajas anteriormente
mencionadas. Se halló sorprendentemente que la eritropoyetina tiene
un efecto beneficioso sobre los trastornos de la distribución de
hierro en las enfermedades cardíacas. El problema se ha resuelto
por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, proporcionando
eritropoyetina para el uso en el tratamiento de los trastornos de
la distribución de hierro en las enfermedades cardíacas.
A menos que se indique de otra manera las
siguientes definiciones se presentan para ilustrar y definir el
significado y el alcance de los diversos términos usados para
describir la invención en la presente.
El término "alquilo inferior" como se usa
en la presente significa un grupo alquilo lineal o ramificado que
tiene de uno a seis átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo
inferior incluyen metilo, etilo e isopropilo, de preferencia
metilo.
El término "alcoxi inferior" como se usa en
la presente significa un grupo R'-O-, en donde R' es
un alquilo inferior como se describió anteriormente.
El término "trastornos de la distribución de
hierro en las enfermedades cardíacas" se refiere a un trastorno
de la distribución de hierro que ocurre en pacientes que padecen de
enfermedades cardíacas. El trastorno de la distribución de hierro
puede ser caracterizado, por ejemplo, como se describió
anteriormente. Particularmente, un trastorno de la distribución de
hierro está caracterizado por los siguientes parámetros: la
concentración del receptor de transferrina soluble [mg/l] dividido
por log (concentración de ferritina [\mug/l] es menor de 3.5 y
simultáneamente la concentración de la proteína C reactiva es mayor
de 5 mg/l.
El término "eritropoyetina" o "proteína
eritropoyetina" se refiere a una proteína con la actividad
biológica in vivo de hacer que las células de la médula ósea
aumenten la producción de reticulocitos y eritrocitos y
seleccionada entre el grupo que consiste de eritropoyetina humana y
análogos que se definen más adelante.
El término "eritropoyetina pegilada
(Peg-EPO o PEG-EPO)" se refiere a
una proteína eritropoyetina que está unida en forma covalente con
uno a tres derivados de polietileno como se describe más
adelante.
Figura 1: Estructura primaria de la EPO humana
(165 aminoácidos) (SEQ ID NO:1).
Figura 2: Estructura primaria de la EPO humana
(166 aminoácidos) (SEQ ID NO:2).
Más detalladamente, la presente invención se
refiere al uso de eritropoyetina en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento de los trastornos de la distribución de hierro
en las enfermedades cardíacas. Ejemplos de enfermedades cardíacas
son, por ejemplo, enfermedad cardíacas coronaria, ateroesclerosis,
ateroesclerosis coronaria, síndrome coronario agudo, falla
cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva y/o insuficiencia
cardíaca. En una modalidad preferida, la invención se refiere a un
uso como se definió anteriormente, en donde la enfermedad cardíaca
es insuficiencia cardíaca.
La presente invención es especialmente útil para
la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden
eritropoyetina como ingrediente farmacéuticamente activo. El término
"eritropoyetina" o "proteína eritropoyetina", o
"EPO" es como sigue: particularmente los términos se refieren a
una glucoproteína, por ejemplo, la eritropoyetina humana, por
ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en (SEQ ID
NO:1) o (SEQ ID NO:2) o una secuencia de aminoácidos
sustancialmente homóloga a las mismas, cuyas propiedades biológicas
se refieren a la estimulación de la producción de eritrocitos y a
la estimulación de la división y la diferenciación de progenitores
eritroides comprometidos en la médula ósea. Como se usa en la
presente, estos términos incluyen a las proteínas modificadas
deliberadamente, como por ejemplo, por mutagénesis dirigida a un
sitio o accidentalmente por medio de mutaciones. Estos términos
también incluyen análogos que tienen de 1 a 6 sitios adicionales
para glucosilación, análogos que tienen al menos un aminoácido
adicional en el extremo carboxi terminal, en donde el aminoácido
adicional incluye al menos un sitio de glucosilación, y análogos que
tienen una secuencia de aminoácidos que incluye un reordenamiento
de al menos un sitio para glucosilación. Estos términos incluyen a
la eritropoyetina humana natural y a la producida en forma
recombinante. En una modalidad preferida de la presente invención,
la proteína eritropoyetina es una eritropoyetina humana.
Como se presenta en detalle más adelante, la
preparación y purificación de la EPO son bien conocidas en la
técnica. Por eritropoyetina se entiende la proteína natural o
recombinante, de preferencia humana, por ejemplo, epoetina alfa o
epoetina beta, como se obtiene a partir de cualquier fuente
convencional tal como tejidos, síntesis de proteínas, cultivo de
células con células naturales o recombinantes. Esta comprendida
cualquier proteína que tiene la actividad de la eritropoyetina, tal
como las muteínas u otras proteínas modificadas. En una modalidad
preferida de la presente invención, la proteína eritropoyetina es
epoetina alfa o epoetina beta. La EPO recombinante puede ser
preparada por medio de la expresión en líneas celulares CHO, BHK o
HeLa, por tecnología de ADN recombinante o por la activación génica
endógena. La expresión de las proteínas, incluyendo, por activación
génica endógena, es bien conocida en la técnica y se describe, por
ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,733,761,
5,641,670 y 5,733,746, y las publicaciones de patentes
internacionales Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO
90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955, cuyos contenidos se incorporan
en la presente como referencia. Se prefiere el uso como se definió
anteriormente, en donde la proteína eritropoyetina es expresada por
activación génica endógena. La especie de EPO preferida para la
preparación de los productos de glucoproteína eritropoyetina son
especies de EPO humanas. De más preferencia, la especie de EPO es la
EPO humana que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la
SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2, de más preferencia la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO:1. Una modalidad preferida de la presente
invención se refiere por lo tanto al uso como se describió
anteriormente, en donde la proteína eritropoyetina tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 2.
Además, la eritropoyetina puede ser un análogo
de glucoproteína que tiene de 1 a 6 sitios adicionales para
glucosilación. Por lo tanto, la presente invención se refiere
también al uso como se describió antes, en donde la proteína
eritropoyetina tiene la secuencia de eritropoyetina humana
modificada por la adición de 1 a 6 sitios de glucosilación. La
glucosilación de una proteína, con uno o más grupos de
oligosacáridos, se realiza en ubicaciones específicas a lo largo
del esqueleto de polipéptidos y afecta en gran parte las propiedades
físicas de la proteína tales como la estabilidad de la proteína, la
secreción, la localización subcelular y la actividad biológica. La
glucosilación es generalmente de dos tipos. Los oligosacáridos
ligados a O están unidos a los residuos de serina o treonina y los
oligosacáridos ligados a N están unidos a los residuos de
asparagina. Un tipo de oligosacárido hallado tanto en los
oligosacáridos ligados a N como en los ligados a O es el ácido
N-acetilneuramínico (ácido siálico), que es una
familia de amino azúcares que contiene 9 o más átomos de carbono.
El ácido siálico es generalmente el residuo terminal tanto en los
oligosacáridos ligados a N como en los ligados a O, y, debido a que
lleva una carga negativa, confiere propiedades ácidas a la
glucoproteína. La eritropoyetina humana que tiene 165 aminoácidos,
contiene tres cadenas de oligosacáridos ligados a N y una ligada a
O que comprende aproximadamente 40% del peso molecular total de la
glucoproteína. La glucosilación ligada a N se realiza en los
residuos de asparagina ubicados en las posiciones 24, 38 y 83 y la
glucosilación ligada a O se realiza en un residuo de serina ubicado
en la posición 126. Las cadenas de oligosacáridos son modificadas
con residuos de ácido siálico terminales. La remoción enzimática de
todos los residuos de ácido siálico de la eritropoyetina
glucosilada da por resultado una pérdida de la actividad in
vivo pero no de la actividad in vitro debido a que la
sialilación de eritropoyetina evita su ligadura, y la depuración
subsiguiente, por la proteína de ligadura hepática.
El término "eritropoyetina" incluye
análogos de la eritropoyetina humana con uno o más cambios en la
secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana que da por
resultado un aumento en el número de sitios para la unión del ácido
siálico. Estos análogos de la glucoproteína pueden ser generados por
mutagénesis dirigida a un sitio que tiene adiciones, deleciones, o
sustituciones de residuos de aminoácidos que aumentan o alteran
sitios que se pueden obtener para glucosilación. Los análogos de
glucoproteína que tienen niveles de ácido siálico mayores que los
hallados en la eritropoyetina humana son generados agregando, sitios
de glucosilación que no perturban la conformación secundaria o
terciaria requerida para la actividad biológica. Las glucoproteínas
de la presente invención también incluyen análogos que tienen
niveles aumentados de unión de carbohidratos en un sitio de
glucosilación que involucra usualmente la sustitución de uno o más
aminoácidos en la proximidad de un sitio ligado a N o ligado a O.
Las glucoproteínas de la presente invención también incluyen
análogos que tienen uno o más aminoácidos que se extienden desde el
extremo carboxi terminal de la eritropoyetina y que proveen al
menos un sitio de carbohidratos adicional. Las proteínas de
eritropoyetina de la presente composición también incluyen análogos
que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye un
reordenamiento de al menos un sitio para glucosilación. Un
reordenamiento de este tipo del sitio de glucosilación involucra la
deleción de uno o más sitios de glucosilación en la eritropoyetina
humana y la adición de uno o más sitios de glucosilación que no
ocurren naturalmente. Aumentar el número de cadenas de carbohidratos
en la eritropoyetina, y por lo tanto el número de ácidos siálicos
por moléculas de eritropoyetina puede conferir propiedades
ventajosas tales como mayor solubilidad, mayor resistencia a las
proteólisis, reducida inmunogenicidad, mayor vida media sérica y
mayor actividad biológica. Los análogos de eritropoyetina con sitios
de glucosilación adicionales se describen con mayores detalles en
la Solicitud de Patente Europea 640 619, de Elliot, publicada el 1
de marzo de
1995.
1995.
En una modalidad preferida, la composición
farmacéutica de la presente invención comprende proteínas de
eritropoyetina con una secuencia de aminoácidos que incluye al
menos un sitio adicional para glucosilación tal como, pero no
limitado a, eritropoyetinas que comprenden la secuencia de
eritropoyetina humana modificada por una modificación seleccionada
entre las siguientes:
Asn^{30}Thr^{32};
Asn^{51}Thr^{53};
Asn^{57}Thr^{59};
Asn^{69};
Asn^{69}Thr^{71};
Ser^{68}Asn^{69}Thr^{71};
Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Gly^{89}Thr^{90};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Thr^{92};
Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90}Ala^{162};
Asn^{69}Thr^{71}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90};
Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91};
Asn^{87}Asn^{89}Ile^{90}Thr^{91};
Asn^{136}Thr^{138};
Asn^{138}Thr^{140};
Thr^{125}; y
Pro^{124}Thr^{125}.
La denominación usada en la presente para la
modificación de la secuencia de aminoácidos significa que la o las
posiciones de la proteína no modificada correspondiente (por
ejemplo, hEPO de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2) indicada por el o los
números en superíndice cambia con respecto al o los aminoácidos que
preceden inmediatamente al o los números en superíndice
respectivos.
La proteína eritropoyetina también puede ser un
análogo que tiene al menos un aminoácido adicional en el extremo
carboxi terminal de la glucoproteína, en donde el aminoácido
adicional incluye al menos un sitio de glucosilación. El aminoácido
adicional puede comprender un fragmento de péptido derivado del
extremo carboxi terminal de la gonadotropina coriónica humana. De
preferencia, la glucoproteína es un análogo seleccionado entre el
grupo que consiste en (a) eritropoyetina humana que tiene la
secuencia de aminoácidos Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
Gln, que se extiende desde el término carboxi; (b) el análogo de
(a) que comprende además
Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO.
La proteína eritropoyetina también puede ser un
análogo que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye un
reordenamiento de al menos un sitio para glucosilación. El
reordenamiento puede comprender una deleción de cualquiera de los
sitios de carbohidratos ligados a N en la eritropoyetina humana y
una adición de un sitio de carbohidratos ligado a N en la posición
88 de la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana. De
preferencia, la glucoproteína es un análogo seleccionado entre el
grupo que consiste en Gln^{24}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO;
Gln^{38}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO; y
Gln^{83}Ser^{87}Asn^{88}Thr^{90} EPO. Un análogo adicional
es darbepoetina alfa. Una proteína eritropoyetina preferida en el
uso descrito antes es darbepoetina alfa.
Más particularmente, la proteína eritropoyetina
de la presente composición farmacéutica como se describe
anteriormente también puede incluir derivados pegilados de la
misma. Los derivados pegilados de la eritropoyetina y su preparación
son conocidos en la técnica y descritos por ejemplo, en WO
01/02017, EP-A-1064951,
EP-A-539,167,
EP-A-605,963, WO 93/25212, WO
94/20069, WO 95/11924, Patente de los Estados Unidos No. 5,56,
EP-A-584,876, WO 92/16555, WO
94/28024, WO 97/04796, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,359,030
y 5,681,811, Patente de los Estados Unidos No. 4,179,337, Patente
Japonesa, WO 98/32466, Patente de los Estados Unidos No. 5,324,650.
De preferencia, en el uso descrito anteriormente, la proteína
eritropoyetina es pegilada. Una modalidad preferida de la especie
eritropoyetina pegilada se refiere a los derivados como se describen
más adelante.
Por consiguiente, la presente invención también
se refiere al uso como se describe anteriormente, en donde la
proteína eritropoyetina es un conjugado, comprendiendo dicho
conjugado una proteína eritropoyetina como se describió
anteriormente que tiene al menos un grupo amino libre y que tiene la
actividad biológica in vivo que hace que las células de la
médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y eritrocitos y
seleccionada entre el grupo que consiste en eritropoyetina humana y
análogos de la misma, que tienen una secuencia de eritropoyetina
humana modificada por la adición de 1 a 6 sitios de glucosilación o
un reordenamiento de al menos un sitio de glucosilación; estando
dicha eritropoyetina ligada en forma covalente a los grupos n
poli(etilenglicol) de la fórmula
-CO-(CH_{2})_{n}-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-OR
con el -CO (es decir, carbonilo) de cada grupo
poli(etilenglicol) formando un enlace amida con uno de dichos
grupos amino; en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m es
desde aproximadamente 450 a aproximadamente 900; n es de 1 a 3; y n
y m son elegidos de modo que el peso molecular del conjugado menos
la proteína eritropoyetina es de 20 kilodaltons a 100 kilodaltons.
Esta invención provee además composiciones farmacéuticas que
contienen conjugados descritos en la presente en donde el
porcentaje de conjugados en donde n es 1 es de al menos 90%, de
preferencia al menos 92% o de preferencia 96% de todos los
conjugados de la
composición.
composición.
Más específicamente, los conjugados mencionados
anteriormente pueden ser representados por la fórmula (I):
(I)P-[NHCO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]_{n}
en donde P es el residuo de una
proteína eritropoyetina como se describió en la presente (es decir,
sin el grupo amino o grupos amino que forman una unión amida con el
carbonilo mostrado en la fórmula (I), que tienen la actividad
biológica in vivo que hace que las células de la médula ósea
aumenten la producción de reticulocitos y eritrocitos; y en donde R
es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m es de aproximadamente 450 a
aproximadamente 900; n es de 1 a 3; y n y m son elegidos de modo
que el peso molecular del conjugado menos la glucoproteína
eritropoyetina es de 20 kilodaltons a 100 kilodaltons. De acuerdo
con esta invención, R es cualquier alquilo inferior. Se prefieren
los conjugados en donde R es
metilo.
El símbolo "m" representa el número de
residuo de óxido de etileno (OCH_{2}CH_{2}) en el grupo
poli(óxido de etileno). Una sola subunidad de PEG
(polietilenglicol) de óxido de etileno tiene un peso molecular de
aproximadamente 44 daltons. Por lo tanto, el peso molecular del
conjugado (excluyendo el peso molecular de la EPO) depende del
número "m". En los conjugados de esta invención "m" es de
aproximadamente 450 a aproximadamente 900 (correspondiendo a un
peso molecular de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa),
de preferencia de aproximadamente 650 a aproximadamente 750
(correspondiendo a un peso molecular de aproximadamente 30 kDa). El
número m es seleccionado de tal modo que el conjugado resultante de
esta invención tiene una actividad fisiológica comparable a la EPO
no modificada, cuya actividad puede representar una actividad igual
que, mayor que, o una fracción de, la actividad correspondiente de
la EPO no modificada. Un peso molecular de "aproximadamente" un
determinado número significa que está dentro de un rango razonable
de ese número tal como es determinado por técnicas analíticas
convencionales. El número "m" es seleccionado de modo que el
peso molecular de cada grupo poli(etilenglicol) unido en
forma covalente a la glucoproteína eritropoyetina es de
aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa y es de preferencia
de aproximadamente 30 kDa.
En los conjugados de esta invención, el número
"n" es el número de poli(etilenglicol) unidos en forma
covalente a grupos amino libres (incluyendo grupos
\varepsilon-amino de un aminoácido lisina y/o el
grupo amino-terminal amino) de una proteína
eritropoyetina por medio de uniones amida. Un grupo conjugado de
esta invención puede tener uno, dos, o tres grupos PEG por molécula
de EPO. "n" es un número entero que oscila entre 1 y 3, de
preferencia "n" es 1 ó 2, y de más preferencia "n" es 1.
Un conjugado preferido de los conjugados descritos anteriormente
comprende compuestos en donde x es 2, m es 650 a 750, n es 1 y R es
metilo.
\newpage
El compuesto de fórmula (I) puede ser preparado
a partir del material polimérico conocido:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R y m son como se
describieron anteriormente, condensando el compuesto de Fórmula II
con la glucoproteína eritropoyetina. Los compuestos de fórmula (II)
en donde x es 3 son alfa-alcoxi inferior, ácido
butírico succinimidil ésteres de poli(etilenglicol) (alcoxi
inferior-PEG-SBA). Los compuestos de
fórmula (II) en donde x es 2 son alfa-alcoxi
inferior, ácido propiónico succinimidil ésteres de
poli(etilenglicol) (alcoxi
inferior-PEG-SPA). Se puede
utilizar cualquier método convencional de hacer reaccionar un éster
activado con una amina para formar una amida. En la reacción
descrita anteriormente, el succinimidil éster es un grupo saliente
que causa la formación de amida. El uso de los succinimidil ésteres
tales como los compuestos de fórmula II para producir conjugados
con proteínas se describe en la Patente de los Estados Unidos No.
5,672,662, publicada el 30 de septiembre de 1997 (Harris y
col.).
La EPO humana contiene nueve grupos amino
libres, el grupo amino-terminal amino más los grupos
\varepsilon-amino de 8 residuos de lisina. Cuando
el reactivo de pegilación se combinó con un compuesto SBA de Fórmula
II, se halló que a un pH 7.5, una relación proteína: PEG de 1:3, y
una temperatura de reacción de 20-25ºC, se produjo
una mezcla de las cantidades mono-pegilada,
di-pegilada y trazas de la especie
tri-pegilada. Cuando el reactivo de pegilación era
un compuesto SPA de Fórmula II, en condiciones similares excepto que
la relación proteína:PEG era 1:2, se produjo principalmente la
especie mono-pegilada. La EPO pegilada puede ser
administrada como una mezcla, o como diferentes especies pegiladas
separadas por la cromatografía de intercambio de cationes.
Manipulando las condiciones de reacción (por ejemplo, relación de
reactivos, pH, temperatura, concentración de proteína, tiempo de
reacción, etc.), se pueden variar las cantidades relativas de las
diferentes especies pegiladas.
Una modalidad preferida adicional de la presente
invención se refiere al uso como se definió anteriormente, en donde
la proteína eritropoyetina es un conjugado comprendiendo dicho
conjugado una proteína eritropoyetina como se definió anteriormente
que tenía al menos un grupo amino libre y que tenía la actividad
biológica in vivo que hace que las células de la médula ósea
aumenten la producción de reticulocitos y eritrocitos, y
seleccionada entre el grupo que consiste en proteína eritropoyetina
humana y análogos de la misma que tienen la estructura primaria de
la proteína eritropoyetina humana modificada por la adición de 1 a 6
sitios de glucosilación; estando ligada dicha proteína
eritropoyetina en forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi
inferior poli(etilenglicol), estando ligado cada grupo
poli(etilenglicol) en forma covalente a la proteína
eritropoyetina por medio de un ligador de la fórmula
-C(O)-X-S-Y-
con el C(O) del ligador formando un enlace amida con uno de
dichos grupos amino, X es -(CH_{2})_{k}- o
-CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
k es de 1 a 10, Y es
el peso molecular promedio de cada
parte poli(etilenglicol) es de aproximadamente 20 kilodaltons
a aproximadamente 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado
es de aproximadamente 51 kilodaltons a aproximadamente 175
kilodaltons.
Esta especie de eritropoyetina también puede
estar representada por la fórmula (III):
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR]_{n}
en donde R puede ser cualquier
alquilo inferior. Un alquilo inferior preferido es metilo. X puede
ser -(CH_{2})_{k}- o
-CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
en donde k es de 1 a aproximadamente 10. De preferencia k es de 1 a
aproximadamente 4, de más preferencia, k es 1 ó 2. De más
preferencia, X es
-(CH_{2}).
En la Fórmula 1, Y es
de
preferencia
de más
preferencia
En la fórmula (III), el número m es seleccionado
de tal modo que el conjugado resultante de fórmula (III) tiene una
actividad fisiológica comparable a la de la EPO no modificada, o una
fracción de, la actividad correspondiente de la EPO no modificada.
La m representa el número de residuos de óxido de etilo en la unidad
PEG. Una sola subunidad PEG de -(OCH_{2}CH_{2})- tiene un peso
molecular de aproximadamente 44 daltons. Por lo tanto, el peso
molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular de la EPO)
depende del número m. Un peso molecular de "aproximadamente"
un determinado número significa que se encuentra dentro de un rango
razonable de ese número según se determinó por técnicas analíticas
convencionales. m es un número entero que oscila entre
aproximadamente 450 y aproximadamente 900 (correspondiendo a un
peso molecular desde 20 a 40 kDa), de preferencia m es de
aproximadamente 550 a aproximadamente 800 (aproximadamente 24 a 35
kDa) y de más preferencia m es de aproximadamente 650 a
aproximadamente 700 (aproximadamente 29 a aproximadamente 31
kDa).
En la Fórmula (III), el número n es el número de
grupos \varepsilon-amino de un aminoácido lisina
en una proteína eritropoyetina unida en forma covalente a una
unidad PEG por medio de una unión amida. Un conjugado de esta
invención puede tener una, dos o tres unidades PEG por molécula de
EPO. n es un número entero que oscila entre 1 y 3, de preferencia n
es 1 ó 2 y de más preferencia n es 1.
Las proteínas eritropoyetina preferidas de
fórmula (III) son representadas por las fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
En la modalidad que más se prefiere de la
presente invención, un conjugado de eritropoyetina es representado
por la fórmula:
en donde en las fórmulas anteriores
n es un número entero de 1 a 3; m es un número entero de 450 a 900;
R es alquilo inferior; X es -(CH_{2})_{k}- o
-CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-
y P es el residuo de la proteína eritropoyetina sin el grupo o
grupos amino que forman una unión amida con
X.
Otros productos de la glucoproteína
eritropoyetina preferidos están representados por las fórmulas:
Los productos de la glucoproteína eritropoyetina
que más prefieren están representados por la fórmula:
Estas proteínas eritropoyetina pueden ser
preparadas:
(a) haciendo reaccionar en forma covalente un
grupo \varepsilon-amino de un aminoácido lisina de
una proteína eritropoyetina representada por la fórmula
P-[NH_{2}]_{n}, con un reactivo
bi-funcional representado por la fórmula
Z-CO-X-S-Q,
para formar un intermediario con una unión amida representada por la
fórmula:
P-[NH-CO-X-S-Q]_{n}
en donde P es una proteína
eritropoyetina menos el grupo amino que forma una unión amida; n es
un número entero que oscila entre 1 y 3; Z es un grupo reactivo,
por ejemplo, NHS éster carboxílico; X es -(CH_{2})_{k}-
o
-CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-
en donde k es de 1 a aproximadamente 10; y Q es un grupo protector, como alcanoilo, por ejemplo, acetilo.
en donde k es de 1 a aproximadamente 10; y Q es un grupo protector, como alcanoilo, por ejemplo, acetilo.
(b) haciendo reaccionar en forma covalente el
intermediario con una unión amida de la etapa (a) con un derivado
poli(etilenglicol) activado representado por la fórmula
W-[OCH_{2}CH_{2}]_{m}-OR, para formar
un producto de glucoproteína eritropoyetina representado por la
fórmula:
en donde W es una forma reactiva
sulfhidrilo de Y; m es un número entero que oscila entre
aproximadamente 450 y aproximadamente 900; R es alquilo inferior; e
Y es como se definió
anteriormente.
En esta modalidad, el reactivo
bi-funcional es de preferencia
N-succinimidil-S-acetiltiopropionato
o
N-succinimidil-S-acetiltioacetato,
Z es de preferencia
N-hidroxi-succinimida, y el derivado
poli(etilenglicol) activado
W-[OCH_{2}CH_{2}]_{m}-OR es
seleccionado de preferencia entre el grupo que consiste en
yodo-acetil-metoxi-PEG,
metoxi-PEG-vinilsulfona y
metoxi-PEG-maleimida.
Más detalladamente, las proteínas eritropoyetina
de fórmula (III) pueden ser preparadas uniendo en forma covalente
los grupos tiol a EPO ("activación") y acoplando la EPO
activada resultante con un derivado poli(etilenglicol)
(PEG). La primera etapa para la preparación de la EPO pegilada de
acuerdo con la presente invención comprende unir en forma covalente
los grupos tiol por medio de los grupos NH_{2} de EPO. Esta
activación de EPO se realiza con reactivos
bi-funcionales que llevan un grupo tiol protegido y
un grupo reactivo adicional, tal como ésteres activos (por ejemplo,
un succinimidil éster), anhídridos, ésteres de ácidos sulfónicos,
halogenuros de ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos,
respectivamente. El grupo tiol es protegido por grupos conocidos en
la técnica, por ejemplo, grupos acetilo. Estos reactivos
bi-funcionales son capaces de reaccionar con los
grupos \xi-amino de los aminoácidos lisina
formando una unión amida. La primera etapa de la reacción se
presenta a continuación:
en donde EPO, n y X son como se
definieron anteriormente y Z es un grupo reactivo conocido en la
técnica, por ejemplo, un sustituyente
N-hidroxi-succinimida (NHS) de la
fórmula:
En una modalidad preferida la activación de los
grupos \varepsilon-amino lisina se realiza por
reacción con reactivos bi-funcionales que tienen
una parte succinimidilo. Los reactivos
bi-funcionales pueden llevar diferentes especies de
espaciadores, por ejemplo, partes -(CH_{2})_{k}- o
-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-
en donde k es de 1 a aproximadamente 10, de preferencia de 1 a
aproximadamente 4, y de más preferencia 1 ó 2 y de mayor
preferencia 1. Ejemplos de estos reactivos son
N-succinimidil-S-acetiltiopropionato
(SATP) y
N-succinimidil-S-acetiltioacetato
(SATA).
Acetiltioalquil-carboxílico-NHS-éster,
como
2-(Acetiltio)-(etoxi)_{k}-ácido
acético-NHS-éster
con k como se definió anteriormente.
La preparación de los reactivos
bi-funcionales es conocida en la técnica. Los
precursores de los 2-(acetiltio)-(etoxi)_{k}-ácido
acético-NHS-ésteres se describen en la
DE-3924705, mientras que la derivación al compuesto
acetiltio es descrita por March, J., "Advanced Organic
Chemistry", McGraw-Hill, 1977,
375-376. SATA se puede obtener comercialmente
(Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU. y Pierce, Rockford, IL).
El número de grupos tiol a ser agregados a una
molécula de EPO puede ser seleccionado ajustando los parámetros de
reacción, es decir, la concentración de proteína (EPO) y la relación
proteína/reactivo bi-funcional. De preferencia, la
EPO es activada uniendo en forma covalente de 1 a 5 grupos tiol por
molécula de EPO, de más preferencia de 1.5 a 3 grupos tiol por
molécula de EPO. Estos rangos se refieren a la distribución
estadística del grupo tiol en la población de la proteína EPO.
La reacción se lleva a cabo, por ejemplo, en una
solución tampón acuosa, pH 6.5-8.0, por ejemplo, en
10 mM de fosfato de potasio, 50 mM de NaCl, pH 7.3. El reactivo
bi-funcional puede ser agregado en DMSO. Después de
completar la reacción, de preferencia después de 30 minutos, se
detiene la reacción por adición de lisina. El exceso del reactivo
bi-funcional puede ser separado por métodos
conocidos en la técnica, por ejemplo, por diálisis o filtración en
columna. El número promedio de grupos tiol agregados a la EPO puede
ser determinado por métodos fotométricos descritos en, por ejemplo,
Grasett, D. R. y Murray, J. F. en J. Appl. Biochem. Biotechnol.
119, 41-49 (1967).
La reacción anterior es seguida por el
acoplamiento covalente de un derivado de poli(etilenglicol)
(PEG) activado. Los derivados de PEG adecuados son moléculas PEG
activadas con un peso molecular promedio de aproximadamente 20 a
aproximadamente 40 kDa, de más preferencia de aproximadamente 24 a
aproximadamente 35 kDa y de mayor preferencia de aproximadamente 30
kDa.
Los derivados de PEG activados son conocidos en
la técnica y se describen en, por ejemplo, Morpurgo, M. y col., J.
Bioconj. Chem. (1996) 7, página 363 ss. para
PEG-vinilsulfona. Las especies de PEG de cadena
lineal y de cadena ramificada son adecuadas para la preparación de
los compuestos de Fórmula 1. Ejemplos de reactivos PEG que
reaccionan son
yodo-acetil-metoxi-PEG
y metoxi-PEG-vinilsulfona:
El uso de estas sustancias activadas con yodo es
conocido en la técnica y descrito por ejemplo, por Hermanson, G. T.
en "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego (1996),
páginas 147-148.
De mayor preferencia, las especies PEG son
activadas por maleimida usando (alcoxi
inferior-PEG-maleimida), tal como
metoxi-PEG-maleimida (PM 30000;
Shearwater Polymers, Inc.). La estructura de alcoxi
inferior-PEG-maleimida es como
sigue:
con R y m como se definieron
anteriormente, de
preferencia:
La reacción de acoplamiento con alcoxi
inferior-PEG-maleimida se lleva a
cabo después de la separación in situ del grupos protector
tiol en una solución tampón acuosa, por ejemplo, 10 mM de fosfato de
potasio, 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 6.2. La separación del
grupo protector puede ser realizada, por ejemplo, con hidroxilamina
en DMSO a 25ºC, pH 6.2 durante aproximadamente 90 minutos. Para la
modificación PEG la relación molar de EPO/alcoxi
inferior-PEG-maleimida activada
debería ser de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:6, y de
preferencia 1:4. La reacción puede ser detenida por adición de
cisteína y reacción de los grupos tiol (-SH) restantes con
N-metilmaleimida u otros compuestos apropiados
capaces de formar enlaces disulfuro. Debido a la reacción de
cualquier grupo tiol activo restante con un grupo protector tal como
N-metilmaleimida u otro grupo protector adecuado,
las glucoproteínas EPO en los conjugados de esta invención pueden
contener tales grupos protectores. Generalmente el procedimiento
descrito en la presente producirá una mezcla de moléculas que tiene
diversos números de tioles protegidos por diferentes números del
grupo protector, dependiendo del número de grupos tiol activados en
la glucoproteína que no fueron conjugados a
PEG-maleimida.
Mientras que la N-metilmaleimida
forma el mismo tipo de enlace covalente cuando se usa para bloquear
a los grupos tiol restantes en la proteína pegilada, los compuestos
disulfuro llevarán en una reacción de intercambio sulfuro/disulfuro
intermolecular a un acoplamiento con puente disulfuro del reactivo
de bloqueo. Los reactivos de bloqueo preferidos del reactivo de
bloqueo. Los reactivos de bloqueo preferidos para este tipo de
reacción de bloqueo son glutatión oxidado (GSSG), cisteína y
cistamina. Mientras que con cisteína no se introduce ninguna carga
neta adicional en la proteína pegilada, el uso de los reactivos de
bloqueo GSSG o cistamina da por resultado una carga negativa o
positiva adicional.
La purificación adicional de los compuestos de
fórmula (III), incluyendo la separación de especies EPO mono-, di-
y tri-pegiladas, puede ser realizada por medio de
métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, cromatografía en
columna.
Los derivados de eritropoyetina pegilados
contienen de preferencia al menos 90% de conjugados
mono-PEG. Generalmente los conjugados
mono-PEG de las glucoproteínas eritropoyetina son
convenientes debido a que tienden a tener mayor actividad que los
conjugados di-PEG. El porcentaje de conjugados
mono-PEG así como también la reacción entre las
especies mono- y di-PEG puede ser controlada por
medio de una reunión de las fracciones más amplias alrededor del
pico de elución para disminuir el porcentaje de fracciones
mono-PEG o más estrechas para aumentar el
porcentaje de mono-PEG en la composición.
Aproximadamente 90% de los conjugados mono-PEG es un
buen equilibrio de rendimiento y actividad. Algunas veces pueden
ser convenientes composiciones en las cuales, por ejemplo, al menos
92% o al menos 96% de los conjugados son especies
mono-PEG (n igual 1). En una modalidad de esta
invención, el porcentaje de conjugados en donde n es 1 es de 90% a
96%.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
eritropoyetina pegilada son conocidas en la técnica y se describen,
por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 01/87329.
Las composiciones pueden comprender 10 a 10000 \mug de una
proteína eritropoyetina por ml como se definió anteriormente. De
preferencia, las composiciones comprenden 10 a 1000 \mug, por
ejemplo, 10, 50, 100, 400, 800 ó 2500 \mug por ml. Además, las
composiciones pueden comprender 10 \mug a 1000 \mug de proteína
eritropoyetina por ml, 10 - 200 mmoles/l de sulfato, 10 a 50
mmoles/l de fosfato, pH 6.0 a 6.5. Esta composición puede comprender
también hasta 20 mM de metionina, 1-5% de un poliol
(p/v), 0.1% de pluronic F68 (p/v) y opcionalmente hasta 1 mM de
CaCl_{2}. Un ejemplo de esta composición comprende hasta 10
\mug de proteína eritropoyetina por ml, 40 mmoles/l de sulfato, 10
mmoles/l de fosfato, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01%
de pluronic F68 (p/v), pH 6.2. Alternativamente la composición
puede comprender 10 \mug a 10000 \mug de proteína eritropoyetina
por ml, 10 a 100 mmoles/l de NaCl, 10 a 50 mmoles/l de fosfato, pH
6.0 a 7.0, opcionalmente 1-5% (p/v) de un poliol.
Además, esta composición puede comprender hasta 20 mM de metionina,
hasta 0.1% de pluronic F68 (p/v) y opcionalmente 7.5 \mumoles/l
de CaCl_{2}. Específicamente, esta composición puede comprender 10
\mug a 10000 \mug de proteína eritropoyetina por ml, 100
mmoles/l de NaCl, 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) y
10 mmoles/l de fosfato, pH 7.0.
La presente invención también se refiere a la
composición anteriormente mencionada que comprende 10 \mug a
10000 \mug de proteína eritropoyetina por ml, 10 a 50 mmoles/l de
arginina, pH 6 a pH 6.5, 10 a 100 mmoles/l de sulfato de sodio.
Además, esta composición puede comprender hasta 20 mM de metionina,
hasta 0.1% de pluronic F68 (p/v), opcionalmente hasta 1 mM de
CaCl_{2} y opcionalmente 1-5% (p/v) de un poliol.
Específicamente, esta composición puede comprender 10 \mug a
10000 \mug de proteína eritropoyetina por ml, 40 mmoles/l de
arginina, pH 6.2, 30 mmoles/l de sulfato de sodio, 3% de manitol
(p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) y
opcionalmente 1 mmol/l de CaCl_{2}.
Una modalidad preferida de la presente invención
se refiere a composiciones que comprenden 10 a 10000 \mug/ml de
eritropoyetina, de preferencia 25 a 2500 \mul/ml de
eritropoyetina, y
- a)
- 10 mM de fosfato de sodio/potasio, 100 mM de NaCl, pH 7.0, o
- b)
- 10 mM de fosfato de sodio, 120 mM de NaCl, pH 6.2, o
- c)
- 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), pH 6.2, o
- d)
- 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2, o
- e)
- 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), pH 6.2, o
- f)
- 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2.
En la modalidad mas preferida, las composiciones
comprenden una cantidad de proteína eritropoyetina de 50, 100, 400,
800 ó 2500 \mug/ml. Las composiciones que más se prefieren o bien
10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol
(p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2 ó 40
mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), 10
mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2. Otros
detalles de tales composiciones se conocen en la WO 01/87329.
La invención también se refiere a un método para
tratar trastornos de la distribución de hierro en enfermedades
cardíacas que comprende la administración de una cantidad efectiva
de proteína eritropoyetina como se definió anteriormente. Además,
la invención se refiere a un medicamento para tratar los trastornos
de la distribución de hierro en enfermedades cardíacas
caracterizado porque contiene una cantidad efectiva de proteína
eritropoyetina. Ejemplos de enfermedades cardíacas son, por
ejemplo, enfermedad cardíaca coronaria, ateroesclerosis,
ateroesclerosis coronaria, síndrome coronario agudo, falla
cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva y/o insuficiencia
cardíaca. En el contexto del método y el medicamento mencionados
anteriormente, la insuficiencia cardíaca es la forma preferida de
las enfermedades cardíacas. Los métodos y medicamentos preferidos
como se describen anteriormente son aquellos en donde la proteína
eritropoyetina es como se definió anteriormente.
En el tratamiento de los trastornos de la
distribución de hierro en enfermedades cardíacas, la EPO puede ser
administrada, por ejemplo, a una dosis de 150 U/kg de peso corporal
dos veces por semana. La dosis puede variarse de acuerdo con los
requerimientos del paciente individual y también puede encontrarse
en un rango de por ejemplo, 100 a 200 U/kg. Dependiendo del tiempo
de vida media del derivado de EPO usado, una dosis puede ser
administrada entre por ejemplo, 1 ó 3 veces por semana. Dependiendo
de los requerimientos de un paciente individual, un médico puede
elegir también una dosis diferente.
La actividad específica de la EPO o los
conjugados de EPO de acuerdo con esta invención puede ser
determinada por varios ensayos conocidos en la técnica. La
actividad biológica de las proteínas EPO purificadas de esta
invención es de tal modo que la administración de la proteína EPO
por inyección a pacientes da por resultado que las células de la
médula ósea aumentan la producción de reticulocitos y eritrocitos en
comparación con los grupos de pacientes control o no inyectados. La
actividad biológica de las proteínas EPO, o fragmentos de las
mismas, obtenidas y purificadas de acuerdo con esta invención pueden
ser probadas por métodos de acuerdo con Annable, y col., Bull. Wld,
Hlth. Org. (1972), 47:99-122, y Pharm. Europa Spec.
Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2). Otro ensayo biológico para
determinar la actividad de la proteína EPO, el ensayo del ratón
normocitanémico, se describe en la técnica (por ejemplo, Pharm.
Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2) y la monografía
de eritropoyetina de Ph. Eur. BRP).
La invención se comprenderá mejor con referencia
a los siguientes ejemplos que ilustran pero no limitan a la
invención descrita en la presente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Un hombre de edad media con enfermedad cardíaca
es controlado después de un catéter cardíaco por trastornos de la
distribución de hierro por medio de la determinación de los
siguientes parámetros - CRP (proteína reactiva C), ferritina y
receptor de transferrina soluble - como describieron P. Lehmann, M.
Wolkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, informa presentado en
el AACC/CSCC, Reunión Anual, 29 de julio - 2 de agosto, 2001,
Chicago, Illinois. Los resultados muestran trastornos de la
distribución de hierro. El paciente es tratado en forma subcutánea
con 150 U/kg de Recormon^{TM} (proteína eritropoyetina que se
puede obtener comercialmente) dos veces por semana durante un
máximo de 12 semanas. Después, la determinación de los parámetros
como se describieron anteriormente muestra una mejora del trastorno
de la deficiencia de hierro.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: F.Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 124 Grenzacherstrasse
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (61) 688 11 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (61) 688 13 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 962 292 hlr ch
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo uso de eritropoyetina en enfermedades cardíacas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA PARA COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DEL MEDIO: Disquetes
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: WORD
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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Claims (14)
1. El uso de la proteína eritropoyetina en la
elaboración de un medicamento para el tratamiento de trastornos de
la distribución de hierro en enfermedades cardíacas.
2. El uso de conformidad con la reivindicación
1, en donde la enfermedad cardíaca es insuficiencia cardíaca.
3. El uso de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eritropoyetina es una
eritropoyetina humana.
4. El uso de conformidad con la reivindicación
3, en donde la proteína eritropoyetina es epoetina alfa o epoetina
beta.
5. El uso de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína eritropoyetina es
expresada por activación génica endógena.
6. El uso de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eritropoyetina tiene
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
7. El uso de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eritropoyetina tiene
la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por la adición
de 1 a 6 sitios de glucosilación.
8. El uso de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eritropoyetina es
darbepoetina alfa.
9. El uso de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eritropoyetina, como
se definió en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, es
pegilada.
10. El uso de conformidad con la reivindicación
9, en donde la proteína eritropoyetina es un conjugado,
comprendiendo dicho conjugado una proteína eritropoyetina que tiene
al menos un grupo amino libre y que tiene la actividad biológica
in vivo que hace que las células de la médula ósea aumenten
la producción de reticulocitos y eritrocitos y es seleccionada
entre el grupo que consiste en eritropoyetina humana y análogos de
la misma que tienen una secuencia de eritropoyetina humana
modificada por la adición de 1 a 6 sitios de glucosilación o un
reordenamiento de al menos un sitio de glucosilación; estando dicha
eritropoyetina ligada en forma covalente a los grupos n
poli(etilenglicol) de la fórmula
-CO-(CH_{2})_{x}-(OCH_{2}CH_{2})_{m}-OR,
con el grupo -CO de cada grupo poli(etilenglicol) formando
un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde R es
alquilo de C_{1}-C_{6}; x es 2 ó 3; m es de
aproximadamente 450 a aproximadamente 900; n es de 1 a 3; y n y m
son elegidos de modo que el peso molecular del conjugado menos la
proteína eritropoyetina es de 20 kilodaltons a 100 kilodaltons.
11. El uso de conformidad con la reivindicación
10, en donde x es 2, m es 650 a 750, n es 1 y R es metilo.
12. El uso de conformidad con la reivindicación
9, en donde la proteína eritropoyetina es un conjugado,
comprendiendo dicho conjugado una proteína eritropoyetina que tiene
al menos un grupo amino libre y que tiene la actividad biológica
in vivo que hace que las células de la médula ósea aumenten
la producción de reticulocitos y eritrocitos y seleccionada entre
el grupo que consiste en proteína eritropoyetina humana y análogos
de la misma que tienen la estructura primaria de la proteína
eritropoyetina humana modificada por la adición de 1 a 6 sitios de
glucosilación; estando ligada dicha proteína eritropoyetina en forma
covalente a de uno a tres grupos alcoxi inferior
poli(etilenglicol), estando ligado cada grupo
poli(etilenglicol) en forma covalente a la proteína
eritropoyetina por medio de un ligador de la fórmula
-C(O)X-S-Y- con el
C(O) del ligador formando un enlace con uno de dichos grupos
amino, X es -(CH_{2})_{k}-
o -CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-, k es de 1 a 10, Y es:
o -CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-, k es de 1 a 10, Y es:
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el peso molecular promedio de cada
parte poli(etilenglicol) es de aproximadamente 20 kilodaltons
a aproximadamente 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado
es de aproximadamente 51 kilodaltons a aproximadamente 175
kilodaltons.
13. El uso de conformidad con la reivindicación
12, con un conjugado de eritropoyetina de la fórmula:
en donde n es un número entero de 1
a 3; m es un número entero de 450 a 900; R es alquilo inferior; X es
-(CH_{2})_{k}- o
-CH_{2}(O-CH_{2}-CH_{2})_{k}-,
k es 1 a 10 y P es el residuo de la proteína amida con
X.
14. Un medicamento para tratar los trastornos de
la distribución de hierro en enfermedades cardíacas
caracterizado porque contiene una cantidad efectiva de
proteína eritropoyetina.
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