RU2324494C2 - Новое применение эритропоэтина при сердечных заболеваниях - Google Patents

Новое применение эритропоэтина при сердечных заболеваниях Download PDF

Info

Publication number
RU2324494C2
RU2324494C2 RU2005119649/15A RU2005119649A RU2324494C2 RU 2324494 C2 RU2324494 C2 RU 2324494C2 RU 2005119649/15 A RU2005119649/15 A RU 2005119649/15A RU 2005119649 A RU2005119649 A RU 2005119649A RU 2324494 C2 RU2324494 C2 RU 2324494C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
erythropoietin
protein
conjugate
group
polyethylene glycol
Prior art date
Application number
RU2005119649/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2005119649A (ru
Inventor
Пауль ЛЕМАНН (DE)
Пауль ЛЕМАНН
Ральф РЁДДИГЕР (DE)
Ральф РЁДДИГЕР
Рут ВАЛЬТЕР-МАТЗУИ (DE)
Рут ВАЛЬТЕР-МАТЗУИ
Original Assignee
Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of RU2005119649A publication Critical patent/RU2005119649A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2324494C2 publication Critical patent/RU2324494C2/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Предложено применение человеческого эритропоэтина альфа или бета либо его конъюгата для приготовления лекарственного средства для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, способ соответствующего лечения и лекарственное средство. Показано улучшение нарушенного распределения железа по показателям С-реактивного белка, ферритина и рецептора растворимого трансферрина у больных ишемической болезнью сердца, атеросклерозом, коронарным атеросклерозом, острым коронарным синдромом, сердечной недостаточностью под действием рекормона. 3 н. и 10 з.п. ф-лы.

Description

Настоящее изобретение относится к новому применению эритропоэтина, в частности к лечению нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях.
Известны различные заболевания, при которых метаболизм железа не является нормальным. При анемии не может образовываться достаточное количество крови из-за полного недостатка железа в организме. Другим метаболическим состоянием, связанным с железом, является гемохроматоз, при котором общая концентрация железа в организме выше нормальной, что приводит к различным состояниям, как, например, деструкция органов.
Нарушения распределения железа отличаются от описанных выше анемии и гемохроматоза, потому что общая концентрация железа в организме нормальная. С одной стороны, железо аккумулируется в различных органах и может привести к повреждениям и даже деструкции этих органов. С другой стороны, применение железа, которое присутствует в нормальных количествах при кроветворении, является нарушенным, что приводит к побочным эффектам, сравнимым с таковыми при анемии.
До настоящего времени не было известно, что больные, страдающие сердечными заболеваниями, имеют большую возможность быть подверженными воздействию нарушений распределения железа. Нарушения распределения железа могут диагностироваться с помощью различных параметров, которые обычно используются для диагностики содержания железа. Основываясь на измерениях ферритина и рецептора растворимого трансферрина, возможно оценить, является ли нормальной общая концентрация железа у больного, страдающего сердечными заболеваниями. Если дело в этом, тогда пониженная концентрация гемоглобина в ретикулоцитах является индикатором нарушений распределения железа. Другим индикатором является постоянная затянувшаяся повышенная концентрация С-реактивного белка (CRP) у больных, страдающих сердечными заболеваниями и у которых наблюдается нормальная общая концентрация железа. Способ диагностики нарушений распределения железа описан Р.Lehmann, M.Volkmann, J.Lotz, A.Baldauf, R.Roeddiger, постер, представленный на конференции AACC/CSCC, ежегодная конференция, 29 июля - 2 августа, 2001, Чикаго, Иллинойс.
До сих пор, однако, никакого лечения не было предложено больным с сердечными заболеваниями, страдающим от нарушений распределения железа. Проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит поэтому в обеспечении лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях для минимизации или подавления вышеуказанных неблагоприятных явлений. Неожиданно было обнаружено, что эритропоэтин оказывает благоприятный эффект на нарушения распределения железа при сердечных заболеваниях. Проблема, таким образом, решается согласно настоящему изобретению путем обеспечения эритропоэтина для применения при лечении нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях.
Если не указано иначе, следующие определения представлены для иллюстрации и определения значения и области различных терминов, используемых для описания представленного здесь изобретения.
Термин "низший алкил", как это используется в контексте, означает алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от одного до шести атомов углерода. Примеры низших алкильных групп включают метил, этил и изопропил, предпочтительно метил.
Термин "(низш.)алкокси", как это используется в контексте, означает группу R'-O-, где R' является низшим алкилом, как описано выше.
Термин "нарушения распределения железа при сердечных заболеваниях" относится к нарушению распределения железа, которое встречается у больных, страдающих сердечными заболеваниями. Нарушение распределения железа может, например, быть охарактеризовано, как описано выше. В частности, нарушение распределения железа характеризуется следующими параметрами: концентрация рецептора растворимого трансферрина [мг/л], разделенная на log(концентрация ферритина [мкг/л]), меньше 3,5 и одновременно концентрация С-реактивного белка выше 5 мг/л.
Термин "эритропоэтин" или "эритропоэтиновый белок" относится к белку с in vivo биологической активностью, побуждающей клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, который выбирается из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и аналогов, определенных ниже.
Термин "модифицированный полиэтиленгликолем эритропоэтин (Peg-EPO или PEG-EPO)" относится к эритропоэтиновому белку, ковалентно связанному с 1-3 производными полиэтилена, как описано ниже.
Описание чертежей:
Фигура 1: Первичная структура человеческого эритропоэтина (ЕРО) (165 аминокислот) (Последовательность №1 / Посл. №1/).
Фигура 2: Первичная структура человеческого эритропоэтина (ЕРО) (166 аминокислот) (Последовательность №2 / Посл. №2/).
Более подробно настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для приготовления лекарственного средства для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях. Примерами сердечных заболеваний являются, например, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, коронарный атеросклероз, острый коронарный синдром, сердечная недостаточность, застойная сердечная недостаточность и/или сердечная недостаточность. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению, как указано выше, когда сердечным заболеванием является сердечная недостаточность.
Настоящее изобретение особенно полезно для приготовления фармацевтических композиций, включающих эритропоэтин в качестве фармацевтически активного ингредиента. Термин "эритропоэтин", или "эритропоэтиновый белок", или "ЕРО" означает следующее: в частности, термины относятся к гликопротеину, например к человеческому эритропоэтину, например имеющему аминокислотную последовательность, представленную в (Посл. №1) или (Посл. №2), или аминокислотную последовательность, в основном гомологичную указанной, биологические свойства которого связаны со стимуляцией продуцирования эритроцитов и со стимуляцией деления и дифференциации коммитированных эритроидных клеток-предшественников в костном мозге. Как это используется в контексте, эти термины включают такие протеины, сознательно модифицированные, например, путем направленного мутагенеза, или случайно путем мутаций. Эти термины также включают аналоги с 1-6 дополнительными сайтами для гликозилирования, аналоги, содержащие, как минимум, одну дополнительную аминокислоту при концевом карбоксиле гликопротеина, где дополнительная аминокислота включает, как минимум, один сайт гликозилирования, и аналоги с аминокислотной последовательностью, включающей перегруппировку, как минимум, одного сайта для гликозилирования. Эти термины включают как природный, так и рекомбинантно продуцированный человеческий эритропоэтин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эритропоэтиновым белком является человеческий эритропоэтин.
Как в деталях представлено ниже, получение и очистка эритропоэтина хорошо известны в данной области. Под эритропоэтином подразумевается природный или рекомбинантный белок, предпочтительно человеческий; например эпоэтин альфа или эпоэтин бета, полученный из любого обычного источника, как, например, ткани, путем синтеза белка, из культуры клеток с природными и рекомбинантными клетками. Охватывается любой белок с активностью эритропоэтина, как, например, мутеины или иным путем модифицированные белки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эритропоэтиновым белком является эпоэтин альфа или эпоэтин бета. Рекомбинантный эритропоэтин может быть получен путем экспрессии в СНО-, ВПК- или HeLa-клеточных линиях по технологии с рекомбинантной ДНК или путем эндогенной активации гена. Экспрессия белков, включающая экспрессию путем эндогенной активации гена, хорошо известна в данной области и раскрывается, например, в патентах США №№5733761, 5641670 и 5733746 и в международных заявках на патенты WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание каждой из которых включено в контекст в виде ссылок. Предпочтительно применение, как определено выше, когда эритропоэтиновый белок экспрессируется путем эндогенной активации гена. Предпочтительными видами эритропоэтина для получения эритропоэтиновых гликопротеиновых продуктов являются виды человеческого эритропоэтина. Более предпочтительными видами эритропоэтина является человеческий эритропоэтин с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ IN NO: 1 или SEQ IN NO: 2 более предпочтительна аминокислотная последовательность Посл. №1. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится поэтому к описанному выше применению, где эритропоэтиновый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ IN NO: 1 или SEQ IN NO: 2.
Кроме того, эритропоэтин может быть аналогом гликопротеина с 1-6 дополнительными сайтами для гликозилирования. Поэтому настоящее изобретение также относится к применению, как описано выше, где эритропоэтиновый белок имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования. Гликозилирование белка с одной или несколькими олигосахаридными группами происходит по специфическим локализациям вдоль полипептидного остова и в высокой степени влияет на физические свойства белка, как, например, стабильность белка, секреция, субклеточная локализация, и на биологическую активность. Гликозилирование обычно бывает двух типов.
Связанные с атомом кислорода олигосахариды присоединяются к остаткам серина или треонина, а связанные с атомом азота олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина. Одним видом олигосахарида, обнаруженного как в связанных с азотом, так и в связанных с кислородом олигосахаридах, является N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота), представляющая семейство аминосахаров, содержащих 9 или более атомов углерода. Сиаловая кислота является обычно терминальным остатком как в случае связанных с азотом олигосахаридов, так и в случае связанных с кислородом олигосахаридов, и, поскольку она несет отрицательный заряд, придает кислотные свойства гликопротеину. Человеческий эритропоэтин, имеющий 165 аминокислот, содержит три связанные с азотом и одну связанную с кислородом олигосахаридные цепи, которые составляют около 40% общей молекулярной массы гликопротеина. Гликозилирование с образованием связи по атому азота происходит при аспарагиновых остатках, расположенных в положениях 24, 38 и 83, и гликозилирование с образованием связи по атому кислорода происходит при остатке серина, расположенном в положении 126. Олигосахаридные цепи модифицируются с помощью терминальных остатков сиаловой кислоты. Ферментативное удаление всех остатков сиаловой кислоты с гликозилированного эритропоэтина приводит к потере активности in vivo, но не in vitro активности, поскольку сиалилирование эритропоэтина предотвращает его связывание и последующий клиренс печеночным связывающим белком.
Термин "эритропоэтин" включает аналоги человеческого эритропоэтина с одним или несколькими изменениями в аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают в результате увеличение числа сайтов для присоединения сиаловой кислоты. Такие гликопротеиновые аналоги могут быть генерированы путем сайт-направленного мутагенеза, включающего добавления, делеции или замещения аминокислотных остатков, которые увеличивают или изменяют сайты, доступные для гликозилирования. Аналоги гликопротеина с уровнями сиаловой кислоты, большими, чем обнаруживаемые в человеческом эритропоэтине, генерируются путем добавления сайтов гликозилирования, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, требующуюся для биологической активности. Гликопротеины по настоящему изобретению также включают аналоги с повышенными уровнями присоединения углеводов при сайте гликозилирования, которые обычно включают замещение одной или нескольких аминокислот в непосредственной близости к связанному с азотом или кислородом сайту. Гликопротеины по настоящему изобретению также включают аналоги, содержащие одну или несколько аминокислот, тянущиеся от карбоксильного конца эритропоэтина и обеспечивающие, как, минимум, один дополнительный углеводный сайт. Эритропоэтиновые белки настоящей композиции также включают аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку, как минимум, одного сайта для гликозилирования. Такая перегруппировка сайта гликозилирования включает делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования в человеческом эритропоэтине и добавление одного или нескольких не встречающихся в природе сайтов гликозилирования. Увеличение числа углеводных цепей в эритропоэтине и, следовательно, числа сиаловых кислот на молекулы эритропоэтина может придать полезные свойства, как, например, повышенную растворимость, большую устойчивость к протеолизу, уменьшенную иммуногенность, повышенное время полужизни сыворотки, и повышенную биологическую активность. Аналоги эритропоэтина с дополнительными сайтами гликозилирования раскрываются более подробно в заявке на европейский патент 640619, опубликованной Elliot, 1 марта, 1995.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает эритропоэтиновые белки с аминокислотной последовательностью, которая включает, как минимум, один дополнительный сайт для гликозилирования, как, например, но не ограничивая этим, эритропоэтины, включающие последовательность человеческого эритропоэтина, видоизмененную путем модификации, выбранную из следующих последовательностей:
Asn30Thr32;
Asn51Thr53;
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Ser87Val87Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125 и
Pro124Thr125.
Используемая в контексте система обозначений для модификации аминокислотной последовательности означает, что положение(я) соответствующего немодифицированного белка (например, человеческий эритропоэтин с SEQ IN NO: 1 или SEQ IN NO: 2), указанное надстрочным номером (номерами), меняется по отношению к аминокислоте (аминокислотам), которые непосредственно предшествуют соответствующему надстрочному номеру (номерам).
Эритропоэтиновый белок может также представлять аналог, содержащий, как минимум, одну дополнительную аминокислоту при карбоксильном конце гликопротеина, где дополнительная аминокислота включает, как минимум, один сайт гликозилирования. Дополнительная аминокислота может включать пептидный фрагмент, производный от концевого карбоксила человеческого хорионического гонадотропина. Предпочтительно гликопротеин является аналогом, выбранным из группы, состоящей из (а) человеческого эритропоэтина, имеющего аминокислотную последовательность, Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln, тянущуюся от карбоксильного конца; (б) аналога по (а), включающего также Ser87 Asn88 Thr90 EPO, и (в) аналога по (а), включающего, кроме того, Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO.
Эритропоэтиновый белок может также представлять аналог с аминокислотной последовательностью, который включает перегруппировку, как минимум, одного сайта для гликозилирования. Перегруппировка может включать делецию любого из связанных с атомом азота углеводных сайтов в человеческом эритропоэтине и добавление связанного с атомом азота углеводного сайта в положении 88 аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина. Предпочтительно гликопротеин является аналогом, выбранным из группы, состоящей из Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO и Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO. Другим аналогом является дарбэпоэтин альфа. Предпочтительным эритропоэтиновым белком при описанном ранее применении является дарбэпоэтин альфа.
В частности, эритропоэтиновый белок представленной фармацевтической композиции, как описано выше, может также включать его модифицированные полиэтиленгликолем производные. Модифицированные полиэтиленгликолем производные эритропоэтина и их получение известны в данной области и описаны, например, в международной заявке на патент WO 01/02017, заявках на европейские патенты ЕР-А-1064951, ЕР-А-539167, ЕР-А-605963, в международных заявках на патенты WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, в патенте США №556, в заявке на европейский патент ЕР-А-584876, в международных заявках на патенты WO 92/16555, WO 94/28024. WO 97/04796, в патентах США №№5359030 и 5681811, в патенте США №4179337, в патенте Японии, в международной заявке на патент WO 98/32466, в патенте США №5324650. Предпочтительно при описанном выше применении эритропоэтиновый белок модифицирован полиэтиленгликолем. Предпочтительный вариант воплощения видов модифицированного полиэтиленгликолем эритропоэтина относится к описанным ниже производным.
Соответственно настоящее изобретение также относится к описанному выше применению, где эритропоэтиновый белок представляет конъюгат, упомянутый конъюгат включает эритропоэтиновый белок, как описано выше, содержащий, как минимум, одну свободную аминогруппу и обладающий in vivo биологической активностью, побуждающей клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и выбирается из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированного прибавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой, как минимум, одного сайта гликозилирования; упомянутый эритропоэтин является ковалентно связанным с числом n полиэтиленгликольных групп формулы -СО-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, при этом -СО (т.е. карбонил) каждой полиэтиленгликольной группы образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп; где R означает низший алкил; х означает число 2 или 3; m означает число примерно от 450 до 900; n означает число от 1 до 3 и n и m выбираются таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата минус эритропоэтиновый белок составляла от 20 кД до 100 кД. Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие описанные здесь конъюгаты, в которых процент конъюгатов, где n означает 1, составляет, как минимум, 90%, предпочтительно, как минимум, 92%, более предпочтительно 96% от всех конъюгатов композиции.
Более конкретно упомянутые выше конъюгаты могут быть представлены формулой (I)
Figure 00000001
где Р означает остаток эритропоэтинового белка, как здесь описано, (т.е. без амино-группы или аминогрупп, которые образуют амидную связь с карбонилом, представленном в формуле I), проявляющего in vivo биологическую активность, побуждающую клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и где R означает низший алкил, х означает 2 или 3, m означает число от 450 до 900, n означает число от 1 до 3, и n и m выбираются таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата минус эритропоэтиновый гликопротеин составляла от 20 кД до 100 кД. Согласно данному изобретению R является любым низшим алкилом. Предпочтительны конъюгаты, в которых R означает метил.
Символ "m" представляет число остатков окиси этилена (ОСН2СН2) в поли-этиленоксидной группе. Одна этиленоксидная субъединица полиэтиленгликоля (PEG) имеет молекулярную массу примерно 44 Д. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (исключая молекулярную массу ЕРО) зависит от числа "m". В конъюгатах по данному изобретению "m" составляет примерно от 450 до 900 (что соответствует молекулярной массе примерно от 20 кД до 40 кД), предпочтительно примерно от 650 до 750 (что соответствует молекулярной массе примерно 30 кД). Число m выбирают так, чтобы получающийся в результате конъюгат по изобретению обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного ЕРО, активность которого может быть такой же, большей или составлять часть соответствующей активности немодифицированного эритропоэтина. Молекулярная масса, упоминаемая как "примерно" определенной величины, означает, что она находится в разумных пределах этой величины, что определяется с использованием общепринятых аналитических методик. Число "m" выбирают таким образом, что молекулярная масса каждой полиэтиленгликольной группы, ковалентно связанной с эритропоэтиновым гликопротеином, составляет примерно от 20 кД до 40 кД и предпочтительно составляет 30 кД.
В конъюгатах по данному изобретению число "n" означает число полиэтиленгликольных групп, ковалентно связанных со свободными аминогруппами (включая 8-аминогруппы лизина и/или амино-терминальную аминогруппу) эритропоэтинового белка амидной связью (связями). Конъюгат по данному изобретению может содержать одну, две или три группы PEG на молекулу ЕРО. Число "n" является целым числом от 1 до 3, предпочтительно "n" означает 1 или 2 и более предпочтительно "n" является 1. Предпочтительный конъюгат из описанных выше конъюгатов включает соединения, где х означает 2, m означает число от 650 до 750, n является 1 и R означает метил.
Соединение формулы (I) может быть получено из известного полимерного продукта:
Figure 00000002
,
в котором R и m являются такими, как описано выше, при конденсации соединения формулы II с эритропоэтиновым гликопротеином. Соединения формулы (II), в которых х означает 3, являются эфирами N-сукцинимидилбутирата и α-(низш.)алкокси-полиэтиленгликоля ((низш.)алкокси-PEG-SBA). Соединения формулы (II), в которых х означает 2, являются эфирами N-сукцинимидилпропионата и α-(низш.)алкокси-полиэтиленгликоля ((низш.)алкокси-PEG-SPA). Может быть применен любой общепринятый способ взаимодействия активированного сложного эфира с амином для образования амида. В реакции, описанной выше, приведенный в качестве примера сукцинимидильный сложный эфир является уходящей группой, способствующей образованию амида. Применение сложных сукцинимидильных эфиров, как, например, соединения формулы II, для получения конъюгатов с белками раскрываются в патенте США №5672662, выданном 30 сентября, 1997 (Harris и др.).
Человеческий эритропоэтин содержит девять свободных аминогрупп, амино-терминальную аминогруппу и ε-аминогруппы 8 остатков лизина. Когда реагент для модификации полиэтиленгликолем соединяли с производным N-сукцинимидил-бутирата (SBA) формулы II, было найдено, что при рН 7,5, при соотношении белок : PEG, равном 1:3, и температуре реакции 20-25°C получали смесь моно-, ди- и следовых количеств три-модифицированных полиэтиленгликолем видов. Когда реагентом для модификации полиэтиленгликолем было производное N-сукцинимидилпропионата (SPA) формулы II, при аналогичных условиях, за исключением того, что соотношение белок:PEG составляло 1:2, получали главным образом мономодифицированные полиэтиленгликолем виды. Модифицированный полиэтиленгликолем эритропоэтин может применяться в виде смеси или в виде различных разделенных с помощью катионообменной хроматографии образцов. При изменении условий реакции (например, соотношения реагентов, рН, температуры, концентрации белка, времени реакции и т.д.) относительные количества различных модифицированных полиэтиленгликолем видов могут варьироваться.
Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению, как определено выше, где эритропоэтиновый белок является конъюгатом, упомянутый конъюгат включает эритропоэтиновый белок, как определено выше, содержащий, как минимум, одну свободную аминогруппу и обладающий in vivo биологической активностью, побуждающей клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и выбирается из группы, состоящей из человеческого эритропоэтинового белка и его аналогов, которые имеют первичную структуру человеческого эритропоэтинового белка, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования; упомянутый эритропоэтиновый белок является ковалентно связанным с 1-3 (низш.)алкоксиполиэтиленгликольными группами, каждая полиэтиленгликольная группа ковалентно связана с эритропоэтиновым белком линкером формулы -C(O)-X-S-Y-, где группа С(O) линкера образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп, Х означает -(CH2)k- или -СН2(O-СН2-CH2)k-, k означает число от 1 до 10, Y является
Figure 00000003
;
Figure 00000004
;
Figure 00000005
или
Figure 00000006
,
средняя молекулярная масса каждой полиэтиленгликольной составляющей составляет примерно от 20 кД до 40 кД, и молекулярная масса конъюгата составляет примерно от 51 кД до 175 кД.
Такие виды эритропоэтина могут быть представлены формулой (III)
Figure 00000007
где R может быть любым низшим алкилом. Предпочтительным низшим алкилом является метил. Х может быть -(CH2)k- или -СН2(O-CH2-CH2)k-, где k является числом от 1 до примерно 10. Предпочтительно k означает число от 1 до примерно 4, более предпочтительно k означает 1 или 2. Наиболее предпочтительно Х означает -(СН2).
В формуле 1 Y означает
Figure 00000003
;
Figure 00000004
;
Figure 00000005
или
Figure 00000006
,
предпочтительно
Figure 00000004
или
Figure 00000006
,
более предпочтительно
Figure 00000006
.
В формуле (III) число m выбирают таким образом, чтобы в результате конъюгат формулы (III) обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного эритропоэтина, активность которого может быть такой же, большей или составлять часть соответствующей активности немодифицированного эритропоэтина. Символ m означает число остатков окиси этилена в единице PEG. Одна субъединица PEG, представляющая -(ОСН2СН2)-, имеет молекулярную массу примерно 44 Д. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (исключая молекулярную массу эритропоэтина) зависит от числа m. Молекулярная масса "примерно" такой величины означает, что она находится в разумных пределах величины, определенной с помощью обычных аналитических методик. Число m является целым, составляющим примерно от 450 до примерно 900 (что соответствует молекулярной массе от 20 до 40 кД), предпочтительно m представляет число примерно от 550 до примерно 800 (примерно от 24 до 35 кД) и наиболее предпочтительно m является числом примерно от 650 до 700 (примерно от 29 до 31 кД).
В формуле (III) число n означает число ε-аминогрупп аминокислоты лизина в эритропоэтиновом белке, ковалентно связанных с полиэтиленгликольной единицей амидной связью. Конъюгат по настоящему изобретению может содержать одну, две или три полиэтиленгликольные единицы на молекулу ЕРО. Число n является целым числом от 1 до 3, предпочтительно n означает 1 или 2 и более предпочтительно n является 1.
Предпочтительные эритропоэтиновые белки формулы (III) представлены формулами:
Figure 00000008
и
Figure 00000009
.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эритропоэтиновый конъюгат представлен формулой:
Figure 00000009
,
где в представленной выше формуле
n является целым числом от 1 до 3;
m означает целое число от 450 до 900;
R означает низший алкил;
Х означает -(CH2)k- или -CH2(O-CH2-CH2)k- и
Р является остатком эритропоэтинового белка без аминогруппы или групп, которые образуют амидную связь с X.
Другие предпочтительные эритропоэтиновые гликопротеиновые продукты представлены формулами:
Figure 00000010
и
Figure 00000011
.
Более предпочтительные эритропоэтиновые гликопротеиновые продукты представлены формулой:
Figure 00000012
Такие эритропоэтиновые белки могут быть получены путем
(а) ковалентного связывания ε-аминогруппы аминокислоты лизина эритропоэтинового белка, представленного формулой P-[NH2]n, c бифункциональным реагентом формулы Z-CO-X-S-Q с целью образования промежуточного соединения с амидной связью, представленного формулой:
P-[NH-CO-X-S-Q]n,
где Р является эритропоэтиновым белком без аминогруппы, которая образует амидную связь; n означает целое число в диапазоне от 1 до 3; Z является реакционноспособной группой, например, сложноэфирной группой эфира N-гидроксисукцинимида и карбоновой кислоты; Х означает -(CH2)k- или -СН2(O-CH2-CH2)k-, где k означает число от 1 до примерно 10 и Q является защитной группой, подобной алканоильной, например, ацетилом.
(б) реакции с образованием ковалентной связи между промежуточным соединением с амидной связью со стадии (а) и активированным производным полиэтиленгликоля, представленным формулой W-[OCH2CH2]m-OR, для образования эритропоэтинового гликопротеинового продукта, представленного формулой:
Figure 00000013
,
где W является сульфгидрильной реакционноспособной формой Y; m является целым числом в диапазоне от 450 до 900; R означает низший алкил и Y является таким, как установлено выше.
В этом варианте осуществления изобретения бифункциональным реагентом является предпочтительно N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат или N-сукцинимидил-5-ацетилтиоацетат, Z означает предпочтительно N-гидроксисукцинимид и активированное производное полиэтиленгликоля W-[OCH2CH2]m-OR предпочтительно выбирают из группы, состоящей из иодацетилметокси-PEG, метокси-PEG-винил-сульфона и метокси-PEG-имида малеиновой кислоты.
Если рассматривать более подробно, эритропоэтиновые белки формулы (III) могут быть получены путем ковалентного связывания тиольных групп с ЕРО ("активация") и сочетания полученного в результате активированного ЕРО с производным полиэтиленгликоля (PEG). Первая стадия получения модифицированного полиэтиленгликолем ЕРО согласно настоящему изобретению включает ковалентное связывание тиольных групп посредством NH2-групп ЕРО. Активирование ЕРО проводят с помощью бифункциональных реагентов, которые служат носителями защищенной тиольной группы и дополнительной реакционноспособной группы, как, например, активированные сложные эфиры (например, сложный сукцинимидильный эфир), ангидриды, сложные эфиры сульфокислот, галогениды карбоновых кислот и сульфокислот соответственно. Тиольную группу защищают известными в данной области группами, например ацетильными группами. Такие бифункциональные реагенты способны взаимодействовать с ε-аминогруппами лизиновых аминокислот с образованием амидной связи. Первая стадия реакции представлена ниже:
Figure 00000014
,
ЕРО, n и X являются такими, как указано выше, и Z является известной в данной области реакционноспособной группой, например N-гидроксисукцинимидным (NHS) заместителем формулы
Figure 00000015
В предпочтительном варианте осуществления изобретения активацию ε-аминогрупп лизина осуществляют при реакции с бифункциональными реагентами, содержащими сукцинимидильную составляющую. Бифункциональные реагенты могут служить носителями различных видов спейсеров, например составляющих -(CH2)k- или -СН2-(O-СН2-СН2-)k-, где k означает число от 1 до примерно 10, предпочтительно от 1 до примерно 4 и более предпочтительно 1 или 2, и наиболее предпочтительно 1. Примерами таких реагентов являются N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат (SATP) и N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA)
Figure 00000016
Figure 00000017
или
Figure 00000018
Figure 00000019
с k, являющимся таким, как определено выше.
Получение бифункциональных реагентов известно в данной области. Предшественники сложных эфиров 2-(ацетилтио)(этокси)kуксусной кислоты и N-гидроксисукцинимида описываются в патенте Германии DE-3924705, в то время как превращение в ацетилтиопроизводное описывается March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA коммерчески доступен (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США, и Pierce, Рокфорд, Иллинойс).
Число тиольных групп, которые следует добавить к молекуле ЕРО, можно выбрать путем регулирования параметров реакции, то есть концентрации белка (ЕРО) и соотношения белок/бифункциональный реагент. Предпочтительно ЕРО активируют путем ковалентного связывания с 1-5 тиольными группами на молекулу ЕРО, более предпочтительно с 1,5-3 тиольными группами на молекулу ЕРО. Такие диапазоны объясняют статистическим распределением тиольных групп в популяции белка ЕРО.
Реакцию проводят, например, в водном буферном растворе, рН 6,5-8,0, например, в 10 мМ фосфате калия, 50 мМ NaCl, рН 7,3. Бифункциональный реагент может добавляться в диметилсульфоксиде. После завершения реакции, предпочтительно через 30 минут, реакцию останавливают путем прибавления лизина. Избыток бифункционального реагента может быть удален известными в данной области способами, например, при диализе или фильтрации через колонку. Среднее число тиольных групп, добавленных к эритропоэтину, может быть определено фотометрическими способами, описанными, например, Grasetti, D.R. и Murray, J.F. в J. Appl. Biochem. Biotechnol., 119, 41-49 (1967).
Описанная выше реакция сопровождается ковалентным связыванием активированного производного полиэтиленгликоля. Подходящими производными полиэтиленгликоля являются активированные молекулы полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой примерно от 20 до 40 кД, более предпочтительно примерно от 24 до 35 кД и наиболее предпочтительно примерно 30 кД.
Активированные производные PEG известны в данной области и описываются, например, Morpurgo, М. и др. в J. Bioconj. Chem., (1996) 7, с.с.363 и следующие, для PEG-винилсульфона. Типы PEG с прямой и разветвленной цепью годятся для получения соединений формулы 1. Примерами реакционноспособных реагентов PEG являются иодацетилметокси-PEG и метокси-РЕС-винилсульфон:
Figure 00000020
или
Figure 00000021
Применение таких активированных иодом веществ известно в данной области и описано Hermanson, G.T. в Bioconjugate Techniques, изд. Academic Press, Сан-Диего (1996), с.с.147-148.
Наиболее предпочтительно виды PEG активируются имидом малеиновой кислоты при использовании (низш.)алкокси-PEG-имида малеиновой кислоты, как, например, метокси-PEG-имид малеиновой кислоты (М.м. 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Строение (низш.)алкокси-PEG-имида малеиновой кислоты следующее:
Figure 00000022
или
Figure 00000023
,
где R и m являются такими, как определено выше, предпочтительно
Figure 00000023
Реакция сочетания с (низш.)алкокси-PEG-имидом малеиновой килоты происходит после in situ расщепления тиольной защитной группы в водном буферном растворе, например, 10 мМ фосфат калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ этилендиамин-тетрауксусная кислота (ЭДТК), рН 6,2. Расщепление защитной группы может быть осуществлено, например, с помощью гидроксиламина в диметилсульфоксиде при 25°C, рН 6,2 в течение примерно 90 минут. Для модификации полиэтиленгликолем молярное соотношение активированный ЕРО/(низш.)алкокси-PEG-имид малеиновой кислоты должно составлять примерно от 1:3 до примерно 1:6 и предпочтительно 1:4. Реакция может быть остановлена с помощью прибавления цистеина и реакции оставшихся тиольных (-SH) групп с N-метилимидом малеиновой кислоты или другими подходящими соединениями, способными образовывать дисульфидные связи. Из-за реакции любых оставшихся активных тиольных групп с защитной группой, как, например, N-метилимид малеиновой кислоты или другая подходящая защитная группа, эритропоэтиновые гликопротеины в конъюгатах по настоящему изобретению могут содержать такие защитные группы. Обычно описанные здесь методики приводят к смеси молекул с варьирующимися числами тиольных групп, защищенных разными числами защитных групп в зависимости от числа активированных тиольных групп в гликопротеине, которые не были конъюгированы с PEG-имидом малеиновой кислоты.
В то время как N-метилимид малеиновой кислоты образует тот же тип ковалентной связи, когда используется для блокирования оставшихся тиольных групп на модифицированном полиэтиленгликолем белке, дисульфидные соединения приведут в ходе межмолекулярной обменной реакции сульфид/дисульфид обменной реакции к связыванию блокирующего реагента с помощью дисульфидного мостика. Предпочтительными блокирующими реагентами для такого типа реакции блокирования являются окисленный глутатион (GSSG), цистеин и цистамин. В то время как с цистеином не вводится дополнительный суммарный заряд в модифицированный полиэтиленгликолем белок, применение блокирующих агентов GSSG или цистамина приводит к дополнительному отрицательному или положительному заряду.
Дальнейшая очистка соединений формулы (III), включая разделение моно-, ди- и три-модифицированных полиэтиленгликолем видов ЕРО, может быть осуществлена способами, известными в данной области, например с помощью колоночной хроматографии.
Модифицированные полиэтиленгликолем производные эритропоэтина содержат, как минимум, 90% моно-PEG-конъюгатов. Обычно моно-PEG-конъюгаты эритропоэтиновых гликопротеинов желательны, так как они обладают более высокой активностью, чем ди-PEG-конъюгаты. Процент моно-PEG-конъюгатов, а также соотношение моно- и ди-PEG-видов может регулироваться путем объединения более широких фракций вблизи пика элюирования для уменьшения процента моно-PEG-конъюгатов или более узких фракций с целью увеличения процента моно-PEG-конъюгатов в композиции. Около 90% моно-PEG-конъюгатов представляет хороший баланс выхода и активности. Иногда могут быть желательны композиции, в которых, например, как минимум, девяносто два процента или, как минимум, девяносто шесть процентов конъюгатов являются моно-PEG-видами (n равно 1). В одном варианте осуществления настоящего изобретения процент конъюгатов, где n означает 1, составляет от девяносто до девяносто шести процентов.
Фармацевтические композиции, включающие модифицированный полиэтиленгликолем эритропоэтин, известны в данной области и описываются в международной заявке на патент WO 01/87329. Композиции могут включать от 10 до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, как определено выше. Предпочтительно композиции включают от 10 до 1000 мкг, например, 10, 50, 100, 400, 800 или 2500 мкг на мл. Далее композиции могут включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, сульфат в концентрации 10-200 ммолей/л, фосфат в концентрации от 10 до 50 ммолей/л, рН от 6,0 до 6,5. Такая композиция может также включать метионин вплоть до 20 мМ, 1-5% полиола (мас./об.), вплоть до 0,1% плуроника F68 (мас./об.) и необязательно до 1 мМ CaCl2. Пример такой композиции включает от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, сульфат 40 ммолей/л, фосфат 10 ммолей/л, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2. Альтернативно композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, NaCl от 10 до 100 ммолей/л, фосфат от 10 до 50 ммолей/л, рН от 6,0 до 7,0, необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. Также такая композиция может включать метионин вплоть до 20 мМ, до 0,1% плуроника F68 (мас./об.) и необязательно CaCl2 7,5 мкмолей/л. Конкретно такая композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, NaCl 100 ммолей/л, 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.) и фосфат 10 ммолей/л, рН 7,0.
Настоящее изобретение также относится к упомянутой выше композиции, включающей от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, аргинин от 10 до 50 ммолей/л, рН от 6 до 6,5, сульфат натрия от 10 до100 ммолей/л. Дополнительно такая композиция может включать метионин до 20 мМ, до 0,1% плуроника F68 (мас./об.), необязательно CaCl2 до1 ммоля/л и необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. Конкретно, такая композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг эритропоэтинового белка на мл, аргинин 40 ммолей/л, рН 6,2, сульфат натрия 30 ммолей/л, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.) и необязательно CaCl2 1 ммоль/л.
Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к композициям, включающим эритропоэтин от 10 до 10000 мкг/мл, предпочтительно эритропоэтин от 25 до 2500 мкг/мл, и
а) 10 мМ фосфат натрия/калия, 100 мМ хлористый натрий, рН 7,0, или
б) 10 мМ фосфат натрия, 120 мМ сульфат натрия, рН 6,2, или
в) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), рН 6,2, или
г) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2, или
д) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), рН 6,2, или
е) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции включают количество эритропоэтинового белка в 50, 100, 400, 800 или 2500 мкг/мл. Наиболее предпочтительные композиции включают либо 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ сульфата натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионина, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2, либо 40 мМ аргинина, 30 мМ сульфата натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионина, 0,01% плуроника F68 (мас./об.), рН 6,2. Другие детали таких композиций известны из международной заявки на патент WO 01/87329.
Изобретение также относится к способу лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, включающему введение эффективного количества эритропоэтинового белка, как указано выше. Кроме того, изобретение относится к лекарственному средству для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, отличающемуся тем, что оно содержит эффективное количество эритропоэтинового белка. Примерами сердечных заболеваний являются, например, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, коронарный атеросклероз, острый коронарный синдром, сердечная недостаточность, застойная сердечная недостаточность и/или сердечная недостаточность. В контексте с описанным выше способом и лекарственным средством сердечная недостаточность является предпочтительной формой сердечных заболеваний. Предпочтительными способами и лекарственными средствами, как описано выше, являются те, где эритропоэтиновый белок является таким, как определено выше.
При лечении нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях ЕРО может, например, быть введен в дозе 150 ЕД/кг массы тела дважды в неделю. Доза может варьироваться в соответствии с потребностями отдельного пациента и может также быть в пределах, например, от 100-200 ЕД/кг. В зависимости от периода полураспада используемого производного эритропоэтина доза может быть введена, например, от 1 до 3 раз в неделю. В зависимости от потребностей отдельного больного врач может также выбрать другую дозу.
Специфическая активность ЕРО или ЕРО-конъюгатов согласно настоящему изобретению может быть определена с помощью различных анализов, известных в данной области. Биологическая активность очищенных эритропоэтиновых белков по настоящему изобретению проявляется в том, что введение эритропоэтинового белка путем инъекции больным людям приводит к повышенному продуцированию в клетках костного мозга ретикулоцитов и эритроцитов по сравнению с неинъецируемыми или контрольными группами субъектов. Биологическая активность эритропоэтиновых белков или их фрагментов, полученных и очищенных согласно настоящему изобретению, может быть исследована с помощью методов согласно Annable и др.. Bull. Wid. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112, и Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997 [2]. Другой биологический анализ для определения активности эритропоэтинового белка, анализ на мышах со зрелыми эритроцитами, описывается в литературе (например, Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio, 1997 [2], и в монографии об эритропоэтине Ph. Eur. BRP).
Изобретение будет лучше понято при ссылке на следующие примеры, которые иллюстрируют, но не ограничивают описанное здесь изобретение.
Примеры
Мужчину средних лет с сердечным заболеванием исследуют после сердечного катетера на нарушения распределения железа, определяя следующие параметры - CRP (С-реактивный белок), ферритин и рецептор растворимого трансферрина - как описано Р.Lehmann, M.Volkmann, J.Lotz, A.Baldauf, R.Roeddiger, постер, представленный на конференции ААСС/CSCC, ежегодная конференция, 29 июля - 2 августа, 2001, Чикаго, Иллинойс. Результаты показывают нарушения распределения железа. Больному вводят 150 ЕД/кг подкожно рекормонТМ (коммерчески доступный эритропоэтиновый белок) дважды в неделю максимум в течение 12 недель. Затем определение описанных выше параметров указывает на улучшение нарушения недостаточности железа.
Figure 00000024
Figure 00000025

Claims (13)

1. Применение человеческого эритропоэтина альфа или бета, либо его конъюгата для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях.
2. Применение по п.1, где сердечным заболеванием является сердечная недостаточность.
3. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин экспрессируется путем эндогенной активации гена.
4. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
5. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную прибавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования.
6. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин представляет собой дарбэпоэтин альфа.
7. Применение по п.1 или 2, где эритропоэтин, определенный в любом из пп.3-6, подвергают модификации полиэтиленгликолем.
8. Применение по п.7, где эритропоэтин представляет собой конъюгат, указанный конъюгат включает эритропоэтиновый белок, содержащий как минимум одну свободную аминогруппу и проявляющий in vivo биологическую активность, побуждающую клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и который выбирают из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой как минимум одного сайта гликозилирования; упомянутый эритропоэтиновый белок является ковалентно связанным с n полиэтиленгликольными группами формулы -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR и группа -СО каждой полиэтиленгликольной группы образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп; где R означает низший алкил; х означает 2 или 3; m означает число примерно от 450 до 900; n означает число от 1 до 3 и n и m выбирают таким образом, что молекулярная масса конъюгата минус эритропоэтиновый белок составляет от 20 до 100 кД.
9. Применение по п.8, где х означает 2, m означает число от 650 до 750, n равно 1 и R означает метил.
10. Применение по п.7, где эритропоэтин представляет конъюгат, указанный конъюгат включает эритропоэтиновый белок, содержащий как минимум одну свободную аминогруппу и проявляющий in vivo биологическую активность, побуждающую клетки костного мозга увеличивать продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, и который выбирают из группы, состоящей из человеческого эритропоэтинового белка и его аналогов, которые имеют первичную структуру человеческого эритропоэтинового белка, модифицированного добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования; упомянутый эритропоэтиновый белок является ковалентно связанным с 1-3 (низш.) алкоксиполиэтиленгликольными группами, каждая полиэтиленгликольная группа ковалентно связана с эритропоэтиновым белком линкером формулы -C(O)-X-S-Y и группа С(O) линкера образует амидную связь с одной из упомянутых аминогрупп, Х означает (СН2)k- или -CH2(О-СН2-СН2)k-, k означает число от 1-10, Y означает
Figure 00000026
;
Figure 00000027
;
Figure 00000028
;
или
Figure 00000029
,
средняя молекулярная масса каждой полиэтиленгликольной составляющей составляет примерно от 20 до 40 кД, а средняя молекулярная масса конъюгата составляет примерно от 51 до 175 кД.
11. Применение по п.10 эритропоэтинового конъюгата формулы
Figure 00000030
где n означает целое число от 1 до 3; m означает целое число от 450 до 900; R означает низший алкил; Х означает -(CH2)k- или -СН2(O-СН2-СН2)k, k означает число от 1 до 10 и Р является остатком эритропоэтинового белка без числа n аминогрупп, которые образуют амидную связь с X.
12. Способ лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, включающий введение эффективного количества эритропоэтина альфа или бета, либо его конъюгата.
13. Лекарственное средство для лечения нарушений распределения железа при сердечных заболеваниях, отличающееся тем, что оно содержит эффективное количество эритропоэтина альфа или бета, либо его конъюгата.
RU2005119649/15A 2002-11-22 2003-11-17 Новое применение эритропоэтина при сердечных заболеваниях RU2324494C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02026342.2 2002-11-22
EP02026342 2002-11-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2005119649A RU2005119649A (ru) 2006-03-20
RU2324494C2 true RU2324494C2 (ru) 2008-05-20

Family

ID=32337998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005119649/15A RU2324494C2 (ru) 2002-11-22 2003-11-17 Новое применение эритропоэтина при сердечных заболеваниях

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7459436B2 (ru)
EP (1) EP1565206B1 (ru)
JP (1) JP2006512326A (ru)
KR (1) KR100839302B1 (ru)
CN (1) CN100531797C (ru)
AR (1) AR042097A1 (ru)
AT (1) ATE426411T1 (ru)
AU (1) AU2003288081B2 (ru)
BR (1) BRPI0316438C1 (ru)
CA (1) CA2505524C (ru)
DE (1) DE60326874D1 (ru)
ES (1) ES2321928T3 (ru)
MX (1) MXPA05005281A (ru)
PL (1) PL210256B1 (ru)
RU (1) RU2324494C2 (ru)
WO (1) WO2004047858A1 (ru)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
AU2004268614C1 (en) * 2003-08-27 2010-10-28 Ophthotech Corporation Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
DK1696947T3 (en) 2003-12-19 2014-03-17 Hoffmann La Roche APPLICATION OF ERYTHROPOIETIN IN THE TREATMENT OF DISORDERS OF THE IRON DISTRIBUTION IN CHRONIC INFLAMMATORY INTESTINAL DISEASES
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US20080176790A1 (en) 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007026772A1 (ja) * 2005-08-31 2007-03-08 Kaneka Corporation ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類およびその作製法
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8304386B2 (en) * 2006-02-03 2012-11-06 Prolor Biotech, Inc. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US7553941B2 (en) 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20080242607A1 (en) 2006-07-21 2008-10-02 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
DK2144923T3 (da) 2007-04-03 2013-05-13 Biogenerix Ag Behandlingsfremgangsmåder under anvendelse af glycopegyleret g-csf
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
CA2715465C (en) 2008-02-27 2017-03-21 Novo Nordisk A/S Conjugated factor viii molecules
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
CN101870735B (zh) * 2010-06-02 2013-06-12 北京精益泰翔技术发展有限公司 一种新型高糖基化促红细胞生成素免疫融合蛋白
EP2838552A4 (en) 2012-04-19 2016-05-18 Opko Biolog Ltd OXYNTOMODULIN VARIANTS WITH EXTENDED ACTION AND PROCESSES FOR PRODUCING SAME
SG10202010383YA (en) 2012-11-20 2020-11-27 Opko Biologics Ltd Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides
SG11201510315TA (en) 2013-07-12 2016-01-28 Ophthotech Corp Methods for treating or preventing ophthalmological conditions
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
KR102662956B1 (ko) 2015-06-19 2024-05-03 옵코 바이오로직스 리미티드 장기-작용성 응고 인자 및 그의 제조 방법
EA201990255A1 (ru) 2016-07-11 2019-07-31 Опко Байолоджикс Лтд Фактор свертывания крови vii пролонгированного действия и способы его получения
US20230331798A1 (en) * 2020-09-22 2023-10-19 Jecho Laboratories, Inc. Glycosylation-modified erythopoietin and use thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS57183508A (en) * 1981-05-07 1982-11-11 Nippon Piston Ring Co Ltd Compound valve seat
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
US4745099A (en) 1985-02-06 1988-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of malignant tumors
NO881507D0 (no) 1987-04-10 1988-04-07 Ortho Pharma Corp Fremgangsmaate for forhoeyning av hematokritnivaaet til et normalt pattedyr.
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
DE3924705A1 (de) 1989-07-26 1991-01-31 Boehringer Mannheim Gmbh Heterobifunktionelle verbindungen
DE69032809T2 (de) 1989-11-06 1999-07-08 Cell Genesys, Inc., Foster City, Calif. Herstellung von Proteinen mittels homologer Rekombination
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
DE69034135T3 (de) 1989-12-22 2012-08-23 Laboratoires Serono S.A. DNS-Konstrukten zur Aktivierung und Veränderung der Expression von endogenen Genen
GB9001987D0 (en) 1990-01-29 1990-03-28 Janssen Pharmaceutica Nv Improved cyclodextrin based erythropietin formulation
US5324650A (en) 1990-03-20 1994-06-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Situ process for production of conjugates
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
EP0576589A4 (en) 1991-03-18 1994-07-27 Enzon Inc Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
NZ244778A (en) 1991-10-21 1994-03-25 Ortho Pharma Corp Peg imidates and protein derivatives thereof
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
CA2101361A1 (en) 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
DE19535571A1 (de) 1995-09-14 1997-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten
JP2001508783A (ja) 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
PT977582E (pt) 1997-03-18 2002-12-31 Roche Diagnostics Gmbh Preparacoes farmaceuticas associadas contendo eritropoietina e preparacoes de ferro
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
DE19734293A1 (de) 1997-08-08 1999-02-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung von pharmazeutischen Kombinationspräparaten enthaltend Erythropoietin und Eisenpräparate zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
BRPI0110914B8 (pt) 2000-05-15 2021-05-25 Hoffmann La Roche 'composição farmacêutica líquida, processo para preparação da mesma e uso de uma composicão farmacêutica'
US20020065214A1 (en) 2000-11-29 2002-05-30 Adrian Iaina Method of treating congestive heart failure
ES2361824T3 (es) 2000-12-20 2011-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de eritropoyetina (epo) con polietilenglicol (peg).
EP1425589B1 (en) 2001-09-14 2007-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Differential diagnosis of disorders of iron metabolism

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Патологическая физиология. /Под ред. А.Д.Адо и Л.М.Ишимовой. - М.: Медицина, 1973, с.273-275. Thomas С. et al. Biochemical markers and hematologic indices in the diagnosis of functional iron deficiency. Clin Chem. 2002 Jul; 48(7): 1066-76 [on line]. PMID: 12089176 [найдено 15.06.2006] Найдено из Интернет:<URL:http://www.clinchem.org/cgi/content/full/48/7/1066. *
Реферат Entrez PubMed: Goodnough LT. et al. Transfusion medicine: support of patients undergoing cardiac surgery. Am J Cardiovasc Drugs. 2001; 1(5):337-51 [on line] PMID: 14728016 [найдено 15.06.2006]. реферат БД ВИНИТИ: Sawada Yoshihide et al. Операция на открытом сердце у мальчика из секты «Свидетели Иеговы»: описание случая успешного лечения аортальной регургитации и аневризмы синуса Вальсаавы на почве инфекционного эндокардита Nihon kyobu geka gakkai zasshi = J.Jap.Thorac.Surg.1997; 45(12):96-100 [on line] № реферата: 98.09-04 М2.357 [найдено 15.06.2006]. *
СУМАРОКОВ А.А. и др. Клиническая кардиология. - M.: Универ-сум паблишинг, 1995, с.184, 185. *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2505524A1 (en) 2004-06-10
AR042097A1 (es) 2005-06-08
JP2006512326A (ja) 2006-04-13
CN100531797C (zh) 2009-08-26
BRPI0316438C1 (pt) 2021-05-25
ES2321928T3 (es) 2009-06-15
PL210256B1 (pl) 2011-12-30
MXPA05005281A (es) 2005-07-25
PL377590A1 (pl) 2006-02-06
BR0316438A (pt) 2005-10-11
ATE426411T1 (de) 2009-04-15
EP1565206B1 (en) 2009-03-25
US20040209802A1 (en) 2004-10-21
AU2003288081B2 (en) 2007-02-01
CN1713919A (zh) 2005-12-28
AU2003288081A1 (en) 2004-06-18
WO2004047858A1 (en) 2004-06-10
EP1565206A1 (en) 2005-08-24
KR20050085091A (ko) 2005-08-29
RU2005119649A (ru) 2006-03-20
BRPI0316438B8 (pt) 2016-09-27
CA2505524C (en) 2017-02-07
KR100839302B1 (ko) 2008-06-17
US7459436B2 (en) 2008-12-02
BRPI0316438B1 (pt) 2016-08-02
DE60326874D1 (de) 2009-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2324494C2 (ru) Новое применение эритропоэтина при сердечных заболеваниях
RU2305554C2 (ru) Применение эритропоэтина
US7459429B2 (en) Method of treating disturbances of iron distribution in inflammatory intestinal diseases
US6340742B1 (en) Erythropoietin conjugates
EP1333036B1 (en) Peg-modified erythropoietin
RU2232163C2 (ru) Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции