JP5128048B2 - エリスロポエチンの使用 - Google Patents

Description

本発明は、エリスロポエチンの新しい用途、特に糖尿病における鉄分布障害の処置に関する。

鉄の代謝が正常ではない種々の疾患が知られている。貧血では、生体中の鉄の全体的な欠乏により十分な血液が形成できない。鉄に関連した他の代謝状態は血色素症であり、生体中の鉄の全体的な濃度が正常より高く、これにより例えば臓器の破壊などの種々の状態をもたらされる。

鉄分布障害は前記の貧血および血色素症とは異なる。なぜなら生体中の鉄の全体的な濃度は正常であるからである。一方で、鉄は種々の臓器に蓄積し、これらの臓器に傷害を与えたりさらには破壊する可能性がある。他方で、血液の形成において正常な量で存在する鉄の使用が損なわれると、貧血に関連した作用に匹敵する二次作用がもたらされる。

今まで、糖尿病に罹患している患者が、鉄分布障害により影響を受ける可能性が高いことは知られていなかった。鉄分布障害は、鉄状態の診断に一般的に使用される種々のパラメータにより診断することができる。フェリチンおよび可溶性トランスフェリン受容体の測定に基づいて、糖尿病患者における鉄の総濃度が正常であるかどうかを評価することができる。正常である場合には、網状赤血球中のヘモグロビン濃度が低さが、鉄分布障害の指標となる。別の指標は、糖尿病に罹患し正常な鉄の総濃度を示す患者における、連続的／長期的に上昇したＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の濃度である。鉄分布障害を診断する方法は、イリノイ州シカゴの２００１年７月２９日から８月２日の年会のＡＡＣＣ／ＣＳＣＣで提示されたポスターのP.Lehmann、M.Volkmann、J.Lotz、A.Baldauf、R.Roeddigerにより記載されている。

これまでは、鉄分布障害に罹患している糖尿病患者のための処置について示唆されてこなかった。それ故、本発明の根底にある問題は、前記の不都合を最小限にまたは抑制するために、糖尿病における鉄分布障害のための処置を提供することである。驚くべきことに、エリスロポエチンが、糖尿病における鉄分布障害に対して有益な効果を示すことが判明した。それ故、本発明によれば、糖尿病における鉄分布障害の処置に使用するためのエリスロポエチンを提供することにより問題は解決する。

特記しない限り、以下の定義は、本明細書の本発明を記載するのに使用した種々の用語の意味および範囲を説明および定義するために示されている。

本明細書に使用したような「低級アルキル」なる用語は、炭素原子数１〜６の直鎖または分岐アルキル基を意味する。低級アルキル基の例には、メチル、エチル、およびイソプロピル、好ましくはメチルが含まれる。

本明細書に使用したような「低級アルコキシ」なる用語は、Ｒ’−Ｏ−基を意味し、ここでのＲ’は、前記に定義したような低級アルキルである。

「糖尿病における鉄分布障害」は、糖尿病に罹患している患者に生じる鉄分布障害を意味する。鉄分布障害は、例えば、前記のように特徴づけることができる。特に、鉄分布障害は、以下のパラメータにより特徴づけられる：ｌｏｇ（フェリチン濃度［μg／Ｌ］）で割った可溶性トランスフェリン受容体の濃度［mg／Ｌ］が３.５より小さく、同時にＣ反応性タンパク質の濃度が５mg／Ｌを超える。

「エリスロポエチン」または「エリスロポエチンタンパク質」なる用語は、網状赤血球および赤血球の産生を増加させるように骨髄細胞を誘導するインビボ生物活性を有し、以下に定義したヒトエリスロポエチンおよび類似体からなる群より選択されたタンパク質を意味する。

「ＰＥＧ化エリスロポエチン（Ｐｅｇ−ＥＰＯまたはＰＥＧ−ＥＰＯ）」なる用語は、以下に記載したような１〜３つのポリエチレン誘導体と共有結合したエリスロポエチンタンパク質を意味する。

より詳細には、本発明は、糖尿病における鉄分布障害の処置用の医薬の製造におけるエリスロポエチンの使用に関する。好ましい実施形態において、本発明は、前記に定義したような使用に関し、ここでの糖尿病は非インスリン依存型糖尿病である。

本発明は、医薬活性成分としてエリスロポエチンを含む医薬組成物の調製に特に有用である。「エリスロポエチン」または「エリスロポエチンタンパク質」または「ＥＰＯ」なる用語は以下の通りである：特にこの用語は、例えば（配列番号１）または（配列番号２）で示したアミノ酸配列またはそれに実質的に相同なアミノ酸配列を有する、例えばヒトエリスロポエチンなどの糖タンパク質を意味し、その生物学的特性は、赤血球産生刺激、ならびに、骨髄における関係のある赤血球前駆体の分裂および分化の刺激に関連している。本明細書に使用したように、これらの用語には、例えば部位特異的突然変異誘発により意図的に、または、偶発的な突然変異により修飾された前記タンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、グリコシル化用の１〜６の追加的部位を有する類似体、糖タンパク質のカルボキシ末端において少なくとも１つの追加的アミノ酸を有する類似体（ここでの追加的アミノ酸は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む）、および、グリコシル化用の少なくとも１つの部位の再編成を含むアミノ酸配列を有する類似体が含まれる。これらの用語には、天然ヒトエリスロポエチンおよび組換え産生ヒトエリスロポエチンの両方が含まれる。本発明の好ましい実施形態において、エリスロポエチンタンパク質はヒトエリスロポエチンである。

以下に詳細に示したように、ＥＰＯの調製および精製は当分野で公知である。エリスロポエチンにより、組織、タンパク質合成、天然または組換え細胞を用いての細胞培養などの任意の慣用的な起源から得られる、天然または組換えタンパク質、好ましくはヒトのもの、例えばエポエチンアルファまたはエポエチンベータを意味する。エリスロポエチンの活性を有する任意のタンパク質、例えばムテインまたは別様に修飾されたタンパク質が包含される。本発明の好ましい実施形態において、エリスロポエチンタンパク質は、エポエチンアルファまたはエポエチンベータである。組換えＥＰＯは、組換えＤＮＡ技術により、または、内因性遺伝子活性化により、ＣＨＯ−、ＢＨＫ−、またはＨｅＬａ細胞系における発現により調製し得る。内因性遺伝子活性化によるものを含むタンパク質の発現は当分野で公知であり、例えば、米国特許第５，７３３，７６１号、第５，６４１，６７０号、および第５，７３３，７４６号、ならびに、国際特許公開公報第ＷＯ９３／０９２２２号、第ＷＯ９４／１２６５０号、第ＷＯ９５／３１５６０号、第ＷＯ９０／１１３５４号、第ＷＯ９１／０６６６７号、および第ＷＯ９１／０９９５５号に開示されており、その各々の内容は本明細書に参照して取り込む。エリスロポエチンタンパク質が内因性遺伝子活性化により発現されている、前記に定義したような使用が好ましい。エリスロポエチン糖タンパク質産物の調製における好ましいＥＰＯ種は、ヒトＥＰＯ種である。より好ましくは、ＥＰＯ種は、配列番号１または配列番号２に示したアミノ酸配列を有するヒトＥＰＯ、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＥＰＯである。それ故、本発明の好ましい実施形態は、エリスロポエチンタンパク質が配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する、前記したような使用に関する。

さらに、エリスロポエチンは、グリコシル化用の１〜６の追加的部位を有する糖タンパク質類似体であり得る。それ故、本発明はまた、エリスロポエチンタンパク質が、１〜６のグリコシル化部位の付加により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を有する、前記したような使用に関する。１つ以上のオリゴ糖基によるタンパク質のグリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿った特定の位置で起こり、タンパク質安定性、分泌、細胞下局在化、および生物活性などのタンパク質の物理的特性に大きな影響を及ぼす。グリコシル化は、通常、２種類である。Ｏ−結合オリゴ糖はセリン残基またはトレオニン残基に付着し、Ｎ−結合オリゴ糖はアスパラギン残基に付着する。Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の両方に見られるオリゴ糖の１種は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）であり、これは、９以上の炭素原子を含むアミノ糖のファミリーである。シアル酸は、通常、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の両方における末端残基であり、負の荷電を有しているので、糖タンパク質に酸性の特性を付与する。１６５アミノ酸を有するヒトエリスロポエチンは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を含む、３つのＮ−結合オリゴ糖鎖および１つのＯ−結合オリゴ糖鎖を含む。Ｎ−結合グリコシル化は、２４位、３８位、および８３位に位置するアスパラギン残基で起こり、Ｏ−結合グリコシル化は、１２６位に位置するセリン残基で起こる。オリゴ糖鎖は、末端のシアル酸残基で修飾されている。グリコシル化エリスロポエチンから全てのシアル酸残基を酵素的に除去すると、インビボ活性は消失するが、インビトロ活性は消失しない。なぜなら、エリスロポエチンのシアル化は、肝臓結合タンパク質によるその結合を妨げ、続いてそのクリアランスを妨げるからである。

「エリスロポエチン」なる用語は、シアル酸付着部位数が増加するようにヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を１つ以上変化させた、ヒトエリスロポエチン類似体を含む。これらの糖タンパク質類似体は、グリコシル化に利用できる部位を増加または変化させるアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を有する部位特異的突然変異誘発により作製し得る。ヒトエリスロポエチンに見られるよりも高いシアル酸レベルを有する糖タンパク質類似体は、生物活性に必要とされる二次または三次コンフォメーションを撹乱しないグリコシル化部位を付加することにより作製される。本発明の糖タンパク質はまた、グリコシル化部位における炭水化物付着レベルの増加した類似体を含み、これにはＮ−結合部位またはＯ−結合部位に近い１つ以上のアミノ酸の置換が通常含まれる。本発明の糖タンパク質はまた、エリスロポエチンのカルボキシ末端から伸長した１つ以上のアミノ酸を有し、少なくとも１つの更なる炭水化物部位を提供する類似体を含む。本発明の組成物のエリスロポエチンタンパク質はまた、グリコシル化用の少なくとも１つの部位の再編成を含むアミノ酸配列を有する類似体を含む。このようなグリコシル化部位の再編成には、ヒトエリスロポエチンにおける１つ以上のグリコシル化部位の欠失、および、１つ以上の非天然のグリコシル化部位の付加が含まれる。エリスロポエチン上の炭水化物鎖の数を増加するにつれて、エリスロポエチン１分子あたりのシアル酸の数は、溶解度増大、タンパク質分解に対する抵抗性の増大、免疫原性の低下、血清半減期の増大、および生物活性の増大などの有益な特性を付与し得る。更なるグリコシル化部位を有するエリスロポエチン類似体は、より詳細には、１９９５年３月１日に公開されたElliotの欧州特許出願６４０６１９号に開示されている。

好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、グリコシル化用の少なくとも１つの追加的部位を含むアミノ酸配列を有するエリスロポエチンタンパク質、例えば、以下に限定されないが、以下から選択された修飾により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を含むエリスロポエチンを含む：
Ａｓｎ^３０Ｔｈｒ^３２；
Ａｓｎ^５１Ｔｈｒ^５３；
Ａｓｎ^５７Ｔｈｒ^５９；
Ａｓｎ^６９；
Ａｓｎ^６９Ｔｈｒ^７１；
Ｓｅｒ^６８Ａｓｎ^６９Ｔｈｒ^７１；
Ｖａｌ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０；
Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０；
Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｇｌｙ^８９Ｔｈｒ^９０；
Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０Ｔｈｒ^９２；
Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０Ａｌａ^１６２；
Ａｓｎ^６９Ｔｈｒ^７１Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０；
Ａｓｎ^３０Ｔｈｒ^３２Ｖａｌ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０；
Ａｓｎ^８９Ｉｌｅ^９０Ｔｈｒ^９１；
Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８９Ｉｌｅ^９０Ｔｈｒ^９１；
Ａｓｎ^１３６Ｔｈｒ^１３８；
Ａｓｎ^１３８Ｔｈｒ^１４０；
Ｔｈｒ^１２５；および
Ｐｒｏ^１２４Ｔｈｒ^１２５。

アミノ酸配列の修飾のために本明細書で使用した表記は、上付き数字（群）により示した対応する非修飾タンパク質（配列番号１または配列番号２のｈＥＰＯ）の位置（群）を、それぞれの上付き数字（群）の直前のアミノ酸（群）に変化させることを意味する。

エリスロポエチンタンパク質はまた、糖タンパク質のカルボキシ末端に少なくとも１つの追加的なアミノ酸を有する類似体であり得、ここでの追加的アミノ酸は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。追加的なアミノ酸は、ヒト絨毛ゴナドトロピンのカルボキシ末端から得られるペプチド断片を含み得る。好ましくは、糖タンパク質は、（ａ）カルボキシ末端から伸長した、アミノ酸配列、ＳｅｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｙｓＡｌａＰｒｏＰｒｏＰｒｏＳｅｒＬｅｕＰｒｏＳｅｒＰｒｏＳｅｒＡｒｇＬｅｕＰｒｏＧｌｙＰｒｏＳｅｒＡｓｐＴｈｒＰｒｏＩｌｅＬｅｕＰｒｏＧｌｎを有するヒトエリスロポエチン；（ｂ）Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０ＥＰＯをさらに含む（ａ）の類似体；および（ｃ）Ａｓｎ^３０Ｔｈｒ^３２Ｖａｌ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０ＥＰＯをさらに含む（ａ）の類似体からなる群より選択された類似体である。

エリスロポエチンタンパク質はまた、グリコシル化用の少なくとも１つの部位の再編成を含む、アミノ酸配列を有する、類似体であり得る。再編成は、ヒトエリスロポエチンにおけるＮ−結合炭水化物部位のいずれかの欠失、および、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列の８８位におけるＮ−結合炭水化物部位の付加を含み得る。好ましくは、糖タンパク質は、Ｇｌｎ^２４Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０ＥＰＯ；Ｇｌｎ^３８Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０ＥＰＯ；およびＧｌｎ^８３Ｓｅｒ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０ＥＰＯからなる群より選択される類似体である。さらなる類似体は、ダルベポエチンアルファである。前記使用における好ましいエリスロポエチンタンパク質は、ダルベポエチンアルファである。

より特定すると、前記したような本医薬組成物のエリスロポエチンタンパク質はまた、そのＰＥＧ化誘導体も含み得る。エリスロポエチンのＰＥＧ化誘導体およびその調製は当分野で公知であり、例えば、第ＷＯ０１／０２０１７号、ＥＰ−Ａ−１０６４９５１、ＥＰ−Ａ−５３９，１６７、ＥＰ−Ａ−６０５，９６３、第ＷＯ９３／２５２１２号、第ＷＯ９４／２００６９号、第ＷＯ９５／１１９２４号、米国特許第５，５６、ＥＰ−Ａ−５８４，８７６、第ＷＯ９２／１６５５５号、第ＷＯ９４／２８０２４号、第ＷＯ９７／０４７９６号、米国特許第５，３５９，０３０号、および第５，６８１，８１１号、米国特許第４，１７９，３３７号、日本特許、第ＷＯ９８／３２４６６号、米国特許第５，３２４，６５０号に記載されている。好ましくは、前記した使用において、エリスロポエチンタンパク質はＰＥＧ化されている。ＰＥＧ化エリスロポエチン種の好ましい実施形態は、以下に記載したような誘導体を意味する。

従って、本発明はまた、前記したような使用を意味し、ここで、エリスロポエチンタンパク質はコンジュゲートであり、前記コンジュゲートは、少なくとも１つの遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボ生物活性を有し、１〜６のグリコシル化部位の付加または少なくとも１つのグリコシル化部位の再編成により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を有するヒトエリスロポエチンおよびその類似体からなる群より選択される前記したようなエリスロポエチンタンパク質を含み；前記エリスロポエチンは、式−ＣＯ−(ＣＨ_２)ｘ−(ＯＣＨ_２ＣＨ_２)_ｍ−ＯＲのｎ個のポリ(エチレングリコール)基に共有結合しており、各々のポリ(エチレングリコール)基の−ＣＯ（すなわちカルボニル）は、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており；Ｒは、低級アルキルであり；ｘは、２または３であり；ｍは、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜３であり；ｎおよびｍは、エリスロポエチンタンパク質の分子量を引いたコンジュゲートの分子量が２０キロダルトンから１００キロダルトンとなるように選択する。本発明はさらに、ｎが１であるコンジュゲートの比率が、組成物の全てのコンジュゲートの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは９６％である、本明細書に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物を提供する。

より具体的には、前記コンジュゲートは、式（Ｉ）
Ｐ−［ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｘ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ−ＯＲ］_ｎ （Ｉ）
（式中、
Ｐは、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボ生物活性を有する、本明細書に記載のようなエリスロポエチンタンパク質の残基であり（すなわち、式Ｉに示したカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基を含まない）；Ｒは、低級アルキルであり；ｘは、２または３であり；ｍは、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜３であり；ｎおよびｍは、エリスロポエチン糖タンパク質の分子量を引いたコンジュゲートの分子量が２０キロダルトンから１００キロダルトンとなるように選択する）
により示され得る。本発明によれば、Ｒは、任意の低級アルキルである。Ｒがメチルであるコンジュゲートが好ましい。

記号「ｍ」は、ポリ(エチレンオキシド)基中のエチレンオキシド残基（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）の数を示す。エチレンオキシドの単一のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）サブユニットは約４４ダルトンの分子量を有する。従って、コンジュゲートの分子量（ＥＰＯの分子量を除く）は、数字「ｍ」に依存する。本発明のコンジュゲートにおいて、「ｍ」は、約４５０〜約９００であり（約２０kDa〜約４０kDaの分子量に対応する）、好ましくは約６５０〜約７５０（約３０kDaの分子量に対応する）である。数字ｍは、得られる本発明のコンジュゲートが、非修飾ＥＰＯと同等な生理活性を有するように選択され、この活性は、非修飾ＥＰＯの対応する活性と同じか、それを超えるか、またはその一部分となる場合がある。「約」ある数の分子量は、慣用的な分析技術により決定したところその数字の妥当な範囲内であることを意味する。数字「ｍ」は、エリスロポエチン糖タンパク質に共有結合した各々のポリ(エチレングリコール)基の分子量が、約２０kDa〜約４０kDaとなるように、好ましくは約３０kDaとなるように選択する。

本発明のコンジュゲートにおいて、数字「ｎ」は、アミド結合（群）を介してエリスロポエチンタンパク質の遊離アミノ基（リジンアミノ酸のε−アミノ基および／またはアミノ末端アミノ基を含む）に共有結合したポリ(エチレングリコール)基の数である。本発明のコンジュゲートは、ＥＰＯ１分子あたり、１、２、または３つのＰＥＧ基を有し得る。「ｎ」は１〜３の整数であり、好ましくは「ｎ」は１または２であり、より好ましくは「ｎ」は１である。前記したコンジュゲートの中で好ましいコンジュゲートは、ｘが２であり、ｍが６５０〜７５０であり、ｎが１であり、Ｒがメチルである化合物を含む。

式（Ｉ）の化合物は、既知のポリマー物質から、式ＩＩ

（式中、Ｒおよびｍは前記した通りである）
の化合物をエリスロポエチン糖タンパク質と縮合することにより調製することができる。ｘが３である式（ＩＩ）の化合物は、ポリ(エチレングリコール)のα−低級アルコキシ、酪酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ）である。ｘが２である式（ＩＩ）の化合物は、ポリ(エチレングリコール)のα−低級アルコキシ、プロピオン酸スクシンイミジルエステル（低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）である。活性化エステルをアミンと反応させてアミドを形成する慣用的な方法を使用することができる。前記した反応において、例示したスクシンイミジルエステルは、アミド形成を引き起こす脱離基である。タンパク質を有するコンジュゲートを作製するためのスクシンイミジルエステル（例えば式ＩＩの化合物）の使用は、１９９７年９月３０日に発行された米国特許第５，６７２，６６２号（Harrisら）に開示されている。

ヒトＥＰＯは、９つの遊離アミノ基、すなわちアミノ末端アミノ基と８つのリジン残基のε−アミノ基を含む。ＰＥＧ化試薬を式ＩＩのＳＢＡ化合物と合わせた場合、ｐＨ７.５、１：３のタンパク質：ＰＥＧ比、２０〜２５℃の反応温度において、モノ−、ジ−、および微量のトリ−ＰＥＧ化種の混合物が生じることが判明した。ＰＥＧ化試薬が式ＩＩのＳＰＡ化合物である場合、タンパク質：ＰＥＧの比が１：２であることを除いて類似した条件において、主にモノ−ＰＥＧ化種が生じる。ＰＥＧ化ＥＰＯは、混合物として、または、カチオン交換クロマトグラフィーで分離した異なるＰＥＧ化種として投与することができる。反応条件を操作することにより（例えば試薬の比、ｐＨ、温度、タンパク質濃度、反応時間など）、異なるＰＥＧ化種の相対量を変化させることができる。

本発明のさらに好ましい実施形態は、前記に定義したような使用に関し、ここで、エリスロポエチンタンパク質は、コンジュゲートであり、前記コンジュゲートは、少なくとも１つの遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボ生物活性を有し、１〜６のグリコシル化部位の付加により修飾されたヒトエリスロポエチンの一次構造を有するヒトエリスロポエチンタンパク質およびその類似体からなる群より選択されるエリスロポエチンタンパク質を含み；前記エリスロポエチンタンパク質は、１〜３の低級アルコキシポリ(エチレングリコール)基に共有結合しており、各々のポリ(エチレングリコール)基は、式−Ｃ(Ｏ)−Ｘ−Ｓ−Ｙ−のリンカーを介してエリスロポエチンタンパク質に共有結合しており、リンカーのＣ(Ｏ)は、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、Ｘは−(ＣＨ_２)_ｋ−または−ＣＨ_２(Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２)_ｋ−であり、ｋは１〜１０であり、Ｙは

であり、各々のポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量は、約２０キロダルトンから約４０キロダルトンであり、コンジュゲートの分子量は約５１キロダルトンから約１７５キロダルトンである。

このエリスロポエチン種はまた、式（ＩＩＩ）
Ｐ−［ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｙ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ−ＯＲ］_ｎ （ＩＩＩ）
（式中、
Ｒは、任意の低級アルキルである）
により示され得る。好ましい低級アルキルは、メチルである。Ｘは−（ＣＨ_２）_ｋ−または−ＣＨ_２（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｋ−であり、ここでのｋは１〜約１０である。好ましくは、ｋは１〜約４であり、より好ましくは、ｋは、１または２である。最も好ましくは、Ｘは、−（ＣＨ_２）である。

式１において、Ｙは

であり、好ましくは

であり、より好ましくは

である。

式（ＩＩＩ）において、数字ｍは、得られる式（ＩＩＩ）のコンジュゲートが、非修飾ＥＰＯと同等な生理活性を有するように選択され、この活性は、非修飾ＥＰＯの対応する活性と同じか、それを超えるか、またはその一部分となる場合がある。ｍは、ＰＥＧ単位中のエチレンオキシド残基の数を示す。−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）−という単一のＰＥＧサブユニットは、約４４ダルトンの分子量を有する。従って、コンジュゲートの分子量（ＥＰＯの分子量を除く）は、数字ｍに依存する。「約」ある数の分子量は、慣用的な分析技術により決定したところその数字の妥当な範囲内であることを意味する。ｍは、約４５０〜約９００（２０〜４０kDaの分子量に対応する）の範囲の整数であり、好ましくはｍは、約５５０〜約８００（約２４〜３５kDa）であり、最も好ましくはｍは、約６５０〜約７００（約２９〜約３１kDa）である。

式（ＩＩＩ）において、数字ｎは、アミド結合を介してＰＥＧ単位に共有結合したエリスロポエチンタンパク質における、リジンアミノ酸のε−アミノ基の数である。本発明のコンジュゲートは、ＥＰＯ１分子あたり、１、２、または３つのＰＥＧ単位を有し得る。ｎは、１〜３の範囲の整数であり、好ましくはｎは１または２であり、より好ましくはｎは１である。

式（ＩＩＩ）の好ましいエリスロポエチンタンパク質は、式

により示される。

本発明の最も好ましい実施形態において、エリスロポエチンコンジュゲートは、式

（式中、
前記の式において、ｎは１〜３の整数であり；ｍは４５０〜９００の整数であり；Ｒは低級アルキルであり；Ｘは−（ＣＨ_２）_ｋ−または−ＣＨ_２（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｋ−であり、Ｐは、Ｘとアミド結合を形成するアミノ基またはアミノ基群を含まないエリスロポエチンの残基である）
により示される。

他の好ましいエリスロポエチン糖タンパク質産物は、式

により示される。

より好ましいエリスロポエチン糖タンパク質産物は、式

により示される。

これらのエリスロポエチンタンパク質は、
（ａ）式Ｐ−［ＮＨ_２］_ｎにより示されるエリスロポエチンタンパク質のリジンアミノ酸のε−アミノ基を、式Ｚ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑにより示される二官能試薬と共有結合的に反応させて、式
Ｐ−［ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑ］_ｎ
（式中、
Ｐは、アミド結合を形成するアミノ基を引いたエリスロポエチンタンパク質であり；ｎは、１〜３の範囲の整数であり；Ｚは、反応性基、例えばカルボン酸−ＮＨＳエステルであり；Ｘは、−（ＣＨ_２）_ｋ−または−ＣＨ_２（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｋ−であり、ここでのｋは１〜約１０であり；Ｑは、アルカノイルのような保護基、例えばアセチルである）
により示されるアミド結合を有する中間体を形成し、
（ｂ）ステップ（ａ）からのアミド結合を有する中間体を、式Ｗ−［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_ｍ−ＯＲにより示される活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体と共有結合的に反応させて、式

（式中、
Ｗは、Ｙのスルフヒドリル反応形態であり；ｍは、約４５０〜約９００の範囲の整数であり；Ｒは、低級アルキルであり；Ｙは、前記に定義した通りである）
により示されるエリスロポエチン糖タンパク質産物を形成することにより調製し得る。

この実施形態において、二官能試薬は、好ましくは、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオナートまたはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタートであり、Ｚは、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドであり、活性化ポリ（エチレングリコール）誘導体Ｗ−［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_ｍ−ＯＲは、好ましくは、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホン、およびメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドからなる群より選択される。

より詳細には、式（ＩＩＩ）のエリスロポエチンタンパク質は、チオール基をＥＰＯに共有結合的に連結し（「活性化」）、得られた活性化ＥＰＯをポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体にカップリングすることにより調製し得る。本発明に記載のＰＥＧ化ＥＰＯの調製の第一ステップは、ＥＰＯのＮＨ_２基を介してチオール基を共有結合的に連結することを含む。このＥＰＯの活性化は、保護チオール基および追加的な反応性基（例えば活性エステル（例えばスクシンイミジルエステル）、無水物、スルホン酸のエステル、それぞれカルボン酸およびスルホン酸のハロゲン化物）を有する、二官能試薬を用いて実施する。チオール基は、当分野で公知の基、例えばアセチル基により保護されている。これらの二官能試薬は、アミド結合を形成することにより、リジンアミノ酸のε−アミノ基と反応することができる。反応の第一ステップを以下に示す：

（式中、
ＥＰＯ、ｎ、およびＸは、前記に定義した通りであり、Ｚは、当分野で既知の反応性基であり、例えば、式

で示されるＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）置換基である。

好ましい実施形態において、ε−アミノリジン基の活性化は、スクシンイミジル部分を有する二官能試薬との反応により実施する。二官能試薬は、異なるスペーサー種、例えば−（ＣＨ_２）_ｋ−または−ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｋ−部分を有し得、ここでのｋは１〜約１０であり、好ましくは１〜約４であり、より好ましくは１または２であり、最も好ましくは１である。これらの試薬の例は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオナート（ＳＡＴＰ）およびＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）

（ｋは前記に定義した通りである）である。

二官能試薬の調製は、当分野で公知である。２−（アセチルチオ）−（エトキシ）_ｋ−酢酸−ＮＨＳ−エステルの前駆体は、ＤＥ−３９２４７０５に記載されており、一方、アセチルチオ化合物への誘導体化は、March,J.、Advanced Organic Chemistry、McGraw-Hill、１９７７、３７５〜３７６に記載されている。ＳＡＴＡは市販されている（Molecular Probes、米国オレゴン州ユージーンおよびPierce、IL州ロックフォード）

ＥＰＯ分子に付加するチオール基の数は、反応パラメータ、すなわちタンパク質（ＥＰＯ）濃度およびタンパク質／二官能試薬の比を調整することにより選択できる。好ましくは、ＥＰＯは、ＥＰＯ１分子あたり１〜５のチオール基を、より好ましくはＥＰＯ１分子あたり１.５〜３のチオール基を共有結合的に連結することにより活性化する。これらの範囲は、ＥＰＯタンパク質個体群上のチオール基の統計学的分布を意味する。

反応は、例えば、ｐＨ６.５〜８.０の緩衝水溶液中、例えばｐＨ７.３の１０mMリン酸カリウム、５０mM ＮａＣｌ中で実施する。二官能試薬は、ＤＭＳＯ中に添加し得る。反応完了後、好ましくは３０分後、反応をリジンの添加により停止する。過剰な二官能試薬を、例えば透析またはカラムろ過など当分野で既知の方法により分離し得る。ＥＰＯに付加されるチオール基の平均数は、例えば、Grasetti,D.R.およびMurray,J.F.、J.Appl.Biochem.Biotechnol.１１９、４１〜４９（１９６７）に記載の光度測定法により決定することができる。

前記の反応の後、活性化ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体の共有結合的カップリングを行なう。適切なＰＥＧ誘導体は、約２０〜約４０kDa、より好ましくは約２４〜約３５kDa、最も好ましくは約３０kDaの平均分子量を有する活性化ＰＥＧ分子である。

活性化ＰＥＧ誘導体は当分野で公知であり、例えば、ＰＥＧ−ビニルスルホンについてMorpurgo,Mら、J.Bioconj.Chem.(１９９６)７、３６３ｆｆ頁に記載されている。直鎖および分岐鎖ＰＥＧ種が、式１の化合物の調製に適している。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧおよびメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである：

これらのヨード活性化物質の使用は当分野で公知であり、例えば、Hermanson,G.T.、Bioconjugate Techniques、Academic Press、サンディエゴ（１９９６）１４７〜１４８頁に記載されている。

最も好ましくは、ＰＥＧ種は、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（分子量３００００；Shearwater Polymers,Inc.）などの（低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミド）を使用して、マレイミドにより活性化される。低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドの構造は

（式中、Ｒおよびｍは、前記に定義した通りである）
であり、好ましくは

である。

低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドとのカップリング反応は、インサイツ（in situ）でのチオール保護基の切断の後に、緩衝水溶液中で、例えば１０mMリン酸カリウム、５０mM ＮａＣｌ、２mM ＥＤＴＡ、ｐＨ６.２中で行なう。保護基の切断は、ヒドロキシアミンを用いて、ＤＭＳＯ中２５℃、ｐＨ６.２で約９０分間行ない得る。ＰＥＧ修飾について、活性化ＥＰＯ／低級アルコキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比は、約１：３から約１：６、好ましくは１：４とすべきである。反応は、システインの添加により、および、ジスルフィド結合を形成できるＮ−メチルマレイミドまたは他の適切な化合物と残りのチオール（−ＳＨ）基との反応により停止し得る。Ｎ−メチルマレイミドなどの保護基または他の適切な保護基と任意の残りの活性チオール基との反応のために、本発明のコンジュゲートにおけるＥＰＯ糖タンパク質は、このような保護基を含み得る。一般に、本明細書に記載した手法により、ＰＥＧ−マレイミドにコンジュゲートしなかった糖タンパク質上の活性チオール基の数に応じて、異なる数の保護基により保護された種々の数のチオールを有する分子の混合物が得られる。

Ｎ−メチルマレイミドは、ＰＥＧ化タンパク質上の残りのチオール基を遮断するのに使用された場合に同じ種類の共有結合を形成するが、ジスルフィド化合物は分子間スルフィド／ジスルフィド交換反応において遮断試薬のジスルフィド架橋カップリングをもたらす。その種類の遮断反応に好ましい遮断試薬は、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、システインおよびシスタミンである。システインではＰＥＧ化タンパク質に更なる正味荷電は導入されないが、遮断試薬ＧＳＳＧまたはシスタミンの使用によりさらなる負荷電または正荷電がもたらされる。

モノ−、ジ−、およびトリ−ＰＥＧ化ＥＰＯ種の分離を含む、式（ＩＩＩ）の化合物のさらなる精製は、当分野で公知の方法により、例えばカラムクロマトグラフィーにより実施し得る。

ＰＥＧ化エリスロポエチン誘導体は、好ましくは、少なくとも９０％のモノＰＥＧコンジュゲートを含む。通常、エリスロポエチン糖タンパク質のモノＰＥＧコンジュゲートが望ましい。なぜなら、ジ−ＰＥＧコンジュゲートよりも高い活性を有する傾向があるからである。モノ−ＰＥＧコンジュゲートの比率ならびにモノ−およびジ−ＰＥＧ種の比は、溶出ピークの周辺のより広い画分をプールして組成物中のモノ−ＰＥＧの比率を減少することにより、あるいは、より狭い画分をプールしてモノ−ＰＥＧの比率を増加することにより制御することができる。約９０％のモノ−ＰＥＧコンジュゲートが、収率と活性との良好な平衡である。時に、例えばコンジュゲートの少なくとも９２％または少なくとも９６％がモノ−ＰＥＧ種（ｎは１である）である組成物が望ましくあり得る。本発明の実施態様において、ｎが１であるコンジュゲートの比率は９０％から９６％である。

ＰＥＧ化エリスロポエチンを含む医薬組成物は当分野で公知であり、例えば、国際特許出願ＷＯ０１／８７３２９号に記載されている。組成物は、前記に定義したように１mlあたり１０〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質を含み得る。好ましくは、組成物は、１mlあたり、１０〜１０００μg、例えば、１０、５０、１００、４００、８００、または２５００μgを含む。さらに、組成物は、１mlあたり１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１０〜２００mmol／ｌのスルファート、１０〜５０mmol／ｌのホスファート（ｐＨ６.０〜６.５）を含み得る。この組成物はまた、２０mMまでのメチオニン、１〜５％のポリオール（w／v）、０.１％までのプルロニックＦ６８（w／v）および場合により１mMまでのＣａＣｌ_２を含み得る。この組成物の例は、１mlあたり１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、４０mmol／ｌのスルファート、１０mmol／ｌのホスファート、３％マンニトール（w／v）、１０mMメチオニン、０.０１％プルロニックＦ６８（w／v）、ｐＨ６.２を含む。代替的に、組成物は、１mlあたり１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１０〜１００mmol／ｌのＮａＣｌ、１０〜５０mmol／ｌのホスファート（ｐＨ６.０〜７.０）、場合により１〜５％（w／v）のポリオールを含み得る。さらに、この組成物は、２０mMまでのメチオニン、０.１％までのプルロニックＦ６８（w／v）、および場合により７.５μmol／ｌのＣａＣｌ_２を含み得る。特に、この組成物は、１mlあたり１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１００mmol／ｌのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、０.０１％のプルロニックＦ６８（w／v）、および１０mmol／ｌのホスファート（ｐＨ７.０）を含み得る。

本発明はまた、１mlあたり１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、１０〜５０mmol／ｌのアルギニン、ｐＨ６〜ｐＨ６.５、１０〜１００mmol／ｌの硫酸ナトリウムを含む前記組成物に関する。さらに、この組成物は、２０mMまでのメチオニン、０.１％までのプルロニックＦ６８（w／v）、場合により１mmol／ｌのＣａＣｌ_２および場合により１〜５％（w／v）のポリオールを含み得る。特に、この組成物は、１mlあたり１０μg〜１００００μgのエリスロポエチンタンパク質、４０mmol／ｌのアルギニン、ｐＨ６.２、３０mmol／ｌの硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w／v）、１０mMのメチオニン、０.０１％プルロニックＦ６８（w／v）および場合により１mmol／ｌのＣａＣｌ_２を含み得る。

本発明の好ましい実施態様は、１０〜１００００μg／mlのエリスロポエチン、好ましくは２５〜２５００μg／mlのエリスロポエチン、および
ａ）１０mMリン酸ナトリウム／カリウム、１００mMのＮａＣｌ、ｐＨ７.０、または
ｂ）１０mMリン酸ナトリウム、１２０mM硫酸ナトリウム、ｐＨ６.２、または
ｃ）１０mMリン酸ナトリウム、４０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w／v）、ｐＨ６.２、または
ｄ）１０mMリン酸ナトリウム、４０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w／v）、１０mMメチオニン、０.０１％プルロニックＦ６８（w／v）、ｐＨ６.２、または
ｅ）４０mMアルギニン、３０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w／v）、ｐＨ６.２、または
ｆ）４０mMアルギニン、３０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w／v）、１０mMメチオニン、０.０１％プルロニックＦ６８（w／v）、ｐＨ６.２
を含む組成物を意味する。

最も好ましい実施態様において、組成物は、５０、１００、４００、８００、または２５００μg／mlの量のエリスロポエチンタンパク質を含む。最も好ましい組成物は、１０mMリン酸ナトリウム、４０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w／v）、１０mMメチオニン、０.０１％プルロニックＦ６８（w／v）、ｐＨ６.２、または４０mMアルギニン、３０mM硫酸ナトリウム、３％マンニトール（w／v）、１０mMメチオニン、０.０１％プルロニックＦ６８（w／v）、ｐＨ６.２を含む。このような組成物のさらなる詳細は、ＷＯ０１／８７３２９号から分かる。

本発明はまた、前記に定義したような有効量のエリスロポエチンタンパク質の投与を含む、糖尿病における鉄分布障害を処置する方法にも関する。さらに、本発明は、有効量のエリスロポエチンタンパク質を含むことを特徴とする、糖尿病における鉄分布障害を処置するための医薬に関する。前記の場合、非インスリン依存型糖尿病が好ましい糖尿病の形態である。

糖尿病における鉄分布の鉄障害の処置において、ＥＰＯを、例えば、１週間に２回、１５０Ｕ／ｋｇ（体重）の用量で投与することができる。用量は、個々の患者の必要性に応じて変更することができ、そしてすなわち１００〜２００Ｕ／ｋｇの範囲でもあり得る。使用するＥＰＯ誘導体の半減期に応じて、用量は、１週間あたり例えば１または３回まで投与することができる。個々の患者の必要性に応じて、医師は異なる用量を選択し得る。

本発明に記載のＥＰＯまたはＥＰＯコンジュゲートの比活性は、当分野で公知の種々のアッセイにより決定することができる。本発明の精製ＥＰＯタンパク質の生物活性は、ヒト患者への注入によるＥＰＯタンパク質の投与により、非注入または対照の対象の群に比べて、網状赤血球および赤血球の産生を増加させる骨髄細胞が得られるようなものである。本発明により得られ精製されたＥＰＯタンパク質またはその断片の生物活性は、Annableら、Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)47:99-112およびPharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio1997(2)に記載の方法により試験することができる。ＥＰＯタンパク質の活性を決定するための別の生物学的アッセイであるノルモシタエミック（normocythaemic）マウスアッセイは当分野に記載されている（例えばPharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)）、およびmonography of erythropoietin of Ph.Eur.BRP.)。

本発明はさらに、本明細書に記載の本発明を説明するものであり制限するものではない以下の実施例を参照することによりより良く理解されるだろう。

実施例
糖尿病に罹患している中高年の女性を、イリノイ州シカゴの２００１年７月２９から８月２日の年会のＡＡＣＣ／ＣＳＣＣで提示されたポスターでP.Lehmann、M.Volkmann、J.Lotz、A.Baldauf、R.Roeddigerにより記載されたように、以下のパラメータ、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、フェリチン、および可溶性トランスフェリン受容体の測定により鉄分布障害について確認した。結果により鉄分布障害が示された。患者に、最大１２週間、１週間に２回、１５０Ｕ／ｋｇのレコルモン（Recormon）(商標)（商業的に入手可能なエリスロポエチンタンパク質）を皮下処置した。その後、前記したようなパラメータの測定により、鉄欠乏疾患の改善が示された。

ヒトＥＰＯの一次構造（１６５アミノ酸）（配列番号１）を示した図である。 ヒトＥＰＯの一次構造（１６６アミノ酸）（配列番号２）を示した図である。

Claims (11)

1. 糖尿病における鉄分布障害の処置用の医薬の製造における、エポエチンベータの使用。
2. 糖尿病が、非インスリン依存型糖尿病である、請求項１の使用。
3. エポエチンベータが、内因性遺伝子活性化により発現される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の使用。
4. エポエチンベータが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の使用。
5. エポエチンベータが、１〜６のグリコシル化部位の付加により修飾された、請求項１又は２に記載の使用。
6. 請求項３〜５のいずれか１項に定義したようなエポエチンベータがＰＥＧ化されている、請求項１又は２に記載の使用。
7. エポエチンベータが、コンジュゲートであり、前記コンジュゲートは、少なくとも１つの遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボ生物活性を有し、１〜６のグリコシル化部位の付加または少なくとも１つのグリコシル化部位の再編成により修飾されたエポエチンベータおよびその類似体からなる群より選択されるエポエチンベータを含み；前記エポエチンベータは、式−ＣＯ−(ＣＨ_２)ｘ−(ＯＣＨ_２ＣＨ_２)_ｍ−ＯＲのｎ個のポリ(エチレングリコール)基に共有結合しており、各々のポリ(エチレングリコール)基の−ＣＯは、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており；式中、Ｒは、低級アルキルであり；ｘは、２または３であり；ｍは、約４５０〜約９００であり；ｎは、１〜３であり；ｎおよびｍは、エポエチンベータの分子量を引いたコンジュゲートの分子量が２０キロダルトンから１００キロダルトンとなるように選択する、請求項６に記載の使用。
8. ｘが２であり、ｍが６５０〜７５０であり、ｎが１であり、Ｒがメチルである、請求項７に記載の使用。
9. エポエチンベータが、コンジュゲートであり、前記コンジュゲートは、少なくとも１つの遊離アミノ基を有し、骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の産生を増加させるインビボ生物活性を有し、１〜６のグリコシル化部位の付加により修飾されたエポエチンベータおよびその類似体からなる群より選択されるエポエチンベータを含み；前記エポエチンベータは、１〜３の低級アルコキシポリ(エチレングリコール)基に共有結合しており、各々のポリ(エチレングリコール)基は、式−Ｃ(Ｏ)−Ｘ−Ｓ−Ｙ−のリンカーを介してエポエチンベータに共有結合しており、リンカーのＣ(Ｏ)は、前記アミノ基の１つとアミド結合を形成しており、Ｘは−(ＣＨ_２)_ｋ−または−ＣＨ_２(Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２)_ｋ−であり、ｋは１〜１０であり、Ｙは
   

   

   であり、各々のポリ(エチレングリコール)部分の平均分子量は、約２０キロダルトンから約４０キロダルトンであり、コンジュゲートの分子量は約５１キロダルトンから約１７５キロダルトンである、請求項６に記載の使用。
10. 式
    

    

    （式中、
    ｎは、１〜３の整数であり；ｍは、４５０〜９００の整数であり、Ｒは、低級アルキルであり；Ｘは、−(ＣＨ_２)_ｋ−または−ＣＨ_２(Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２)_ｋ−であり、ｋは１〜１０であり、Ｐは、Ｘとアミド結合を形成するｎ個のアミノ基を含まないエポエチンベータの残基である）
    で示されるエポエチンベータコンジュゲートの請求項９に記載の使用。
11. 有効量のエポエチンベータを含むことを特徴とする、糖尿病における鉄分布障害を処置するための医薬。

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