RO109864B1 - Constructie adn, genom, linie celulara, metoda de modificare sau activare a expresiei unei gene si procedeu de obtinere a unui produs al unei gene - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o construcție ADN, genom, linie celulară, metodă de modificare sau activare a expresiei unei gene și procedeu de obținere a unui produs al unei gene.

Se cunoaște faptul că fiecare celulă dintr-un organism conține informația genetică care codifică toate proteinele aflate în acel organism. Insă numai un foarte mic procent din genele prezentate într-un tip de celulă dat este într-adevăr transcris. Acum, sunt înțelese mecanism ele intracelulare care reglează ordinea genelor de transcris. Proteinele specifice celulei prezente în nucleu interacționează cu segmentele regulatoare ADN care se leagă de anumite gene. Această interacțiune a proteinelor din nucleu cu secvențele regulatoare ale ADN este necesară pentru transcripția genei. Acest lucru conduce la biosinteza mARN și expresia finală a proteinei codificate (Mitchell și Tjian, Science, 245:371, 1989).

Aceste segmente regulatoare ale ADN sat elemente pentru fiecare genă sunt situate în partea superioară și, în unele cazuri, în interiorul sau chiar în partea inferioară a regiunilor de codificare. Printr-o interacțiune cu proteinele din nucleu specifice celulei, segmentele regulatoare ADN influențează capacitatea ARN-polimerazei, enzima care limitează viteza în expresia proteinei, de a avea acces la corpul genei și a sintetiza un transcript mARN. Astfel, aceste segmente ADN și proteinele rezidente în nucleu joacă un rol critic în reglarea expresiei genelor specifice (Johnson și McKnight, Ann, Rev. Biochem., 58:799, 1989).

Segmentele regulatoare ADN leagă locurile (situsurile) pentru proteinele din nucleu. Acestor proteine din nucleu se atașează la spirala ADN și alterează, după cum se pare, structura ei, pentru a face gena dorita disponibilă pentru recunoașterea polimerazei ARN, care facilitează transcripția genei. Expresia acestor proteine regulatoare specifice celulei determină care gene vor fi transcrise într-o celulă și viteza cu care se va produce transcrierea. Ca un exemplu al specificității acestui sistem, celulele pituitare și nu celulele ficatului exprimă proteinele pituitare, chiar dacă genele pentru proteinele pituitare sunt prezente în toate celulele ficatului. Nucleul celulelor ficatului nu conține proteinele specifice de legare a ADN care interacționează cu elementele genelor pituitare rezidente în celulele ficatului.

Metodele obișnuite întrebuințate pentru a exprima proteine utilizează tehnologia ADN recombinat

Știind faptul că secvențele regulatoare specifice ale ADN sunt necesare pentru a evita transcripția genei într-un anumit tip de celulă, oamenii de știință au exprimat gene străine într-un anumit tip de celulă prin inginerie genetică. în general, segmentele regulatoare ADN care sunt recunoscute de proteinele din nucleul celulelor sunt situate în partea superioară regiunii de codificare a unei gene străine de exprimat în acest fel, după inserția în celulă, ADN străin poate fi exprimat pentru că proteinele regulatoare din nucleu ale celulelor recunosc acum aceste secvențe regulatoare ADN. Această tehnologie a fost întrebuințată pentru a produce proteine care fuseseră greu de obținut sau de purificat din surse naturale prin procedeele de purificare cunoscute.

Pe lângă secvențele de ADN recognoscibile și gena de interes, la construcția ADN se atașează și un marcher selectabil. în acest fel, numai celulele care au preluat ADN supraviețuiesc culturii următoare într-un mediu selectabil. De exemplu, gena pentru rezistența la neomicină poate fi inclusă în vectorul de expresie. După transfecție, celulele sunt cultivate în G418, un antibiotic neomicinic care este letal pentru celulele mamiferelor. Dacă totuși, celulele și-au însușit gena de rezistență la neomicină, vor fi capabile să reziste la efectele toxice ale medicamentului. Astfel, numai celulele care au preluat ADN transfectat se mențin în cultură. Se înțelege că orice marcher selectabil ar putea fi folosit atâta timp cât asigură selecția celulelor care au preluat ADN transfectat De asemenea, se înțelege că nu este critică amplasarea specifică a materialului genetic introdus în celulă. Este important numai ca să fie preluat undeva în nucleu, dacă atât segmentul regulator cât și gena străină (precum și marcherul selectabil) sunt inserate împreună.

Dacă procedeele de mai sus au fost de folos în explorarea puterii ingineriei genetice, ele nu au fost întotdeauna metodele cele mai eficace de expresie a genelor. Aceasta se datorește faptului că inserarea (inserția) ADN în nucleul unei linii celulare, de obicei, se face printr-o tehnică numită transfecție. ADN care a fost prelucrat pentru expresia în linia celulară de interes este precipitat și membrana celulei se solubilizează pentru a permite intrarea ADN. Așa cum s-a arătat mai sus, locul exact în care se încorporează ADN în genom nu este previzibil niciodată; ADN poate într-adevăr să rămână episomal (să nu se integreze în genom). Aceasta determină imprevizibilitatea atât a gradului de expresie a proteinei produse, cât și a stabilității liniei celulare.

Un al doilea dezavantaj al acestui procedeu este faptul că, construcția vectorului de expresie este extrem de grea când gena de interes este relativ mare (mai mare de 5...10 kilobaze). Multe din proteinele exprimate prin tehnologia ADN recombinat au fost codificate de cADN-uri și nu de clone genomice mult mai mari. Aceasta se face pentru a reduce mărimea totală a insertului. în timp ce folosirea cADN-urilor face ingineria genetică mai convenabilă, ca o consecință vitezele de transcripție a genei și de producere a proteinei pot suferi. Recent, s-a arătat că nivelele expresiei sunt uneori mult mărite, prin utilizarea inserțiilor genomice și nu de cADN (Brinster și alții, Proc.NatlAcad.ScL, 85:836-840, 1988 și Chung și Perry, Mol.Cell.BioL,

9:2075-2082, 1989). Deși mecanismele ce stau la baza acestor observații nu sunt bine cunoscute, se știe că în anumite situații elementele de mărire prezente în introni pot îmbunătăți eficiența transcripției genei. Există și evidența că intronii, sau elementele îmbinate care rezultă din prezența intronilor, pot avea efect asupra cazurilor de prelucrare a ARN ce urmează după inițierea transcripției (Buchman și Berg, Mol.Cell. Biol., 8:4395-4405, 1988). Aceasta poate stabiliza transcriptul, deci îmbunătăți viteza de acumulare de mARN. în lucrarea lui Brinster, citată mai sus, se arată, de asemenea, că poziția intronilor în genă poate fi importantă pentru etapizarea formării nucleozomilor față de promotor. Influența diferitelor elemente regulatoare asupra transcripției genelor eucariotice este discutată de Khouiy și alții, Cell, 33:313-314 (1983), Maniatis și alții, Science 236:1237-1245 (1987) și Muller și alții, Eur. J.Biochem., 176:485-495 (1988).

în al treilea rând, pentru a reuși să intre în nucleu, ADN transfectat, care conține întreaga regiune codificatoare a genei străine, trebuie să traverseze citoplasmă și să intre prin plasma permeabilizată a membranei celulei. In acest timp, ADN poate să vină în contact cu enzimele lisosomale care pot altera sau distruge complet integritatea ADN. Astfel, regiunea de codificare a ADN poate să nu mai fie identică cu cea care a fost transfectată.

Pe scurt, o mare cantitate de ADN transfectat în celulă, folosind procedeele cunoscute și în special regiunea codificatoare a sa, nu va fi transcrisă exact. Se poate degrada înainte de intrarea în nucleu, perturbată enzima tic astfel, încât să nu codifice întreaga proteină dorită sau poate să nu conțină toate segmentele regulatoare necesare pentru a permite transcrierea. Se poate insera într-o porțiune a genomului care împiedica transcrierea. Dacă cADN este transcris, proteina de interes poate să nu fie produsă eficient din cauza omiterii intronilor care pot conține intensificatori sau să permită prelucrarea eficientă a mARN. In final, poate rămâne episomal, poate ajuta la producerea proteinei, dar să fie instabilă pentru că populația de celule crește prin diviziune celulară.

Invenția se referă la o construcție ADN care este compusă dintr- un segment regulator ADN capabil să stimuleze expresia caracteristicilor, unei gene în linia celulară gazdă când este legată operativ de aceasta, sau o genă exprimabilă amplificabilă capabilă a amplifica gena într-o linie celulară gazdă când este inserată în imediata apropiere a acesteia și un segment țintă ADN omolog la regiunea genomului genei selectate din linia celulară gazdă.

Construcția ADN este inserată întrun genom al unei linii celulare care este astfel transformat, segmentul ADN regulator sau gena exprimabilă amplificabilă transferată de numita construcție nefiind găsit în mod natural în genom.

Genomul astfel transformat este introdus într-o linie celulară eucariotică animală sau vegetală, ceea ce îi conferă capacitatea de a exprima un produs al unei gene retiente în mod normal la transcripție sau de a modifica caracteristicile expresiei unei gene din genomul acelei linii celulare.

Invenția se mai referă și la o metodă de activare a expresiei unei gene reticente în mod normal la transcripție sau pentru modificarea caracteristicilor expresiei unei gene predeterminate din interiorul genomului unei linii celulare care, constă în inserarea prin recombinare omoloagă a unei construcții ADN descrisă mai sus, astfel încât segmentul regulator să fie legat operativ la gena de interes pentru a produce amplificarea acesteia, când gena amplificabilă este amplificată.

Un alt obiect al invenției este un procedeu pentru obținerea produsului unei gene dintr-o linie celulara, care constă în cultivarea liniei celulare eu cano tice vegetale sau animale descrise mai sus, în condiții care permit exprimarea produsului acestei gene și separarea produsului acestei gene.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- se pune la îndemâna specialiștilor o metodă eficace de expresie a genelor reticente în mod normal la transcripție;

- locul de inserție a ADN în genom este cunoscut exact, ceea ce duce la obținerea unei linii celulare stabile;

- se pot vehicula gene de dimensiuni mari;

- nu se produc forme mutante ale proteinei dorite, pentru care regiunea codificatoare a genei dorite nu este supusă modificărilor enzimatice.

Se dau, în continuare, exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig.

1...15, care reprezintă:

- fig.1, prezentarea generală a construcției ADN, conform cu prezenta incenție;

- fig.2A, modul de integrare a construcției ADN în genom, în cazul recombinării neomoloage sau întâmplătoare;

- fig.2B, modul de integrare a construcției ADN în genom, în cazul recombinării omoloage;

- fig.3, construirea unui vector de recombinare omoloagă preferat, conform cu prezenta invenție;

- fig.4, modul de integrare a unei bucăți circulare de ADN, prin recombinarea omoloagă, când se întrebuințează numai o singură bucată de ADN țintă;

- fig.5, plasmida pRSVCAT, care include situsurile de restricție ale ei;

- fig.6, construirea unei plasmide pRSV, inclusiv situsurile de restricție ale ei;

- fig.7, plasmida pSV2NEO, inclusiv situsurile de restricție ale ei;

- fig.8, construirea plasmidei pSVNEOBAM, inclusiv situsurile de restricție ale ei;

- fig.9, construirea plasmidei pRSVNEO, inclusiv situsurile de restricție ale ei;

- fig. 10, construirea plasmidei pRSVCAlNEO, inclusiv situsurile de restricție ale ei;

fig.l 1, un fragment de 15,3 kb ale genei de șobolan TSH/Î și prezentând diferite segmente de restricție ale lui;

- fig. 12, construirea plasmidei pRSVCATNEOTSHB3, inclusiv situsurile de restricție ale ei;

- fig. 13, construirea plasmidei pRSVCATNEOTSHB35XbaI, inclusiv locurile de restricție ale ei;

- fig.14-, o porțiune a secvenței nucleotidei TSH/î împreună cu regiunile ei la care corespunde fiecare primer pentru amplificarea PCR. Exonii 2 și 3 sunt arătați cu litere mari. Un fragment amplificat 247 BP este redat prin asteriscuri de subliniere;

- fig. 15, rezultatele electroforezei în gel poliacriloamidic a cADN sintetizat din ARN extras din diferite populații de celule și al cărui cADN TSH/3,dacă este prezent, s-a amplificat prin PCR. Natura celulelor care reprezintă diferitele pasaje este stabilită în fig. 15 sub gel.

Recombinarea omoloagă este o tehnică elaborată în ultimii câțiva ani pentru ca genele țintă să inducă sau să corecteze mutații în genele active, din punct de vedere transcripțional [Kucherlapati, Prog. in Nuci. Acid. Res. and Mol., Biol., 36:301 (1989). Această tehnică de recombinare omoloagă a fost creată ca o metodă pentru introducerea mutațiilor specifice în regiunile specifice ale genomului mamiferului (Thomas și alții, Cell, 44:419- 428, 1986; Thomas și Capecchi, Cell, 51:503512, 1987; Doetschman și alții, Proc. NatL Acad. Sci, 85:8583-8587,1988) sau pentru a corecta mutațiile specifice în genele cu deficiențe (Doetschman și alții, Nature, 330:576-578, 1987).

Prin această tehnică, o bucată de ADN care se dorește să fie introdusă în genom poate fi îndreptată spre o regiune specifică a genei de interes, prin atașarea sa la ADN purtător (țintă). ADN purtător este ADN, care este complementar (omolog) la o regiune de ADN genomic. Dacă două bucăți de ADN omoloage și cu o singură bandă (adică ADN purtător și ADN genomic) sunt în imediată vecinătate, ele vor hibridiza pentru a forma o spirală cu bandă dublă. De ADN-ul purtător este atașată secvența de ADN care se dorește să se introducă în genom.

Există o serie de metode prin care se poate produce recombinarea omoloagă. Un exemplu este în timpul procedeului de replicare a ADN în cursul mitozei din celule..

Printr-un mecanism care nu este în întregime înțeles, ADN parental cu dublă bandă se deschide chiar înainte de divizarea celulelor într-o regiune locală numită balonul de replicare. Cele două benzi separate de ADN pot folosi acum ca modele din care se sintetizează noi benzi de ADN. Un braț al furcii de replicare are codul ADN în direcția 5’ spre 3’, care este orientarea corespunzătoare din care se poate citi enzima polimerază ADN. Această enzimă se atașează în porțiunea 5’ a ADN cu o singură bandă și folosind banda ca model, începe să se sintetizeze banda ADN complementară. Cealaltă bandă inițială de ADN este codificată în direcția 3’ spre 5’. Ea nu poate fi citită în această direcție de polimeraza ADN. Pentru ca această bandă de ADN să fie replicată, trebuie să aibă loc un mecanism special.

O enzima specializată, ARN primaza, se atașează ea însăși în banda 3’ spre 5’ de ADN și sintetizează un primer scurt ARN la intervale de-a lungul benzii. Utilizând aceste segmente ARN ca primeri, polimeraza ADN se atașează acum la ADN cu primeri și sintetizează o bucată complementară de ADN în direcția 5’ spre 3’. Aceste bucăți de ADN nou sintetizate se numesc fragmente Okazaki. Primeni ARN care au determinat începerea întregii reacții sunt îndepărtați prin funcția exonucleazei a polimerului ADN și se înlocuiesc cu ADN. Acest fenomen continuă până când polimeraza ajunge la o parte de ADN fără primer, unde procesul de sinteză locala se oprește. Astfel, deși banda inițială complementară ADN se sintetizează peste tot în direcția 3’ spre 5’, ea de fapt este produsă prin prindere inversă în direcția 5’ spre 3’. Orice crestătură care s-ar putea produce în ADN în timpul prinderii inverse se etanșează cu o enzimă numită ligaza ADN.

Pentru a menține o fidelitate absolută a codului ADN, o funcție de corectare este prezentă în polimeraza ADN. Polimeraza ADN necesită bucăți cu primeri de ADN pe care să sintetizeze o nouă bandă ADN. Așa cum s-a arătat mai sus, aceasta poate fi o singură bandă de ADN în care s-au introdus primeri ARN, sau o bandă complementară de ADN. Când polimeraza ADN găsește bucăți de ADN complementare prost legate, ea poate acționa ca o exonuclează și îndepărta bazele ADN într-o direcție 3’ spre 5’, până când ajunge din nou la amplasarea perfectă.

Pe această bază, este posibil acum să se înțeleagă baza tehnicii descrise în această invenție. Bucăți mici de ADN purtătoare, care sunt complementare la o regiune specifică a genomului, se pun în contact cu banda de origine, în timpul procesului de replicare ADN. Este o proprietate generală a ADN care s-a introdus într-o celulă să hibridizeze și de aceea să se recombine cu alte bucăți de ADN prin regiuni omoloage împărțite. Dacă această bandă complementară se atașează la o oligonucleotidă care conține o mutație sau o secvență diferită de ADN, și ea este încorporată în banda nou sintetizată ca rezultat al recombinării. A

In acest fel prin funcția de corectare este posibil ca noua secvență de ADN să servească drept modeL Astfel, ADN transfectat este încorporat în genom.

Dacă secvența unei anumite gene este cunoscută, o bucată de ADN care este complementară la o regiune aleasă de genă poate fi sintetizată sau obținută astfel, cum ar fi prin restricția corespunzătoare a ADN nativ pe locurile specifice de recunoaștere, legând regiu10 nea de interes. Această bucată va acționa ca piesă țintă (purtătoare) la introducerea în celulă și va hibridiza cu regiunea sa omoloagă din genom. Dacă se produce această hibridizare în timpul replicării ADN, această bucată de ADN, și orice secvență adițională legată de ea, va acționa ca un fragment Okazaki și va fi prinsă invers în banda fică nou sintetizată a ADN.

In tehnica conform prezentei invenții, atașate de aceste bucăți ținta ADN sunt regiunile de ADN care se știe că interacționează cu proteinele regulatoare din nucleu prezente în celulă și, eventual, cu marcherii de ADN amplificabili și selectabili. Astfel, expresia proteinelor specifice se poate realiza nu prin transferarea ADN care codifică gena însăși și ADN marcher, ceea cc este mai uzual, și mai degrabă prin utilizarea ADN țintă (regiuni de omologie cu gena endogenă de interes) cuplat cu segmente regulatoare ADN care conferă genei semnale de recunoaștere pentru transcripție. Cu această tehnologie, este posibil să se exprime și să se amplifice orice genă înrudită, prezentă într-un tip de celulă, fără a transfecta de fapt acea genă. în plus, exprimarea acestei gene este controlată prin întregul ADN genomic și nu prin porțiuni ale genei sau ale cADN, îmbunătățind astfel viteza de transcripție și eficacitatea prelucrării mARN. Mai mult, caracteristicile de expresie ale oricărei gene înrudite prezente într-un tip de celulă se pot modifica prin introducerea adecvată a segmentelor regulatoare ADN și fără introducerea întregii porțiuni de codificare a genei de interes.

Conform cu aceste aspecte ale prezentei invenții, se realizează noi metode pentru exprimarea genelor de interes care în mod normal sunt reticente la transcripție, sau pentru modificarea expresiei genelor de interes care se exprimă endogen, în interiorul unei linii celulare diferențiate. Secvențele gen ornice înrudite care se dorește să fie exprimate, sau să li se modifice expresia, vor fi dotate cu secvențele necesare de ADN specifice celulei (segmente regulatoare și/sau de amplificare) pentru a determina sau a modifica expresia genei în celulă. ADN obținut va conține secvența ADN care codifică pentru proteina legată direct în mod operativ de segmentele heteroloage regulatoare și/sau de amplificare (pentru secvența ADN înrudită). Eventual, se poate include un marcher selectabil pozitiv în construcție, pentru a ușura alegerea celulelor rezultate. Utilizarea genei rezistente la neomicină este preferată, deși se poate folosi orice marcher selectabil. De asemenea, eventual, se pot folosi marcheri selectabili negativi. De exemplu, gena timidinkinazei a virusului de Herpes Simplex (HSVtk) se poate utiliza ca marcher pentru selecția împotriva ADN vector integrat la întâmplare. ADN- urile legat, sau ADN-urile existente de exprimare, se pot amplifica, dacă ADN țintă este legat de un marcher amplificabil.

De aceea, conform cu metoda din prezenta invenție, orice genă care se exprimă normal, când este prezentă în linia sa celulară eucariotică specifică, mai ales o linie celulară diferențiată, poate fi forțată la exprimare într-o linie celulară nespecifică pentru ea, în care gena este într-o formă reticentă. Aceasta se produce fără a introduce de fapt întreaga secvență ADN pentru acea genă. în plus, acea genă, sau o genă care se exprimă în mod normal, poate fi amplificată pentru a mări vitezele de expresie. Mai mult, caracteristicile de expresie ale genelor care nu sunt complet reticente transcripțional se pot modifica la fel ca și caracteristicile de expresie ale genelor în microorganisme.

într-una din realizările prezentei invenții, celulele eucariotice care conțin, dar în mod normal nu transcriu o genă specifică de interes, se introduc pentru a face aceasta prin tehnica descrisă aici. Vectorul de recombinare omoloagă, descris mai jos, este introdus într-o linie celulară clonală și, după selecția chimică, este determinat să producă o genă spe12 cifică prin orice mijloace corespunzătoare, cum ar fi, de exemplu, prin detectarea mARN transcris din noua genă activată, detectarea imunologică a produsului genei specifice, sau încercarea funcțională a produsului genei specifice.

Prezentarea în linii generale a construcției ADN care se folosește pentru activarea transcripțională a genelor endogene prin recombinarea omoloagă este dată în fig.l.

în general, construcția ADN conține cel puțin două și maximum șase sau mai multe segmente ADN separate. Segmentele constau din cel puțin unul, de preferință două, segmente țintă ADN A și B, omoloage cu o regiune a genomului celulei din gena dorită sau vecină cu ea, genă care se exprimă, o genă de selecție pozitivă C, o genă de amplificare D, o genă de selecție negativă E și un segment regulator ADN F, care este activ pentru transcripție în celula de transfectat în realizarea cea mai de bază a prezentei invenții, trebuie să fie prezente numai un singur segment țintă B și segmentul regulator F. Toate celelalte regiuni sunt după dorință și produc construcții preferate.

Regiunile A și B sunt secvențe ADN care sunt omoloage cu regiunile genei endogene de interes, care urmează să fie făcută actică prin transcripție. Regiunile specifice A și B ale genei endogene sunt alese astfel, încât să fie în partea superioară și cea inferioară, respectiv a poziției specifice la care se dorește să se introducă segmentul regulator. Deși aceste regiuni sunt separate în construcție, ele sunt, de preferință, vecine în gena endogenă. Pot fi ocazii în care se utilizează porțiuni neînvecinate ale genomului ca segmente țintă, de exemplu, acolo unde se dorește să se elimine o porțiune de genom, cum este un element regulator negativ.

Deși se preferă două regiuni țintă,

A și B, pentru a mări regiunile totale de omologie și, deci, a mări eficiența tei invenții se pretează și la folosirea numai a unei singure regiuni țintă. în forma sa cea mai simplă (când urmează să se introducă numai segmentul regulator F și gena marcher selectabilă C și promotorul C’), se folosește o bucată circulară de ADN care conține aceste elemente împreună cu ADN țintă (vezi fig.4). în acest fel, regiunea omoloagă B hibridizează cu contrapartea sa genomică. Segmentele (7, C și F sunt introduse în porțiunea B a genei înrudite, după momentul încrucișării.

Dacă se dorește ca secvența regulatoare ADN să fie introdusă în partea superioară genei de interes ca, de exemplu, când se dorește să se activeze și să se exprime o genă reticentă în mod normal la transcripție, regiunea de omologie este, de preferință, omoloagă cu o poițiune ne-codificabilă a genomului din partea superioară porțiunilor codificabile ale genei de interes. Când sunt prezente două regiuni țintă, regiunea inferioară A poate include o porțiune a regiunii de codificat, deși se preferă ca și ea să fie în totalitate în partea superioară a regiunii de codificare. în plus, se preferă ca regiunile omoloage să se aleagă astfel ca secvența regulatoare ADN să se introducă în partea inferioară a promotorului nativ pentru gena de interes, mai ales dacă promotorul nativ este un promotor negativ și nu un promotor pozitiv inversat

Mărimea regiunilor țintă, adică a regiunilor de omologie nu este critică, deși cu cât sunt mai scurte regiunile, cu atât este mai puțin probabil că ele vor găsi regiunile adecvate de omologie și se vor recombina în punctul dorit Astfel, cu cât sunt mai scurte regiunile de omologie, cu atât este mai puțin eficace recombinarea omoloagă, adică procentul de clone recombinate bine este mai mic. Sta sugerat ca cerința minimă de omologie a secvenței să fie de 25 perechi bază (Ayares și alții, PNAS, SUA, 83:51995203, 1986). In plus, dacă vreunul din celelalte elemente ale construcției se găsește, de asemenea, în genomul celulei gazdă, există posibilitatea recombinării într-un loc greșit Totuși, având în vedere capacitatea de selecție foarte bună pozitivă și negativă a prezentei invenții, ea poate fi aplicată cu succes chiar dacă eficiența este mică. Rezultatele optime se obțin când regiunea totală de omologie, inclusiv ambele regiuni țintă, este mare, de exemplu 1 la 3 kilobaze. Atâta timp cât segmentul regulator F poate fi legat operativ de gena de interes, nu există limită a regiunii țintă și mai ales a regiunii țintă din partea superioară B.

Se poate determina empiric cu ușurință dacă regiunile țintă sunt sau nu prea mari sau segmentul regulator F amplasat prea departe de regiunea de codificare a genei pentru a se lega operativ de ea. în acest caz, regiunile A și B pot fi făcute omoloage cu o secțiune diferită a genei de interes și procedeul se repetă până când segmentul regulator F este introdus corespunzător așa ca sa se lege operativ de gena de interes. De exemplu, locul de restricție al regiunii combinate A-B al genei endogene se poate schimba și procedeul se repetă. Conceptul prezentei invenții fiind cunoscut, împreună cu tehnicile descrise aici, un specialist în acest domeniu va fi capabil să facă și să utilizeze prezenta invenție, aplicând-o la orice genă dată de interes în orice linie celulară sau microorganism fără utilizarea unei experimentări inoportune.

Regiunea C este o genă marcher pozitiv selectabilă capabilă să facă linia celulară transfectată rezistentă la un mediu înconjurător toxic obișnuit Ca exemple de asemenea gene sunt adenozindeaminaza (ADA), aminoglicozidfosfotransferaza (neo), dihidrofolatreductaza (DHFR), higromicin-B-fosfotransferaza (HPH), timidinchinaza (tk), xantinguanin-fosforiboziltransferaza (gtp), gena rezistentă la multe medicamente (MDR), omitindecarboxilaza (ODC) și N-(fosfonacetil)-L-aspartat rezistentă (CAD).

Pe lângă gena marcher pozitiv selectabilă, eventual se poate include și o genă amplificabilă în construcție în regiunea D. Genele amplificabile sunt ge- 5 nele care conduc la o creștere a numărului de copii sub presiune selectivă. Numărul de copii al unei gene aflate în vecinătatea genei amplificabile va crește, de asemenea. Genele amplificabile ce 10 se pot folosi sunt DHFR, MDR, ODC, ADA și CAD. Membrii grupului genei marcher pozitiv selectabile și cei ai grupului genei amplificabile se suprapun astfel că, în teorie, în loc să se utilizeze 15 două gene, una pentru selecția pozitivă și una pentru amplificare, se pot utiliza una singură în ambele scopuri. însă, întrucât majoritatea liniilor celulare conțin copii endogene ale acestor gene am- 20 plificabile, celulele vor fi deja întrucâtva rezistente la condițiile de selecție și poate fi greu de distins celulele care au transfectat ADN de cele care nu au recepționat ADN transfectat De aceea, 25 în cazurile când se dorește o genă amplificabilă, trebuie să se includă în construcție și o genă de selecție pozitivă care este dominantă, cum ar fi HPH, gpt, neo și tk (în celule tk). în unele între- 30 buințări este posibil sau preferabil să se omită marcherul amplificabil. De exemplu, gena de interes poate sa nu aibă nevoie de amplificare ca, de exemplu, când activarea transcripțională prin sec- 35 vența regulatoare ADN heterologă este suficientă fără amplificare. De asemenea, dacă eficiența recombinării omoloage este foarte scăzută, poate fi necesar să se renunțe la gena amplificabilă, pentru 40 că raportul între ADN neomolog și ADN omolog este direct legata de eficiența recombinării omoloage (Letsou, Genetics, 117:759-770, 1987). Este de asemenea posibil să se elimine gena de 45 selecție pozitivă și să se selecteze celulele numai prin alegerea pentru producerea de proteină dorită sau rnARN. însă, în majoritatea cazurilor se preferă să se includă cel puțin gena de selecție pozitivă.

Regiunea E a construcției este o genă marcher selectabilă negativ. O astfel de genă nu este exprimată în celulele în care construcția ADN se introduce adecvat prin recombinarea omoloagă, dar este exprimată în celulele în care construcția ADN se introduce impropriu, cum ar fi prin integrarea la întâmplare. O asemenea genă este gena timidinchinază a virusului Herpes Simplex: (HSVtk). HSVtk are o strictețe mai mică pentru nucleotide și este capabilă să fosforileze analogi de nucleotidă pe care celulele normale de mamifere nu le pot fosforila. Dacă

HSVtk este prezentă în celule, analogi de nucleotidă ca aciclovir și ganciclovir sunt fosforilați și introduși în ADN al celulei gazdă, ucigând astfel celula. Prezența genei marcher selectabile negativ permite să se utilizeze selecția pozitivnegativ pentru recombinarea omoloagă, așa cum a descris Mansour și alții (Natura, 336348-352). Capechi utilizează o strategie care aduce avantajul modurilor diferite de integrare ce se produc când se introduce ADN vector linearizat prin recombinarea omoloagă în comparație cu introducerea sa prin integrare la întâmplare. Dacă vectorul ADN se introduce la întâmplare, majoritatea înserturilor se vor insera la capete (Folger și alții, Mol.Cell.BioL, 2:1372-1387, 1982; Roth și alții, MoLCelLBioL, 5:2599- 2607, 1985 și Thomas și alții, CeU, 44:419-428, 1986). Pe de altă parte, dacă vectorul este inserat prin recombinare omoloagă, el se va recombina prin regiunile de omologie care provoacă pierderea secvențelor din afara acelor regiuni.

Utilizând construcția din fig.1 ca exemplu, modul de integrare pentru recombinarea omoloagă față de integrarea la întâmplare este ilustrat în fig.2A și 2B. în cazul recombinării neomoloage (fig.2A), vectorul este înserat pe la capetele construcției Aceasta permite ca regiunea E, în acest caz gena HSVtk, să fie înserată în genom. însă, când se produce recombinarea omoloagă (fig.2H), gena HSVtk se pierde. Prima rundă de selecție utilizează medicamentul adecvat sau condițiile pentru selecția pozitivă prezentă în interiorul construcției. Celulele care au ADN integrat fie prin integrare la întâmplare, fie prin recombinare omoloagă, vor supraviețui acestei runde de selecție. Celulele supraviețuitoare sunt apoi expuse unui medicament, cum este ganciclovir, care va ucide toate celulele care conțin gena HSVtk în acest caz, majoritatea celulelor în care vectorul s-a integrat prin înserare la întâmplare conțin gena HSVtk și sunt ucise de medicament, în timp ce, cele în care vectorul s-a integrat prin recombinare omoloagă au pierdut gena HSVtk și supraviețuiesc. Aceasta permite eliminarea majorității celulelor care conțin ADN integrat la întâmplare, rămânând majoritatea celulelor supraviețuitoare care conțin ADN integrat pe calea recombinării omoloage. Acest lucru ușurează mult identificarea cazului de recombinare corectă.

Etapa de selecție negativă se poate, de asemenea, elimina dacă este necesar. Va necesita ca etapa de alegere să fie cu mai mare volum de muncă, trebuind să se folosească tehnici ca reacția în lanț a polimerazei (POR) sau alegerea imunologică.

Regiunea a șasea (F) conține segmentul regulator ADN care se va utiliza pentru a face gena de interes activă în transcripție. Segmentul regulator ADN corespunzător este ales în funcție de tipul de celulă ce se va utiliza. Ca segment regulator se va folosi, de preferință, unul despre care se știe că promovează expresia unei gene date în linia celulară g^zdă diferențiată. De exemplu, dacă linia celulară gazdă constă din celule pituitare care în mod natural exprimă proteine, cum sunt hormonul de creștere și prolactina, promotorul pentru oricare din aceste gene se poate utiliza ca element F regulator ADN. Când se introduce, conform cu prezenta invenție, segmentul regulator va fi legat operativ de gena ce în mod normal este reticentă la transcripție și va stimula transcripția și/sau expresia acelei gene de interes în linia celulară gazdă. Se pot utiliza, de asemenea, segmente regulatoare ADN eterogene care lucrează direct asupra tipurilor de celule, cum este promotorul Rous Sarcoma Virus (RSV). Atâta timp cât segmentul regulator stimulează transcripția și/sau expresia, sau poate fi indus să stimuleze transcripția și/sau expresia genei de interes, după ce a fost inserat în linia celulară gazdă, așa ca să fie legat operativ de gena de interes cu ajutorul prezentei invenții , el se poate utiliza în prezenta invenție. Este important ca atunci când se leagă segmentul regulator F de segmentul țintă A să nu se introducă din întâmplare un codon de pornire în secvență, pentru că o asemenea situație ar putea altera cadrul de citire al genei ce se dorește să fie exprimată. Desigur, construcția trebuie să fie construită și inserată astfel ca segmentul regulator F să se lege operativ de gena de interes.

Segmentul regulator ADN, regiunea F, nu trebuie să fie prezente în cazurile în care se dorește să se mărească sau să se amplifice transcripția unei gene care deja se exprimă în linia celulară de interes, fie pentru că se exprimă natural în acea linie de celule, fie pentru că linia celulara avusese anterior manipulat ADN-ul său pentru a provoca această expresie. în aceste cazuri, inserția unei gene amplificabile, regiunea D, de preferință cu gena marcher selectabilă pozitiv, regiunea C și eventual și cu gena marcher selectabilă negativ, regiunea E, vor fi suficiente pentru a crește numrăul de copii ale genei de interes și astfel a mări cantitatea totală de transcripție. în alt mod, se poate include un nou segment regulator, regiunea F, care în mod inerent determină o creștere (sau o altă modificare) a vitezei de transcripție în comparație cu regiunea regulatoare existentă pentru gena de interes, pentru a mări în plus transcripția genei de interes de expresie existente.

Un astfel de segment regulator nou ar putea conține promotori sau intensificatori care îmbunătățesc eficacitatea transcripției.

Regiunile C’, D’ și E* sunt regiuni 5 promotoare care se utilizează pentru a deplasa genele în regiunile C, D și respectiv E. Acești promotori sunt activi din punct de vedere transcripțional în linia celulară aleasă și pot fi aceiași 10 sau diferiți de promotorul din regiunea F folosit pentru a deplasa gena endogenă de interes. Direcția specifică a transcripției, arătată în fig.l, nu este critică.

Cei specializați în acest domeniu pot 15 determina orice amplasare corespunzătoare a genelor C, D și E și a promotorilor lor C, D’ și E’astfel ca promotorii să stimuleze expresia genelor asociate lor fără să distrugă în același timp în vreun 20 fel expresia genei de interes sau oricare din celelalte gene ale construcției.

Prezenta invenție poate fi ilustrată prin referirea la activarea subunității beta a tirotropinei (TSH#) la șobolan în 25 liniile celulare GH1 (ATCC COL 82). CH3 (ATCC CCL 821) sau GH4CL Liniile celulare GH sunt derivate de la o tumoare pituitară provocată de radiație la șobolani notată cu MtT/W5 (Takemoto, Cart- 30 cerRes., 22:917,1962) și adaptată pentru a crește în cultură de către Tashjian și alții, Endocrinology, 82:342-352, 1968. Aceste linii celulare pot fi subclonate și separate pentru ușurința lor de a produce 35 hormonul de creștere și TSH/1 Selecția (separarea) se poate face, de preferință, cu ajutorul analizei petei Northem, ca să se determine dacă este prezent mARN pentru gena hormonului de creștere a 40 șobolanilor și să se stabilească că nu există mARN pentru gena TSH/3 care se produce. Liniile celulare mai pot fi selectate prin analiza Southern pentru a determina că există cel puțin o copie a 45 genei TSH/3 prezentă în genom. Se întrebuințează numai liniile celulare GH care produc hormonul de creștere, nu și TSH/3, dar conține o copie a genei

ΊΒΗ/3.

Vectorul de recombinare omoloagă specific ce se utilizează în liniile celulare GH se poate cera în modul următor (fig.3). Regiunea A poate consta din regiunea 5’ din partea superioară netranslatată a genei TSH/1 definită de către fragmentul HindIII care se întinde de la - 74 la - 2785 și regiunea Bpoate conține fragmentul ADN care se întinde de la locul HindIII - 2785 la locul Ncol la aproximativ 2,1 kb mai departe în partea superioară, așa cum a descris Carr și alții (J.Biol.Chem., 262:981-987, 1987) și Croyle și alții ((DNA, 5:299-304, 1986). Gena de selecție pozitivă (regiunea C) poate fi un fragment BglI-Smal de 1067 bp derivat de la plasmida pSV^ieo (Al’CC nr.37.149) (Southern și alții, J.MoLAppl. Gen., 1:327-341, 1982). Gena neo poate fi deplasată de promotorul Reus Sarcoma Virus (RSV) (regiunea C’) care este derivat de la fragmentul NedI-HindIII din plasmida pRSVcat (ATCC nr.37.152) (Gorman și alții, PNAS, 79:6777-6781, 1982). în acest exemplu, nu trebuie să se folosească marcher amplificabil și astfel nu este nevoie să fie o regiune D pentru a optimiza eficacitatea recombinării omoloage. Eficacitatea este în relație inversă cu proporția de secvențe ne-omoloage față de cele omoloage prezente în construcție (Letscu și alții, Genetics, 117:759770, 1987). Regiunea E sau gena de selecție negativă poate consta din gena HSVtk care este un fragment Xho de 2 kb obținut din plasmida pMCITK (Capecchi și alții, Nature, 336: 348-352, 1988). Gena HSVtk din această construcție poate fi deplasată de promotorul virusului polyoma și intensificatorul său (regiunea E’), așa cum a construit Thomas și alții (Ce//, 51:503-512,1987). întro a doua construcție ADN promotorul polyoma poate fi înlocuit de promotorul RSV descris mai sus. Secvența regulatoare ADN utilizată pentru a activa gena TSH/3 poate fi fie promotorul RSV, fie promotorul hormonului de creștere a șobolanului. Promotorul hormonului de creștere a șobolanului constă din fragmentul SacI-EcoRI obținut din plasmida pRGH237CAT (Laraon și alții, PNAS, 83:8283-8287, 1986). Promotorul RSV are avantajul de a fi util și în alte linii celulare, în afară de celulele GH, în timp ce promotorul GH este cunoscut ca fiind util în celulele GH, unde este activ și indus specific (Brent și alții, J.BioL Chem., 264:178-182, 1989). Promotorul hormonului de creștere a șobolanului și promotorul RSV se pot introduce în locul F în construcții separate.

După transfecția construcției de mai sus în linia celulară GH, celulele se pot crește în medii care conțin G418. Aceasta va permite să crească numai acele celule care au integrată plasmida ADN în genom prin recombinarea omoloagă sau prin integrarea la întâmplare. Celulele supraviețuitoare pot fi crescute în mediu care conține ganciclovir. Majoritatea celulelor care supraviețuiesc acestei runde de selecție vor fi cele în care plasmida vector ADN este integrată prin recombinarea omoloagă· Aceste celule pot fi selectate pentru a demonstra că ele produc mARN care corespunde genei TSH/ϊ și că ele produc proteină TSH/J. ADN genomic poate fi, de asemenea, secvențat în jurul ariei de inserție a promotorului heterolog, pentru a se asigura că s-a produs recombinarea corespunzătoare.

Exemplul 1. Activarea genei TSHfi în celulele pituitare de șobolan

Folosind procedura care urmează, gena subunității de beta tirotropină (TSH/T) care, de obicei, nu se poate transcrie în linia celulară pituitară GH3 a șobolanului, s- a transcris cu activare în acele celule, folosind procedeul recombinării omoloage pentru a transforma în țintă un element de activare din partea superioară a regiunii de codificare a TSH/λ Promotorul Rous Sarcoma Virus (RSV) se știe că funcționează eficient în celulele GH3[Christian Nelson și alții, Nature, 322557-562, 1986; Zheng-Sheng Ye și alții, The Joumal ofBiological Chemistry,

263:7821- 7829 (1988)] și de aceea a fost ales ca element de activare. S-a construit un vector plasmidă care conține elementul de activare RSV, porțiuni ale regiunii de flancare 5’ a locului genei TSH/î, și un marcher de medicament selectabil, gena aminoglicozid-fosfotransferazei (NEO), pentru izolarea populațiilor de celule transfectate. Acidul ribonucleic (ARN) a fost extras din populațiile de celule GH3 rezistente Ia medicament colectate și transformat în acidul deoxiribonucleic complementar (cADN). Apoi, cADN a fost selectat prin tehnica reacției în lanț a polimerazei (PCR), privind prezența cADN TSH/1. Construcția vectorilor de recombinare omoloagă și a vectorilor de control este prezentată mai jos împreună cu procedurile experimentale și cu rezultatele.

Exemplul 2. Construcția plasmidei Vectorul schelet al recombinării omoloage (HR) este (pRSVCATNEO).

Promotorul virusului sarcomului Rous (RSV) a fost derivat de la plasmida piSVCAT (Cornelia M.Gorman și alții, Proceedings of the Național Academy of Science, 79:6777-6781,1982) (fig.5) prin izolarea fragmentului Ndel-Hind-III de 580 perechi de baze (bp) care conține unitatea de promotor funcțional. Capetele acestui fragment au fost blocate folosind fragmentul de polimeraza ADN I Klenow și de aceste capete s-au legat agenții de legătură Xbal. După digerarea cu endonucleaza de restricție Xbal și purificarea gelului, fragmentul obținut a fost legat în locul Xbal al pUC18. O colonie de bacterii care adăpostește o plasmidă cu insertul RSV în orientarea arătată în fig.6 a fost denumită pRSV. Gena aminoglicozid-fosfotransferazei (NEO) s-a donat din pSV2NEO (PJ. Southern și alții. Joumal of Molecular arid Applied Genetics. 1:327-341, 1982) prin izolarea fragmentului BglII și BamHI (fig.7) și legarea acestui fragment în situl (locul) BamHI al pRSV (fig.6). S-a scos o plasmida care conține gena NEO în orientarea din fig.8 §i s-a denumit pRSVNEOBAM.

S-a digerat pRSVNEOBAM cu Smal și fragmentul de 4328 bp care conține regiunea promotoare RSV, majoritatea genei NEO și pUC18 s-a izolat prin electroforeza gelului. Capetele Smal ale acestui fragment au fost conectate Xhol, clivate cu enzima de restricție Xhol și plasmida s-a recircularizat prin legare. Plasmida obținută este arătată în fig.9 și s-a notat cu pRSVNEO. Acest ultim pas de donare a condus la îndepărtarea unui fragment de 786 bp de la capătul 3’ al fragmentului NEO care nu este necesar pentru expresia sa funcțională. Această construcție produce o plasmida în care gena NEO este mutată transcripțional de promotorul RSV.

Apoi locul Ndel amplasat la capătul 5’ al promotorului RSV din pRSVCAT (fig.5) s-a transformat într-un loc Săli. Acest lucru s-a realizat prin digerarea pRSVCAT cu Ndel, umplerea capetelor folosind fragmentul polimerazei ADN I Klenow și legarea elementelor de atașare Săli de capetele blocate obținute. Elementele de atașare (legătură) s-au digerat complet cu Săli și plasmida s-a recircularizat prin legare. In locul nou construit Săli s-a donat fragmentul Sa11-XhoI din pRSVNEO (fig.9) care conține promotorul RSV și gena NEO. S-a izolat o plasmidă cu promotorul RSV și fragmentul NEO orientau cum se arată în fig. 10 și s-a denumit pRSVCATNEO. Această plasmidă, când este transfectată în celulele GH3, este capabilă să confere acestor celule rezistența G418, demonstrând ușurință promotorului RSV de a deplasa transcripția genei NEO și abilitatea acelui ARN de a fi translatat într-o proteină funcțională (date nereprezentate). ARN total din transfectantele stabile de mai sus s-a analizat prin reacția în lanț a polimerazei (POR) pentru a determina dacă gena CAT a fost transcrisa. Rezultatele PCR arată că gena CAT a fost într-adevăr transcrisă în toate coloniile rezistente G418 testate (date nereprezentate), indicând că promotorul RSV 5’ al genei CAT a fost capabil să deplaseze transcripția unei gene amplasate la 3’de ea. Acest lucru este important pentru că acest promotor RSV va fi cel care trebuie să deplaseze transcripția genei TSH/î când vectorul TSH/î HR descris mai jos se integrează pe calea recombinării omoloage în genomul GH3.

Exemplul 3. Vectorul TSHfi HR.

S-a creat un vector capabil să se integreze în genomul GH3 prin recombinare omoloagă prin inserarea a două porțiuni din regiunile de flancare 5’ ale genei subunității beta a tirotropinei (1SH/3) în locurile unice Săli și HindIII din pRSVCATNEO (fig. 10). O colonie genomică de splină de șobolan care conține inserturi a 15 kilobaze (KB) sau mai mari donată în lambda DASH s-a obținut de la Stratagene, San Diego, California. Utilizând procedurile standard (Current Protocols in Molecular Biology, pag. 1.9.1-1,13.6,6.1.1-6.4.10) s-a izolat o clonă de 15,3 kb din gena TSII/3 genomică de șobolan care cuprinde 9 kb din secvența 5’ a primului exon. Fragmentul de 15,3 kb a constat din două fragmente Xbal, un fragment de 10,6 kb corespunzător capătului 5’ al fragmentului de 15,3 kb și o bucată de 4,7 kb corespunzătoare regiunii 3’ a fragmentului de 15,3 kb (fig. 11). Ambele aceste fragmente Xbal s-au subclonat în pUC18 și plasmidele care conțin inserțiile în ambele orientări s-au izolat Fragmentul de 2,3 kb Xbal-HindIII conținut în fragmentul de 4,7 kb Xbal (fig. 11) s-a purificat și locul Xbal al acestui fragment s-a transformat într-un loc HindIII prin umplerea capetelor cu fragmente Klenow și legarea de elementele de legătură HindIII. Acest fragment s-a legat în locul unic HindIII conținut în pRSVCATNEO (fig. 10). Un izolat corespunzător unei plasmide cu insertul de 2,3 kb în orientarea corectă arătată în fig. 12 s-a denumit pRSVCATNEOTSHB3.

Fragmentul Xbal subclonat de 10,6 kb din clona TSH/8 de șobolan (fig.li) s-a izolat și capetele Xbal s-au transformat în locuri Săli prin terminația neascuțila a fragmentului cu fragmentul polimerazei ADN I Klenow și atașarea agenților de legătură Săli. Acest fragment Săli de 10,6 kb a fost apoi clonat în locul Săli al pRSVCATNEOTSHB3 (fig. 12). S-a identificat o plasmida care conține insertul în orientarea corectă și s-a denumit _PRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (fig. 13). Ultima plasmidă a fost depozitată la American Type Culture Collection Rockville, MD, și a primit numărul de depozit ATCC 40933. In scopul acestui depozit, plasmida a fost renumită pHRTSH. Acest depozit s-a făcut în concordanță cu toate cerințele Tratatului de la Budapesta.

Exemplul 4. Linia celulară

Celulele GH3 sunt o populație subclonată a MtT/W5 care s-a derivat dintr-o tumoare pituitară indusă de radiație la șobolani (B.K.Takemoto, Cancer Research, 22:917,1962) și s-a adaptat pentru a crește în cultură de către Tashjian și alții, Endocrinology, 82:342-352 (1968). Celulele GH3 s-au obținut de la banca de celule a American Type Culture Collection și se mențin în cultură prin creșterea în mediu Eagle modificat Dulbecco (DMEM) + ser de cal 15% (HS) + ser fetal de bovine 2,5% (FBS) + L-glutamină 1% (mediu GH3) la 37°C în CO2 5%.

Exemplul 5. Prepararea ADN

Prepararea pe scară largă a plasmidei ADN

Toate plasmidele utilizate pentru transfectările stabile au fost purificate utilizând metoda lizei alcaline pentru purificarea pe scară mare a plasmidei ADN, cum s-a descris în Current Protocols in Molecular Biology, voi. 1, pag. 1.7.1 -1,7.2. - ADN izolat prin metoda lizei alcaline a fost apoi purificat, în continuare, prin dublă îndoire într-un gradient de clorură de cesiu, cum s-a descris tot în Current Protocols in Molecular Biology, voLl, pag.1.7.5-1.7.7.

înainte de transfectare, vectorii HR au fost digerați cu AatlI sau Apal. Apal s-a folosit pentru linearizarea plasmidei de control pRSVCATNEO și AatlI pentru linearizarea plasmidei HR pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI. Amplasarea locurilor de clivaj ale Apal și AatlI se poate vedea în fig. 10 și respectiv 13. După digerarea cu enzima de restricție corespunzătoare, amestecul de reacție s-a extras cu fenol/cloroform, s-a extras cloroformul, s-a precipitat cu etanol și s-a spălat odată cu etanol 70%. Plasmidele au fost apoi resuspendate în apă deionizată sterilă (dH2O) până la o concentrație de 1 microgram/microlitru (pg/pl), ceea ce s-a determinat prin absorbanța la OD26O. într-o încercare de a mări eficiența transfectării și/sau raportul între recombinările omoloage pozitive și cele care se datoresc integrării la întâmplare, pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI s-a digerat cu Apal. Digestia cu Apal taie în trei locuri separate în pRSVCATNEOTSHB

3-5XbaI și îndepărtează toate regiunile vectorului cu excepția celor necesare pentru recombinarea omoloagă (fig. 13). După digestia cu Apal, amestecul de reacție se supune electroforezei pe un gel de agaroză 0,8% și banda superioară corespunzătoare Ia fragmentul de 10,992 bp ce conține cele două regiuni de flancare 5’ ale genei ’lSH/ή regiunea promotor RSV-NEO și promotorul RSV care activează gena TSH/3 se izolează din gel prin electroeluare în tub de dializă. ADN electroeluat este mai departe purificat folosind o minicoloană elutip (Schleicher și Schuell) cu modul de lucru standard recomandat de fabricant ADN se eluează din coloană, se precipită cu etanol, se spală cu etanol 70% și se resuspendă la o concentrație de 1 pgfpf.

Transfectările stabile Transfectarea cu fosfat de calciu Cu 48 h înainte de transfectare 3 x IO⁶ celule GH3 se întind pe farfurii de 10 cm. Pentru fiecare farfurie se adaugă 10 pg ADN vector cu 30 pg ADN de speimă de somon sonisată la 0,5 ml tampon de transfectare. Tamponul de transfectare se prepară prin combinarea a 4 g NaCl, 0,185 g KC1,0,05 g Na2HPO₄,

2.7

0,5 g dextroză, 2.5 g HEPES și dlfeO până la un volum final de 500 ml și aducerea pH- ului la 7,5. Se adaugă 31 pl CaC12 2 molar (M) la 0,5 ml ADN + tampon de transfectare și se amestecă. Această soluție se lasă să stea la temperatura camerei 45 min. Când amestecul ADN - CaC12 - tampon de transfectare este gata, mediul GH3 se îndepărtează din celulele GII3 și ADN - CaC12 tampon de transfectare se așază în strat peste celule. Celulele se lasă să stea la temperatura camerei 20 min. După 20 min, se adaugă 5 ml mediu GH3 și plăcile se incubează la 37°C, timp de 6 h. Celulele sunt, după aceea, zdruncinate prin aspirarea completă a mediului și adăugarea a 5 ml tampon de transfectare proaspăt care conține 15% glicerină timp de 3,5 min. Celulele sunt clătite de două ori cu PBS §i alimentate cu 10 ml mediu GH3. Ei 48 h după transfecție, mediul se îndepărtează și se adaugă 10 ml mediu GH3 care conține 400 pg/ml G 418.

Electroporația

Electroporația se efectuează folosind un aparat BTX 300 Transfector cu 3,5 mm spațiu între electrozi. 1 x 10' celule GH3 care cresc în fază logaritmică se îndepărtează de pe plăcile lor prin tripsinizare, se peletizează prin centrifugare și se spală odată cu PBS. Celulele se resuspendă în 1,0 ml PBS și se transferă în chiuvete de dispunere de 2,9 ml Ultra-UV (American Scientific Products) pe gheață. Se adaugă celulelor 10 pg ADN, se amestecă și se așază înapoi pe gheață, timp de 5 min. După 5 min, electrozii se plasează în cameră și celulele sunt electroporate la 750 microfarazi cu un puls de 200 volți. Chiuveta este apoi readusă pe gheață, timp de 10 min. Celulele sunt transferate din chiuveta în 91 mediu GH3 care conține 1% penicilină și 1% streptomicină la temperatura camerei într-un tub conic de 15 ml și se lasă să stea timp de 10 min. Electroporația totală a 1 x 10' celule se transferă pe trei plăci de 10 cm dând aproximativ 3 x IO⁶ celule per placă. După 48 h se adaugă mediul GH3 care conține 400/zg/ml G 418.

Transfectarea celulelor GH3 cu pRSVCATNEOTSHB3 5XbaI (Âatll tăiat), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (tăiat cu Apal) și pRSVCATNEO (tăiat cu Apal).

Plasmidele pRSVCAT NEOTSHB35XbaI (tăiat cu Aatll). pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (tăiat cu Apal) și pRSVCATNEO (tăiat cu Apal) sunt transfectate în celule GH3 împreună cu un martor (control) fără ADN, utilizând procedeu] cu fosfat de calciu și procedeul cu electroporația. Ia 48 h după transfecție, celulele sunt supuse selecției G418. I.a aproximativ 14 până la 21 zile mai târziu coloniile devin vizibile cu ochiul pe farfuriile de 10 cm și se numără. La toate probele martor fără ADN nu au apărut colonii vizibile, demonstrând că selecția G 418 a funcționat și că prezența unei plasmide care conține regiunea RSVNEO a fost necesară pentru a conferi rezistență G418. în acest moment coloniile au fost culese și amestecate prin izolarea regiunilor de pe farfuriile de 10 cm cu inele de donare late de 17 mm. Aceste inele mari de donare au cuprins între 10 și 70 colonii în funcție de densitatea coloniilor pe placă și au permis ca celulele GH3 din această regiune izolată să fie îndepărtate și amestecate în același timp prin tripsinație. Coloniile tripsinizate din fiecare inel au fost transferate pe plăci cu 6 adâncituri și au fost lăsate să crească în mediu GH3 care conține G 418. După atingerea a 70% până la 80% confluență, 80000 celule au fost transferate pe o placă cu 24 adâncituri și celulele rămase au fost păstrate prin congelare pentru alte teste la o dată ulterioară. Celulele din plăcile cu 24 adâncituri cu crescut până au atins 50% până la 80% confluență. Tot ARN din aceste celule GH a fost apoi depozitat prin procedeul care urmează.

Izolarea ARN din celulele GH3 trans109864 fectate crescute in plăci cu 24 adâncituri.

Cele ce urmează reprezintă o modificare a protocolului descris de Chomezynski și Sacchi, Anal.Biochem., 162: 156-159 (1987). Mediul care acoperă celulele GH3 în cele 24 adâncituri ale plăcilor se îndepărtează și celulele se spală cu 1 ml PBS. Se adaugă 1 ml soluție GTC și celulele se incubează la temperatura camerei, timp de 5 min. Soluția GTC se prepară prin dizolvarea a 250 g tiocianat de guanidină (Fluka) în 293 ml dH2O, și apoi adăugarea a 17.6 ml cifrat de sodiu 0,75 M pH=7,0 și 26,4 ml sarcosil 10% (L-laurilsarcosină). Chiar înainte de utilizare, se adaugă 360 μ\ β mercaptoetanol per 50 ml soluție GTC. După 5 min, la temperatura camerei, lizatul de GTC - celule 1 ml se transferă într-un tub cu cap închis Sarstedl 55.518 care conține 2 ml soluție GTC. l a fiecare tub se adaugă 300 μ\ acetat de sodiu 2M pII=4,0 și tubul se răsucește. După aceea, se adaugă 3 ml soluție fenolică saturată în dH2O și tuburile se agită din nou. La fiecare tub se adaugă 600 μ\ cloroform: alcool izoamilic (49:1) și tubul se agita energic în mână, timp de 10 s și se așază pe gheață 15 min. Tuburile sunt apoi centrifugate în aparat Sorval RC-5B, utilizând un rotor SM24 cu 8000 revoluții pe minut (RPM), timp de 20 min, la 4°C Faza apoasă se transferă într-un tub proaspăt Sarstedt care conține 3 ml izopropanol și se așază la -20°C, timp de 1 h. După 1 h tuburile sunt învârtite într-un aparat Sorval RC-5B, folosind un rotor cu 8000 rot/min, timp de 20 min, la 4°C. Supematanții se îndepărtează și peleții se resuspendă în 500 μ\ soluție GTC, ARN resuspendat se transferă într-un tub Eppendorf de

1,5 ml, la care se adaugă 500 μ\ izopropanol. Tuburile se așază încă o dată la -20°C, timp de o oră. Tuburile Eppendorf sunt răsucite, timp de 5 min, într-o microcentrifugă și se descarcă supematantul. Peletele se spală cu etanol 70% de două ori și se lasă să se usuce până ce etanolul s-a evaporat complet Peletele se resuspendă în 20 μ\ apă cu dietilpirocarbonat (depc) și se încălzește la 65°C, timp de 5 min. Acest ARN este apoi utilizat pentru a face cADN în unul din cele două procedee descrise mai jos.

Reacțiile cADN

Metoda 1. Prima bandă de cADN s-a sintetizat din 2,5-6,0 microlitri ARN total (aproximativ 0,5...6/zg) într-un volum de reacție de 10...20μ\. ARN total s-a obținut prin metoda extracției descrisă mai sus și a fost denaturai timp de 5...10 min, la 70°C și înghețat repede pe gheață, înainte dc a se adăuga componentele reacției. Condițiile de reacție au fost 7rw-HCl 50 milimolar (mM) (p 11=8,3). MgC1210 mM, DIT10 mM, dCIP, dATP, dGTP și dTTP fiecare 0,5 mM (Pharmacia), KC140mM, 500 unități/ml RNasin (Promega Biotech), 85 //g/ml oligo (dT)i2wțCollaborativeResearch, Inc.) și 15.000 - 20.000 unități/ml transcriptază inversă a virusului leucemiei murine Moloney (Bethesda Research Laboratories) incubate la 37°C, timp de 60 min. Reacția s-a terminat prin adăugare de EDTA 40 mM și acidul nucleic s-a precipitat prin adăugare de acetat de sodiu la o concentrație de 0,3M și două volume de etanol. Precipitatul s-a lăsat să se formeze la 0°C, timp de 30 min și apoi s-a peletizat prin centrifugare într-o microcentrifugă la 14000 rot/min, timp de 30 min. Peletele s-au spălat cu etanol 70%, s-au uscat și s-au resuspendat în apă tratată cu depc până la un volum de 15...25 μ\.

Metoda 2. Condițiile pentru sinteza primei benzi de cADN din ARN s-au adaptat de la Carol A. Brenner și alții, Bio Techniques, vol.7, nr.10, pag.10961103 (1989). 1 μΐ de ARN total din ARN preparat prin procedeul descris mai sus, s-a adăugat la 9 μ\ tampon de reacție într-un tub Eppendorf de 0,5 ml. Tamponul de reacție a constat din 200 unități transcriptază inversă de virus de leucemie murină Molony (MMLVRT, Bethesda Research Labs) și următorii reactivi în concentrațiile finale date: Tris.HCl 70 mM pH=8,8, KC1 40 mM, 0,1% Triton

X-100, dNPT 1 mM, MgC12 4 mM și 0,45 OD260 unități de hexameri întâmplători. (Pharmacia). După amestecare, tuburile au fost incubate la temperatura camerei, timp de 10 min și apoi așezate la 42°C, timp de o oră. După o oră tuburile au fost încălzite la 90°C, timp de un minut, pentru a dezactiva MMLVRT și apoi s-au răcit la temperatura camerei.

Amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) a ARN din celulele GH3

Următorii primeri s-au utilizat pentru a amplifica, prin PCR, TSH/fcADN și sintetizat din transcriplele ARN produse de celulele GH3, ca rezultat al activării cu plasmidele HR a genei endogene TSH/5 prin recombinare omoloagă, primerul 5’ 3’

TSH05 AGTATATGATGTACGTGGACAGG TSH$3 CACITCCCACACTTGCAGCTCAGG

In fig. 14 se arată regiunile din gena T “SII/l la care corespunde fiecare primer.

Condițiile reacției PCR

Toate reacțiile PCR s-au efectuat în termociclerul Ericomp Twinblock. Dacă amplificarea PCR a trebuit să se aplice pe cADN obținut prin metoda 2, s-a adăugat direct un amestec de reacție suplimentar de 40 μ\ la cei 10 μϊ, reacție cADN aducând volumul total până la 50 μΐ. Concentrațiile finale ale reactivilor în acești 50 μ\ au fost Tris.HCl 70 mM pH=8,8, KC1 40 mM, 0,1% Triton X 100, 2,25 unități polimeraza Taq (Pharmacia), fiecare primer 0,2 micromolar (μΜ), fiecare dNTP 200 μΜ și MgC12 0,8 mM.

Dacă amplificarea PCR a trebuit să se aplice pe cADN obținut prin metoda de mai sus, s-au adăugat 5 până la 10 μΐ cADN rcsusperidat la 40 până la 45 μΐ care conțin în concentrații finale următorii reactivi: Trw.IICl 70 mM pH=8,8, 5 KC1 40 mM, 0,1% Triton X-100, 2,25 unități polimcrază Taq, fiecare primer 0,2 μΜ, fiecare dNTP 200 μΜ și MgC12 0,8 mM.

Amestecurile de reacție au fost apoi 10 supuse la următoarele cicluri PCR:

min la 94°C;

s la 55°C;

min la 72°C.

S-a repetat ciclul de mai sus de 30 15 până la 40 ori. 10 μΐ din fiecare amestec de reacție s-au trecut pe un gel poliacrilamidic 6% și s-au separat în funcție de prezenței unui fragment de 247 bp PCR care ar indica prezența mARN îmbinat 20 corespunzător pentru TSHB.

Rezultatele PCR pentru amplificarea ARN TSHB din celulele GN3 și ARN total din glanda pituitară de șobolan

Pentru a determina dacă celulele CH3 25 sintetizează în mod normal ARN TSHjS, cADN din celulele netransfectate GH3, precum și cADN din glandele pituitare de șobolan au fost supuși condițiilor de reacție PCR de mai sus. Banda corectă 30 cu 247 bp care indică prezența mARN TSH)3 a fost vizibilă în martorul pozitiv al probei de glandă pituitară de șobolan, dar nu s-a văzut nici o bandă din proba cu ARN total din celulele GH3 chiar și 35 după 60 cicluri (date nereprezentate).

Rezultatele transfectării

Numărul de colonii rezistente G418 prezente pe farfuriile de 10 cm a fost notat între zilele 14 și 21, după adăugarea 40 G418 la mediu.

Metoda de transfectare pRSVCATNEO

Colonii pe farfurie de 10 cm pRSVCATNEOTSHB3-5XBAI tăiat Apal tăiat Aatll

Fosfat de calciu 1 Fosfat de calciu 2 Electroporație 1 Electroporație 2

1295 1051

415

723

ARN total a fost recoltat din amestecul de colonii conținut în plăcile cu 24 adâncituri, cum s-a descris mai sus, cADN s-a fabricat din aceste preparate ARN și s-a supus amplificării PCR. Numărul 5 de colonii pozitive care produc mARN TSH/3 s-a determinat prin prezența unui fragment de 247 bp, cum s a văzut pe un gel poliacrilamidic. Fiecare din amestePlasmida pRSVCATNEO pRSVt )ATNFOTSHB3-5XBAI (digerat cu AaT2) pRSVCATNEOTSHB3-5XBAI (digerat cu Apa 1)

Aceste rezultate au demonstrat 10 activarea cu succes a genei 1 SI 1/3 în mod normai reticentă la transcripție, prin metoda conform prezentei invenții. Dacă numărul de colonii care sunt pozitive pentru transcripția TSH/3 este mic în 15 comparație cu numărul de colonii care sunt rezistența la G418 (aproximativ una din fiecare 10³ colonii rezistente la G418), acest rezultat este însă în concordanță cu vitezele relatate pentru alte experiențe 20 de recombinare omoloagă [Michael Kriegler, Gene Transfer and Expression, A I aboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, (1990), pag.56-60]. S-a constatat, în general, că viteza de recombinare 25 omoloagă pare să fie proporțională cu viteza de transcripție a genei urmărite jM.Frohman și G.Martin, Cell, 56:145, (1989); S.L.Mansour și alții, Nature, 336: 348,(1988/. Trebuie să se remarce faptul 30 că viteza care s-a demonstrat este cu trei ordine de mărime mai mare decât cea ce s-ar putea aștepta pentru mutația la întâmplare aplicată genei TSHjS.

Pentru a ne asigura că rezultatele 35 pentru fiecare amestec de colonii sunt reproductibile și că activarea transcripției ARN este stabilă, amestecurile de colonii care au fost anterior înghețate, corespunzătoare amestecurilor care au 40 dat testul pozitiv la prima selectare, au fost dezghețate și s-au extins în cultură.

curile alese a conținut între 10 și 70 colonii. Numărul estimat de colonii per amestec per transfectarc s-a folosit pentru a aproxima numărul de clone de celule GH3 rezistente G418 în care a fost activată transcripția genei TSHj9. Dacă un amestec testat este pozitiv, s-a apreciat că acesta prezintă o colonei pozitivă prezentă în acel amestec anume.

pozitiv

Colonii reezidente G418	ARN TSHfi
60	0
4942	3
8580	6

Amestecurile pozitive GH3 proaspăt dezghețate au fost însămânțate în baloane cu culturi de țesuturi T 25 și s-au extins până când celulele au atins 70 până la 80% confluență. După aceea 80000 celule au fost așezate plan în plăci cu 24 adâncituri de la fiecare balon și au crescut până când 50 până la 70% din ele au devenit aderente. S-a extras ARN din celule, s-a transformat în cADN și s-au ales din nou pentru prezența ARN TSH/3 prin trecerea a 10 /zl din fiecare reacție PCR pe un gel 6% poliacrilamidic. în fig. 15 se arată rezultatele reacțiilor PCR reprezentative de la a doua alegere, așa cum s-au văzut pe un gel de poliacrilamidă prin pătare cu bromură de etidium și fluorescență. Șirurile 1, 2 și 3 conțin reacțiile PCR efectuate pe cADN din celulele GH3 care au fost transfectate de pRSVCATNEO. pRSVCATNEO nu conține regiuni de omologie cu TSH/3 §i astfel nu este capabilă să activeze gena TSH/3 prin recombinare omoloagă. După cum se poate vedea pe gelul din fig. 15, nu există benzi corespunzătoare la 247 bp în acele șiruri, indicând că gena TSH/3 nu este activată. Șirul 6 conține, de asemenea, un martor negativ. In acest șir au fost combinate trei amestecuri din probele de celule GH3 care fuseseră transfectate cu pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (tăiere cu Apal), dar care au fost negative la transcripția genei TS11/7 la prima alegere. Absența fragmentului de 247 bp în șirul 6 demonstrează că prezența plasmidei transfectate pRSVCATNEOTSHB35XbaI (tăiere cu Apal) integrată la întâmplare în genom nu este capabilă să producă fragmentul PCR TSH/î de 247 bp. Liniile 7, 8, 9 și 10 cuprind experiențele cu reacțiile PCR pe cADN făcut din ARN total recoltat de la glandele pituitare de șobolan în cantități pe fiecare reacție de 25 nanograme, 100 nanograme, 200 nanograme și 400 nanograme. Prezența în aceste linii a benzii de 247 bp așteptată, produsă din cADN preparat din țesut de șobolan care în mod normal exprimă TSII/ί a demonstrat că condițiile reacției PCR au fost corect optimizate și că banda PCR obținută în liniile 4 și 5 care conține probele pozitive Ί SI 1/7 de recombinare omoloagă este de mărimea corectă. Două amestecuri transfectate cu pRSVCATNEOTSH B3-5XbaI (tăiere cu Apal) care au fost pozitive la prima alegere, Apal-107 în linia 4 și ApaI-136 în linia 5, au fost testate încă odată pozitiv pentru activarea genei TSH/î, după cum s-a demonstrat prin prezența benzii corecte Ί 814/7 PCR amplificate din cADN făcut din extractele de ARN total de la acele amestecuri ce au dovedit că transcripția genei Ί8Η/7 a fost activată stabil. Prezența benzilor de 247 bp în liniile 4 și 5 care conțin ARN din probele pozitive anterior ApaI-107 și ApaI-136 și absența benzilor în probele martor negative ale celulelor GH3 transfectate cu pRSVCATNEO în liniile 1-3 și în probele negative pRSV CATNEOTSHB3-5XbaI (taiere cu Apal) din linia 6 au demonstrat că producerea de ARN 1SI4/7 într-o linie celulară care în mod normal nu produce acest ARN a fost determinată să fie stabilă prin recombinarea omoloagă.

Prezenta invenție nu se limitează la linia celulară descrisă aici. Toate liniile celulare au informații genetice care, de obicei, sunt reticente sau inerte. Majori36 tatea sunt capabile să exprime numai anumite gene. Insă, o genă care în mod normal este reticentă sau inertă la transcripție din orice, astfel de linie celulară poate fi activată pentru a exprima produsul genei, conform cu prezenta invenție, și orice genă din genom poate avea caracteristicile sale de expresie modificate conform cu prezenta invenție. Chiar liniile celulare anterior transformate se pot utiliza atâta timp cât transformarea anterioară nu a distrus gena de interes. Sursa de linie celulară nu este importantă. Linia celulară poate fi de la animal sau plantă, primară, continuă sau imortală. Desigur, este de dorit ca orice astfel de linie celulară să fie stabilă și imortală, astfel ca după tratament prin tehnica conform prezentei invenții, expresia să poată fi comercializată. Microorganismele donate, fie procariote, fie eucariote, pot fi, de asemenea, tratate prin tehnica conform cu prezenta invenție.

Prezenta invenție a fost descrisă, de preferință, cu privire la expresia unei gene, care în mod normal este reticentă sau inertă la transcripție, dar procedeul conform acestei invenții se poate aplica și la modificarea caracteristicilor de expresie ale unei gene care este exprimată natural în linia celulară gazdă. De exemplu, dacă se dorește să se dea expresia unei gene în funcție de condițiile de cultură și altele, astfel ca expresia să se aplice sau să se scoată la dorință, se poate insera un segment ADN regulator corespunzător, cum este un promotor regulator, care conferă asemenea caracteristici, cum sunt represibilitatea sau inductibilitatea. De exemplu, daca se știe că tipul de celulă conține receptori nucleari steroizi, ca cei estrogen, testosteronă sau glucocorticoid, sau receptori de tiroxină, se pot utiliza elementele de răspuns ale steroidului sau tiroxinei ca regiune F. Acest element de răspuns este orice ADN care leagă asemenea receptor pentru a provoca un răspuns pozitiv referitor la transcripție. Chiar dacă o celulă nu răspunde în mod natural la glucocorticoide, de exemplu, o porțiune de ADN care codifică receptorul glucocorticoid s-ar putea adăuga la construcție, sau introduce în alt fel undeva în genom, pentru a face ca celula să răspundă la glucocorticoide. Utilizarea unui promotor regulator poate să fie dorită fie dacă gena de interes este normal reticentă la transcripție, fie ca nu este. Se pot obține și alte feluri de reglări prin introducerea segmentului regulator ADN corespunzător în poziția exactă de interes cu ajutorul procedeului din prezenta invenție.

Astfel, dacă stimularea expresiei genelor normal reticente la transcripție este realizarea preferată a prezentei invenții, în sensul său cel mai larg invenția se aplică la modificarea caracteristicilor expresiei oricărei gene endogene din linia celulară gazdă.

Procedeul specific de recombinare omoloagă nu este în sine o parte nouă a prezentei invenții. Asemenea procedee sunt cunoscute și specialiștii în acest domeniu vor înțelege că se poate utiliza oricare din ele în prezenta invenție atâta timp cât permite introducerea unei secvențe regulatoare ADN în poziția dorită față de gena de interes. Se descrie un procedeu preferat, utilizând o construcție linearizată cu două regiuni omoloage la fiecare din capetele secvențelor de inserat, dar orice procedeu care poate realiza această funcție ca, de exemplu, prin folosirea construcțiilor circulare, poate fi folosit în prezenta invenție. Trăsătura specifică a acestei invenții este folosirea tehnicilor de recombinare omoloagă pentru a introduce o secvență regulatoare ADN care provoacă modificarea caracteristicilor de expresie în linia celulară sau microorganismul ce se utilizează, legându-se operativ cu o genă din genomul liniei celulare, de preferință una care este în mod normal reticentă la transcripție, sau pentru a introduce o secvență amplificabilă fără o secvență regulatoare, suficient de aproape de o genă din genomul liniei celulare care deja transcrie pentru a provoca amplificarea acestei gene în timpul amplificării secvenței amplifica bile. Nu este absolut necesar să se includă și un marcher selectabil. Selecția se poate baza numai pe detectarea produsului genei de interes sau a mARN-urilor în mediu sau în celule după introducerea construcției ADN. în plus, în realizarea în care este introdusă o secvență regulatoare, amplificarea, dacă se dorește, nu este critică pentru realizare. Același lucru este valabil și pentru gena de selecție negativă care face procesul de alegere mai ușor, dar nu este neapărat necesara pentru realizarea invenției. Astfel, realizarea de bază impune numai introducerea segmentului regulator ADN sau a segmentului amplificării în poziția specifică dorită. Dar se preferă adăugarea de gene marcher selectabile pozitiv și/ sau negativ fiind utile în procedeul de selecție, precum și adăugarea unei gene amplificabile în realizarea în care se adaugă un segment regulator.

Termenul modificare a expresiei, așa cum este folosit în întreaga descriere și în revendicări, este definit aici ca excluzând terminarea expresiei prin introducerea prin recombinare omoloagă a mutației, a unei deleții, unui codon de oprire, sau a altor secvențe de nucleotidă, inclusiv a unei gene întregi, în gena de interes, așa ca să împiedice produsul de interes să fie exprimat în stadiul tehnicii se arată că utilizarea recombinării omoloage pentru introducerea de mutații specifice și expresia unui produs de celulă s-ar putea termina interent prin aceasta (vezi, de exemplu, Schwartzberg și alții, PNAS (SUA), 87:3210-3214, 1990). Prezenta invenție nu intenționează să cuprindă un asemenea procedeu. în prezenta invenție modificarea expresiei se face cu ajutorul introducerii regiunilor regulatoare și/sau de amplificare într-o poziție specifică dorită prin recombinarea omoloagă. Modificările preferate sunt cele care activează și/sau măresc expresia produsului de interes.

Când în prezenta descriere se folosește expresia că un segment regulator

ADN este legat operativ cu o genă, prin aceasta se înțelege că segmentul regulator ADN este dispus în așa fel față de gena de interes încât transcripția acestei gene să fie reglată de acel segment regulator ADN. Segmentul regulator este, de preferință, situat în partea superioară a genei, dar poate fi și în partea inferioară sau în interiorul ei, cu condiția să acționeze pentru a regla expresia genei într-un fel. Segmentul regulator ADN poate fi un promotor, unul de terminare, unul de acționare, intensificator, liniștitor, atenuator și altele, sau orice combinație a acestora.

Termenii în partea superioară și în partea inferioară din întreaga descriere și din revendicări înseamnă în direcția 5’ și respectiv în direcția 3’, în raport cu banda care codifică a genei de interes.

Claims (8)

1. Revendicări

   1. Construcție ADN, caracterizată prin aceea că, este compusă dintr-un segment regulator ADN, capabil să modifice expresia caracteristicilor unei gene într-o linie celulară gazdă când este legată operativ de aceasta, sau o genă exprimabilă amplificabilă capabilă să amplifice o genă într-o linie celulară gazdă, când este inserata în imediata apropiere a acesteia și un segment țintă ADN omolog la regiunea genomului genei selectate din linia celulară gazdă.
2. 2. Construcție ADN, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cuprinde cel puțin o genă marker expresibilă, selectabilă dispusă astfel, încât sa fie inserata împreună cu segmentul regulator sau cu gena amplificabilă exprimabilă.
3. 3. Construcție ADN, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cuprinde două segmente ADN țintă, fiecare omolog cu regiunea genomului din interiorul sau imediata vecinătate a genei de interes, unul din aceste segmente țintă fiind în partea superioară a segmentului regulator sau a genei exprimabile amplificabile, iar celălalt segment țintă fiind în partea inferioară a segmentelor regulatoare sau a genei exprimabile, amplificabile.
4. 4. Construcție ADN, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, mai cuprinde o genă marker selectabilă negativ așezată față de segmentul țintă al respectivei construcții ADN, în așa fel încât să nu fie inserată atunci când construcția ADN este inserată prin recombinare omoloagă, cum markerul selectabil negativ nu este exprimat în celulele în care construcția ADN exte complet inserată.
5. 5. Genom al unei linii celulare, caracterizat prin aceea că este transformat de construcția ADN descrisă în revendicările 1...4, segmentul ADN regulator sau gena exprimabilă amplificabilă transferată de numita construcție nefiind găsit în mod natural în genom.
6. 6. Linie celulara eucariotică animală sau vegetală, caracterizată prin aceea că ea conține un genom ca și cel descris în revendicarea 5, ceea ce îi conferă capacitatea de a exprima un produs al unei gene reticente, în mod normal, la transcripție sau de a modifica caracteristicile expresiei unei gene din genomul acelei linii celulare.
7. 7. Metodă de activare a expresiei unei gene reticente în mod normal la transcripție sau pentru modificarea caracteristicilor expresiei unei gene predeterminate din interiorul genomului unei linii celulare, caracterizată prin aceea că, în genomul liniei celulare este inserată prin recombinare omoloagă o construcție ADN, descrisă în revendicările 1...4 astfel, încât segmentul regulator să fie legat operativ la gena de interes sau gena amplificabilă în imediata vecinătate a genei de interes, pentru a produce amplificarea acesteia când gena amplificabilă este amplificată.
8. 8. Procedeu pentru obținerea produsului unei gene dintr-o linie celulara, caracterizat prin aceea că, se cultivă linia celulară eucariotică vegetală sau animală, descrisă în revendicarea 6, în condiții care permit exprimarea produsului aces tei gene și separarea produsului acestei gene.