KR20050057054A

KR20050057054A - 에리트로포이에틴의 용도

Info

Publication number: KR20050057054A
Application number: KR1020057003501A
Authority: KR
Inventors: 폴 레만; 랄프 로에디거; 루트 발터-마취
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2005-06-16
Also published as: AU2003251713A1; PL209699B1; US20040110679A1; MXPA05002067A; BR0313792A; RU2305554C2; US7459435B2; AU2003251713B2; BRPI0313792B8; JP2006503821A; CA2496581A1; CN1311866C; PL375784A1; EP1536823B1; CA2496581C; ATE510556T1; RU2005108976A; JP5128048B2; EP1536823A1; ES2364651T3

Abstract

본 발명은 당뇨병에서 철 분포 장애를 치료하기 위한 에리트로포이에틴의 용도에 관한 것이다.

Description

에리트로포이에틴의 용도{USE OF ERYTHROPOIETIN}

본 발명은 에리트로포이에틴의 신규한 용도, 특히 당뇨병에서 철 분포 장애를 치료하는 용도에 관한 것이다.

많은 당뇨병은 철 대사가 정상적이지 않은 것으로 공지되어 있다. 빈혈에서는 신체 전반에 걸쳐 철의 결핍으로 인하여 충분한 혈액이 형성될 수 없다. 철과 관련된 기타 대사 증상은 신체에서 철의 전체 농도가 정상보다 높은 혈색소침착증으로서 다양한 증상, 예컨대 기관의 파괴를 야기시킨다.

신체에서 철의 전체 농노는 정상적이기 때문에 철 분포 장애는 전술한 빈혈 및 혈색소침작증과는 다르다. 한편, 철은 다양한 기관에 침착되어 이러한 기관의 손상 및 심지어 파괴를 유도할 수 있다. 반면, 혈액의 형성에서 정상적인 양으로 존재하는 철의 용도는 빈혈과 관련된 것과 필적할 만한 2차적인 효과를 유도하여 손상시킨다.

현재까지 당뇨병 환자는 철 분포의 장애에 의해 영향을 받을 확률이 높다는 사실이 공지되어 있지 않다. 철 분포의 장애는 철 상태의 진단에서 일반적으로 사용되는 다양한 매개변수에 의해 진단될 수 있다. 페리틴 및 가용성 트랜스페린 수용체의 측정을 기준으로 하여 당뇨병 환자에서 철의 전체 농도의 정상여부를 평가할 수 있다. 이러한 경우, 세망세포에서 헤모글로빈의 낮아진 농도는 철 분포의 장애에 대한 지표가 된다. 또다른 지표는 당뇨병 환자 및 전체 철 이온이 정상으로 나타나는 환자에서 C-반응성 단백질(CRP)의 연속적/지속적으로 증가된 농도이다. 철 분포의 장애를 진단하는 방법은 미국 일리노이주 시카고에서 2001년 7월 29에서 8월 2일까지 AACC/CSCC 연간 회의에서 포스터 발표된 문헌[P. Lehmann, M. Volkman, J. Lotz, A. Baldaut, R. Roeddiger]에 개시되어 있다.

지금까지, 철 분포에서의 장애를 겪고 있는 당뇨병 환자에 대하여 이러한 치료가 제한된 바가 없었다. 따라서, 본 발명의 동기가 되는 문제점은 전술된 단점을 최소화하거나 억제하기 위하여 당뇨병에서 철 분포의 장애에 대한 치료를 제공하는 것이다. 놀랍게도, 에리트로포이에틴이 당뇨병에서 철 분포의 장애에 대한 유리한 효과를 갖는다는 것이 발견되었다. 따라서, 당뇨병에서 철 분포의 장애를 치료하는데 에리트로포이에틴을 제공함으로써 본 발명에 따라 이러한 문제점이 해결된다.

달리 언급이 없는 한, 하기 용어들은 본원을 설명하는데 사용되는 다양한 용어의 의미 및 범주를 예시하고 정의하는 것이다.

본원에서 사용된 "저급 알킬"이란 용어는 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 알킬 기를 의미한다. 저급 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸 및 아이소프로필, 바람직하게는 메틸을 들 수 있다.

본원에서 사용된 "저급 알콕시"란 용어는 기 R'-O(여기에서, R'는 상기에서 정의한 바와 같은 저급 알킬이다)를 의미한다.

"당뇨병에서 철 분포의 장애"란 용어는 당뇨병 환자에서 일어나는 철 분포의 장애를 언급하는 것이다. 철 분포의 장애는 예를 들어 전술한 바와 같이 특성화될 수 있다. 특히, 철 분포의 장애는 다음 매개변수로 특성화될 수 있다: log(페리틴의 농도[㎍/ℓ])에 의해 나누어지는 가용성 트랜스페린 수용체의 농도(mg/ℓ)가 3.5 보다 작으며 동시에 C-반응성 단백질의 농도가 5mg/ℓ 보다 높다.

"에리트로포이에틴" 또는 "에리트로포이에틴 단백질"이란 용어는 골수세포가 세망세포 및 적혈구의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 갖는 단백질을 언급하는 것으로, 인간 에리트로포이에틴 및 하기에 정의되는 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

"페길화 에리트로포이에틴(Peg-EPO 또는 PEG-EPO)"라는 용어는 하기에 정의되는 바와 같이 1 내지 3개의 폴리에틸렌 유도체와 공유결합되는 에리트로포이에틴 단백질을 언급하는 것이다.

도 1은 인간 EPO(165개의 아미노산)(서열번호 :1)의 일차 구조이다.

도 2는 인간 EPO(166개의 아미노산)(서열번호 :2)의 일차 구조이다.

보다 상세하게, 본 발명은 당뇨병에서 철 분포의 장애 치료용 약제를 제조하기 위한 에리트로포이에틴의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 용도에 관한 것으로, 여기에서 당뇨병은 비인슐린 의존성 당뇨병이다.

본 발명은 특히 약학 활성 성분으로서 에리트로포이에틴을 포함하는 약학 조성물의 제조에 유용하다. "에리트로포이에틴" 또는 "에리트로포이에틴 단백질" 또는 "EPO"란 용어는 하기와 같다: 특히 당단백질, 예를 들어 인간 에리트로포이에틴, 예를 들어 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열, 또는 생물학적 성질이 적혈구 생산의 자극 및 골격에서 예탁된 적혈구 전구체의 분리 및 분화의 자극과 관련되는, 상기 아미노산과 실제로 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 인간 에리트로포이에틴을 언급한다. 본원에서 사용되는 이러한 용어들은 계획적으로 변형된 단백질, 예를 들어 특정부위 돌연변이 또는 우연한 돌연변이를 통해 변형된 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 글라이코실화를 위한 1 내지 6개의 부가적 부위를 갖는 유사체, 당단백질의 카복시 말단에서 하나 이상의 부가적 아미노산을 갖는 유사체(이 때 부가적 아미노산은 하나 이상의 글라이코실화 부위를 포함한다), 및 글라이코실화를 위한 하나 이상의 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체도 포함한다. 이러한 용어는 모두 천연 및 재조합으로 제조된 인간 에리트로포이에틴을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 에리트로포이에틴 단백질은 인간 에리트로포이에틴이다.

하기에 상세하게 설명하는 바와 같이, EPO의 제조 및 정제는 당분야에 공지되어 있다. 에리트로포이에틴라는 용어는 임의의 통상적인 근원, 예컨대 조직, 단백질 합성, 천연 또는 재조합 세포를 사용하는 세포 배양으로 수득된, 천연 또는 재조합 단백질, 바람직하게 인간, 예를 들어 에포에틴 알파 또는 에포에틴 베타를 의미하는 것이다. 에리트로포이에틴, 예컨대 돌연변이체 또는 달리 변형된 단백질의 활성을 갖는 임의의 단백질도 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 에리트로포이에틴 단백질은 에포에틴 알파 또는 에포에틴 베타이다. 재조합 EPO는 재조합 DNA 기술 또는 내인성 유전자 활성화에 의해 CHO-, BHK- 또는 헬라(HeLa) 세포주에서 발현을 통해 제조될 수 있다. 내인성 유전자의 활성화에 의한 단백질의 발현은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,733,761 호, 제 5,641,670 호 및 제 5,733,746 호 및 국제 특허공개 제 93/09222 호, 제 94/12650 호, 제 95/31560 호, 제 90/11354 호, 제 91/06667 호 및 제 91/09955 호에 개시되어 있으며, 각 문헌의 내용은 본원에서 참조로서 인용된다. 전술한 바와 같이, 내인성 유전자 활성화에 의해 발현되는 에리트로포이에틴 단백질이 용도가 바람직하다. 에리트로포이에틴 당단백질 산물의 제조를 위해 바람직한 EPO 종은 인간 EPO 종이다. 보다 바람직하게, EPO 종은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 EPO, 보다 바람직하게는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 EPO이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시태양은 전술한 바와 같이, 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 에리트로포이에틴 단백질의 용도에 관한 것이다.

또한, 에리트로포이에틴은 글라이코실화를 위한 1 내지 6개의 부가적 부위를 갖는 당단백질 유사체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 전술한 바와 같이, 1 내지 6개의 글라이코실화 부위의 부가에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 에리트로포이에틴 단백질의 용도에 관한 것이다. 하나 이상의 올리고사카라이드 기를 사용하는 단백질의 글라이코실화는 폴리펩타이드의 골격에 따라 특정한 위치에서 일어나며, 단백질의 물리적 성질, 예컨대 단백질 안정성, 분비, 아세포성 국소화 및 생물학적 활성에 크게 영향을 미친다. 글라이코실화는 대개 두 개의 유형이다. O-결합된 올리고사카라이드는 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착되어 있으며, N-결합된 올리고사카라이드는 아스파라긴 잔기에 부착되어 있다. N-결합되고 O-결합된 올리고사카라이드에서 발견되는 하나의 유형의 올리고사카라이드는 탄소수 9 이상의 아미노 당 종인 N-아세틸뉴라민산(시알산)이다. 시알산은 대개 N-결합되고 O-결합된 올리고사카라이드 상의 말단 잔기이며, 이는 음극 전하를 가지므로 당단백질에 대한 산성 성질을 부여한다. 165개의 아미노산을 갖는 인간 에리트로포이에틴은 당단백질의 전체 분자량의 약 40%를 포함하는 세 개의 N-결합되고 하나의 O-결합된 올리고사카라이드 사슬을 함유한다. N-결합된 글라이코실화는 24, 38 및 83 위치의 아스파라긴 잔기에서 일어나며, O-결합된 글라이코실화는 126 위치의 세린 잔기에서 일어난다. 올리고사카라이드 사슬은 말단 시알산 잔기를 사용하여 변형된다. 에리트로포이에틴의 시알화는 간 결합 단백질에 의해 이의 결합 및 후속 간극(clearance)을 방지하므로 글라이코실화된 에리트로포이에틴로부터 모든 시알산 잔기의 효소적인 제거는 생체외 활성이 아닌 생체내 활성의 손실을 가져온다.

"에리트로포이에틴"라는 용어는 시알산 부착을 위한 부위 수의 증가를 유발하는 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 변화를 갖는 인간 에리트로포이에틴의 유사체를 포함한다. 이러한 당단백질 유사체는 부가, 삭제 또는 글라이코실화를 위해 입수가능한 부위를 증가시키거나 변환시키는 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 특정부위 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 인간 에리트로포이에틴에서 발견되는 것보다 많은 양의 시알산을 갖는 당단백질 유사체는 생물학적 활성을 위해 요구되는 2차 또는 3차 구조를 교란시키지 않는 글라이코실화 부위를 부가시킴으로써 제조된다. 본 발명의 글라이코실화는 또한 대개 N-결합되거나 또는 O-결합된 부위에 아주 근접한 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 글라이코실화 부위에서 증가된 탄수화물의 부착 정도를 갖는 유사체도 포함한다. 또한, 본 발명의 글라이코실화는 에리트로포이에틴의 카복시 말단으로부터 확장되고 하나 이상의 부가적인 탄화수소 부위에 제공되는 하나 이상의 아미노산을 갖는 유사체를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물의 에리트로포이에틴 단백질은 글라이코실화를 위한 하나 이상의 부위에서의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체를 포함한다. 이러한 글라이코실화 부위의 재배열은 인간 에리트로포이에틴에서 하나 이상의 글라이코실화 부위의 삭제 및 비천연적으로 일어나는 하나 이상의 글라이코실화 부위의 부가를 포함한다. 에리트로포이에틴에서 탄화수소 사슬 수를 증가시키는 에리트로포이에틴 분자 당 시알산의 수는 유리한 성질, 예컨대 증가된 가용성, 단백질 분해에 대한 높아진 내성, 감소된 면역원성, 증가된 혈청 반감기 및 증가된 생물학적 활성을 부여할 수 있다. 부가적 글라이코실화 부위를 갖는 에리트로포이에틴 유사체는 엘리오트(Elliot)에 의해 1995년 3월 1일자로 공개된 유럽 특허 출원 제 640 619 호에 상세하게 기술되어 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 부가적 글라이코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 에리트로포이에틴 단백질을 포함한다. 이의 예로는 하기로부터 선택된 변형에 의해 변이된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 포함하는 에리트로포이에틴을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다:

본원에서 사용되는 아미노산 서열의 변형에 대한 주석은 위첨자 숫자(들)로 지시되는 상응하는 불변형된 단백질(예를 들어 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 hEPO)의 위치가 각 위첨자 숫자(들) 바로 앞에 있는 아미노산으로 변형된 것을 의미한다.

에리트로포이에틴 단백질은 당단백질의 카복시 말단에서 하나 이상의 부가적 아미노산을 갖는 유사체일 수 있으며, 이 때 부가적 아미노산은 하나 이상의 글라이코실화 부위를 포함한다. 부가적 아미노산은 인간 융모생식샘자극호르몬의 카복시 말단으로부터 유도된 펩타이드 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게, 당단백질은 (a) 카복시 말단으로부터 연장되는 아미노산 서열, Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln을 갖는 인간 에리트로포이에틴; (b) Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO를 추가로 포함하는 상기 (a)의 유사체; 및 (c) Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO를 추가로 포함하는 상기 (a)의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 유사체이다.

또한, 에리트로포이에틴 단백질은 글라이코실화를 위한 하나 이상의 부위의 재배열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유사체일 수 있다. 재배열은 인간 에리트로포이에틴에서 임의의 N-결합된 탄화수소 부위의 삭제 및 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열의 88번 위치에서 N-결합된 탄화수소 부위의 부가를 포함할 수 있다. 바람직하게, 당단백질은 Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; 및 Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO로 이루어진 군으로부터 선택된 유사체이다. 추가의 유사체는 다베포에틴 알파이다. 전술된 사용에서 바람직한 에리트로포이에틴 단백질은 다베포에틴 알파이다.

보다 상세하게, 전술한 바와 같은 본 발명의 약학 조성물의 에리트로포이에틴 단백질은 이의 페길화 유도체를 포함할 수도 있다. 에리트로포이에틴의 페길화 유도체 및 이의 제조방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 특허공개 제 01/02017 호, 유럽 특허공개공보 제 1064951 호, 제 539,167 호, 제 605,963 호, 국제 특허공개 제 93/25212 호, 제 94/20069 호, 제 95/11924 호, 미국 특허 제 5,56, 호, 유럽 특허공개공보 제 584,876 호, 국제 특허공개 제 92/16555 호 제 94/28024 호, 제 97/04796 호, 미국 특허 제 5,359,030 호, 제 5,681,811 호, 제 4,179,337 호, 국제 특허공개 제 98/32466 호, 미국 특허 제 5,324,650 호에 개시되어 있다. 전술한 용도에서 바람직하게, 에리트로포이에틴 단백질은 페길화된다. 페길화 에리트로포이에틴 종의 바람직한 실시태양은 전술한 바와 같은 유도체를 언급한다.

따라서, 본 발명은 또한 전술한 바와 같은 용도를 제공하며, 이 때 에리트로포이에틴 단백질은 접합체이고, 상기 접합체는 전술한 바와 같이 하나 이상의 유리 아미노 기를 갖고 골수세포가 세망세포 및 적혈구의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 갖는 에리트로포이에틴 단백질을 포함하고, 인간 에리트로포이에틴 및 1 내지 6개 글라이코실화 부위의 부가 또는 하나 이상의 글라이코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 적혈구의 서열을 갖는 이의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 에리트로포이에틴은 상기 하나의 아미노 기와 아마이드 결합을 형성하는 각 폴리(에틸렌 글리콜)의 -CO(즉, 카보닐)를 갖는 화학식 -CO-(CH₂)_X-(OCH₂CH₂)_m-OR의 n개 폴리(에틸렌 글리콜) 기(여기에서, R은 저급 알킬이고; x는 2 또는 3이고; m은 약 450 내지 약 900이고; n은 1 내지 3이되, n 및 m은 접합체에서 에리트로포이에틴 단백질을 뺀 분자량이 20 내지 100kDa이 되도록 선택된다)와 공유결합된다. 본 발명은 또한 접합체(여기서 n은 1이다)의 분율이 조성물의 총 접합체의 90% 이상, 바람직하게 92% 이상, 보다 바람직하게 96%인 본원에 개시된 접합체를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

보다 상세하게, 상기 접합체는 하기 화학식 I로 표시될 수 있다:

P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n

상기 식에서,

P는 골수세포가 세망세포 및 적혈구의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 갖는 화학식 I에 나타낸 카보닐과 아마이드 결합을 형성하는 아미노 기 또는 아미노 기들을 함유하지 않는 본원에서 정의된 바와 같은 에리트로포이에틴 단백질의 잔기이고;

R은 저급 알킬이고;

x는 2 또는 3이고;

m은 약 450 내지 약 900이고;

n은 1 내지 3이되, n 및 m은 접합체에서 에리트로포이에틴 단백질을 뺀 분자량이 20 내지 100kDa이 되도록 선택된다.

본 발명에 따라, R은 임의의 저급 알킬이다. R이 메틸인 접합체가 바람직하다.

"m"의 의미는 폴리(에틸렌 옥사이드)기에서 에틸렌 옥사이드 잔기(OCH₂CH₂)의 수를 나타내는 것이다. 에틸렌 옥사이드의 단일 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 단위는 약 44Da의 분자량을 갖는다. 따라서, 접합체의 분자량(EPO의 분자량은 배제됨)은 숫자 "m"에 의해 좌우된다. 본 발명의 접합체에서, "m"은 약 450 내지 약 900(약 20 내지 약 40kDa의 분자량과 상응함), 바람직하게 약 650 내지 약 750(약 30kDa의 분자량과 상응함)이다. 숫자 m은 본 발명에서 생성되는 접합체가 불변형된 EPO에 필적할 수 있을 정도의 동일하거나 이상인 물리적 활성을 갖거나 또는 불변형된 EPO의 상응하는 활성 분획을 가지도록 선택된다. "약"의 분자량은 특정 수가 통상적인 분석 기술에 의해 측정되는 바와 같은 수의 이론적인 범위내에 있는 것을 의미한다. 숫자 "m"은 에리트로포이에틴 당단백질에 공유결합된 각 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량이 약 20 내지 약 40kDa, 바람직하게는 약 30kDa가 되도록 선택된다.

본 발명의 접합체에서, 숫자 "n"은 아마이드 결합을 통해 에리트로포이에틴 단백질의 유리 아미노 기(리신 아미노산의 ε-아미노 기 및/또는 아미노 말단 아미노기를 포함함)와 공유결합된 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 수이다. 본 발명의 접합체는 EPO 분자 당 1, 2 또는 3개의 PEG 기를 가질 수 있다. "n"은 1 내지 3의 정수, 바람직하게는 1 또는 2, 보다 바람직하게는 1이다. 전술한 접합체 중 바람직한 접합체는 x가 2이고, m이 650 내지 750이고, n이 1이고, R이 메틸인 화합물을 포함한다,

화학식 I의 화합물은 하기 화학식 II의 화합물을 에리트로포이에틴 당단백질과 축합시킴으로써 하기 화학식 II의 공지된 중합성 물질로부터 제조될 수 있다:

상기 식에서,

R 및 m은 상기에서 정의된 바와 같다.

x가 3인 화학식 II의 화합물은 알파-저급 알콕시 폴리(에틸렌 글리콜)의 부티르산 숙신이미딜 에스터(저급 알콕시-PEG-SBA)이다. x가 2인 화학식 II의 화합물은 알파-저급 알콕시 폴리(에틸렌 글리콜)의 프로피온산 숙신이미딜 에스터(저급 알콕시-PEG-SPA)이다. 활성화 에스터를 아민과 반응시켜 아마이드를 형성하는 임의의 통상적인 방법이 유용할 수 있다. 전술한 반응에서, 예시된 숙신이미딜 에스터는 아마이드 형성을 유발하는 이탈기이다. 단백질을 갖는 접합체를 제조하기 위한 화학식 II의 화합물과 같은 숙신이미딜 에스터의 용도는 1997년 9월 30일자로 등록된 해리스(Harris) 등의 미국 특허 제 5,672,662 호에 개시되어 있다.

인간 EPO는 아미노 말단 아미노 기와 8개의 리신 잔기의 ε-아미노 기를 합한 9개의 유리 아미노 잔기를 함유한다. 페길화 시약이 화학식 II의 SBA 화합물과 조합될 때, pH 7.5, 1:3의 단백질:PEG의 비율 및 22 내지 25℃의 반응온도에서 모노-, 다이- 및 미량의 트라이-페길화 종의 혼합물이 생성된다. 페길화 시약이 화학식 II의 SPA 화합물일 때, 단백질:PEG의 비율이 1:2인 것을 제외하고 유사한 조건에서 주로 모노-페길화 종이 생성된다. 페길화 EPO는 혼합물로서 또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리된 상이한 페길화 종으로서 투여될 수 있다. 반응 조건(예를 들어 시약 비율, pH, 온도, 단백질 농도, 반응 시간 등)을 조절함으로써 상이한 페길화 종의 상대적인 양을 변화시킬 수 있다.

또한 본 발명의 바람직한 실시태양은 전술한 바와 같은 용도에 관한 것으로, 이 때 에리트로포이에틴 단백질이 접합체이고, 상기 접합체가 전술한 바와 같이 하나 이상의 유리 아미노 기를 갖고 골수세포가 세망세포 및 적혈구의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 갖는 에리트로포이에틴 단백질을 포함하고, 인간 에리트로포이에틴 및 1 내지 6개 글라이코실화 부위의 부가 또는 하나 이상의 글라이코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 일차 구조를 갖는 이의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 에리트로포이에틴 단백질이 1 내지 3개의 저급 알콕시 폴리(에틸렌 글리콜) 기와 공유결합되고, 각 폴리(에틸렌 글리콜) 기가 하나의 상기 아미노 기와 아마이드 결합을 형성하는 링커의 C(O)를 갖는 화학식 -C(O)-X-S-Y-(여기에서, X는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k이고, k는 1 내지 10이고, Y는

또는 이다)의 링커를 통해 에리트로포이에틴 단백질과 공유결합되어 있고, 각 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기의 평균 분자량은 약 20 내지 약 40kDa이고, 접합체의 분자량은 약 51 내지 약 175kDa이다.

이러한 에리트로포이에틴 종은 또한 하기 화학식 III으로 표시될 수 있다:

P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n

상기 식에서,

R은 임의의 저급 알킬이다.

바람직한 저급 알킬은 메틸이다. X는 -(CH₂)k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)k-일 수 있으며, 여기에서 k는 1 내지 약 10이다. 바람직하게 k는 1 내지 약 4, 보다 바람직하게 k는 1 또는 2이다. 가장 바람직하게 X는 -(CH₂)이다.

화학식 I에서, Y는 또는 , 바람직하게는 또는 , 보다 바람직하게는 이다.

화학식 III에서, 숫자 m은 화학식 III의 생성된 접합체가 불변형된 EPO에 필적할 수 있을 정도의 동일하거나 이상인 물리적 활성을 갖거나 또는 불변형된 EPO의 상응하는 활성 분획을 가지도록 선택된다. m은 PEG 단위에서 에틸렌 옥사이드 잔기의 수를 나타낸다. -(OCH₂CH₂)-의 단일 PEG 아단위는 약 44Da의 분자량을 갖는다. 따라서, 접합체의 분자량(EPO의 분자량은 배제됨)은 숫자 m에 의해 좌우된다. "약"의 분자량은 특정 수가 통상적인 분석 기술에 의해 측정되는 바와 같은 수의 이론적인 범위내에 있는 것을 의미한다. m은 약 450 내지 약 900(약 20 내지 약 40kDa의 분자량과 상응함), 바람직하게 약 550 내지 약 800(약 24 내지 35kDa), 가장 바람직하게 약 650 내지 700(약 29 내지 약 31kDa) 범위의 정수이다.

화학식 III에서, 숫자 n은 아마이드 결합을 통해 PEG 단위에 공유결합된 에리트로포이에틴 단백질에서 리신 아미노산의 ε-아미노 기의 수이다. 본 발명의 접합체는 EPO 분자 당 1, 2 또는 3개의 단위를 가질 수 있다. n은 1 내지 3의 정수, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1이다.

화학식 III의 바람직한 에리트로포이에틴 단백질은 하기 화학식 IV 및 V로 표시될 수 있다:

[상기 식에서,

n은 1 내지 3의 정수이고;

m은 450 내지 900의 정수이고;

R은 저급 알킬이고;

X는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-이고;

P는 X와의 아마이드 결합을 형성하는 아미노 기 또는 기들을 함유하지 않는 에리트로포이에틴 단백질의 잔기이다].

본 발명의 가장 바람직한 실시태양에서, 에리트로포이에틴 접합체는 하기 화학식 V으로 표시될 수 있다:

화학식 V

[상기 식에서,

n은 1 내지 3의 정수이고;

m은 450 내지 900의 정수이고;

R은 저급 알킬이고;

X는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-이고;

이외의 바람직한 에리트로포이에틴 당단백질 산물은 하기 화학식들로 표시될 수 있다:

및

보다 바람직한 에리트로포이에틴 당단백질 산물은 하기 화학식으로 표시될 수 있다:

이러한 에리트로포이에틴 단백질은 하기 (a) 및 (b) 단계에 의해 제조될 수 있다:

(a) 화학식 P-[NH₂]_n으로 표시되는 에리트로포이에틴 단백질의 ε-아미노 기를 화학식 Z-CO-X-S-Q로 표시되는 이-작용성 시약과 공유적으로 반응시켜 하기 화학식으로 표시되는 아마이드 결합을 갖는 중간물질을 형성시키는 단계:

P-[NH-CO-X-S-Q]_n

[상기 식에서,

P는 아마이드 결합을 형성하는 아미노 기가 없는 에리트로포이에틴 단백질이고;

n은 1 내지 3의 정수이고;

Z는 반응성 기, 예를 들어 카복실-NHS 에스터이고;

X는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-이고;

k는 1 내지 약 10이고;

Q는 알카노일 같은 보호기, 예를 들어 아세틸이다]; 및

(b) 상기 (a)에서 수득된 중간물질을 화학식 W-[OCH₂CH₂]_m-OR로 표시되는 활성화 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체와 공유적으로 반응시켜 하기 화학식으로 표시되는 에리트로포이에틴 당단백질 산물을 형성시키는 단계:

[상기 식에서,

W는 Y의 설프히드릴 반응성 형태이고;

m은 약 450 내지 약 900의 정수이고;

R은 저급 알킬이고;

Y는 상기에서 정의한 바와 같다].

본 실시태양에서, 이-작용성 시약은 바람직하게 N-수신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트 또는 N-수신이미딜-S-아세틸티오아세테이트이고, Z는 바람직하게 N-하이드록시-수신이미드이고, 활성화 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체 W-[OCH₂CH₂]_m-OR는 바람직하게 요오도-아세틸-메톡시-PEG, 메톡시-PEG-바이닐설폰 및 메톡시-PEG-말레이미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

보다 상세하게, 화학식 III의 에리트로포이에틴 단백질은 EPO에 티올 기를 공유결합시키고("활성화"), 생성된 활성화 EPO를 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 유도체와 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 따라 페길화 EPO를 제조하는 제1 단계는 EPO의 NH₂- 기를 통해 티올 기를 공유결합시키는 것을 포함한다. 이러한 EPO의 활성화는 티올 기 및 부가적 반응성 기, 예컨대 활성 에스터(예를 들어 숙신이미딜에스터), 무수물, 설폰산 에스터, 카복실산 및 설폰산의 할로겐화물 각각의 보호화를 수행하는 이-작용성 시약을 사용하여 수행된다. 티올 기는 당분야에 공지된 기, 예를 들어 아세틸 기에 의해 보호된다. 이러한 이-작용성 시약은 아마이드 결합을 형성함으로써 리신 아미노산의 ξ-아미노 기와 반응할 수 있다. 이 반응의 제1 단계는 하기 반응식 1과 같다:

상기 식에서,

EPO, n 및 X는 상기에서 정의된 바와 같고;

Z는 당분야에 공지된 반응성 기, 예를 들어 하기 화학식의 N-하이드록시-숙신이미드(NHS) 치환기이다:

바람직한 실시태양에서, ε-아미노 리신 기의 활성화는 숙신이미딜 잔기를 갖는 이-작용성 시약과 반응함으로써 수행된다. 이-작용성 시약은 상이한 공간 기, 예를 들어 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_k- 잔기를 가질 수 있으며, 이 때 k는 1 내지 약 10, 바람직하게는 1 내지 약 4, 보다 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1이다. 이러한 시약의 예로는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트(SATP) 및 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)가 있다.

아세틸티오알킬-카복실-NHS-에스터, 등

또는

2-(아세틸티오)-(에톡시)_k-아세트산-NHS-에스터

[여기에서, k는 상기에서 정의한 바와 같다]

이-작용성 시약의 제조는 당분야에 공지되어 있다. 2-(아세틸티오)-(에톡시)_k-아세트산-NHS-에스터의 전구체는 독일 특허 제 3924705 호에 개시되어 있으며, 아세틸티오 화합물로의 유도체화는 문헌[March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376]에 개시되어 있다. SATA는 상업적으로 입수가능하다(몰레쿨라 프로브, 유진(Moclecular Probes, Eugene, 미국 오레곤주 소재) 및 피어스 락포드(Pierce, Rockford, 미국 일리노이주 소재).

EPO 분자에 부가될 티올 기의 수는 반응 매개변수, 즉 단백질(EPO) 농도 및 단백질/이-작용성 시약의 비율을 조정함으로써 선택될 수 있다. 바람직하게, EPO는 EPO 분자 당 1 내지 5의 티올 기, 보다 바람직하게는 EPO 분자당 1.5 내지 3개의 티올 기를 공유결합시킴으로써 활성화된다. 이 범위는 EPO 단백질 군집의 전체에 대한 티올 기의 통계적인 분포를 언급하는 것이다.

이 반응은 예를 들어 완충 수용액(pH 6.5 내지 8.0, 예를 들어 10mM 인산칼륨, 50mM NaCl, pH 7.3)에서 수행된다. 이-작용성 시약은 DMSO 중에 첨가될 수 있다. 반응 종료 후, 바람직하게 약 30분 후, 리신을 첨가시킴으로써 반응을 중시시킨다. 과량의 이-작용성 시약은 당분야의 공지된 방법, 예를 들어 투석 또는 칼럼 여과에 의해 분리될 수 있다. EPO에 부가될 티올 기의 평균 수는 예를 들어 문헌[Grasetti, D.R. and Murray, J.F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49(1967)]에 개시된 광도 측정 방법에 의해 측정될 수 있다.

이어서, 활성화 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 유도체의 공유 커플링 반응이 수행된다. 적합한 PEG 유도체는 약 20 내지 약 40kDa, 보다 바람직하게 약 24 내지 약 35kDa, 가장 바람직하게 약 30kDa의 평균 분자량을 갖는 활성화 PEG 분자이다. 활성화 PEG 유도체는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 PEG-바이닐설폰 에 대한 문헌[Morpurgo, M. et al., J. Bioconj. Chem.(1996) 7, page 363 ff]에 개시되어 있다. 직쇄 및 분지쇄 PEG 종은 화학식 I의 화합물의 제조에 적합하다. 반응성 PEG 시약의 예로는 요오도-아세틸-메틸-PEG 및 메톡시-PEG-바이닐설폰을 들 수 있다:

또는

이러한 요오도-활성화 물질의 용도는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Hermanson, G. T. in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148]에 개시되어 있다.

가장 바람직하게, PEG 종은 (저급 알콕시-PEG-말레이미드), 예컨대 메톡시-PEG-말레이미드(분자량 30000; 시어워터 폴리머 인코포레이티드(Shear water Polymers, Inc.)를 사용하여 말레이미드에 의해 활성화된다. 저급 알콕시-PEG-말레이미드의 구조는 하기 화학식과 같다:

또는

바람직하게는

이다.

[상기 식에서,

R 및 m은 상기에서 정의한 바와 같다].

저급 알콕시-PEG-말레이미드와 커플링 반응은 완충 수용액(예를 들어 10mM 인산칼륨, 50mM NaCl, 2mM EDTA, pH 6.2)에서 티올 보호 기의 절단 후 일어난다. 보호 기의 절단은 예를 들어 25℃에서 약 90분동안 DMSO 중에서 하이드록실아민을 사용하여 수행될 수 있다. PEG 변형을 위해 활성화 EPO/저급 알콕시-PEG-말레이미드의 비율은 약 1:3 내지 약 1:6, 바람직하게는 약 1:4이어야 한다. 반응은 시스테인의 첨가 및 잔류하는 티올(-SH) 기와 N-메틸말레이미드 또는 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는 기타 적합한 화합물의 반응으로 중지될 수 있다. 임의의 잔류하는 활성 티올 기와 보호 기, 예컨대 N-메틸말레이미드 또는 기타 적합한 보호 기의 반응으로 인하여, 본 발명의 접합체에서 EPO 당단백질은 이러한 보호 기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 공정은 PEG-말레이미드에 접합되지 않는 당단백질 상에 활성화 티올 기의 수에 의존하여, 보호 기의 상이한 수에 의해 보호된 티올의 다양한 수를 갖는 분자 혼합물을 제조할 것이다.

페길화 단백질 상에 티올 기가 잔류하는 것을 블록킹하기 위해 사용될 때 N-메틸말레이미드는 공유결합의 동일 유형을 형성하지만, 다이설파이드 화합물은 블록킹제의 다이설파이드 가교 커플링에 대한 분자간 설파이드/다이설파이드 교환 반응에서 유도될 것이다. 블록킹 반응을 위한 바람직한 유형희 블록킹제는 산화된 글루타티온(GSSG), 시스테인 및 시스타민이다. 부가적인 전체 전하를 갖지 않는 시스테인을 사용하여 페길화 단백질이 유도되므로, 블록킹제 GSSG 또는 시스타민의 사용은 부가적인 음전하 또는 양전하를 유발한다.

모노-, 다이- 및 트라이-페길화 EPO 종의 분리를 비롯한 화학식 III의 화합물의 추가의 정제는 당분야에 공지된 방법, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.

페길화 에리트로포이에틴 유도체는 바람직하게 90% 이상의 모노-PEG 접합체를 함유한다. 대개 에리트로포이에틴 당단백질의 모노-PEG 접합체는 다이-PEG 접합체보다 높은 활성을 갖는 경향이 있어 바람직하다. 모노-PEG 접합체의 분율 뿐만 아니라 모노- 및 다이-PEG 종의 비율은 조성물 중의 모노-PEG의 분율을 감소시키기 위해 용출 피크 주변의 보다 광범위한 분획을 풀링(pooling)시키거나 또는 조성물 중의 모노-PEG의 분율을 증가시키기 위해 보다 협소한 분획을 풀링시킴으로써 조절될 수 있다. 약 90% 모노-PEG 접합체는 수율 및 활성 면에서 양호한 균형를 갖는다. 때때로 예를 들어 92% 이상 또는 96% 이상의 접합체가 모노-PEG 종(n은 1임)인 조성물이 요구될 수 있다. 본 발명의 실시태양에서, 접합체(여기서 n은 1이다)의 분율은 90 내지 96%이다.

페길화 에리트로포이에틴을 포함하는 약학 조성물은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 특허공개 제 01/87329 호에 개시되어 있다. 조성물은 전술한 바와 같이 1ml 당 10 내지 10000㎍의 에리트로포이에틴 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게, 조성물은 1ml 당 10 내지 10000㎍, 예를 들어 10, 50, 100, 400, 800 또는 2500㎍을 포함한다. 또한, 조성물은 1ml 당 10 내지 10000㎍ 에리트로포이에틴 단백질, 10 내지 200mmol/ℓ 설페이트, 10 내지 50mmol/ℓ 포스페이트, pH 6.0 내지 6.5를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 20mM 이하의 메티오닌, 1 내지 5%의 폴리올(w/v), 0.1% 이하의 플루론성 F68(w/v) 및 선택적으로 1mM 이하의 CaCl₂를 포함할 수도 있다. 이러한 조성물의 예는 1ml 당 10 내지 10000㎍ 에리트로포이에틴 단백질, 40mmol/ℓ 설페이트, 10mmol/ℓ 포스페이트, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메티오닌, 0.01% 플루론성 F68(w/v), pH 6.2를 포함한다. 택일적으로, 조성물은 1ml 당 10 내지 10000㎍ 에리트로포이에틴 단백질, 10 내지 100mmol/ℓ NaCl, 10 내지 50mmol/ℓ 포스페이트, pH 6.0 내지 7.0, 선택적으로 1 내지 5%(w/v)의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 20mM 이하의 메티오닌, 0.1 이하의 플루론성 F68(w/v) 및 선택적으로 7.5μmol/ℓ CaCl₂를 포함할 수 있다. 특정하게, 이러한 조성물은 1ml 당 10 내지 10000㎍ 에리트로포이에틴 단백질, 100mmol/ℓ NaCl, 10mM 메티오닌, 0.01% 플루론성 F68(w/v) 및 10mmol/ℓ 포스페이트, pH 7.0을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 1ml 당 10 내지 10000㎍ 에리트로포이에틴 단백질, 10 내지 50mmol/ℓ 아르기닌, pH 6.0 내지 6.5, 10 내지 100mmol/ℓ 황산나트륨을 포함하는 조성물을 언급한다. 추가로, 이러한 조성물은 20mM 이하의 메티오닌, 0.1% 이하의 플루론성 F68(w/v), 선택적으로 1mmol/ℓ 이하의 CaCl₂ 및 선택적으로 1 내지 5%(w/v)의 폴리올을 포함할 수 있다. 특정하게, 이러한 조성물은 1ml 당 10 내지 10000㎍ 에리트로포이에틴 단백질, 40mmol/ℓ 아르기닌, pH 6.2, 30mmol/ℓ 황산나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메티오닌, 0.01% 플루론성 F68(w/v) 및 선택적으로 1mmol/ℓ CaCl₂를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양은 10 내지 10000㎍/ml 에리트로포이에틴, 바람직하게 25 내지 2500㎍/ml 에리트로포이에틴 및

(a) 10mM 인산나트륨/인산칼륨, 100mM NaCl, pH 7.0;

(b) 10mM 인산나트륨, 120mM 황산나트륨, pH 6.2;

(c) 10mM 인산나트륨, 40mM 황산나트륨, 3% 만니톨(w/v), pH 6.2;

(d) 10mM 인산나트륨, 40mM 황산나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메티오닌, 0.01% 풀루론성 F68(w/v), pH 6.2;

(e) 40mM 아르기닌, 30mN 황산나트륨, 3% 만니톨(w/v), pH 6.2; 또는

(f) 40mM 아르기닌, 30mN 황산나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메티오닌, 0.01% 풀루론성 F68(w/v), pH 6.2를 포함하는 조성물을 언급한다.

가장 바람직한 실시태양에서, 조성물은 50, 100, 400, 800 또는 2500㎍/ml의 에리트로포이에틴 단백질을 포함한다. 가장 바람직한 조성물은 10mM 인산나트륨, 40mM 황산나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메티오닌, 0.01% 플루론성 F68(w/v), pH 6.2, 또는 40mM 아르기닌, 30mM 황산나트륨, 3% 만니톨(w/v), 10mM 메티오닌, 0.01% 플루론성 F68(w/v), pH 6.2를 포함한다. 보다 상세하게는 이러한 조성물은 국제 특허공개 제 01/87329 호에 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 전술한 바와 같이 유효량의 에리트로포이에틴 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병에서 철 분포 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유효량의 에리트로포이에틴 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병에서 철 분포 장애를 치료하기 위한 약제에 관한 것이다. 상기의 경우에서, 비인슐린 의존성 당뇨병이 당뇨병의 바람직한 유형이다.

당뇨병에서 철 분포 장애의 치료에서, EPO는 예를 들어 150U/kg 체중의 양으로 1주일에 2회 투여될 수 있다. 이 양은 개별적인 환자의 필요에 따라 변화될 수 있으며, 예를 들어 100 내지 200U/kg의 양일 수도 있다. 사용되는 EPO 유도체의 반감기에 따라, 투약은 예를 들어 1주일에 1 내지 3회 투여될 수 있다. 개별적인 환자의 필요에 따라 의사는 상이한 투여량을 선택할 수도 있다.

본 발명에 따른 EPO 또는 EPO 접합체의 특정한 활성은 당분야에 공지된 다양한 분석방법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 정제된 EPO 단백질의 생물학적 활성은, 인간 환자에게 EPO 단백질을 주사로 투여할 경우 비주사된 군 또는 대조군에 비하여 객체의 골수세포가 세망세포 및 적혈구의 생산을 증가시키도록 하는 것이다. 본 발명에 따라 수득 및 정제된 EPO 단백질 또는 이의 단편의 생물학적 활성은 문헌[Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112] 및 문헌[Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)]에 개시된 방법에 의해 시험될 수 있다. EPO 단백질의 활성을 측정하기 위한 또다른 생물학적 분석인 정상 적혈구적 마우스 분석은 당분야(예를 들어 문헌[Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)] 및 문헌[the monography of erythropoietin of Ph. Eur. BPR.])에 개시되어 있다.

본 발명은 하기 예시되는 실시예를 참조로 하여 보다 이해될 수 있을 것이나, 이러한 실시예는 본원에 개시된 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예

미국 일리노이주 시카고에서 2001년 7월 29에서 8월 2일까지 AACC/CSCC 연간 회의에서 포스터 발표된 문헌[P. Lehmann, M. Volkman, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger]에 개시되어 있는 바에 따라, 하기 매개변수-CRP(C 반응성 단백질), 페리틴 및 가용성 트랜스페린 수용체를 측정함으로써 당뇨병을 앓고 있는 중년 여성의 철 분포 장애를 조사하였다. 그 결과, 철 분포의 장애를 나타내었다. 환자에게 최대 12주동안 150U/kg 레코몬(Recormon, 상표, 상업적으로 입수가능한 에리트로포이에틴 단백질)을 주 2회 피하 처리하였다. 이후, 전술한 매개변수를 측정한 결과, 철 결핍성 장애가 개선되었음을 확인하였다.

서열목록에 대한 일반적인 정보

(i) 출원인:

(A) 성명: 에프. 호프만-라 로슈 아게(F. Hoffmann-La Roche AG)

(B) 번지: 그렌짜체스트라쎄 124

(C) 도시: 바젤

(E) 국가: 스위스

(F) 우편번호(ZIP): 체하-4070

(G) 전화번호: (61) 688 11 11

(H) 팩스: (61) 688 13 95

(I) 텔렉스: 962 292 hlr ch

(ii) 발명의 명칭: 에리트로포이에틴의 용도

(iii) 서열수: 2

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성

(C) 작동 시스템: WORD

<110> F.Hoffmann-La Roche AG <120> USE OF ERYTHROPOIETIN <150> EP02019100.3 <151> 2002-08-29 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims

당뇨병에서 철 분포 장애 치료용 약제를 제조하기 위한 에리트로포이에틴 단백질의 용도.
제 1 항에 있어서,

당뇨병이 비인슐린 의존성 당뇨병인 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 인간 에리트로포이에틴인 용도.
제 3 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 에포에틴 알파 또는 에포에틴 베타인 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 내인성 유전자 활성화에 의해 발현되는 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 1 내지 6개 글라이코실화 부위의 부가에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 다베포에틴 알파인 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 에리트로포이에틴 단백질이 페길화된 용도.
제 9 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 접합체이고; 상기 접합체가 하나 이상의 유리 아미노 기를 갖고 골수세포가 세망세포 및 적혈구의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 갖는 에리트로포이에틴 단백질을 포함하고, 인간 에리트로포이에틴 및 1 내지 6개 글라이코실화 부위의 부가 또는 하나 이상의 글라이코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 서열을 갖는 이의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 에리트로포이에틴 단백질이 상기 하나의 아미노 기와 아마이드 결합을 형성하는 각 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 -CO를 갖는 화학식 -CO-(CH₂)_X-(OCH₂CH₂)_m-OR의 n개 폴리(에틸렌 글리콜) 기(여기에서, R은 저급 알킬이고; x는 2 또는 3이고; m은 약 450 내지 약 900이고; n은 1 내지 3이되, n 및 m은 접합체에서 에리트로포이에틴 단백질을 뺀 분자량이 20 내지 100kDa이 되도록 선택된다)와 공유결합된 용도.
제 10 항에 있어서,

x가 2이고, m이 650 내지 750이고, n이 1이고, R이 메틸인 용도.
제 9 항에 있어서,

에리트로포이에틴 단백질이 접합체이고; 상기 접합체가 하나 이상의 유리 아미노 기를 갖고 골수세포가 세망세포 및 적혈구의 생산을 증가시키도록 하는 생체내 생물학적 활성을 갖는 에리트로포이에틴 단백질을 포함하고, 인간 에리트로포이에틴 및 1 내지 6개 글라이코실화 부위의 부가 또는 하나 이상의 글라이코실화 부위의 재배열에 의해 변형된 인간 에리트로포이에틴의 일차 구조를 갖는 이의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 에리트로포이에틴 단백질이 1 내지 3개의 저급 알콕시 폴리(에틸렌 글리콜) 기와 공유결합되고, 각 폴리(에틸렌 글리콜) 기가 상기 하나의 아미노 기와 아마이드 결합을 형성하는 링커의 C(O)를 갖는 화학식 -C(O)-X-S-Y-(여기에서, X는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k이고, k는 1 내지 10이고, Y는

또는 이다)의 링커를 통해 에리트로포이에틴 단백질과 공유결합되어 있고, 각 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기의 평균 분자량은 약 20 내지 약 40kDa이고; 접합체의 분자량은 약 51 내지 약 175kDa인 용도.
제 12 항에 있어서,

하기 화학식 V의 에리트로포이에틴 접합체를 갖는 용도:

화학식 V

상기 식에서,

n은 1 내지 3의 정수이고;

m은 450 내지 900의 정수이고;

R은 저급 알킬이고;

X는 -(CH₂)_k- 또는 -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-이고;

k는 1 내지 10이고;

P는 X와 아마이드 결합을 형성하는 n개 아미노 기를 함유하지 않는 에리트로포이에틴 단백질의 잔기이다.
유효량의 에리트로포이에틴 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병에서 철 분포 장애를 치료하는 방법.
유효량의 에리트로포이에틴 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병에서 철 분포 장애를 치료하기 위한 약제.
본원에서 정의된 발명.