MXPA05002067A - Uso de la eritropoyetina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de la eritropoyetina para el tratamiento de las perturbaciones de la distribucion del hierro en pacientes con diabetes.

Description

USO DE LA ERITROPOYETINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un nuevo uso de la eritropoyetina, en especial el tratamiento de perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se conocen varias enfermedades, en las cuales el metabolismo del hierro no es normal. En un caso de anemia, no puede formarse suficiente sangre debido a una deficiencia general de hierro en el organismo. Otra condición metabólica relacionada con el hierro es la hemocrornatosis, en la cual la concentración general de hierro en el cuerpo es mayor que la normal, lo que conduce a diferentes condiciones como por ejemplo la distribución de los órganos. Las perturbaciones de la distribución del hierro difieren de la anemia y la hemocromatosis descritas anteriormente porque la concentración general de hierro en el cuerpo es normal. Por un lado, el hierro se acumula en varios órganos y puede conducir a daños y hasta la destrucción de estos órganos. Por otro lado, el uso del hierro que está presente en cantidades normales en la formación de sangre está dañado, lo que conduce a efectos secundarios que son comparables con los relacionados con la anemia. Hasta hoy, no se ha tenido conocimiento de que los pacientes que sufren de diabetes tengan una elevada (Ref. 151928) probabilidad de ser afectados por las perturbaciones de la distribución del hierro. Las perturbaciones de la distribución del hierro pueden diagnosticarse a través de varios parámetros que se utilizan comúnmente en el diagnóstico del estado del hierro. En base a las mediciones de ferritina y el receptor de transferrina soluble es posible evaluar si la concentración general de hierro en un paciente diabético es normal. Si este fuera el caso, entonces, una menor concentración de Hemoglobina en los reticulocitos es un indicador de perturbaciones de la distribución del hierro. Otro indicador es una concentración continuamente elevada y prolongada de la proteína C-reactiva (CRP) en paciente que sufren de diabetes y exhiben una concentración general normal de hierro. Un método para diagnosticar perturbaciones de la distribución del hierro ha sido el descrito por P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. oeddiger, cartel presentado en la AACC/CSCC, Annual Meeting, 29 de julio - 2 de agosto del 2001, Chicago, Illinois. Hasta el momento, aún no se ha sugerido ningún tratamiento para pacientes diabéticos que sufren de perturbaciones en la distribución del hierro. El problema subyacente de la presente invención es, por consiguiente, proveer un tratamiento para las perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes para minimizar o suprimir las desventajas mencionadas anteriormente. Se ha encontrado en forma sorpresiva que la eritropoyetina tiene un efecto beneficioso sobre las perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes. Por lo tanto, el problema queda resuelto, de acuerdo con la presente invención, suministrando eritropoyetina para uso en el tratamiento de perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes. Salvo que se indique lo contrario, las siguientes definiciones se configuran para ilustrar y definir el significado y el alcance de los diferentes términos usados para describir la presente invención. El término "alquilo inferior" como se utiliza aquí, se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene desde uno hasta seis átomos de carbono. Ejemplos de grupos alquilo inferior incluyen metilo, etilo e isopropilo, de preferencia metilo. El término "alcoxi inferior" como se utiliza aquí, se refiere a un grupo R'-O-, en el cual R' es un alquilo inferior como se describió anteriormente . El término "perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes" se refiere a una perturbación de la distribución del hierro que ocurre en pacientes que sufren de diabetes . La perturbación de la distribución del hierro puede, por ejemplo, caracterizarse como se describió anteriormente. En particular, una perturbación de la distribución del hierro se caracteriza por los ^siguientes parámetros: la concentración del receptor de transferrina soluble [mg/L] dividido por log (concentración de ferritina [/¿g/L] ) es menor a 3.5 y en forma simultánea la concentración de proteina C-reactiva es superior a 5 mg/L. El término "eritropoyetina'' o "proteína eritropoyetina" se refiere a una proteína con la actividad biológica ín vivo de hacer que las células de la médula ósea aumenten la producción de los reticulocitos y los glóbulos rojos y se selecciona del grupo formado por eritropoyetina humana y sus análogos que se definen más adelante. El término "eritropoyetina pegilada (Peg-EPO o PEG-EPO) " se refiere a una proteina eritropoyetina que está ligada en forma covalente con uno hasta tres derivados de polietileno como se describe más adelante. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Estructura primaria de la EPO humana (165 aminoácidos) (SEC ID NO:l) . Figura 2: Estructura primaria de la EPO humana (166 aminoácidos) (SEC ID NO: 2) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En mayor detalle, la presente invención se refiere al uso de la eritropoyetina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes . En una modalidad preferida, la invención se refiere a un uso como se definió anteriormente, en el cual la diabetes es diabetes mellitus no-insulino dependiente.

La presente invención es especialmente útil para la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden eritropoyetina como ingrediente farmacéuticamente activo. El término "eritropoyetina" o "proteína eritropoyetina" o "EPO" es como sigue : en particular los términos se refieren a una glicoproteína, por ejemplo, la eritropoyetina humana, por ejemplo que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la (SEC ID NO: 1) o la (SEC ID NO: 2) o una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa a éstas, cuyas propiedades biológicas se refieren a la estimulación de la producción de glóbulos rojos y la estimulación de la división y la diferenciación de progenitores eritroides comprometidos en la médula ósea. Como se utilizan aquí, estos términos incluyen tales proteínas modificadas en forma deliberada, como por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o en forma accidental a través de mutaciones. Estos términos incluyen, además, análogos que tienen desde 1 hasta 6 sitios adicionales para glicosilación, análogos que tienen al menos un aminoácido adicional en el extremo terminal carboxi de la glicoproteína, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un sitio de glicosilación, y sus análogos que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye un reordenamiento de al menos un sitio para glicosilación. Estos términos incluyen tanto la eritropoyetina humana natural como la producida en forma recombinante . En una modalidad preferida de la presente invención, la proteína eritropoyetina es una eritropoyetina humana.

Como se indica más adelante en detalle, la preparación y la purificación de la EPO son bien conocidas en el arte. Por eritropoyetina se entiende la proteína natural o recombinante, de preferencia humana, por ejemplo, epoetina alfa o epoetina beta, obtenida de cualquier fuente convencional como tejidos, síntesis de proteínas, cultivos celulares con células recombinantes o naturales. Se incluye cualquier proteína que tenga actividad de la eritropoyetina, como las muteínas o proteínas modificadas de otro modo. En una modalidad preferida de la presente invención, la proteína eritropoyetina es epoetina alfa o epoetina beta. La EPO recombinante puede prepararse a través de la expresión en líneas celulares CHO-, BHK- o HeLa, por tecnología de ADN recombinante o por activación de genes endógenos. La expresión de las proteínas, incluso por activación de gen endógeno, es bien conocida en el arte y se describe, por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,733,761, 5,641,670, y 5,733,746, y las publicaciones de patentes internacionales Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955, cuyos contenidos se incorporan aquí a modo de referencia. Se prefiere el uso como se definió anteriormente, en donde la prcteína eritropoyetina se expresa por activación del gen endógeno. Las especies preferidas de EPO para la preparación de los productos de gliqpproteína eritropoyetina son las especies de EPO humana.

De más preferencia, la especie de EPO es la EPO humana que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID N0:1 o la SEC ID NO: 2, de más preferencia la secuencia de aminoácidos SEC ID NO : 1. Una modalidad preferida de la presente invención por consiguiente, se refiere al uso como se describió anteriormente, en el cual la proteína eritropoyetina tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N0:1 o la SEC ID NO : 2. Además, la eritropoyetina puede ser un análogo de glicoproteína que tiene desde 1 hasta 6 sitios adicionales para glicosilación. Por consiguiente, la presente invención se refiere, además, al uso como se describió anteriormente, en el cual la proteína eritropoyetina tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por el agregado de desde 1 hasta 6 sitios de glicosilación. La glicosilación de una proteína, con uno o más grupos oligosacá idos , ocurre en ubicaciones específicas a lo largo de la cadena principal del polipéptido y afecta en gran medida las propiedades físicas de la proteína como la estabilidad de la proteína, la secreción, la localización sub-celular y la actividad biológica. La glicosilación usualmente es de dos tipos. Los oligosacáridos ligados por O están unidos a residuos de serina o treonina y los oligosacáridos ligados por N están unidos a residuos de asparagina. Un tipo de oligosacárido que se encuentra tanto en los oligosacáridos ligados por O como aquellos ligados por N es el ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) , que es una familia de azúcares de amino que contienen 9 o más átomos de carbono. El ácido siálico es, usualmente, el residuo terminal de los oligosacáridos ligados por 0, o ligados por N y, dado que lleva una carga negativa, confiere propiedades ácidas a la glicoproteína . La eritropoyetina humana, que tiene 165 aminoácidos, contiene tres cadenas de oligosacáridos ligados por N y una cadena de oligosacárido ligada por 0 que comprenden aproximadamente un 40% del peso molecular total de la glicoproteína. La glicosilación ligada por N ocurre en los residuos de asparagina ubicados en las posiciones 24, 38, y 83 y la glicosilación ligada por 0 ocurre en el residuo de serina ubicado en la posición 126. Las cadenas de oligosacáridos están modificadas con residuos terminales de ácido siálico. La eliminación enzimática de todos los residuos de ácido siálico de la eritropoyetina glucosilada produce la pérdida de la actividad in vivo aunque no de la actividad in vitro porque la sialilación de la eritropoyetina evita su unión, y posterior depuración, por la proteína de unión hepática. El término "eritropoyetina" incluye análogos de la eritropoyetina humana con uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana que producen un aumento en el número de sitios para la unión de ácido siálico. Estos análogos de la glicoproteína pueden generarse por mutagénesis dirigida al sitio que tiene adiciones, eliminaciones o sustituciones de los residuos de aminoácidos que aumentan o alteran los sitios que están disponibles para la glicosilació . Los análogos de glicoproteína que tienen niveles de ácido siálico mayores a los encontrados en la eritropoyetina humana se generan a través del agregado de sitios de glicosilación que no perturban la conformación secundaria o terciaria requerida para la actividad biológica. Las glicoproteínas de la presente invención incluyen, además, análogos que tienen niveles más elevados de unión a los carbohidratos en el sitio de glicosilación que usualmente incluyen la sustitución de uno o más aminoácidos en cercana proximidad a un sitio ligado por N o ligado por O. Las glicoproteínas de la presente invención incluyen, además, análogos que tienen uno o más aminoácidos que se extienden desde el extremo terminal carboxi de la eritropoyetina y proveen al menos un sitio de carbohidratos adicional. Las proteínas eritropoyetinas de la presente composición incluyen, además, análogos que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye un reordenamiento de al menos un sitio para glicosilación. Tal reordenamiento del sitio de glicosilación incluye la eliminación de uno o más sitios de glicosilación en eritropoyetina humana y el agregado de uno o más sitios no naturales de glicosilación. El aumento del número de cadenas de carbohidratos sobre la eritropoyetina, y por consiguiente, el número de ácidos siálicos por moléculas de eritropoyetina puede conferir propiedades ventajosas como una mayor solubilidad, una mayor resistencia a la proteólisis, reducida inmunogenicidad, mayor vida media sérica, y mayor actividad biológica. Los análogos de la eritropoyetina con sitios de glicosilación adicionales se describen en más detalle en la Solicitud de Patente Europea 640 619, concedida a Elliot publicada el 1 de marzo de 1995. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica de la presente invención comprende proteínas eritropoyetinas con una secuencia de aminoácidos que incluye al menos un sitio adicional para glicosilación como, sin carácter limitativo, las eritropoyetinas que comprenden la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por una modificación seleccionada de las siguientes: Asn30Thr32; AsnslThr53 , Asn57Thr59; Asn69 ; Asne9Thr71 ; SerS8Asn69Thr71 Val87Asn88Thr90 Ser87Asn88Thr90 Ser87Asn88Gly89Thr90; Ser87Asn88Thr90Thr92; Ser87Asn88Thr90Ala162; Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90; Asn89Ile90Thr91; Ser87Asn89lle90Thr91; Asni36Thri38. Asn138Thr140; Thr125; y Pro124Thr125. La anotación usada aquí para la modificación de la secuencia de aminoácidos significa que la posición o las posiciones de la correspondiente proteína no modificada (por ejemplo, hEPO de la SEC ID NO:l o la SEC ID NO: 2) indicada por los números con superíndices cambia por los aminoácidos que preceden inmediatamente los respectivos números con superíndices . La proteína eritropoyetina puede ser también un análogo que tiene al menos un aminoácido adicional en el extremo terminal carboxi de la glicoproteína, en la que el aminoácido adicional incluye al menos un sitio de glicosilación. El aminoácido adicional puede comprender un fragmento de péptido derivado del extremo terminal carboxi de la gonadotropina coriónica humana. De preferencia, la glicoproteína es un análogo seleccionado del grupo formado por, (a) eritropoyetina humana que tiene la secuencia de aminoácidos, Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gln, que se extiende desde el término carboxi; (b) el análogo en (a) comprende, además, Ser87 Asn88 Thr90 EPO; y (c) el análogo en (a) comprende, además, Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 EPO. La proteína eritropoyetina puede ser también un análogo que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye un reordenamiento de al menos un sitio para glicosilación. El reordenamiento puede comprender una eliminación de cualquiera de los sitios de carbohidrato ligado por N en la eritropoyetina humana y un agregado de un carbohidrato ligado por N en la posición 88 de la secuencia de los aminoácidos de la eritropoyetina humana. De preferencia, la glicoproteína es un análogo seleccionado del grupo formado por Gln24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gln38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; y Gln83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO. Un análogo adicional es la darbepoetina alfa. Una proteína eritropoyetina preferida en el uso descrito anteriormente es la darbepoyetina alfa. Más en particular, la proteína eritropoyetina de la presente composición farmacéutica como se describió anteriormente puede incluir, además, sus derivados pegilados. Los derivados pegilados de la eritropoyetina y su preparación son conocidos en el arte y se describen, por ejemplo, en WO 01/02017, EP-A-1064951 , EP-A-539, 167, EP-A-605,963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, la Patente de los Estados Unidos No. 5,56, EP-A-584 , 876 , WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,359,030 y 5,681,811, la Patente de los Estados Unidos No. 4,179,337, la Patente Japonesa, WO 98/32466, la Patente de los Estados Unidos No. 5,324,650. Preferible, en el uso descrito anteriormente, la proteína eritropoyetina es pegilada. Una modalidad preferida de la especie de la eritropoyetina pegilada se refiere a los derivados como se describe más adelante . Por consiguiente, la presente invención se refiere, además, al uso como se describió anteriormente, en el cual la proteina eritropoyetina es un conjugado, dicho conjugado comprende una proteína eritropoyetina como se describió anteriormente que tiene al menos un grupo amino libre y tiene la actividad biológica in vivo de hacer que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y se selecciona del grupo formado por la eritropoyetina humana y sus análogos que tienen una secuencia de la eritropoyetina humana modificada por el agregado de desde 1 hasta 6 sitios de glicosilación o un reordenamiento de al menos un sitio de glicosilación; dicha eritropoyetina está ligada en forma covalente a grupos n poli (etilenglicol) de la fórmula -CO- (CH2) x- (0CH2CH2) m-0R, con el -C0 (es decir, carbonilo) de cada grupo poli (etilenglicol) formando un enlace de amida con uno de dichos grupos amino; en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3 ; ra es desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 900; n es desde 1 hasta 3; y n y m se eligen de modo tal que el peso molecular del conjugado menos la proteina eritropoyetina es desde 20 kilodaltons hasta 100 kilodaltons. Esta invención provee, además, composiciones farmacéuticas que contienen los conjugados descritos aquí en los cuales el porcentaje de conjugados en el cual n es 1 es al menos del noventa por ciento, de preferencia al menos noventa y dos por ciento, de mayor preferencia noventa y seis por ciento de todos los conjugados de la composición. Más específicamente los conjugados anteriores pueden estar representados por la fórmula (I) P- [NHCO- (CH2)x(OCH2CH2)mOR]n (I) en donde P es el residuo de una proteína eritropoyetina como se describió aquí, (es decir, sin el grupo amino o los grupos amino que forman una ligadura de amida con el carbonilo que se muestra en la Fórmula I) , tiene la actividad biológica in vivo de hacer que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y glóbulos rojos; y en donde R es alquilo inferior; x es 2 ó 3 ; m es desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 900; n es desde 1 hasta 3; y n y m se eligen de modo tal que el peso molecular del conjugado menos la glicoproteína eritropoyetina es desde 20 kilodaltons hasta 100 kilodaltons. De acuerdo con esta invención, R es cualquier alquilo inferior. Se prefieren los conjugados en los cuales R es metilo.

El símbolo "m" representa el número de residuos de óxido de etileno (OCH2CH2) en el grupo poli (óxido de etileno) . Una sub-unidad de PEG (polietilenglicol) simple de óxido de etileno tiene un peso molecular de aproximadamente 44 daltons . De esta manera, el peso molecular del conjugado (sin incluir el peso molecular de la EPO) depende del número "m" . En los conjugados de esta invención "m" es desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 900 (que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 40 kDa) , de preferencia desde aproximadamente 650 hasta aproximadamente 750 (que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 30 kDa) . El número m se selecciona de modo tal que el conjugado resultante de esta invención tenga una actividad fisiológica comparable con la EPO no modificada, cuya actividad puede representar igual que, más que, o una fracción de la actividad correspondiente de la EPO no modificada. Un peso molecular de "aproximadamente" un número determinado significa que se encuentra comprendido dentro de un rango razonable de ese número determinado por técnicas de análisis convencionales . El número "m" se selecciona de modo tal que el peso molecular de cada grupo poli (etilenglicol) ligado en forma covalente a la glicoproteína eritropoyetina es desde aproximadamente 20 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, es de preferencia aproximadamente 30 kDa.

En los conjugados de esta invención, número "n" es el número de grupos poli ( et ilenglicol ) unidos en forma covalente a los grupos amino libres (entre los que se incluyen los grupos e-amino de un aminoácido de lisina y/o el grupo amino terminal-amino) de una proteina erit ropoyetina a través de ligadura (s) de amida. Un conjugado de esta invención puede tener uno, dos o tres grupos PEG por cada molécula de EPO. "n" es un número entero que varia desde 1 hasta 3, de preferencia x,n" es 1 ó 2, y de mayor preferencia "n" es 1. Un conjugado preferido de los conjugados descritos anteriormente comprende compuestos en los cuales x es 2, m es desde 650 hasta 750, n es 1 y R es metilo. El compuesto de fórmula (I) puede prepararse a partir del material polimérico conocido: en el cual R y m son como se describieron anteriormente, por condensación del compuesto de Fórmula II con la glicoproteina eritropoyetina . Los compuestos de Fórmula (II) en los cuales x es 3 son alfa-alcoxi inferior, ésteres de succinimidilo de ácido butírico de poli (etilenglicol) (alcoxi inferior-PEG-SBA) . Los compuestos de fórmula (II) en los cuales x es 2 son alfa-alcoxi inferior, esteres de succinimidilo de ácido propiónico de poli (etilenglicol) (alcoxi inferior-PEG-SPA) . Puede utilizarse cualquier método convencional de hacer reaccionar un éster activado con una amina para formar una amida. En la reacción que se describió anteriormente, el éster de succinimidilo ejemplificado es un grupo saliente que produce la formación de la amida. El uso de ésteres de succinimidilo como los compuestos de fórmula II para producir conjugados con las proteínas se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,672,662, concedida el 30 de septiembre de 1997 (Harris, et al.). La EPO humana contiene nueve grupos amino libres, el grupo amino terminal-amino más los grupos e- amino de 8 residuos de lisina. Cuando el reactivo de pegilación se combinó con un compuesto de SBA de fórmula II, se ha encontrado que con pH 7.5, una relación de proteína: PEG de 1:3, y una temperatura de reacción de 20-25°C, se produce una mezcla de mono-, di-, y cantidades de trazas de la especie tri -pegilada . Cuando el reactivo de pegilación era un compuesto de SPA de fórmula II, en condiciones similares excepto que la relación de proteína: PEG era de 1:2, se produce principalmente la especie mono-pegilada . La EPO pegilada puede administrarse como una mezcla, o a medida que la cromatografía por intercambio de cationes separa diferentes especies pegiladas . Por la manipulación de las condiciones de reacción (por ejemplo, la relación de los reactivos, pH, temperatura, concentración de proteínas, tiempo de reacción etc.), pueden variarse las cantidades relativas de las diferentes especies pegiladas. Una modalidad preferida adicional de la presente invención se refiere al uso como se definió anteriormente, en el cual la proteína eritropoyet ina es un conjugado, dicho conjugado comprende una proteína eritropoyet ina como se definió anteriormen e que tiene al menos un grupo amino libre y tiene la actividad biológica in vivo de hacer que las células de la médula ósea aumenten la producción de ret iculocit os y glóbulos rojos y se selecciona del grupo formado por proteína eritropoyet ina humana y sus análogos que tienen la estructura primaria de proteína eritropoyet ina humana modificada por el agregado de desde 1 hasta 6 sitios de glicosilación; dicha proteína eri tropoyetina está ligada en forma covalente a desde uno hasta tres grupos alcoxi inferior poli ( et ilengl i col ) , cada grupo poli (etilenglicol ) está ligado en forma covalente a la proteína eritropoyet ina a través de una ligadura de la fórmula -C(0) -X-S-Y-con el C (0) de la ligadura formando un enlace de amida con uno de dichos grupos amino, X es -(CH2) CH2 (0CH2-C-H-, - . k es esde 1 hasta 1O. Y p.s el peso molecular promedio de cada resto de poli (etilenglicol) es desde aproximadamente 20 kilodaltons hasta aproximadamente 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado es desde aproximadamente 51 kilodaltons hasta aproximadamente 175 kilodaltons. Esta especie de eritropoyetina también puede estar representada por la fórmula (III) P- [NH-CO-X-S-Y- (OCH2CH2) m-OR] „ (III) en la cual R puede ser cualquier alquilo inferior. Un alquilo inferior preferido es metilo, X puede ser -(CH2)k_ o -CH2 ( 0-CH2-CH2 ) k~ en donde k es desde 1 hasta aproximadamente 10. De preferencia, k es desde 1 hasta aproximadamente 4, de más preferencia, k es 1 ó 2. De mayor preferencia, X es - (CH2) . . En la Fórmula 1, Y es de preferencia mayor preferencia En la fórmula (III), el número m se selecciona de modo tal que el conjugado resultante de fórmula (III) tenga una actividad fisiológica comparable con la EPO no modificada, cuya actividad puede representar igual que, más que,_^ o una fracción de la actividad correspondiente de la EPO no modificada, m representa el número de residuos de óxido de etileno en la unidad de PEG. Una sub-unidad de PEG simple de -(OCH2CH2)- tiene un peso molecular de aproximadamente 44 daltons. De esta manera, el peso molecular del conjugado (sin incluir el peso molecular de la EPO) depende del número m. Un peso molecular de "aproximadamente" un número determinado significa que se encuentra comprendido dentro de un rango razonable de ese número determinado por técnicas de análisis convencionales, m es un número entero que varía desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 900 (que corresponde a un peso molecular de desde 20 hasta 40 kDa) , de preferencia m es desde aproximadamente 550 hasta aproximadamente 800 (aproximadamente 24 hasta 35 kDa) , y de mayor preferencia m es desde aproximadamente 650 hasta aproximadamente 700 (aproximadamente 29 hasta aproximadamente 31 kDa) . En la fórmula (III) , el número n es el número de grupos e-amino de un aminoácido de lisina en una proteina eritropoyetina ligada en forma covalente a una unidad de PEG a través de una ligadura de amida. Un conjugado de esta invención puede tener una, dos o tres unidades de PEG por cada molécula de EPO. n es un número entero que varia desde 1 hasta 3 , de preferencia n es 1 ó 2 , y de mayor preferencia n es 1. Las proteínas eritropoyetinas preferidas de fórmula (III) están representadas por las fórmulas: En la modalidad más preferida de la presente invención, un conjugado de eritropoyetina está representado por la fórmula: en la cual en las fórmulas anteriores n es un número entero desde 1 hasta 3; m es un número entero desde 450 hasta 900; R es alquilo inferior; X es -(CH2)k- o -CH2 (0-CH2-CH2) k~, y P es el residuo de la proteina eritropoyetina sin el grupo o los grupos amino que forman una ligadura de amida con X. Otros productos de glicoproteina eritropoyetina preferidos están representados por las fórmulas: Los productos de glicoproteina eritropoyetina más preferidos están representados por la fórmula: Estas proteínas eritropoyetinas pueden prepararse por (a) reacción covalente de un grupo e-amino de un aminoácido de Usina de una proteina eritropoyetina representada por la fórmula, P-[NH2]n, con un reactivo bi-funcional representado por la fórmula, Z-CO-X-S-Q, para formar un intermediario con una ligadura de amida representada por la fórmula: P- [NH-CO-X-S-Q]n en donde P es una proteína eritropoyetina inferior al grupo amino que forma una ligadura de amida; n es un número entero que varía desde 1 hasta 3; Z es un grupo reactivo, por ejemplo, un éster carboxílico-NHS; X es -(CH2)k- o -CH2 (0-CH2-CH2)k~/ en donde k es desde 1 hasta aproximadamente 10; y Q es un grupo protector, como alcanoilo, por ejemplo acetilo. (b) reacción covalente del intermediario con una ligadura de amida obtenida de la etapa (a) con un derivado de poli (etilenglicol) activado representado por la fórmula, W-[OCH2CH2]m-OR, para formar un producto de glicoproteina eritropoyetina representado por la fórmula: en la cual W es una forma reactiva de sulfhidrilo de Y; m es un número entero que varia desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 900; R es alquilo inferior; e Y es como se definió anteriormente. En esta modalidad, el reactivo bi-funcional es, de preferencia N-succinimidil-S-acetiltiopropionato o N-succinimidil-S-acetiltioacetato, Z es, de preferencia N-hidroxisuccinimida, y el derivado de poli (etilenglicol) activado W- [OCH2CH2] m-OR se selecciona, de preferencia, del grupo formado por yodo-acetil-metoxi-PEG, metoxi-PEG-vinilsulfona, y metoxi-PEG-maleimida . En más detalle, las proteínas eritropoyetinas de fórmula (III) pueden prepararse por enlace covalente de grupos tiol a EPO ("activación") y acoplamiento de la EPO activada resultante con un derivado de poli (etilenglicol) (PEG) . La primera etapa para la preparación de EPO pegilada de acuerdo con la presente invención comprende ligar en forma covalente los grupos tiol a través de los grupos NH2 de la EPO. Esta activación de la EPO se realiza con reactivos bi-funcionales que transportan un grupo tiol protegido y un grupo reactivo adicional, como ésteres activos (por ejemplo, a succinimidiléster) , anhídridos, ésteres de ácidos sulfónicos, halogenuros de ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, respectivamente. El grupo tiol está protegido por grupos conocidos en el arte, por ejemplo, grupos acetilo. Estos reactivos bi-funcionales tienen la capacidad de reaccionar con los grupos ?-amino de los aminoácidos de lisina al formar una ligadura de amida. La primera etapa de la reacción se define a continuación: EPO, n y X son como se definieron anteriormente y Z es un grupo reactivo conocido en el arte, por ejemplo, un sustítuyente N-hidroxi-succinimida (NHS) de la fórmula En una modalidad preferida la activación de los grupos e-amino lisina se realiza por reacción con reactivos bi-funcionales que tienen un resto succinimidilo . Los reactivos bi-funcionales pueden transportar diferentes especies espadadoras, por ejemplo restos -(CH2)k~ ° -CH2- (0-CH2-CH2-)k_/ en donde k es desde 1 hasta aproximadamente 10, de preferencia desde 1 hasta aproximadamente 4, y de más preferencia 1 ó 2, y de mayor preferencia 1. Ejemplos de estos reactivos son N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) y N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) éster acetiltioalquil-carboxilico-NHS-, como SATP SATA 2- (Acetiltio) - (etoxi) k-ácido acético-NHS-éster con k como se definió anteriormente.

La preparación de los reactivos bi-funcionales se conoce en el arte. Los precursores de 2- (acetiltio) - (etoxi) ácido acético-NHS-ésteres se describen en la DE-3924705, mientras que la derivación al compuesto acetiltio se describe en March, J. , Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill , 1977, 375-376. SATA se encuentra disponible comercialmente (Molecular Probes, Eugene, OR, USA y Pierce, Rockford, IL) . El número de grupos tiol que se agregará a una molécula de EPO puede seleccionarse ajustando los parámetros de la reacción, es decir, la concentración de proteína (EPO) y la relación de proteína/reactivo bi-funcional . De preferencia, la EPO se activa a través de la ligadura covalente de desde 1 hasta 5 grupos tiol por cada molécula de EPO, de mayor preferencia desde 1.5 hasta 3 grupos tiol por cada molécula de EPO. Estos rangos se refieren a la distribución estadística del grupo tiol sobre la población de proteínas EPO. La reacción se lleva a cabo, por ejemplo, en una solución buffer acuosa, pH 6.5-8.0, por ejemplo, en fosfato de potasio 10 mM, NaCl 50 niM, pH 7.3. El reactivo bi-funcional puede agregarse en DMSO. Luego de la finalización de la reacción, de preferencia luego de 30 minutos, la reacción se interrumpe mediante el agregado de lisina. El exceso de reactivo bi-funcional puede separarse a través de métodos conocidos en el arte, por ejemplo, por diálisis o filtración en columna. El número promedio de grupos tiol agregados a la EPO puede determinarse a través de métodos fotométr icos descritos en, por ejemplo, Grasetti, D.R. y Murray, J.F. en J. Appl . Biochem. Biotechnol. 119, 41 - 49 (1967) . A la reacción anterior le sigue el acoplamiento covalente de un derivado de poli ( etilenglicol) (PEG) activado. Los derivados apropiados de PEG son moléculas de PEG activadas con un peso molecular promedio de desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 kDa, de más preferencia desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 35 kDa, y de mayor preferencia aproximadamente 30 kDa. Los derivados de PEG activados son conocidos en el arte y se describen en, por ejemplo, en Morpurgo, M. et al. J. Bioconj . Chem. (1996) 7_, página 363 ff para PEG-vinil sulf ona . Las especies de PEG de cadena lineal o de cadena ramificada son apropiadas para la preparación de los compuestos de Fórmula I. Ejemplos de reactivos de PEG reactivos son yodo-acetil-metoxi-PEG y metoxi-PEG-vinilsulfona : El uso de estas sustancias de yodo activado se conoce en el arte y se describe por ejemplo por Hermanson, G. T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148. De mayor preferencia, las especies de PEG se activan a través de la maleimida usando (alcoxi inferior-PEG-maleimida) , como metoxi-PEG-maleimida (PM 30000; Shearwater Polymers, Inc.) . La estructura de alcoxi inferior-PEG-maleimida es la siguiente: con R y m son como se definieron anteriormente, preferencia La reacción de acoplamiento con alcoxi inf erior-PEG-maleimida tiene lugar después de la disociación in situ del grupo protector tiol en una solución buffer acuosa, por ejemplo, fosfato de potasio 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6.2. La disociación del grupo protector puede realizarse, por ejemplo, con hidroxil amina en DMSO a 25°C, pH 6.2 durante aproximadamente 90 minutos. Para la modificación de PEG, la relación molar de la EPO activada/alcoxi inferior-PEG-maleimida debe ser desde aproximadamente 1:3 hasta aproximadamente 1:6, y de preferencia 1:4. La reacción puede interrumpirse a través del agregado de cisteína y la reacción de grupos tiol restantes (-SH) con N-metilmaleimida u otros compuestos apropiados capaces de formar enlaces de disulfuro. Debido a que la reacción de cualquiera de los grupos tiol activos restantes con un grupo protector como N-metilmaleimida u otro grupo protector apropiado, las gl icoproteínas EPO presentes en los conjugados de esta invención pueden contener tales grupos protectores . En general el procedimiento descrito aquí producirá una mezcla de moléculas que tienen números variables de tioles protegidos a través de diferentes números del grupo protector, dependiendo del número de grupos tiol activados en la glicoproteina que no están conjugados a la PEG-maleimida. - Mientras que la N-metilmaleimida forma el mismo tipo de enlace covalente cuando se usa para bloquear los grupos tiol restantes en la proteína pegilada, los compuestos de disulfuro conducirán en una reacción de intercambio de sulfuro/disulfuro intermolecul r a un acoplamiento con puente al disulfuro del reactivo de bloqueo. Los reactivos de bloqueo preferidos para ese tipo de reacción de bloqueo son la glutationa oxidada (GSSG) , la cisterna y la cistamina. Mientras que con la cisterna no se introduce carga adicional en la proteína pegilada, el uso de los reactivos de bloqueo GSSG o cistamina produce una carga negativa y positiva adicional. La purificación adicional de los compuestos de fórmula (III), incluyendo la separación de las especies mono-, di- y tri-EPO pegilada, puede realizarse a través de métodos conocidos en el arte, por ejemplo, cromatografía en columna. Los derivados de eritropoyet ina pegilada de preferencia contienen al menos noventa por ciento de conjugados mono-PEG. Usualmente los conjugados mono-PEG de las glicoproteínas eritropoyetinas son deseables, dado que tienden a tener una actividad más alta que los conjugados di-'PEG. El porcentaje de conjugados mono-PEG así como también la relación de las especies mono- y di-PEG pueden controlarse reuniendo fracciones más amplias alrededor del pico de elución para reducir el porcentaje de mono-PEG o fracciones más angostas para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Aproximadamente, el noventa por ciento de los conjugados mono-PEG es un buen balance de rendimiento y actividad. En ocasiones, pueden desearse las composiciones en las cuales, por ejemplo, al menos el noventa y dos por ciento o al menos noventa y seis por ciento de los conjugados son especies mono-PEG (n es igual a 1) . En una modalidad de esta invención el porcentaje de conjugados en los cuales n es 1 es desde noventa por ciento hasta noventa y seis por ciento. Las composiciones farmacéuticas que comprenden eritropoyet ina pegilada son conocidas en el arte y se describen, por ejemplo en la solicitud de patente internacional WO 01/87329. Las composiciones pueden comprender desde 10 hasta 10000 µ< de una proteína erit ropoyet ina por mi como se definió anteriormente. De preferencia, las composiciones comprenden desde 10 hasta 1000 tg, por ejemplo 10, 50, 100, 400, 800 ó 2500 /ig por mi. En forma adicional, las composiciones pueden comprender desde 10 ^g hasta 10000 µg de proteína eritropoyet ina por mi, 10-200 mmol/1 de sulfato, 10 hasta- 50 mmol/1 de fosfato, pH 6.0 hasta 6.5. Esta composición puede comprender, además, hasta 20 m de metionina, 1-5% de un poliol (p/v) , hasta 0.1% de pluronic F68 (p/v) y en forma opcional hasta 1 mM de CaCl2. Un ejemplo de esta composición comprende desde 10 /xg hasta 10000 g de proteína eritropoyetina por mi, 40 mmol/1 de sulfato, 10 mmol/1 de fosfato, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2. En forma alternativa puede comprender desde 10 hasta 10000 µg de proteína eritropoyet ina por mi, 10 hasta 100 mmol/1 de NaCl, 10 hasta 50 mmol/1 de fosfato, pH 6.0 hasta 7.0, en forma opcional 1-5% (p/v) de un poliol. En forma adicional, esta composición puede comprender hasta 20 mM de metionina, hasta 0.1% de pluronic F68 (p/v) y en forma opcional hasta 7.5 µt???/? de CaCl2- Específicamente, esta composición puede comprender desde 10 g hasta 10000 ^g de proteína eritropoyet ina por mi, 100 mmol/1 de NaCl, 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) , y 10 mmol/1 de fosfato, pH 7.0. La presente invención se refiere, además, a la composición anterior que comprende desde 10 ^g hasta 10000 µg de proteína eritropoyet ina por mi, 10 hasta 50 mmol/1 de arginina, pH 6 hasta pH 6.5, 10 hasta 100 mmol/1 de sulfato de sodio. En forma adicional, esta composición puede comprender hasta 20 mM de metionina, hasta 0.1% de pluronic F68 (p/v), en forma opcional hasta 1 mmol/1 de CaCl2 y en forma opcional 1-5% (p/v) de un poliol . Específicamente, esta composición puede comprender desde 10 /¿g hasta 10000 /¿g de proteina eritropoyetina por mi, 40 mmol/1 de arginina, pH 6.2, 30 mmol/1 de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) y en forma opcional 1 mmol/1 de CaCl2. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a composiciones que comprenden 10 hasta 10000 µ?/ml de eritropoyetina , de preferencia 25 hasta 2500 g/ml de eritropoyet ina , y a) 10 mM de fosfato de sodio/potasio, 100 mM de NaCl, pH 7.0, o b) 10 mM de fosfato de sodio, 120 mM de sulfato de sodio , pH 6.2, o c) 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , pH 6.2, o d) 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2, o e) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , pH 6.2, o f) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v), pH 6.2.

En la modalidad más preferida, las composiciones comprenden una cantidad de proteína eritropoyetina de 50 , 100 , 400 , 800 ó 2500 µ /t?1. Las composiciones más preferidas comprenden tanto 10 mM de fosfato de sodio, 40 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) , pH 6.2 como 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sodio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0.01% de pluronic F68 (p/v) , pH 6.2. A partir de la WO 01/87329 son conocidos detalles adicionales de tales composiciones. La invención se refiere, además, a un método para tratar perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes que comprende la administración de una cantidad efectiva de proteina eritropoyetina como se definió anteriormente. En forma adicional, la invención se refiere a un medicamento para tratar perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes caracterizado porque contiene una cantidad efectiva de proteína eritropoyetina. En los casos anteriores, la diabetes mellitus, no-insulino dependiente es la forma preferida de diabetes . En el tratamiento de las perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes, la EPO puede, por ejemplo, administrarse en una dosis de 150 U/kg de peso corporal dos veces una semana. La dosis puede ser variada de acuerdo con la necesidad del paciente en particular y puede además estar en un intervalo de, por ejemplo, 100 hasta 200 U/kg. Dependiendo del periodo de vida media del derivado de EPO utilizado, puede administrarse una dosis entre, por ejemplo, 1 ó 3 veces por semana. Dependiendo de la necesidad de un paciente en particular, también es posible que un médico elija una dosis diferente. La actividad especifica de la EPO o los conjugados de EPO de acuerdo con esta invención puede administrarse a través de varios ensayos conocidos en el arte. La actividad biológica de las proteínas de EPO purificadas de esta invención es tal que la administración de la proteína EPO mediante inyección a pacientes humanos logra que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y glóbulos rojos en comparación con los grupos de sujetos de control o no inyectados. La actividad biológica de las proteínas EPO, o sus fragmentos, obtenidas y purificadas de acuerdo con esta invención puede probarse a través de métodos de acuerdo con Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org . (1972) 47: 99-112_y Pharm. Europa Spec . Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) . Otro ensayo biológico para determinar la actividad de la proteína EPO, el ensayo normoci t émico en el ratón, se describe en el arte (por ejemplo, P arm. Europa Spec . Issue Erythropoie in BRP Bio 1997(2) , y la monografía de la eritropoyet ina de Ph., Eur . BRP . ) . La invención se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos que ilustran, aunque no limitan, la invención que aquí se describe. EJEMPLO Se revisa una mujer de mediana edad que sufre de diabetes para evaluar las perturbaciones de la distribución del hierro a través de la determinación de los siguientes parámetros - CRP (proteína C-reactiva) , receptor de ferritina y transf errina soluble - como se describe en P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, cartel presentado en AACC/CSCC, Annual Meeting, 29 de julio - 2 de agosto de 2001, Chicago, Illinois. Los resultados muestran perturbaciones de la distribución del hierro. Se trata a la paciente por vía subcutánea con 150 U/kg de Recormon™ (disponible comercialmente como proteína eritropoyet ina ) dos veces por semana durante un máximo de 12 semanas. De allí en adelante, la determinación de __los parámetros como se describió anteriormente muestra una mejoría del trastorno de la deficiencia del hierro . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invenció .

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. El uso de proteína eritropoyet ina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la diabetes es diabetes mellitus no-insulino dependiente.

3. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eritropoyetina es una eritropoyetina humana.

4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la proteína eritropoyetina es epoetina alfa o epoetina beta.

5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína eritropoyetina -se expresa por activación del gen endógeno .

6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 , en donde la proteína eri tropoyet ina tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:l o la SEC ID NO : 2.

7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eri ropoyet ina tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por el agregado de desde 1 hasta 6 sitios de glicosilación .

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 , en donde la proteína eritropoyetina es darbepoetina alfa.

9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteína eritropoyetina como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 hasta 8 es pegilada.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, en donde la proteína eritropoyetina es un conjugado, dicho conjugado comprende una proteína eritropoyetina que tiene al menos un grupo amino libre y tiene la actividad biológica in vivo de hacer que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticuloci tos y glóbulos rojos y se selecciona del grupo formado por la eritropoyetina humana y sus análogos que tienen una secuencia de la eritropoyetina humana modificada por el agregado de desde 1 hasta 6 sitios de glicosilación o un reordenamiento de al menos un sitio de glicosilación; dicha proteína eritropoyet ina está ligada en forma covalente a grupos n poli (etilenglicol ) de la fórmula -C0- (CH2) x- (OCH2CH2) m-OR o con el -C0 de cada grupo poli (etilenglicol) formando un enlace de amida con uno de dichos grupos amino; en la cual R es alquilo inferior; x es 2 ó 3 ; m es desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 900; n es desde 1 hasta 3; y n y m se eligen de modo tal que el peso molecular del conjugado menos la proteína eritropoyetina es desde 20 kilodaltons hasta 100 kilodaltons .

11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde x es 2, m es 650 hasta 750, n es 1 y R es metilo.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 9, en donde la proteína eritropoyetina es un conjugado, dicho conjugado comprende una proteína eritropoyet ina que tiene al menos un grupo amino libre y tiene la actividad biológica in vivo de hacer que las células de la médula ósea aumenten la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y se selecciona del grupo formado por proteína eritropoyetina humana y sus análogos que tienen la estructura primaria de proteína eritropoyetina humana modificada por el agregado de desde 1 hasta 6 sitios de glicosilación; dicha proteina eritropoyetina está ligada en forma covalente a desde uno hasta tres grupos alcoxi inferior poli (etilenglicol ) , cada grupo poli ( etilenglicol ) está ligado en forma covalente a la proteina eritropoyetina a través de una ligadura de la fórmula -C(0)-X-S-Y- con el C(0) de la ligadura formando un enlace de amida con uno de dichos grupos amino, X es -(CH2)k~ o -CH2 ( 0-CH2-CH2 ) y- , k es desde 1 hasta 10 , Y es el peso molecular promedio de cada resto de poli ( etilenglicol ) es desde aproximadamente 20 kilodaltons hasta aproximadamente 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado es desde aproximadamente 51 kilodaltons hasta aproximadamente 175 kilodaltons.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, con un conjugado de eritropoyetina de la fórmula : en donde n es un número entero desde 1 hasta 3; m es un número entero desde 450 hasta 900; R es alquilo inferior; X es -(CH2)k- o -CH2 (0-CH2-CH2) k-, k es 1 hasta 10 y P es el residuo de la proteína eritropoyetina sin los grupos n amino que forman una ligadura de amida con X.

14. Un medicamento para tratar perturbaciones de la distribución del hierro en pacientes con diabetes, caracterizado porque contiene una cantidad efectiva de proteína eritropoyetina.