BRPI0316438B1 - uso de eritropoietina em doenças cardíacas - Google Patents
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Abstract
"uso de eritropoietina em doenças cardíacas". a presente invenção refere-se ao uso de eritropoietina para o tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE ERI-TROPOIETINA EM DOENÇAS CARDÍACAS". A presente invenção refere-se a um novo uso de eritropoietina, especíalmente ao tratamento de distúrbios da distribuição de ferro em doenças cardíacas. Várias doenças são conhecidas, nas quais o metabolismo de ferro não é normal. Em uma anemia, sangue o bastante não pode ser formado devido a uma carência global de ferro no sangue. Uma outra condição metabólica relacionada ao ferro é hemocromatose, na qual a concentração global de ferro no sangue é maior do que o normal, o que leva a várias condições tais como, por exemplo, a destruição de órgãos.
Distúrbios de distribuição de ferro diferem da anemia e hemocromatose acima descritas devido ao fato de a concentração global de ferro no sangue ser normal. Por um fado, o ferro é acumulado em vários órgãos e pode levar a danos e mesmo destruição desses órgãos. Por outro lado, o uso do ferro, o qual está presente em quantidades normais na formação de sangue, é prejudicada, levando a efeitos secundários os quais são comparáveis àqueles relatados na anemia.
Até agora, não se sabe se pacientes que sofrem de doenças cardíacas têm uma alta probabilidade de serem afetados por distúrbios de distribuição de ferro. Distúrbios de distribuição de ferro podem ser diagnosticados através de vários parâmetros, os quais são comumente usados nos diagnósticos de estados de ferro. Baseado em medições do receptor de ferri-tina e transferrina solúvel, é possível avaliar se a concentração global de ferro no paciente que está sofrendo de doenças cardíacas está normal. Se este for o caso, então, uma concentração diminuída da Hemoglobina em reticulócitos é um indicador de distúrbios de distribuição de ferro. Outro indicador é uma concentração elevada contínua/prolongada de proteína C-reativa (CRP) em pacientes que sofrem de doenças cardíacas e exibindo uma concentração global de ferro normal. Um método para diagnosticar os distúrbios de distribuição de ferro foi descrito por P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, cartaz apresentado no AACC/CSCC, An- nual Meeting, 29 de Julho - 2 de Agosto de 2001, Chicago, Illinois.
Até o momento, nenhum tratamento foi ainda sugerido para pacientes com doenças cardíacas que sofrem de distúrbios na distribuição de ferro. O problema que fundamenta a presente invenção é, portanto, proporcionar um tratamento para distúrbios de distribuição de ferro nas doenças cardíacas de forma a minimizar ou suprimir as desvantagens mencionadas acima. Surpreendentemente, descobriu-se que a eritropoietina tem um efeito benéfico sobre distúrbios de distribuição de ferro nas doenças cardíacas. O problema é, portanto, resolvido, de acordo com a presente invenção, através de fornecimento de eritropoietina para o uso no tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas. A menos que de outro modo indicado, as seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e escopo dos vários termos usados para descrevera invenção aqui. O termo "alquila-inferior", conforme usado aqui, significa um grupo alquila linear ou ramificado tendo de um a seis átomos de carbono. E-xemplos de grupos alquila-inferior incluem metila, etila e isopropila, de preferência metila. O termo "alcóxi inferior", conforme usado aqui, significa um grupo R'-0-, em que R' é uma alquila-inferior, conforme descrito acima. O termo "distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas" se refere a um distúrbio de distribuição de ferro o qual ocorre em pacientes que sofrem de doenças cardíacas. O distúrbio de distribuição de ferro pode, por exemplo, ser caracterizado conforme descrito acima. Particularmente, um distúrbio de distribuição de ferro é caracterizado através dos seguintes parâmetros: a concentração do receptor de transferrina solúvel [mg/L] dividida por log (concentração de ferrítina [pg/L]) é menor do que 3,5 e, simultaneamente, a concentração de proteína C-reativa está acima de 5 mg/L. O termo "eritropoietina" ou "proteína eritropoietina" se refere a uma proteína com a atividade biológica in vivo que faz com que célula da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células sanguíneas vermelhas e selecionada do grupo consistindo em eritropoietina humana e análogos, os quais são definidos abaixo. O termo "eritropoietina peguilada (Peg-EPO ou PEG-EPO)" se refere a uma proteína de eritropoietina a qual é covalentemente ligada a um a três derivados de polietileno, conforme descrito abaixo.
Descrição dos Desenhos: Figura 1: Estrutura primária da EPO humana (165 aminoácidos) (SEQ ID NO:1).
Figura 2: Estrutura primária da EPO humano (166 aminoácidos) (SEQ ID NO:2).
Em maiores detalhes, a presente invenção se refere ao uso de eritropoietina na fabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas. Exemplos de doenças cardíacas são, por exemplo, doenças cardíacas coronarianas, aterosclero-ses, ateroscleroses coronariana, síndrome coronariana aguda, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva e/ou insuficiência cardíaca. Em uma concretização preferida, a invenção se refere ao uso conforme definido acima, em que a doença cardíaca é insuficiência cardíaca. A presente invenção é especialmente usada para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo eritropoietina como ingrediente farma-ceuticamente ativo. O termo "eritropoietina" ou "proteína de eritropoietina" ou ΈΡΟ" é conforme segue: particularmente, os termos se referem a uma gli-coproteína, por exemplo, uma eritropoietina humana, por exemplo, tendo uma sequência de aminoácido apresentada em (SEQ ID NO: 1) ou (SEQ ID NO: 2) ou uma sequência de aminoácido substancialmente homóloga às mesmas, cujas propriedades biológicas se referem à estimulação de produção de células sangüíneas vermelhas e a estimulação da divisão e diferenciação de progenitores eritróides envolvidos na medula óssea. Conforme usado aqui, esses termos incluem tais proteínas modificadas delíberadamente, como, por exemplo, através de mutagênese sííio-dirigida ou acidentalmente através de mutações. Esses termos também incluem análogos tendo de 1 a 6 sítios adicionais de glicosilação, análogos tendo pelo menos um aminoáci- do adicional na extremidade carbóxi terminal da gíicoproteína, em que o a-minoácido adicional inclui pelo menos um sítio de glicosilação e análogos tendo uma sequência de aminoácido a qual inclui uma reestruturação de pelo menos um sítio de glicosilação. Esses termos incluem eritropoietina humana produzida natural e recombinantemente. Em uma concretização preferida da presente invenção, a proteína de eritropoietina é uma eritropoietina humana.
Conforme apresentado em detalhes abaixo, a preparação e purificação de EPO são bem conhecidas na técnica. Por eritropoietina entenda-se a proteína natural ou recombinante, de preferência humana, por exemplo, alfa epoetina ou beta epoetina, conforme obtido de qualquer fonte convencional, tais como tecidos, síntese de proteína, cultura de célula com células naturais ou recombinantes. Qualquer proteína tendo a atividade de eritropoietina, tais como muteínas ou proteínas de outro modo modificadas, está a-brangida. Em uma concretização preferida da presente invenção, a proteína de eritropoietina é alfa epoetina ou beta epoetina. EPO recombinante pode ser preparada via expressão em linhagens de células CHO-, BHK- ou HeLa, através de tecnologia de DNA recombinante ou através de ativação do gene endógeno. A expressão de proteínas, incluindo, através de ativação do gene endógeno, é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5.733.761,5.641.670 e 5.733.746 e publicações de patente internacional Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 e WO 91/09955, os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência. O uso, conforme descrito acima, em que a proteína de eritropoietina é expressa através de ativação do gene endógeno, é preferido. As espécies preferidas de EPO para a preparação de produtos de gíicoproteína eritropoietina são espécies de EPO humanas. Mais preferivelmente, a espécie de EPO é a EPO humana tendo a seqüên-cia de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:1 ou SEQID NO:2, mais preferivelmente, a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:1. Uma concretização preferida da presente invenção, portanto, se refere ao uso conforme descrito acima, em que a proteína de eritropoietina tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2.
Ainda, a eritropoietina pode ser um análogo de glicoproteína tendo de 1 a 6 sítios adicionais de glicosilagão. Portanto, a presente invenção também se refere ao uso conforme descrito acima, em que a proteína de eritropoietina tem a sequência da eritropoietina humana modificada através da adição de 1 a 6 sítios de glicosilação. Glicosilação de uma proteína, com um ou mais grupos oligossacarídeos, ocorre em locais específicos ao longo da cadeia principal do polipeptídeo e afeta grandemente as propriedades físicas da proteína, tais como estabilidade da proteína, secreção, localização subcelular e atividade biológica. A glicosilação é, usualmente, de dois tipos. Oligossacarídeos O-ligados são presos a resíduos de serina ou treonina e oligossacarídeos N-ligados são presos a resíduos de asparagina. Um tipo de oligossacarídeo encontrado em oligossacarídeos N-ligados e O-ligados é ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), o qual é uma família de aminoacú-cares contendo 9 ou mais átomos de carbono. O ácido siálico é, usualmente, o resíduo terminal em oligossacarídeos N-ligados e O-ligados e, devido ao fato de ele trazer uma carga negativa, confere propriedades ácidas à glicoproteína. A eritropoietina humana, tendo 165 aminoácidos, contém três cadeias de oligossacarídeos N-ligados e uma O-ligados, as quais compreendem cerca de 40% do peso molecular total da glicoproteína. Glicosilação N-ligada ocorre em resíduos de asparagina localizados nas posições 24, 38 e 83 e glicosilação O-ligada ocorre em um resíduo de serina localizado na posição 126. As cadeias de oligossacarídeos são modificadas com resíduos de ácido siálico terminais. Remoção enzimática de todos os resíduos de ácido siálico da eritropoietina glicosilada resulta em perda da atividade in vivo mas não da atividade in vitro, em virtude do fato de a sialilação de eritropoietina impedir sua ligação e subsequente eliminação, através da proteína de ligação hepática. O termo "eritropoietina" inclui análogos de eritropoietina humana com uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos da eritropoietina humana as quais resultam em um aumento no número de sítios para fixação de ácido siálico. Esses análogos de glicoproteína podem ser gerados atra- vés de mutagênese sítio-dirigida tendo adições, deleções ou substituições de resíduos de aminoácido que aumentam ou alteram sítios que estão disponíveis para glicosiiação. Análogos de glicoproteína tendo níveis de ácido siáiico maiores do que aqueles encontrados na eritropoietina humana são gerados através de adição de sítios de glicosiiação os quais não perturbam a conformação secundária ou terciária requerida para atividade biológica. As glicoproteínas da presente invenção também incluem análogos tendo níveis aumentados de fixação de carboidrato em um sítio glicosiiação o que envolve, usualmente, a substituição de um ou mais aminoácidos em proximidade íntima a um sítio N-ligado ou O-ligado. As glicoproteínas da presente invenção também incluem análogos tendo um ou mais aminoácidos se estendendo da extremidade carbóxi terminal da eritropoietina e proporcionando pelo menos um sítio adicional de carboidrato. As proteínas de eritropoietina da presente composição também incluem análogos tendo uma sequência de aminoácido a qual inclui uma reestruturação de pelo menos um sítio para glicosiiação. Tal reestruturação do sítio de glicosiiação envolve a deleção de um ou mais sítios de glicosiiação na eritropoietina humana e a adição de um ou mais sítios de glicosiiação que não ocorrem naturalmente. O aumento do número de cadeias de carboidrato na eritropoietina e, portanto, do número de ácidos siálicos por molécula de eritropoietina, pode conferir propriedades vantajosas, tais como solubilidade aumentada, resistência maior à proteóli-se, imunogenicidade reduzida, meia-vida aumentada no soro e atividade biológica aumentada. Análogos de eritropoietina com sítios adicionais de glico-silação são descritos em maiores detalhes no Pedido de Patente Européia 640 619, para Elliot, publicado em 1 de Março de 1995.
Em uma concretização preferida, a composição farmacêutica da presente invenção compreende proteínas de eritropoietina com uma sequência de aminoácido a qual inclui pelo menos um sítio adicional para gli-cosilação tais como, mas não limitado, a eritropoietinas compreendendo a seqüência da eritropoietina humana modificada através de uma modificação selecionada do seguinte: Asn30Thr32;
Asns1Thr53, Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser^Asn^Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn8eThr90;
Asn89lle90Thr91;
Ser87Asn89lle90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; e Pro124Thr125. A notação usada aqui para modificação de sequência de amino-ácido significa que a(s) posição(ões) da proteína não modificada correspondente (por exemplo, hEPO de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2) indicada(s) através do(s) número(s) superescrito(s) é(são) alterada(s) para o(s) aminoá-cido(s) que precede(m) ímediatamente o(s) respectivo(s) número(s) super-escritos. A proteína de erítropoietina pode também ser um análogo tendo pelo menos um aminoácido adicional na extremidade carbóxí terminal da glicoproteína, em que o aminoácido adicional inclui pelo menos um sítio de glicosilação. O aminoácido adicional pode compreender um fragmento de peptídeo derivado da extremidade carbóxi terminal da gonadotropina coriô-nica humana. De preferência, a glicoproteína é um análogo selecionado do grupo consistindo em (a) erítropoietina humana tendo a sequência de aminoácido Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gin, se estendendo a partir do carbóxi término; (b) o análogo em (a) ainda compreendendo Ser87 Asn88 T-hr90 EPO; e (c) o análogo em (a) ainda compreendendo Asn30 Thr32 Vai87 Asn88 Thr90 EPO. A proteína de erítropoietina pode também ser um análogo tendo uma seqüência de aminoácido a qual inclui uma reestruturação de pelo menos um sítio para glicosilação. A reestruturação pode compreender uma de-leção de quaisquer sítios do carboidrato N-ligado na erítropoietina humana e a adição de um carboidrato N-ligado à posição 88 da seqüência de aminoá-cidos da erítropoietina humana. De preferência, a glicoproteína é um análogo selecionado do grupo consistindo em Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; e Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO. Um outro análogo é alfa darbepoetina. Uma proteína de erítropoietina preferida no uso descrito antes é alfa darbepoietina.
Mais particularmente, a proteína de erítropoietina da presente composição farmacêutica, conforme descrito acima, pode também incluir derivados peguilados da mesma. Derivados peguilados de erítropoietina e sua preparação são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, no WO 01/02017, EP-A-1064951, EP-A-539.167, EP-A-605.963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, Patente US No. 5.56, EP-A-584.876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, Patente US Nos. 5.359.030 e 5.681.811, Patente US No. 4.179.337, Patente Japonesa, WO 98/32466, Patente US No. 5.324.650. De preferência, no uso descrito acima, a proteína de erítropoietina é peguilada. Uma concretização preferida de espécies de erítropoietina peguilada se refere aos derivados conforme descrito abaixo.
Conseqüentemente, a presente invenção também se refere ao uso, conforme descrito acima, em que a proteína de erítropoietina é um conjugado, o referido conjugado compreendendo uma proteína de erítropoietina conforme descrito acima tendo pelo menos um grupo amino livre e tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células sangüíneas vermelhas e selecionada do grupo consistindo em erítropoietina humana e análogos da mes- ma os quais têm a seqüência da eritropoietina humana modificada através de adição de 1 a 6 sítios de gücosilação ou uma reestruturação de pelo menos um sítio de gücosilação; a referida eritropoietina sendo covalentemente ligada a n grupos poli(etilenogiicol) da fórmula -CO-(CH2)r(OCH2CH2)m-OR, com a -CO (isto é, carbonila) de cada grupo poli(etilenoglicol) formando uma ligação de amida com um dos referidos grupos amino; em que R é alquila-inferior; x é 2 ou 3; m é de cerca de 450 a cerca de 900; n é de 1 a 3; e n e m são escolhidos de modo que o peso molecular do conjugado menos a proteína de eritropoietina é de 20 quilodaltons a 100 quilodaltons. A presente invenção ainda proporciona composições farmacêuticas contendo os conjugados descritos aqui, nas quais o percentual de conjugados no qual n é 1, é pelo menos noventa por cento, de preferência pelo menos noventa e dois por cento, mais preferivelmente noventa e seis por cento de todos conjugados da composição.
Mais especificamente, os conjugados acima podem ser representados através da fórmula (I): P-ÍNHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) em que P é o resíduo de uma proteína eritropoietina conforme descrito aqui, (isto é, sem o grupo amino ou grupos amino os quais formam uma ligação de amida com a carbonila mostrada na Fórmula I), tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células sanguíneas vermelhas; e em que R é alquila-inferior; x é 2 ou 3; m é de cerca de 450 a cerca de 900; n é de 1 a 3; e n e m são escolhidos de modo que o peso molecular do conjugado menos a gli-coproteína eritropoietina é de 20 quilodaltons a 100 quilodaltons. De acordo com essa invenção, R é qualquer alquila-inferior. Conjugados nos quais R é metila são preferidos, O símbolo ”m" representa o número de resíduos de oxido de eti-leno (OCH2CH2) no grupo poli(óxido de etileno). Uma única subunidade de PEG (polietileno glicol) de óxido de etileno tem um peso molecular de cerca de 44 daltons. Assim, 0 peso molecular do conjugado (excluindo 0 peso molecular do EPO) depende do número "m". Nos conjugados da presente in- venção, "m" é de cerca de 450 a cerca de 900 (correspondendo a um peso molecular de cerca de 20 kDa a cerca de 40 kDa), de preferência de cerca de 650 a cerca de 750 (correspondendo a um peso molecular de cerca de 30 kDa). O número m é selecionado de modo que o conjugado resultante da presente invenção tenha uma atividade fisiológica comparável à EPO não modificada, atividade a qual pode representar a mesma, mais do que ou uma fração da atividade correspondente da EPO não modificada. Um peso molecular de "cerca de" um determinado número significa que ele está dentro de uma faixa razoável desse número, conforme determinado através de técnicas analíticas convencionais. O número "m" é selecionado de modo que o peso molecular de cada grupo poli(etileno glicol) covalentemente ligado à glicoproteína eritropoietina é de cerca de 20 kDa a cerca de 40 kDa e é, de preferência, de cerca de 30 kDa.
Nos conjugados da presente invenção, o número "n" é o número de grupos poli(etileno glicol) covalentemente ligados a grupos amino livre (incluindo grupos ε-amino de um aminoácido lisina e/ou o grupo amino ami-no-terminal) de uma proteína de eritropoietina via ligação(ões) de amida. Um conjugado da presente invenção pode ter um, dois ou três grupos PEG por molécula de EPO. "n" é um número inteiro oscilando de 1 a 3, de preferência "n" é 1 ou 2 e mais preferivelmente ”n" é 1. Um conjugado preferido dos conjugados descritos acima compreende compostos em que x é 2, m é 650 a 750, n é 1 e R é metila. O composto da fórmula (I) pode ser preparado a partir do material polimérico conhecido: (II) em que R e m são conforme descritos acima, através de condensação do composto da Fórmula II com a glicoproteína eritropoietina. Compostos da fórmula (II) na qual x é 3 são alfa-alcóxi inferior, succinimidil ésteres de ácido butírico de poli(etileno glicol) (alcóxi inferior-PEG-SBA). Compostos da fór- mula (II) na qual x é 2 são alfa-alcóxi inferior, succinimidil ésteres de ácido propiônico de poíi(etíleno glicol) (alcóxi inferior-PEG-SPA). Qualquer método convencional de reação de um és ter ativado com uma amina para formar uma amida pode ser utilizado. Na reação descrita acima, o succinimidil éster exemplificado é um grupo de saída que causa a formação da amida. O uso de succinimidil ésteres, tais como os compostos da fórmula II, para produzir conjugados com proteínas é descrito na Patente Ü.S. No. 5.672.662, emitida em 30 de Setembro de 1997 (Harris e outros). EPO humana contém nove grupos amino livres, o grupo amino amino-terminal mais os grupos ε-amino de 8 resíduos de lisina. Quando o re-agente de peguiiação foi combinado com um composto SBA da Fórmula II, descobriu-se que em um de pH 7,5, uma proporção de proteínaPEG de 1:3 e uma temperatura de reação de 20-25 °C, uma mistura de mono-, di- e quantidades residuais das espécies tripeguiladas foram produzidas. Quando o rea-gente de peguiiação era um composto SPA da Fórmula II, em condições similares, exceto que a proporção de proteína:PEG era de 1:2, primariamente, a espécie monopeguilada é produzida. A EPO peguilada pode ser administrada como uma mistura ou como diferentes espécies peguiladas distintas separadas através de cromatografia por troca de cátions. Através de manipulação das condições de reação (por exemplo, proporção de reagentes, pH, temperatura, concentração de proteína, tempo de reação etc.), as quantidades relativas das diferentes espécies peguiladas podem ser variadas.
Uma outra concretização preferida da presente invenção se refere ao uso, conforme definido acima, em que a proteína de eritropoietina é um conjugado, o referido conjugado compreendendo uma proteína de eritropoíe-tina conforme definido acima tendo pelo menos um grupo amino livre e tendo a atividade biológica in vivo para fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células sanguíneas vermelhas e selecionada do grupo consistindo em proteína de eritropoietina humana e análogos da mesma os quais têm a estrutura primária da proteína de eritropoietina humana modificada através de adição de 1 a 6 sítios de glicosila-ção; a referida proteína de eritropoietina sendo covalentemente ligada a de um a três grupos alcóxi inferior de poli(etileno glicol), cada grupo poli(etileno giicol) sendo covaientemente ligado à proteína de eritropoietina via um ligan-te da fórmula -C(0)-X-S-Y- com o C(O) do figante, formando uma ligação de amida com um dos referidos grupos amino, X é-(CH2)k- ou -CH2(0-CH2-CH2)k-, k é de 1 a 10, Y é: o peso molecular médio de cada porção poli(eti!eno glicol) é de cerca de 20 quilodaltons a cerca de 40 quilodaltons e o peso molecular do conjugado é de cerca de 51 quilodaltons a cerca de 175 quilodaltons.
Essas espécies de eritropoietina podem também ser representadas através da fórmula (III): P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n (III) em que R pode ser qualquer alquila inferior. Uma alquila inferior preferida é metila. X pode ser -(CH2)k- ou -CH2(0-CH2-CH2)k-r em que k é de 1 a cerca de 10. De preferência, k é de 1 a cerca de 4, mais preferivelmente, k é 1 ou 2. Ainda mais preferivelmente, X é -(CH2).
Na Fórmula 1, Y é: de preferência: mais preferivelmente: Na fórmula (III), o número m é selecionado de modo que o conjugado resultante de fórmula (III) tenha uma atividade fisiológica comparável à EPO não modificada, atividade a qual pode representar a mesma que, mais do que ou uma fração da atividade correspondente da EPO não modificada. m representa o número de resíduos de óxido de etileno na unidade PEG. Uma única subunidade PEG de -(OCH2CH2)- tem um peso molecular de cerca de 44 daltons. Assim, o peso molecular do conjugado (excluindo o peso molecular da EPO) depende do número m. Um peso molecular de "cerca de" um determinado número significa que ele está dentro de uma faixa razoável desse número, conforme determinado através de técnicas analíticas convencionais, m é um número inteiro oscilando de cerca de 450 a cerca de 900 (correspondendo a um peso molecular de 20 a 40 kDa), de preferência m é de cerca de 550 a cerca de 800 (cerca de 24 a 35 kDa) e mais preferivelmente m é de cerca de 650 a cerca de 700 (cerca de 29 a cerca de 31 kDa).
Na fórmula (III), o número n é o número de grupos ε-amino de um aminoácido lisina em uma proteína de eritropoietina covalentemente ligado a uma unidade PEG via uma ligação de amida. Um conjugado da presente invenção pode ter uma, duas ou três unidades PEG por molécula de EPO. n é um número inteiro oscilando de 1 a 3, de preferência n é 1 ou 2 e mais preferivelmente n é 1.
Proteínas de eritropoietina preferidas da fórmula (II!) são repre- sentadas pelas fórmulas: Na concretização mais preferida da presente invenção, um conjugado de eritropoietina é representado através da fórmula: em que, na fórmula acima, n é um número inteiro de 1 a 3; m é um número inteiro de 450 a 900; R é alquila inferior; X é -(CH2)i<- ou -CH2(0-CH2-CH2)k-e P é o resíduo da proteína de eritropoietina sem o grupo ou grupos amino os quais formam uma ligação de amida com X.
Outros produtos de gücoproteína eritropoietina preferidos são representados pelas fórmulas: Produtos de glicoproteina eritropoietina mais preferidos são representados pela fórmula: Essas proteínas de eritropoietina podem ser preparadas através de: (a) reação covalente de um grupo ε-amíno de um aminoácido lisina de uma proteína de eritropoietina representada pela fórmula, P-[NH2]n> com um reagente bifuncional representado pela fórmula Z-CO-X-S-Q, a fim de formar um intermediário com uma ligação de amida representado pela fórmula: P-[NH-CO-X-S-Q]n em que P é uma proteína de eritropoietina menos o grupo amíno o qual forma uma ligação de amida; n é um número inteiro oscilando de 1 a 3; Z é um grupo reativo, por exemplo, um éster carboxílico-NHS; X é -(CH2)k- ou -CH2{0-CH2-CH2)k', em que k é de 1 a cerca de 10; e Q é um grupo de proteção, tal como alcanoíla, por exemplo, acetila. (b) reação covalente do intermediário com uma ligação de amida da etapa (a) com um derivado de polí(etileno glicol) ativado representado pela fórmula W-pChbCHalm-OR, a fim de formar um produto de glicoproteí-na eritropoietina representado pela fórmula: em que W é uma forma sulfidrila reativa de Y; m é um número inteiro oscilando de cerca de 450 a cerca de 900; R é alquila inferior; e Y é conforme definido acima.
Nessa concretização, o reagente bifuncional é, de preferência, N-succinimidil-S-acetiltiopropionato ou N-succinimidil-S-acetiltioacetato, Z é, de preferência, N-hidróxi-succinimida e o derivado de poli(etileno glicol) ativado W-[OCH2CH2]m-OR é, de preferência, selecionado do grupo consistindo em iodo-acetil-metóxi-PEG, metóxi-PEG-vinil-sulfona e metóxi-PEG-malei-mida.
Em maiores detalhes, as proteínas de eritropoietina da fórmula (III) podem ser preparadas através de ligação covalente de grupos tiol à EPO ("ativação") e acoplamento da EPO ativada resultante com um derivado de poli(etileno glicol) (PEG). A primeira etapa para a preparação de EPO peguilada de acordo com a presente invenção compreende ligação covalente de grupos tiol via grupos NH2- de EPO. Essa ativação de EPO é realizada com reagentes bifuncionais os quais trazem um grupo tiol protegido e um grupo reativo adicional, tais como éteres ativos (por exemplo, um succinimi-dil éster), anidridos, ésteres de ácidos sulfônicos, halogenídeos de ácidos carboxílicos e ácidos sulfônicos, respectivamente. O grupo tiol é protegido por grupos conhecidos na técnica, por exemplo, grupos acetila. Esses reagentes bifuncionais são capazes de reagir com os grupos ξ-amino de ami-noácidos lisina através de formação de uma ligação de amida. A primeira etapa da reação é apresentada abaixo: EPO, n e X são conforme definido acima e Z é um grupo reativo conhecido na técnica, por exemplo, um substituinte de N-hidróxi-succinimida (NHS) da fórmula: Em uma concretização preferida, a ativação dos grupos s-amino lisina é realizada através de reação com reagentes bifuncionais tendo uma porção succinimidila. Os reagentes bifuncionais podem trazes diferentes espécies espaçadoras, por exemplo, porções -(CH2)k- ou -CH2-(0-CH2-CH2-)k-, em que k é de 1 a cerca de 10, de preferência de 1 a cerca de 4 e mais preferivelmente 1 ou 2 e ainda mais preferivelmente 1. Exemplos desses rea-gentes são N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) e N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA): NHS-éster acetiltioalquil-carboxílico, tal como: NHS-éster de ácido 2-(acetiltio)-(etóxi)k-acético com k conforme definido acima. A preparo dos reagentes bifuncionais é conhecida na técnica. Precursores de NHS-ésteres de ácido 2-(acetiltio}-(etóxi)k-acético são descritos no DE-3924705, enquanto que a derivatização ao composto de acetiltio é descrita por March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-HilI, 1977, 375-376. SATA está comercialmente disponível (Molecular Probes, Eugene, OR, USA e Pierce, Rockford, IL). O número de grupos tiol a ser adicionado a uma molécula de EPO pode ser selecionado através de ajuste dos parâmetros de reação, isto é, da concentração de proteína (EPO) e da proporção de reagente bifuncio-nal/proteína. De preferência, a EPO é ativada através de ligação covalente de 1 a 5 grupos tiol por molécula de EPO, mais preferivelmente de 1,5 a 3 grupos tiol por molécula de EPO. Essas faixas se referem à distribuição es- tatística do grupo tiol com relação à população de proteína de EPO. A reação é realizada, por exemplo, em uma solução tampão a-quosa, pH de 6,5-8,0, por exemplo, em fosfato de potássio a 10 mM, NaCl a 50 mM, pH de 7,3. O reagente bifuncional pode ser adicionado em DMSO. Após término da reação, de preferência após 30 minutos, a reação é cessada através de adição de lisina. Reagente bifuncional em excesso pode ser separado através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através de diálise ou filtração em coluna. O número médio de grupos tiol adicionados à EPO pode ser determinado através de métodos fotométricos descritos em, por exemplo, Grasetti, D.R. e Murray, J.F. em J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119,41 -49 (1967). A reação acima é seguida por acoplamento covalente de um derivado de poli(etileno glicol) (PEG) ativado. Derivados de PEG adequados são moléculas de PEG ativadas com um peso molecular médio de cerca de 20 a cerca de 40 kDa, mais preferivelmente de cerca de 24 a cerca de 35 kDa e ainda mais preferivelmente cerca de 30 kDa.
Derivados de PEG ativados são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Morpurgo, M. e outros J. Bioconj. Chem. (1996) 7, página 363 ff para PEG-vinilsulfona. Espécies de PEG com cadeia linear e cadeia ramificada são adequadas para a preparação dos compostos de Fórmula 1. Exemplos de reagentes de PEG reativos são iodo-acetil-metóxi-PEG e metóxi-PEG-vinilsulfona: O uso dessas substâncias íodo-ativadas é conhecido na técnica e descrito, por exemplo, por Hermanson, G. T. em Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) páginas 147-148.
Mais preferivelmente, as espécies de PEG são ativadas através de maleimida usando-se (alcóxi inferior-PEG-maleimida), tal como metóxi-PEG-maleimida (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). A estrutura da alcóxi inferior-PEG-maleimida é como segue: com R e m sendo conforme definido acima, de preferência: A reação de acoplamento com alcóxi inferior-PEG-maleimida ocorre após divagem in situ do grupo tiol protegido na solução tampão a-quosa, por exemplo, fosfato de potássio a 10 mM, NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, pH de 6,2. A divagem do grupo protegido pode ser realizada, por e-xemplo, com hidroxilamina em DMSO a 25°C, pH de 6,2, durante cerca de 90 minutos. Para a modificação de PEG, proporção molar de EPO/aicóxi inferior-PEG-maieimida ativada deverá ser de cerca de 1:3 a cerca de 1:6 e de preferência 1:4. A reação pode ser cessada através de adição de cisteína e reação dos grupos tiol (-SH) restantes com N-metilmaieimida ou outros compostos apropriados capazes de formação de ligações de dissulfeto. Em virtude da reação de quaisquer grupos tiol ativos restantes com um grupo protegido, ta! como N-metilmaleimida ou outro grupo protegido adequado, as glicoproteínas EPO nos conjugados da presente invenção podem conter tais grupos protegidos. Geralmente, o procedimento descrito aqui produzirá uma mistura de moléculas tendo números variados de tióis protegidos por diferentes números do grupo de proteção, dependendo do número de grupos tiol ativados na glicoproteína que não foram conjugados à PEG-maleimida.
Embora a N-metilmaleimida forme o mesmo tipo de ligação co-valente quando usada para bloquear os grupos-tiot restantes em uma proteína peguilada, compostos de dissulfeto levarão, em uma reação de troca in- termolecular de sulfeto/dissulfeto, a um acoplamento ligado em ponte de dis-sulfeto do reagente de bloqueio. Reagentes de bloqueio preferidos para esse tipo de reação de bloqueio são glutationa oxidada (GSSG), cisteína e cista-mina. Embora com a cisteína nenhuma carga líquida adicional seja introduzida na proteína peguilada, o uso dos reagentes de bloqueio GSSG ou cis-tamina resulta em uma carga positiva ou negativa adicional. A purificação adicional dos compostos da fórmula (III), incluindo a separação de espécies de EPO mono-, di- e tri-peguilada, pode ser feita através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia em coluna.
Derivados preferidos de eritropoietina peguilada contêm pelo menos noventa por cento de conjugados de mono-PEG. Usualmente, conjugados de mono-PEG de glicoproteínas eritropoietina são desejáveis em virtude de eles tenderem a ter maior atividade do que conjugados de di-PEG. O percentual de conjugados de mono-PEG, bem como a proporção de espécies de mono- e di-PEG, pode ser controlada empoçando-se frações mais amplas em torno do pico de eluição para diminuir o percentual de frações de mono-PEG ou menores para aumentar o percentual de mono-PEG na composição. Cerca de noventa por cento de conjugados de mono-PEG é um bom equilíbrio entre rendimento e atividade. Algumas composições nas quais, por exemplo, pelo menos noventa e dois por cento ou pelo menos noventa e seis por cento dos conjugados são espécies de mono-PEG (n i-gual a 1) podem ser desejadas. Em uma concretização da presente invenção, o percentual de conjugados onde n é 1 é de noventa por cento a noventa e seis por cento.
Composições farmacêuticas compreendendo eritropoietina peguilada são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional WO 01/87329. As composições podem compreender 10 a 10000 pg de uma proteína de eritropoietina por ml, conforme definido acima. De preferência, as composições compreendem 10 a 1000 pg, por exemplo, 10, 50, 100, 400, 800 ou 2500 pg por ml. Ainda, as composições podem compreender 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoietina por ml, 10 - 200 mmoles/l de sulfato, 10 a 50 immoles/l de fosfato, pH de 6,0 a 6,5. Essa composição pode também compreender metionina até 20 mM, 1 - 5 % de um poliol (p/v), até 0,1% de Pluronic F68 (p/v) e opcionalmente CaCI2 até 1 mM. Um exemplo dessa composição compreende 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoietina por ml, 40 mmoles/l de sulfato, 10 mmoles/l de fosfato, 3% de manitol (p/v), metionina a 10 mM, 0,01% de Pluronic F68 (p/v), pH de 6,2. Em alternativa, a composição pode compreender 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoietina por ml, 10 a 100 mmoles/l de NaCI, 10 a 50 mmoles/l de fosfato, pH de 6,0 a 7,0, opcionalmente 1-5% (peso/v) de um poliol. Ainda, essa composição pode compreender metionina até 20 mM, até 0,1% de Pluronic F68 (p/v) e opcionalmente 7,5 pmoles/l de CaCI2. Especificamente, essa composição pode compreender 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoietina por ml, 100 mmoles/l de NaCI, metionina a 10 mM, 0,01% de Pluronic F68 (p/v) e 10 mmoles/l de fosfato, pH de 7,0. A presente invenção também se refere à composição acima compreendendo 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoietina por ml, 10 a 50 mmoles/l de arginína, pH de 6 a um pH de 6,5,10 a 100 mmoles/l de sulfato de sódio. Além disso, essa composição pode compreender metionina até 20 mM, até 0,1% de Pluronic F68 (p/v), opcionalmente até 1 mmol/l de CaCI2 e opcionalmente 1 - 5% (p/v) de um poliol. Especificamente, essa composição pode conter 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoietina por ml, 40 mmoles/l de arginina, pH de 6,2, 30 mmoles/l de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), metionina a 10 mM, 0,01% de Pluronic F68 (p/v) e opcío-nalmente 1 mmol/l de CaCI2.
Uma concretização preferida da presente invenção se refere à composições compreendendo 10 a 10000 pg/ml de eritropoietina, de preferência 25 a 2500 pg/ml de eritropoietina e: a) fosfato de sódio/potássio a 10 mM, NaCI a 100 mM, pH de 7,0 ou b) fosfato de sódio a 10 mM, sulfato de sódio a 120 mM, pH de 6,2 ou c) fosfato de sódio a 10 mM, sulfato de sódio a 40 mM, 3% de manitol (p/v), pH de 6,2 ou d) fosfato de sódio a 10 mM, sulfato de sódio a 40 mM, 3% de manitol (p/v), metionina a 10 mM, 0,01% de Pluronic F68 (p/v), pH de 6,2 ou e) arginina a 40 mM, sulfato de sódio a 30 mM, 3% de manitol (p/v), pH de 6,2 ou f) arginina a 40 mM, sulfato de sódio a 30 mM, 3% de manitol (p/v), metionina a 10 mM, 0,01% de Pluronic F68 (p/v), pH de 6,2.
Na concretização mais preferida, as composições compreendem uma quantidade de proteína de eritropoietina de 50, 100, 400, 800 ou 2500 pg/ml. As composições mais preferidas compreendem fosfato de sódio a 10 mM, sulfato de sódio a 40 mM, 3% de manitol (p/v), metionina a 10 mM, 0,01% de Pluronic F68 (p/v), pH de 6,2 ou arginina a 40 mM, sulfato de sódio a 30 mM, 3% de manitol (p/v), metionina a 10 mM, 0,01% de Pluronic F68 (p/v), pH de 6,2. Outros detalhes a respeito de tais composições são conhecidos do WO 01/87329. A invenção também se refere a um método para tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas compreendendo administração de uma quantidade eficaz de proteína de eritropoietina, conforme definido acima. Além disso, a invenção se refere a um medicamento para o tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas caracterizado pelo fato de ele conter uma quantidade eficaz de proteína de eritropoietina. Exemplos de doenças cardíacas são, por exemplo, doenças cardíacas coronartanas, ateroscleroses, ateroscleroses coronarianas, síndrome coronariana aguda, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva e/ou insuficiência cardíaca. No contexto do método e medicamento mencionados acima, insuficiência cardíaca é a forma preferida de doenças cardíacas. Métodos e medicamentos preferidos conforme descrito acima são aqueles em que a proteína de eritropoietina é conforme definido acima.
No tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas, a EPO pode, por exemplo, ser administrada em uma dosagem de 150 U/kg de peso corporal duas vezes por semana. A dosagem pode ser variada de acordo com a necessidade do paciente individual e pode também estar na faixa, por exemplo, de 100 a 200 U/kg. Dependendo o tempo de meia-vida do derivado de EPO usado, uma dose pode ser administrada, por exemplo, entre 1 ou 3 vezes por semana. Dependendo das necessidades de um paciente individual, o médico também podería escolher uma dosagem diferente. A atividade específica de EPO ou conjugados de EPO de acordo com a presente invenção pode ser determinada através de vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica das proteínas de EPO purificadas da presente invenção é tal que administração da proteína de EPO através de injeção a pacientes humanos resulta em aumento da produção de reticulócitos e células sangüíneas vermelhas por células da medula óssea comparado a grupos de indivíduos não-injetados ou de controle. A atividade biológica das proteínas de EPO ou fragmentos das mesmas obtidos e purificados de acordo com a presente invenção pode ser testada por meio de métodos de acordo com Annable, e outros, Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 e Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Outro ensaio biológico para determinação da atividade da proteína de EPO, o ensaio com camundongo normocitêmico, é descrito na técnica (por exemplo, Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) e a monografia de eritropoietina de Ph. Eur. BRP.). A invenção será melhor compreendida através de referência ao exemplo a seguir o qual ilustra, mas não limita, a invenção descrita aqui. Exemplo Um homem de meia idade com doença cardíaca é verificado após um cateter cardíaco com relação a distúrbios de distribuição de ferro através de determinação dos seguintes parâmetros - CRP (proteína C reativa), receptor de ferritina e transferrina solúvel - conforme descrito em P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, cartaz apresentado no AACC/CSCC, Annual Meeting, 29 de julho - 2 de agosto de 2001, Chicago, Illinois. Os resultados mostram distúrbios de distribuição de ferro. O paciente é tratado subcutaneamente com 150 U/kg de Recormon® (proteína de eritropoietina comercialmente disponível) duas vezes por semana durante um máximo de 12 semanas. Após o que, determinação dos parâmetros conforme descrito acima mostram uma melhora no distúrbio de deficiência de ferro.
REIVINDICAÇÕES
Claims (14)
1. Uso de proteína de eritropoietina, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios da distribuição de ferro em doenças cardíacas.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença cardíaca é insuficiência cardíaca,
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina é uma eritropoietina humana.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina é alfa epoetina ou beta epoetina.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina é expressa através de ativação de gene endógeno.
6. Uso, de acordo com a reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina apresenta a seqüência de aminoãcidos de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina apresenta a sequência da eritropoietina humana modificada através da adição de 1 a 6 sítios de glicosilação.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que que a proteína de eritropoietina é alfa darbepoetina.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 8, é peguilada.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina é um conjugado, o referido conjugado compreendendo uma proteína de eritropoietina tendo pelo menos um grupo amino livre e tendo a atividade biológica m vivo de fazer com que células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células sanguíneas vermelhas e selecionada do grupo consistindo em eritropoietina humana e análogos da mesma os quais têm uma seqüência da eritropoietina humana modificada através da adição de 1 a 6 sítios de glicosilação ou uma reestruturação de pelo menos um sítio de glicosilação; a referida proteína de eritropoietina sendo covaientemente ligada a n grupos poli(etileno glicol) da fórmula -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)n1-OR na qual -CO de cada grupo poli(etileno glicol) forma uma ligação de amida com um dos referidos grupos amino; R é alquila inferior; x é 2 ou 3; m ê de cerca de 450 a cerca de 900; n é de 1 a 3; e nem são escolhidos de modo que o peso molecular do conjugado menos a proteína de eritropoietina é de 20 quílodaltons a 100 quilodaltons.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: x é 2, m é 650 a 750, n é 1, e R é metila,
12. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína de eritropoietina é um conjugado, o referido conjugado compreendendo uma proteína de eritropoietina tendo pelo menos um grupo amino livre e tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células sanguíneas vermelhas e selecionada do grupo consistindo em proteína de eritropoietina humana e análogos da mesma os quais têm a estrutura primária da proteína de eritropoietina humana modificada pela adição de 1 a 6 sítios de glicosilação; a referida proteína de eritropoietina sendo covaientemente ligada a de um a três grupos alcóxi inferior - poli(etileno glicol), cada grupo polí{etileno glicol) sendo covaientemente ligado à proteína de eritropoietina via um ligante da fórmula -C(0)-X-S-Y- na qual -C(O) do lígante forma uma ligação de amida com um dos referidos grupos amino; X é -(CH2)k- ou -CH2(0-CH2-CH2V-, k é de 1 a 10, Y é: o peso molecular médio de cada porção poli(etileno glicol) é de cerca de 20 quilodaltons a cerca de 40 quilodaltons, e o peso molecular do conjugado é de cerca de 51 quilodaltons a cerca de 175 quilodaltons.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é com um conjugado de eritropoietina da fórmula: na qual n é um número Inteiro de 1 a 3; m é um numero inteiro de 450 a 900; R é alquila inferior; X é -(CH2)k- ou -CH2(0-CH2-CH2)k-, ké 1 a 10; e P é o resíduo da proteína de eritropoietina sem os n grupos amino os quais formam uma ligação de amida com X.
14. Medicamento para uso no tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em doenças cardíacas, caracterizado pelo fato de que contém uma quantidade eficaz de proteína de eritropoietina.
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