PL209699B1

PL209699B1 - Zastosowanie erytropoetyny w leczeniu cukrzycy

Info

Publication number: PL209699B1
Application number: PL375784A
Authority: PL
Inventors: Paul Lehmann; Ralf Roeddiger; Ruth Walter-Matsui
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2011-10-31
Also published as: KR20050057054A; EP1536823A1; BRPI0313792B8; CA2496581C; EP1536823B1; WO2004019972A1; AR041061A1; RU2305554C2; AU2003251713A1; MXPA05002067A; CN1678341A; JP2006503821A; ATE510556T1; CA2496581A1; BRPI0313792B1; US20040110679A1; RU2005108976A; PL375784A1; CN1311866C; US7459435B2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie erytropoetyny do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń dystrybucji żelaza w cukrzycy.

Znane są różne choroby, w których metabolizm żelaza jest nieprawidłowy. W niedokrwistości nie może być wytworzona wystarczająca ilość krwi ze względu na ogólny niedobór żelaza w organizmie. Innym stanem metabolicznym związanym z żelazem jest hemochromatoza, w której całkowite stężenie żelaza w organizmie jest wyższe od prawidłowego, co prowadzi do różnych stanów, takich jak np. niszczenie narządów.

Zaburzenia dystrybucji żelaza różnią się od opisanej powyżej niedokrwistości i hemochromatozy, ponieważ całkowite stężenie żelaza w organizmie jest prawidłowe. Z jednej strony żelazo jest gromadzone w różnych narządach, co może prowadzić do uszkodzeń, a nawet zniszczenia tych narządów. Z drugiej strony wykorzystanie żelaza, które występuje w prawidłowych ilościach, do tworzenia krwi jest zaburzone, co prowadzi do wtórnych objawów, które są porównywalne z tymi występującymi w niedokrwistoś ci.

Dotychczas nie było wiadomo, że istnieje wysokie prawdopodobieństwo wystąpienia zaburzeń dystrybucji żelaza u pacjentów chorujących na cukrzycę. Zaburzenia dystrybucji żelaza można rozpoznać za pomocą różnych parametrów, które są powszechnie stosowane w diagnostyce stanu żelaza. Na podstawie pomiarów ferrytyny i rozpuszczalnego receptora transferyny można ocenić, czy u pacjenta z cukrzycą całkowite stężenie żelaza jest prawidłowe. Jeżeli tak jest, to wówczas obniżone stężenie hemoglobiny w retikulocytach jest wskaźnikiem zaburzeń dystrybucji żelaza. Innym wskaźnikiem jest stale przedłużone podwyższone stężenie białka C-reaktywnego (CRP) u pacjentów cierpiących na cukrzycę i wykazujących prawidłowe całkowite stężenie żelaza. Sposób diagnozowania zaburzeń dystrybucji żelaza opisali P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A, Baldauf, R. Roeddiger, plakat przedstawiany na AACC/CSCC, Annual Meeting, 29 lipiec - 2 sierpień, 2001, Chicago, Illinois.

Dotychczas nie proponowano żadnego leczenia dla pacjentów z cukrzycą cierpiących na zaburzenia dystrybucji żelaza. Dlatego problemem leżącym u podstaw wynalazku jest umożliwienie leczenia zaburzeń dystrybucji żelaza w cukrzycy w celu zmniejszenia lub ograniczenia wspomnianych wyżej niedogodności. Nieoczekiwanie stwierdzono, że erytropoetyna ma korzystny wpływ na zaburzenia dystrybucji żelaza w cukrzycy. Tak więc powyższy problem został rozwiązany przez dostarczenie erytropoetyny do stosowania w leczeniu zaburzeń dystrybucji żelaza w cukrzycy.

Wynalazek dotyczy zatem zastosowania erytropoetyny do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń dystrybucji żelaza w cukrzycy insulinoniezależnej.

Korzystnie białko erytropoetynę stanowi ludzka erytropoetyna, a zwłaszcza epoetyna α lub epoetyna β.

Korzystnie białko erytropoetyna jest eksprymowane przez aktywację endogennych genów.

Korzystnie białko erytropoetyna ma sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.

Korzystnie białko erytropoetyna ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji.

Korzystnie białko erytropoetynę stanowi darbepoetyna α.

Korzystnie zdefiniowane powyżej białko erytropoetyna jest pegilowane.

Korzystnie białko erytropoetyna stanowi koniugat, który to koniugat zawiera białko erytropoetynę mające co najmniej jedną wolną grupę aminową oraz wykazującą aktywność biologiczną in vivo wywoływania zwiększenia wytwarzania retikulocytów i czerwonych ciałek krwi przez komórki szpiku kostnego, wybraną z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i jej analogi, które mają sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji lub przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji; przy czym to białko erytropoetyna jest kowalencyjnie związane z n ugrupowaniami glikolu polietylenowego o wzorze -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, w którym grupa -CO każdego ugrupowania glikolu polietylenowego tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych; R oznacza C1-C6 alkil, x oznacza 2 lub 3; m oznacza 450 - 900, n oznacza 1 - 3; oraz n i m są dobrane tak, że masa cząsteczkowa koniugatu minus białka erytropoetyny wynosi 20 - 100 kilodaltonów.

Szczególnie korzystnie stosuje się koniugat, w którym x oznacza 2, m oznacza 650 - 750, n oznacza 1, a R oznacza metyl.

Korzystnie białko erytropoetyna stanowi koniugat, który to koniugat zawiera białko erytropoetynę mające co najmniej jedną wolną grupę aminową oraz wykazującą aktywność biologiczną in vivo wywoływania zwiększenia wytwarzania retikulocytów i czerwonych ciałek krwi przez komórki szpiku

PL 209 699 B1 kostnego, wybraną z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i jej analogi, które mają pierwotną strukturę ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji; przy czym to białko erytropoetyna jest kowalencyjnie związane z 1 - 3 ugrupowaniami niższo-alkoksy-glikolu polietylenowego, a każde ugrupowanie glikolu polietylenowego jest kowalencyjnie związane z białkiem erytropoetyna poprzez łącznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, w którym grupa C(O) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych, X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, k oznacza 1 - 10, Y oznacza

przy czym średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania glikolu polietylenowego wynosi 20 - 40 kilodaltonów, a masa cząsteczkowa koniugatu wynosi 51 - 175 kilodaltonów.

Szczególnie korzystnie stosuje się koniugat erytropoetyny o wzorze:

w którym n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; m oznacza liczbę całkowitą 450 - 900; R oznacza C1-C6 alkil; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, k oznacza 1 - 10 a P oznacza resztę białka erytropoetyny bez n grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z X.

Jeżeli nie podano inaczej, poniższe definicje przedstawiono w celu zilustrowania i zdefiniowania znaczenia i zakresu różnych określeń stosowanych w opisie wynalazku.

Określenie „niższy alkil” oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową zwierającą 1 - 6 atomów węgla. Przykłady niższych alkili obejmują metyl, etyl i izopropyl, korzystnie metyl.

Określenie „niższy alkoksyl” oznacza grupę R'-O-, w której R' oznacza niższy alk jak zdefiniowany powyżej.

Określenie „zaburzenia dystrybucji żelaza w cukrzycy” dotyczy zaburzenia dystrybucji żelaza, które występuje u pacjentów cierpiących na cukrzycę. Zaburzenie dystrybucji żelaza można np. scharakteryzować jak opisano powyżej. W szczególności zaburzenie dystrybucji żelaza charakteryzuje się następującymi parametrami: stężenie rozpuszczalnego receptora transferyny [mg/l] podzielone przez log (stężenie ferrytyny [μθ/l]) jest niższe niż 3,5 i jednocześnie stężenie białka C-reaktywnego jest wyższe niż 5 mg/l.

Określenie „erytropoetyna” lub „białko erytropoetyna” dotyczy białka o aktywności biologicznej in vivo, pobudzającej komórki szpiku kostnego do zwiększenia wytwarzania retikulocytów i czerwonych ciałek krwi, wybranego z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i analogi, które zdefiniowano poniżej.

Określenie „pegilowana erytropoetyna (Peg-EPO lub PEG-EPO)” dotyczy białka erytropoetyny, które jest kowalencyjnie związane z jedną do trzech pochodnych polietylenu, opisanych poniżej.

PL 209 699 B1

Wynalazek jest szczególnie użyteczny do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających erytropoetynę jako składnik farmaceutycznie czynny. Określenie „erytropoetyna” lub „białko erytropoetyna” lub „EPO” ma następujące znaczenie: w szczególności określenia te dotyczą glikoproteiny, np. ludzkiej erytropoetyny, np. o sekwencji aminokwasów przedstawionej jako SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2 lub o sekwencji aminokwasów zasadniczo do nich homologicznej, której właściwości biologiczne odnoszą się do stymulacji wytwarzania czerwonych ciałek krwi i stymulacji podziałów i różnicowania ukierunkowanych prekursorów erytroidalnych w szpiku kostnym. Te określenia stosowane w opisie obejmują takie białka celowo zmodyfikowane, np. przez ukierunkowaną mutagenezę lub przypadkowo przez mutacje. Określenia te obejmują także analogi zawierające 1 - 6 dodatkowych miejsc glikozylacji, analogi zawierające co najmniej jeden dodatkowy aminokwas na C-końcu glikoproteiny, przy czym dodatkowy aminokwas zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji, oraz analogi o sekwencji aminokwasów zawierającej przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji. Określenia te obejmują zarówno naturalną, jak i rekombinowaną ludzką erytropoetynę. W korzystnej postaci wynalazku białkiem erytropoetyną jest ludzka erytropoetyna.

Jak przedstawiono szczegółowo poniżej, wytwarzanie i oczyszczanie EPO jest dobrze znane w dziedzinie wynalazku. Pod okreś leniem erytropoetyna rozumie się tu naturalne lub rekombinowane białko, korzystnie ludzkie, np. epoetynę α lub epoetynę β, uzyskane z dowolnego znanego źródła, takiego jak tkanki, synteza białek, hodowla komórkowa z naturalnymi lub rekombinowanymi komórkami. Określenie to obejmuje dowolne białka o aktywności erytropoetyny, takie jak muteiny lub białka zmodyfikowane w inny sposób. Rekombinowaną EPO można wytwarzać drogą ekspresji w liniach komórkowych CHO, BHK lub HeLa, z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA lub drogą aktywacji endogennych genów. Ekspresja białek, w tym EPO, przez aktywację endogennych genów jest dobrze znane w dziedzinie wynalazku i ujawniona np. w opisach patentowych US nr 5733761, 5641670 i 5733746 oraz w publikacjach zgłoszeń międzynarodowych nr WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 i WO 91/09955. Korzystne jest zastosowanie zdefiniowane powyżej, w którym białko erytropoetynę wytwarza się drogą ekspresji przez aktywację endogennych genów. Korzystnymi rodzajami EPO do wytwarzania produktów glikoproteiny erytropoetyny są rodzaje ludzkiej EPO. Korzystniej rodzajem EPO jest ludzka EPO o sekwencji aminokwasów przedstawionej jako SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2, korzystniej o sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 1.

Ponadto erytropoetyna może stanowić analog glikoproteiny zawierający 1 - 6 dodatkowych miejsc glikozylacji. Glikozylacja białka, jedną lub większą liczbą grup oligosacharydowych, występuje w specyficznych miejscach wzdłuż szkieletu polipeptydowego i znacząco wpływa na właściwości fizyczne białka, takie jak trwałość białka, wydzielanie, lokalizacja wewnątrzkomórkowa i aktywność biologiczna białka. Zazwyczaj występuje glikozylacja dwóch typów. O-Przyłączane oligosacharydy są przyłączane do reszt seryny lub treoniny, a N-przyłączane oligosacharydy są przyłączane do reszt asparaginy. Jednym z typów oligosacharydów, występującym zarówno wśród N-przyłączanych, jak i O-przyłączanych oligosacharydów, jest kwas N-acetyloneuraminowy (kwas sialowy), który należ y do grupy aminocukrów zawierających 9 lub większą liczbę atomów węgla. Kwas sialowy jest zazwyczaj resztą końcową zarówno w N-przyłączanych, jak i O-przyłączanych oligosacharydach, a ponieważ niesie ujemny ładunek, nadaje glikoproteinie właściwości kwasowe. Ludzka erytropoetyna, mająca 165 aminokwasów, zawiera trzy N-przyłączone i jeden O-przyłączony łańcuchy oligosacharydowe, które stanowią około 40% całkowitej masy cząsteczkowej glikoproteiny. N-Glikozylacja zachodzi przy resztach asparaginowych w pozycjach 24, 38, i 83, a O-glikozylacja zachodzi przy reszcie seryny w pozycji 126. Ł a ń cuchy oligosacharydowe są zmodyfikowane końcowymi resztami kwasu sialowego. Enzymatyczne usunięcie wszystkich reszt kwasu sialowego z glikozylowanej erytropoetyny powoduje utratę aktywności in vivo, ale nie aktywności in vitro, ponieważ sialilacja erytropoetyny zapobiega jej wiązaniu przez wątrobowe białko wiążące i następującemu później klirensowi.

Określenie „erytropoetyna” obejmuje analogi ludzkiej erytropoetyny z jedną lub większą liczbą zmian w sekwencji aminokwasowej ludzkiej erytropoetyny, które to zmiany powodują wzrost liczby miejsc przyłączania kwasu sialowego. Te analogi glikoproteiny można wytworzyć przez ukierunkowaną mutagenezę wprowadzając addycje, delecje lub podstawienia reszt aminokwasowych, co zwiększa liczbę lub zmienia miejsca dostępne dla glikozylacji. Analogi glikoproteiny o zwiększonym poziomie kwasu sialowego w porównaniu z ludzką erytropoetyną wytwarza się dodając miejsca glikozylacji, które nie zaburzają drugorzędowej lub trzeciorzędowej konformacji wymaganej dla aktywności biologicznej. Glikoproteiny stosowane zgodnie z wynalazkiem obejmują także analogi o zwiększonym poziomie przyłączenia węglowodanów w miejscu glikozylacji, co zazwyczaj wynika z podstawienia jedPL 209 699 B1 nego lub większej liczby aminokwasów w pobliżu miejsca N-przyłączania lub O-przyłączania. Glikoproteiny stosowane zgodnie z wynalazkiem obejmują także analogi zawierające jeden lub większą liczbę aminokwasów przyłączonych na C-końcu erytropoetyny, z utworzeniem co najmniej jednego dodatkowego miejsca dla węglowodanu. Białka erytropoetyny stosowane zgodnie z wynalazkiem obejmują także analogi o sekwencji aminokwasów zawierającej przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji. Takie przegrupowanie miejsca glikozylacji obejmuje delecję jednego lub większej liczby miejsc glikozylacji w ludzkiej erytropoetynie oraz dodanie jednego lub większej liczby niewystępujących naturalnie miejsc glikozylacji. Zwiększenie liczby łańcuchów węglowodanowych na erytropoetynie, a zatem i liczby kwasów sialowych na cząsteczkę erytropoetyny, może nadawać korzystne właściwości, takie jak zwiększona rozpuszczalność, zwiększona odporność na proteolizę, obniżona immunogenność, wydłużony okres półtrwania w surowicy oraz zwiększona aktywność biologiczna. Analogi erytropoetyny z dodatkowymi miejscami glikozylacji ujawniono bardziej szczegółowo w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 640 619 (Elliot), opublikowanym 1 marca 1995 roku.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycja farmaceutyczna korzystnie zawiera białka erytropoetyny o sekwencji aminokwasów obejmują cej co najmniej jedno dodatkowe miejsce glikozylacji, takie jak, lecz nie wyłącznie, erytropoetyny zawierające sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowanej przez modyfikację wybraną spośród poniższych:

Asn³⁰Thr³² _Asn ⁵¹Thr⁵³

Asn⁵⁷Thr⁵⁹

Asn⁶⁹;

Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn⁸⁹lle⁹⁰Thr⁹¹;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

_Asn ¹³⁶Thr¹³⁸;

_Asn ¹³⁸Thr¹⁴⁰;

Thr¹²⁵; i _Pro ¹²⁴Thr¹²⁵.

Stosowane w opisie oznaczenia dotyczące modyfikacji aminokwasów oznaczają, że jedna lub większa liczba pozycji w odpowiednim niemodyfikowanym białku (np. hEPO o SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2) wskazanych liczbą (liczbami) w indeksach górnych jest zmieniona na aminokwas(-y) podany(-e) bezpośrednio przed liczbą (liczbami) w indeksie górnym.

Białko erytropoetyna może także stanowić analog zawierający co najmniej jeden dodatkowy aminokwas na C-końcu glikoproteiny, przy czym dodatkowy aminokwas zawiera co najmniej jedno miejsce glikozylacji. Dodatkowy aminokwas może zawierać fragment peptydowy pochodzący z C-końca ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej. Korzystnie glikoproteina stanowi analog wybrany z grupy obejmującej (a) ludzką erytropoetynę o sekwencji aminokwasów Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln, przyłączoną do C-końca; (b) analog (a) zawierający ponadto Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; oraz (c) analog (a) zawierający ponadto Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.

Białko erytropoetyna może stanowić także analog o sekwencji aminokwasów zawierającej przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji. Przegrupowanie może obejmować delecję któregokolwiek z miejsc przyłączania węglowodanu do N w ludzkiej erytropoetynie oraz addycję miejsca wiązania węglowodanu do N w pozycji 88 sekwencji aminokwasowej ludzkiej erytropoetyny. Korzystnie glikoproteina stanowi analog wybrany z grupy obejmującej Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO i Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO. Kolejnym analogiem jest darbepoetyna α.

W szczególności białko erytropoetyna w kompozycji farmaceutycznej opisanej powyż ej może także zawierać jego pegilowane pochodne. Pegilowane pochodne erytropoetyny i ich wytwarzanie są

PL 209 699 B1 znane i opisane np. w WO 01/02017, EP-A-1064951, EP-A-539167, EP-A-605963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, w US nr 556, EP-A-584876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, US nr 5359030 i 5681811, US nr 4179337, japońskim opisie patentowym, WO 98/32466, US nr 5324650. Korzystna postać pegilowanej erytropoetyny odnosi się do opisanych poniżej pochodnych.

Ponadto kompozycje farmaceutyczne zawierają opisane powyżej koniugaty, przy czym zawartość koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 92% lub korzystnie 96% wszystkich koniugatów kompozycji.

W szczególności powyższe koniugaty można przedstawić wzorem (I)

P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) w którym P oznacza resztę białka erytropoetyny jak opisano powyżej (czyli bez grupy aminowej lub grup aminowych tworzących wiązanie amidowe z karbonylem przedstawionym we wzorze I), wykazującą aktywność biologiczną in vivo powodującą zwiększanie wytwarzania retikulocytów i czerwonych ciałek krwi przez komórki szpiku kości; R oznacza niższy alkil; x oznacza 2 lub 3; m oznacza około 450 - 900, n oznacza 1 - 3, z tym, że n i m są tak dobrane aby różnica masy cząsteczkowej koniugatu i masy czą steczkowej białka erytropoetyny wynosi 20 - 100 kilodaltonów. Korzystne są koniugaty, w których R oznacza metyl.

Symbol „m” oznacza liczbę grup tlenku etylenu (OCH2CH2) w ugrupowaniu poli(tlenku etylenu). Pojedyncza podjednostka PEG (glikolu polietylenowego), tlenek etylenu ma masę cząsteczkową około 44 daltonów. Zatem masa cząsteczkowa koniugatu (z wyłączeniem masy cząsteczkowej EPO) zależy od liczby „m”. W koniugatach stosowanych zgodnie z wynalazkiem „m” oznacza około 450 - 900 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 20 - 40 kilodaltonów), korzystnie około 650 - 750 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 30 kilodaltonów). Liczba m jest wybrana tak, że powstały koniugat według wynalazku ma aktywność fizjologiczną porównywalną z niemodyfikowaną EPO, która to aktywność może być taka sama, wyższa lub stanowić część odpowiedniej aktywności niemodyfikowanej EPO. Masa cząsteczkowa „około” pewnej liczby oznacza, że znajduje się ona w rozsądnych granicach blisko tej liczby, oznaczonej znanymi metodami analitycznymi. Liczba „m” jest wybrana tak, że masa cząsteczkowa każdego ugrupowania glikolu polietylenowego kowalencyjnie połączonego z glikoproteiną erytropoetyną wynosi około 20 - 40 kilodaltonów, a korzystnie około 30 kilodaltonów.

W koniugatach stosowanych zgodnie z wynalazkiem liczba „n” oznacza liczbę ugrupowań glikolu polietylenowego kowalencyjnie związanych z wolnymi grupami aminowymi (w tym z grupami ε-aminowymi aminokwasu lizyny i/lub grupą aminową N-końca) białka erytropoetyny przez wiązanie (wiązania) amidowe. Koniugat stosowany zgodnie z wynalazkiem może zawierać jedno, dwa lub trzy ugrupowania PEG na cząsteczkę EPO. Liczba „n” oznacza liczbę całkowitą 1 - 3, korzystnie „n” oznacza 1 lub 2, a jeszcze korzystniej „n” oznacza 1. Korzystne koniugaty spośród koniugatów opisanych powyżej stanowią związki, w których x oznacza 2, m oznacza 650 - 750, n oznacza 1, a R oznacza metyl.

Związek o wzorze (I) można wytwarzać ze znanego związku polimerowego:

gdzie R i m mają wyżej podane znaczenie, drogą kondensacji związku o wzorze II z glikoproteiną erytropoetyną. Związki o wzorze (II), w których x oznacza 3, są estrami sukcynoimidylowymi kwasu α-niższo-alkoksy-polioksyetylenomasłowego (niższo-alkoksy-PEG-SBA). Związki o wzorze (II), w którym x oznacza 2, są estrami sukcynoimidylowymi kwasu α-niższo-alkoksy-poli-oksyetylenopropionowego (niższo-alkoksy-PEG-SPA). Można stosować dowolny znany sposób prowadzenia reakcji aktywowanego estru z aminą, z wytworzeniem amidu. W reakcji opisanej powyżej przykładowe ugrupowanie estru sukcynoimidylowego jest grupą odszczepiającą się, powodującą powstanie amidu. Zastosowanie estrów sukcynoimidylowych, takich jak związki o wzorze II, do wytwarzania koniugatów z białkami, ujawniono w US nr 5672662 (Harris i in.), z 30 września 1997 r.

Ludzka EPO zawiera dziewięć wolnych grup aminowych, N-końcową grupę aminową i 8 grup ε-aminowych reszt lizyny. Gdy reagent pegilujący połączono ze związkiem SBA o wzorze II, stwierPL 209 699 B1 dzono, że przy pH 7,5 i przy stosunku białko:PEG wynoszącym 1:3 oraz w temperaturze reakcji 20 25°C, wytworzono mieszaninę mono- i di-pegilowanych, oraz śladowych ilości tri-pegilowanych produktów. Gdy reagentem pegilującym był związek SPA o wzorze II, w podobnych warunkach, z wyjątkiem tego, że stosunek białko:PEG wynosił 1:2, wytworzono głównie monopegilowane produkty. Pegilowaną EPO można podawać jako mieszaninę lub w postaci różnych pegilowanych produktów rozdzielonych metodą chromatografii kationowymiennej. Poprzez dobór warunków reakcji (np. stosunku reagentów, pH, temperatury, stężenia białka, czasu reakcji itd.), można zmieniać względne ilości różnych pegilowanych produktów.

Rodzaje erytropoetyny można także przedstawić wzorem (III) P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n (III) w którym R może oznaczać dowolny ni ższy alkil. Korzystnym niższym alkilem jest metyl. X może oznaczać -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, gdzie k oznacza około 1 - 10. Korzystnie k oznacza około 1 - 4, korzystniej k oznacza 1 lub 2. Najkorzystniej X oznacza -(CH2).

We wzorze 1, Y oznacza

korzystniej

We wzorze (III), liczba m jest wybrana tak, że powstały koniugat o wzorze (III) ma aktywność fizjologiczną porównywalną z niemodyfikowaną EPO, przy czym ta aktywność może być taka sama, wyższa lub stanowić część odpowiedniej aktywności niemodyfikowanej EPO. Liczba m oznacza liczbę ugrupowań tlenku etylenu w jednostce PEG. Pojedyncza podjednostka PEG -(OCH2CH2)- ma masę

PL 209 699 B1 cząsteczkową około 44 daltonów. Zatem masa cząsteczkowa koniugatu (bez masy cząsteczkowej EPO) zależy od liczby m. Masa cząsteczkowa „około” konkretnej liczby oznacza, że jest ona rozsądnie bliska tej liczbie, oznaczonej znanymi metodami analitycznymi. Liczba m oznacza liczbę całkowitą około 450 - 900 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 20 - 40 kilodaltonów), korzystnie m oznacza około 550 - 800 (około 24 - 35 kilodaltonów), a najkorzystniej m oznacza około 650 - 700 (około 29 - 31 kilodaltonów).

We wzorze (III), liczba n oznacza liczbę grup ε-aminowych aminokwasu lizyny w białku erytropoetynie, kowalencyjnie związanych z jednostką PEG wiązaniem amidowym. Koniugat według wynalazku może zawierać jedną, dwie lub trzy jednostki PEG na cząsteczkę EPO. Liczba n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3, korzystnie n oznacza 1 lub 2, a najkorzystniej n oznacza 1.

Korzystne białka erytropoetyny o wzorze (III) są określone wzorami:

W najkorzystniejszej postaci wynalazku koniugat erytropoetyny jest określony wzorem:

przy czym w powyższym wzorze n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; m oznacza liczbę całkowitą 450 900; R oznacza niższy alkil; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, a P oznacza resztę białka erytropoetyny bez grupy aminowej lub grup aminowych, tworzących wiązanie amidowe z X.

Inne korzystne produkty glikoproteiny erytropoetyny są określone wzorami:

PL 209 699 B1

Korzystniejsze produkty glikoproteiny erytropoetyny są określone wzorem:

Te białka erytropoetyny można wytwarzać przez:

(a) poddawanie grupy ε-aminowej aminokwasu lizyny białka erytropoetyny o wzorze P-[NH2]n reakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego z dwufunkcyjnym reagentem o wzorze Z-CO-X-S-Q, z wytworzeniem związku pośredniego z wiązaniem amidowym, o wzorze:

P-[NH-CO-X-S-Q]n w którym P oznacza białko erytropoetynę bez grupy aminowej tworzącej wiązanie amidowe, n oznacza liczbę całkowitą 1 - 3; Z oznacza grupę reaktywną, np. ugrupowanie estru karboksylowego NHS; X oznacza -(CH2)k- lub -CH2(O-CH2-CH2)k-, gdzie k oznacza od 1 do około 10, a Q oznacza grupę zabezpieczającą, taką jak alkanoil, np. acetyl.

(b) poddawanie związku pośredniego z wiązaniem amidowym z etapu (a) reakcji tworzenia wiązania kowalencyjnego z aktywowaną pochodną glikolu polietylenowego o wzorze W-[OCH2CH2]m-OR, z wytworzeniem produktu glikoproteiny erytropoetyny o wzorze:

w którym W oznacza postać Y reagującą z grupą sulfhydrylową; m oznacza liczbę całkowitą około 450 - 900; R oznacza niższy alkil, a Y ma wyżej podane znaczenie.

W tym sposobie dwufunkcyjnym reagentem jest korzystnie N-sukcynoimidylo-S-acetylotiopropionian lub N-sukcynoimidylo-S-acetylotiooctan, Z korzystnie oznacza N-hydroksysukcynoimid, a aktywowana pochodna glikolu polietylenowego W-[OCH2CH2]m-OR jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej jodoacetylometoksy-PEG, metoksy-PEG-winylosulfon i metoksy-PEG-maleimid.

W szczególności białka erytropoetyny o wzorze (III) można wytwarzać przez kowalencyjne przyłączanie grup tiolowych do EPO („aktywację”) oraz sprzęganie powstałej aktywowanej EPO z pochodną glikolu polietylenowego (PEG). Pierwszy etap wytwarzania pegilowanej EPO polega na kowalencyjnym przyłączeniu grup tiolowych przez grupy NH2- w EPO. Aktywację tę prowadzi się z użyciem dwufunkcyjnych reagentów z zabezpieczoną grupą tiolową i dodatkową grupą reaktywną, taką jak odpowiednio ugrupowania aktywnych estrów (np. estru sukcynoimidylowego), bezwodników, estrów kwasów sulfonowych, halogenków kwasów karboksylowych i kwasów sulfonowych. Grupa tiolowa jest zabezpieczona znanymi grupami, np. grupą acetylową. Te reagenty dwufunkcyjne mogą reagować z grupami ξ-aminowymi aminokwasów lizyny, tworząc wiązanie amidowe. Pierwszy etap reakcji przedstawiono poniżej:

PL 209 699 B1

EPO, n i X mają wyżej podane znaczenie, a Z oznacza znaną reaktywną grupę, np. podstawnik N-hydroksysukcynoimidowy (NHS) o wzorze:

Korzystnie aktywację grup ε-aminowych lizyny prowadzi się drogą reakcji z dwufunkcyjnymi reagentami zawierającymi grupę sukcynoimidylową. Reagenty dwufunkcyjne mogą zawierać różnego rodzaju grupy łączące, np. ugrupowania -(CH2)k- lub -CH2-(O-CH2-CH2-)k-, gdzie k oznacza około 1 - 10, korzystnie około 1 - 4, korzystniej 1 lub 2, a najkorzystniej 1. Przykładami takich reagentów są S-acetylotiopropionian N-sukcynoimidylu (SATP) i S-acetylotioctan N-sukcynoimidylu (SATA)

ester NHS kwasu 2-(acetylotio)-(etoksy)k-octowego, gdzie k ma wyżej podane znaczenie.

Wytwarzanie reagentów dwufunkcyjnych jest znane. Prekursory estrów NHS kwasu 2-(acetylotio)-(etoksy)k-octowego opisano w DE-3924705, natomiast wytwarzanie pochodnych związku acetylotiolowego opisał March, J. Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA jest dostępny w handlu (Molecular Probes, Eugene, OR, USA i Pierce, Rockford, IL).

Liczbę grup tiolowych przyłączanych do cząsteczki EPO można wybrać ustalając parametry reakcji, czyli stężenie białka (EPO) i stosunek białko/reagent dwufunkcyjny. Korzystnie EPO jest aktywowana przez kowalencyjne połączenie z 1 - 5 grupami tiolowymi na cząsteczkę EPO, korzystniej 1,5 - 3 grupami tiolowymi na cząsteczkę EPO. Zakresy te odnoszą się do statystycznego rozmieszczenia grup tiolowych w całej populacji białka EPO.

Reakcję prowadzi się np. w wodnym roztworze buforowym, pH 6,5 - 8,0, np. w 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, pH 7,3. Reagent dwufunkcyjny można dodać w DMSO. Po zakończeniu

PL 209 699 B1 reakcji, korzystnie po 30 minutach, reakcję przerywa się przez dodanie lizyny. Nadmiar reagenta dwufunkcyjnego można oddzielić znanymi sposobami, np. przez dializę lub filtrację kolumnową. Średnią liczbę grup tiolowych przyłączonych do EPO można określić metodami fotometrycznymi opisanymi np. w Grasetti, D.R. i Murray, J.F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41 - 49 (1967).

Po powyższej reakcji prowadzi się kowalencyjne sprzęganie aktywowanej pochodnej glikolu polietylenowego (PEG). Odpowiednie pochodne PEG są aktywowanymi cząsteczkami PEG o średniej masie cząsteczkowej około 20 - 40 kilodaltonów, korzystniej około 24 - 35 kilodaltonów, a najkorzystniej około 30 kilodaltonów.

Aktywowane pochodne PEG są znane i opisano je np. w Morpurgo, M. i in., J. Bioconj. Chem. (1996) 7, str. 363 i następne, w odniesieniu do PEG-winylosulfonu. Do wytwarzania związków o wzorze I odpowiednie są PEG o łańcuchach liniowych lub rozgałęzionych. Do przykładowych reaktywnych reagentów PEG należą jodoacetylometoksy-PEG i metoksy-PEG-winylosulfon:

Stosowanie tych jodo-aktywowanych substancji jest znane i opisane, np. Hermanson, G. T. w Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) str. 147 - 148.

Najkorzystniej cząsteczki PEG aktywuje się maleimidem, stosując (niższo-alkoksy-PEGmaleimid), taki jak metoksy-PEG-maleimid (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Struktura niższoalkoksy-PEG-maleimidu jest następująca:

Reakcja sprzęgania z niższo-alkoksy-PEG-maleimidem zachodzi po odszczepieniu in situ grupy zabezpieczającej grupę tiolową w wodnym roztworze buforowym, np. 10 mM fosforanie potasu, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2. Reakcję odszczepiania grupy zabezpieczającej można prowadzić np. za pomocą hydroksyloaminy w DMSO w 25°C, pH 6,2, przez około 90 minut. Do modyfikacji PEG stosunek molowy aktywowanego EPO/niższo-alkoksy-PEG-maleimidu powinien wynosić około 1:3 1:6, korzystnie 1:4. Reakcję można przerwać przez dodanie cysteiny i przereagowanie pozostałych grup tiolowych (-SH) z N-metylomaleimidem lub innymi odpowiednimi związkami zdolnymi do tworzenia wiązań disulfidowych. Ze względu na reakcję jakichkolwiek pozostałych aktywnych grup tiolowych z grupami zabezpieczają cymi, takimi jak ugrupowanie N-metylomaleimidu, lub inn ą odpowiednią grupą zabezpieczającą, glikoproteiny EPO w koniugatach według wynalazku mogą zawierać takie grupy zabezpieczające. Ogólnie w wyniku opisanej tu procedury otrzymuje się mieszaninę cząsteczek o różnej liczbie grup tiolowych zabezpieczonych przez róż ną liczbę grup zabezpieczających, zależnie od liczby aktywowanych grup tiolowych glikoproteiny, które nie zostały sprzężone z PEG-maleimidem.

PL 209 699 B1

N-Metylomaleimid tworzy taki sam typ wiązań kowalencyjnych gdy stosuje się go do blokowania pozostałych grup tiolowych pegilowanego białka, natomiast w związkach disulfidowych będzie zachodzić wewnątrzcząsteczkowa reakcja wymiany sulfid/disulfid, prowadząca do sprzęgania przez mostki disulfidowe reagenta blokującego. Korzystne reagenty blokujące dla tego typu reakcji blokowania to utleniony glutation (GSSG), cysteina i cystamina. Podczas gdy z cysteina nie wprowadza się do pegilowanego białka dodatkowego ładunku, to w przypadku stosowania takich reagentów blokujących, jak GSSG lub cystamina, zostaje wprowadzony dodatkowy ładunek dodatni lub ujemy.

Dalsze oczyszczanie związków o wzorze (III), w tym rozdział mono-, di- i tri-pegilowanych EPO, można prowadzić znanymi sposobami np. metodą chromatografii kolumnowej.

Pegilowane pochodne erytropoetyny korzystnie zawierają co najmniej 90% koniugatów monoPEG. Zwykle pożądane są koniugaty mono-PEG glikoprotein erytropoetyn, gdyż zazwyczaj wykazują one wyższą aktywność niż koniugaty di-PEG. Udział procentowy koniugatów mono-PEG, a także stosunek mono- do di-PEG można regulować przez połączenie szerszych frakcji wokół wyeluowanego piku dla zmniejszenia udziału procentowego mono-PEG, albo połączenie węższych frakcji dla zwiększenia udziału procentowego mono-PEG w kompozycji. Około 90% koniugatów mono-PEG to ilość zapewniająca rozsądną wydajność i aktywność. Czasami mogą być wymagane kompozycje, w których np. co najmniej 92% lub co najmniej 96% koniugatów stanowią mono-PEG (n oznacza 1). Zgodnie z wynalazkiem udział procentowy koniugatów, w których n oznacza 1, wynosi 90 - 96%.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające pegilowaną erytropoetynę są znane i opisane np.

w publikacji zgł oszenia mię dzynarodowego WO 01/87329. Kompozycje mogą zawierać 10 - 10000 μ g białka erytropoetyny na ml, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie kompozycje zawierają 10 - 1000 μg, np. 10, 50, 100, 400, 800 lub 2500 μg/ml. Ponadto kompozycje według wynalazku mogą zawierać 10 10000 μg białka erytropoetyny na ml, 10 - 200 mmoli/l siarczanu, 10 - 50 mmoli/l fosforanu, pH 6,0 6,5. Ta kompozycja może także zawierać metioninę (do 20 mM), 1 - 5% poliolu (wag./obj.), do 0,1% Pluronic F68 (wag./obj.) oraz ewentualnie do 1 mM CaCl2. Przykładowo taka kompozycja zawiera 10 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli/l siarczanu, 10 mmoli/l fosforanu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% Pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2. W innej postaci wynalazku, kompozycja może zawierać 10 - 10000 μg białka erytropoetyny na ml, 10 - 100 mmoli/l NaCl, 10 - 50 mmoli/l fosforanu, pH 6,0 - 7,0, ewentualnie 1 - 5% (wag./obj.) poliolu. Ponadto, ta kompozycja może także zawierać metioninę (do 20 mM), do 0,1% Pluronic F68 (wag./obj.) oraz ewentualnie do 7,5 μmola/l CaCl₂. Konkretnie, kompozycja może zawierać 10 - 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 100 mmoli/l NaCl, 10 mM metioninę, 0,01% Pluronic F68 (wag./obj.) oraz 10 mmoli/l fosforanu, pH 7,0.

Zgodnie z wynalazkiem powyższa kompozycja zawiera 10 - 10000 μg białka erytropoetyny na ml, 10 - 50 mmoli/l argininy, pH 6 - 6,5, 10 - 100 mmoli/l siarczanu sodu. Dodatkowo ta kompozycja może zawierać metioninę (do 20 mM), do 0,1% Pluronic F68 (wag./obj.), ewentualnie do 1 mmola/l CaCl2 oraz ewentualnie 1 - 5% (wag./obj.) poliolu. Konkretnie, kompozycja ta może zawierać 10 10000 μg białka erytropoetyny/ml, 40 mmoli/l argininy, pH 6,2, 30 mmoli/l siarczanu sodu, 3% mannit (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% Pluronic F68 (wag./obj.) oraz ewentualnie 1 mmol/litr CaCl2.

Korzystnie kompozycje farmaceutyczne zawierają 10 - 10000 μg/ml erytropoetyny, korzystnie 25 - 2500 μg/ml erytropoetyny, oraz

a) 10 mM fosforan sodu/potasu, 100 mM NaCl, pH 7,0, albo

b) 10 mM fosforan sodu, 120 mM siarczan sodu, pH 6,2, albo

c) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), pH 6,2, albo

d) 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% Pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2, albo

e) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), pH 6,2, albo

f) 40 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% Pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2.

Kompozycje farmaceutyczne zawierają białko erytropoetynę w ilości 50, 100, 400, 800 lub 2500 μg/ml. Najkorzystniejsze kompozycje zawierają 10 mM fosforan sodu, 40 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% Pluronic 10 F68 (wag./obj.), pH 6,2 lub 4 0 mM argininę, 30 mM siarczan sodu, 3% mannitu (wag./obj.), 10 mM metioninę, 0,01% Pluronic F68 (wag./obj.), pH 6,2. Dalsze szczegóły dotyczące takich kompozycji są znane z WO 01/87329.

Wynalazek umożliwia leczenie zaburzeń dystrybucji żelaza w cukrzycy insulinoniezależnej przez podawanie skutecznej ilości białka erytropoetyny jak zdefiniowano powyżej.

PL 209 699 B1

W leczeniu zaburzeń żelaza w zaburzeniach ż elaza w cukrzycy EPO może być podawana w dawce 150 U/kg masy ciała dwa razy w tygodniu. Dawka moż e róż nić się w zależ ności od zapotrzebowania konkretnego pacjenta i może mieścić się w zakresie np. 100 - 200 U/kg. W zależności od okresu półtrwania stosowanej pochodnej EPO, dawka może być podawana np. 1 - 3 razy na tydzień. W zależności od zapotrzebowania konkretnego pacjenta lekarz może także wybrać inne dawkowanie.

Aktywność właściwą EPO lub koniugatów EPO można określić w różnych znanych testach. Aktywność biologiczna oczyszczonych białek EPO jest taka, że podanie białka EPO ludziom we wstrzyknięciu powoduje zwiększenie wytwarzania retikulocytów i czerwonych ciałek krwi przez komórki szpiku kostnego w porównaniu z pacjentami, którym nie podawano wstrzyknięć, lub pacjentami z grup kontrolnych. Aktywność biologiczną uzyskanych i oczyszczonych białek EPO lub ich fragmentów można przebadać metodami według Annable i in., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99 - 112 i Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Inny sposób oznaczania aktywności białka EPO, test normocytemiczny na myszach, opisano w literaturze (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) i w monografii dotyczącej erytropoetyny, Ph. Eur. BRP).

Poniżej opisano figury rysunku powołane w opisie wynalazku.

Fig. 1: Struktura podstawowa ludzkiej EPO (165 aminokwasów) (SEQ ID NO: 1).

Fig. 2: Struktura podstawowa ludzkiej EPO (166 aminokwasów) (SEQ ID NO: 2).

Wynalazek zostanie lepiej zrozumiany po zapoznaniu się z poniższym przykładem ilustrującym wynalazek.

P r z y k ł a d

Kobietę w średnim wieku, chorującą na cukrzycę, bada się pod kątem zaburzeń dystrybucji żelaza przez oznaczenie następujących parametrów - CRP (białka C-reaktywnego), ferrytyny i rozpuszczalnego receptora transferyny - jak opisali P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, plakat przedstawiany na AACC/CSCC, Corocznej Konferencji, 29 lipiec - 2 sierpień, 2001, Chicago, Illinois, USA. Wyniki wskazywały na zaburzenia dystrybucji żelaza. Pacjentkę leczono przez podskórne podawanie 150 U/kg Recormon™ (dostępnego w handlu białka erytropoetyny) dwa razy w tygodniu przez maksymalnie 12 tygodni. Następnie oznaczenie opisanych powyżej parametrów wskazało na złagodzenie zaburzenia dotyczącego niedoboru żelaza.

PL 209 699 B1

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) Nazwa: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Ulica: 124 Grenzacherstrasse (C) Miasto: Bazylea (E) Kraj: Szwajcaria (F) Kod pocztowy(ZIP): CH-4070 (G) Nr telefonu: (61) 688 11 11 (H) Nr telefaxu: (61) 688 13 95 (I) Nr telexu: 962 292 hlr ch (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Zastosowanie erytropoetyny w leczeniu cukrzycy (iii) LICZBA SEKWENCJI: 9 (iv) SPOSÓB ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: WORD (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release 2.0 <170> Patentln wersja 2.0 <210> I <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Ala 1

Pro

Arg

Leu 5

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg 10

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Glu

Ala

Lys 20

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile 25

Thr

Gly

Cys

Ala 30

Glu

His

Cys

Ser

Leu 35

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr 40

Val

Pro

Asp

Thr

Lys 45

Val

Asn

Phe

Tyr

Ala 50

Trp

Lys

Arg

Met

Glu 55

Val

Gly

Gin

Ala 60

Val

Glu

Val

Trp

Gin 65

Gly

Leu

Ala

Leu

Leu 70

Ser

Glu

Ala

Val

Leu 75

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu 80

Leu

Val

Asn

Ser

Ser 85

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro 90

Leu

Gin

Leu

His

Val 95

Asp

Lys

Ala

Val

Ser 100

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu 105

Thr

Leu

Arg 110

Ala

Leu

Gly

Ala

Gin 115

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser 120

Pro

Asp

Ala

Ala 125

Ser

Ala

Pro

Leu

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Phe

Arg

Val

PL 209 699 B1

	130				135		140
Tyr 145	Ser	Asn	Phe Leu	Arg 150	Gly Lys	Leu Lys Leu 155	Tyr Thr	Gly Glu Ala 160
Cys	Arg	Thr	Gly Asp 165

<210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ala 1

Pro

Arg

Leu 5

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg 10

Val

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Glu

Ala

Lys 20

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile 25

Thr

Gly

Cys

Ala 30

Glu

His

Cys

Ser

Leu 35

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr 40

Val

Pro

Asp

Thr

Lys 45

Val

Asn

Phe

Tyr

Ala 50

Trp

Lys

Arg

Met

Glu 55

Val

Gly

Gin

Ala 60

Val

Glu

Val

Trp

Gin 65

Gly

Leu

Ala

Leu

Leu 70

Ser

Glu

Ala

Val

Leu 75

Arg

Gly

Gin

Ala

Leu 80

Leu

Val

Asn

Ser

Ser 85

Gin

Pro

Trp

Glu

Pro 90

Leu

Gin

Leu

His

Val 95

Asp

Lys

Ala

Val

Ser 100

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu 105

Thr

Leu

Arg 110

Ala

Leu

Gly

Ala

Gin 115

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser 120

Pro

Asp

Ala

Ala 125

Ser

Ala

Pro

Leu 130

Arg

Thr

Ile

Thr

Ala 135

Asp

Thr

Phe

Arg

Lys 140

Leu

Phe

Arg

Val

Tvr 145

Ser

Asn

Phe

Leu

Arg 150

Gly

Lys

Leu

Lys

Leu 155

Tyr

Thr

Gly

Glu

Ala 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

Claims

1. Zastosowanie erytropoetyny do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń dystrybucji żelaza w cukrzycy insulinoniezależnej.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym białko erytropoetynę stanowi ludzka erytropoetyna.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym białko erytropoetynę stanowi epoetyna α lub epoetyna β.

4. Zastosowanie według zastrz. 1 - 3, w którym białko erytropoetyna jest eksprymowane przez aktywację endogennych genów.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym białko erytropoetyna ma sekwencję aminokwasów

SEQ ID NO: 1 lub SEQ ID NO: 2.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym białko erytropoetyna ma sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji.

7. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym białko erytropoetynę stanowi darbepoetyna α.

PL 209 699 B1

8. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym białko erytropoetyna zdefiniowane w zastrz. 2 - 7 jest pegilowane.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, w którym białko erytropoetyna stanowi koniugat, który to koniugat zawiera białko erytropoetynę mające co najmniej jedną wolną grupę aminową oraz wykazującą aktywność biologiczną in vivo wywoływania zwiększenia wytwarzania retikulocytów i czerwonych ciałek krwi przez komórki szpiku kostnego, wybraną z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i jej analogi, które mają sekwencję ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji lub przegrupowanie co najmniej jednego miejsca glikozylacji; przy czym to białko erytropoetyna jest kowalencyjnie związane z n ugrupowaniami glikolu polietylenowego o wzorze -CO-(CH2)x(OCH2CH2)m-OR, w którym grupa -CO każdego ugrupowania glikolu polietylenowego tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych; R oznacza C1-C6 alkil, x oznacza 2 lub 3; m oznacza 450 - 900, n oznacza 1 - 3; oraz n i m są dobrane tak, że masa cząsteczkowa koniugatu minus białka erytropoetyny wynosi 20 - 100 kilodaltonów.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, w którym x oznacza 2, m oznacza 650 - 750, n oznacza 1, a R oznacza metyl.

11. Zastosowanie według zastrz. 8, w którym białko erytropoetyna stanowi koniugat, który to koniugat zawiera białko erytropoetynę mające co najmniej jedną wolną grupę aminową oraz wykazującą aktywność biologiczną in vivo wywoływania zwiększenia wytwarzania retikulocytów i czerwonych ciałek krwi przez komórki szpiku kostnego, wybraną z grupy obejmującej ludzką erytropoetynę i jej analogi, które mają pierwotną strukturę ludzkiej erytropoetyny zmodyfikowaną przez dodanie 1 - 6 miejsc glikozylacji; przy czym to białko erytropoetyna jest kowalencyjnie związane z 1 - 3 ugrupowaniami niższo-alkoksy-glikolu polietylenowego, a każde ugrupowanie glikolu polietylenowego jest kowalencyjnie związane z białkiem erytropoetyną poprzez łącznik o wzorze -C(O)-X-S-Y-, w którym grupa C(O) tworzy wiązanie amidowe z jedną z grup aminowych, X oznacza -(CH2)k- -CH2(O-CH2-CH2)k-, k oznacza 1 - 10, Y oznacza przy czym średnia masa cząsteczkowa każdego ugrupowania glikolu polietylenowego wynosi 20 - 40 kilodaltonów, a masa cząsteczkowa koniugatu wynosi 51 - 175 kilodaltonów.

12. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym koniugat erytropoetyny ma wzór: