BRPI0313792B1 - utilização de proteína de eritropoetina, método para tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em diabetes e medicamento para o seu tratamento - Google Patents
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Abstract
"utilização de proteína de eritropoetina, método para tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em diabetes e medicamento para o seu tratamento". a presente invenção refere-se ao uso de eritropoetina para o tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em diabetes.
Description
UTILIZAÇÃO DE PROTEÍNA DE ERITROPOETINA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS DE DISTRIBUIÇÃO DE FERRO EM DIABETES E MEDICAMENTO PARA O SEU TRATAMENTO A presente invenção refere-se a um novo uso de eritropoetina, especialmente para o tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em diabetes.
Conhecem-se várias enfermidades, nas quais o metabolismo do ferro não é normal. Em uma anemia, pode ser formada insuficiência de sangue em decorrência de uma ausência global de ferro no corpo. Uma outra condição metabólica relacionada com o ferro consiste na hemocromatose, em que a concentração global de ferro no corpo é mais lata do que o normal, o que conduz a várias condições, tais como, por exemplo, a destruição de órgãos.
Os distúrbios da distribuição de ferro diferem da anemia e da hemocromatose descritos anteriormente, porque a concentração global de ferro no corpo é normal. Por um lado, o ferro acumula-se nos vários órgãos e pode conduzir a danos e até à destruição desses órgãos. Por outro lado, o uso do ferro que se encontra presente em quantidades normais na formação de sangue é prejudicado, conduzindo a efeitos secundários que são comparáveis àqueles relacionados com anemia.
Até agora não se sabia que os pacientes que sofriam de diabetes tinham uma alta probabilidade de serem afetados por distúrbios de distribuição de ferro. Os distúrbios de distribuição de ferro podem ser diagnosticados por vários parâmetros os quais são amplamente utilizados no diagnóstico do estado do ferro. Com base nas medições de ferritina e receptor de transferência solúvel é possível avaliar se a concentração total de ferro em um paciente diabético é normal. Se este for o caso, então uma concentração abaixada de hemoglobina nos reticulócitos é um indicador para distúrbios de distribuição de ferro. Um outro indicador é uma concentração elevada continuamente prolongada da proteina C-reativa em pacientes que padecem de diabetes e que exibem uma concentração de ferro total normal. Um método para o diagnóstico de distúrbios de distribuição de ferro foi descrito por P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, posteriormente apresentado na AACC/CSCC, Annual Meeting, July 29 - August 2, 2001, Chicago, Illinois.
Desta maneira, ainda não foi sugerido qualquer tratamento para pacientes diabéticos que padecem de distúrbios na distribuição de ferro. O problema subjacente à presente invenção é, portanto, proporcionar um tratamento para distúrbios da distribuição de ferro em diabetes a fim de reduzir ao mínimo ou de suprimir as desvantagens mencionadas anteriormente. Descobriu-se, surpreendentemente, que a eritropoetina é dotada de um efeito benéfico nos distúrbios de distribuição de ferro em diabetes. O problema é solucionado, portanto, de acordo com a presente invenção, pela pro- visão de eritropoetina para o uso no tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em diabetes. A não ser que de outro modo indicadas, as descrições seguintes são expostas para ilustrarem e definirem o significado e escopo dos vários termos usados para descreverem a invenção neste contexto.
Da maneira que é utilizado neste contexto, o termo "alquila inferior" significa um grupo de alqui-la linear ou ramificada dotada de u a seis átomos de carbono. Exemplos de grupos de alquila inferior incluem metilo, etilo e isopropilo, preferentemente metilo.
Da maneira que é utilizado neste contexto, o termo "alcoxila inferior" significa um grupo R'-0-, em que R' é um alquila inferior tal como descrito anteriormente .
Da maneira que é utilizado neste contexto, o termo "distúrbios de distribuição de ferro em diabetes" refere-se a um distúrbio de distribuição de ferro que ocorre em pacientes que padecem de diabetes. 0 distúrbio de distribuição de ferro pode, por exemplo, ser caracterizado tal como descrito anteriormente. Com particularidade, um distúrbio de distribuição de ferro é caracterizado pelos seguintes parâmetros: a concentração de receptor de transferrina solúvel [mg/1] dividido pela log(concentração de ferritina [^g/l]) é menor do que 3,5 e simultaneamente a concentração de proteína C-reativa está acima de 5 mg/1. 0 termo "eritropoetina" ou "proteína de eritropoetina" refere-se a uma proteína com a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue e selecionada a patrir do grupo que consiste de eritropoetina humana e análogos que são definidos mais adiante. O termo eritropoetina pegilada "Peg-EPO ou PEG-EPO" refere-se a uma proteína de eritropoetina que é ligada covalentemente com de um a três derivados de polietileno tais como descritos mais adiante.
Descrição dos Desenhos: A Figura 1 é uma estrutura principal de EPO humano (165 aminoácidos) (SEQ ID N0:1). A Figura 2 é uma estrutura principal de EPO humano (166 aminoácidos) (SEQ ID N0:2).
De uma maneira mais detalhada, a presente invenção refere-se ao uso de eritropoetina na manufatura de um medicamento para o tratamento de distúrbios da distribuição de ferro em diabetes. Em uma concretização preferida, a invenção relaciona-se com uma utilização tal como descrita anteriormente, em que o diabetes é diabetes mellitus não dependente de insulina. A presente invenção é especialmente útil para a preparação de composições farmacêuticas que compreendem eritropoetina como ingrediente farmaceutica-mente ativo. O termo "eritropoetina" ou "proteína de eritropoetina" ou "EPO" é o seguinte: particularmente os termos referem-se a uma glicoproteína, por exemplo, a eritropoetina humana, por exemplo, tendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na (SEQ ID NO: 1) ou na (SEQ ID NO: 2) ou uma seqüência de aminoácidos substancialmente homóloga z elas, cujas propriedades biológicas referem-se ao estimulo da produção das células vermelhas do sangue e ao estimulo da divisão e diferenciação de progenitores eritróides incumbidos na medula óssea. Da maneira que são utilizados neste contexto, estes termos incluem essas proteínas modificadas delibe-radamente, tais como por exemplo, por mutagênese dirigida por local ou acidentalmente através de mutações. Estes termos também incluem análogos que são dotados de 1 a 6 locais adicionais para glicosilação, análogos que são dotados de pelo menos um aminoácido adicional na extremidade terminal carboxila da glicoproteína, em que o aminoácido adicional inclui pelo menos um local de glicosilação, e análogos que são dotados de uma seqüência de aminoácidos que inclui uma reordenação de pelo menos um local para glicosilação. Estes termos incluem eritropoetina humana tanto natural quanto produzida de forma recombinante. Em uma concretização preferida da presente invenção, a eritropoetina é uma eritropoetina humana.
Tal como se encontra estabelecido mais adiante, a preparação e a purificação da EPO são amplamente conhecidas na técnica. Por eritropoetina entende-se a proteína natural ou recombinante, preferente-mente humana, conforme obtida a partir de qualquer fon- te convencional tal como tecidos, síntese de proteína, cultura de células com células naturais ou recombinan-tes. Qualquer proteína que seja dotada da atividade de eritropoetina, tais como muteínas ou proteínas de outro modo modificadas, encontram-se abrangidas. Em uma concretização preferida da presente invenção, a proteína de eritropoetina é epoetina alfa ou epoetina beta. A EPO recombinante pode ser preparada por meio de expressão nas linhas de células CHO-, BHK- ou HeLa, por tecnologia de DNA recombinante ou por ativação de genes endógenos. A expressão de proteínas, incluindo por ativação de genes endógenos, é amplamente conhecida na técnica e encontra-se exposta, por exemplo, nas patentes U.S. N°s 5.733.761, 5.641.670 e 5.733.746, e nas publicações de patentes internacionais Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 e WO 91/09955, ficando o conteúdo de cada uma delas incorporado neste contexto por referência. A utilização tal como definida anteriormente, em que a proteína de eritropoetina é expressada por ativação de gene endógeno é preferida. As espécies de EPO preferidas para a preparação de produtos de glicoproteína de eritropoetina são as espécies de EPO humana. Com maior preferência, a espécie de EPO é a EPO humana que tem a seqüência de aminoácidos exposta na SEQ ID NO:l ou na SEQ ID NO:2, com maior preferência a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:l. Portanto, uma concretização preferida da presente invenção refere-se à utilização tal como descrita anteriormente, em que a proteína de eri-tropoetina tem a seqüência de aminoácidos SEQ ID N0:1 ou na SEQ ID NO:2.
Além disso, a eritropoetina poderá ser um análogo de glicoproteína dotado de 1 a 6 locais adicionais para glicosilação. Portanto, a presente invenção também se refere à utilização tal como descrita anteriormente, em que a proteína de eritropoetina é dotada da seqüência de eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação. A glicosilação de uma proteína, com um ou mais grupos de oligossacarí-deos, ocorre em locais específicos ao longo de uma espinha dorsal de polipeptídios e afeta enormemente as propriedades físicas da proteína, tais como estabilidade da proteína, secreção, localização subcelular, e atividade biológica. A glicosilação é usualmente de dois tipos. Os oligossacarídeos de ligação "0" são presos aos resíduos de serina ou treonina e os oligossacarídeos de ligação "N" são presos aos resíduos de asparagina. Um tipo de oligossacarídeo encontrado nos oligossacarídeos de ligação "N" e de ligação "0" é o ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), que é uma família dos amino açúcares que contêm 9 ou mais átomos de carbono. 0 ácido siálico é usualmente o resíduo terminal dos oligossacarídeos de ligação "N" e de ligação "0" e, porque ele comporta uma carga negativa, confere propriedades ácidas à glicoproteína. A eritropoetina humana, dotada de 165 aminoácidos, contém três ca- deias de oligossacarideos de três ligações "N" e uma ligação "0" que compreendem cerca de 40% do peso molecular total da glicoproteina. A glicosilação de ligação "N" ocorre nos residuos de asparagina localizados nas posições 24, 38 e 83, e a glicosilação de ligação "0" ocorre em um resíduo de serina localizado na posição 126. As cadeias de oligossacarideos são modificadas com resíduos de ácido siálico terminais. A remoção enzimática de todos os resíduos de ácido siálico a partir da eritropoetina glicosilada resulta na perda de atividade in vivo, mas não na atividade in vitro porque a sialilação da eritropoetina impede a sua aglutinação, e subseqüente liberação, pela proteína de aglutinação hepática. 0 termo "eritropoetina" inclui análogos da eritropoetina humana com uma ou mais mudanças na se-qüência de aminoácidos da eritropoetina humana, que resultam em um aumento no número de locais para fixação de ácido siálico. Estes análogos de glicoproteina podem ser gerados por mutagênese orientada ao local dotada de adições, remoções, ou substituições de resíduos de aminoácidos que aumentam ou alteram locais que se encontram disponíveis para glicosilação. Análogos de glicoproteínas dotados de níveis de ácido siálico maiores do que aqueles encontrados na eritropoetina humana são gerados pela adição de locais de glicosilação que não perturbam a conformação secundária ou terciária requerida para atividade biológica. As glicoproteínas da presente invenção também incluem análogos dotados de niveis de fixação de carboidratos aumentados em um local de glicosilação que usualmente envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos em estreita proximidade com um local de ligação de "N" ou ligação de "O". As glicoproteinas da presente invenção também incluem análogos que são dotados de um ou mais aminoácidos que se estendem a partir da extremidade terminal de carboxilo da eritropoetina e que proporcionam pelo menos um local de carboidrato adicional. As proteínas de eritropoetina da presente composição também incluem análogos que são dotados de uma seqüência de aminoácidos que inclui a reorganização de pelo menos um local para glicosilação. Uma tal reorganização de local de glicosilação envolve a remoção de um ou mais locais de glicosilação na eritropoetina humana e a adição de um ou mais locais de glicosilação que se apresentam de forma não natural. 0 aumento do número de cadeias de carboidratos na eritropoetina e, conseqüentemente,do número de ácidos siá-licos por moléculas de eritropoetina, podem conferir propriedades vantajosas, tais como uma solubilidade aumentada, uma maior resistência à proteólise, imunogeni-cidade reduzida, uma semivida de soro aumentada, e uma atividade biológica aumentada. Os análogos de eritropoetina com locais de glicosilação adicionais encontram-se expostos de uma maneira mais detalhada no pedido de patente européia 640.619, de Elliot, publicado em 1 de março de 1995.
De acordo com uma concretização preferida, a composição farmacêutica da presente invenção compreende proteínas de eritropoetina com uma seqüência de aminoácidos que inclui pelo menos um local adicional para glicosilação tal como, sendo que não se fica limitado às mesmas, eritropoetinas que compreendem a seqüência da eritropoetina humana modificada por uma modificação selecionada a partir das seguintes: Asn30Thr32;
Asn51Thr53, Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser 68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92 ;
Ser87Asn88Thr90Ala162 ;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; and Pro124Thr125. A notação utilizada neste contexto para modificação da seqüência de aminoácidos significa que a(s) posição(ões) da(s) proteína(s) não modificada(s) correspondente (s) (por exemplo, hEPO da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2) indicada pelos números sobrescritos é alterada para o(s) aminoácido(s) que imediatamente precedem o(s) número(s) sobrescrito(s) respectivo. A proteína de eritropoetina também pode ser um análogo que tem pelo menos um aminoácido adicional na extremidade terminal carboxílica da glicoproteí-na, em que o aminoácido adicional inclui pelo menos um local de glicosilação. 0 aminoácido adicional poderá compreender um fragmento de peptídeo derivado da extremidade terminal carboxílica da gonadotropina coriônica humana. De preferência, a glicoproteína é um análogo selecionado a partir do grupo que consiste de (a) eritropoetina humana que tem a seqüência de aminoácidos Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin, que se estende a partir do término carboxílico;
0*7 OO (b) o análogo em (a) compreendendo ainda Ser Asn T-hr90 EPO; e (c) o análogo em (a) compreendendo ainda Asn30 Thr32 Vai87 Asn88 Thr90 EPO. A proteína de eritropoetina também poderá ser dotada de uma seqüência de aminoácidos que inclui uma reordenação de pelo menos um local para glicosilação. A reordenação pode compreender uma supressão de qualquer um dos locais de carboidratos de ligação "N" na eritropoetina humana e uma adição de um local de carboidrato de ligação "N" na posição 88 da seqüência de aminoácidos da eritropoetina humana. De preferência, a glicoproteina está na forma de um análogo selecionado a partir do grupo que consiste de Gin24 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO; e Gin83 Ser87 Asn88 Thr90 EPO. Um outro análogo é darbepoetina alfa. Uma proteína de eritropoetina preferida na utilização descrita anteriormente é darbepoetina alfa.
Mais particularmente, a proteina de eritropoetina da presente composição farmacêutica tal como descrita anteriormente poderá incluir igualmente os seus derivados pegilados. Os derivados pegilados da eritropoetina e a sua preparação são conhecidos na técnica e encontram-se descritos, por exemplo, na WO 01/02017, EP-A-1064951, EP-A-539.167, EP-A-605.963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, patente U.S. N° 5.56, EP-A-584.876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, patentes U.S. N°s 5.359.030 e 5.681.811, patente U.S. N° 4.179.337, patente japonesa, WO 98/32466, patente U.S. N° 5.324.650. Preferencialmente, na utilização descrita anteriormente, a proteína de eritropoetina é pegilada. Uma concretização preferida das espécies de eritropoetina pegilada refere-se aos derivados conforme descritos mais adiante.
Conseqüentemente, a presente invenção refere-se igualmente à utilização tal como descrita anteriormente, em que a eritropoetina é um conjugado, o di- to conjugado compreendendo uma proteína de eritropoeti-na tal como descrito anteriormente dotado de pelo menos um grupo amino livre e tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoetina humana e seus análogos que têm a seqüên-cia de eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação ou uma reordenação de pelo menos um local de glicosilação, sendo a dita eritropoetina ligada covalentemente a n grupos poli(etileno gli-col) da fórmula —CO-(CH2)x-(OCH2)m-OR com o —CO (isto é, carbonilo) de cada grupo de poli(etileno glicol) formando uma ligação de amida com um dos referidos grupos amino; em que R é alquila inferior; x é 2 ou 3; m varia de cerca de 450 a cerca de 900; n varia de 1 a 3; ene m são selecionados de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicoproteína de eritropoetina varia de 20 quilodáltons a 100 quilodáltons. Esta invenção proporciona, outrossim, composições farmacêuticas as quais contêm os conjugados descritos neste contexto, em que a percentagem de conjugados em que n é 1 compreende pelo menos noventa por cento, de preferência pelo menos noventa e dois por cento, ou preferencialmente noventa e seis por cento de todos os conjugados da composição.
Mais especificamente, os conjugados descritos anteriormente podem ser representados pela fór- mula (I) P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I) em que P é o resíduo de uma proteína de eritropoetina tal como descrita neste contexto, (isto é, sem o grupo amino ou os grupos amino que formam uma ligação de ami-da com o carbonilo ilustrado na Fórmula I), tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue; e em que R é alquila inferior; x é 2 ou 3; m varia de 450 até cerca de 900; n varia dela3, enem são selecionados de maneira tal que o peso molecular do conjugado menos a glicoproteína de eritropoetina seja de 20 quilodáltons a 100 quilo-dáltons. De acordo com esta invenção, R é qualquer alquila inferior. Os conjugados em que R é metilo são os preferidos. O símbolo "m" representa o número de resíduos de óxido de etileno (OCH2CH2) no grupo de poli (óxido de etileno). Uma única subunidade de PEG (po-lietileno glicol)de óxido de etileno é dotada de um peso molecular de cerca de 44 dáltons. Assim, o peso molecular do conjugado (excluindo-se o peso molecular da EPO) depende do número "m". Nos conjugados desta invenção "m" varia entre cerca de 450 até cerca de 900 (correspondente a um peso molecular de cerca de 20 kDa até cerca de 40 kDa), preferencialmente entre cerca de 650 até cerca de 750 (correspondente a um peso molecu- lar de cerca de 30 kDa) . O número m é selecionado de uma maneira tal que o conjugado resultante desta invenção possui uma atividade fisiológica comparável à EPO não modificada, atividade essa que pode representar a mesma, maior do que, ou uma fração da atividade correspondente da EPO não modificada. Um peso molecular de "cerca de" um determinado número significa que se encontra dentro de uma faixa razoável desse número conforme determinado por técnicas analíticas convencionais. O número "m" é selecionado de maneira tal que o peso molecular de cada grupo de poli(etileno glicol) ligado covalentemente à glicoproteína de eritropoetina varia entre cerca de 20 kDa até cerca de 40 kDa, e compreende preferentemente cerca de 3 kDa.
Nos conjugados desta invenção, o número "n" é o número de grupos de poli(etileno glicol) ligados covalentemente aos grupos amino livres (incluindo os grupos ε-amino de um aminoácido de lisina e/ou do grupo amino terminal) de uma proteína de eritropoetina por intermédio de ligações de amida. Um conjugado desta invenção poderá ter um, dois ou três grupos PEG por molécula de EPO. O "n" é um inteiro que varia de 1 a 3, preferentemente "n" é 1 ou 2, e com maior preferência "n" é 1. Um conjugado preferido dos conjugados descritos anteriormente compreende compostos em que x é 2, m varia de 650 a 750, n é 1 e R é metilo. O composto da fórmula (I) pode ser preparado a partir de material polimérico conhecido: (II) em que R e m são tais como descritos anteriormente, pela condensação do composto da Fórmula (II) com a glico-proteína de eritropoetina. Os compostos da fórmula (II) em que x é 3, compreendem os ésteres de succinimidil de poli(etileno glicol) de ácido butirico alcoxila al-fa-inferior, (alcoxila inferior-PEG-SBA). Os compostos da fórmula (II) em que x é 2 compreende os ésteres de succinimidil de poli(etileno glicol) de ácido propiôni-co alcoxilo alfa-inferior, (alcoxilo inferior-PEG-SPA). Poderá ser utilizado qualquer processo convencional para se fazer reagir um éster estimulado com uma amina para se formar uma amida. Na reação descrita anteriormente, o éster de succinimidil exemplificado é um grupo residual que provoca a formação da amida. 0 uso de ésteres de succinimidil tais como os compostos da fórmula II para produzirem conjugados com proteínas encontra-se exposto na patente Ü.S. N° 5.672.662, concedida em 30 de setembro de 1997 (Harris, et al.). A EPO humana contém nove grupos amino livres, o grupo amino amino-terminal mais os grupos ε-amino de 8 resíduos de lisina. Quando o reagente de pegilação foi combinado com um composto SBA da Fórmula II, constatou-se que sob pH 7,5, uma relação proteína: PEG de 1:3, e uma temperatura de reação de 20-25°C, foram produzidas uma mistura de mono-, di- e quantida- des residuais das espécies tri-pegiladas. Quando o re-agente de pegilação foi o composto SPA da Fórmula II, sob condições semelhantes com a exceção de que a relação proteína:PEG foi de 1:2, produz-se principalmente a espécie mono-pegilada. A EPO pegilada pode ser administrada como uma mistura, ou como a espécie pegilada diferente separada por cromatografia de permuta catiô-nica. Pela manipulação das condições de reação (por exemplo, relação de reagentes, pH, temperatura, concentração de proteínas, tempo de reação e outros), as quantidades relativas das diferentes espécies pegiladas poderão ser variadas.
Uma outra concretização preferida da presente invenção refere-se à utilização tal como ficou definida anteriormente, em que a proteína de eritropoe-tina é um conjugado, o referido conjugado compreendendo uma proteína de eritropoetina tal como definida anteriormente que é dotada de pelo menos um grupo amino livre e que é dotada da atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e de células vermelhas do sangue, e selecionado a partir do grupo que consiste de eritropoetina humana e seus análogos que têm a estrutura principal da eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação; sendo a dita proteína de eritropoetina ligada covalentemente a de um a três grupos de poli(etileno glicol) alcoxila inferior, com cada grupo de poli(etileno glicol) sendo ligado covalentemente à proteína de eritropoetina por mente à proteína de eritropoetina por intermédio de um ligante da fórmula -C(0)-X-S-Y-, com o C (0) do ligante formando uma aglutinação de amida com um dos referidos grupos amino, X é -(CH2)k- ou -CH2(0-CH2-CH2)k-, em que k varia de 1 até cerca de 10, Y é OU o peso molecular médio de cada metade de poli(etileno glicol) varia de cerca de 20 quilodáltons até cerca de 40 quilodáltons, e o peso molecular do conjugado varia de cerca de 51 quilodáltons até cerca de 175 quilodáltons .
Esta espécie de eritropoetina também pode ser representada pela fórmula (III) (III) em que R poderá ser qualquer alquila inferior. Um al-quila inferior preferido é metilo. X poderá ser ou . em que k varia de 1 até cerca de 10. De preferência, k varia de 1 até cerca de 4, com maior preferência k é 1 ou 2. Com maior preferência X é Na fórmula I, Y é OU de preferência, OU com maior preferência, Na Fórmula (III), o número m é selecionado de maneira tal que o conjugado resultante da fórmula (III) possui uma atividade fisiológica comparável à da EPO não modificada, atividade essa que pode representar a mesma, mais do que, ou uma fração da atividade correspondente da EPO não modificada. 0 m representa o número de resíduos de óxido de etileno na unidade PEG. Uma única sub-unidade PEG de -(OCH2CH2)- tem um peso molecular de cerca de 44 dáltons. Desta maneira, o peso molecular do conjugado (excluindo-se o peso molecular da EPO) depende do número m. Um peso molecular de "aproximadamente" um certo número significa que se encontra dentro de uma faixa razoável desse número, conforme determinado por meio de técnicas analíticas convencionais. O m é um inteiro que varia entre cerca de 450 até cerca de 900 (correspondente a um peso molecular de 20 a 40 kDa), de preferência m varia entre cerca de 550 até cerca de 800 (cerca de 24 a 35 kDa) , e com maior preferência, m varia entre cerca de 650 até cerca de 700 (cerca de 29 até cerca de 31 kDa).
Na fórmula (III), o número n é o número de grupos ε-amino de um aminoácido de lisina em uma proteína de eritropoetina aglutinada covalentemente a uma unidade PEG por intermédio de uma ligação de amida. Um conjugado desta invenção poderá ser dotado de uma, duas, ou três unidades PEG por molécula de EPO. O n é um inteiro que varia de 1 a 3, de preferência n é 1 ou 2, e com maior preferência, n é 1.
As proteína de eritropoetina da fórmula (III) são representados pelas fórmulas: e >
Na concretização de maior preferência da presente invenção, um conjugado de eritropoetina é representado pela fórmula: em que nas fórmulas expostas anteriormente n é um inteiro de 1 a 3; m é um inteiro de 450 a 900; R é alqui-la inferior; X é ou e P é o re- síduo da glicoproteína de eritropoetina sem o grupo amino ou grupos que formam uma ligação de amida com X.
Outros produtos de glicoproteína de eritropoetina preferidos encontram-se representados pelas fórmulas: e Os produtos de glicoproteina de eritropoe-tina de maior preferência encontram-se representados pela fórmula: Estas proteína de eritropoetina podem ser preparadas por: (a) fazendo-se reagir covalentemente um grupo ε-amino de um ácido amino de lisina de uma proteína de eritropoetina representado pela fórmula, P-[NH2] nf com um reagente bifuncional representado pela fórmula, Z-CO-X-S-Q, para formar um intermediário com uma ligação de amida representada pela fórmula: em que P é uma proteína de eritropoetina menor do que o grupo amino que forma uma ligação de alida; n é um inteiro que varia de 1 a 3; Zé um grupo reativo, por exemplo, um éster carboxílico-NHS; X é -(0¾)¾- ou -0¾ (0—0¾-0¾) k—, em que k varia de 1 até cerca de 10; e Q é um grupo de proteção, tal como alcanoíla, por exemplo, acetil. (b) fazer reagir covalentemente o intermediário com uma ligação de amida proveniente da etapa (a) com um derivado de polietileno glicol ativado, representado pela fórmula, para formar um produto de glicoproteína de eritropoetina representado pela fórmula: em que W é uma forma reativa sulfidrílica de Y; m é um inteiro que varia entre cerca de 450 até cerca de 900; R é alquila inferior; e Y é tal como se encontra definido anteriormente.
Nesta concretização, o reagente bifuncio-nal é preferentemente N-succinimidil-S-acetiltiopropi-onato ou N-succinimidil-S-acetiltioacetato, Z é preferentemente N-hidróxi-succinimida, e o derivado de polietileno glicol ativado é selecionado preferentemente a partir do grupo que consiste de iodo- acetil-metóxi-PEG, metóxi-PEG-vinilsulfona, e metóxi-PEG-maleimida.
De uma maneira mais detalhada, as proteínas de eritropoetina da fórmula (III) podem ser preparadas pela ligação covalente de grupos tiol à EPO ("ativação") e acoplamento da EPO ativada resultante com um derivado de poli(etileno glicol)(PEG). A primeira etapa para a preparação da EPO pegilada de acordo com a presente invenção compreende a ligação covalente de grupos tiol com grupos NH2 de EPO. Esta ativação de EPO é realizada com reagentes bifuncionais que transportam um grupo tiol protegido e um grupo reativo adicional, tais como ésteres ativos (por exemplo, um éster de succinimidil), anidridos, ésteres de ácidos sulfôni-cos, halogenetos de ácidos carboxílicos e ácidos sulfô-nicos, respectivamente. 0 grupo tiol é protegido por grupos conhecidos na técnica, por exemplo, grupos ace-til. Estes reagentes bifuncionais são capazes de reagir com os grupos ε-amino dos ácidos amino lisina pela formação de uma ligação de amida. A primeira etapa da reação encontra-se exposta em seguida: EPO, n e X são tais como definidos anteriormente e Z é um grupo reativo conhecido na técnica, por exemplo, um substituinte de N-hidróxi-succiniina (NHS) com a fórmula: De acordo com uma concretização preferida, a ativação dos grupos de ε-amino lisina é realizada mediante reação com reagentes bifuncionais que são dotados de uma metade succinimidil. Os reagentes bifuncionais podem transportar diferentes espécies de espaçado-res, por exemplo, metades ou em que k varia de 1 até cerca de 10, de preferência de 1 até cerca de 4, e com maior preferência, 1 ou 2, e com maior preferência, 1. Exemplos destes reagentes são N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) e N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA). Éster de -NHS-acetiltioalquil-carboxilico, tal como OU
SATP SATA Éster -NHS- de ácido 2-(acetiltio)-(etóxi)k-acético, em que k é tal como ficou definido anteriormente. A preparação dos reagentes bifuncionais é conhecida na técnica. Os precursores de ésteres -NHS-de ácido 2-(acetiltio)-(etóxi)k-acético encontram-se descritos na DE-3924705, enquanto a derivação para o composto acetiltio encontra-se descrita por March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. 0 SATA encontra-se disponível comercialmente (Molecular Probes, Eugene, OR, USA e Pierce, Rockford, IL). 0 número de grupos tiol a serem adicionados a uma molécula EPO pode ser selecionado pela ajus-tagem dos parâmetros de reação, isto é, a concentração da proteína (EPO) e a relação proteína/reagente bifun-cional. De preferência, a EPO é ativada mediante ligação covalente de 1 a 5 grupos tiol por molécula de EPO, com maior preferência, de 1,5 a 3 grupos tiol por molécula de EPO. Estas faixas referem-se à distribuição estatística do grupo tiol sobre a população de proteínas de EPO. A reação é realizada, por exemplo, em uma solução amortecedora aquosa, pH 6,5-8,0, por exemplo, em 10 mM fosfato de potássio, 50 mM NaCl, pH 7,3. 0 reagente bifuncional pode ser adicionado em DMSO. Depois que foi concluída a reação, de preferência após 30 minutos, a reação é sustada mediante adição de lisina. O excesso de reagente bifuncional pode ser separado por meio de processos conhecidos na técnica, por exemplo, mediante diálise ou filtragem de coluna. O número médio de grupos tiol adicionados à EPO pode ser determinado por meio de processos fotométricos, descritos, por exemplo, por Grasetti, D.R. e Murray, J.F., em J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967). A reação supra é seguida pelo acoplamento covalente de um derivado de polietileno glicol (PEG) ativado. Os derivados de PEG adequados são moléculas de PEG ativadas com um peso molecular médio entre cerca de 20 até cerca de 40 kDa, com maior preferência, entre cerca de 24 até cerca de 35 kDa, e com maior preferência, cerca de 30 kDa.
Os derivados de PEG ativados são conhecidos na técnica e encontram-se descritos, por exemplo, Morpurgo, M. et al., J. Bioconj. Chem. (1996) ]_, página 363 ff para PEG-vinilsulfona. As espécies de PEG de cadeia linear e de cadeia ramificada são adequadas para a preparação dos compostos da Fórmula 1. Exemplos de reagentes de PEG reativos são iodo-acetil-metóxi-PEG e metóxi-PEG-vinilsulfona: ou A utilização destas substâncias ativadas por iodo é conhecida na técnica e encontra-se descrita, por exemplo, por Hermanson, G.T. em Bioconjugate Tech-niques, Academic Press, San Diego (1996) p, 147-148.
Com maior preferência, as espécies de PEG são ativadas por maleimida utilizando-se (alcóxi-PEG-maleimida), tal como metóxi-PEG-maleimida (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). A estrutura da alcóxi-PEG-maleimida é a seguinte: ou em que R e m são tais como foram definidos anteriormente, preferencialmente. A reação de acoplamento com alcóxi-PEG-maleimida ocorre depois de separação in situ do grupo de proteção de tiol em uma solução de amortecimento a-quosa, por exemplo, 10 mM fosfato de potássio, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2. A divagem do grupo de proteção pode ser realizada, por exemplo, com hidroxilamino em DMSO a 25°C, pH 6,2 durante cerca de 90 minutos. Para a modificação do PEG, a relação molar de E-PO/alcóxi-PEG-maleimida ativada deverá ser de cerca de 1:3 até cerca de 1:6, e de preferência 1:4. Δ reação poderá ser sustada mediante a adição de cisteina e a reação dos grupos tiol (-SH) remanescentes com N-metilmaleimida ou outros compostos apropriados capazes de formarem aglutinações de bissulfureto. Por causa da reação de quaisquer grupos tiol ativos remanescentes com um grupo de proteção, tais como N-metilmaleimida ou outro grupo de proteção adequado, as glicoproteinas de EPO nos conjugados desta invenção podem conter esses grupos de proteção. De uma maneira geral o procedimento descrito neste contexto produzirá uma mistura de moléculas que são dotadas de números variáveis de tióis protegidos por diferentes números do grupo de proteção, na dependência do número dos grupos tiol ativados na glicoproteina que não foram conjugados ao PEG-maleimida.
Considerando-se que N-metilmaleimida forma o mesmo tipo de aglutinação covalente quando usada para bloquear os restantes grupos tiol da proteína pegilada, compostos de bissulfureto conduzirão a uma reação de permuta sulfureto/bissulfureto intermolecular para um acoplamento ligado de bissulfureto do reagente de bloqueio. Os reagentes de bloqueio preferidos para esse tipo de reação de bloqueio são a glutationa oxidada (GSSG), a cisteina e a cistamina. Enquanto que com a cisteina nenhuma carga liquida é introduzida na proteína pegilada, com o uso de reagentes de bloqueio GSSG ou cistamina resulta em uma carga negativa ou positiva adicional. A maior purificação dos compostos da Fórmula 1, incluindo a separação das espécies de EPO mono, di- e tri-pegiladas, poderá ser realizada por meio de processos conhecidos na técnica, por exemplo, cromato-grafia de coluna.
Derivados de eritropoetina pegilados pre-ferentemente contêm pelo menos noventa por cento de conjugados mono-PEG. Usualmente os conjugados mono-PEG de glicoproteínas de eritropoetina são desejáveis porque eles tendem a ter atividade mais alta do que os conjugados di-PEG. A percentagem dos conjugados monoPEG bem como a relação das espécies mono- e di-PEG pode ser controlada pelo agrupamento de frações mais amplas em torno do pico de eluição, para diminuir a percentagem de frações mono-PEG ou mais estreitas para aumentar a percentagem de mono-PEG na composição. Cerca de noventa por cento de conjugados mono-PEG constitui um bom equilíbrio de rendimento e atividade. Por vezes compo- sições em que, por exemplo, pelo menos noventa por cento ou pelo menos noventa e seis por cento dos conjugados são espécies mono-PEG (n igual a 1) poderão ser desejadas. Em uma concretização desta invenção, a percentagem de conjugados onde n é 1 varia de noventa por cento a noventa e seis por cento.
As composições farmacêuticas que compreendem eritropoetina pegilada são conhecidas na técnica e encontram-se descritas, por exemplo, no pedido de patente internacional WO 01/87329. As composições podem compreender de 10 a 10000 pg de uma proteina de eritropoetina por ml, tal como se definiu anteriormente. Preferentemente, as composições compreendem de 10 a 1000 pg, por exemplo, 10, 50, 100, 400, 800 ou 2500 pg por ml. Além disso, as composições poderão compreender de 10 pg a 10000 pg de proteina de eritropoetina por ml, 10-200 mmol/1 sulfato, 10 a 50 mmol/1 de fosfato, pH 6,0 a 6,5. Esta composição também pode compreender até 20 mM de metionina, 1-5 % de um poliol (p/v) , até 0,1% de pluronic F68 (p/v) e opcionalmente até 1 mM de CaCl2. Um exemplo desta composição compreende 10 pg a 10000 pg de proteina de eritropoetina por ml, 40 mmol/1 de sulfato, 10 mmol/1 de fosfato, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2. Alternativamente, a composição poderá compreender 10 pg a 10000 pg de proteina de eritropoetina por ml, 10 a 100 mmol/1 de NaCl, 10 a 50 mmol/1 de fosfato, pH 6,0 a 7,0, opcionalmente 1-5% (p/v) de um poliol. Além disto, esta composição poderá compreender até 20 mM de metionina, até 0,1% de pluronic F68 (p/v) e opcional- mente 7,5 pmol/1 de CaCl2. Especificamente, esta composição poderá compreender de 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 100 mmol/1 de NaCl2, 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), e 10 mmol/1 de fosfato, pH 7,0. A presente invenção também se refere à composição mencionada anteriormente a qual compreende 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 10 a 50 mmol/1 de arginina, pH 6 a 6,5, 10 a 100 mmol/1 de sulfato de sódio. Além disto, esta composição poderá compreender até 20 mM de metionina, até 0,1% de pluronic F68 (p/v), e opcionalmente até 1 mmol/j de CaCl2 e opcionalmente 1-5% (p/v) de um poliol.
Especificamente, esta composição poderá compreender de 10 pg a 10000 pg de proteína de eritropoetina por ml, 40 mmol/1 de arginina, pH 6,2, 30 mmol/1 de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v) e, opcionalmente, 1 mmol/1 de CaCl2- Uma concretização preferida da presente invenção refere-se às composições que compreendem de 10 a 10000 pg/ml de eritropoetina, de preferência 25 a 2500 pg/ml de eritropoetina, e a) 10 mM de sódio/fosfato de potássio, 100 mM de NaCl, pH 7,0 ou b) 10 mM de fosfato de sódio, 120 mM de sulfato de sódio, pH 6,2 ou c) 10 mM fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), pH 6,2 ou d) 10 mM de fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2 ou e) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3$ de manitol (p/v), pH 6,2 ou f) 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0,01% pluronic F68 (p/v) pH 6,2.
Na concretização de maior preferência, as composições compreendem uma quantidade de proteína de eritropoetina de 50, 100, 400, 800 ou 2500 pg/ml. As composições de maior preferência compreendem ou 10 mM de fosfato de sódio, 40 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v), 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2, ou então 40 mM de arginina, 30 mM de sulfato de sódio, 3% de manitol (p/v) , 10 mM de metionina, 0,01% de pluronic F68 (p/v), pH 6,2. Outros detalhes dessas composições são conhecidos a partir do WO 01/87329. A invenção também se refere a um método adequado para o tratamento de distúrbios por distribuição de ferro em diabetes, o qual compreende a administração de uma quantidade de proteína de eritropoetina efetiva tal como ficou definida anteriormente. Além disso, a invenção relaciona-se com um medicamento adequando para o tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em diabetes caracterizado pelo fato de conter uma quantidade de proteina de eritropoetina efetiva. 5 Nos casos mencionados anteriormente, os diabetes melli-tus não dependentes de insulina constituem a forma de diabetes preferida.
No tratamento de distúrbios de ferro por distribuição de ferro em diabetes, a EPO pode ser admi-D nistrada, por exemplo, de acordo com uma dosagem de 150 U/kg de peso corpóreo, duas vezes por semana. A dosagem pode ser variada de acordo com as necessidades do paciente individual e também pode estar na faixa de, por exemplo, 100 a 200 U/kg. Na dependência do tempo 5 de semi-vida do derivado de EPO utilizado, poderá ser administrada uma dose entre, por exemplo, 1 ou 3 vezes por semana. Na dependência das necessidades de um paciente individual, um médico também poderá escolher uma dosagem diferente. 0 A atividade especifica da EPO ou conjuga- dos de EPO de acordo com a presente invenção pode ser determinada por vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica das proteínas de EPO purificadas desta invenção é tal que a administração da proteina de 5 EPO por injeção a pacientes humanos resulta em as células da medula óssea aumentarem a produção de reticuló-citos e das células vermelhas do sangue em comparação com os grupos de pacientes não injetados ou de contro- le. A atividade biológica das proteínas de EPO, ou de fragmentos das mesmas, obtidas e purificadas de acordo com esta invenção, pode ser testada por meio de processos de acordo com Annable, et al. , Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47:99-112 e Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) . Um outro ensaio biológico para se determinar a atividade da proteína de EPO, o ensaio de camundongo normocitaêmico, encontra-se descrito na técnica (por exemplo, Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2), e a monografia de eritropoetina de Ph Eur. BRP.). A invenção será mais bem compreendida pela referência aos exemplos seguintes que ilustram, mas não limitam, a invenção descrita neste contexto.
EXEMPLO
Uma mulher de meia idade que padece de diabetes é examinada quanto a distúrbios de distribuição de ferro por determinação dos seguintes parâmetros -COMPOSIÇÃO DE REVESTIMENTO DE PRÉ-TRATAMENTO (proteína C reativa), ferritina e receptor de transferrina solúvel - conforme descrito por P. Lehmann, M. Volkmann, J. Lotz, A. Baldauf, R. Roeddiger, , posteriormente apresentado na AACC/CSCC, Annual Meeting, July 29 - August 2, 2001, Chicago, Illinois. Os resultados mostram distúrbios de distribuição de ferro. A paciente é tratada subcutaneamente com 150 U/kg Recormo™ (proteína de e-ritropoetina disponível comercialmente) duas vezes na semana durante um máximo de 12 semanas. Depois disso, a determinação dos parâmetros tais como descritos anteriormente mostram um aperfeiçoamento no distúrbio de deficiência de ferro.
REIVINDICAÇÕES
Claims (12)
1 - Utilização de proteína de eritropoetina, caracterizada pelo fato de que é usada na fabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios de distribuição de ferro em diabéticos não dependentes de insulina.
2 - Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina é uma eritropoetina humana.
3 - Utilização, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina é epoetina alfa ou epoetina beta.
4 - Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina é expressa por ativação de gene endógeno.
5 - Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina apresenta a sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2.
6 - Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina apresenta a sequência de eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação.
7 - Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina é darbepoetina alfa.
8 - Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoietina, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, é pegilada.
9 - Utilização, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina é um conjugado, o referido conjugado compreendendo uma proteína de eritropoetina que apresenta pelo menos um grupo amino livre e tendo a atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e células vermelhas do sangue e selecionado a partir do grupo que consiste em eritropoetina humana e seus análogos que têm uma sequência de eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação ou uma reordenação de pelo menos um local de glicosilação; sendo a referida eritropoetina ligada covalentemente a n grupos poli(etileno glicol) da fórmula -CO-(CH2) x-(OCH2) m_0R com o -CO de cada grupo de poli(etileno glicol) formando uma ligação de amida com um dos referidos grupos amino; em que R é alquila (Οχ-Οε) ; x é 2 ou 3; m varia de 450 a 900; n varia dela3;enem são selecionados de maneira tal que 0 peso molecular do conjugado menos a proteína de eritropoetina varia de 20 quilodáltons a 100 quilodáltons.
10 - Utilização, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que x é 2, m é 650 a 750, n é 1 e R é metil.
11 - Utilização, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de eritropoetina é um conjugado, o referido conjugado compreendendo uma proteína de eritropoetina que apresenta pelo menos um grupo amino livre e que apresenta atividade biológica in vivo de fazer com que as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos e de células vermelhas do sangue, e selecionado a partir do grupo que consiste em eritropoetina humana e seus análogos que têm a estrutura principal da eritropoetina humana modificada pela adição de 1 a 6 locais de glicosilação; sendo a referida proteína de eritropoetina ligada covalentemente a de um a três grupos de poli(etileno glicol) alcoxila inferior, com cada grupo de poli(etileno glicol) sendo ligado covalentemente à proteína de eritropoetina por intermédio de um ligante da fórmula -C(0)-X-S-Y-, com o C(0) do ligante formando uma aglutinação de amida com um dos referidos grupos amino, X é - (CH2) k- ou -CH2 (0-CH2-CH2) k-, em que k varia de 1 até 10, Y é OU o peso molecular médio de cada metade de poli(etileno glicol) varia de 20 quilodáltons até 40 quilodáltons, e o peso molecular do conjugado varia de 51 quilodáltons até 175 quilodáltons.
12 - Utilização, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é usada com um conjugado de eritropoetina da fórmula: em que n é um inteiro de 1 a 3; m é um inteiro de 450 a 900; R é alquila (Ci-C6) ; X é -(CH2)k- ou -CH2 (0-CH2-CH2)k-, k varia de 1 até 10 e P é o resíduo da proteína de eritropoetina sem os n grupos amino que formam uma ligação de amida com X.
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