NUEVO USO DE ERITROPOYETINA EN ENFERMEDADES CARDIACAS
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un nuevo uso de eritropoyetina, especialmente para el tratamiento de trastornos de la distribución de hierro en las enfermedades cardíacas . Se conocen diversas enfermedades en las cuales el metabolismo de hierro no es normal. En una anemia, no se puede formar suficiente sangre debido a una falta general de hierro en el cuerpo. Otra condición metabólica relacionada con el hierro es la hemocromatosis , en la cual la concentración total de hierro en el cuerpo es mayor que la normal, lo que conduce a diversas condiciones tales como, por ejemplo, la destrucción de órganos . Los trastornos de la distribución de hierro difieren de la anemia y la hemocromatosis descritas anteriormente debido a que la concentración total de hierro en el cuerpo es normal. Por un lado, el hierro es acumulado en diversos órganos y puede conducir a daños y aún destrucción de esos órganos. Por otro lado, el uso del hierro que está presente en cantidades normales en la formación de sangre se encuentra deteriorado, llevando a efectos secundarios que se pueden comparar con los relacionados con la anemia. REF: 163715 Hasta ahora no se sabía que los pacientes que padecen de enfermedades cardíacas tiene una alta probabilidad de ser afectados por trastornos de la distribución de hierro. Los trastornos de la distribución de hierro pueden ser diagnosticados mediante diversos parámetros que se usan comúnmente en el diagnóstico del estado del hierro. En base a las mediciones de ferritina y del receptor de transferrina soluble es posible evaluar si la concentración total de hierro en un paciente que padece de enfermedades cardíacas es normal. Si es éste el caso, entonces una concentración disminuida de hemoglobina en los reticulocitos es un indicador de trastornos de la distribución de hierro. Otro indicador es una concentración elevada continua/prolongada de la proteína reactiva C (CRP) en paciente que padecen de enfermedades cardíacas y que presentan una concentración de hierro total normal. Un método para diagnosticar trastornos de la distribución de hierro ha sido descrito por P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf , R. Roeddiger, informe presentado en la ACC/CSCC, Reunión Anual, 29 de julio - 2 de agosto, 2001, Chicago, Illinois. Hasta ahora no se ha sugerido ningún tratamiento para paciente con enfermedades cardíacas que padecen de trastornos de la distribución de hierro. El problema subyacente a la presente invención es por lo tanto proveer un tratamiento para los trastornos de la distribución de hierro en las enfermedades cardiacas para minimizar o suprimir las desventajas anteriormente mencionadas. Se halló sorprendentemente que la eritropoyetina tiene' un efecto beneficioso sobre los trastornos de la distribución de hierro en las enfermedades cardíacas . El problema se ha resuelto por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, proporcionando eritropoyetina para el uso en el tratamiento de los trastornos de la distribución de hierro en las enfermedades cardíacas. A menos que se indique de otra manera las siguientes definiciones se presentan para ilustrar y definir el significado y el alcance de los diversos términos usados para describir la invención en la presente. El término "alquilo inferior" como se usa en la presente significa un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de uno a seis átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo inferior incluyen metilo, etilo e isopropilo, de preferencia metilo. El término "alcoxi inferior" como se usa en la presente significa un grupo R'-O-, en donde R' es un alquilo inferior como se describió anteriormente. El término "trastornos de la distribución de hierro en las enfermedades cardíacas" se refiere a un trastorno de la distribución de hierro que ocurre en paciente que padecen de enfermedades cardíacas. El trastorno de la distribución de hierro puede ser caracterizado, por ejemplo, como se describió anteriormente. Particularmente, un trastorno de la distribución de hierro está caracterizado por los siguientes parámetros : la concentración del receptor de transferrina soluble [mg/l] dividido por log (concentración de ferritina [ß3</1] es menor de 3.5 y simultáneamente la concentración de la proteína C reactiva es mayor de 5 mg/l. El término "eritropoyetina" o "proteína eritropoyetina" se refiere a una proteína con la actividad biológica in vivo de hacer que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y eritrocitos y seleccionada entre el grupo que consiste en eritropoyetina humana y análogos que se definen más adelante . El término "eritropoyetina pegilada (Peg-EPO o PEG-EPO) " se refiere a una proteína eritropoyetina que está unida en forma covalente con uno a tres derivados de polietileno como se describe más adelante. Figura 1: Estructura primaria de la EPO humana (165 aminoácidos) (SEQ ID N0:1) . Figura 2 : Estructura primaria de la EPO humana ,(166 aminoácidos) (SEQ ID NO: 2 ). . Más detalladamente, la presente invención se refiere al uso de eritropoyetina en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de los trastornos de la distribución de hierro en las enfermedades cardíacas. Ejemplos de enfermedades cardíacas son, por ejemplo, enfermedad cardíaca coronaria, ateroesclerosis , ateroesclerosis coronaria, síndrome coronario agudo, falla cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva y/o insuficiencia cardíaca. En una modalidad preferida, la invención se refiere a un uso como se definió anteriormente, en donde la enfermedad cardíaca es insuficiencia cardíaca. La presente invención es especialmente útil para la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden eritropoyetina como ingrediente farmacéuticamente activo. El término "eritropoyetina" o "proteína eritropoyetina" o "EPO" es como sigue: particularmente los términos se refieren a una glucoproteína , por ejemplo, la eritropoyetina humana, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en (SEQ ID NO: 1) o (SEQ ID NO : 2 ) o una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a las mismas, cuyas propiedades biológicas se refieren a la estimulación de la producción de eritrocitos y a la estimulación de la división y la diferenciación de progenitores eritroides comprometidos en la médula ósea. Como se usa en la presente, estos términos incluyen a las proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, por mutagénesis dirigida a nn sitio o accidentalmente por medio de mutaciones. Estos términos también incluyen análogos que tienen de 1 a 6 sitios adicionales para glucosilación, análogos que tienen al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxi terminal, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un sitio de glucosilación, y análogos que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye un reordenamiento de al menos un sitio para glucosilación. Estos términos incluyen a la eritropoyetina humana natural y a la producida en forma recombinante . En una modalidad preferida de la presente invención, la proteína eritropoyetina es una eritropoyetina humana . Como se presenta en detalle más adelante, la preparación y purificación de la EPO son bien conocidas en la técnica. Por eritropoyetina se entiende la proteina natural o recombinante, de preferencia humana, por ejemplo, epoetina alfa o epoetina beta, como se obtiene a partir de cualquier fuente convencional tal como tejidos, síntesis de proteínas, cultivo de células con células naturales o recombinantes . Está comprendida cualquier proteína que tiene la actividad de la eritropoyetina, tal como las muteínas u otras proteínas modificadas. En una modalidad preferida de la presente invención, la proteína eritropoyetina es epoetina alfa o epoetina beta. La EPO recombinante puede ser preparada por medio -de la expresión en líneas celulares CHO, BHK o HeLa, por tecnología de ??? recombinante o por activación génica endógena. La expresión de las proteínas, incluyendo, por activación génica endógena, es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,733,761, 5,641,670 y 5,733,746, y las publicaciones de patentes internacionales Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia. Se prefiere el uso como se definió anteriormente, en donde la proteina eritropoyetina es expresada por activación génica endógena. La especie de EPO preferida para la preparación de los productos de glucoproteína eritropoyetina son especies de EPO humanas. De más preferencia, la especie de EPO es la EPO humana que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO : 1 o la SEQ ID NO : 2 , de más preferencia la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere por lo tanto al uso como se describió anteriormente, en donde la proteína eritropoyetina tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l o la SEQ ID NO: 2. Además, la eritropoyetina puede ser un análogo de glucoproteína que tiene de 1 a 6 sitios adicionales para glucosilacion. Por lo tanto, la presente invención se refiere también al uso como se describió antes, en donde la proteína eritropoyetina tiene la secuencia de eritropoyetina humana modificada por la adición de 1 a.6 sitios de glucosilacion. La glucosilacion de una proteína, con uno o más grupos de oligosacáridos , se realiza en ubicaciones específicas a lo largo del esqueleto de polipéptidos y afecta en gran parte las propiedades físicas de la proteína tales como la estabilidad de la proteína, la secreción, la localización subcelular y la actividad biológica. La glucosilación es generalmente de dos tipos. Los oligosacáridos ligados a 0 están unidos a los residuos de serina o treonina y los oligosacáridos ligados a N están unidos a los residuos de asparagina. Un tipo de oligosacárido hallado tanto e los oligosacáridos ligados a N como en los ligados a 0 es el ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) , que es una familia de amino azúcares que contiene 9 o más átomos de carbono. El ácido siálico es generalmente el residuo terminal tanto en los oligosacáridos ligados a N como en los ligados a 0, y, debido a que lleva una carga negativa, confiere propiedades ácidas a la glucoproteína. La eritropoyetina humana que tiene 165 aminoácidos, contiene tres cadenas de oligosacáridos ligados a N y una ligada a 0 que comprende aproximadamente 40% del peso molecular total de la glucoproteína. La glucosilación ligada a N se realiza en los residuos de asparagina ubicados en las posiciones 24, 38 y 83 y la glucosilación ligada a 0 se realiza en un residuo de serina ubicado en la posición 126. Las cadenas de oligosacáridos son modificadas con residuos de ácido siálico terminales. La remoción enzimática de todos los residuos de ácido siálico de la eritropoyetina glucosilada da por resultado una pérdida de la actividad in vivo pero no de la actividad in vi tro debido a que la sialilación de eritropoyetina evita su ligadura, y la depuración subsiguiente, por la proteína de ligadura hepática. El término "eritropoyetina" incluye análogos de la eritropoyetina humana con uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana que da por resultado un aumento en el número de sitios para la unión del ácido siálico. Estos análogos de la glucoproteína pueden ser generados por mutagénesis dirigida a un sitio que tiene adiciones, deleciones, o sustituciones de residuos de aminoácidos que aumentan o alteran sitios que se pueden obtener para glucosilación. Los análogos de glucoproteína que tienen niveles de ácido siálico mayores que los hallados en la eritropoyetina humana son generados agregando, sitios de glucosilación que no perturban la conformación secundaria o terciaria requerida para la actividad biológica. Las glucoproteínas de la presente invención también incluyen análogos que tienen niveles aumentados de unión de carbohidratos en un sitio de glucosilación que involucra usualmente la sustitución de uno o más aminoácidos en la proximidad de un sitio ligado a N o ligado a 0. Las glucoproteínas de la presente invención también incluyen análogos que tienen uno o más aminoácidos que se extienden desde el extremo carboxi terminal de la eritropoyetina y que proveen al menos un sitio de carbohidratos adicional. Las proteínas de eritropoyetina de la presente composición también incluyen análogos que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye un reordenamiento de al menos un sitio para glucosilacion. Un reordenamiento de este tipo del sitio de glucosilacion involucra la deleción de uno o más sitios de glucosilacion en la eritropoyetina humana y la adición de uno o más sitios de glucosilacion que no ocurren naturalmente. Aumentar el número de cadenas de carbohidratos en la eritropoyetina, y por lo tanto el número de ácidos siálicos por moléculas de eritropoyetina puede conferir propiedades ventajosas tales como mayor solubilidad, mayor resistencia a la proteólisis, reducida inmunogenicidad, mayor vida media sérica y mayor actividad - biológica. Los análogos de eritropoyetina con sitios de glucosilacion adicionales se describen con mayores detalles en la Solicitud de Patente Europea 640 619, de Elliot, publicada el 1 de marzo de 1995. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica de la presente invención comprende proteínas de eritropoyetina con una secuencia de aminoácidos que incluye al menos un sitio adicional para glucosilacion tal como, pero no limitado a, eritropoyetinas que comprenden la secuencia de eritropoyetina humana modificada por una modificación seleccionada entre las siguientes: Asn30Thr32 ; Asn51Thr53 ; Asn7Thr59 ;
Asn69Thr71 ; Ser68Asn69Thr71 ; Val87Asn88Thr90; Ser87Asn88Thr90; Ser87Asn88Gly8SThr90; Ser87Asn88Thr90T r92; Ser87Asn88Thr90Alaie2; Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90; Asn89Ile90Thr91; Asn87Asn89Ile90Thr91; Asn136T r138; Asn138Thr140; T r125; y Pro124Thr125. La denominación usada en la presente para la modificación de la secuencia de aminoácidos significa que la o las posiciones de la proteína no modificada correspondiente (por ejemplo, hEPO de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 2) indicada por el o los números en superíndice cambia con respecto a el o los aminoácidos que preceden inmediatamente a el o los números en superíndice respectivos . La proteína eritropoyetina también puede ser un análogo que tiene al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxi terminal de la glucoproteína, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un sitio de glucosilación. El aminoácido adicional puede comprender un fragmento de péptido derivado del extremo carboxi terminal de la gonadotropina coriónica humana. De preferencia, la glucoproteína es un análogo seleccionado entre el grupo que consiste en (a) eritropoyetina humana que tiene la secuencia de aminoácidos Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gln, que se extiende desde el término carboxi; (b) el análogo de (a) que comprende además Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 EPO. La proteína eritropoyetina también puede ser un análogo que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye un reordenamiento de al menos un sitio para glucosilación. El reordenamiento puede comprender una deleción de cualquiera de los sitios de carbohidratos ligados a N en la eritropoyetina humana y una adición de un sitio de carbohidratos ligado a N en la posición 88 de la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana. De preferencia, la glucoproteína es un análogo seleccionado entre el grupo que consiste en Gln2Ser87Asn88Thr90 EPO; Gln38Ser87Asn88Thr90 EPO; y
Gln83Ser87Asn88Thr90 EPO. Un análogo adicional es darbepoetina alfa. Una proteína eritropoyetina preferida en el uso descrito antes es darbepoetina alfa . Más particularmente, la proteína eritropoyetina de la presente composición farmacéutica como se describe anteriormente también puede incluir derivados pegilados de la misma. Los derivados pegilados del a eritropoyetina y su preparación son conocidos en la técnica y descritos por ejemplo, en WO 01/02017, EP-A-1064951 , EP-A-539 , 167 , EP-A-605,363, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, Patente de los Estados Unidos No. 5,56, EP-A-58 , 876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,359,030 y 5,681,811, Patente de los Estados Unidos "No. 4,179,337, Patente Japonesa, WO 98/32466, Patente de los Estados Unidos No. 5,324,650. De preferencia, en el uso descrito anteriormente, la proteína eritropoyetina es pegilada. Una modalidad preferida de la especie eritropoyetina pegilada se refiere a los derivados como se describen más adelante . Por consiguiente, la presente invención también se refiere al uso como se describe anteriormente, en donde la proteína eritropoyetina es un conjugado, comprendiendo dicho conjugado una proteína eritropoyetina como se describió anteriormente que tiene al menos un grupo amino libre y que tiene la actividad biológica in vivo que hace que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y eritrocitos y seleccionada entre el grupo que consiste en eritropoyetina humana y análogos de la misma, que tienen una secuencia de eritropoyetina humana modificada por la adición de 1 a 6 sitios de glucosilación o un reordenamiento de al menos un sitio de glucosilación ; estando dicha eritropoyetina ligada en forma covalente a los grupos n poli (etilenglicol) de la fórmula -C0- (C¾) n- (OCH2CH2) n-0R con el -C0 (es decir, carbonilo) de cada grupo poli (etilenglicol ) formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino; en donde es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m es desde aproximadamente 450 a aproximadamente 900; n es de 1 a 3; y n y m son elegidos de modo que el peso molecular del conjugado menos la proteína eritropoyetina es de 20 3ilodaltons a 100 kilodaltons . Esta invención provee además composiciones farmacéuticas que contienen conjugados descritos en la presente en donde el porcentaje de conjugados en donde n es 1 es de al menos 90%, de preferencia al menos 92% o de preferencia 96% de todos los conjugados de la composición. Más específicamente, los conjugados mencionados anteriormente pueden ser representados por la fórmula (I) : P- [NHCO- (CH2)x- (OCH2CH2)m-OR]„ (I) en donde P es el residuo de una proteína eritropoyetina como se describió en la presente (es decir, sin el grupo amino o grupos amino que forman una unión amida con el carbonilo mostrado en la fórmula (I) , que tienen la actividad biológica in vivo que hace que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y eritrocitos; y en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3 ; m es de aproximadamente 450 a aproximadamente 900; n es de 1 a 3 ; y n y m son elegidos de modo que el peso molecular del conjugado menos la glucoproteína eritropoyetina es de 20 kilodaltons a 100 kilodaltons. De acuerdo con esta invención, R es cualquier alquilo inferior. Se prefieren los conjugados en donde R es metilo. El símbolo ¾" representa el número de residuo de óxido de etileno (OCH2CH2) en el grupo poli (óxido de etileno) . Una sola subunidad de PEG (polietilenglicol) de óxido de etileno tiene un peso molecular de aproximadamente 44 daltons. Por lo tanto, el peso molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular de la EPO) depende del número "m" . En los conjugados de esta invención "m" es de aproximadamente 450 a aproximadamente 900 (correspondiendo a un peso molecular de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa) , de preferencia de aproximadamente 650 a aproximadamente 750 (correspondiendo a un peso molecular de aproximadamente 30 kDa) . El número m es seleccionado de tal modo que el conjugado resultante de esta invención tiene una actividad fisiológica comparable a la ??? no modificada, cuya actividad puede representar una actividad igual que, mayor que, o una fracción de, la actividad correspondiente de la EPO no modificada. Un peso molecular de "aproximadamente" un determinado número significa que está dentro de un rango razonable de ese número tal como es determinado por técnicas analíticas convencionales . El número "m" es seleccionado de modo que el peso molecular de cada grupo poli (etilenglicol) unido en forma covalente a la glucoproteína eritropoyetina es de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa y es de preferencia de aproximadamente 30 kDa. En los conjugados de esta invención, el número "n" es el número de poli (etilenglicol ) unidos en forma covalente a grupos amino libres (incluyendo grupos e-amino de un aminoácido lisina y/o el grupo amino-terminal amino) de una proteína eritropoyetina por medio de uniones amida. Un grupo conjugado de esta invención puede tener uno, dos, o tres grupos PEG por molécula de EPO . "n" es un número entero que oscila entre 1 y 3, de preferencia ¾n" es 1 ó 2 , y de más preferencia "n" es 1. Un conjugado preferido de los conjugados descritos anteriormente comprende compuestos en donde x es 2 , m es 650 a 750, n es 1 y R es metilo. El compuesto de fórmula (I) puede ser preparado a partir del material polimérico conocido:
RO(CH2CH20)m(CH2)xCOOÍjl (II)
en donde R y m son como se describieron anteriormente, condensando el compuesto de Fórmula II con la glucoproteína eritropoyetina. Los compuestos de fórmula (II) en donde x es 3 son alfa-alcoxi inferior, ácido butírico succinimidil ásteres de poli (etilenglicol) (alcoxi inferior-PEG-SBA) . Los compuestos de fórmula (II) en donde x es 2 son alfa-alcoxi inferior, ácido propiónico succinimidil esteres de poli (etilenglicol) (alcoxi inferior-PEG-SPA) . Se puede utilizar cualquier método convencional de hacer reaccionar un éster activado con una amina para formar una amida. En la reacción descrita anteriormente, el succinimidil éster es un grupo saliente que causa la formación de amida. El uso de los succinimidil ésteres tales como los compuestos de fórmula II para producir conjugados con proteínas se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,672,562, publicada el 30 de septiembre de 1997 (Harris y col.). La EPO humana contiene nueve grupos amino libres, el grupo amino-terminal amino más los grupos e-amino de 8 residuos de lisina. Cuando el reactivo de pegilación se combinó con un compuesto SBA de Fórmula II, se halló que a un pH 7.5, una relación proteína : PEG de 1:3, y una temperatura de reacción de 20-25°C, se produjo una mezcla de las cantidades mono-pegilada, di-pegilada y trazas de la especie tri-pegilada . Cuando el reactivo de pegilación era un compuesto SPA de Fórmula II, en condiciones similares excepto que la relación proteína: PEG era 1:2, se produjo principalmente la especie mono-pegilada. La EPO pegilada puede ser administrada como una mezcla, o como diferentes especies pegíladas separadas por la cromatografía de intercambio de cationes. Manipulando las condiciones de reacción (por ejemplo, relación de reactivos, pH, temperatura, concentración de proteína, tiempo de reacción, etc.)/ se pueden variar las cantidades relativas de las diferentes especies pegiladas . Una modalidad preferida adicional de la presente invención se refiere al uso como se definió anteriormente, en donde la proteína eritropoyetina es un conjugado, comprendiendo dicho conjugado una proteína eritropoyetina como se definió anteriormente que tenía al menos un grupo amino libre y que tenía la actividad biológica in vivo que hace que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticuloci os y eritrocitos, y seleccionada entre el grupo que consiste en proteína eritropoyetina humana y análogos de la misma que tienen la estructura primaria de la proteína eritropoyetina humana modificada por la adición de 1 a 6 sitios de glucosilación; estando ligada dicha proteína eritropoyetina en forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi inferior poli (etílenglicol ) , estando ligado cada grupo poli (etilenglicol) en forma covalente a la proteína eritropoyetina por medio de un ligador de la fórmula -C(0)-X-S-Y- con el C(O) del ligador formando un enlace amida con uno de dichos grupos amino, X es -(CH2)k- o -CH2 (0-CH2-CH2) k~ , k es de 1 a 10, Y es
el peso molecular promedio de cada parte poli ( etilenglicol) es de aproximadamente 20 kilodaltons a aproximadamente 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado es de aproximadamente 51 kilodaltons a aproximadamente 175 kilodaltons . Esta especie de eritropoyetina también puede estar representada por la fórmula (III) : P- [NH-CO-X-S-Y- (OCH2CH2),n-OR]n en donde R puede ser cualquier alquilo inferior.. Un alquilo inferior preferido es metilo. X puede ser -(CH2)k- o -CH2 (0-CH2-CH2)k en donde k es de 1 a aproximadamente 10. De preferencia k es de 1 a aproximadamente 4, de más preferencia, k es 1 ó 2. De más preferencia, X es -(CH2) . - En la Fórmula 1, Y es
de preferencia
de más preferencia
En la fórmula (III) , el número m es seleccionado de tal modo que el conjugado resultante de fórmula (III) tiene una actividad fisiológica comparable a la de lá EPO no modificada, actividad que puede representar la misma que, más que, o una fracción de, la actividad correspondiente de la EPO no modificada. La m representa el número de residuos de óxido de etilo en la unidad PEG. Una sola subunidad PEG de - (OCH2CH2)- tiene un peso molecular de aproximadamente 44 daltons. Por lo tanto, el peso molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular de la EPO) depende del número m. Un peso molecular de "aproximadamente" un determinado número significa que se encuentra dentro de un rango razonable de ese número según se determinó por técnicas analíticas convencionales . m es un número entero que oscila entre aproximadamente 450 y aproximadamente 900 (correspondiendo a un peso molecular desde 20 a 40 kDa) , de preferencia m es de aproximadamente 550 a aproximadamente 800 (aproximadamente 24 a 35 JcDa) ,y de más preferencia m es de aproximadamente 650 a aproximadamente 700 (aproximadamente 29 a aproximadamente 31 kDa) . En la Fórmula (III) , el número n es el número de grupos e-amino de un aminoácido lisina en una proteína eritropoyetina unida en forma covalente a una unidad PEG por medio de una unión amida. Un conjugado de esta invención puede tener una, dos o tres unidades PEG por molécula de EPO. n es un número entero que oscila entre 1 y 3, de preferencia n es 1 ó 2 y de más preferencia n es 1. Las proteínas eritropoyetina preferidas de fórmula (III) son representadas por las fórmulas:
En la modalidad que más se prefiere de la presente invención, un conjugado de eritropoyetina es representado por la fórmula:
en donde en las fórmulas anteriores n es un número entero de 1 a 3; m es un número entero de 450 a 900; R es alquilo inferior; X es -(CH2)k- o -C¾ (0-CH2-CH2) ?~ y P es el residuo de la proteína eritropoyetina sin el grupo o grupos amino que forman una unión amida con X. Otros productos de la glucoproteína eritropoyetina preferidos están representados por las fórmulas :
Los productos de la glucoproteína eritropoyetina que más se prefieren están representados por la fórmula:
Estas proteínas eritropoyetina pueden ser preparadas : (a) haciendo reaccionar en forma covalente un grupo e-amino de un aminoácido lisina de una proteína eritropoyetina representada por la fórmula P-[NH2]n, con un reactivo bi-funcional representado por la fórmula Z-CO-X-S-Q, para formar un intermediario con una unión amida representada por la fórmula : P- [NH-CO-X-S-Q]n en donde P es una proteína eritropoyetina menos el grupo amino que forma una unión amida; n es un- número entero que oscila entre 1 y 3; Z es un grupo reactivo, por ejemplo, HS éster carboxílico; X es -(C¾)k- o -CH2 (0-CH2-CH2) k- en donde 1c es de 1 a aproximadamente 10; y Q es un grupo protector, como alcanoilo, por ejemplo, acetilo. (b) haciendo reaccionar en forma covalente el intermediario con una unión amida de la etapa (a) con un derivado poli (etilenglicol) activado representado por la fórmula W- [OCH2CH2]m-OR, para formar un producto de glucoproteína eritropoyetina representado por la fórmula:
en donde W es una forma reactiva sulfhidrilo de Y; m es un número entero que oscila entre aproximadamente 450 y aproximadamente 900; R es alquilo inferior; e Y es como se definió anteriormente . En esta modalidad, el reactivo bi-funcional es de preferencia N-succinimidil-S-acetiltiopropionato o N-succinimidil-S-acetiltioacetato, Z es 'de preferencia N-hidroxi-succinimida, y el derivado poli (etilenglicol) activado W- es seleccionado de preferencia entre el grupo que consiste en yodo-acetil-metoxi-PEG, metoxi-PEG-vinilsulfona y metoxi-PEG-maleimida. Más detalladamente, las proteínas eritropoyetina de fórmula (III) pueden ser preparadas uniendo en forma covalente los grupos tiol a EPO ("activación") y acoplando la EPO activada resultante con un derivado poli (etilenglicol) (PEG) . La primera etapa para la preparación de la EPO pegilada de acuerdo con la presente invención comprende unir en forma covalente los grupos tiol por medio de los grupos N¾ de EPO. Esta activación de EPO se realiza con reactivos bi-funcionales que llevan un grupo tiol protegido y un grupo reactivo adicional, tal como ésteres activos (por ejemplo, un succinimidil éster) , anhídridos, ésteres de ácidos sulfónicos, halogenuros de ácidos carboxílieos y ácidos sulfónicos, respectivamente. El grupo tiol es protegido por grupos conocidos en la técnica, por ejemplo, grupos acetilo. Estos reactivos bi-funcionales son capaces de reaccionar con los grupos ?-amino de los aminoácidos lisina formando una unión amida. La primera etapa de la reacción se presenta a continuación: EPo NHJ + EPO, n y X son como se definieron anteriormente y Z es un grupo reactivo conocido en la técnica, por ejemplo, un sustituyente Rf-hidroxi-succinimida (NHS) de la fórmula:
En una modalidad preferida la activación de los grupos e-amino lisina se realiEa por reacción con reactivos bi-funcionales que tienen una parte succinimidilo . Los reactivos bi-funcionales pueden llevar diferentes especies de espaciadores, por ejemplo, partes -((¾)¾- o -C¾- (O-CH2-CH2) k- en donde k es de 1 a aproximadamente 10, de preferencia de 1 a aproximadamente 4 , y de más preferencia 1 ó 2 y de mayor preferencia 1. Ejemplos de estos reactivos son N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) y N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) .
Acetiltioalquil-carboxílico-NHS-éster, como
SATP SATA
. 2- (Acetiltio) - (etoxi) -ácido acético-INHS-éster con k como se definió anteriormente. La preparación de los reactivos bi-funcionales es conocida en la técnica. Los precursores de los 2- (acetiltio) - (etoxi) k-ácido acético- HS-ésteres se describen en la DE-3924705, mientras que la derivación al compuesto acetiltio es descrita por Marc , J., "Advanced Organic Chemistry", McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA se puede obtener comercialmente (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU. y Pierce, Rockford, IL) . El número de grupos tiol a ser agregados a una molécula de EPO puede ser seleccionado ajustando los parámetros de reacción, es decir, la concentración de prote na (EPO) y la relación proteína/reactivo bi-funcional . De preferencia, la EPO es activada uniendo en forma covalente de 1 a 5 grupos tiol por molécula de EPO, de más preferencia de 1.5 a 3 grupos tiol por molécula de EPO. Estos rangos se refieren a la distribución estadística del grupo tiol en la población de la proteína EPO. La reacción se lleva a cabo, por ejemplo, en una solución tampón acuosa, pH 6.5-8.0, por ejemplo, en 10 mM de fosfato de potasio, 50 mM de NaCl, pH 7.3. El reactivo bi-funcional puede ser agregado en DMSO. Después de completar la reacción, de preferencia después de 30 minutos, se detiene la reacción por adición de lisina. El exceso del reactivo bi-funcional puede ser separado por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por diálisis o filtración en columna. El número promedio de grupos tiol agregados a la EPO puede ser determinado por métodos fotométricos descritos en, por ejemplo, Grasett, D. R. Y Murray, J. F. En J. Appl . Biochem. Biotec nol. 119, 41-49 (1967) . La reacción anterior es seguida por el acoplamiento covalente de un derivado de poli (etilenglicol) (PEG) activado. Los derivados de PEG adecuados son moléculas PEG activadas con un peso molecular promedio de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, de más preferencia de aproximadamente 24 a aproximadamente 35 kDa y de mayor preferencia de aproximadamente 30 kDa . Los derivados de PEG activados son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Morpurgo, M. y col., J. Bioconj . Chem. (1996) 1_, página 363 ss. para PEG-vinilsulfona . Las especies de PEG de cadena lineal y de cadena ramificada son adecuadas para la preparación de los compuestos de Fórmula 1. Ejemplos de reactivos PEG que reaccionan son yodo-acetil-metoxi-PEG y metoxi-PEG-vinilsulfona:
El uso de estas sustancias activadas con yodo es conocido e la técnica y descrito por ejemplo, por Hermanson, G. T. en "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego (1996), páginas 147-148. De mayor preferencia, las especies PEG son activadas por maleimida usando (alcoxi inferior-PEG-maleimida) , tal como metoxi-PEG-maleimida (PM 30000; Shear ater Polymers, Inc.). La estructura de alcoxi inferior-PEG-maleimida es como sigue:
con R y m como se definieron anteriormente, de preferencia:
La reacción de acoplamiento con alcoxi inferior-PEG-maleimida se lleva a cabo después de la separación ín situ del grupo protector tiol en una solución tampón acuosa, por ejemplo, 10 m de fosfato de potasio, 50 mM de NaCl, 2 iriM de EDTA, pH 6.2. La separación del grupo protector puede ser realizada, por ejemplo, con hidroxilamina en DMSO a 25°C, pH 6.2 durante aproximadamente 90 minutos. Para la modificación PEG la relación molar de EPO/alcoxi inferior-PEG-maleimida activada debería ser de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:6, y de preferencia 1:4. La reacción puede ser detenida por adición de cisteína y reacción de los grupos tiol (-SH) restantes con N-metilmaleimida u otros compuestos apropiados capaces de formar enlaces disulfuro. Debido a la reacción de cualquier grupo tiol activo restante con un grupo protector tal como N-metilmaleimida u otro grupo protector adecuado, las glucoproteínas EPO en los conjugados de esta invención pueden contener tales grupos protectores . Generalmente el procedimiento descrito e la presente producirá una mezcla de moléculas que tiene diversos números de tioles protegidos por diferentes números del grupo protector, dependiendo del número de grupos tiol activados en la glucoproteína que no fueron conjugados a PEG-maleimida . Mientras que la N-metilmaleimida forma el mismo tipo de enlace covalente cuando se usa para bloquear a los grupos tiol restantes en la protelna pegilada, los compuestos disulfuro llevarán en una reacción de intercambio sulfuro/disulfuro intermolecular a un acoplamiento con puente disulfuro del reactivo de bloqueo. Los reactivos de bloqueo preferidos del reactivo de bloqueo. Los reactivos de bloqueo preferidos para este tipo de reacción de bloqueo son glutatión oxidado (GSSG) , cisteína y cistamina. Mientras que con cisteína no se introduce ninguna carga neta adicional en la proteína pegilada, el uso de los reactivos de bloqueo GSSG o cistamina da por resultado una carga negativa o positiva adicional .
La purificación adicional de los compuestos de fórmula (III), incluyendo la separación de especies EPO mono-, di- y tri-pegiladas, puede ser realizada por medio de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, cromatografí en columna . Los derivados de eritropoyetina pegilados contienen de preferencia al menos 90% de conjugados mono-PEG. Generalmente los conjugados mono-PEG de las glucoproteínas eritropoyetina son convenientes debido a que tienden a tener mayor actividad que los conjugados di-PEG. El porcentaje de conjugados mono-PEG así como también la reacción entre las especies mono- y di-PEG puede ser controlada por medio de una reunión de las fracciones más amplias alrededor del pico de elución para disminuir el porcentaje de fracciones mono-PEG o más estrechas para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Aproximadamente 90% de los conjugados mono-PEG es un buen equilibrio de rendimiento y actividad. Algunas veces pueden ser convenientes composiciones en las cuales, por ejemplo, al menos 92% o al menos 96% de los conjugados son especies mono-PEG (n igual 1) . En una modalidad de esta invención, el porcentaje de conjugados en donde n es 1 es de 90% a 96%. Las composiciones farmacéuticas que comprenden eritropoyetina pegilada son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 01/87329. Las composiciones pueden comprender 10 a 10000 µg de una ' proteína eritropoyetina por mi como se definió anteriormente. De preferencia, las composiciones comprenden 10 a 1000 g, por ejemplo, 10, 50, 100, 400, 800 ó 2500 µg por mi. Además, las composiciones pueden comprender 10 µ<5 a 1000 de proteína eritropoyetina por mi, 10 - 200 mmoles/1 de sulfato, 10 a 50 mmoles/l de fosfato, pH 6.0 a 6.5. Esta composición puede comprender también hasta 20 mM de metionia, 1-5% de un poliol (p/v) , 0.1% de pluronic F68 (p/v) y opcionalmente hasta 1 mM de CaCl2. Un ejemplo de esta composición comprende hasta 10 g de proteína eritropoyetina por mi, 40 mmoles/1 de sulfato, 10 mmoles/1 de fosfato, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2. Alternativamente la composición puede comprender 10 µg a 10000 /xg de proteína eritropoyetina por mi, 10 a 100 mmoles/1 de NaCl, 10 a 50 mmoles/1 de fosfato, pH 6.0 a 7.0, opcionalmente 1-5% (p/v) de un poliol. Además, esta composición puede comprender hasta 20 mM de metionina, hasta 0.1% de pluronic F68 (p/v) y opcionalmente 7.5 µ?????ße/? de CaCl2. Específicamente, esta composición puede comprender 10 µg a 1000.0 g de proteína eritropoyetina por mi, 100 mmoles/1 de NaCl, 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) y 10 mmoles/1 de fosfato, pH 7.0, La presente invención también se refiere a la composición anteriormente mencionada que comprende 10 g a 10000 ju.g de proteína eritropoyetina por mi, 10 a 50 mmoles/1 de arginina, pH 6 a pH 6.5, 10 a 100 mmoles/1 de sulfato de sodio. Además, esta composición puede comprender hasta 20 mM de metionia, hasta 0..1% de pluronic F68 (p/v) , opcionalmente hasta 1 mM de CaCl2 y opcionalmente 1-5% (p/v) de un poliol. Específicamente, esta composición puede comprender 10 ¿íg a 10000 µg de proteína eritropoyetina por mi, 40 mmoles/1 de arginina, pH 6.2, 30 mmoles/1 de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) y opcionalmente 1 mmol/1 de CaCl2- Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a composiciones que comprenden 10 a 10000 ßg/ml de eritropoyetina, de preferencia 25 a 2500 µ?/ml de eritropoyetina, y a) 10 mM de fosfato de sodio/potasio, 100 mM de NaCl, pH 7.0, o b) 10 M de fosfato de sodio, 120 mM de NaCl, pH 6.2, o c) 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), pH 6.2, o d) 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) , pH 5.2, o e) 40 M de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), pH 6.2, o f) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) ( pH 6.2. En la modalidad que más se prefiere, las composiciones comprenden una cantidad ' de proteína eritropoyetina de 50, 100, 400, 800 ó 2500 tg/ml. Las composiciones que más se prefieren o bien 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2 o 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2. Otros detalles de tales composiciones se conocen en la WO 01/87329. La invención también se refiere a un método para tratar trastornos de la distribución de hierro en enfermedades cardíacas que comprende la administración de una cantidad efectiva de proteína eritropoyetina como se definió anteriormente. Además, la invención se refiere a un medicamento para tratar los trastornos de la distribución de hierro en enfermedades cardíacas caracterizado porque contiene una cantidad efectiva de proteína eritropoyetina. Ejemplos de enfermedades cardíacas son, por ejemplo, enfermedad cardíaca coronaria, ateroesclerosis , ateroesclerosis coronaria, síndrome coronario agudo, falla cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva y/o insuficiencia cardíaca. En el contexto del método y el medicamento mencionados anteriormente, la insuficiencia cardíaca es la forma preferida de las enfermedades cardíacas . Los métodos y medicamentos preferidos como se describen anteriormente son aquellos en donde la proteína eritropoyetina es como se definió anteriormente . En el tratamiento de los trastornos de la distribución de hierro en enfermedades cardíacas, la EPO puede ser administrada, por ejemplo, a una dosis de 150 U/kg de peso corporal dos veces por semana. La dosis puede variarse de acuerdo con los requerimientos del paciente individual y también puede encontrarse en un rango de por ejemplo, 100 a 200 U/kg. Dependiendo del tiempo de vida media del derivado de EPO usado, una dosis puede ser administrada entre por ejemplo, 1 ó 3 veces por semana. Dependiendo de los requerimiento de un paciente individual, un médico puede elegir también una dosis diferente . La actividad específica de la EPO o los conjugados de EPO de acuerdo con esta invención puede ser determinada por varios ensayos conocidos en la técnica. La actividad biológica de las proteínas EPO purificadas de esta invención es de tal modo que la administración de la proteína EPO por inyección a pacientes da por resultado que las células de la médula ósea aumentan la producción de reticulocitos y eritrocitos en comparación con los grupos de pacientes control o no inyectados. La actividad biológica de las proteínas EPO, o fragmentos de las mismas, obtenidas y purificadas de acuerdo con esta invención pueden ser probadas por métodos de acuerdo con Annable, y col., Bull. Wld, Hlth. Org. (1972), 47:99-112, y P arm. Europa Spec . Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2) . Otro ensayo biológico para determinar la actividad de la proteína EPO, el ensayo del ratón .normocitanémico, se describe en la técnica (por e emplo, Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2) y la monografía de eritropoyetina de Ph. Eur. BRP) . La invención se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos que ilustran pero no limitan a la invención descrita en la presente. EJEMPLO Un hombre de edad mediana con enfermedad cardíaca es controlado después de un catéter cardíaco por trastornos de la distribución de hierro por medio de la determinación de los siguientes parámetros - CRP (proteína reactiva C) , ferritina y receptor de transferrina soluble - como describieron P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, informa presentado en el AACC/CSCC, Reunión Anual, 29 de julio - 2 de agosto, 2001, Chicago, Illinois. Los resultados muestran trastornos de la distribución de hierro. El paciente es tratado en forma subcutánea con 150 U/kg de Recormon™ (proteína eritropoyetina que se puede obtener comercialmente) dos veces por semana durante un máximo de 12 semanas. Después, la determinación de los parámetros como se describieron anteriormente muestra una mejora del trastorno de la deficiencia de hierro. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.