KR20050085091A - 심장 질환에서 에리스로포이에틴의 신규한 용도 - Google Patents

심장 질환에서 에리스로포이에틴의 신규한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심장 질환에서 철분 분포 장애의 치료를 위한 에리스로포이에틴의 용도에 관한 것이다.

Description

심장 질환에서 에리스로포이에틴의 신규한 용도{NOVEL USE OF ERYTHROPOIETIN IN HEART DISEASES}
본 발명은 에리스로포이에틴의 신규한 용도, 특히 심장 질환에서 철분 분포 장애의 치료에 관한 것이다.
철분의 대사가 정상적이지 않은 다양한 질환이 공지되어 있다. 빈혈(anemia)에서, 충분하지 못한 혈액은 신체에서 철분이 전체적으로 부족하기 때문이다. 철분에 관련된 다른 대사적 상태는 신체에서 철분의 전체적인 농도가 정상보다 높은 혈액색소침착증(hemochromatosis)이고, 이는 예를 들어 기관의 파괴와 같은 다양한 상태를 유도한다.
철분의 분포 장애는 신체에서 철분의 전체 농도가 정상이기 때문에 상기에 언급된 빈혈 및 혈액색소침착증과 다르다. 한편, 철분은 다양한 기관에 축적되어 손상을 유도할 수 있고, 심지어 이러한 기관을 파괴할 수 있다. 한편, 혈액의 형성에서 정상적인 양으로 존재하는 철분의 사용이 악화되면, 빈혈에 관련된 효과에 유사한 이차 효과가 유도된다.
지금까지, 심장질환으로 고통받는 환자들이 철분 분포 장애에 의해 영향을 받을 가능성이 높다는 사실은 알려지지 않았다. 철분 분포 장애는 철분 상태의 진단에서 일반적으로 사용되는 다양한 파라미터에 의해 진단될 수 있다. 페리틴(ferritin) 및 가용성 트랜스퍼린(transferrin) 수용체의 측정에 기초하여, 심장 질환으로 고통받는 환자에게서 철분의 전체적인 농도가 정상인지 여부를 평가하는 것이 가능하다. 망상 적혈구에서 헤모글로빈의 낮아진 농도가 철분 분포 장애의 하나의 지표(indicator)이다. 심장 질환으로 고통받고 정상적인 전체적인 철분 농도를 보이는 환자에서는 C-반응성 단백질(CRP)의 연속적으로/장기적으로 상승된 농도가 또 다른 지표가 된다. 2001년 7월 29일 내지 8월 2일에 미국 일리노이주 시카고에서 개최된 AACC/CSCC의 애뉴얼 미팅에서 P. 레만(Lehmann), M. 폴크만(Volkmann), J. 로츠(Lots), A. 발다우프(Baldauf), R. 뢰디거(Roeddiger)에 의해 발표된 포스터에 철분 분포 장애를 진단하기 위한 방법이 개시되었다.
발명의 요약
지금까지, 철분 분포 장애로 고통받는 심장 질환 환자를 위한 어떤 치료법도 제안되지 않았다. 그러므로 본 발명의 기본적인 문제는 상기에 언급한 단점을 최소화하거나 억제하기 위한 심장 질환에서 철분 분포 장애를 위한 치료법을 제공하는 것이다. 놀랍게도 에리스로포이에틴이 심장 질환에서 철분 분포 장애에 유익한 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 상기 문제는 본 발명에 따라서 심장 질환에서 철분 분포 장애의 치료법에 사용하기 위한 에리스로포이에틴을 제공함으로서 해결된다.
달리 지시되지 않는 한, 하기의 정의는 본원에서 본 발명을 명시하기 위해 다양한 용어의 의미와 범위를 예시하고 정의하기 위해 개시된다.
용어 "저급 알킬"은 본원에서 사용되는 바와 같은 탄소수 1 내지 6을 갖는 직선형 또는 분지형 알킬기를 의미한다. 저급 알킬기의 예는 메틸, 에틸 및 아이소프로필, 바람직하게 메틸을 포함한다.
용어 "저급 알콕시"는 본원에서 사용되는 바와 같은 R'-O-기를 의미하고, 여기에서 R'는 상기에서 개시한 바와 같은 저급 알킬이다.
용어 "심장 질환 철분 분포 장애"는 심장 질환으로 고통받는 환자에게서 발생하는 철분 분포 장애를 지칭한다. 철분 분포 장애는 예를 들어 상기에서 개시된 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 철분 분포 장애는 하기의 파라미터를 특징으로 한다: 로그(페리틴의 농도[㎍/L])로 나눈 가용성 트랜스퍼린 수용체의 농도[㎎/L]가 3.5이하이고, 동시에 C-반응성 단백질의 농도가 5㎎/L이상이다.
용어 "에리스로포이에틴" 또는 "에리스로포이에틴 단백질"은 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키는 생체 내 생물학적 활성을 갖는 인간 에리스로포이에틴 및 하기에 정의된 아날로그로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 지칭한다.
용어 "페길화된(pegylated) 에리스로포이에틴(Peg-EPO 또는 PEG-EPO)"은 하기에 개시한 바와 같은 1 내지 3개의 폴리에틸렌 유도체가 공유결합된 에리스로포이에틴 단백질을 지칭한다.
도 1은 인간 EPO의 일차 구조(165개 아미노산)(서열 1)이다.
도 2는 인간 EPO의 일차 구조(166개 아미노산)(서열 2)이다.
더욱 자세하게, 본 발명은 심장 질환에서 철분 분포 장애의 치료법에 관한 약제의 제조에서 에리스로포이에틴의 용도에 관한 것이다. 심장 질환의 예는 예를 들어 관상 동맥 심장 질환, 동맥 경화증, 관상 동맥 경화증, 급성 관상 동맥 증후군, 심부전, 울혈성 심부전 및/또는 심장 기능 부전이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 심장 질환이 심장 기능 부전인, 상기에 정의된 용도에 관한 것이다.
본 발명은 약학적 활성 성분으로서 에리스로포이에틴을 포함하는 약학 조성물의 제조에 특히 유용하다. 용어 "에리스로포이에틴" 또는 "에리스로포이에틴 단백질" 또는 "EPO"는 특히 예를 들어 (서열 1) 또는 (서열 2)에 개시된 아미노산 서열 또는 실질적으로 그에 일치하는 아미노산 서열을 갖는 인간 에리스로포이에틴 같은 당단백질을 지칭하고, 이의 생물학적 특성은 적혈구 생성의 자극 및 골수에서 수임 적혈구 전구 세포(erythroid progenitor)의 분열 및 분화의 자극에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 용어는 예를 들어 자리-유도 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 또는 우연한 돌연 변이를 통해 유도(deliberately) 변형된 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 또한 글라이코실화(glycosylation)를 위한 1 내지 6개의 추가적인 자리를 갖는 아날로그(analog), 당단백질의 카복시 종결 단말에서 하나 이상의 추가적인 아미노산을 갖는 아날로그(여기에서, 추가적인 아미노산은 하나 이상의 글라이코실화 자리를 포함함), 및 글라이코실화를 위한 하나 이상의 자리의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 아날로그를 포함한다. 이러한 용어는 자연적인 인간 에리스로포이에틴 및 재조합 생성된 인간 에리스로포이에틴을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 에리스로포이에틴 단백질은 인간 에리스로포이에틴이다.
하기에 자세하게 개시된 바와 같이, EPO의 제조 및 정제는 당분야에서 잘 공지되어 있다. "에리스로포이에틴"은 조직, 단백질 합성, 및 자연적인 세포 또는 재조합 세포로의 세포 배양 같은 임의의 통상적인 공급원으로부터 수득한, 예를 들어 에포에틴 α 또는 에포에틴 β 같은 자연 또는 재조합 단백질(바람직하게 인간 단백질)을 의미한다. 뮤테인(mutein) 또는 다르게는 변형된 단백질 같은 에리스로포이에틴의 활성을 갖는 임의의 단백질이 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 에리스로포이에틴 단백질은 에포에틴 α 또는 에포에틴 β이다. 재조합 EPO는 CHO-, BHK- 또는 HeLa 세포 라인에서 재조합 DNA 기술 또는 내인성 유전자 활성화(endogenous gene activation)에 의해 발현되어 제조될 수 있다. 내인성 유전자 활성화를 포함한 단백질의 발현은 당분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 각각의 내용을 본원에서 참고로서 인용한 미국 특허 제5,733,761호, 제5,641,670호, 및 제5,733,746호, 및 국제 특허 공보 제93/09222호, 제94/12650호, 제95/31560호, 제90/11354호, 제91/06667호 및 제91/09955호에 개시되어 있다. 에리스로포이에틴 단백질이 내인성 유전자 활성화에 의해 발현되는 상기에 정의된 바와 같은 용도가 바람직하다. 에리스로포이에틴 당단백질 생성물의 제조를 위해 바람직한 EPO 종은 인간 EPO 종이다. 더욱 바람직하게, EPO 종은 서열 1 또는 서열 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는 인간 EPO이고, 더욱 바람직하게 아미노산 서열 서열 1이다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 실시양태는 에리스로포이에틴 단백질이 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 상기에 개시된 바와 같은 용도에 관한 것이다.
추가적으로, 에리스로포이에틴은 글라이코실화를 위한 1 내지 6개의 추가적인 자리를 갖는 당단백질 아날로그일 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 에리스로포이에틴 단백질이 1 내지 6개의 글라이코실화 자리의 첨가에 의해 변형된 인간 에리스로포이에틴의 서열을 갖는 상기에 개시한 바와 같은 용도에 관한 것이다. 하나 이상의 올리고사카라이드기로의 단백질의 글라이코실화는 폴리펩타이드 백본(backbone)을 따라 특정 위치에서 발생하고, 단백질의 안정성, 분비, 세포내 위치, 및 생물학적 활성 같은 단백질의 물리적 특성에 크게 영향을 미친다. 글라이코실화는 보통 두 가지 형태이다. O-연결된 올리고사카라이드는 세린 또는 트레오닌 잔기에 연결되고, N-연결된 올리고사카라이드는 아스파라진 잔기에 연결된다. N-연결된 올리고사카라이드 및 O-연결된 올리고사카라이드 둘다에서 발견되는 올리고사카라이드의 한 형태는 9 이상의 탄소수를 함유하는 아미노 당 계열인 N-아세틸뉴라민산(사이알산)이다. 사이알산은 일반적으로 N-연결된 올리고사카라이드 및 O-연결된 올리고사카라이드 둘다에서의 종결 잔기이고, 음의 전하를 띄기 때문에 당단백질에 산성 특성을 부여한다. 165개의 아미노산을 갖는 인간 에리스로포이에틴은 당단백질의 총 분자량의 약 40%를 포함하는 3개의 N-연결된 올리고사카라이드 및 O-연결된 올리고사카라이드 쇄를 함유한다. N-연결된 글라이코실화는 24, 38, 및 83번 위치에 위치한 아스파라진 잔기에서 발생하고, O-연결된 글라이코실화는 126번 위치에 위치한 세린 잔기에서 발생한다. 올리고사카라이드 쇄는 종결 사이알산 잔기로 변형된다. 글라이코실화된 에리스로포이에틴으로부터 모든 사이알산 잔기의 효소적 제거는 생체 내에서 활성의 손실을 야기하지만, 에리스로포이에틴의 사이알화가 그것의 결합을 예방하기 때문에 시험관 내 활성의 손실, 및 간-결합 단백질에 의한 후속적인 제거를 야기하지 않는다.
용어 "에리스로포이에틴"은 사이알산 연결을 위한 자리의 수를 증가시키는, 인간 에리스로포이에틴의 아미노산 서열에서 하나 이상의 변화를 갖는 인간 에리스로포이에틴의 아날로그를 포함한다. 이 당단백질 아날로그는 글라이코실화를 위해 이용가능한 자리를 증가시키거나 바꾸는 아미노산 잔기의 첨가, 삭제, 또는 치환시키는 자리-유도 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 인간 에리스로포이에틴에서 발견되는 것보다 높은 사이알산의 수준을 갖는 당단백질 아날로그는 생물학적 활성을 위해 필요한 2차 또는 3차 구조를 혼란시키지 않는 글라이코실화 자리의 첨가에 의해 생성된다. 본 발명의 당단백질은 또한 N-연결된 자리 또는 O-연결된 자리에 근접한 하나 이상의 아미노산의 치환을 통상적으로 포함하는 글라이코실화 자리에서 증가된 탄수화물의 연결 수준을 갖는 아날로그를 포함한다. 본 발명의 당단백질은 또한 에리스로포이에틴의 카복시 종결 말단으로부터 확장된 하나 이상의 아미노산을 갖고 하나 이상의 추가적인 탄수화물 자리를 제공하는 아날로그를 포함한다. 본 조성물의 에리스로포이에틴 단백질은 또한 글라이코실화를 위한 하나 이상의 자리의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 아날로그를 포함한다. 글라이코실화 자리의 이러한 재배열은 인간 에리스로포이에틴에서 하나 이상의 글라이코실화 자리의 제거 및 하나 이상의 비-자연적으로 발생하는 글라이코실화 자리의 첨가를 포함한다. 에리스로포이에틴 상의 탄수화물쇄의 수와 에리스로포이에틴 분자당 사이알산의 수를 증가시키면 증가된 용해도, 증가된 단백질 분해에 대한 저항성, 감소된 면역발생성, 증가된 혈청의 반감기, 및 증가된 생물학적 활성과 같은 유리한 특성을 부여할 수 있다. 추가적인 글라이코실화 자리를 갖는 에리스로포이에틴 아날로그는 1995년 3월 1일 공개된 엘리엇(Elliot)에게 허여된 유럽 특허 출원 제640 619호에 더욱 자세하게 개시되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 하기로부터 선택된 변형에 의해 변형된 인간 에리스로포이에틴의 서열을 포함하는 에리스로포이에틴(이에 한정되지 않음) 같은 글라이코실화를 위한 하나 이상의 추가적인 자리를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 에리스로포이에틴 단백질을 포함한다:
아미노산 서열의 변형을 위해 본원에서 사용하는 표시법은 윗첨자 숫자로 지시된 상응하는 변형되지 않은 단백질(예를 들어 서열 1 또는 서열 2의 hEPO)의 위치가 각각의 윗첨자 숫자 바로 앞에 있는 아미노산으로 변하는 것을 의미한다.
에리스로포이에틴 단백질은 또한 당단백질의 카복시 종결 말단에서 하나 이상의 추가적인 아미노산을 갖는 아날로그일 수 있고, 여기에서 추가적인 아미노산은 하나 이상의 글라이코실화 자리를 포함한다. 추가적인 아미노산은 인간 융모생식샘자극호르몬(chorionic gonadotropin)의 카복시 종결 말단으로부터 유래된 펩타이드 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게, 당단백질은 (a) 카복시 종결부로부터 연장된 아미노산 서열 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln을 갖는 인간 에리스로포이에틴; (b) (a)에 추가적으로 Ser87 Asn88 Thr90 EPO를 포함하는 아날로그; (c) (a)에 추가적으로 Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO를 포함하는 아날로그로 구성된 군으로부터 선택되는 아날로그이다.
에리스로포이에틴 단백질은 또한 글라이코실화를 위한 하나 이상의 자리의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 아날로그일 수 있다. 재배열은 인간 에리스로포이에틴에서 임의의 N-연결된 탄수화물 자리의 제거 및 인간 에리스로포이에틴의 아미노산 서열의 88번 위치에서 N-연결된 탄수화물 자리의 첨가를 포함할 수 있다. 바람직하게, 당단백질은 Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; 및 Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO로 구성된 군으로부터 선택되는 아날로그이다. 추가적인 아날로그는 다르베포에틴(darbepoetin) α이다. 상기에 개시된 용도에서 바람직한 에리스로포이에틴 단백질은 다르베포이에틴(darbepoietin) α이다.
더욱 구체적으로, 상기에 개시한 바와 같이 본 약학 조성물의 에리스로포이에틴 단백질은 또한 그의 페길화된 유도체를 포함할 수 있다. 에리스로포이에틴의 페길화된 유도체 및 그의 제조는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 국제 공개 공보 제01/02017호, 유럽 특허 제A-1064951호, 제A-539,167호, 제A-605,963호, 국제 공개 공보 제93/25212호, 제94/20069호, 제95/11924호, 미국 특허 제5,56호, 유럽 특허 제A-584,876호, 국제 공개 공보 제92/16555호, 제94/28024호, 제97/04796호, 미국 특허 제5,359,030호, 및 제5,681,811호, 제4,179,337호, 일본 특허, 국제 공개 공보 제98/32466호, 미국 특허 제5,324,650호에 개시되어 있다. 바람직하게, 상기에 개시된 용도에서, 에리스로포이에틴 단백질은 페길화되어 있다. 페길화된 에리스로포이에틴 종의 바람직한 실시양태는 하기에 개시된 바와 같은 유도체에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 에리스로포이에틴 단백질이 컨쥬게이트(conjugate)인 상기에 개시된 용도에 관한 것으로, 상기 컨쥬게이트는 하나 이상의 자유 아미노기를 가지며, 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키는 생체 내 생물학적 활성을 갖고, 1 내지 6개의 글라이코실화 자리의 첨가 또는 하나 이상의 글라이코실화 자리의 재배열에 의해 변형되는 인간 에리스로포이에틴의 서열을 갖는 인간 에리스로포이에틴 및 그의 아날로그로 구성된 군으로부터 선택되는 상기에 개시된 에리스로포이에틴 단백질을 포함하고; 상기 에리스로포이에틴은 구조식 CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR의 n개의 폴리(에틸렌 글라이콜)기에 공유결합되는데, 각각의 폴리(에틸렌 글라이콜)중의 -CO(즉, 카본일)기는 상기 아미노기 중 하나와 아마이드 결합을 형성하며; 여기에서 R은 저급 알킬이고; x는 2 또는 3이고; m은 약 450 내지 약 900이고; n은 1 내지 3이고; 및 n 및 m은 에리스로포이에틴 단백질의 분자량을 뺀 컨쥬게이트의 분자량이 약 20kDa 내지 100kDa이 되도록 선택된다. 본 발명은 추가적으로 본원에서 개시한 n이 1인 컨쥬게이트의 백분율이 조성물의 전체 컨쥬게이트의 90%이상, 바람직하게 92% 이상, 더욱 바람직하게 96%인 컨쥬게이트를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
더욱 구체적으로 상기의 컨쥬게이트는 화학식 I으로 표시될 수 있다.
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n
상기 식에서,
P는 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키는 생체 내 생물학적 활성을 갖는, 본원에서 개시된 바와 같은 에리스로포이에틴 단백질의 잔기이고(화학식 I에서 보여주는 카본일과 아마이드 결합을 형성하는 아미노기 또는 아미노기들이 없음); R은 저급 알킬이고; x는 2 또는 3이고; m은 약 450 내지 900이고; n은 1 내지 3이고; 및 n 및 m은 에리스로포이에틴 단백질의 분자량을 뺀 컨쥬게이트의 분자량이 약 20kDa 내지 100kDa이 되도록 선택된다. 본 발명에 따라, R은 임의의 저급 알킬이다. R이 메틸인 컨쥬게이트가 바람직하다.
표시 "m"은 폴리(에틸렌 옥사이드)기에서 에틸렌 옥사이드 잔기 (OCH2CH2)의 수를 나타낸다. 에틸렌 옥사이드의 단일 PEG(폴리에틸렌 글라이콜) 서브단위는 약 44Da의 분자량을 갖는다. 그러므로, 컨쥬게이트의 분자량(EPO의 분자량을 제외함)은 숫자 "m"에 좌우된다. 본 발명의 컨쥬게이트에서 "m"은 약 450 내지 약 900이고(약 20kDa 내지 약 40kDa의 분자량에 상응함), 바람직하게 약 650 내지 약 750이다(약 30kDa의 분자량에 상응함). 숫자 m은 본 발명의 생성된 컨쥬게이트가 변형되지 않은 EPO에 유사한 생리적인 활성을 갖도록 선택되고, 상기 활성은 변형되지 않은 EPO의 상응하는 활성의 단편과 동일하거나 많이 나타날 수 있다. 특정 숫자 앞에 "약"을 갖는 분자량은 통상적인 분석 기법에 의해 측정된 숫자의 합리적인 범위 내에 있음을 의미한다. 숫자 "m"은 에리스로포이에틴 당단백질에 공유결합된 각각의 폴리(에틸렌 글라이콜)기의 분자량이 약 20kDa 내지 약 40kDa이고, 바람직하게 약 30kDa이 되도록 선택된다.
본 발명의 컨쥬게이트에서, 숫자 "n"은 아마이드 결합을 통한 에리스로포이에틴 단백질의 자유 아미노기(라이신 아미노산의 ε-아미노기 및/또는 아미노-종결 아미노기를 포함함)에 공유결합된 폴리(에틸렌 글라이콜)기의 수이다. 본 발명의 컨쥬게이트는 EPO 분자당 1, 2 또는 3개의 PEG기를 가질 수 있다. "n"은 1 내지 3 범위의 정수이고, 바람직하게 "n"은 1 또는 2이고, 더욱 바람직하게 "n"은 1이다. 상기에 개시된 컨쥬게이트의 바람직한 컨쥬게이트는 x가 2이고, m이 650 내지 750이고, n이 1이고, R이 메틸인 화합물을 포함한다.
화학식 I의 화합물은 화학식 II의 화합물을 에리스로포이에틴 당단백질과 축합함으로써 공지된 중합성 물질로부터 제조될 수 있다:
상기 식에서,
R 및 m은 상기에 개시된 바와 같다. x가 3인 화학식 II의 화합물은 폴리(에틸렌 글라이콜)의 α-저급 알콕시, 뷰타르산 석신이미딜 에스터(저급 알콕시-PEG-SBA)이다. x가 2인 화학식 II의 화합물은 폴리(에틸렌 글라이콜)의 α-저급 알콕시, 프로파이온산 석신이미딜 에스터(저급 알콕시-PEG-SPA)이다. 아마이드를 형성하기 위해 활성화된 에스터를 아민과 반응시키는 임의의 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 상기에 언급된 반응에서, 예시된 석신이미딜 에스터는 아마이드 형성을 야기하는 이탈기이다. 단백질과 컨쥬게이트를 생성하기 위한 화학식 II의 화합물 같은 석신이미딜 에스터의 용도는 1997년 9월 30일에 허여된 미국 특허 제5,672,662호(해리스(Harris) 등)에 개시되어 있다.
인간 EPO는 9개의 자유 아미노기, 즉 아미노-종결 아미노기와 8개의 라이신 잔기의 ε-아미노기를 함유한다. 페길화 반응 시약이 화학식 II의 SBA 화합물과 결합될 때, pH 7.5, 1:3의 단백질:PEG 비, 20 내지 25℃의 반응 온도에서, 모노-, 다이-, 및 미량의 트라이-페길화된 종의 혼합물이 생성됨이 발견되었다. 페길화 반응 시약이 화학식 II의 SPA 화합물인 경우, 단백질:PEG 비가 1:2인 유사한 조건에서 일차적으로 모노-페길화된 종이 생성되었다. 페길화된 EPO는 혼합물로서, 또는 양이온 교환 크로마토그래피로 분리된 상이한 페길화된 종으로서 투여될 수 있다. 반응 조건(예를 들어, 시약의 비율, pH, 온도, 단백질 농도, 반응 시간 등)을 조작함으로써 상이한 페길화된 종의 상대적인 양이 달라질 수 있다.
본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태는 에리스로포이에틴 단백질이 컨쥬게이트인 상기에 정의된 바와 같은 용도에 관한 것으로, 상기 컨쥬게이트는 하나 이상의 자유 아미노기를 가지며, 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키는 생체 내의 생물학적 활성을 갖고, 1 내지 6개의 글라이코실화 자리의 첨가에 의해 변형된 인간 에리스로포이에틴 단백질의 일차 구조를 갖는 인간 에리스로포이에틴 단백질 및 그의 아날로그로 구성된 군으로부터 선택되는 상기에 정의된 에리스로포이에틴 단백질을 포함하고; 상기 에리스로포이에틴은 1 내지 3개의 저급 알콕시 폴리(에틸렌 글라이콜)기에 공유결합되고, 각각의 폴리(에틸렌 글라이콜)기는 화학식 -C(O)-X-S-Y-의 결합자를 통해 에리스로포이에틴 단백질과 공유결합으로 연결되는데, 결합자의 C(O)는 상기 아미노기 중의 하나와 아마이드 결합을 형성하며, X는 -(CH2)k- 또는 -CH2(O-CH2-CH2)k-이고, k는 1 내지 10이고, Y는 또는
이고; 각각의 폴리(에틸렌 글라이콜) 잔기의 평균 분자량은 약 20kDa 내지 약 40kDa이고, 컨쥬게이트의 분자량은 약 51kDa 내지 약 175kDa이다.
이 에리스로포이에틴 종은 또한 화학식 III의 화합물로 나타낼 수 있다:
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n
상기 식에서,
R은 임의의 저급 알킬이 될 수 있다. 바람직한 저급 알킬은 메틸이다. X는 -(CH2)k- 또는 -CH2(O-CH2-CH2)k-이고, 여기에서 k는 1 내지 약 10이다. 바람직하게, k는 1 내지 약 4이고, 더욱 바람직하게 k는 1 또는 2이다. 가장 바람직하게, X는 -(CH2)이다.
상기 화학식에서, Y는
화학식 III에서, 숫자 m은 화학식 III의 생성된 컨쥬게이트가 변형되지 않은 EPO에 유사한 생리학적 활성을 갖도록 선택되고, 상기 활성은 변형되지 않은 EPO의 상응하는 활성의 단편과 동일하거나 많음을 나타낼 수 있다. m은 PEG 단위에서 에틸렌 옥사이드 잔기의 수를 나타낸다. -(OCH2CH2)-의 단일 PEG 서브단위는 약 44Da의 분자량을 갖는다. 그러므로, 컨쥬게이트의 분자량(EPO의 분자량을 제외함)은 숫자 m에 좌우된다. 특정 숫자 앞에 약을 포함하는 분자량은 통상적인 분석 기법에 의해 측정된 숫자의 합리적인 범위 내에 있음을 의미한다. m은 약 450 내지 약 900 범위의 정수이고(약 20kDa 내지 약 40kDa의 분자량에 상응함), 바람직하게 m은 약 550 내지 약 800이고(약 24 내지 35kDa의 분자량에 상응함), 가장 바람직하게 m은 약 650 내지 700이다(약 29 내지 31kDa에 상응함).
화학식 III에서, 숫자 n은 아마이드 결합을 통해 PEG 단위에 공유결합된 에리스로포이에틴 단백질에서 라이신 아미노산의 ε-아미노기의 수이다. 본 발명의 컨쥬게이트는 EPO의 분자당 1, 2, 또는 3개의 PEG 단위를 가질 수 있다. n은 1 내지 3 범위의 정수이고, 바람직하게 n은 1 또는 2이고, 더욱 바람직하게 n은 1이다.
화학식 III의 바람직한 에리스로포이에틴 단백질은 하기의 화학식으로 표시 될 수 있다:
본 발명에서 가장 바람직한 실시양태에서, 에리스로포이에틴 컨쥬게이트는 하기의 화학식으로 표시된다:
상기 식에서,
n은 1 내지 3의 정수이고; m은 450 내지 900의 정수이고; R은 저급 알킬이고; X는 -(CH2)k- 또는 CH2(O-CH2-CH2)k-이고, P는 X와 아마이드 결합을 형성하는 아미노기 또는 아미노기들이 없는 에리스로포이에틴 단백질의 잔기이다.
다른 바람직한 에리스로포이에틴 당단백질 생성물은 하기의 화학식으로 대표된다:
가장 바람직한 에리스로포이에틴 당단백질 생성물은 하기의 화학식으로 대표된다:
이 에리스로포이에틴 단백질은 하기 단계에 의해 제조될 수 있다:
(a) 화학식 P-[NH2]n으로 표시되는 에리스로포이에틴 단백질의 라이신 아미노산의 ε-아미노기를 화학식 Z-CO-X-S-Q으로 표시되는 이-작용성 시약과 공유결합 반응시켜 하기의 화학식으로 표시되는 아마이드 결합을 갖는 중간체를 형성하는 단계:
P-[NH-CO-X-S-Q]n
(상기 식에서, P는 아마이드 결합을 형성하는 아미노기가 보다 적은 에리스로포이에틴 단백질이고; n은 1 내지 3 범위의 정수이고; Z는 반응성기이고, 예를 들어, 카복실릭-NHS 에스터이고; X는 -(CH2)k- 또는 CH2(O-CH2-CH2)k-이고, 여기에서 k는 1 내지 약 10이고; 및 Q는 알칸오일(예를 들어 아세틸) 같은 보호기임)
(b) 화학식 W-[OCH2CH2]m-OR으로 표시되는 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜) 유도체와 단계 (a)의 아마이드 결합과 상기 중간체를 공유결합으로 반응시켜 하기의 화학식으로 대표되는 에리스로포이에틴 당단백질을 형성하는 단계:
상기 식에서,
W는 Y의 설프하이드릴 반응성 형태이고; m은 약 450 내지 약 900 범위의 정수이고; R은 저급 알킬이고; 및 Y는 상기에 정의한 바와 같다.
본 실시양태에서, 이-작용성 시약은 바람직하게 N-석신이미딜-S-아세틸티오프로파이오네이트 또는 N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트이고, Z는 바람직하게 N-하이드록시-석신이미드이고, 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜) 유도체 W-[OCH2CH2]m-OR이 바람직하게 아이오도-아세틸-메톡시-PEG, 메톡시-PEG-바이닐설폰, 및 메톡시-PEG-말레이미드로 구성된 군으로부터 선택된다.
더욱 자세하게, 화학식 III의 에리스로포이에틴 단백질을 EPO에 티올기를 공유결합("활성화")하고 생성된 활성화된 EPO를 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG) 유도체와 결합함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 페길화된 EPO의 제조를 위한 첫 번째 단계는 티올기를 EPO의 NH2기를 통해 공유결합시키는 것을 포함한다. EPO의 활성화는 활성 에스터(예를 들어, 석신이미딜에스터), 안하이드라이드, 설폰산의 에스터, 카복실산 및 설폰산의 각각의 할로게나이드 같은, 추가적인 반응기 및 보호된 티올기를 갖는 이-작용성 시약으로 수행될 수 있다. 티올기는 당분야에서 공지된 기(예를 들어, 아세틸기)에 의해 보호된다. 이-작용성 시약은 아마이드 연결을 형성함으로써 라이신 아미노산의 ξ-아미노산과 반응할 수 있다. 반응의 제 1 단계는 하기와 같이 개시된다:
상기 식에서,
EPO, n 및 X는 상기에 정의된 바와 같고, Z는 당분야에 공지된 반응성기, 예를 들어 화학식 의 N-하이드록시-석신이미드(NHS) 치환기이다.
바람직한 실시양태에서, ε-아미노 라이신기의 활성화는 석신이미딜 잔기를 갖는 이-작용성 시약과 반응시킴으로써 수행된다. 이-작용성 시약은 상이한 스페이서 종, 예를 들어 -(CH2)k- 또는 -CH2-(O-CH2-CH2-)k-잔기를 포함할 수 있고, 여기에서 k는 1 내지 약 10이고, 바람직하게 1 내지 약 4이고, 더욱 바람직하게 1 또는 2이고, 가장 바람직하게 1이다. 이러한 시약의 예는 N-석신이미딜-S-아세틸티오프로파이오네이트(SATP) 및 N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)이다.
상기 식에서,
k는 상기의 정의된 바와 같다.
이-작용성 시약의 제조는 당분야에 공지되어 있다. 2-(아세틸티오)-(에폭시)k-아세트산-NHS-에스터의 전구체가 독일 특허 제3924705호에 개시되어 있는 반면, 아세틸티오 화합물로의 유도체화 반응이 마치(March), J의 문헌 [Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376]에 개시되어 있다. SATA는 통상적으로 입수가능하다(미국 오레곤주 유진에 위치한 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes) 및 피어스, 록포드, II(Pierce, Rockford, II)로부터 입수가능함).
EPO 분자에 첨가된 티올기의 수는 반응 파라미터, 즉 단백질(EPO) 농도 및 단백질/이-작용성 시약 비율을 조정함으로써 선택할 수 있다. 바람직하게, EPO는 EPO 분자당 1 내지 5 티올기(더욱 바람직하게 EPO 분자당 1.5 내지 3 티올기임)를 공유결합함으로써 활성화된다. 범위는 EPO 단백질 개체군에 대한 티올기의 통계적인 분포를 의미한다.
반응은, 예를 들어 pH 6.5 내지 8.0인 수성 완충 용액, 예를 들어 pH 7.3인 10mM 포타슘 포스페이트, 50mM NaCl에서 수행된다. 이-작용성 시약을 DMSO에 첨가할 수 있다. 반응이 완성된 후, 바람직하게 30분 후, 반응을 라이신을 첨가하여 중지시킨다. 과량의 이-작용성 시약을 당분야에 공지된 방법, 예를 들어 투석 또는 컬럼 여과에 의해 분리시킬 수 있다. EPO에 첨가된 티올기의 평균 수를, 예를 들어 그라세티(Grasetti) D. R. 및 머레이(Murray) J. F.에 의해 문헌 [J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967)]에 개시된 광도 방법(photometric method)에 의해 결정할 수 있다.
상기 반응에 이어 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG) 유도체의 공유결합이 일어난다. 적절한 PEG 유도체는 약 20 내지 40kDa(더욱 바람직하게 약 24 내지 35kDa, 가장 바람직하게 약 30kDa)의 분자량을 가진 활성화된 PEG 분자이다.
활성화된 PEG 유도체는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 PEG-바이닐설폰에 대한 모르퓨르고(Morpurgo), M 등의 문헌 [J. Bioconj. Chem. (1996) 7, page 363 ff]에 개시되어 있다. 직쇄 및 분지쇄 PEG 종이 화학식 1의 화합물의 제조에 적합하다. 반응성 PEG 시약의 예는 아이오도-아세틸-메톡시-PEG 및 메톡시-PEG-바이닐설폰이다:
이러한 아이오도-활성화된 물질의 용도는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 헤르만슨(Hermanson) G. T.의 문헌 [Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148]에 개시되어 있다.
가장 바람직하게, PEG 종은 메톡시-PEG-말레이미드(MW 30000; 쉬어워터 폴리머(Shearwater Polymers, Inc.)사) 같은 (저급 알콕시-PEG-말레이미드)를 사용하여 말레이미드에 의해 활성화된다. 저급 알콕시-PEG-말레이미드의 구조는
이고,
바람직하게
이다(상기 식에서, R 및 m은 상기에 정의한 바와 같다).
수성 완충 용액(예를 들어 10mM 포타슘 포스페이트, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 6.2)에서 동일 반응계에서 티올 보호기의 분할 후에 저급 알콕시-PEG-말레이미드와 결합 반응이 일어난다. 보호기의 분할은 예를 들어 25℃, pH 6.2에서 약 90분 동안 DMSO 중의 하이드록시아민과 수행될 수 있다. PEG 변형을 위해 활성화 EPO/저급 알콕시-PEG-말레아미드의 몰 비율은 약 1:3 내지 1:6이어야 하고, 바람직하게 1:4이어야 한다. 반응은 시스테인의 첨가 및 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는 N-메틸말레이미드 또는 다른 적절한 화합물과 남은 티올(-SH)기의 반응에 의해 정지될 수 있다. N-메틸말레이미드 같은 보호기 또는 다른 적절한 보호기와 임의의 남은 활성 티올기의 반응 때문에, 본 발명의 컨쥬게이트에서 EPO 당단백질은 이러한 보호기를 함유할수 있다. 일반적으로 본원에서 개시한 절차는 PEG-말레이미드에 접합되지 않은 당단백질상에 활성화된 티올기의 수에 따라, 상이한 수의 보호기에 의해 보호된 티올의 다양한 숫자를 갖는 분자의 혼합물이 생성될 것이다.
페길화된 단백질 상에 남은 티올기를 차단하는데 사용시, N-메틸말레이미드가 공유결합의 동일한 유형을 형성하는 반면에, 다이설파이드 화합물은 분자내 설파이드/다이설파이드 교환 반응에서 차단 시약의 다이설파이드 가교된 결합을 야기할 것이다. 차단 반응의 유형에 대한 바람직한 차단 시약은 산화된 글루타티온(GSSG), 시스테인 및 시스타민이다. 시스테인과는 추가적인 순 전하(net charge)가 페길화된 단백질로 도입되지 않는 반면에, 차단 시약 GSSG 또는 시스타민의 사용은 추가적인 음전하 또는 양전하를 야기한다.
모노-, 다이- 및 트라이-페길화된 EPO 종의 분리를 포함하는 화학식 III의 화합물의 추가적인 정제는 당분야에 공지된 방법(예를 들어, 컬럼 크로마토그래피)으로 수행될 수 있다.
페길화된 에리스로포이에틴 유도체는 바람직하게 90% 이상의 모노-PEG 컨쥬게이트를 함유한다. 일반적으로 에리스로포이에틴 당단백질의 모노-PEG 컨쥬게이트는 다이-PEG 컨쥬게이트보다 높은 활성을 갖는 경향이 있기 때문에 바람직하다. 모노-PEG 컨쥬게이트의 백분율 뿐만 아니라 모노- 및 다이-PEG 종의 비율은 용리 피크 주변에서 보다 넓은 단편을 모아 모노-PEG의 백분율을 감소시키거나, 보다 좁은 단편을 모아 조성물 내에 모노-PEG의 백분율을 증가시키도록 조절될 수 있다. 약 90% 모노-PEG 컨쥬게이트가 양호한 균형의 수율 및 활성을 갖는다. 때때로 예를 들어, 컨쥬게이트의 92% 이상 또는 96% 이상이 모노-PEG 종(n=1)인 조성물이 바람직하다. 본 발명의 실시양태에서 n이 1인 컨쥬게이트의 백분율은 90 내지 96%이다.
페길화된 에리스로포이에틴을 포함하는 약학 조성물은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 국제 특허 공보 제01/87329호에 개시되어 있다. 조성물은 상기에 정의된 바와 같이 ㎖당 에리스로포이에틴 단백질 10 내지 10000㎍을 함유할 수 있다. 바람직하게, 조성물은 ㎖당 10 내지 10000㎍, 예를 들어 10, 50, 100, 400, 800 또는 2500㎍를 포함한다. 추가적으로, 조성물은 ㎖당 10 내지 10000㎍의 에리스로포이에틴 단백질, 10 내지 200mmol/ℓ 설페이트, 10 내지 50mmol/ℓ 포스페이트, pH 6.0 내지 6.5를 포함한다. 이 조성물은 또한 20mM 메타이오닌, 1 내지 5%의 폴리올(w/v), 0.1% 이하의 플루로닉 F68(w/v) 및 선택적으로 1mM 이하의 CaCl2를 포함할 수 있다. 이 조성물의 예는 ㎖당 10 내지 1000㎍의 에리스로포이에틴 단백질, 40mmol/ℓ 설페이트, 10mmol/ℓ 포스페이트, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메타이오닌, 0.01% 플루로닉 F68(w/v), pH 6.2를 포함한다. 다르게는, 조성물은 ㎖당 10 내지 10000㎍ 에리스로포이에틴 단백질, 10 내지 100mmol/ℓ NaCl, 10 내지 50mmol/ℓ 포스페이트, pH 6.0 내지 7.0 및 선택적으로 1 내지 5%(w/v) 폴리올을 포함할 수 있다. 추가적으로, 본 조성물은 20mM 이하의 메타이오닌, 0.1% 이하의 플루로닉 F68(w/v) 및 선택적으로 7.5umol/ℓ CaCl2를 포함할 수 있다. 구체적으로, 이 조성물은 ㎖당 10 내지 10000㎍ 에리스로포이에틴 단백질, 100mmol/ℓ NaCl, 10mM 메타이오닌, 0.01% 플루로닉 F68(w/v), 및 10mmol/ℓ 포스페이트, pH 7.0을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 ㎖당 10 내지 10000㎍ 에리스로포이에틴 단백질, 10 내지 50 mmol/ℓ 아르기닌, pH 6 내지 pH 6.5, 10 내지 100 mmol/ℓ 황산 나트륨을 포함하는 상기 조성물에 관한 것이다. 추가적으로, 이 조성물은 20mM 이하의 메타이오닌, 0.1% 이하의 플루로닉 F68(w/v), 선택적으로 1mmol/ℓ CaCl2 및 선택적으로 1 내지 5%(w/v)의 폴리올을 포함할 수 있다. 구체적으로, 이 조성물은 ㎖당 10 내지 10000㎍ 에리스로포이에틴 단백질, 40mmol/ℓ 아르기닌, pH 6.2, 30mmol/ℓ 황산 나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메타이오닌, 0.01% 플루로닉 F68(w/v) 및 선택적으로 1mmol/ℓ CaCl2일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 10 내지 10000㎍/㎖, 바람직하게 25 내지 2500㎍/㎖ 에리스로포이에틴, 및
a) 10mM 소듐/포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, pH 7.0 또는
b) 10mM 소듐 포스페이트, 120mM 황산 나트륨, pH 6.2 또는
c) 10mM 소듐 포스페이트, 40mM 황산 나트륨, 3% 만니톨(w/v), pH 6.2 또는
d) 10mM 소듐 포스페이트, 40mM 황산 나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메타이오닌, 0.01% 플루로닉 F68(w/v), pH 6.2 또는
e) 40mM 아르기닌, 30mM 황산 나트륨, 3% 만니톨(w/v), pH 6.2 또는
f) 40mM 아르기닌, 30mM 황산 나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메타이오닌, 0.01% 플루로닉 F68(w/v), pH 6.2를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
가장 바람직한 실시양태에서, 조성물은 50, 100, 400, 800, 또는 2500㎍/㎖의 양으로 에리스로포이에틴 단백질을 포함한다. 가장 바람직한 조성물은 10mM 소듐 포스페이트, 40mM 소듐 설페이트, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메타이오닌, 0.01% 플루로닉 F68(w/v), pH 6.2이거나 40mM 아르기닌, 30mM 황산 나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메타이오닌, 0.01% 플루로닉 F68(w/v), pH 6.2를 포함한다. 이러한 조성물의 추가적인 사항은 국제 공개 공보 제01/87329호에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 에리스로포이에틴 단백질을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 심장 질환에서 철분 분포 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 에리스로포이에틴 단백질을 유효량으로 함유하는 것을 특징으로 하는 심장 질환에서 철분 분포의 장애를 치료하는 약제에 관한 것이다. 심장 질환의 예는 예를 들어 관상 동맥 심장 질환, 동맥 경화증, 관상 동맥 경화증, 급성 관상 동맥 증후군, 심부전, 울혈성 심부전 및/또는 심장 기능 부전이다. 상기 언급한 방법 및 약제와 관련하여, 심장 기능 부전은 심장 질환의 바람직한 형태이다. 상기에 개시된 바와 같은 바람직한 방법 및 약제는 에리스로포이에틴 단백질이 상기에 정의된 바와 같은 방법 및 약제이다.
심장 질환에서 철분 분포의 장애를 치료하는데 있어서, EPO는 예를 들어 일주일에 두 번씩 150U/몸무게(kg)의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자 개개인의 필요에 따라 변화될 수 있고, 또한 예를 들어 100 내지 200U/kg의 범위일 수 있다. 사용된 EPO 유도체의 반감기에 따라, 투여량은 예를 들어 일주일당 1 내지 3회 사이에서 투여될 수 있다. 환자 개개인의 필요에 따라, 의사는 또한 상이한 투여량을 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 EPO 또는 EPO 컨쥬게이트의 구체적인 활성은 당분야에서 공지된 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 정제된 EPO 단백질의 생물학적 활성으로 주사에 의해 EPO 단백질이 투여된 인간 환자에게서 주사되지 않은 환자 또는 대조군 환자에 비해 망상 적혈구 및 적혈구의 생성이 증가된 골수 세포를 생성케 한다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 EPO 단백질, 또는 그의 단편의 생물학적 활성은 애너블(Annable) 등의 문헌 [Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47:99-112] 및 문헌 [Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)]에 따른 방법에 의해 실험될 수 있다. EPO 단백질의 활성을 측정하기 위한 또 다른 생물학적 분석인, 정상 적혈구 용혈 쥐 분석(normocythaemic mouse assay)은 당분야에 개시되어 있다(예를 들어, 문헌 [Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)] 및 Ph. Eur. BRP의 에리스로포이에틴에 대한 전공 논문).
본 발명은 본원에 개시된 발명을 예시하되, 제한하지 않는 하기의 실시예에 따라 더욱 잘 이해될 것이다.
심장 질환을 가진 중년의 남성을 심장 카테터 삽입술 후에 하기의 파라미터의 측정에 의해 철분 분포의 장애를 검사하였다: CRP(C 반응성 단백질), 페리틴 및 가용성 트랜스페린 수용체(2001년 7월 29일 내지 8월 2일에 미국 일리노이주 시카고에서 개최된 AACC/CSCC의 애뉴얼 미팅에서 P. 레만(Lehmann), M. 폴크만(Volkmann), J. 로츠(Lots), A. 발다우프(Baldauf), R. 뢰디거(Roeddiger)에 의해 발표된 포스터에 개시됨). 결과는 철분 분포의 장애를 나타낸다. 환자를 최대 12주 동안 일주일에 두 번씩 150U/kg 레코르몬(Recormon, 등록상표, 통상적으로 입수가능함)을 피하투여하여 치료하였다. 그 후, 상기에 개시된 바와 같은 파라미터의 측정은 철분 결핍 질환의 개선을 보여준다.
<110> GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: F.Hoffmann-La Roche AG (B) STREET: 124 Grenzacherstrasse (C) CITY: Basle (E) COUNTRY: Switzerland (F) POSTAL CODE (ZIP): CH-4070 (G) TELEPHONE: (61) 688 11 11 (H) TELEFAX: (61) 688 13 95 (I) TELEX: 962 292 hlr ch (ii) TITLE OF INVENTION: Novel use of Erythropoietin in heart diseases (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: WORD (D) SOFTWARE: PatentIn Release 2.0 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims (16)

  1. 심장 실환에서 철분 분포 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 에리스로포이에틴 단백질의 용도.
  2. 제 1 항에 있어서,
    심장 질환이 심장 기능 부전인 용도.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 인간 에리스로포이에틴인 용도.
  4. 제 3 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 에포에틴 α 또는 에포에틴 β인 용도.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 내인성 유전자 활성화에 의해 발현되는 용도.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 용도.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 1 내지 6개의 글라이코실화 자리의 첨가에 의해 변형되는 인간 에리스로포이에틴의 서열을 갖는 용도.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 다르베포에틴 α인 용도.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 에리스로포이에틴 단백질이 페길화되는 용도.
  10. 제 9 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 컨쥬게이트이고, 상기 컨쥬게이트는 하나 이상의 자유 아미노기를 가지며, 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키는 생체 내 생물학적 활성을 갖고, 1 내지 6개의 글라이코실화 자리의 첨가 또는 하나 이상의 글라이코실화 자리의 재배열에 의해 변형되는 인간 에리스로포이에틴의 서열을 갖는 인간 에리스로포이에틴 및 그의 아날로그로 구성된 군으로부터 선택되는 에리스로포이에틴 단백질을 포함하고; 상기 에리스로포이에틴은 구조식 CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR의 n개의 폴리(에틸렌 글라이콜)기에 공유결합되는데, 각각의 폴리(에틸렌 글라이콜) 중의 -CO기는 상기 아미노기 중 하나와 아마이드 결합을 형성하며; 여기에서 R은 저급 알킬이고; x는 2 또는 3이고; m은 약 450 내지 약 900이고, n은 1 내지 3이고; 및 n 및 m은 에리스로포이에틴 단백질의 분자량을 뺀 컨쥬게이트의 분자량이 약 20kDa 내지 100kDa이 되도록 선택되는 용도.
  11. 제 10 항에 있어서,
    x가 2이고, m이 650 내지 750이고, n이 1이고, R이 메틸인 용도.
  12. 제 9 항에 있어서,
    에리스로포이에틴 단백질이 컨쥬게이트이고, 상기 컨쥬게이트는 하나 이상의 자유 아미노기를 가지며, 골수 세포가 망상 적혈구 및 적혈구의 생성을 증가시키는 생체 내의 생물학적 활성을 갖고, 1 내지 6개의 글라이코실화 자리의 첨가에 의해 변형된 인간 에리스로포이에틴 단백질의 일차 구조를 갖는 인간 에리스로포이에틴 단백질 및 그의 아날로그로 구성된 군으로부터 선택되는 에리스로포이에틴 단백질을 포함하고; 상기 에리스로포이에틴 단백질은 1 내지 3개의 저급 알콕시 폴리(에틸렌 글라이콜)기에 공유결합되고, 각각의 폴리(에틸렌 글라이콜)기는 화학식 -C(O)-X-S-Y-의 결합자를 통해 에리스로포이에틴 단백질과 공유결합으로 연결되는데, 결합자의 C(O)는 상기 아미노기 중의 하나와 아마이드 결합을 형성하며; X는 -(CH2)k- 또는 -CH2(O-CH2-CH2)k-이고, k는 1 내지 10이고, Y는
    이고; 각각의 폴리(에틸렌 글라이콜) 잔기의 평균 분자량은 약 20kDa 내지 약 40kDa이고, 컨쥬게이트의 분자량은 약 51kDa 내지 약 175kDa인 용도.
  13. 제 12 항에 있어서,
    하기 화학식의 에리스로포이에틴 컨쥬게이트를 갖는 용도:
    상기 식에서,
    n은 1 내지 3인 정수이고; m은 450 내지 900인 정수이고; R은 저급 알킬이고; X는 -(CH2)k- 또는 -CH2(O-CH2-CH2)k-이고, k는 1 내지 10이고, P는 X와 아마이드 결합을 형성하는 n개의 아미노기를 갖지 않는 에리스로포이에틴 단백질의 잔기이다.
  14. 유효량의 에리스로포이에틴 단백질을 투여하는 것을 포함하는 심장 질환에서 철분 분포 장애를 치료하기 위한 방법.
  15. 유효량의 에리스로포이에틴 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 심장 질환에서 철분 분포 장애를 치료하기 위한 약제.
  16. 본원에서 상기에 정의된 발명.
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