FI107391B - Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi - Google Patents

Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI107391B
FI107391B FI922863A FI922863A FI107391B FI 107391 B FI107391 B FI 107391B FI 922863 A FI922863 A FI 922863A FI 922863 A FI922863 A FI 922863A FI 107391 B FI107391 B FI 107391B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
dna
genome
segment
cell line
Prior art date
Application number
FI922863A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI922863A0 (fi
FI922863A (fi
Inventor
Scott C Chappel
Original Assignee
Applied Research Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23806064&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI107391(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Applied Research Systems filed Critical Applied Research Systems
Publication of FI922863A0 publication Critical patent/FI922863A0/fi
Publication of FI922863A publication Critical patent/FI922863A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI107391B publication Critical patent/FI107391B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Description

107391
Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi Tämä keksintö koskee prosessia stabiilin solulinjan tai kloonatun mikro-organismin 5 genomissa luonnollisesti olevan geenin ekspression ominaispiirteiden modifioimiseksi. Edullisessa suoritusmuodossa tämä keksintö koskee menetelmää ja sellaisen geenin aktivoimiseksi ja ekspressoimiseksi, joka on stabiilissa solulinjassa ja normaalisti transkriptionaalisesti hiljainen tai inertti. Tuloksena ekspressoidaan geenin proteiinituotetta. Tämä ilmiö tapahtuu ilman solun transfektiota DNAilla, joka koo-10 daa tuotetta. Edullisesti, soluun kuuluva geeni, joka koodaa toivottua tuotetta, tunnistetaan solussa ja aktivoidaan insertoimalla sopiva säätelyelementti tekniikalla, jota kutsutaan homologiseksi rekombinaatioksi. Positiivisia ja/tai negatiivisia selek-toitavia markkereita voidaan myös insertoida auttamaan selektoimaan soluja, joissa on tapahtunut oikeat homologisen rekombinaation tapahtumat. Lisäsuoritusmuotona 15 voidaan spesifioitunut geeni amplifioida lisäämään ekspressionopeuksia, riippumatta siitä, onko tuo geeni normaalisti transkriptionaalisesti hiljainen ja onko se aktivoitu tämän keksinnön keinoilla vai ekspressoidaanko tuotetta endogeenisesti.
Tiedetään hyvin, että jokainen solu organismissa sisältää geneettistä tietoa, joka koodaa kaikki proteiinit, joita organismista löydetään. Kuitenkin vain hyvin pieni 20 prosenttiosuus geeneistä, joita on annetussa solutyypissä, transkriptoidaan todella.
Solunsisäinen mekanismi, joka säätelee transkriptoitavien geenien järjestystä, on nyt ·.·. ymmärretty. Soluspesifiset proteiinit, jotka ovat tumassa, ovat vuorovaikutuksessa • · * ^ DNA-segmenttien kanssa, jotka ovat liittyneet tiettyihin geeneihin. Tätä tumaan liit I" tyvien proteiinien vuorovaikutusta DNA-säätelysekvenssien kanssa vaaditaan geenin • · · 25 transkriptioon. Tämä johtaa mRNA:n biosynteesiin ja koodatun proteiinin lopulli- • · · *· seen ekspressioon (Mitchell ja Tjian, Science, 245:371, 1989).
• · · « · · • · .·:1· Nämä jokaisen geenin DNA-säätelysegmentit ja elementit ovat vastavirtaan ja jois- sakin tapauksissa koodausalueilla tai jopa myötävirtaan. Soluspesifisten tumaan liit- ..,.: tyvien proteiinien vuorovaikutuksen kautta DNA-säätelysegmentit vaikuttavat RNA- • · ... 30 polymeraasin, nopeutta rajoittava entsyymi proteiiniekspressiossa, kykyyn päästä ':' geenin runkoon ja syntetisoida mRNA-transkripti. Täten näillä DNA-segmenteillä ja V-j solun tumaan liittyvillä proteiineilla on kriittinen osuus spesifisten geenien ekspres- sion säätelyssä (Johnsonja McKnight, Ann. Rev. Biochem., 58:799, 1989).
· • · • · 2 107391 DNA:n säätelysegmentit ovat tumaan liittyvien proteiinien sitoutumiskohtia. Nämä tumaan liittyvät proteiinit kiinnittyvät DNA-heliksiin ja ilmeisesti muuttavat sen rakennetta tehden toivotun geenin saatavaksi RNA-polymeraasin tunnistettavaksi, mikä helpottaa geenin transkriptiota. Näiden soluspesifisten säätelyproteiinien eks-5 pressio määrää, mikä geeni transkriptoidaan solussa ja nopeuden, millä ekspressio tapahtuu. Esimerkkinä tämän systeemin spesifisyydestä, aivolisäkkeeseen liittyvät solut, mutta eivät maksasolut, ekspressoivat aivolisäkkeeseen liittyviä proteiineja, vaikkakin aivolisäkkeeseen liittyvien proteiinien geenejä on läsnä kaikissa maksasoluissa. Maksasolujen tumissa ei ole spesifisiä DNA:ta sitovia proteiineja, jotka ovat 10 vuorovaikutuksessa maksasoluissa vakinaisina olevien aivolisäkkeeseen liittyvien geenien kanssa.
Tiedettäessä, että spesifisiä DNA-säätelysekvenssejä vaaditaan aktivoimaan geeni-transkriptiota tietyssä solutyypissä, tiedemiehet ovat ekspressoineet vieraita geenejä tietyssä solutyypissä geneettisellä manipulaatiolla. Yleensä DNA-säätelyelemennt, 15 jotka solun tumaan liittyvät proteiinit tunnistavat, laitetaan vastavirtaan vieraan, ekspressoitavan geenin koodausalueesta. Tällä tavoin voidaan vierasta DNA.ta eks-pressoida soluun insertion jälkeen, koska solun tumaan liittyvät säätelyproteiinit tunnistavat nyt nämä DNA-säätelysekvenssit. Tätä teknologiaa on käytetty tuottamaan proteiineja, joita on ollut vaikea saada tai puhdistaa luonnonlähteistä perintei-20 sillä puhdistusstrategioilla.
Tunnistettavien DNA-sekvenssien ja kiinnostuksen kohteena olevan geenin lisäksi, kiinnitetään selektoitava markkeri DNA-rakenteeseen. Tällä tavoin vain solut, jotka : .· ovat ottaneet DNA:ta, säilyvät seuraavan kasvatuksen yli selektoitavassa alustassa.
«
Esimerkiksi neomysiiniresistenssigeeni voidaan liittää mukaan ekspressiovektoriin. :Y: 25 Transfektion jälkeen soluja kasvatetaan G418:ssa, neomysiiniantibiootti, joka on letaali nisäkässoluille. Jos solut kuitenkin ovat saaneet neomysiiniresistenssigeenin, ne kykenevät vastustamaan lääkkeen toksisia vaikutuksia. Tällä tavoin vain solut, • · jotka ovat ottaneet transfektoitua DNA:ta, säilyvät viljelmässä. On tehty se johtopäätös, että mitä tahansa selektoitavaa markkeria voitaisiin käyttää niin kauan kuin 30 se antaisi selektioon sellaisia soluja, jotka ovat ottaneet transfektoitua DNA:ta. Li- • o # t säksi on tehty johtopäätös, että ei ole mitään kriittisyyttä insertoidun geneettisen materiaalin sijoittumiselle soluun. On vain tärkeätä, että se otetaan sisään jossakin : _ ·.: tuman alueella, koska sekä säätelysegmentti että vieras geeni (samoin kuin selektoi- :"': tava markkeri) insertoidaan yhdessä.
3 107391
Koska edellä olleet tekniikat ovat olleet instrumentaalisia käyttäessään geneettisen manipuloinnin voimaa, ne eivät aina ole olleet tehokkaimmat menetelmät geenien ekspressioon. Tämä johtuu siitä tosiasiasta, että DNA:n insertio solulinjan tumaan suoritetaan tavallisesti tekniikalla, joka tunnetaan transfektiona. DNA, jota on käsi-5 telty ekspressoitumaan kiinnostuksen kohteena olevassa solulinjassa, säestetään ja solumembraani liuotetaan, jolloin sallitaan DNA:n sisääntulo. Kuten edellä osoitettiin, tarkkaa kohtaa, mihin DNA genomissa liittyy, ei koskaan voida ennustaa; todellakin, DNA voi jäädä episomaaliseksi (ei ole liittynyt genomiin). Tämä johtaa sekä tuotetun proteiinin ekspression tason että solulinjan stabiiliuden epävakaisuuteen.
10 Toinen tämän tekniikan puute on tosiasia, että ekspressiovektorin rakentaminen on äärettömän vaikeata, kun kiinnostuksen kohteena oleva geeni on suhteellisen suuri (suurempi kuin 5-10 kb). Monet rekombinantti-DNA-tekniikalla ekspressoidut proteiinit ovat cDNA:n koodaamia mieluummin kuin paljon suurempien genomisten kloonien. Tämä on tehty vähentämään insertin kokonaiskokoa. cDNA:n käyttäminen 15 tekee geneettisen manipuloinnin tarkoituksenmukaisemmaksi, geenitranskription ja proteiinin tuottonopeudet saattavat kärsiä sen seurauksena. Äskettäin on osoitettu, että ekspressiotasot ovat joskus suuresti kasvaneet genomisten, mieluummin kuin cDNA-inserttien, käytöllä (Brinster et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 85:836-840, 1988 ja Chuang ja Perry, Mol. Cell. Biol., 9:2075-2082, 1989). Vaikka mekanismeja, jot-20 ka ovat vastuussa tästä havainnosta, ei ymmärretä hyvin, tiedetään, että joissakin tilanteissa vahvistajaelementit, joita on introneissa, voivat parantaa geenin transkrip-tionaalista tehokkuutta. On myös todistettu, että introneilla tai pilkkomistapahtumil-•. ·. la, jotka johtuvat intronien läsnäolosta, saattaa olla vaikutus RNA-prosessointitapah- ’. tumiin, jotka seuraavat transkription aloitusta (Buchman ja Berg, Mol. Cell. Biol., ***; 25 8:4395-4405, 1988). Tämä saattaa stabiloida transkriptin parantaen mRNA-akkumu- • · · *·'·* laation nopeutta. Edellä viitatussa Brinster et al.-julkaisussa on myös oletettu, että • · · '· “ intronien asema geenissä saattaa olla tärkeä nukleosomien tahdistamisessa suhteessa • · promoottoriin. Khoury et ai, Cell, 33:313-14 (1983), Maniatis et ai, Science, ·,· : 236:1237-45 (1987) ja Muller et ai, Eur. J. Biochem., 176:485-95 (1988) ovat kes- 30 kustelleet erilaisten säätelyelementtien vaikutuksesta eukaryoottisten geenien trans-kriptioon.
Kolmanneksi, jotta saadaan sisäänpääsy tumaan, transfektoidun DNA:n, vieraan geenin koko koodausalue mukaan luettuna, täytyy läpäistä sytoplasma, kun on tulta : ’ “: sisään solun läpäisevän plasmamembraanin kautta. Tänä aikana DNA saattaa joulua . 35 kosketuksiin lysosomaalisten entsyymien kanssa, jotka voivat muuttaa tai täydelli- • aa 107391 4 sesti tuhota DNA:n kokonaisuuden. Täten DNA:n koodausalue ei ehkä ole identtinen transfektoidun kanssa.
Uusi geeniaktivaation ja/tai -ekspression menetelmä, jota jäljempänä kuvaamme, ei voi johtaa toivotun proteiinin mutanttimuotojen tuottoon, koska toivotun geenin 5 koodausaluetta ei ole altistettu entsymaattisille modifikaatioille.
Lyhyesti sanottuna suurta määrää soluun perinteisiä tekniikoita käyttäen transfektoi-tua DNA:ta, ja erityisesti sen koodausaluetta, ei transkriptoida tarkasti. Se voidaan hajottaa ennen tumaan menoa, häiritä entsymaattisesti niin, että se ei koodaa koko toivottua proteiinia tai siinä ei ehkä ole tarpeellisia säätelysegmenttejä transkription 10 sallimiseksi. Se saatetaan insertoida genomin siihen osaa, joka estää transkription. Jos DNA transkriptoidaan, kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia ei ehkä tuoteta tehokkaasti johtuen intronien, joissa saattaa olla vahvistajat tai tekevät mahdolliseksi tehokkaan mRNA.n prosessoinnin, poisjättämisestä. Lopuksi, se voi jäädä episo-maaliseksi, edistää proteiinituottoa, mutta olla epästabiili, kun solupopulaatio kasvaa 15 solujakautumisen kautta.
Toivottavampaa olisi kehittää menetelmä sellaisen geeniekspression indusoimiseksi, joka tuottaisi solulinjan, joka on liittänyt olemassa olevien menetelmien positiiviset ominaisuudet, mutta jotenkin kiertää ei-toivotut piirteet. Olisi vielä toivottavaa kyetä ekspressoimaan tai modifioimaan valitun solutyypin tiettyjen geenien endogeenistä 20 ekspressiota. Lisäksi on toivottavaa kyetä hyötymään mahdollisista eduista, joita antaa täydellinen genominen sekvenssi, johon voi kuulua piilossa olevat transkrip-. 1 ·': tionaaliset vahvistajat, joita introneissa saattaa olla, asettamalla intronit sopivasti oi- : keata nukleosomitahdistusta varten tai tehokkaammilla mRNA-prosessointitapahtu- millä. Nämä edut eivät yleensä ole miellyttäviä rekombinantti-DNA ekspression?e- • · : 25 netelmissä johtuen geenin koosta. Jos kyettäisiin ekspressoimaan geeniä, joka jo on .·. | genomissa, so. endogeenistä geeniä, solulinjastabiilius ja ekspressionopeudet tulisi- * ·« !.. 1 vat yhdenmukaisemmiksi ja ennustettavammiksi.
Sen mukaisesti tämän keksinnön tarkoitus on eliminoida edellä erikseen mainitut •: ♦ ♦: puutteet tekniikan tasossa.
; 30 Tämän keksinnön toinen tarkoitus on saada geeniekspression säätely- ja/tai amplifi- kaatiomenetelmä, joka tuo mukanaan rekombinanttigeeniteknologian positiiviset ominaisuudet, mutta kiertää ei-toivotut piirteet.
• · · 107391 5 Tämän keksinnön tarkoitus on vielä saada menetelmä spesifisten geenien ekspres-soimiseksi, joita geenejä on läsnä mutta jotka normaalisti ovat transkriptionaalisesti hiljaisia valitussa solulinjassa.
Tämän keksinnön lisätarkoitus on saada menetelmä proteiinien ekspressoimiseksi, 5 jotka proteiinit hyötyvät täysin täydellisistä genomisista sekvensseistä, jotka ovat vastuussa mRNA-akkumulaatiosta ja/tai transkriptiosta.
Tämän keksinnön vielä eräs tarkoitus on saada menetelmä kiinnostuksen kohteena olevan geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi insertoimalla DNA-sää-telysegmentit ja/tai amplifiointisegmentit stabiilin solulinjan tai kloonatun mikro-10 organismin genomiin kiinnostuksen kohteena olevaan natiiviin geeniin, vastavirtaan siitä tai muuten sen läheisyyteen.
Tämän keksinnön vielä eräs tarkoitus on saada aikaan menetelmä stabiilissa solulinjassa tai kloonatussa mikro-organismissa luonnollisesti läsnäolevan geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi ja samalla sellaisten ominaispiirteiden inser-15 toimiseksi, jotka auttavat solujen, jotka ovat kunnolla modifioituneet, selektiossa.
Tämän keksinnön vielä eräs tarkoitus on saada aikaan genomi, jossa on kiinnostuksen kohteena olevan geenin eksonien tai koodausalueen läheisyydessä säätely- tai amplifiointisegmentti, jota ei luonnollisesti siellä ole.
Tämän keksinnön vielä eräs tarkoitus on saada DNA-rakenteita, joita voidaan käyt-20 tää luomaan tämän keksinnön homologisia rekombinanttimenetelmiä.
» · • 4 : Vielä tämän keksinnön tarkoitus on saada aikaan solulinjat ja mikro-organismit, • · · . *.·. joissa on tämän keksinnön mukaiset genomit.
• · • · • · · *· *· Nämä ja muut tämän keksinnön tarkoitukset pannaan täytäntöön homologisen Γεν·: kombinaation tekniikan keinoin, jolloin ammattimies voi aiheuttaa läsnäolevien • · · : 25 vaikkakin transkriptionaalisesti hiljaisten geenien ekspression ja edullisesti amplifi- kaation. Tällä tekniikalla voidaan myös modifioida luonnostaan läsnäolevan geenin, ·:··: mutta ei välttämättä hiljaisen tai inertin, ekspressio-ominaispiirteitä, stabiilin solu· ’; linjan genomissa, kuten esimerkiksi tekemään ekspressio konditionaaliseksi, so. rep- . , ressoituvaksi tai indusoituvaksi tai vahvistamaan ekspression nopeutta.
V ’: 30 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
« · · • « • · 6 107391 Tällä keksinnöllä saadaan menetelmä solulinjan tai mikro-organismin genomissa olevan geenin ekspressio-ominaisuuksien modifioimiseksi. Genomiin insertoidaan DNA-rakenne homologisen rekombinaation tekniikalla. Rakenteeseen kuuluu DNA-säätelysegmentti, joka kykenee modifioimaan minkä tahansa geenin, joka on opera-5 tiivisesti liittynyt isäntäsolulinjaan tai mikro-organismiin, ekspressio-ominaispiirtei-tä, samoin kuin kohdennetun segmentin, joka on homologinen genomialueen kanssa, mihin DNA-säätelysegmentti toivotaan insertoitavan. Rakenne ja insertiotekniikka on suunniteltu aiheuttamaan uuden DNA-säätelysegmentin liittymisen operatiivisesti kiinnostuksen kohteena olevaan geeniin. Täten ilman että välttämättä insertoi-10 daan yhtään uusia koodauseksoneita, tuon geenin ekspressio-ominaispiirteet on modifioitu. Edullisessa suoritusmuodossa geeni on se, joka on normaalisti transkrip-tionaalisesti hiljainen tai inertti isäntäsolulinjassa tai mikro-organismissa ja DNA-säätelyalueen avulla, joka on kohdistettu suoraan sopivaan asemaan suhteessa tuohon geeniin homologisen rekombinaation keinoin, aktivoidaan geeni täten sen geeni-15 tuotteen ekspressioon.
DNA-rakenteessa on edullisesti kaksi kohdennettua segmenttiä, jotka samalla kun ne ovat genomiin insertoitavien elementtien toisistaan erottamina rakenteessa, ovat edullisesti natiivin geenin vieressä.
Rakenteessa on vielä edullisesti vähintään yksi ekspressoitava selektoitava markke-20 rigeeni, kuten neomysiiniresistenssin antava geeni. Tämä markkerigeeni, jossa un promoottori sitä varten, on myös järjestetty rakenteen kahden kohdennetun alueen väliin.
• ♦ : Eräässä toisessa suoritusmuodossa rakenteessa on ekspressoituva amplifioituva geeni, jotta kiinnostuksen kohteena oleva geeni voidaan amplifioida. Tämä geeni, ♦ « : 25 jossa on sitä varten promoottori, on myös asetettu rakenteen kahden kohdennetun : alueen väliin. Joissakin tapauksissa selektoitava markkeri ja amplifioitava markkeri « ·« I.. ° voivat olla samat.
• · · • 1 » Tämän keksinnön lisäsuoritusmuodossa DNA-rakenteessa on negatiivinen selektoi-*:··: tava markkerigeeni, jota ei ekspressoida soluissa, joissa DNA-rakenne on oikein in- 30 sertoitu. Tämä negatiivinen selektoitava markkerigeeni on asetettu kahden kohdis-. ’ . tusalueen ulkopuolelle niin, että se poistetaan, kun rakenne liitetään geeniin oikein homologisella rekombinaatiolla. Esimerkki sellaisesta negatiivisestä selektoitavasta * · ·· ·' markkerigeenistä on Herpes Simplex -viruksen tymidiinikinaasigeeni.
• · • » ♦ 7 107391
Vielä eräässä suoritusmuodossa on mahdollista modifioida sellaisen spesifisen geenin ekspressio-ominaispiirteitä, joka jo ekspressoi tuotetta kiinnostuksen kohteena olevassa solulinjassa tai mikro-organismissa. Tämä voidaan panna täytäntöön inser-toimalla homologisella rekombinaatiolla DNA-rakenne, jossa on (1) ekspressoituva, 5 amplifioitava geeni, joka lisää kiinnostuksen kohteena olevan geenin kopiolukua, kun solulinja tai mikro-organismi altistetaan amplifikaatio-olosuhteisiin ja/tai (2) promoottori/vahvistajaelementti (tai muu säätelyelementti), joka modifioi kiinnostuksen kohteena olevan geenin ekspressiota, kuten esimerkiksi lisäämällä transkription nopeutta, lisäämällä translaatiotehokkuutta, lisäämällä mRNA-akkumulaatiota, 10 tekemällä ekspressio indusoitavaksi, jne. Geeniekspressio, jota modifioidaan tällä tavalla, saattaa olla luonnollista ekspressiota tai ekspressiota, jonka on aiheuttanut aiempi solulinjan tai mikro-organismin geneettinen manipulaatio. Aiempi geneettinen manipulaatio on saatettu tehdä tavanomaisin tekniikoin tai homologisen rekom-binaation keinoin tämän keksinnön mukaisesti. Jälkimmäisessä tapauksessa DNA-15 insertio, joka johtaa ekspressio-ominaispiirteiden modifikaatioon, voidaan suorittaa osana samaa geneettistä manipulaatiota, joka johtaa geenin ekspressioon tai voidaan suorittaa sen jälkeisenä vaiheena.
Tähän keksintöön kuuluvat myös rakenteet, joita on valmistettu edellä esitetyn mukaisesti, samoin kuin genomit, jotka on altistettu oikein homologiselle rekombinaa-20 tiolle sellaisten rakenteiden ja solulinjojen ja mikro-organismien avulla, joissa on näitä genomeja.
Lisäksi mukaan on liitetty myös menetelmä halutun tuotteen valmistamiseksi kasvat- • ·' tamalla transformoituja soluja tämän keksinnön mukaisesti.
• 1 ♦ ♦ · ·
Kuvio 1 osoittaa yleisen luonnoksen DNA-rakenteesta tämän keksinnön mukai- : 25 sesti.
• · · « · * ♦
Kuvio 2A esittää tavan DNA-rakenteen integraatiosta genomiin ei-homologisen tai » · · V : satunnaisen rekombinaation tapahtumassa.
..... Kuvio 2B esittää tavan DNA-rakenteen integraatiosta genomiin homologisen re- • · kombinaation tapahtumassa.
. , 30 Kuvio 3 esittää edullisen homologisen rekombinaatiovektorin rakenteen tämän . - ·. keksinnön mukaisesti.
· • · • · „ 107391
Kuvio 4 esittää tavan sirkulaarisen DNA-osan integraatiosta homologisella rs* kombinaatiolla, kun käytetään vain yksittäistä kohdennettua DNA:n palaa.
Kuvio 5 esittää pRSVCAT-plasmidin, sen restriktiokohdat mukaan luettuina.
5 Kuvio 6 esittää pRSV-plasmidin rakenteen, sen restriktiokohdat mukaan luettuina.
Kuvio 7 esittää pRSV2NEO-plasmidin, sen restriktiokohdat mukaan luettuina.
Kuvio 8 esittää pPSVNEOBAM-plasmidin rakenteen, sen restriktiokohdat mukaan luettuina.
Kuvio 9 esittää pRSVNEO-plasmidin rakenteen, sen restriktiokohdat mukaan luet-10 tuina.
Kuvio 10 esittää pRSVCATNEO-plasmidin rakenteen, sen restriktiokohdat mukaan luettuina.
Kuvio 11 esittää 15,3 kb rotan TSHp-geenin fragmentin ja osoittaen sen erilaisia restriktiosegmenttejä.
15 Kuvio 12 esittää pRSVCATNEOTSHB3-plasmidin rakenteen, sen restriktiokohdat mukaan luettuina.
Kuvio 13 esittää pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI-plasmidin rakenteen, sen restrik-. * ·': tiokohdat mukaan luettuina.
Kuvio 14 esittää TSHp-nukleotidisekvenssin osan yhdessä niiden alueiden kanssa,
» « I
*; ’ · * 20 joita PCR-amplifikaation jokainen aluke vastaa. Eksonit 2 ja 3 on osoitet- • ♦ · _ *· *· tu isoilla kirjaimilla. 247 BP amplifioitu fragmentti nähdään alleviiva- ·*/·: tuilla tähdillä.
• · e • » · • _
Kuvio 15 esittää cDNA:n, joka on syntetisoitu erilaisista solupopulaatioista uute-tusta RNA:sta ja jonka TSHp cDNA, jos läsnä, on amplifioitu PCR:llä 25 polyakryyliamidigeelielektroforeesitulokset. Solujen, jotka edustavat eri ·;' linjoja, luonne on esitetty kuviossa 15 geelin alapuolella.
. · · ·. Homologinen rekombinaatio on tekniikka, joka on kehitetty viime vuosina kohden- ’ ·' netuille geeneille indusoimaan tai korjaamaan mutaatioita transkriptionaalisesti ak- :. ·: tiivisissa geeneissä (Kucherpalati, Prog, in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36:301 • « 9 107391 (1989)). Tämä homologisen rekombinaation tekniikka kehitettiin menetelmäksi spesifisten mutaatioiden tuomiseksi nisäkäsgenomin spesifisille alueille (Thomas et ai., Cell, 44:419-428, 1986; Thomas ja Capecchi, Cell, 51:503-512, 1987; Doetschman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 85:8583-8587, 1988) tai kolaamaan spesifisiä mutaa-5 tioita viallisissa geeneissä (Doetschman et ai., Nature, 330:576-578, 1987).
Homologista rekombinaatiota on käytetty myös DNA-ffagmenttien integroimiseen E. colin. kromosomiin (Raibaud et ai., Gene 29:231-241, 1984).
Tällä tekniikalla DNA-pala, jonka toivotaan insertoituvan genomiin, voidaan ohjata kiinnostuksen kohteena olevan geenin spesifiselle alueelle liittämällä se "DNA.han, 10 jonka avulla kohdennetaan". "DNA, jonka avulla kohdennetaan" on DNA, joka on komplementaarinen (homologinen) genomisen DNA:n alueen kanssa. Jos kaksi yksi-juosteisen DNA:n homologista palaa (so. DNA, jonka avulla kohdennetaan ja geno-minen DNA) ovat tiiviissä läheisyydessä, ne hybridisoituvat muodostamaan kaksi-juosteisen heliksin. Liittyneenä DNA:han, jonka avulla kohdennetaan, on DNA-sek-15 venssi, jonka toivotaan insertoituvan genomiin.
On lukuisia menetelmiä, joilla homologinen rekombinaatio voi tapahtua. Yksi esimerkki on DNA-replikaatioprosessin aikana mitoosissa soluissa.
Mekanismissa, jota ei täydellisti ymmärretä, aukeaa kaksoisjuosteinen emä-DNA välittömästi ennen solujakautumista paikallisella alueella, jota kutsutaan replikaatio-20 pallukaksi. DNA:n kaksi erillistä juostetta eivät voi toimia mallina, josta uudet .. ·. DNA-juosteet syntetisoidaan. Replikaatiohaarukan yhdellä käsivarrella on koodi 5' - * 3-suuntaan, joka on sopiva suunta, josta DNA-polymeraasientsyymi voi "lukea".
”** Tämä entsyymi tarttuu yksijuosteisen DNA:n 5-osaan ja käyttämällä juostetta mal- • · · *;*·* Iina, alkaa syntetisoida komplementaarista DNA-juostetta. Toinen emä DNA-juoste :.**i 25 koodataan 3' - 5'-suuntaan. DNA-polymeraasi ei voi lukea sitä tähän suuntaan. Tä- • · :: män DNA-juosteen replikoitumiseksi täytyy tapahtua spesifisen mekanismin.
• · » • · · • « ·
Spesialisoitunut entsyymi, RNA-primaasi, liittää itsensä DNA:n 3' - 5'-juosteeseen ja syntetisoi lyhyen RNA-alukkeen aika ajoin pitkin juostetta. Käyttämällä näitä RNA-segmenttejä alukkeina, kiinnittyy DNA-polymeraasi nyt mallina olleeseen •; · * 30 DNA:han ja syntetisoi komplementaarisen DNA-palan 5' - 3'-suuntaan. Näitä uudes- :/.j taan syntetisoituja DNA-paloja kutsutaan Okazaki-fragmenteiksi. DNA-polymeraa- sin eksonukleaasitoiminta poistaa RNA-alukkeet, jotka ohvat vastuussa koko reakti-.' ; on aloittamisesta ja korvaa sen DNA:lla. Tämä ilmiö jatkuu, kunnes polymeraasi saavuttaa ei-aloitetun alueen DNA:ta, jossa paikallinen synteettinen prosessi lop- • · »· · 10 107391 puu. Täten, vaikka komplementaarista emäjuostetta syntetisoidaan kaikkialla 3' - 5'-suuntaan, sitä tuotetaan todellisuudessa 5' - 3'-suuntaan "jälkipistoin". Mitkä tahansa raot, joita saattaa esiintyä DNAissa "jälkipisto"-prosessin aikana, suljetaan DNA-ligaasi nimisellä entsyymillä.
5 Jotta ylläpidetään DNA-koodin absoluuttinen tarkkuus, on DNA-polymeraasissa koelukutoiminta. DNA-polymeraasi vaatii mallina olleita DNA-paloja, joihon syntetisoidaan uusi DNA-juoste. Kuten edellä mainittiin, tämä voi olla yksijuosteinen DNA, jossa on ollut mallina RNA tai komplemetaarinen DNA-juoste. Kun DNA-polymeraasi löytää väärin yhdistettyjä komplementaarisia DNA-paloja, se voi toimia 10 kuten eksonukleaasi ja poistaa DNA-emäksiä 3' - 5'-suuntaan, kunnes se saavuttaa jälleen täydellisen yhteensopivuuden.
Täten on nyt mahdollista ymmärtää tässä kuvatun tekniikan perusta. Pieniä paloja DNAita, joiden avulla kohdennetaan ja jotka ovat komplementaarisia genomin spesifisen alueen kanssa, saatetaan kosketuksiin emäjuosteen kanssa DNA-replikaatio-15 prosessin aikana. Se on DNA:n, joka on insertoitu soluun hybridisoitumaan ja siksi rekombinoitumaan muiden DNA-palojen kanssa yhteisten homologisten alueiden kautta, yleinen ominaisuus. Jos tämä komplementaarinen juoste liitetään oligonuk-leotidiin, jossa on mutaatio tai erilainen DNA-sekvenssi, se liitetään myös vasta syntetisoituun juosteeseen rekombinaation tuloksena. Koelukutoiminnan seuraukse-20 na on uuden DNA-sekvenssin mahdollista toimia mallina. Täten transfektoitu DNA liitetään genomiin.
.1 2 3·1: Jos tietyn geenin sekvenssi tunnetaan, pala DNA:ta, joka on komplementaarinen : geenin valitun alueen kanssa, voidaan syntetisoida tai saadaan muuten, kuten sopi-
• M
valla natiivin DNA:n restriktiolla sopivissa tunnistuskohdissa, jotka rajaavat kiinnos- • · _ : 25 tuksen kohteena olevaa aluetta. Tämä pala toimii välineenä, jonka avulla kohdenne- I « · taan, soluun insertion jälkeen ja hybridisoituu sen homologiseen alueeseen genomis- • · · 2 !..1 sa. Jos tämä hybridisaatio tapahtuu DNA-replikaation aikana, tämä DNA-pala ja 3 1 mikä tahansa lisäsekvenssi, joka on liittynyt siihen, toimii Okazaki-fragmenttina ja takapistoitetaan vasta syntetisoituun DNA:n tytärjuosteeseen.
• · ' ; 30 Tämän keksinnön tekniikassa näihin DNA-paloihin, joiden avulla kohdennetaan, on , kiinnittyneenä DNA-alueita, joiden tiedetään olevan vuorovaikutuksessa solussa ; '' läsnäolevien tuman säätelyproteiinien kanssa ja vaihtoehtoisesti, amplifioituvia ja selektoitavia DNA-markkereita. Täten spesifisten proteiinien ekspressio voidaan saavuttaa, ei transfektoimalla DNA:ta, joka koodaa geeniä itseään ja markkeri-35 DNA:ta, kuten on yleisintä, vaan mieluummin käyttämällä DNA:ta, jonka avulla u 107391 kohdennetaan (homologiset alueet kiinnostuksen kohteena olevan endogeenisen geenin kanssa) kytkettynä DNA:n säätelysegmenttien kanssa, joista saadaan geenille tunnistettavat signaalit transkriptiota varten. Tällä tekniikalla on mahdollista eks-pressoida ja amplifioida mikä tahansa solutyypissä läsnäoleva samaa alkuperää ole-5 va geeni ilman että todellisesti transfektoidaan geeniä. Lisäksi tämän geenin ekspressiota kontrolloi koko genominen DNA mieluummin kuin geenin tai cDNA:n osat, täten parantaen transkription nopeutta ja mRNA-prosessoinnin nopeutta. Lisäksi solutyypissä läsnäolevan minkä tahansa samaa alkuperää olevan geenin eks-pressio-ominaispiirteitä voidaan modifioida sopivalla DNA-säätelysegmenttien in-10 sertiolla ja siirtämättä kiinnostuksen kohteena olevan geenin koko koodausaluetta.
Tämän keksinnön näiden näkökohtien mukaisesti on saatu uusia menetelmiä eks-pressoimaan kiinnostuksen kohteena olevia, normaalisti transkriptionaalisesti hiljaisia geenejä tai modifioimaan kiinnostuksen kohteena olevien endogeenisesti eks-pressoituvien geenien ekspressiota erilaistuneessa solulinjassa. Samaa alkuperää 15 olevat genomiset sekvenssit, joiden toivotaan ekspressoituvan tai joiden ekspressiota toivotaan modifioitavan, antavat tarpeelliset soluspesifiset DNA-sekvenssit (säätely ja/tai amplifikaatiosegmentit) ohjaamaan tai modifioimaan geenin ekspressiota solussa. Saadussa DNArssa on DNA-sekvenssi, joka koodaa toivottua proteiinia, joka on suoraan liittynyt operatiivisella tavalla heterologisiin (samaa alkuperää oleva 20 DNA-sekvenssi) säätely- ja/tai amplifikaatiosegmentteihin. Positiivinen selektoitava markkeri kuuluu vaihtoehtoisesti rakenteeseen helpottamaan tuloksena olevien solujen seulomista. Neomysiiniresistenssin geenin käyttö on edullista, vaikka mitä ta- ·,·. hansa selektoitavaa markkeria voidaan käyttää. Negatiivisesti selektoitavia markke- • · [ t’t reita voidaan vaihtoehtoisesti myös käyttää. Esimerkiksi Herpes Simplex Virus-ty- < i « ' ΓΙ 25 midiini kinaasi (HSVtk) -geeniä voidaan käyttää markkerina selektoimaan satunnai- *l\ sesti integroitunutta vektori-DNA:ta. Fuusioituneet DNA:t tai olemassa olevat eks- « · · pressoivat DNA:t voidaan amplifioida, jos kohdistus-DNA liitetään amplifioitavaan ’.'i mark-keriin.
M1 • · · • · ·
Siksi tämän keksinnön menetelmän mukaisesti mikä tahansa geeni, jota ekspressoi-30 daan normaalisti, kun se on läsnä sen spesifisessä eukaryoottisessa solulinjassa, eri- • ♦ (- tyisesti erilaistunut solulinja, voidaan pakottaa ekspressoitumaan solulinjassa, joka '; ei ole spesifinen sille, missä geeni on hiljaisessa muodossa. Tämä tapahtuu ilman, \ ‘ · i että todella insertoidaan koko DNA-sekvenssiä tälle geenille. Lisäksi tuota geeniä, tai normaalisti ekspressoituvaa geeniä, voidaan amplifioida kohonneisiin ekspressi-.·1. : 35 onopeuksiin. Lisäksi geenien, jotka eivät ole täydellisesti transkriptionaalisesti hil- t · · « # · • · 12 107391 jäisiä, ekspressio-ominaispiirteitä voidaan modifioida samoin kuin mikro-organismeissa olevien geenien ekspressio-ominaispiirteitä.
Eräässä tämän keksinnön suoritusmuodossa eukaryoottiset solut, joissa on, mutta jotka eivät normaalisti transkriptoi spesifistä kiinnostuksen kohteena olevaa geeniä, 5 indusoidaan tekemään niin tässä kuvatulla menetelmällä. Homologinen rekombi-naatiovektori, joka on kuvattu jäljempänä, insertoidaan kloonattuun solulinjaan kemiallisen selektion jälkeen, tarkkaillaan spesifisen geenituotteen tuottoa millä tahansa sopivalla keinolla, kuten esimerkiksi havaitsemalla mRNA.ta, joka on transkrip-toitu vasta aktivoidusta geenistä, spesifisen geenituotteen immunologisella havait-10 semisella tai spesifisen geenituotteen toiminnallisella määrityksellä.
DNA-rakenteen, jota käytetään transkriptionaalisesti aktivoimaan endogeenisiä geenejä homologisella rekombinaatiolla, yleinen luonnos kuvataan kuviossa 1.
DNA-rakenteessa on yleensä vähintään kaksi ja kuuteen asti tai enemmän erillisiä DNA-segmenttejä. Segmentit koostuvat vähintään yhdestä, edullisesti kahdesta 15 DNA-segmentistä, joiden avulla kohdennetaan (Aja B), jotka ovat homologisia so-lugenomin alueelle, joka on geenin läheisyydessä, jota toivotaan ekspressoitavan, positiivisesta selektiogeenistä (C), amplifioitavasta geenistä (D), negatiivisesta se-lektiogeenistä (E) ja DNA-säätelysegmentistä (F), joka on transkriptionaalisesti aktiivinen transfektoitavassa solussa. Tämän keksinnön useimmissa perassuoritusmuo-20 doissa täytyy vain yksittäisen segmentin, jonka avulla kohdennetaan (B) ja säätely-segmentin (F) olla läsnä. Kaikki muut alueet ovat valinnaisia ja tuottavat edullisia rakenteita.
• * · rt Alueet A ja B ovat DNA-sekvenssejä, jotka ovat homologisia kiinnostuksen kohtee- * · · *·*·] na olevan endogeenisen geenin, joka on tarkoitus tehdä transkriptionaalisesti aktiivi- • o · *· *· 25 seksi, alueille. Endogeenisen geenin spesifiset alueet A ja B selektoidaan siten, että V·: ne ovat vastavirtaan ja myötävirtaan, vastaavasti, spesifisestä kohdasta, johon sääte- • * · · lysegmentti toivotaan insertoitavan. Vaikka nämä alueet ovat erotetut rakenteessa, ne ovat edullisesti viereisiä endogeenisessä geenissä. Saattaa olla tapauksia, joissa ·:··: genomin ei-viereisiä osia käytetään segmentteinä, joiden avulla kohdennetaan, esi- . ' ; 30 merkiksi milloin toivotaan genomista deletoitavan osa, kuten negatiivinen säätely- .· . elementti.
« « « « · ·
Koska kaksi kohdistusaluetta, A ja B, ovat edullisia, jotta lisätään homologian ko-; konaisalueita ja täten lisätään rekombinaatiotehokkuutta, niin tämän keksinnön me- netelmä käsittää myös vain yksittäisen kohdistusalueen käytön. Yksinkertaisimmas- 13 107391 sa muodossa (kun vain säätelysegmentti F ja selektoitava markkerigeeni C ja promoottori C on tarkoitus insertoida) käytetään sirkulaarista DNA-palaa, jossa on näitä elementtejä yhdessä DNA:n kanssa, jonka avulla kohdennetaan (ks. kuvio 4). Tällä tavoin homologinen alue (B) hybridisoituu sen genomisen kaksoiskappaleen 5 kanssa. Segmentit C, C ja F insertoidaan samaa alkuperää olevan geenin B-osaan geenien crossing over -tapahtuman jälkeen.
Kun DNA-säätelysekvenssin toivotaan insertoituvan vastavirtaan kiinnostuksen kohteena olevassa geenissä, kuten esimerkiksi kun halutaan aktivoida ja ekspressoi-da normaalisti transkriptionaalisesti hiljaista geeniä, homologia-alue on edullisesti 10 homologinen kiinnostuksen kohteena olevan geenin genomin ei-koodaavan osan kanssa, joka on vastavirtaan koodausalueen osista. Kun alueet, joiden avulla kohdistetaan, ovat läsnä, voi myötävirran alueessa (A) olla osa koodausaluetta, vaikka on edullista että se myös on täydellisesti vastavirtaan koodausalueesta. Lisäksi on edullista, että homologiset alueet valitaan siten, että DNA-säätelysekvenssi insertoi-15 daan myötävirtaan kiinnostuksen kohteena olevan geenin natiivista promoottorista, erityisesti jos natiivi promoottori on negatiivinen promoottori mieluummin kuin poispäältä oleva positiivinen promoottori.
Alueiden, joiden avulla kohdennetetaan, koko, so. homologia-alueet, ei ole kriittinen, vaikka mitä lyhyemmät alueet sitä vähemmän todennäköistä, että ne löytävät 20 sopivia homologia-alueita ja rekombinoituvat toivotussa kohtaa. Täten, mitä lyhyemmät homologia-alueet ovat, sitä tehottomampaa on homologinen rekombinaatio, so. onnistuneesti rekombinoitujen kloonien pienempi prosenttiosuus. On ehdotettu, : että minimivaatimukset sekvenssihomologialle on 25 emäsparia (Ayares et ai, PNAS, USA, 83:5199-5203, 1986). Lisäksi jos rakenteen mitä muita elementtejä ta-:V: 25 hansa löydetään myös isäntäsolun genomista, on mahdollisuus rekombinaatiosca väärässä kohtaa. Kuitenkin ottaen huomioon tämän keksinnön erinomainen positii- • · vinen ja negatiivinen selektoituvuus sitä voidaan panna täytäntöön onnistuneesti, • · vaikkakin tehokkuus on alhainen. Optimaaliset tulokset saavutetaan, kun koko homologia-alue, molemmat alueet, joiden avulla kohdennetaan, mukaan luettuina, on ; 30 suuri, esimerkiksi 1-3 kb. Niin kauan kuin säädeltävä segmentti F voidaan operatii- * * visesti liittää kiinnostuksen kohteena olevaan geeniin, alueen, jonka avulla kohden netaan, koolla ei ole rajoitusta ja erityisesti vastavirtaan alueesta B, jonka avulla kohdennetaan.
I (
I I I
« I
':' Voidaan helposti määrittää empiirisesti, ovatko alueet, joiden avulla kohdennetaan, t 1 35 liian suuria vai ei tai onko säädeltävä segmentti F sijoitettu liian kauaksi geenin, jo- « « 4 • « * « « I » 14 107391 ka on tarkoitus operatiivisesti liittää siihen, koodausalueesta. Sellaisessa tapauksessa alueet A ja B voidaan tehdä homologisiksi kiinnostuksen kohteena olevan geenin erilaisen sektion kanssa ja prosessia toistetaan kunnes säädeltävä segmentti F on oikein insertoitu siten, että se on operatiivisesti liittynyt kiinnostuksen kohteena ole-5 vaan geeniin. Esimerkiksi endogeenisen geenin yhdistyneen alueen A-B restrik-tiokohta voidaan muuttaa ja prosessi toistetaan. Kun tämän keksinnön käsite kerran tunnetaan, ammattimies yhdessä tässä esitettyjen tekniikkojen kanssa pystyisi tekemään ja käyttämään tätä keksintöä minkä tahansa annetun kiinnostuksen kohteena olevan geenin suhteen missä tahansa solulinjassa tai mikro-organismissa ilman, että 10 käytetään kohtuutonta kokeilua.
Alue C on positiivinen selektoitava markkerigeeni, joka kykenee antamaan transfek-toidulle solulinjalle resistenssin normaalisti toksista ympäristöä vastaan. Esimerkkejä sellaisista geeneistä ovat adenosiinideaminaasi (ADA), aminoglykosidifosfotrans-feraasi (neo), dihydrofolaattireduktaasi (DHFR), hygromysiini-B-fosfotransferaasi 15 (HPH), tymidiinikinaasi (tk), ksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasi (gpt), moninkertaisen lääkeresistenssiyden geeni (MDR), omitiinidekarboksylaasi (ODC) ja N-(fosfonasetyyli)-L-aspartaattiresistenssi (CAD).
Positiivisen selektoitavan markkerigeenin lisäksi amplifioitava geeni on myös valinnaisesti alueen D rakenteessa. Amplifioitavat geenit ovat geenejä, jotka johtavat 20 kopioluvun kasvuun, kun ovat selektiivisen paineen alaisina. Geenin, joka sijaitsee amplifioitavan geenin vieressä, kopioluku kasvaa myös. Amplifioitaviin geeneihin, joita voidaan käyttää, kuuluvat DHFR, MDR, ODC, ADA ja CAD. Positiivisesti : selektoitavan markkerigeeniiyhmän ja amplifioitavan geeniryhmän jäsenet menevät niin päällekkäin, että teoriassa, sen sijaan että käytetään kahta geeniä, yhtä positiivi- • * i.s.J 25 seen selektioon ja yhtä amplifikaatioon, yhtä geeniä voitaisiin käyttää molempiin tarkoituksiin. Kuitenkin koska useimmissa solulinjoissa on endogeenisiä kopioita näistä amplifioituvista geeneistä, ovat solut jo jonkin verran resistenssejä selektio-• · . .*: *. olosuhteille ja solujen erottaminen niistä, joissa on transfektoitunutta DNA:ta ja jot ka eivät ota vastaan transfektoitua DNA:ta, voi olla vaikeata. Täten tapauksissa, 30 joissa amplifioitavaa geeniä toivotaan, positiivinen selektiogeeni, joka on dominoi - s e __ va, kuten HPH, gpt, neo ja tk (tk-soluissa), pitäisi myös liittää rakenteeseen. Joillekin sovellutuksille voi olla mahdollista tai edullista jättää amplifioitava markkeri pois. Esimerkiksi kiinnostuksen kohteena olevaa geeniä ei ehkä tarvitse amplifioida, kuten esimerkiksi kun transkriptionaalinen aktivaatio heterologisella DNA-säätely-/ . 35 sekvenssillä on riittävä ilman amplifikaatiota. Myös jos homologisen rekombinaati- ...* on tehokkuus on hyvin alhainen, saattaa olla tarpeellista jättää amplifikaatiogeeni 9 ♦ • · >»» 15 107391 pois, koska ei-homologisen DNA:n suhde homologiseen DNA:han on suoraan suhteessa homologisen rekombinaation tehokkuuteen (Letsou, Genetics, 117:759-770, 1987). On myös mahdollista eliminoida positiivinen selektiogeeni ja selektoida solut pelkästään seulomalla halutun proteiinin tai mRNA:n tuottoa. On kuitenkin edullista 5 useimmissa tapauksissa liittää mukaan vähintään yksi positiivinen selektiogeeni.
Rakenteen E-alue on negatiivinen selektoitava markkerigeeni. Sellaista geeniä ei ekspressoida soluissa, joissa DNA-rakenne on oikein insertoitu homologisella rekombinaatiolla, mutta ekspressoidaan soluissa, joissa DNA-rakenne insertoidaan virheellisesti, kuten satunnaisella integraatiolla. Eräs sellainen geeni on Herpes 10 Simplex -viruksen tymidiinikinaasigeeni (HSVtk). HSVtk:n tiukka vaatimus nukleotideille on alentunut ja kykenee fosforyloimaan nukleotidianalogeja, joita normaalit nisäkässolut eivät kykene fosforyloimaan. Jos HSVtk on läsnä soluissa, nukleotidi-analogit, kuten asyklovir ja gansyklovir fosfoiyloidaan ja liitetään isäntäsolun DNA:han täten tappamalla solu. Negatiivisen selektoitavan markkerigeenin läsnäolo 15 tekee mahdolliseksi käyttää positiivista-negatiivista selektiota homologiseen re-kombinaatioon, kuten Mansour et ai (Nature, 336:348-352, 1988) ovat kuvanneet. Capecchi käyttää strategiaa, jossa hyödynnetään integraation eroavia käytäntöjä, mikä tapahtuu kun linearisoitu vektori-DNA insertoituu homologisella rekombinaa-tiolla verrattuna kun se integroituu satunnaisella integraatiolla. Jos vektori-DNA in-20 sertoituu satunnaisesti, pääosa inserteistä insertoituu päiden kautta (Folger et ai, Mol. Cell. Biol., 2:1372-1387, 1982; Roth et ai, Mol. Cell. Biol., 5:2599-2607; 1985; ja Thomas et ai, Cell, 44:419-428, 1986). Toisaalta, jos vektori insertoituu homologisella rekombinaatiolla, se rekombinoituu homologia-alueiden kautta, mikä /.'; aiheuttaa noiden alueiden ulkopuolella olevien sekvenssien menettämisen.
• · • · · 25 Käyttämällä kuviossa 1 kuvattua rakennetta esimerkkinä, homologisen rekombinaa- :.v tion integraatio versus satunnaisen integraation tapa on kuvattu kuvioissa 2A ja 2B.
• ·
Ei-homologisen rekombinaation tapauksessa (kuvio 2A) vektori insertoidaan raken- :**.· teen päiden kautta. Tämä sallii alueen E, tässä tapauksessa HSVtk-geenin, insertoi- :T: tuvan genomiin. Kuitenkin kun homologinen rekombinaatio tapahtuu (kuvio 2B), 30 HSVtk-geeni menetetään. Ensimmäinen selektiokierros käyttää sopivaa lääkettä tai .. . · olosuhteita positiiviseen selektioon, joka on rakenteessa. Solut, joissa DNA on in- , · · \ tegroitunut joko homologisella rekombinaatiolla tai satunnaisella rekombinaatiolla, ' ·' selviävät tästä selektiokierroksesta. Selvinneet solut altistetaan sitten lääkkeelle, ku- « » \ * i ten gansyklovir, joka tappaa kaikki solut, joissa on HSVtk-geeni. Tässä tapauksessa 14 1 :35 useimmat solut, joissa vektori insertoitui satunnaisella insertiolla, sisältävät HSVtk-« : geenin ja lääke tappaa ne, kun taas ne, joissa vektori insertoitui homologisella re • « • · # • · • * · 16 107391 kombinaatiolla, ovat menettäneet HSVtk-geenin ja selviävät. Tämä sallii useimpien solujen, joissa on satunnaisesti integroitunut DNA, eliminoimisen, jättäen pääosan selvinneistä soluista, joissa on homologisella rekombinaatiolla integroitunut DNA. Tämä helpottaa suuresti oikean rekombinaatiotapahtuman tunnistamista.
5 Negatiivinen selektiovaihe voidaan myös eliminoida, jos tarpeellista. Se vaatii, että seulontavaihe on työintensiivisempää sisältäen tekniikat kuten polymeraasiketjureaktio (PCR) tai immunologinen seulonta.
Kuudes alue (F) sisältää DNA-säätelysegmentin, jota käytetään tekemään kiinnostuksen kohteena oleva geeni transkriptionaalisesti aktiiviseksi. Sopiva DNA-sääteJy-10 segmentti valitaan riippuen käytettävästä solutyypistä. Säätelysegmentti, jota edullisesti käytetään, on sellainen, jonka tiedetään edistävän annetun geenin ekspressiota erilaistuneessa isäntäsolulinjassa. Esimerkiksi jos isäntäsolulinja koostuu aivolisäkkeeseen liittyvistä soluista, jotka ekspressoivat luonnollisesti proteiineja, kuten kasvuhormonia ja prolaktiinia, jommankumman geenin promoottoria voidaan käyttää 15 DNA-säätelyelementtinä F. Kun on insertoitu tämän keksinnön mukaisesti, säätely-segmentti liitetään operatiivisesti normaalisti transkriptionaalisesti hiljaiseen kiinnostuksen kohteena olevaan geeniin ja stimuloi tuon geenin transkriptiota ja/tai ekspressiota isäntäsolulinjassa. Käyttökelpoisia ovat myös sekalaiset DNA-säätelyseg-mentit, jotka työskentelevät ristiin solutyypeissä, kuten Rousin sarkoomaviruksen 20 (RSV) promoottori. Niin kauan kuin säätelysegmentti stimuloi kiinnostuksen kohteena olevan geenin transkriptiota ja/tai ekspressiota tai se voidaan indusoida stimuloimaan transkriptiota ja/tai ekspressiota sen jälkeen, kun se on insertoitu isäntäso-. . lulinjaan niin, että se on operatiivisesti liitetty tämän keksinnön keinoin kiinnostuko : ; sen kohteena olevaan geeniin, sitä voidaan käyttää tässä keksinnössä. On tärkeätä, • · · ‘·:·* 25 kun liitetään säätelysegmentti F kohdistussegmenttiin A, että aloituskodonia ei va- '·*. hingossa viedä sekvenssiin, koska sellainen tapahtuma voisi muuttaa geenin, jonka • · :.*·· toivotaan ekspressoituvan, lukuraamia. Tietenkin rakenne täytyy tehdä ja insertoida • · :/·: siten, että säätelysegmentti F on operatiivisesti liittynyt kiinnostuksen kohteena ole- :T: vaan geeniin.
. 30 DNA-säätelysegmentin, alue F, ei tarvitse olla läsnä tapauksissa, missä toivotaan li- ‘, sättävän tai amplifioitavan geenin, joka jo ekspressoituu kiinnostuksen kohteena ole- • · ·' vassa solulinjassa, transkriptiota, joko koska se ekspressoituu luonnollisesti tuossa solulinjassa tai koska solulinjan DNA.ta on manipuloitu aikaisemmin aiheuttamaan : * “: sellaista ekspressiota. Sellaisissa tapauksissa amplifioitavan geenin, alue D, insertio, .· . 35 edullisesti positiivisesti selektoitavan markkerigeenin kanssa, alue C, ja vaihtoeh- « · • · · • « „ 107391 toisesti myös negatiivisesti selektoitavan markkerigeenin, alue E, kanssa, on riittävä nostamaan kiinnostuksen kohteena olevan geenin kopiolukua ja täten lisäämään transkription kokonaismäärää. Vaihtoehtoisesti uusi säätelysegmentti, alue F, syn-nynnäisesti edistäen kasvanutta (tai muuten modifioitua) transkriptionopeutta verrat-5 tuna olemassa olevaan kiinnostuksen kohteen geenin säätelyalueeseen, voidaan liittää mukaan, jotta vielä lisätään olemassa olevan ekspressoivan, kiinnostuksen kohteena olevan geenin transkriptiota. Sellaisessa uudessa säätelysegmentissä voisi olla promoottorit tai vahvistajat, jotka parantavat transkriptiotehokkuutta.
Alueet C, D' ja E' ovat promoottorialueita, joita käytetään ekspressoimaan geenejä 10 alueille C, D ja E, vastaavasti. Nämä promoottorit ovat transkriptionaalisesti aktiivisia valitussa solulinjassa ja voivat olla samoja tai erilaisia kuin alueen F promoottori, jota käytetään ekspressoitaessa kiinnostuksen kohteena olevaa endogeenistä geeniä. Kuviossa 1 yksityiskohtaisesti kuvattu transkription spesifinen suunta ei ole kriittinen. Ammattimiehet voivat määrittää minkä tahansa sopivan sijoituksen gt'; · 15 neille C, D ja E ja niiden promoottoreille C, D' ja E', niin että promoottorit stimuloivat niihin liittyneiden geenien ekspressiota ilman, että samanaikaisesti saatetaan millään tavoin kiinnostuksen kohteena olevan geenin tai minkään muun toisen koostumuksessa olevan geenin ekpsressiota sekaisin.
Tätä keksintöä voidaan kuvata viittaamalla rotan tyrotropiini-beta alayksikön akti-20 vaatioon (TSHP) GHr (ATCC CCL 82), GH3- (ATCC CCL 82,1) tai GlLCl-solu-linjoissa (GH). GH-solulinjat on johdettu säteilytyksellä indusoidusta aivolisäkkeen kasvaimesta rotissa, joita merkitään MtT/W5 (Takemoto, Cancer Res., 22:917, . . 1962) ja on sopeutettu kasvamaan Tashjian et ai, Endocrinology, 82:342-352, 1968, : viljelmissä. Nämä solulinjat voidaan alakloonata ja niiden kykyä tuottaa kasvuhor- ’···1 25 monia ja TSHp:aa seulotaan. Sellaista seulomista tehdään edullisesti Northern blot- analyysillä, jotta määritetään, onko rotan kasvuhormonigeenin mRNA:ta läsnä ja • · arvioimaan, ettei TSHP-geeniä varten ole tuotettu mRNA:ta. Solulinjat voidaan :**. j seuloa myös Southern analyysillä, jotta määritetään, että ainakin yksi kopio TSKp·· :T: geeniä on läsnä genomissa. Vain GH-solulinjoja, jotka tuottavat kasvuhormonia 30 mutta eivät TSHp:tä, mutta sisältävät TSHp-geenin kopion, käytetään.
Spesifinen homologinen rekombinaatiovektori käytettäväksi GH-soluissa voidaan suunnitella seuraavalla tavalla (kuvio 3). Alue A voi koostua TSHp-geenin ei-trans- loidusta alueesta 5' vastavirtaan, joka on Hindlll-fragmentin rajaama ulottuen -74 - . ; -2785 ja alueessa B voi olla DNA-fragmentti, joka ylettyy -2785 Hindlll-kohdasta .· , 35 Ncol-kohtaan noin 2,1 kb vielä vastavirtaan, kuten Carr et ai (J. Biol. Chem., • « « « ,g 107391 262:981-987, 1987) ja Croyle et ai (DNA, 5:299-304, 1986) kuvasivat. Positiivinen selektiogeeni (alue C) voi olla 1067 bp Bglll-Smal-fragmentti, joka on johdettu pSV2neo-plasmidista (ATCC nr. 37 149) (Southern et ai, J. Mol. Appi. Gen., 1:327-341, 1982). Rousin sarkoomaviruksen (RSV) promoottori (alue C) voi ekspressoitia 5 neogeeniä NdelHindlll-fragmentista plasmidilta pRSVcat (ATCC nr. 37152) (Gorman et ai, PNAS, 79:6777-6781, 1982). Tässä esimerkissä ei tarvitse käyttää amplifioitavaa markkeria ja täten ei tarvita aluetta D, jotta optimoitaisiin homologisen rekombinaation tehokkuus. Tehokkuus on kääntäen verrannollinen rakenteessa olevien ei-homologisten sekvenssien osuus homologisiin (Letsou et ai, Genetics, 10 117:759-779, 1987). Alue E, tai negatiivisen selektion geeni, voi koostua HSVtk- geenistä, joka on 2 kb Xho-fragmentti, joka on saatu plasmidista pMCITK-plasmidi (Capecchi et ai, Nature, 336:348-352, 1988). Tässä rakenteessa olevaa HSVtk-geeniä voi polyoomaviruspromoottori ja -vahvistaja (alue E') kuljettaa, kuten Thomas et ai (Cell, 51:503-512, 1987) ovat rakentaneet. Toisessa DNA-rakenteessa 15 polyoomapromoottori voidaan korvata RSV-promoottorilla, kuten edellä on kuvattu. DNA-säätelysekvenssi, jota käytettiin aktivoimaan TSHp-geeniä, voi olla joko RSV-promoottori tai rotan kasvuhormonipromoottori. Rotan kasvuhormonipromoot-tori koostuu SacI-EcoRI-fragmentista, joka saatiin plasmidista pRGH237CAT (Larson et ai, PNAS, 83:8283-8287, 1986). RSV-promoottorilla on etuna, että siiri 20 voidaan käyttää muissa solulinjoissa, paitsi GH-soluissa, koska GH-proottorin tiedetään olevan aktiivinen GH-soluissa ja voidaan spesifisesti indusoida (Brent et ai, J. Biol. Chem., 264:178-182, 1989). Rotan kasvuhormonipromoottori ja RSV-pro-moottori voidaan insertoida F-alueeseen erillisissä rakenteissa.
•. · . Edellä olleen rakenteen transfektion jälkeen GH-solulinjaan soluja voidaan kasvat- 25 taa alustoissa, joissa on G418:aa. Tämä sallii vain niiden solujen, joissa plasmidi- • · » l[’.' DNA on integroitunut genomiin joko homologisella rekombinaatiolla tai satunnai- sella integraatiolla, kasvamisen. Selvinneet solut voidaan kasvattaa alustoissa, joissa • · e ’· on gansykloviriä. Pääosa soluista, jotka selviävät tästä selektiokierrosta, ovat ne, *· ’« joissa vektoriplasmidi-DNA on integroitunut homologisella rekombinaatiolla. Näitä 30 soluja voidaan seuloa, jotta osoitetaan, että ne tuottavat mRNA.ta, joka vastaa TSHp-geeniä ja että ne tuottavat TSHP-proteiinia. Genominen DNA voidaan myös ‘: r sekvensoida heterologisen promoottorin insertioalueen ympäriltä, jotta varmistetaan, ‘: että tapahtui oikea rekombinaatiotapahtuma.
* » · • · · • t • * ♦ • · · • · * 1 · • « 19 107391
Esimerkki TSHp-geenin aktivaatio rotan aivolisäkkeen soluissa Käyttämällä seuraavaa protokollaa, tyrotropiini-beta-alayksikkö (TSHP) -geenin transkriptio, jota ei normaalisti tapahdu rotan GH3-aivolisäkesolulinjassa, aktivoitiin 5 niissä soluissa käyttämällä homologisen rekombinaation prosessia kohdistamaan aktivoivan elementin TSHp-koodausalueesta vastavirtaan. Rousin sarkoomaviruksen (RSV) promoottorin tiedetään toimivan tehokkaasti GH3-soluissa (Christian Nelson et ai, Nature, 322:557-562 (1986); Zheng-Sheng Ye et ai, The Journal of Biological Chemistry, 263:7821-7829 (1988)) ja valittiin siksi aktivoivaksi elementiksi. Raken-10 nettiin plasmidivektori, jossa oli RSV aktivoiva elementti, TSHp-geenilokuksen 5' reunustavan alueen osat ja selektoitava lääkemarkkeri, aminoglykosidifosfotransfe-raasigeeni (NEO), transfektoitujen solupopulaatioiden eristämiseksi. Ribonukleiini-happo (RNA) uutettiin kerätyistä lääkeresistensseistä GH3-solupopulaatioista ja muutettiin komplementaariseksi deoksiribonukleiinihapoksi (cDNA). Sitten 15 cDNA:sta seulottiin TSHP cDNA:n läsnäolo polymeraasiketjureaktiotekniikalla (PCR). Homologisen rekombinaatiovektoreiden ja kontrollivektoreiden rakenne on luonnosteltu yhdessä kokeellisten menetelmien ja tulosten kanssa.
Plasmidin rakentaminen
Homologisen rekombinaation (HR) runkovektori (pRSVCATNEO).
20 Rousin sarkoomavirus (RSV) -promoottori johdettiin pRSVCAT-plasmidistä (Cornelia M. Gorman et ai., Proceedings of the National Academy of Science, 79:6777-6781 (1982)) (kuvio 5) eristämällä 580 emäsparin (bp) Ndel-Hindlll-frag- ♦ · : V mentti, jossa on toiminnallinen promoottoriyksikkö. Tämän fragmentin päät tehtiin tylpiksi käyttämällä polymeraasi I Klenow -fragmenttia ja Xbal-linkkerit ligoitiin 25 tylppiin päihin. Sen jälkeen, kun oli pilkottu Xbal-restriktioendonukleaasilla ja • ♦ puhdistettu geelissä, ligoitiin saatu fragmentti pUC18:n Xbal-kohtaan. Bakteeripe- • · : säkettä, jossa oli plasmidi, jonka RSV-insertti oli kuvion 6 osoittamassa suunnassa, .·;·* merkittiin pRSV. Aminoglykosidifosfotransferaasigeeni (NEO) kloonattiin pSV2NEO:sta (PJ. Southern et ai., Journal of Molecular and Applied Genetics, 30 1:327-341 (1982)) eristämällä Bglll- ja BamHI-fragmentti (kuvio 7) ja ligoimalla tuo fragmentti pRSV:n BamHI-kohtaan (kuvio 6). Plasmidi, jossa oli NEO-geeni kuvion 8 osoittamassa suunnassa, poimittiin ja merkittiin pRSVNEOBAM. pRSVNEOBAM pilkottiin SmaLllä ja 4328 bp fragmentti, jossa oli RSV-promoot-;···; torialue, pääosa NEO-geenistä ja pUC18, eristettiin geelielektroforeesilla. Tämän .· . 35 fragmentin Smal-päät olivat Xhol-linkkeroidut, pilkottiin XhoI-restriktioentsyymiHä » » • · 20 107391 ja plasmidi tehtiin uudestaan sirkulaaiiseksi ligaatiolla. Saatu plasmidi nähdään kuviossa 9 ja sitä kutsutaan pRSVNEO:ksi. Tämä viimeinen kloonausvaihe johti 786 bp fragmentin deleetioon NEO-fragmentin 3-päästä, mikä ei ole tarpeellinen sen toiminnalliselle ekspressiolle. Tämä rakenne tuottaa plasmidin, jossa NEO-geeniä 5 ohjaa transkriptionaalisesti RSV-promoottori.
Seuraavaksi Ndel-kohta, joka sijaitsee pRSVCATm RSV-promoottorin 5':ssa (kuvio 5), muutettiin Sali-kohdaksi. Tämä saatiin aikaiseksi pilkkomalla pRSVCAT NdeLllä, täyttämällä päät käyttämällä DNA-polymeraasi I Klenow -fragmenttia ja ligoimalla Sall-linkkerit saatuihin tylppiin päihin. Linkkerit pilkottiin täydelhsesti 10 Sällillä ja plasmidi tehtiin uudestaan sirkulaaiiseksi ligaatiolla. Uudelleen rakennettuun Sal-kohtaan kloonattiin Sall-XhoI-fragmentti pRSVNEOilta (kuvio 9), jossa oli RSV-promoottori ja NEO-geeni. Plasmidi, jossa oli RSV-promoottori ja NEO-fragmentti suuntautunut kuten kuviossa 10 nähdään, eristettiin ja nimettiin pRSVCATNEOiksi. Tämä plasmidi kykeni siirrettynä GH3-soluihin antamaan 15 G418-resistenssin niille soluille, jotka osoittivat RSV-promoottorin kykyä ohjata NEO-geenin transkriptiota ja tuon RNA:n kykyä transloitua toiminnalliseksi proteiiniksi (tiedot eivät näy). Kokonais-RNA edellä olleista stabiileista transfektanteista analysoitiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR), jotta määritetään, oliko CAT-geeni transkriptoitu. PCR-tulokset osoittivat, että CAT-geeni oli todella transkriptoitu 20 kaikissa testatuissa G418-resistenteissä pesäkkeissä (tiedot eivät näy), osoittaen, että CAT-geenin RSV-promoottori 5' kykeni ohjaamaan geenin, joka oh sijoitettu 3':een siihen nähden, transkriptiota. Tämä on tärkeätä, koska tämä RSV-promoottori on vastuussa TSHp-geenin transkription ohjaamisesta, kun jäljempänä kuvattu TSHp ·.·. HR -vektori integroituu homologisella rekombinaatiolla GH3-genomiin.
25 TSHB-vektori • « • · · • · « • · .*. J Vektori, joka kykeni integroitumaan GH3-genomiin homologisella rekombinaatiolla • · : luotiin insertoimalla kaksi tyrotropiini-beta alayksikkö (TSHP) -geenin 5' reunusta- ."·;·* van alueen pätkää ainutlaatuisiin Sali- ja Hindlll-kohtiin, jotka olivat pRSVCAT- NEOilla (kuvio 10). Rotan pernan genominen kirjasto, jossa oli 15 kiloemäksen (kb) 30 tai suuremmat insertit kloonattuna lambda DAS H: iin, saatiin Strategenestä, San Diego, CA. Käyttämällä standardiprotokollia (Current Protocols in Molecular Bio-logy, ss. 1.9.1-1.13.6, 6.1.1-6.4.10) eristettiin 15,3 kb klooni rotan genomista ,: TSHp-geeniä, jossa oli 9 kb sekvenssi 5' ensimmäisestä eksonista. 15,3 kb fragment- . ‘ . ti koostui kahdesta Xbal-fragmentista, 10,6 kb-fragmentti vastasi 15,3 kb-fragmentin 35 5'-päätä ja 4,7 kb pala vastasi 15,3-fragmentin 3'-aluetta (kuvio 11). Molemmat 2i 107391 näistä Xbal-fragmenteista alakloonattiin pUC18:aan ja plasmidit, joissa oli insertit molempiin suuntiin, eristettiin. 2,3 kb Xbal - Hindin-fragmentti, joka oli 4,7 kb Xbal-fragmentissa, puhdistettiin ja tämän fragmentin Xbal-kohta muutettiin Hindlll-kohdaksi täyttämällä päät Klenowin fragmentilla ja ligoimalla Hindin-linkkereihin. 5 Tämä fragmentti ligoitiin ainutlaatuiseen HindlH-kohtaan, joka oli pRSVCAT-NEOissa (kuvio 10). Eristeelle, joka vastasi plasmidia, jossa oli 2,3 kb insertti oikeassa suunnassa, kuten kuviossa 12 nähdään, annettiin nimi pRSVCAT-NEOTSHB3.
Alakloonattu 10,6 kb Xbal-fragmentti rotan TSHp-kloonista (kuvio 11) eristettiin ja 10 Xbal-päät muutettiin Sali-kohdiksi tekemällä fragmentti tylppäpäiseksi DNA-polymeraasi I Klenow-fragmentilla ja kiinnittämällä Sall-linkkerit. Sitten tämä 10,6 kb Sali-fragmentti kloonattiin pRSVCATNEOTSHB3:n Sali-kohtaan (kuvio 12). Plasmidi, jossa oli insertti oikeassa suunnassa, tunnistettiin ja nimettiin pRSVCAT-NEOTSHB3-5XbaI:ksi (kuvio 13). Jälkimmäinen plasmidi on tallennettu American 15 Type Culture Collection:iin, Rockville, MD ja sille on annettu talletusnumero ATCC 40933. Tätä talletusta varten plasmidille annettiin uusi nimi pHRTSH. Tänä talletus tehtiin Budapestin sopimuksen kaikkien vaatimusten mukaisesti.
Solulinja GH3-solut ovat mtT/W5:n alakloonattu populaatio, jotka saatiin säteilytyksen in-20 dusoimasta aivolisäkkeen kasvaimesta rotissa (B.K. Takemoto, Cancer Research, 22:917 (1962)) ja sovellettiin kasvamaan Tashjian et ai., viljelmässä, Endocrinology, 82:342-352 (1968). GH3-solut saatiin American Type Culture Collection solu-: pankista ja niitä pidetään viljelmässä kasvattamalla Dulbecco's Modified Eagle's : : -alustalla (DMEM) + 15 % hevosen seerumia (HS) + 2,5 % naudan sikiön seerumia 25 (FBS) + 1 % L-glutamiinia (GH3-alustat) 37 °C:ssa 5 % CC^ssa.
• · • · · *1 DNA:n valmistus • · · '· Plasmidi-DNA:n valmistus suuressa mittakaavassa • · · • · · • · «
Kaikki plasmidit, joita käytettiin stabiileihin transfektioihin, puhdistettiin käyttämä! · .;' lä alkalista suuren mittakaavan lyysaus-menetelmää plasmidi-DNA:n puhdistusta . , 30 varten, kuten on kuvattu teoksessa Current Protocols in Molecular Biology, voi. 1, ss. 1.7.1-1.7.2. DNA:ta, joka eristettiin alkalisella lyysausmenetelmällä, puhdistet-tiin lisää kaksoisjuovilla kesiumkloridigradientissa, kuten myös on kuvattu teoksessa • · « :... '· Current Protocols in Molecular Biology, voi. 1, s. 1.7.5-1.7.7.
• « • « « • « • · • · 22 107391
Ennen transfektiota HR-vektorit pilkottiin joko AatHilla tai Apal:llä. Apalitä käytettiin linearisoimaan kontrolliplasmidi pRSVCATNEO ja AatII:ta linearisoimaan HR-plasmidi pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI. Apal- ja Aatll-pilkkomiskohtien sijainti voidaan nähdä kuvioissa 10 ja 13, vastaavasti. Sen jälkeen, kun oli pilkottu 5 sopivalla restriktioentsyymillä, reaktio uutettiin fenoli/kloroformilla, uutettiin kloroformilla, saostettiin etanolilla ja pestiin kerran 70-prosenttisella etanolilla. Sitten plasmidit suspendoitiin uudestaan steriiliin, deionisoituun veteen (dH20) 1 mikro-gramma/mikrolitra (pg/μΐ) konsentraatioksi, kuten määritettiin absorbanssilla OD26o. Yrityksenä lisätä transfektiotehokkuutta ja/tai homologiselle rekombinaatiolle posi-10 tiivisten suhdetta niihin, jotka johtuivat satunnaisesta integraatiosta, pRSVCAT-NEOTSHB3-5XbaI pilkottiin Apalillä. Pilkkominen Apalillä leikkaa kolmesta erillisestä kohdasta pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI:llä ja poistaa vektorin kaikki alueet, paitsi niitä, jotka ovat tarpeellisia homologiselle rekombinaatiolle (kuvio 13). Sen jälkeen, kun on pilkottu Apalillä, reaktiolle tehtiin elektroforeesi 0,8-prosenttisessa 15 agaroosigeelissä ja ylimmäinen juova, joka vastasi 10,992 bp fragmenttia, jossa oli kaksi TSHp-geenin 5' reunustavaa aluetta, RSV-promoottori - NEO-alue ja TSHP-geenin aktivoiva RSV-promoottori, eristettiin geelistä elektroeluaatiolla dialyysiput-kiin. Elektroeluoitua DNAita puhdistettiin lisää käyttämällä elutip minipylvästä (Schleicher ja Schuell) valmistajan suosittamalla standardiprotokollalla. DNA eluoi-20 tiin pylväästä, saostettiin etanolilla, pestiin 70-prosenttisella etanolilla ja suspendoitiin uudestaan 1 pg/μΐ konsentraatioksi.
Stabiilit transfektiot Kalsiumfosfaattitransfektio : 48 h ennen transfektiota 3 x 106 GH3-solua maljattiin 10 senttimetrin (cm) maljoille.
• 1 o 25 Jokaista maljaa varten lisättiin 10 μg vekton-DNAita yhdessä 30 μg kanssa sonikoi- *.·.· tua lohen spermaa 0,5 millilitraan (ml) transfektiopuskuria. Transfektiopuskuri val- niistettiin yhdistämällä 4 g NaClia, 0,185 g KClia, 0,05 g Na2HP04:a, 0,5 g dekst-
roosia, 2,5 g HEPESiä ja dH20, niin että lopputilavuus oli 500 ml ja saattamalla pH
7,5:ksi. 31 μΐ 2 molaarista (M) CaCl2:a lisättiin 0,5 ml:aan DNAita + transfektio- 30 puskuri ja sekoitettiin vorteksilla. Tämän liuoksen annettiin seistä huoneenlämpöti- ....: lassa 45 min. Kun DNA - CaCl2-transfektiopuskuri oli valmis, poistettiin GH3-alusta . · · ·. GH3-soluista ja DNA - CaCl2-transfektiopuskuri kerrostettiin solujen päälle. Solujen • - annettiin seistä huoneenlämpötilassa 20 min. 20 min kuluttua lisättiin 5 ml GH3- • · :: alustaa ja maljoja inkuboitiin 37 °C:ssa 6 h. Sitten soluille annettiin shokki imemällä • ·» 35 alusta pois ja lisäämällä 5 ml tuoretta transfektiopuskuria, jossa oli 15 % glyserolia, .·! : 3,5 min. Solut huuhdeltiin 2 x PBSillä ja niille annettiin 10 ml GH3-alustaa. 48 h * «· t · · k · 23 107391 transfektion jälkeen alusta poistettiin ja lisättiin 10 ml GH3-alustaa, jossa oli 400 pg/ml G418.
Elektroporaatio
Elektroporaatio suoritettiin käyttämällä BTX 300 transfektoria 3,5 millimetrin (mm) m 5 aukkoelektrodeja. 1 x 10 GH3-soluja, jotka kasvoivat log-faasissa, poistettiin maljoiltaan trypsinoimalla, pelletoitiin sentrifiigoimalla ja pestiin kerran PBSillä. Solut suspendoitiin uudestaan 1,0 ml:aan PBS:ää ja siirrettiin 2,9 ml Ultra-UV kertakäyt-tökyvetteihin (American Scientific Products) jäissä. Soluihin lisättiin 10 pg DNAna, sekoitettiin ja laitettiin takaisin jäihin 5 min. 5 min kuluttua elektrodit laitettiin kam-10 mioon ja solut elektroporattiin asettamalla 750 mikrofaradia 200 V pulssilla. Sitten kyvetti laitettiin takaisin jäihin, 10 min. Solut siirrettiin kyvetistä 9 ml:aan GH3-alustaa, jossa oli 1 % penisilliiniä ja 1 % streptomysiiniä huoneenlämpötilassa 15 ml a kartiomaiseen putkeen ja annettiin seistä 10 min. 1 x 10 solun koko elektroporaatio siirrettiin kolmeen 10 cm maljaan antaen keskimäärin 3 x 106 solua/malja. 48 h ku-15 luttua lisättiin GH3-alustaa, jossa oli 400 pg/ml G418:aa.
GH3-solujen transfektio pRSVCATNEOTSHB3-5Xbal:llä (AatH:lla pilkottu), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI:llä (Apalillä pilkottu) ja pRSVCATNEQ:lla (Apal.lla pilkottu) pRSVCATNEOTSHB3-5Xbal- (Aatllilla pilkottu), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI-20 (Apalillä pilkottu) ja pRSVCATNEO- (Apalilla pilkottu) plasmidit transfektoitiin GH3-soluihin ilman DNA-kontrollia käyttämällä sekä kalsiumfosfaattiprotokollaa et-·.·. tä elektroporaatioprotokollaa. 48 h transfektion jälkeen solut laitettiin G418 * .·. selektioon. Keskimäärin 14-21 d myöhemmin pesäkkeet tulivat silmillä nähtäviksi • ♦ ·
Vy 10 emin maljoilla ja laskettiin. Missään ei-DNA-kontrollia ei ollut havaittavia pe- 25 säkkeitä, osoittaen G418-selektion toimivan ja plasmidin, jossa oli RSV-NEO-alue, « · · ** *; läsnäolon olevan tarpeellinen antamaan G418-resistenssin. Tässä kohtaa pesäkkeet " poimittiin, kerättiin eristämällä alueita, joissa oli 17 mm:n laajuiset kloonausrenkaat, : 10 emin maljoilla. Nämä laajat kloonausrenkaat sisälsivät 10-70 pesäkettä riippuen pesäkkeiden tiheydestä/malja ja sallivat GH3-solujen poistamisen tuosta eristetystä 30 alueesta ja keräyksen samanaikaisesti trypsinaatiolla. Trypsinoidut pesäkkeet jokaisessa renkaassa siirrettiin 6 kaivon maljaan ja annettiin kasvaa GH3-alustoissa, joissa oli G418:aa. Kun oli saavutettu 70-80 %:n konfluenssi, siirrettiin 80 000 solua 24 kaivon maljalle ja jäljelle jääneet solut kryosäilöttiin myöhempiä testauksia varten. Soluja kasvatettiin 24 kaivon maljoilla, kunnes ne saavuttivat 50-80 %:n konfluens-35 sin. Kokonais-RNA kerättiin näistä GH3-soluista seuraavalla menetelmällä.
i t - * « · 24 107391 RNA:n eristäminen transfektoiduista GH3-soluista, joita oli kasvatettu 24 kaivon maljoilla
Seuraava on modifikaatio Chomczynski ja Sacchi kuvaamasta protokollasta, Anal. Biochem., 162:156-159 (1987). Alusta, joka peitti GH3-solut 24 kaivon maljoilla, 5 poistettiin ja solut pestiin 1 ml:lla PBS:ää. 1 ml GTC-liuosta lisättiin ja soluja inhi boitiin huoneenlämpötilassa 5 min. GTC-liuos valmistettiin liuottamalla 250 g gua-nidiumtiosyaanaattia (Fluka) 293 ml:aan dH20:een ja lisäämällä sitten 17,6 ml 0,75 M Na-sitraattia pH 7,0 ja 26,4 ml 10 % sarkosyyli-(L-lauryylisarkosiinia). Juuri ennen käyttöä lisättiin 360 μΐ P-merkaptoetanolia/50 ml GTC-liuosta. 1 ml 10 GTC-solulysaattia siirrettiin 5 min jälkeen huoneenlämpötilassa Sarstedt 55.518 -putkeen, jossa oli katkaistava pää, sisältäen 2 ml GTC-liuosta. Jokaiseen putkeen lisättiin 300 μΐ 2 M natriumasetaattia, pH 4,0 ja putkea sekoitettiin vorteksilla. Seu-raavaksi lisättiin 3 ml dH20-kyllästettyä fenolia ja putkia sekoitettiin taas vorteksilla. Jokaiseen putkeen lisättiin 600 μΐ kloroformi:isoamyylialkoholia (49:1) ja putkea 15 ravisteltiin käsin 10 s ja laitettiin jäihin 15 min. Sitten putket sentrifugoitiin Sorva* RC-5B:ssä käyttämällä SM24-roottoria 8000 kierrosta/min (RPM) 20 min 4 °C:ssa. Vesipitoinen faasi siirrettiin uuteen Sarstedt-putkeen, jossa oli 3 ml isopropanolia ja laitettiin -20 °C:een 1 h. 1 h jälkeen putket sentrifugoitiin Sorval RC5B:ssä käyttämällä SM-24-roottoria 8000 kierrosta/min (RPM) 20 min 4 °C:ssa. Supematantit 20 poistettiin ja pelletit suspendoitiin uudestaan 500 μΐ^βη GTC-liuosta. Uudelleen suspendoitu RNA siirrettiin 1,5 ml eppendorfputkeen, johon oli lisätty 500 μΐ isopropanolia. Putket laitettiin kerran vielä -20 °C:een 1 h. Eppendorfputkia sentrifugoitiin 5 min mikrofugissa ja supematantti heitettiin pois. Pelletti pestiin 70-*.·. prosenttisella etanolilla 2 kertaa ja annettiin kuivua, kunnes etanoli oli täydellisesti * 25 haihtunut. Pelletti suspendoitiin uudestaan 20 μΐ^βη dietyylipyrokarbonaatilla • * · (depc) käsiteltyä vettä ja kuumennettiin 65 °C:een 5 minuutiksi. Tätä RNA:ta käy-tettiin sitten tekemään cDNA:ta toisessa kahdesta jäljempänä kuvatusta menetelmäs- • e · *·" tä.
• «
« « I
• o« cDNA-reaktiot * 30 Menetelmä 1
Ensimmäinen standardi-DNA syntetisoitiin 2,5-6,0 pl:sta kokonais-RNA:ta (keskimäärin 0,5-6 μg) 10-20 μΐ reaktiotilavuudessa. Kokonais-RNA saatiin edellä kuva-•' . > tulla uuttanaismenetelmällä ja denaturoitiin 5-10 min 70 °C:ssa ja jäähdytettiin no- , peasti jäissä ennen reaktiokomponenttien lisäämistä. Reaktio-olosuhteet olivat 35 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM jokaista dCTP, ( e 4 > 107391
dATP, dGTP ja dTTP (Pharmacia), 40 mM KC1, 500 yksikköä/ml RNaasi (Promega Biotech), 85 μΐ/ml oligo(dT)i2.i8 (Collaborative Research, Inc.) ja 15 000-20 000 yksikköä/ml Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistä transkriptaasia (Bethesda Research Laboratories), inkuboitiin 37 °C:ssa 60 min. Reaktio lopetettiin lisäämällä 5 EDTA.ta 40 mM.ksi ja nukleiinihappo saostettiin lisäämällä natriumasetaattia 0,3 M
konsentraatioon ja 2 tilavuutta etanolia. Saostuman annettiin muodostua 0 °C:ssa 30 min, pelletoitiin sentrifugoimalla mikrofugissa 14 000 rpm 30 min. Pelletti pestiin 70-prosenttisella etanolilla, kuivattiin, suspendoitiin uudestaan depc-käsiteltyyn veteen 12-25 μΐ tilavuuteen.
10 Menetelmä 2
Olosuhteet ensimmäiseen cDNA.n juostesynteesiin RNArsta on otettu soveltaen Carol A. Brenneriltä et ai, BioTechniques, Voi. 7, nr.10, ss. 1096-1103 (1989). 1 μΐ kokonais-RNA:ta RNA-valmistusmenetelmästä, joka on kuvattu edellä, lisättiin 9 μl:aan reaktiopuskuria 0,5 ml:n eppendorfputkessa. Reaktiopuskuri koostui 200 15 yksiköstä Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteisestä transkriptaasista (MMLVRT Bethesda Research Labs) ja lopullisesta seuraavien reagenssien kon-sentraatiosta: 70 mM Tris.HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1 % Triton X-100, 1 mM jokaista dNTP, 4 mM MgCl2 ja 0,45 OD26o-yksiköstä satunnaisia heksameerejä (Pharmacia). Sen jälkeen, kun oli sekoitettu, putkia inkuboitiin huoneenlämpötilassa 20 10 min ja laitettiin sitten 42 °C:een 1 h. 1 h kuluttua putkia kuumennettiin 90 °C:een 1 min MMLVRT.n deaktivoimiseksi ja sitten jäähdytettiin huoneenlämpötilaan.
GH3-soluista olevan RNA:n polymeraasiketjureaktio (PCR) amplifikaatio « · • · • ·
Seuraavia alukkeita käytettiin amplifioimaan PCR:llä TSHp cDNA, joka oli synteti- « · * ΓΙ soitu RNA-transkripteistä, jotka oli tuotettu GH3-soluilla seurauksena siitä, että HR- 25 plasmidit aktivoivat endogeenisen TSHp-geenin homologisella rekombinaatiolla.
• t t • · · • · aluke 5' 3'
TSHP5 AGTATATGATGTACGTGGACAGG TSHp3 CACTTGCCACACTTGCAGCTCAGG
C I ( ( · | ‘ Kuvio 14 osoittaa TSHP-geenin alueet, joita jokainen aluke vastaa.
• · 30 PCR-reaktio-olosuhteet • · · • · ' S Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin Ericomp Twinblock -thermocyclerissä. Jos oli tar- .·’ : koitus tehdä PCR-amplifikaatio cDNA: lie, joka oli tehty menetelmällä 2, lisättiin • « * · · • · ♦ * « · · 26 107391 40 μΐ lisäreaktioseosta suoraan 10 pl:aan cDNA-reaktiota saattaen kokonaistilavuus 50 μΐ-.ksi. Reagenssien lopulliset konsentraatiot 50 μΐ-.ssa olivat 70 mM Tris-HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1 % Triton X-100, 2,25 yksikköä Taq-polymeraasia (Pharmacia), 0,2 μΜ jokaista aluketta, 200 μΜ jokaista dNTP:tä ja 0,8 mM MgCl2.
5 Jos oli tarkoitus tehdä PCR cDNA:lle, joka oli tehty edellä olevalla menetelmällä 1, lisättiin 5-10 μΐ uudelleen suspendoitua cDNA:ta 40-45 pl:aan, jossa oli seuraavat lopulhset konsentraatiot: 70 mM Tris-HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1 % Triton X-100, 2,25 yksikköä Taq-polymeraasia, 0,2 μΜ jokaista aluketta, 200 μΜ jokaista dNTP:tä ja 0,8 mM MgCl2.
10 Sitten reaktioille tehtiin seuraavat PCR-kierrot.
1 min 94 °C:ssa.
30 s 55 °C:ssa.
2 min 72 °C:ssa.
Edellä ollut kierros toistettiin 30-40 kertaa. 10 μΐ jokaista reaktioseosta ajettiin 6 % 15 polyakryyliamidigeelissä ja 247 bp PCR-fragmentin läsnäoloa seulottiin, mikä osoittaisi TSHP:ta varten oikein silmukoidun mRNA:n läsnäolon.
PCR-tulokset GH3-solujen TSHp-RNA:n ja rotan aivolisäkkeen kokonais-RNA:n amplifioimiseksi
Jotta määritetään, syntetisoivatko GH3-solut normaalisti TSHp-RNA:ta, altistettiin 20 cDNA ei-transfektoiduista GH3-soluista, samoin kuin cDNA rotan aivolisäkkeestä : edellä oleviin PCR-reaktio-olosuhteisiin. Oikea 247 bp vyöhyke, joka osoittaa : i . TSHP-mRNA:n läsnäolon, oli näkyvä rotan aivolisäkenäytteen positiivisessa kont- rollissa, mutta juovaa ei näkynyt GH3-solun kokonais-RNA-näytteessä edes 60 kier- • ♦ : roksen jälkeen (tiedot eivät näkyvissä).
• 1 « « ”· 25 Transfektiotulokset • · · « « · • · · 10 cm:n maljoilla läsnäolevien G418 resistenssien pesäkkeiden lukumäärä taulu-, ' koiriin 14-21 päivää G418 alustaan lisäyksen jälkeen.
( ( 4 < 4 4 4 4 « ♦ « « · · « 4 4 < ·. ·: i •«· • · t ♦ 1 1 27 107391
Transfektio- Pesäkkeitä/10 cm malja menetelmä pRSVCATNEO pRSVCATNEOTSHB3-5XBAl
Apal-pilk. Aat2-pilk.
Kalsiumfosf. 1 48 13 29 5 Kalsiumfosf.2 -- 21 58
Elektropor.l — 1295 415
Elektropor.2 -- 1051 723
Kokonais-RNA kerättiin yhdistetyistä pesäkkeistä, jotka olivat 24 kaivon maljoilla, kuten edellä kuvattiin. cDNA tehtiin näistä RNA-valmisteista ja altistettiin PCR-10 amplifikaatiolle. Positiivisten pesäkkeiden, jotka tuottivat TSHP-mRNA:ta, lukumäärä, määritettiin 247 bp fragmentin läsnäololla, kuten polyakiyyliamidigeelissä oli näkyvissä. Jokaisessa seulotussa keräymässä oli 10-70 pesäkettä. Pesäkkeiden arvioitua lukumäärää/keräymä/transfektio käytettiin arvioimaan G418-resistenssien GH3-solukloonien, joissa oli aktivoitu TSHp-geenin transkriptio, lukumäärää. Jos 15 keräymä oli testissä positiivinen, oletettiin, että se edusti yhtä positiivista pesäkettä läsnä tuossa tietyssä keräymässä.
Plasmidi G418-res. pesäkkeet TSHP-RNA-pos.
pRSVCATNEO 60 0 pRSVCATNEOTSHB3-5XBAl 4942 3 20 (Aat2 pilkottu) pRSVCATNEOTSHB3-5XBAl 8580 6 (Apal pilkottu) Nämä tulokset osoittavat normaalisti transkriptionaalisesti hiljaisen TSHp-geenin : onnistuneen aktivaation tämän keksinnön menetelmällä. Koska pesäkkeiden, jotka ··· i 25 ovat positiivisia TSHP-transkriptiolle, lukumäärä on pieni verrattuna pesäkkeiden .·. : lukumäärään, jotka ovat G418-resistenssejä (likimäärin yksi jokaisesta 10 G418- * resistenssistä pesäkkeestä), tämä tulos on yleisesti yhdenmukainen nopeuksien kans- • · * λ/ sa, joita on raportoitu muille homologisen rekombinaation kokeille (Michael Krieg- ' ler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual, Stockton Press, New 30 York, NY (1990), s. 56-60). Yleisesti on havaittu, että homologisen rekombinaation ‘' ‘' ' ‘ nopeus näyttää olevan verrannollinen kohdistetun geenin transkriptionopeuteen 'ti(M. Frohman ja G. Martin, Cell, 56:145 (1989); S.L. Mansour et ai, Nature, ;'. _; 336:348 (1988)). Pitäisi huomata, että nopeus, joka on osoitettu, on kolme suuruus- , ·1. luokkaa korkeampi kuin mitä saatettaisiin odottaa satunnaiselle mutaatiolle, joka 35 laittaa TSHP-geenin päälle.
i * i < k 1 < « < « < < t « < 4 1« a 107391
Jotta varmistettiin, että tulokset jokaiselle pesäkekeräymälle olivat toistettavat ja että RNA-transkription aktivaatio oli stabiili, pesäkekeräymät, jotka oli aikaisemmin jäädytetty, ja vastasivat keräymiä, jotka olivat testeissä positiivisia ensimmäisessä seulonnassa, sulatettiin ja levitettiin viljemiksi. Juuri sulatetut GH3-positiiviset kf; 5 räymät ympättiin T 25 -kudosviljelmäpulloihin ja kasvatettiin, kunnes solut saavuttivat 70-80 %:n konfluenssin. Sitten 80 000 solua maljattiin 24 kaivon maljoille jokaisesta pullosta ja kasvatettiin kunnes ne olivat 50-70 % kontinentteja. RNA uutettiin soluista, muutettiin cDNA:ksi ja TSHp-RNA:n läsnäoloa seulottiin tekemällä 10 piille jokaisesta PCR-reaktiosta 6 %:n polyakryyliamidigeeli. Kuvio 15 osoittaa 10 tyypillisten PCR-reaktioiden tulokset toisesta seulonnasta tehtynä näkyväksi polyak-ryyliamidigeelissä etidiumbromidivärjäyksellä ja fluoresenssilla. Linjat 1, 2 ja 3 sisältävät PCR-reaktiot, jotka on tehty cDNAille GH3-soluista, jotka oli transfektoitu pRSVCATNEOilla. pRSVCATNEOissa ei ole homologia-alueita TSHp in kanssa ja täten ei ole kykenevä aktivoimaan TSHp-geeniä homologisella rekombinaatiolla. 15 Kuten voidaan nähdä geelissä kuviossa 15, ei ole juovia, jotka vastaisivat 247 bp niissä linjoissa, osoittaen että TSHp-geeni ei ole aktivoitu. Linjassa 6 on myös negatiivinen kontrolli. Tässä linjassa 3 keräymää yhdistettiin GH3-solujen näytteistä, joL ka oli transfektoitu pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI;llä (Apal pilkottu), mutta jotka olivat ensimmäisessä seulonnassa negatiivisia TSHp-geenin transkriptiolle. 247 bp-20 fragmentin puuttuminen linjassa 6 osoittaa, että transfektoidun pRSVCAT-NEOTSHB3-5XbaI- (Apal pilkottu) plasmidin, joka oli integroitunut satunnaisesti genomiin, läsnäolo ei kykene tuottamaan 247 bp TSHP PCR-fragmenttia. Linjoissa • · : ·* 7, 8, 9 ja 10 on PCR-reaktiot, jotka on tehty cDNAille, joka on tehty kokonais- RNAista, joka on kerätty rotan aivolisäkkeistä määrinä, jotka olivat 25 ng, 100 ng, « « v.: 25 200 ng ja 400 ng/reaktio, vastaavasti. Odotetun 247 bp juovan, joka tuotettiin nor- maalisi! TSHp:ta ekspressoivasta rotan kudoksesta valmistetusta cDNA:sta, läsnäolo näissä linjoissa osoitti, että PCR-reaktio-olosuhteet olivat oikein optimoidut ja että PCR-vyöhyke, joka saatiin linjoissa 4 ja 5 ja joissa oli homologisen rekombinaation positiiviset, oli oikean kokoinen. Kaksi keräymää, jotka oli transfektoitu 30 pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI:llä (Apal pilkottu), jotka olivat positiivisia ensim- • · ... mäisessä seulonnassa, ApaI-107 linjassa 4 ja ApaI-136 linjassa 5, olivat jälleen ker- T ran positiivisia TSHp-geeniaktivaatiolle, kuten osoitettiin oikean TSHp PCR-juovan läsnäololla, joka oli amplifioitu cDNAista, joka oli tehty kokonais-RNA-uutteista niistä keräymistä, jotka vahvistivat että TSHp-geenin transkriptio on stabiilisti akti- ; 35 voitu. Vyöhykkeiden 247 bp läsnäolo linjoissa 4 ja 5, joissa oli RNAita edellisistä • · · !./ positiivisista Apal-107:stä ja Apal-136:sta ja juovien puuttuminen negatiivisista pRSVCATNEOilla transfektoiduista GH3-solukontrolleista linjoissa 1-3 ja 29 107391 pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Apal pilkottu) negatiiviset linjassa 6 osoittivat, että TSHp-RNA:n tuoton solulinjassa, joka normaalisti ei tuota RNAita, on homologinen rekombinaatio laittanut stabiilisi! päälle.
Tämä keksintö ei rajoitu tässä kuvattuun solulinjaan. Kaikissa solulinjoissa on ge-5 neettistä informaatiota, joka normaalisti on hiljainen tai inertti. Useimmat kykenevät ekspressoimaan vain tiettyjä geenejä. Kuitenkin normaalisti minkä tahansa sellaisen solulinjan transkriptionaalisesti hiljainen tai inertti geeni voidaan aktivoida ekspresT soimaan geenituotetta tämän keksinnön mukaisesti ja genomin minkä tahansa geenin ekspressio-ominaispiirteitä voidaan modifioida tämän keksinnön mukaisesti. Jopa 10 aiemmin transformoituja solulinjoja voidaan käyttää niin kauan kuin aiempi transformaatio ei katkaise kiinnostuksen kohteena olevaa geeniä. Solulinjan lähde ei ole tärkeä. Solulinja voi olla eläimen tai kasvin, primäärinen, jatkuva tai kuolematon. Tietenkin on toivottavaa, että mikä tahansa sellainen solulinja on stabiili ja kuolematon, niin että tämän keksinnön mukaisella tekniikalla käsittelyn jälkeen ekspres-15 siota voidaan kaupallistaa. Kloonattuja mikro-organismeja, olivatpa prokaryoottisia tai eukaryoottisia, voidaan myös käsitellä tämän keksinnön mukaisella tekniikalla.
Koska tätä keksintöä on kuvattu edullisesti suhteessa normaalisti transkriptionaalisesti hiljaisen tai inertin geenin ekspressioon, on tämän keksinnön tekniikka myös sovelletettavissa luonnollisesti isäntäsolulinjassa ekspressoituvan geenin ekspressio-20 ominaispiirteiden modifikaatioon. Esimerkiksi jos toivotaan tehtävän geenin eks-v. pressio riippuvaiseksi viljelyolosuhteista tai sen kaltaisista, niin että ekspressio voi- ' ! daan laittaa päälle ja pois päältä haluttaessa, voidaan insertoida sopiva DNA-sääte^ lysegmentti, kuten säädeltävä promoottori, mikä antaa sellaiset ominaisuudet kuten • · · repressoituvuus tai indusoituvuus. Esimerkiksi jos tiedetään, että solutyypissä on • · · '· *· 25 tumaan liittyviä steroidireseptoreita, kuten estrogeeni, testosteroni tai glukokortikoi- di tai tyroksiinireseptoreita, steroidi- tai tyroksiinivaste-elementtejä voitaisiin käyt- • « · ; tää F-alueena. Sellainen vaste-elementti on mikä tahansa DNA, joka sitoo sellaisia reseptoreita, jotta tuodaan esiin positiivinen vaste suhteessa transkriptioon. Jopa jos ·:··: solu ei luonnollisesti vastaa glukokortikoideihin, esimerkiksi rakenteeseen voitaisiin .***; 30 lisätä DNA-pala, joka koodaa glukokortikoidireseptoria tai insertoida muuten jo honkin kohtaan genomissa, niin että tehdään solu vastaanottavaiseksi glukokortikoi- « * · / deille. Säädeltävän promoottorin käyttö voisi olla toivottavaa, olipa kiinnostuksen kohteena oleva geeni normaalisti transkriptionaalisesti hiljainen tai ei. Muunlaista säätelyä voidaan saada myös kohdistamalla sopiva DNA-säätelysegmentti tarkkaan » · .· ·. 35 kiinnostuksen kohteena olevaan asemaan tämän keksinnön prosessin keinoin.
30 107391 Täten koska tämän keksinnön edullinen sovellutus on normaalisti hiljaisten geenien ekspression stimuloiminen, on se laajimmassa merkityksessään sovelletettavissa minkä tahansa isäntäsolulinjalle endogeenisen geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifikaatioon.
5 Homologisen rekombinaation spesifinen tekniikka ei ole itsessään tämän keksinnön uusi osa. Sellaisia tekniikoita tunnetaan ja ammattimies ymmärtää, että mitä tahansa sellaista tekniikkaa voidaan käyttää tässä keksinnössä niin kauan kuin se sallii DNA-säätelysegmentin kohdistamisen haluttuun kohtaan suhteessa kiinnostuksen kohteena olevaan geeniin. Koska on esitetty edullinen tekniikka käyttämällä linearisoitua 10 rakennetta, jossa on kaksi homologista aluetta insertoitavien sekvenssien molemmilla puolin, mikä muu tahansa toisen tekniikan, joka toteuttaa tämän toiminnon, kuten esimerkiksi käyttämällä sirkulaarisia rakenteita, on tarkoitettu myös kuuluvan tämän keksinnön piiriin. Tämän keksinnön kriittinen piirre on homologisen rekombinaatio-tekniikkojen käyttö insertoimaan DNA-säätelysekvenssi, joka aiheuttaa käytetyssä 15 solulinjassa tai mikro-organismissa ekspressio-ominaispiirteiden modifikaation, opt ratiivisesti kytkettynä solulinjan genomin geenin kanssa, edullisesti sellaiseen, joka on normaalisti transkriptionaalisesti hiljainen, tai insertoimaan amplifioitavan sekvenssin ilman säätelysekvenssiä, tarpeeksi lähelle geeniä solulinjan, joka jo transkriptoi, genomissa aikaansaamaan sellaisen geenin amplifikaation amplifioita-20 van sekvenssin amplifikaation jälkeen. Selektoitavan markkerin mukanaolo ei ole ehdottoman tärkeätä. Selektio voi perustua pelkästään kiinnostuksen kohteena ole-. ·’: van geenituotteen tai mRNA:n havaitsemiseen alustassa tai soluissa DNA-rakenteen : insertion jälkeen. Lisäksi suoritusmuodossa, jossa säädeltävä sekvenssi insertoidaan, ;y. ei amplifikaatio, koska toivottua, ole toiminnalle kriittistä. Sama pätee negatiivisen .·. : 25 selektion geenille, mikä tekee seulomisprosessin helpommaksi, mutta ei ole kriit-
• · I
^ j tinen keksinnön onnistumiselle. Täten perussuoritusmuoto vaatii vain DNA-säätely- « · · !..1 segmentin tai amplifioitavan segmentin insertion spesifiseen toivottuun asemaan.
*· ’ Kuitenkin positiivisten ja/tai negatiivisten selektoitavien markkerigeenien lisäys käytettäväksi selektiotekniikassa on edullista, kuten on amplifioitavan geenin lisäys : 1 30 suoritusmuodossa, johon lisätään säätelyelementti.
• · • .1 . Termi "ekspression modifikaatio", kuten sitä on käytetty läpi tämän yksityiskohtai- sen esityksen ja patenttivaatimusten, kuvataan tässä ekspression terminaation estä-*···1 misenä insertoimalla homologisella rekombinaatiolla mutaatio, deleetio, lopetusko- doni tai muu nukleotidisekvenssi, koko geeni mukaan luettuna, kiinnostuksen koh-. · ’. 35 teenä olevaan geeniin niin, että estetään kiinnostuksen kohteena olevan tuotteen eks- pressoituminen. Tekniikan taso opettaa käyttämään homologista rekombinaatiota in- si 107391 sertoimaan spesifisiä mutaatioita ja sen keinot ovat saattaneet luonnostaan lopettaa solutuotteen ekspression (ks. esimerkiksi, Schwartzberg et ai, PNAS (USA), 87:3210-3214 (1990)). Tämän keksinnön ei ole tarkoitus käsittää sellaista menetelmää. Tässä keksinnössä "ekspression modifikaatio" suoritetaan keinoilla, jossa iii-5 sertoidaan säätely- ja/tai amplifioitavat alueet spesifiseen toivottuun kohtaan homologisen rekombinaation keinoin. Edullisia modifikaatioita ovat ne, jotka aktivoivat ja/tai vahvistavat kiinnostuksen kohteena olevan tuotteen ekspressiota.
Milloin tahansa tämä yksityiskohtainen esitys käyttää fraasia, että DNA-säätelyseg-mentti on "operatiivisesti liittynyt" geeniin, sellaisen terminologian on tarkoitus tar-10 koittaa, että DNA-säätelysegmentti on niin sijoittunut suhteessa kiinnostuksen kohteena olevaan geeniin, että sellaisen geenin transkriptiota säätelee tuo DNA-säätelysegmentti. Säätelysegmentti on edullisesti vastavirtaan geenissä, mutta voi olla myötävirtaan tai geenin sisällä edellyttäen, että se toimii säätelemään geenin ekspressiota jollakin tavalla. DNA-säätelysegmentti voi olla promoottori, terminaattori, 15 operaattori, vahvistaja, vaimennin, heikentäjä tai sen kaltainen tai mikä tahansa niiden yhdistelmä.
Milloin tahansa termejä "vastavirtaan" tai myötävirtaan" käytetään tässä yksityiskohtaisessa esityksessä ja patenttivaatimuksissa, on ne tarkoitettu tarkoittamaan f'· suuntaan tai 3-suuntaan, vastaavasti, suhteessa kiinnostuksen kohteena olevan gee-20 nin koodausjuosteeseen.
• ·’ Edellä ollut kuvaus spesifisistä suoritusmuodoista paljastaa niin täysin keksinnön :: yleisen luonteen, että muut voivat helposti modifioida ja/tai soveltaa sellaisia spesi- fisiä suoritusmuotoja erilaisiin sovellutuksiin ilman että poiketaan yleisestä käsit-teestä. Minkä tahansa sellaisten sovellutusten ja modifikaatioiden on tarkoitettu si-25 säilyvän esitettyjen suoritusmuotojen ekvivalenttien tarkoitukseen ja alueeseen. On ymmärrettävää, että fraseologia ja terminologia, jota tässä on käytetty, on kuvaus-tarkoitukseen eikä rajoitukseksi.
• · • · · • · 1
4 I
· ·

Claims (27)

32 107391
1. Menetelmä normaalisti transkriptionaalisesti hiljaisen geenin aktivoimiseksi erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomissa niin, että saadaan mainittu solulin-ja ekspressoimaan mainitun geenin geenituotetta, tunnettu siitä, että insertoidaan
2. Förfarande för modifiering av expressionskännetecknen för en gen i ett genom 20 av en differentierad eukaryotisk cellinje, kännetecknat av att en DNA-konstruktion « · : .* insättes i det nämnda genomet medelst homolog rekombination, varvid nämnda :. i.' DNA-konstruktion innehäller ett DNA-reglersegment som förmär modifiera expres- • · :sionskännetecknen för genen dä det operativt har kopplats tili denna, säsom jämfört med dess existerande DNA-reglersegment, och ett DNA-mälsegment som är homo-:*·.· 25 logt med nämnda genomomräde i nämnda gen eller dess närhet, och att nämnda konstruktion insättes pä sä sätt att nämnda reglersegment operativt har kopplats nämnda gen av intresse.
2. Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi, tunnettu siitä, että insertoidaan DNA-rakenne mainittuun genomiin homologisella rekombinaatiolla, mainitun DNA-rakenteen sisältäessä DNA-säätelysegmentin, joka kykenee modifioimaan geenin ekspressio- 15 ominaispiirteitä, kun se on operatiivisesti liittynyt siihen, kuten verrattuna sen olemassa olevaan DNA-säätelysegmenttiin, ja DNA-kohdennussegmentin, joka on homologinen mainitun genomin alueen kanssa mainitussa geenissä tai sen läheisyydessä, ja että mainittu rakenne insertoidaan siten, että mainittu säätelysegmentti on operatiivisesti liittynyt mainittuun kiinnostuksen kohteena olevaan geeniin.
3. Förfarande för modifiering av expressionskännetecknen för en gen i genomet • · · av en differentierad eukaryotisk cellinje, kännetecknat av att en DNA-konstruktion 30 insättes i det nämnda genomet medelst homolog rekombination, varvid DNA-konstruktionen innehäller en uttryckbar, amplifierbar gen som förmär amplifiera nämnda gen dä den har insatts i tillräcklig närhet tili denna, och ett DNA-mälsegment som är homologt med nämnda genomomräde i nämnda gen eller dess närhet, :...: och att nämnda konstruktion insättes pä sä sätt att nämnda amplifierbara gen stär i 37 107391 tillräcklig närhet till nämnda gen av intresse för att ästadkomma dess amplifikation da nämnda amplifierbara gen amplifieras.
3. Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio- : V ominaispiirteiden modifioimiseksi, tunnettu siitä, että insertoidaan DNA-rakenne :.i,: mainittuun genomiin homologisella rekombinaatiolla, DNA-rakenteen sisältäessä ekspressoituvan, amplifioituvan geenin, joka kykenee amplifioimaan mainitun gee- nin, kun se on insertoitu riittävän tiiviiseen läheisyyteen siihen nähden, ja DNA- :*·.· 25 kohdennussegmentin, joka on homologinen mainitun genomin alueen kanssa maini- • · tussa geenissä tai sen läheisyydessä, ja että mainittu rakenne insertoidaan siten, että mainittu amplifioituva geeni on riittävän tiiviissä läheisyydessä mainittuun kiin-; nostuksen kohteena olevaan geeniin aiheuttamaan sen amplifikaation, kun mainittua amplifioituvaa geeniä amplifioidaan. • e « · ·
4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att nämnda DNA-konstruk-tion dessutom uppvisar ätminstone en uttryckbar selekterbar markergen som har 5 placerats sä att den insättes tillsammans med nämnda uttryckbara, amplifierbara gen.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa DNA-rakenteessa on lisäksi vähintään yksi ekspressoituva selektoitava markkeri-geeni, joka on sijoitettu niin, että se insertoidaan mainitun ekspressoituvan, ampli-/ ; Hoituvan geenin kanssa. 33 107391
5. Förfarande enligt patentkrav 1, 2 eller 3, kännetecknat av att nämnda DNA-konstruktion uppvisar tvä DNA-mälsegment, vardera homologt med nämnda genom-omräde i nämnda gen eller i dess närhet, varvid det ena mälsegmentet befinner sig 10 uppströms firän nämnda reglersegment och det andra mälsegmentet befinner sig ned-ströms frän nämnda reglersegment.
5. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa DNA-rakenteessa on kaksi DNA-kohdennussegmenttiä, kumpikin homologinen mainitun genomialueen kanssa mainitussa geenissä tai sen läheisyydessä, yhden kohdennussegmentin ollessa ylävirtaan mainitusta säätelysegmentistä ja toisen mai- 5 nituista kohdennussegmenteistä ollessa alavirtaan mainitusta säätelysegmentistä.
5 DNA-rakenne mainittuun genomiin homologisella rekombinaatiolla, DNA-raken-teen sisältäessä DNA-säätelysegmentin, joka kykenee stimuloimaan mainitun geenin ekspressiota, kun se on operatiivisesti liittynyt siihen, ja DNA-kohdennussegmentin. joka on homologinen mainitun genomin alueen kanssa mainitussa geenissä tai sen läheisyydessä, ja että DNA-rakenne insertoidaan siten, että mainittu säätelysegment-10 ti on operatiivisesti liittynyt mainittuun kiinnostuksen kohteena olevaan geeniin.
6. Förfarande enligt patentkrav 1, 2 eller 3, kännetecknat av att nämnda DNA-konstruktion dessutom uppvisar ätminstone en uttryckbar selekterbar markergen som har placerats sä att den insättes tillsammans med nämnda reglersegment. 15 7. Förfarande enligt patentkrav 1, 2, 3, 4, 5 eller 6, kännetecknat av att nämnda DNA-konstruktion dessutom uppvisar en negativ selekterbar markergen som har placerats i förhällande tili nämnda mälsegment pä sä sätt att den inte insättes dä nämnda konstruktion lämpligen insättes medelst homolog rekombination, varvid nämnda negativa selekterbara marker inte uttrycker i de celler i vilka nämnda DNA- .' · *: 20 konstruktion lämpligen har insatts. • · « « f i
6. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa DNA-rakenteessa on lisäksi vähintään yksi ekspressoituva selektoituva mark-kerigeeni, joka on sijoitettu niin, että se insertoidaan mainitun säätelysegmentin kanssa.
7. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa DNA-rakenteessa on lisäksi negatiivinen selektoitava markkerigeeni, joka on sijoitettu mainittuun kohdennussegmenttiin nähden niin, että se ei insertoidu. kun mainittu rakenne sopivasti insertoidaan homologisella rekombinaatiolla, jolloin mainittua negatiivista selektoitavaa markkeria ei ekspressoida soluissa, joihin mai-15 nittu DNA-rakenne on sopivasti insertoitu.
8. Förfarande enligt patentkrav 1, 2, 5, 6 eller 7, kännetecknat av att nämnda ’·’·[ DNA-konstruktion dessutom uppvisar en uttryckbar amplifierbar gen som har :: placerats sä att den insättes tillsammans med nämnda reglersegment. • « • · · * · ·
8. Patenttivaatimuksen 1, 2, 5, 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa DNA-rakenteessa on lisäksi ekspressoituva amplifioituva geeni, joka on sijoitettu niin, että se insertoituu mainitun säätelysegmentin kanssa.
9. Förfarande enligt patentkrav 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8, kännetecknat av att 25 nämnda cellinje är en eukaryotisk cellinje.
9. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu .' ·': 20 siitä, että mainittu solulinja on eukaryoottinen solulinja.
10. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att nämnda cellinje är en ··« djurcelllinje.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu- • I * ‘; * · ’ linja on eläinsolulinja. • · · • * · :*·.· 11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu- . :'. linja on nisäkässolulinja.
11. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att nämnda cellinje är en däggdjurcellinje. 30 12. Förfarande enligt patentkrav 9, kännetecknat av att nämnda cellinje är en • · ’ växtcelllinje. 38 107391
12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu- *: : linja on kasvisolulinja. • * · • ·
13. Förfarande enligt patentkrav 6, kännetecknat av att dessutom ästadkommes en expression av nämnda genprodukt, omfattande dessutom följande skeden efter nämnda insättningsskede: klonema för nämnda cellinje, vilken uttrycker en produkt av nämnda selekterbara 5 markergen, selekteras; de selekterade klonema odlas i förhällanden som är tillräckliga att tilläta en expression av nämnda genprodukt; och nämnda genprodukt uppsamlas.
13. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi aikaan- '' saadaan mainitun geenituotteen ekspressio, mihin lisäksi kuuluvat vaiheet, mainitun : ’ insertiovaiheen jälkeen: • · 30 selektoidaan mainitun solulinjan, joka ekspressoi mainitun selektoitavan markkeri-’ · · · ’ geenin tuotetta, kloonit; 34 107391 kasvatetaan selektoituja klooneja olosuhteissa, jotka ovat riittävät sallimaan mainitun geenituotteen ekspression; ja kerätään mainittu geenituote.
14. Förfarande enligt patentkrav 13, kännetecknat av att nämnda selekterbara 10 markergen är en neomysinresistensgen och nämnda selekteringsskede bestär av selektering av de kloner som uppvisar neomysinresistens.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu se-5 lektoitava markkerigeeni on neomysiiniresistenssigeeni ja mainittu selektoimisvaihe koostuu niiden kloonien selektoimisesta, joissa on neomysiiniresistenssiys.
15. Förfarande enligt patentkrav 13 eller 14, kännetecknat av att nämnda DNA-konstruktion dessutom uppvisar en negativ selekterbar markergen som har placerats i förhällande tili nämnda mälsegment pä sa sätt att den inte insättes da nämnda 15 konstruktion lämpligen insättes medelst homolog rekombination, varvid nämnda negativa selekterbara marker inte uttrycks i de celler i vilka nämnda DNA-konstruk-tion lämpligen har insatts och nämnda selekteringsskede dessutom omfattar en selektering av de kloner som inte uttrycker nämnda negativa selekterbara markergen.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitussa DNA-rakenteessa on lisäksi negatiivinen selektoitava markkerigeeni, joka on sijoitettu mainittuun kohdennussegmenttiin nähden niin, että se ei insertoidu, kun 10 mainittu rakenne insertoidaan sopivasti homologisella rekombinaatiolla, jolloin mainittua negatiivista selektoitavaa markkeria ei ekspressoida soluissa, joihin mainittu DNA-rakenne on sopivasti insertoitu ja mainittuun selektoimisvaiheeseen kuuluu lisäksi niiden kloonien selektoiminen, jotka eivät ekspressoi mainittua negatiivista selektoitavaa markkerigeeniä.
16. Förfarande enligt patentkrav 15, kännetecknat av att nämnda negativa selek-20 terbara markergen är en tymidinkinasgen frän Herpes Simplex viruset och nämnda : V selekteringsskede dessutom omfattar en selektering av de kloner som klarar en :. ‘,: exponering tili ett sädant medium som dödar celler som uttrycker nämnda gen.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ne gatiivinen selektoitava markkerigeeni on Herpes Simplex -viruksen tymidiinikim:?.-sigeeni ja mainittuun selektoimisvaiheeseen kuuluu niiden kloonien selektoiminen, jotka selviävät sellaiselle alustalle altistamisesta, joka tappaa solut, jotka ekspressoi-vat mainittua geeniä. » · « · [ ! 20 17. Erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomi, jossa genomissa on DNA-sää- • · · telysegmentti, joka on operatiivisesti liittynyt luonnollisesti esiintyvään geeniin, • « · mainitun DNA-säätelysegmentin ollessa kykenevä stimuloimaan mainitun luonnolli- • · · *· *· sesti esiintyvän geenin ekspressiota, tunnettu siitä, että mainittu luonnollisesti V*: esiintyvä geeni on luonnollisessa kohdassaan genomissa ja että siten liittynyt DNA- * a · : 25 säätelysegmentti on genomin kohdassa, jossa se ei esiinny luonnollisesti.
17. Genom av en differentierad eukaryotisk cellinje, vilket genom uppvisar ett • · · ! ! DNA-reglersegment som operativt har kopplats tili en naturligt förekommande gen, • «e 25 varvid nämnda DNA-reglersegment förmär stimulera expressionen av den nämnda « « * v ’ naturligt förekommande genen, kännetecknat av att nämnda naturligt förekomman de gen befinner sig i sitt naturliga läge i genomet och det sälunda kopplade DNA-reglersegmentet befinner sig i ett genomläge i vilket det inte uppträder naturligt. • · · « · • · ·
18. Differentierad eukaryotisk cellinje, kännetecknad av att den förmär uttrycka 30 en genprodukt av en normalt transkriptionellt tyst gen i cellinjen för nämnda genom da i nämnda genom har insatts ett DNA-reglersegment som operativt har kopplats med nämnda normalt transkriptionellt tysta gen, varvid nämnda DNA-reglersegment förmär förbättra expressionen av genprodukten i nämnda cellinje. 39 107391
18. Erilaistunut eukarioottinen solulinja, tunnettu siitä, että se kykenee ekspres- « · ... soimaan geenituotetta normaalisti transkriptionaalisesti hiljaisella geenillä mainitun *:* solulinjan genomissa, mainitussa genomissa ollen insertoituneena siihen DNA-sää- telysegmentti, joka on operatiivisesti liittynyt mainitun normaalisti transkriptionaa-: 30 lisesti hiljaisen geenin kanssa, mainitun DNA-säätelysegmentin ollessa kykenevä . edistämään mainitun solulinjan geenituotteen ekspressiota.
19. Differentierad eukaryotisk cellinje, kännetecknad av att den förmär förbättra expressionen av genprodukten jämfört med den cellinje fran vilken den härletts, varvid nänmda genprodukt är en expressionsprodukt av en endogen gen i genomet för nänmda cell, da i nämnda genom har insatts pä ett operativt sätt nänrna endogena 5 gen eller närä denna ett exogent DNA-reglersegment och/eller en amplifierbar gen som formar förbättra expressionen av nänmda genprodukt i nänmda cellinje.
19. Erilaistunut eukarioottinen solulinja, tunnettu siitä, että se kykenee vahvistamaan geenituotteen ekspressiota verrattuna sohdinjaan, josta se on johdettu, maini- 107391 tun geenituotteen ollessa endogeenisen geenin ekspressiotuote mainitun solun geno-missa, mainitussa genomissa ollen insertoitunut siihen operatiivisella tavalla mainittuun endogeeniseen geeniin tai sen lähelle eksogeeninen DNA-säätelysegmentti ja/tai amplifioituva geeni, joka kykenee vahvistamaan mainitun geenituotteen eks-5 pressiota mainitussa solulinjassa.
20. Cellinje enligt patentkrav 19, kännetecknad av att nänmda exogena DNA-reglersegment och/eller amplifierbara gen är ett exogent DNA-reglersegment.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että mainittu eksogeeninen DNA-säätelysegmentti ja/tai amplifioituva geeni on eksogeeninen DNA-säätelysegmentti.
21. Cellinje enligt patentkrav 19, kännetecknad av att nämnda exogena DNA- 10 reglersegment och/eller amplifierbara gen är en exogen amplifierbar gen.
21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että mainittu ekso-10 geeninen DNA-säätelysegmentti ja/tai amplifioituva geeni on eksogeeninen amplifioituva geeni.
22. Cellinje enligt patentkrav 18 eller 20, kännetecknad av att nämnda DNA-reglersegment är sädant att det formar förbättra expressionen av en genprodukt soin normalt uttryckes av nämnda cellinje eller mikroorganism.
22. Patenttivaatimuksen 18 tai 20 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että mainittu DNA-säätelysegmentti on sellainen, joka kykenee edistämään geenituotteen ekspressiota, jota mainittu solulinja tai mikro-organismi normaalisti ekspressoi.
23. Cellinje enligt patentkrav 22, kännetecknad av att det insatta DNA-reglerseg-15 mentet är en del av DNA-konstruktionen som bestär av nämnda DNA-reglersegment och ätminstone en selekterbar markergen.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että insertoitu DNA-säätelysegmentti on osa DNA-rakennetta, joka koostuu mainitusta DNA-sää-telysegmentistä ja vähintään yhdestä selektoitavasta markkerigeenistä.
24. Cellinje enligt patentkrav 23, kännetecknad av att nämnda DNA-konstruktion dessutom uppvisar en amplifierbar gen. « « : 25. Förfarande för att erhälla en genprodukt ur en cellinje, kännetecknat av en :: 20 differentierad eukaryotisk cellinje enligt vilket som heist av patentkrav 18—24 odlas ' j,' i förhallanden som tilläter en expression av nämnda genprodukt och nämnda gen- ;\j produkt uppsamlas. φ * • · i • · · l.m‘ 26. DNA-konstruktion för att insättas i ett genom i en differentierad eukaryotisk *·* cellinje, kännetecknad av att den omfattar ett DNA-reglersegment som förmäi 25 modifiera expressionsegenskapema för en gen i den cellinje i vilken den insättes da nänmda reglersegment operativt har kopplats tili nämnda gen, och ett DNA-mäl- • # · segment som är homologt med det genomomräde i vilket det skall insättas pä sä sätt att da nämnda DNA-konstruktion insättes i mälstället kommer DNA-reglersegmentet att operativt kopplas tili nämnda gen.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen solulinja, tunnettu siitä, että mainitussa DNA-rakenteessa on lisäksi amplifioituva geeni.
25. Menetelmä geenituotteen saamiseksi solulinjasta, tunnettu siitä, että kasvate- taan minkä tahansa patenttivaatimuksen 18-24 mukaista erilaistunutta eukarioottisu solulinjaa olosuhteissa, jotka sallivat mainitun geenituotteen ekspression, ja kerätään : ’ ·.: mainittua geenituotetta.
• · • · · • · ♦ **’ " 26. DNA-rakenne insertoitavaksi erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomiin, 25 tunnettu siitä, että se käsittää DNA-säätelysegmentin, joka kykenee modifioimaan sen solulinjan, johon se insertoidaan geenin ekspressio-ominaisuuksia, silloin kun • · « mainittu säätelysegmentti on operatiivisesti liitetty mainittuun geeniin, ja DNA-koh-dennussegmentin, joka on homologinen sen genomin alueen kanssa, johon se aiotaan insertoida, siten että kun mainittu DNA-rakenne insertoidaan kohdennettuun ; 30 kohtaan, DNA-säätelysegmentti tulee operatiivisesti liittymään mainittuun geeniin. I i i < t . · · . 27. DNA-rakenne insertoitavaksi erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomiin, tunnettu siitä, että se käsittää ekspressoituvan, amplifioituvan geenin, joka kykenee m 107391 amplifioimaan geenin siinä solulinjassa, johon se insertoidaan, kun mainittu ampli-fioitava geeni on insertoitu riittävän tiiviiseen läheisyyteen geeniin nähden, ja DNA-kohdennussegmentin, joka on homologinen sen genomin, johon se aiotaan insertoi-da, alueen kanssa, mainitussa geenissä tai sen läheisyydessä, ja että mainittu raken-5 ne insertoidaan siten, että siten kun mainittu DNA-rakenne insertoidaan kohdennettuun kohtaan, amplifioitava geeni tulee riittävän tiiviiseen läheisyyteen geeniin nähden mainitun geenin kopioluvun amplifioitumisen sallimiseksi, kun mainittu solu altistetaan amplifioitumisolosuhteille. 10 1. Förfarande för aktivering av en normalt transkriptionellt tyst gen i genomet av en differentierad eukaiyotisk cellinje pä sä sätt att nämnda cellinje börjar uttrycka en genprodukt av nämnda gen, kännetecknat av att en DNA-konstruktion insättes 1 det nämnda genomet medelst homolog rekombination, varvid DNA-konstruktionen innehäller ett DNA-reglersegment som förmär stimulera expressionen av nämnda 15 gen da det operativt har kopplats tili denna, och ett DNA-mälsegment som är homologt med nämnda genomomräde i nämnda gen eller dess närhet, och att DNA-konstruktionen insättes pä sä sätt att nämnda reglersegment operativt har kopplats tili nämnda gen av intresse.
27. DNA-konstruktion för att insättas i ett genom i en differentierad eukaryotisk . cellinje, kännetecknad av att den omfattar en uttryckbar amplifierbar gen som i ( « förmär amplifiera en gen i den cellinje i vilken den insättes da nämnda amplifierbara 40 107391 gen har insatts tillräckligt närä i förhällande till genen, och ett DNA-mälsegment som är homologt med det genomomräde i vilket det skall insättas i nänrnda gen eller dess närhet, och att nämnda konstruktion insättes sä att da nämnda DNA-konstruk-tion insättes i malstället kommer den amplifierbara genen i tillräcklig närhet i fSrh'd-5 lande tili genen for att tilläta en amplifiering av kopieantalet av nämnda gen da nämnda cell utsättes for amplifieringsförhällanden, » · • « i « t I I t I I ( I ( I I r c t c r 9 9 • O · • 9 * • « • e 9*9 9 99 9 < • « * 9*9 9 « e « « 9 9 9 99 9 9 9 999
FI922863A 1989-12-22 1992-06-18 Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi FI107391B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45478389A 1989-12-22 1989-12-22
US45478389 1989-12-22
US9007642 1990-12-21
PCT/US1990/007642 WO1991009955A1 (en) 1989-12-22 1990-12-21 Endogenous gene expression modification with regulatory element

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI922863A0 FI922863A0 (fi) 1992-06-18
FI922863A FI922863A (fi) 1992-06-18
FI107391B true FI107391B (fi) 2001-07-31

Family

ID=23806064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI922863A FI107391B (fi) 1989-12-22 1992-06-18 Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi

Country Status (26)

Country Link
EP (5) EP1484412A3 (fi)
JP (3) JP3501286B2 (fi)
KR (1) KR0176693B1 (fi)
AR (1) AR245776A1 (fi)
AT (2) ATE156189T1 (fi)
AU (1) AU645294B2 (fi)
BG (1) BG60624B1 (fi)
BR (1) BR9007937A (fi)
CA (1) CA2071989C (fi)
DE (3) DE69034135T3 (fi)
DK (2) DK0779362T4 (fi)
ES (2) ES2104690T3 (fi)
FI (1) FI107391B (fi)
GR (1) GR3025057T3 (fi)
HK (2) HK1000547A1 (fi)
HU (1) HU217212B (fi)
IL (4) IL116046A (fi)
LT (1) LT3998B (fi)
LV (1) LV10655B (fi)
NO (1) NO311896B1 (fi)
OA (1) OA09594A (fi)
RO (1) RO109864B1 (fi)
RU (1) RU2128227C1 (fi)
UA (1) UA42675C2 (fi)
WO (1) WO1991009955A1 (fi)
ZA (1) ZA9010392B (fi)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6048729A (en) * 1987-05-01 2000-04-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
SG88714A1 (en) * 1989-11-06 2002-05-21 Cell Genesys Inc Production of proteins using homologous recombination
GB9008746D0 (en) * 1990-04-18 1990-06-13 Connaught Lab The use of autologous promoters to express gene products in bordetella
US5643753A (en) 1990-04-18 1997-07-01 Connaught Laboratories Limited Use of autologous promoters to express gene products in bordetella
SG93780A1 (en) * 1991-05-06 2003-01-21 Cell Genesys Inc Gene manipulation and expression using genomic elements
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6692737B1 (en) 1991-11-05 2004-02-17 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6054288A (en) * 1991-11-05 2000-04-25 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6063630A (en) * 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
NZ245015A (en) * 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
WO1993023553A1 (en) * 1992-05-19 1993-11-25 Exemplar Corporation Production of transgenics by joining regulatory and coding regions in vivo
AU4401993A (en) * 1992-06-04 1993-12-30 Exemplar Corporation Insertion of heterologous dna outside of known chromosomal genes
US6531124B1 (en) 1992-07-10 2003-03-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
DK153992D0 (da) * 1992-12-22 1992-12-22 Novo Nordisk As Metode
US5733753A (en) * 1992-12-22 1998-03-31 Novo Nordisk A/S Amplification of genomic DNA by site specific integration of a selectable marker construct
GB2299336A (en) 1993-12-23 1996-10-02 Merck & Co Inc Homologous recombination antibody expression sysstem for murine cells
AU738395B2 (en) * 1994-05-13 2001-09-20 Transkaryotic Therapies, Inc. DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
US6124439A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockefeller University OB polypeptide antibodies and method of making
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6001968A (en) 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6048837A (en) * 1994-08-17 2000-04-11 The Rockefeller University OB polypeptides as modulators of body weight
US6124448A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockfeller University Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6130071A (en) * 1997-02-05 2000-10-10 Helsinki University Licensing, Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) ΔCys156 protein and gene, and uses thereof
US6818220B1 (en) 1994-11-14 2004-11-16 Licentia Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof
US6645933B1 (en) 1995-08-01 2003-11-11 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Receptor ligand VEGF-C
US6498015B1 (en) 1995-06-07 2002-12-24 Icos Corporation Methods of identifying agents that modulate the binding between MDC and an MDC receptor
US7018627B1 (en) 1995-06-07 2006-03-28 Icos Corporation Macrophage derived chemokine (MDC), MDC analogs, MDC inhibitor substances, and uses thereof
US6737513B1 (en) 1996-06-07 2004-05-18 Icos Corporation Macrophage derived chemokine (MDC) and chemokine analogs and assay to identify modulators of MDC activity, and therapeutic uses for same
US6361946B1 (en) 1997-02-05 2002-03-26 Licentia Ltd Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
US7727761B2 (en) 1995-08-01 2010-06-01 Vegenics Limited Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
US7084252B1 (en) 1996-01-16 2006-08-01 The Rockefeller University DB, the receptor for leptin
US7063958B1 (en) 1996-01-16 2006-06-20 The Rockefeller University Nucleic acids db, the receptor for leptin
US7148004B1 (en) 1997-01-16 2006-12-12 The Rockefeller University Oligonucleotides of the OB-R isoforms and methods of diagnosing body weight
US7619079B2 (en) 1996-02-14 2009-11-17 The Rockefeller University Db, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof
DE69739675D1 (de) 1996-10-01 2010-01-07 Geron Corp Oter
US5925544A (en) * 1996-11-18 1999-07-20 Novo Nordisk A/S Method of homologous recombination followed by in vivo selection of DNA amplification
US7125714B2 (en) 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
US5888809A (en) * 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
PT986644E (pt) 1997-07-23 2007-01-31 Roche Diagnostics Gmbh Preparação de eritropoietina por activação genética endógena com promotores virais
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
EP0986644B1 (de) * 1997-07-23 2006-10-04 Boehringer Mannheim GmbH Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren
US6897066B1 (en) 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US5932465A (en) 1997-10-16 1999-08-03 Icos Corporation Phosphodiesterase 8A
AU757930B2 (en) * 1997-12-01 2003-03-13 Roche Diagnostics Gmbh Optimization of cells for endogenous gene activation
WO1999042596A2 (en) 1998-02-23 1999-08-26 Icos Corporation Phosphodiesterase 10
US6479256B1 (en) 1998-03-04 2002-11-12 Icos Corporation Lectomedin materials and methods
US6200951B1 (en) 1998-03-12 2001-03-13 Icos Corporation Chitinase chitin-binding fragments
US6541623B1 (en) 1998-04-03 2003-04-01 Hyseq, Inc. Interleukin—1 receptor antagonist and uses thereof
US6294655B1 (en) 1998-04-03 2001-09-25 Hyseq, Inc. Anti-interleukin-1 receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6426191B1 (en) 1998-04-03 2002-07-30 Hyseq, Inc. Assays involving an IL-1 receptor antagonist
US6337072B1 (en) 1998-04-03 2002-01-08 Hyseq, Inc. Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof
US6071691A (en) * 1998-04-27 2000-06-06 Oregon Health Science University Materials and methods for modulating differentiation
US6492138B1 (en) 1998-05-21 2002-12-10 Amgen Canada Inc. Polynucleotides encoding a novel SHC-binding protein
AU4213999A (en) * 1998-05-27 1999-12-13 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide by modifying the copy number of a gene
US6476211B1 (en) 1998-07-16 2002-11-05 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
US6387645B1 (en) 1998-07-16 2002-05-14 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
US6447771B1 (en) 1999-03-19 2002-09-10 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
IL140931A0 (en) 1998-07-16 2002-02-10 Hyseq Inc Methods and materials relating to novel cd39-like polypeptides
US6773911B1 (en) 1998-11-23 2004-08-10 Amgen Canada Inc. Apoptosis-inducing factor
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
ATE445335T1 (de) 1998-12-23 2009-10-15 Sinai School Medicine Hemmstoffe zur unterdrückung des bitteren geschmacks
US6780977B1 (en) 1999-01-29 2004-08-24 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6350447B1 (en) 1999-01-29 2002-02-26 Hyseq, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6783959B1 (en) 1999-01-29 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6899875B1 (en) 1999-01-29 2005-05-31 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
AU3003700A (en) * 1999-02-19 2000-09-04 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US6335013B1 (en) 1999-03-19 2002-01-01 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
AU3770800A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Amgen, Inc. Beta secretase genes and polypeptides
WO2000077179A2 (en) 1999-06-16 2000-12-21 Icos Corporation Human poly(adp-ribose) polymerase 2 materials and methods
US6632665B1 (en) 1999-08-09 2003-10-14 Wake Forest University Human gene encoding 3′-5′ exonuclease
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US6900043B1 (en) 1999-09-21 2005-05-31 Amgen Inc. Phosphatases which activate map kinase pathways
US6344549B1 (en) 1999-10-14 2002-02-05 Icos Corporation ATR-2 cell cycle checkpoint
JP2003512838A (ja) 1999-10-22 2003-04-08 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー ショウジョウバエｇタンパク質結合レセプター、核酸、およびそれに関連する方法。
US7314716B2 (en) 1999-11-19 2008-01-01 Mount Sinai School Of Medicine Gustducin γ subunit materials and methods
US6635742B1 (en) 2000-01-25 2003-10-21 Nuvelo, Inc. Antibodies specific for semaphorin-like polypeptides
US6586390B1 (en) 2000-01-21 2003-07-01 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel prothrombinase-like polypeptides and polynucleotides
US6465620B1 (en) 2000-01-21 2002-10-15 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel von Willebrand/Thrombospondin-like polypeptides and polynucleotides
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US7514239B2 (en) 2000-03-28 2009-04-07 Amgen Inc. Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof
EP1297112A2 (en) 2000-05-22 2003-04-02 PHARMACIA &amp; UPJOHN COMPANY Novel matrix metalloproteinases
AU2001270266B2 (en) 2000-06-28 2004-10-21 Amgen Inc. Thymic stromal lymphopoietin receptor molecules and uses thereof
US7067626B2 (en) 2000-07-05 2006-06-27 Pharmacia & Upjohn Company Human ion channel proteins
GB0018876D0 (en) 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
US6787684B2 (en) 2000-10-16 2004-09-07 E. & J. Gallo Winery Lipoxygenase genes from Vitis vinifera
EP1345628B1 (en) 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
PT1407787E (pt) 2001-06-20 2009-07-07 Koken Kk Método de promoção da transferência de ácido nucleico
CN100489102C (zh) 2001-06-26 2009-05-20 塞诺米克斯公司 T1r异源寡聚的味觉受体和表达所述受体的细胞系及其在鉴定味觉化合物中的用途
AU2002318229B2 (en) 2001-07-10 2008-03-13 Senomyx, Inc. Use of specific T2R taste receptors to identify compounds that block bitter taste
US7662924B2 (en) 2002-02-22 2010-02-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Beta chain-associated regulator of apoptosis
WO2003100007A2 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Schering-Plough Ltd. Eta-1 gene and methods for use
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
EP1572291B1 (en) 2002-10-08 2013-04-03 Ares Trading S.A. The use of cytokine able to bind il-18bp and of inhibiting the activity of a second cytokine
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CA2802143C (en) 2003-01-14 2018-06-19 Dana-Farber Cancer Institute Sparc encoding polynucleotide as a cancer therapy sensitizer
ES2625342T3 (es) 2003-06-27 2017-07-19 Monell Chemical Senses Center Receptores gustativos de la familia T1R del gato doméstico
CL2004002015A1 (es) 2003-08-06 2005-05-13 Senomyx Inc Derivados de amida, productos que las contienen, utiles para modificar el sabor de alimentos y medicamentos.
WO2005032467A2 (en) 2003-09-29 2005-04-14 Warren Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
EP1696034A4 (en) * 2003-12-19 2006-12-27 Dainippon Sumitomo Pharma Co NUCLEIC ACID TRANSFER METHOD
WO2005116069A2 (en) 2004-04-14 2005-12-08 Monell Chemical Senses Center Taste receptors of the t1r family from domestic dog
EP2520310B1 (en) 2004-04-23 2016-03-30 Zoetis Services LLC Cellular permissivity factor for viruses, and uses thereof
IL161673A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Applied Research Systems Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
AU2005282731B2 (en) 2004-09-02 2010-04-01 Yale University Regulation of oncogenes by microRNAs
US7785807B2 (en) 2004-12-13 2010-08-31 Monell Chemical Senses Center Voltage-gated, pH-sensitive anion channel and its novel splice variant involved in taste sensation
EP3072522B1 (en) 2005-01-06 2019-04-24 Novo Nordisk A/S Anti-kir combination treatments and methods
WO2006101629A2 (en) 2005-02-17 2006-09-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated SODIUM CHANNEL PROTEIN TYPE III α-SUBUNIT SPLICE VARIANT
ME03528B (me) 2005-03-23 2020-04-20 Genmab As Antitijela protiv cd38 za liječenje multiplog mijeloma
WO2007002528A1 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Yale University Anti-aging micrornas
PL1951395T3 (pl) 2005-09-14 2012-08-31 Ares Trading Sa Sposób ilościowego oznaczania poloksamerów
US7972813B2 (en) 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
WO2007047988A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
EP1957637B1 (en) 2005-12-08 2013-08-14 Amgen, Inc. Improved host cells and culture methods
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
WO2007124152A2 (en) 2006-04-21 2007-11-01 Senomyx, Inc. Comestible compositions comprising high potency savory flavorants, and processes for producing them
EA018101B1 (ru) 2007-05-11 2013-05-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Способы лечения кожных язв
EP2152865B1 (en) 2007-05-11 2015-04-15 Thomas Jefferson University Methods of treatment and prevention of neurodegenerative diseases and disorders
AR067537A1 (es) 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Purificacion de polipeptidos pegilados
CL2008002054A1 (es) 2007-07-17 2009-05-29 Hoffmann La Roche Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico.
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
CA2694476C (en) 2007-07-27 2017-06-27 Universiteit Gent Permissive cells and uses thereof
CN104130247B (zh) 2007-08-21 2018-06-01 塞诺米克斯公司 人t2r苦味受体及其用途
GB0803076D0 (en) 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010042747A2 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
SG10201707763PA (en) 2009-05-05 2017-11-29 Amgen Inc FGF21 Mutants And Uses Thereof
WO2010129600A2 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
EA022396B1 (ru) 2009-09-23 2015-12-30 Ратиофарм Гмбх Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин
EP2325194A1 (en) 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2528933A1 (en) 2010-01-28 2012-12-05 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
JP2013523184A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
RS59769B1 (sr) 2010-06-09 2020-02-28 Genmab As Antitela protiv humanog cd38
CN111012921A (zh) 2010-06-15 2020-04-17 根马布股份公司 针对组织因子的人抗体药物缀合物
MX342444B (es) 2010-09-14 2016-09-29 F Hoffmann-La Roche Ag * Metodo para purificar eritropoyetina conjugada con polietilenglicol (peg).
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
WO2013009971A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Detection and screening method and materials useful in performance thereof
CA2844197A1 (en) 2011-08-03 2013-02-07 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolina Healthcare System Treatment of fibrosis using microrna-19b
BR112014014105B1 (pt) 2011-12-16 2023-10-10 Targetgene Biotechnologies Ltd Método para modificar um sítio-alvo predeterminado no interior de um ácido nucleico genômico ou organelar alvo em uma célula hospedeira eucariótica por um complexo núcleoproteína
CA2915948A1 (en) 2013-08-20 2015-02-26 Lek Pharmaceuticals D.D. Cell culture medium and process for controlling a-amidation and/or c-terminal amino acid cleavage of polypeptides
JP6841753B2 (ja) 2014-09-15 2021-03-10 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション ヒストンｈ３−リジントリメチル化を除去することによって体細胞核移入（ｓｃｎｔ）効率を増加させるための方法および組成物
JP7177035B2 (ja) 2016-07-15 2022-11-22 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｐｅｇ化エリスロポエチンを精製するための方法
EP3731871B1 (en) 2017-12-29 2023-10-04 F. Hoffmann-La Roche AG Process for providing pegylated protein composition
JP7227633B2 (ja) 2017-12-29 2023-02-22 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｐｅｇ化タンパク質組成物を提供するための方法
CN111801120A (zh) 2017-12-29 2020-10-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986006077A1 (en) * 1985-04-08 1986-10-23 Amgen A method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription
EP0273085A1 (en) * 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
ZA88319B (en) * 1987-02-06 1988-08-12 Lubrizol Enterprises, Inc. Ocs enhancer
GB8807683D0 (en) * 1988-03-31 1988-05-05 Ici Plc Regulation of gene expression
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
WO1991005052A1 (en) * 1989-09-28 1991-04-18 Leningradsky Gosudarstvenny Universitet Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae
SG88714A1 (en) * 1989-11-06 2002-05-21 Cell Genesys Inc Production of proteins using homologous recombination
NZ245015A (en) 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production

Also Published As

Publication number Publication date
EP0779362B2 (en) 2012-06-13
DK0779362T4 (da) 2012-07-30
EP1482053A2 (en) 2004-12-01
BR9007937A (pt) 1992-11-17
FI922863A0 (fi) 1992-06-18
HK1000547A1 (en) 1998-04-03
UA42675C2 (uk) 2001-11-15
HUT62657A (en) 1993-05-28
DK0779362T3 (da) 2004-05-10
KR0176693B1 (ko) 1999-04-01
RU2128227C1 (ru) 1999-03-27
NO922436L (no) 1992-06-19
ES2151463T1 (es) 2001-01-01
EP1484412A2 (en) 2004-12-08
ES2104690T3 (es) 1997-10-16
DE779362T1 (de) 2001-04-05
DE69034135T3 (de) 2012-08-23
EP1482053A3 (en) 2007-10-17
EP0779362B1 (en) 2004-04-21
IL116046A0 (en) 1996-01-31
HU9202068D0 (en) 1992-10-28
DE69031172T2 (de) 1998-03-12
DE69034135D1 (de) 2004-05-27
AR245776A1 (es) 1994-02-28
OA09594A (en) 1993-04-30
HK1000786A1 (en) 2005-01-14
NO311896B1 (no) 2002-02-11
EP1375666A3 (en) 2007-09-26
JPH05504682A (ja) 1993-07-22
JP3501286B2 (ja) 2004-03-02
LV10655A (lv) 1995-04-20
BG60624B1 (bg) 1995-10-31
NO922436D0 (no) 1992-06-19
FI922863A (fi) 1992-06-18
ATE264916T1 (de) 2004-05-15
CA2071989A1 (en) 1991-06-23
RO109864B1 (ro) 1995-06-30
ZA9010392B (en) 1992-01-29
DE69031172D1 (de) 1997-09-04
EP1484412A3 (en) 2007-10-17
EP0505500B1 (en) 1997-07-30
CA2071989C (en) 1999-07-27
HU217212B (hu) 1999-12-28
ATE156189T1 (de) 1997-08-15
IL96765A0 (en) 1991-09-16
JP3740134B2 (ja) 2006-02-01
EP0505500A1 (en) 1992-09-30
LT3998B (en) 1996-06-25
ES2151463T5 (es) 2012-10-29
LV10655B (en) 1995-08-20
JP2004089200A (ja) 2004-03-25
AU7183691A (en) 1991-07-24
GR3025057T3 (en) 1998-01-30
WO1991009955A1 (en) 1991-07-11
IL164252A0 (en) 2005-12-18
DK0505500T3 (da) 1997-08-25
EP0779362A1 (en) 1997-06-18
JP2004000233A (ja) 2004-01-08
DE69034135T2 (de) 2004-08-26
EP1375666A2 (en) 2004-01-02
AU645294B2 (en) 1994-01-13
IL116046A (en) 2007-03-08
LTIP1595A (en) 1995-07-25
ES2151463T3 (es) 2004-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI107391B (fi) Menetelmä erilaistuneen eukarioottisen solulinjan genomin geenin ekspressio-ominaispiirteiden modifioimiseksi
US5272071A (en) Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
Hanson et al. Analysis of biological selections for high-efficiency gene targeting
Kandolf The H1A histone variant is an in vivo repressor of oocyte-type 5S gene transcription in Xenopus laevis embryos.
AU698174B2 (en) A gene expression system utilizing an RNA polymerase prebound to DNA
US20080182331A1 (en) Procedure for specific replacement of a copy of a gene present in the recipient genome by the integration of a gene different from that where the integration is made
WO2004063381A1 (en) Targeted transgenesis using the rosa26 locus
EP3974524A1 (en) Dna vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification
CN107142247A (zh) 可诱导的CRISPRon或CRISPRi小鼠胚胎干细胞及其应用
Keaveney et al. Identification of a functional role for the 3′ region of the human oestrogen receptor gene
US20050282764A1 (en) Method of identifying nucleic acid compositions for muting expression of a gene
Ke et al. Splicing signals are required for S-phase regulation of the mouse thymidylate synthase gene
Vacher et al. raf regulates the postnatal repression of the mouse α-fetoprotein gene at the posttranscriptional level
EP1975228A1 (en) Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest
US20070031920A1 (en) High expression locus vector based on ferritin heavy chain gene locus
WO2024076688A2 (en) Synthetic genomic safe harbors and methods thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: LABORATOIRES SERONO SA

Free format text: LABORATOIRES SERONO SA