JP3740134B2 - 一定の細胞系又は微生物の内因性遺伝子の発現特徴の変性のための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム内に天然に存在する遺伝子の発現特徴の変性のための方法に関する。好ましい態様においては、本発明は、安定細胞系内に存在し、そして通常、転写的に静かで又は不活性である遺伝子の活性化及び発現のための方法に関する。結果として、その遺伝子のタンパク質生成物が発現される。この現象は、その生成物をコードするＤＮＡにより細胞をトランスフェクトしないで生じる。むしろ、所望する生成物をコードする常在性遺伝子が、細胞内で同定され、そしていわゆる相同的組換え技法を通して適切な調節セグメントを挿入することによって活性化される。陽性及び／又は陰性選択マーカーがまた、適切な相同的組換え出来事が生じている細胞の選択を助けるために挿入され得る。追加の態様として、特定化された遺伝子は、その遺伝子が通常転写的に静かであり、そして本発明により活性化されているか又は内因的に生成物を発現するかにかかわらず、早められた発現速度のために増幅され得る。
【０００２】
【従来の技術】
生物内の個々の細胞は、その生物内に見出されるすべてのタンパク質をコードする遺伝子情報を含むことが良く知られている。しかしながら、一定細胞型内に存在するひじょうに少数％の遺伝子のみが実際的に転写される。転写されるべき遺伝子配列を調節する細胞内機構が現在理解される。核内に存在する細胞特異的タンパク質は、特定の遺伝子により連結されるＤＮＡ調節セグメントと相互作用する。ＤＮＡ調節配列と核タンパク質とのこの相互作用は、遺伝子転写のために必要とされる。これは、ｍＲＮＡの生合成及びコードされたタンパク質の究極的な発現をもたらす（Ｍｉｔｃｈｅｌｌａｎｄ Ｔｊｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：３７１，１９８９）。
【０００３】
個々の遺伝子のためのこれらのＤＮＡ調節セグメント又は要素は、コード領域から上流に及び多くの場合、コード領域内又はその下流に存在する。細胞特異的核タンパク質との相互作用を通して、ＤＮＡ調節セグメントは、遺伝子の本体に接近し、そしてｍＲＮＡ転写体を合成するためのＲＮＡポリマラーゼの能力、すなわちタンパク質発現における酵素を制限する速度に影響を及ぼす。従って、これらのＤＮＡセグメント及び常在性核タンパク質は、特定遺伝子の発現の調節に臨界的な役割を示す（Ｊｃｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｍｃｋｎｉｇｈｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：７９９，１９８９）。
【０００４】
ＤＮＡ調節セグメントは、核タンパク質のための結合部位である。これらの核タンパク質は、ＤＮＡヘリックスに結合し、そして遺伝子転写を促進する、ＲＮＡポリマラーゼ認識のために利用できる所望する遺伝子を製造するためにその構造を明らかに変える。これらの細胞特異的調節タンパク質の発現は、遺伝子が細胞内で転写され、そしてその速度で発現が生じるであろうことを決定する。このシステムの特異的な例として、たとえ脳下垂体タンパク質のための遺伝子がすべての肝臓細胞内に存在したとしても、脳下垂体細胞（但し、肝臓細胞ではない）は脳下垂体タンパク質を発現する。肝臓細胞の核は、肝臓細胞内に存在する脳下垂体遺伝子の要素と相互作用する特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含まない。
組換えＤＮＡ技法を用いてタンパク質を発現するために使用される現在の方法
特異的ＤＮＡ調節配列が特定細胞型内で遺伝子転写を活性化するために必要とされる知識により、科学者は、遺伝子工学を通して特定の細胞型内に外来性遺伝子を発現して来た。一般的に、細胞の核タンパク質により認識されるＤＮＡ調節セグメントは、発現されるべき外来性遺伝子のコード領域から上流で置換される。この方法においては、細胞中への挿入の後、外来性ＤＮＡは、細胞の核調節タンパク質がこれらのＤＮＡ調節配列を認識するので、発現され得る。この技法は、従来の精製技法により天然源から得又は精製するために困難であったタンパク質を生成するために使用されて来た。
【０００５】
認識できるＤＮＡ配列及び対象の遺伝子の他に、選択可能マーカーがＤＮＡ構造体に結合される。この手段においては、ＤＮＡを摂取した細胞のみが選択培地における培養の後、生存する。たとえば、耐ネオマイシン性のための遺伝子が発現ベクターに含まれ得る。トランスフェクションに続いて、細胞は、Ｇ４１８、すなわち哺乳類細胞に対しては致死的であるネオマイシン抗生物質中で培養される。しかしながら、その細胞が耐ネオマイシン性遺伝子を得たならば、それらは薬物の毒性効果に耐えることができるであろう。この手段においては、トランスフェクトされたＤＮＡを摂取した細胞のみが、培養物中に維持される。いづれかの選択可能マーカーは、それがトランスフェクトされたＤＮＡを摂取した細胞の選択を提供する限り使用され得ることが理解される。細胞内の挿入された遺伝子材料の特異的位置に関しての臨界性は存在しないことがさらに理解される。調節セグメント及び外来性遺伝子（並びに選択可能マーカー）の両者が一緒に挿入される場合、それが核内のいづれかに摂取されることが単に重要である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子発現の現在の方法における欠陥
上記技法は遺伝子工学の力を開発する助けになって来たが、それらは必ずしも遺伝子を発現するのに最っとも効果的な方法ではなかった。これは、細胞系の核中へのＤＮＡの挿入が通常、トランスフェクションとして知られる技法を通して達成される事実による。対象の細胞系における発現のために構築されたＤＮＡが沈澱せしめられ、そして細胞膜が、ＤＮＡの侵入を可能にするために溶解される。上記のようにして、ＤＮＡがゲノム中に組込む正確な部位は決して予測できず；実際、ＤＮＡはエピソーム（ゲノム中に組込まれていない）のまま存続することができる。これは、生成されるタンパク質の発現のレベル及び細胞系の安定性のレベルの非予測性をもたらす。
【０００７】
この技法の第２の欠点は、発現ベクターの構成が、対象の遺伝子が比較的大きい（５〜１０Ｋ塩基以上）場合、ひじょうに困難である事実である。組換えＤＮＡ技法により発現されるタンパク質の多くは、より大きなゲノムクローンよりもむしろｃＤＮＡによりコードされていた。これは、対象の全体の大きさを減ずるために行なわれる。ｃＤＮＡの使用は遺伝子工学をより便利にするが、遺伝子転写及びタンパク質生成の速度が結果として損害を受ける。発現レベルは、時々、ｃＤＮＡ挿入体よりもむしろゲノムの使用によりひじょうに高められることが最近示された（Ｂｒｉｎｓｔｅｒなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８３６〜８４０，１９８８及びＣｈｕｎｇ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：２０７５〜２０８２，１９８９）。この観察を担当する機構は十分に理解されていないが、ある状況下で、イントロン内に存在するエンハンサー要素が遺伝子の転写効能を改良することができることは知られている。イントロン、又はイントロンの存在に起因するスプライシング出来事が、転写の開始に続くＲＮＡプロセッシング出来事に対して効果を有する証拠がまた存在する（Ｂｕｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：４３９５〜４４０５，１９８８）。これは、転写体を安定化し、それによってｍＲＮＡ蓄積の速度を改良する。上記に引用されなＢｒｉｎｓｔｅｒなどの文献においては、遺伝子内のイントロンの位置がプロモーターに対するヌクレオソームの相化のために重要であることがまた仮定される。真核生物の遺伝子の転写に対する種々の調節要素の影響が、Ｋｈｏｕｒｙなど．，Ｃｅｌｌ，３３：３１３〜１４（１９８３），Ｍａｎｉａｔｉｓなど，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：１２３７〜４５（１９８７）及びＭｕｌｌｅｒなど，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７６：４８５〜９５（１９８８）に論ぜられている。
【０００８】
第３に、核中への侵入を得るために、外来性遺伝子の全コード領域を含むトランスフェクトされたＤＮＡは、細胞の透過形質膜を通しての侵入に従って細胞質を横切る。その時間の間、ＤＮＡは、ＤＮＡの統合を変えることができ又は完全に破壊するリソソーム酵素と接触することができる。従って、ＤＮＡのコード領域は、トランスフェクトされた領域と同じではない。
【０００９】
下記遺伝子活性化及び／又は発現変性の新規方法は、所望する遺伝子のコード領域が酵素変性にゆだねられないので、所望するタンパク質の変異形の生成をもたらすことができない。
【００１０】
要約すれば、従来技法を用いての細胞中にトランスフェクトされた多量のＤＮＡ及び特にそのコード領域は、正確に転写されないであろう。それは酵素的に混乱された核中への侵入の前、少化し、その結果、所望する全タンパク質をコードせず又は転写を可能にするすべての必要な調節セグメントを含まない。それは、転写を妨げるゲノムの一部中に挿入され得る。ｃＤＮＡが転写される場合、対象のタンパク質は、エンハンサーを含み、又は効果的なｍＲＮＡのプロセッシングを可能にするイントロンの脱落により効果的に生成され得ない。最後に、それはエピソームのまま存続し、タンパク質生成を促進するが、しかし細胞集団は細胞分裂を通して増殖するので不安定である。
【００１１】
存在する方法の陽性特性を組込んでいるが、しかし興味のない特徴を包含しない細胞系を生成する遺伝子発現の誘発方法を開発することが最っとも所望される。細胞タイプの選択において特定の遺伝子の内因性発現を発現し、又は変性することができることがさらに所望される。適切なヌクレオソーム相化のためにイントロンの適切な置換により又はより効果的なｍＲＮＡプロセッシング出来事により、イントロン内に存在する隠れた転写エンハンサーを含むことができる完全なゲノム配列により付与され得る可能性ある利点を利用するこがさらに所望される。これらの利点は、遺伝子の大きさにより、組換えＤＮＡ発現方法に通常有されない。ゲノムに通常存在する遺伝子、すなわち内因性遺伝子を発現することができる場合、細胞系の安定性及び発現速度はより適合、且つ予測可能になる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
従って、従来技術における上記欠点を排除することが本発明の目的である。
【００１３】
組換え遺伝子技法の陽正特性を組込んでいるが、しかし興味のない特徴を包含しない遺伝子発現の調節及び／又は増幅の方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１４】
細胞系の選択において存在するが、しか通常、転写的には作動しない特定の遺伝子を発現するための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１５】
ｍＲＮＡの蓄積及び／又は転写を担当する完全なゲノム配列の十分な利点を有するタンパク質を発現するための方法を提供することがまた本発明の追加の目的である。
【００１６】
対象の生来の遺伝子の上流、その遺伝子内又はその遺伝子に最っとも近くの安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム中にＤＮＡ調節セグメントを挿入し、そして／又はセグメントを増幅することによって対象の遺伝子の発現特徴を変性するための方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００１７】
安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム内に天然に存在する遺伝子の発現特徴及び同時に、適切に変性された細胞の選択において助力するであろう挿入体特徴を変性するための方法を提供することが本発明の追加の目的である。
【００１８】
対象の遺伝子のコード領域又はエキソン近くに、そこで天然において現われない調節又は増幅セグメントを有するゲノムを提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００１９】
本発明の相同的組換え方法を達成するために使用され得るＤＮＡ構造体を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００２０】
本発明のゲノムを含む細胞系及び微生物を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００２１】
本発明のこれらの及び他の目的が相同的組換え技法により達成され、これにより当業者は、常在性であるが、但し転写的には不活性な遺伝子の発現及び好ましくは増幅を引き起こすことができる。この技法によれば、たとえば発現を条件付き、すなわち抑制可能又は誘発可能にするために、又は発現の速度を早めるために、安定細胞系のゲノムで天然に存在するが、しかし必ずしも不活性でない遺伝子の発現特徴をだれでも変性することができる。
【００２２】
本発明は、細胞系又は微生物のゲノム内での遺伝子の発現特徴を変性するための方法を提供する。ＤＮＡ構造体は、相同的組換えの技法によりそのゲノム中に挿入される。その構造体は、宿主細胞系又は微生物内で操作可能的に結合されるいづれかの遺伝子の発現特徴を変性することができるＤＮＡ調節セグメント、及び挿入されるべきＤＮＡ調節セグメントのために所望されるゲノムの領域に相同の標的セグメントを含む。構成及び挿入技法は、新規ＤＮＡ調節セグメントの、対象の遺伝子への操作的結合を引き起こすために企画される。従って、いづれか新規のコードエキソンを必ずしも挿入しなければ、その遺伝子の発現特徴は変性される。好ましい態様においては、その遺伝子は、宿主細胞系又は微生物内で通常転写的に静かであり又は不活性である遺伝子であり、そして相同的組換えによりその遺伝子に関して適切な位置に直接的に目標を決定されるＤＮＡ調節領域により、その遺伝子はその遺伝子生成物の発現のために活性化される。
【００２３】
ＤＮＡ構造体は好ましくは、ゲノム中に挿入されるそれらの要素により構造体においてお互いから分離されるが、好ましくは生来の遺伝子に隣接する２つの標的セグメントを含む。
【００２４】
構造体はさらに好ましくは、少なくとも１種の発現可能な選択可能マーカー遺伝子、たとえば耐ネオマイシン性を付与する遺伝子を含む。そのためのプロモーターを含むこのマーカー遺伝子はまた、構造体の２種の標的領域間に配置される。
【００２５】
もう１つの態様において、構造体は、対象の遺伝子の発現を増幅するために発現可能な増幅可能遺伝子を含む。そのためのプロモーターを含むこの遺伝子はまた、構造体の２種の標的領域間に配置される。多くの場合、選択可能マーカー及び増幅可能マーカーは同じであり得る。
【００２６】
本発明の追加の態様においては、ＤＮＡ構造体は、そのＤＮＡ構造体が正しく挿入されている細胞において発現されない負の選択可能マーカー遺伝子を含む。この負の選択可能マーカー遺伝子は、その構造体が均質組換えにより遺伝子中に正しく組合される場合、除去するために２種の標的領域外に配置される。そのような負の選択可能マーカー遺伝子の例は、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子である。
【００２７】
さらにもう１つの態様においては、対象の細胞系又は微生物においてすでに生成物を発現している特定の遺伝子の発現特徴を変性することが可能である。これは、（１）細胞系又は微生物が増幅条件にゆだねられる場合、対象の遺伝子のコピー数を高める発現可能な増幅可能遺伝子及び／又は（２）たとえば転写速度を早め、翻訳効率を高め、ｍＲＮＡの蓄積を高め、発現を誘導的にし、等により、対象の遺伝子の発現を変性するプロモーター／エンハンサー要素（又は他の調節要素）を含むＤＮＡ構造体を均質組換えにより挿入することによって達成され得る。この態様で変性される遺伝子発現は、細胞系又は微生物のこれまでの遺伝子操作により引き起こされて来た天然の発現又は発現であり得る。これまでの遺伝子操作は、従来の技法により又は本発明の相同的組換えによってであった。後者の場合、発現特徴の変性をもたらすＤＮＡ挿入は、遺伝子の発現をもたらす同じ遺伝子操作の一部として達成され得、又は続く段階として行なわれ得る。
【００２８】
本発明はまた、上記論議に従って調製された構造体及びそのような構造体により相同的組換えに適切にゆだねられたゲノム並びにそれらのゲノムを含む細胞系及び微生物も包含する。さらに、本発明の形質転換された細胞を培養することによる所望する生成物の調製方法もまた包含される。
【００２９】
【発明の実施の形態】
相同的組換えは、転写的に活性的な遺伝子における変異を誘発し又は補正するための標的遺伝子のために過去数年間開発されて来た技法である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｃ；Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｍｏｌ . Ｂｉｏｌ．，３６：３０１（１９８９））。この相同的組換えの技法は、哺乳類ゲノムの特異的領域中への特異的変異の導入方法として（Ｔｈｏｍａｓなど．，Ｃｅｌｌ，４４：４１９〜４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３〜５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ . Ｓｃｉ．，８５：８５８３〜８５８７，１９８８）又は欠陥遺伝子内での特異的変異を補正するために（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎなど．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６〜５７８，１９８７）開発された。
【００３０】
この技法を通して、ゲノム中に挿入したいＤＮＡの断片は、それを“標的ＤＮＡ”に結合することによって対象の遺伝子の特異的領域に向けられ得る。“標的ＤＮＡ”とは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるＤＮＡである。一本鎖ＤＮＡの２つの相同断片（すなわち標的ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ）がひじょうに隣接して存在する場合、それらは二本鎖ヘリックスを形成するためにハイブリダイズするであろう。ゲノム中に挿入することが所望されるＤＮＡ配列は、その標的ＤＮＡに結合される。
【００３１】
相同的組換えが生じ得る多くの方法が存在する。１つの例は、細胞中での有糸分裂の間、ＤＮＡの複製の工程である。
【００３２】
完全には理解されていない機構を通して、親二本鎖ＤＮＡは、複製バブルと呼ばれる局部領域で、細胞分裂のすぐ前で開環される。２種の分離されたＤＮＡの鎖は、新規ＤＮＡ鎖が合成される鋳型として作用することができる。複製フォークの１つのアームは、５′から３′方向にＤＮＡコードを有し、それは酵素ＤＮＡポリマラーゼが“読取る”ことができる適切な配向である。この酵素は一本鎖ＤＮＡの５′部分に結合し、そして鋳型としてその鎖を用いて、相補的ＤＮＡ鎖を合成し始める。ＤＮＡの他の親鎖は、３′から５′の方向にコードされる。それはＤＮＡポリマラーゼによりこの方向で読取られ得ない。複製するこのＤＮＡ鎖のためには、特別な機構が生じるはずである。
【００３３】
特殊化された酵素、すなわちＲＮＡプライマーゼは、ＤＮＡの３′から５′の鎖にそれ自体結合し、そしてその鎖にそってある間隔で短いＲＮＡプライマーを合成する。プライマーとしてそれらのＲＮＡセグメントを用いて、ＤＮＡポリマラーゼはプライムされたＤＮＡに結合し、そして５′から３′の方向にＤＮＡの相補的断片を合成する。新しく合成されたＤＮＡのこれらの断片は、オカザキフラグメントと呼ばれる。全反応の開始を担当するＲＮＡプライマーは、ＤＮＡポリマラーゼのエキソヌクレアーゼ機能により除去され、そしてＤＮＡにより置換される。この現象は、ポリマラーゼが、局部的合成工程が停止するＤＮＡのプライムされていない長さに達するまで続く。従って、相補的親鎖は３′から５′の方向に全体的に合成されるが、それは実際、５′から３′の方向に“バックスティチ（ｂａｃｋｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）”することによって生成される。その“バックスティチ”工程の間、ＤＮＡに生じ得るいづれかのニックは、いわゆるＤＮＡリガーゼと呼ばれる酵素により閉じられる。
【００３４】
ＤＮＡコードの絶対的な正確さを維持するために、校正機能がＤＮＡポリマラーゼ内に存在する。ＤＮＡポリマラーゼは、新規ＤＮＡ鎖の合成に基づいてＤＮＡのプライムされた断片を必要とする。上記のように、これは、ＲＮＡによりプライムされた一本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡの相補的鎖であり得る。ＤＮＡポリマラーゼがＤＮＡの相補的断片をミスマッチしたことが見出された場合、それはエンドヌクレアーゼとして作用し、そしてそれが完全な対合に再び達するまで、３′から５′の方向にＤＮＡ塩基を除去することができる。
【００３５】
この背景１より、本明細書に記載される技法の基本を理解することが可能である。ゲノムの特定領域に対して相補的である標的ＤＮＡの小さな断片が、ＤＮＡ複製工程の間、親鎖と接触せしめられる。それは、共有される相同領域を通してＤＮＡの他の断片とハイブリダイズし、そして従って組換えするために細胞中に挿入されたＤＮＡの一般的な性質である。この相補的鎖が変異又はＤＮＡの異なった配列を含むオリゴヌクレオチドに結合される場合、それは組換えの結果として新しく合成された鎖中に組込まれる。校正機能の結果として、そのＤＮＡの新規配列が鋳型として作用することが可能である。従って、トランスフェクトされたＤＮＡはゲノム中に組込まれる。
【００３６】
特定遺伝子の配列が知られている場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的であるＤＮＡの断片が、たとえば対象の領域の境界を示す特異的認識部位で生来のＤＮＡの適切な制限により合成され又は得られる。この断片は、細胞中への挿入に基づいて標的装置として作用し、そしてゲノム内でその相同領域にハイブリダイズするであろう。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの断片及びそれに結合されるいづれか追加の配列は、オカザキフラグメントとして作用し、そして新しく合成されたＤＮＡの娘鎖中にバックスティチされるであろう。
【００３７】
本発明の技法においては、これらの標的ＤＮＡの断片に、細胞内に存在する核調節タンパク質及び場合によっては、増幅可能で且つ選択可能なＤＮＡマーカーと相互作用することが知られているＤＮＡの領域が結合される。従って、特定タンパク質の発現は、遺伝子自体及びマーカーＤＮＡをコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、転写のための認識できるシグナルを遺伝子に付与するＤＮＡ調節セグメントにより結合される標的ＤＮＡ（対象の内因性遺伝子と相同性の領域）の使用により達成され得る。この技法により、その遺伝子を実際にトランスフェクトしないで、細胞タイプ内に存在するいづれかの同種遺伝子を発現し、そして増幅することが可能である。さらに、この遺伝子の発現は、その遺伝子の一部又はｃＤＮＡよりもむしろ完全なゲノムＤＮＡにより制御され、従って転写の速度及びｍＲＮＡプロセッシングの効率を改良する。さらに、細胞タイプ内に存在するいづれかの同種遺伝子の発現特徴は、ＤＮＡ調節セグメントの適切な挿入により及び対象の遺伝子の完全なコード部分の挿入を伴わないで変性され得る。
【００３８】
本発明のこれらの観点によれば、分化された細胞系内で、対象の通常転写的に不活な遺伝子を発現し、又は対象の内因的に発現する遺伝子の発現を変性するための新規方法が提供される。発現され、又は変性されたそれらの発現を有することが所望される同種ゲノム配列が、細胞内での遺伝子の発現を指図し、又は変性するために必要な細胞特異的ＤＮＡ配列（調節及び／又は増幅セグメント）により供給されるであろう。得られるＤＮＡは、異種（同種ＤＮＡ配列に対して）調節及び／又は増幅セグメントに操作的に直接的に結合される所望するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むであろう。正の選択マーカーは、場合によっては、得られる細胞のスクリーニングを促進するために構造体内に含まれる。いづれの選択可能マーカーでも使用され得るが、耐ネオマイシン性遺伝子の使用が好ましい。負の選択マーカーも、場合によっては使用され得る。たとえばヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子は、ランダムに組込まれたベクターＤＮＡに対して選択するマーカーとして使用され得る。融合されたＤＮＡ又は存在する発現ＤＮＡは、標的ＤＮＡが増幅可能なマーカーに結合される場合、増幅され得る。
【００３９】
従って、本発明の方法によれば、その特定の真核細胞系、特に分化された細胞系に存在する場合に通常発現されるいづれかの遺伝子は、その遺伝子が不活性な形で存在する、その遺伝子に対して特異的でない細胞系における発現を余儀なくされ得る。これは、その遺伝子のための十分なＤＮＡ配列を実際に挿入しないで生じる。さらに、その遺伝子、又は通常発現する遺伝子は、増強された発現速度のために増幅され得る。さらに、完全には転写的に不活性でない遺伝子の発現特徴は、微生物における遺伝子の発現特徴を変性できるように変性され得る。
【００４０】
本発明の１つの態様において、対象の特定遺伝子を含むが、しかし通常転写しない真核細胞は、本明細書に記載される技法により転写するように誘導される。下記相同組換えベクターはクローン性細胞系中に挿入され、そして化学的選択に従って、いづれか適切な手段により、たとえば新しく活性化された遺伝子から転写されるｍＲＮＡの検出、特定の遺伝子生成物の免疫学的検出又は特定の遺伝子生成物についての機能的アッセイにより特定の遺伝子生成物の生成についてモニターされる。
【００４１】
相同的組換えにより内因性遺伝子を転写的に活性化するために使用されるＤＮＡ構造体の一般的な外形が第１図に示される。
【００４２】
一般的に、ＤＮＡ構造体は、少なくとも２種〜６種までの又はそれ以上の別々のＤＮＡセグメントを含む。そのセグメントは、発現されることが所望される遺伝子内の又はその遺伝子に最っとも近い細胞ゲノムの領域に相同の少なくとも１種、好ましくは２種のＤＮＡ標的セグメント（Ａ及びＢ）、正の選択遺伝子（Ｃ）、増幅可能な遺伝子（Ｄ）、負の選択遺伝子（Ｅ）及びトランスフェクトされるべき細胞において転写的に活性的であるＤＮＡ調節セグメント（Ｆ）を含んで成る。本発明の最っとも基本的な態様においては、単に、単一の標的セグメント（Ｂ）及び調節セグメント（Ｆ）が存在すべきである。他の領域のすべては任意であり、そして好ましい構造体を生成する。
【００４３】
領域Ａ及びＢは、転写的に活性化される対象の内因性遺伝子の領域に相同であるＤＮＡ配列である。内因性遺伝子の特定領域Ａ及びＢは、挿入されるべき調節セグメントのために所望される特定の位置でのそれぞれ上流及び下流に存在するように選択される。これらの領域は構造体において分離されるが、それらは好ましくは内因性遺伝子において隣接する。ゲノムの非隣接部分が標的セグメントとして利用され、たとえばゲノムの一部、たとえば負の調節セグメントを削除することが所望される出来事が存在し得る。
【００４４】
２種の標的領域、Ａ及びＢは、相同の全領域を高め、そして従って組換え効率を高めるために好ましいが、本発明の方法はまた、単一の標的領域の使用も包含する。その単純な形においては（調節セグメントＦ及び選択可能マーカー遺伝子Ｃ及びプロモーターＣ′のみが挿入される予定である場合）、標的ＤＮＡと共にそれらの要素を含むＤＮＡの環状断片が使用される。この手段においては、相同領域（Ｂ）が、そのゲノム対応部分とハイブリダイズする。セグメントＣ′，Ｃ及びＦは、クロスオーバー出来事に続いて、同種遺伝子のＢ部分内に挿入される。
【００４５】
ＤＮＡ調節配列が対象の遺伝子の上流に挿入されることが所望される場合、たとえば通常転写的に不活性的な遺伝子を活性化し、そして発現することが所望される場合、相同の領域は好ましくは、対象の遺伝子のコード部分の上流のゲノムの非コード部分に相同である。２つの標的領域が存在する場合、下流の領域（Ａ）はコード領域の一部を含むことができるが、但し、それはそのコード領域の完全に上流に存在することが好ましい。相同領域は、ＤＮＡ調節配列が、特に生来のプロモーターがターンオフされた正のプロモーターよりもむしろ負のプロモーターである場合、対象の遺伝子のために生来のプロモーターの下流に挿入されるように選択されることがさらに好ましい。
【００４６】
標的領域、すなわち相同の領域の大きさは、臨界ではないが、但しより短い領域ほど、それらは相同の適切な領域を見出し、そして所望するスポットで組換えが生じる傾向が低くなる。従って、相同領域が短いほど、相同組換えの効率がより低くなり、すなわち都合良く組換えされるクローンの％が低くなる。配列相同のための最少必要条件は、２５個の塩基対であることが示唆されている（Ａｙａｒｅｓなど、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８３：５１９９〜５２０３，１９８６）。さらに、構造体中の他の要素のいづれかがまた、宿主細胞のゲノムに見出される場合、誤った場所で組換えの可能性が存在する。しかしながら、本発明の卓越した正の及び負の選択能力の観点から、その効率が低くても、それは好都合良く実施され得る。両標的領域を含む相同の全領域が大きい、たとえば１〜３kbである場合に最適な結果が達成される。調節可能なセグメントＦが対象の遺伝子に操作的に結合され得る限り、標的領域及び特に上流の標的領域Ｂの大きさに対する限界が存在しない。
【００４７】
標的領域が大き過ぎるか又はいなか、又は調節セグメントＦがそれに操作的に結合される遺伝子のコード領域から遠く離れて過ぎているのか又はいなかは実験的に容易に決定され得る。そのような場合、領域Ａ及びＢは対象の遺伝子の異なったセクションに相同され得、そして調節可能なセグメントＦが対象の遺伝子に操作的に結合されるように正しく挿入されるまで、その工程は反復される。たとえば、内因性遺伝子の組合された領域Ａ−Ｂの制限部位は変更され得、そしてその工程は反復される。本発明の概念が本明細書に開示される技法と共に知られた後、当業者は過度の実験を行なわないでいづれかの細胞系又は微生物における対象のいづれか与えられた遺伝子に関して本発明を使用することができる。
【００４８】
領域Ｃは、トランスフェクトされた細胞系を通常毒性の環境に対して耐性にすることができる正の選択可能マーカー遺伝子である。そのような遺伝子の例は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、複数薬物耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパーラート耐性遺伝子（ＣＡＤ）である。
【００４９】
正の選択可能マーカー遺伝子の他に、増幅可能な遺伝子がまた、領域Ｄで構造体に任意に含まれる。増幅可能な遺伝子は、選択的な圧力下で、コピー数の上昇を導びく遺伝子である。その増幅可能な遺伝子に隣接して位置づけされた遺伝子のコピー数がまた上昇するであろう。使用され得る増幅可能な遺伝子は、ＤＨＦＲ，ＭＤＲ，ＯＤＣ，ＡＤＡ及びＣＤＡを包含する。正の選択可能マーカー遺伝子群のメンバー及び増幅可能な遺伝子群のメンバーはオーバーラップし、その結果、理論的には、２種の遺伝子、たとえば
正の選択のための遺伝子及び増幅のための遺伝子を用いる代わりに、１種の遺伝子が両目的のために使用され得る。しかしながら、ほとんどの細胞系はこれらの増幅可能遺伝子の内因性コピーを含むので、細胞はその選択条件に対してすでにいく分耐性であり、そしてトランスフェクトされたＤＮＡを受容しない細胞とトランスフェクトされたＤＮＡを有する細胞との区別は困難である。従って、たとえば増幅可能な遺伝子が所望される場合、優性である正の選択遺伝子、たとえばＨＰＨ，ｇｐｔ，ｎｅｏ及びｔｋ（ｔｋ−細胞における）がまた、構造体に含まれるべきである。いくつかの用途のためには、増幅可能なマーカーを削除することが可能であり又は好ましい。たとえば、対象の遺伝子は、たとえば異種ＤＮＡ調節配列による転写活性化が増幅を伴わないで十分である場合、増幅される必要はない。また、相同組換え効率がひじょうに低い場合、非相同ＤＮＡ：相同ＤＮＡの比は相同組換え効率に直接的に関係されるので、増幅可能遺伝子を除外することが必要である（Ｌｅｔｓｏｕ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１７：７５９〜７７０，１９８７）。所望するタンパク質又はｍＲＮＡの生成のためにスクリーニングにより、正の選択遺伝子を排除し、そして細胞を単に選択することもまた可能である。しかしながら、ほとんどの場合、少なくとも正の選択遺伝子を含むことが好ましい。
【００５０】
構造体中の領域Ｅは、負の選択可能マーカー遺伝子である。そのような遺伝子は、ＤＮＡ構造体が相同的組換えにより正しく挿入されている細胞においては発現されないが、しかしＤＮＡ構造体が、たとえばランダム組込みにより不適切に挿入されている細胞においては発現される。１つのそのような遺伝子は、ヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）である。ＨＳＶｔｋは、ヌクレオチドに対して低い緊縮性を有し、そして通常の哺乳類細胞がリン酸化できないヌクレオチド相同体をリン酸化することができる。ＨＳＶｔｋが細胞に存在する場合、ヌクレオチド相同体、たとえばアシクロバー（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）及びガンシクロバー（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）がリン酸化され、そして宿主細胞のＤＮＡ中に組込まれ、従って細胞を殺害する。負の選択可能マーカー遺伝子の存在は、Ｍａｎｓｏｕｒなど（Ｎａｔｕｎｅ，３３６：３４８〜３５２，１９８８）により記載されるように相同組換えのために負−正の選択の使用を可能にする。Ｃａｐｅｃｃｈｉは、線状化されたベクターＤＮＡがランダム組込みにより挿入する場合に比べて、それが相同的組換により挿入する場合に生じる組込みの異なった態様の利点を有する手段を使用する。ベクターＤＮＡがランダムに挿入する場合、その挿入体の大部分は、末端を通して挿入するであろう（Ｆｏｌｇｅｒなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１３７２〜１３８７，１９８２；Ｒｏｔｈなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２５９９〜２６０７，１９８５；及びＴｈｏｍａｓなど、Ｃｅｌｌ，４４：４１９〜４２８，１９８６）。他方、ベクターが相同的組換により挿入する場合、それは、それらの領域の外側の配列の損失を引き起こす相同の領域を通して組換えするであろう。
【００５１】
例として第１図に示される構造体を用いて、相同的組換えのための組込みｖｓランダム組込みの態様が第２Ａ及び２Ｂ図に示される。非相同的組換えの場合（第２Ａ図）、ベクターは、構造体の末端を通して挿入される。これは、領域Ｅ、この場合ＨＳＶｔｋ遺伝子のゲノム中への挿入を可能にする。しかしながら、相同的組換えが起こる場合（第２Ｂ図）、ＨＳＶｔｋ遺伝子は失なわれる。第１回目の選択は、構造体内に存在する正の選択のために適切な薬物又は条件を使用する。相同的組換え又はランダム組込みのいづれかにより組込まれるＤＮＡを有する細胞は、この回の選択を生存するであろう。次に生存細胞が、薬物、たとえばＨＳＶｔｋ遺伝子を含むすべての細胞を殺害するであろうガンシクロバーに暴露される。この場合、ランダム組込みにより組込まれたベクターがＨＳＶｔｋ遺伝子を含む細胞のほとんどは殺害されるが、しかし相同的組換えにより組込まれたベクターがＨＳＶｔｋ遺伝子を失っている細胞は生存する。これは、ランダムに組込まれたＤＮＡを含む細胞のほとんどの排除を可能にし、相同的組換えを通して組込まれたＤＮＡを含む生存細胞の大部分を残す。これは、正しい組換え出来事の同定をひじょうに促進する。
【００５２】
負の選択段階はまた、必要なら排除され得る。それは、ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）又は免疫学的スクリーニングのような技法の必要性を包含するスクリーニング段階はより集中的な労力を必要とするであろう。
【００５３】
６番目の領域（Ｆ）は、対象の遺伝子を転写的に活性にするために使用されるＤＮＡ調節セグメントを含む。適切なＤＮＡ調節セグメントは、使用される細胞タイプに依存して選択される。使用される調節セグメントは、分化された宿主細胞系における与えられた遺伝子の発現を促進することが知られているセグメントである。たとえば、宿主細胞系が、タンパク質、たとえば成長ホルモン及びプロラクチンを天然で発現する脳下垂体細胞から成る場合、それらの遺伝子のいづれかのためのプロモーターは、ＤＮＡ調節要素Ｆとして使用され得る。本発明に従って挿入される場合、調節セグメントは、通常転写的に不活性な対象の遺伝子に操作的に結合され、そして宿主細胞系におけるその遺伝子の転写及び／又は発現を刺激するであろう。細胞タイプを通して作用する無差的なＤＮＡ調節セグメント、たとえばラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターもまた有用である。調節セグメントが転写及び／又は発現を刺激し、又は本発明により対象の遺伝子に操作的に結合されるように宿主細胞系中に挿入された後、対象の遺伝子の転写及び／又は発現を刺激するために誘発され得る限り、それは本発明に使用され得る。それは開始コドンが配列中に突然的に導入されていない標的セグメントＡに調節セグメントＦを連結する場合、そのような発生が発現されることが所望される遺伝子の読取り枠を変えるので、重要である。もちろん、構造体は、調節セグメントＦが対象の遺伝子に操作的に結合されるように構成され、そして挿入されるべきである。
【００５４】
ＤＮＡ調節セグメント、すなわち領域Ｆは、たとえばそれは細胞系において天然において発現するので又は細胞系はそのような発現を引き起こすために操作されたそのＤＮＡを前もって有しているのて、対象の細胞系においてすでに発現している遺伝子の転写を増強し、又は増幅することが所望される場合、存在する必要はない。そのような場合、増幅可能遺伝子、領域Ｄ、好ましくは正の選択可能マーカー遺伝子、領域Ｃ及び場合によってはまた、負の選択可能マーカー遺伝子、領域Ｅの挿入は、対象の遺伝子のコピー数を高め、そして従って全体量の転写を高めるのに十分であろう。他方、対象の遺伝子のための存在する調節領域に比べて転写の増強された（又は変性された）速度を本質的に促進する新規調節セグメント、領域Ｆは、対象の存在する発現遺伝子の転写をさらに増強するために含まれ得る。そのような新規調節セグメントは、転写効率を改良するプロモーター又はエンハンサーを含む。
【００５５】
領域Ｃ′，Ｄ′及びＥ′は、それぞれ領域Ｃ，Ｄ及びＥにおける遺伝子を誘導するために使用されるプロモーター領域である。これらのプロモーターは、選択された細胞系において転写的に活性であり、そして対象の内因性遺伝子を誘導するために使用される領域Ｆにおけるプロモーターと同じか又は異なったものであり得る。第１図に特定された転写の特異的方向は臨界ではない。当業者は、対象の遺伝子又は構造体中の他のいづれかの遺伝子の発現を同時に妨げないで、プロモーターがそれらの関連する遺伝子の発現を刺激するように、遺伝子Ｃ，Ｄ及びＥ及びそれらのプロモーターＣ′，Ｄ′及びＥ′のいづれか適切な配置を決定することができる。
【００５６】
本発明は、ＧＨ1(ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２），ＧＨ3(ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８２．１）又はＧＨ4 ｃｌ細胞系（ＧＨ）においてのラットチロトロピンβサブユニット（ＴＳＨβ）活性化により例示され得る。ＧＨ細胞系は、ＭｔＴ／Ｗ５（Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２２：９１７，１９６２）と命名され、そしてＴａｓｈｊｉａｎなど、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，８２：３４２〜３５２，１９６８により培養で増殖するように適合された、ラットにおける放射線誘発性脳下垂体腫瘍に由来する。これらの細胞系は、成長ホルモン及びＴＳＨβを生成するそれらの能力についてサブクローンされ、そしてスクリーンされ得る。そのようなスクリーニングは、好ましくはノザンブロット分析により行なわれ、ラット成長ホルモン遺伝子のためのｍＲＮＡが存在するかいづれかが決定され、そして生成されるＴＳＨβ遺伝子のためのｍＲＮＡが存在しないことが確立される。その細胞系はまた、ゲノム内に存在するＴＳＨβ遺伝子の少なくとも１つのコピーが存在することを決定するためにサガン分析によりスクリーンされ得る。成長ホルモンを生成し、そしてＴＳＨβを生成しないが、しかしＴＳＨβ遺伝子のコピーを含むＧＨ細胞系のみが使用される。
【００５７】
ＧＨ細胞に使用するための特定の相同的組換えベクターは、次の態様で企画され得る（第３図）。領域Ａは、−７４から−２７８５に伸びるＨｉｎｄ IIIフラグメントにより定義されるＴＳＨβ遺伝子の５′上流の末翻訳領域から成り、そして領域Ｂは、−２７８５Ｈｉｎｄ III部位から、さらに上流のＮｃｏＩ部位に伸びる約２．１kbのＤＮＡフラグメントを含むことができる（Ｃａｒｒなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.,２６２：９８１〜９８７，１９８７及びＣｒｏｙｌｅなど、ＤＮＡ，５：２９９〜３０４，１９８６）。正の選択遺伝子（領域Ｃ）は、プラスミドｐＳＶＺｎｅｏ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７，１４９）に由来るす１０６７bpのＢｇｌII−ＳｍａＩフラグメントであり得る（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．，１：３２７〜３４１，１９８２）。そのｎｅｏ遺伝子は、プラスミドｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣＮｏ．３７，１５２）からのＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントに由来するラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のプロモーター（領域Ｃ′）により駆動され得る。この例においては、増幅可能マーカーは使用される必要がなく、そして従って、相同的組換えの効率を最適化するために領域Ｄの必要性が存在しない。その効率は、構造体に存在する非相同配列：相同配列の割合に反比例する（Ｌｅｔｓｏｕなど、Ｃｒｅｎｅｔｉｃｓ，１１７：７５９〜７７０，１９８７）。領域Ｅ又は負の選択遺伝子は、プラスミドｐＭＣＩＴＫ（Ｃａｐｅｃｃｈｉなど、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８〜３５２，１９８８）から得られる２kbのＸｈｏフラグメントであるＨＳＶｔｋ遺伝子から成る。その構造体におけるＨＳＶｔｋ遺伝子は、Ｔｈｏｍａｓなど（Ｃｅｌｌ，５１：５０３〜５１２，１９８７）により構成されるようにポリオーマウィルスのプロモーター及びエンハンサー（領域Ｅ′）により駆動され得る。第２のＤＮＡ構造体において、そのポリオーマプロモーターは、上記のＲＳＶプロモーターにより置換され得る。ＴＳＨβ遺伝子を活性化するために使用されるＤＮＡ調節配列は、ＲＳＶプロモーター又はラット成長ホルモンプロモーターのいづれかであり得る。ラット成長ホルモンプロモーターは、プラスミドｐＲＧＨ２３７ＣＡ７（Ｌａｒｓｏｎなど、ＰＮＡＳ，８３：８２８３〜８２８７，１９８６）から得られるＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントから成る。ＲＳＶプロモーターは、ＧＨ細胞の他に他の細胞系において有用である利点を有し、そしてＧＨプロモーターは、ＧＨ細胞において活性的であることが知られており、そして特異的に誘発され得る（Ｂｒｅｎｔなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７８〜１８２，１９８９）。ラット成長ホルモンプロモーター及びＲＳＶプロモーターは、別々の構造体において位置Ｆで挿入され得る。
【００５８】
ＧＨ細胞系中への上記構造体のトランスフェクションの後、その細胞はＧ４１８を含む培地中で増殖され得る。これは、相同的組換え又はランダム組込みのいづれかによりゲノム中にプラスミドＤＮＡを組込まれたそれらの細胞のみの増殖を可能にするであろう。生存細胞は、ガンシクロバーを含む培地中で増殖され得る。この回の選択を生存する細胞の大部分は、ペクタープラスミドＤＮＡが相同的組換えにより組込まれているものであろう。これらの細胞は、それらがＴＳＨβ遺伝子に対応するｍＲＮＡを生成し、そしてそれらがＴＳＨβタンパク質を生成することを示すためにスクリーンされ得る。ゲノムＤＮＡはまた、適切な組換え出来事が生じたかを確めるために異種プロモーターの挿入の部分近くを配列決定され得る。
【００５９】
【実施例】
例−ラット脳下垂体細胞におけるＴＳＨβ遺伝子の活性化
次の手段を用いて、ラットＧＨ3 脳下垂体細胞系においては通常存在しないチロトロピンβサブユニット（ＴＳＨβ）遺伝子転写を、相同的組換えの方法を用いることによってそれらの細胞中で活性化し、ＴＳＨβコード領域の上流の活性化要素の標的を決定した。ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターは、ＧＨ3 細胞において効果的に機能することが知られており（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｎｅｌｓｏｎなど、Ｎａｔｕｒｅ，３２２：５５７〜５６２（１９８６）；Ｚｈｅｎｇ−Ｓｈｅｎｇ Ｙｅなど、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｏｍｉｓｔｒｙ，２６３：７８２１〜７８２９（１９８８））、そして従って、活性化要素として選択された。トランスフェクトされた細胞集団の単離のために、ＲＳＶ活性化要素、ＴＳＨβ遺伝子座の５′フランキング領域の部分及び選択可能な薬物マーカー、たとえばアミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を含むプラスミドベクターを構成した。リボ核酸（ＲＮＡ）を、プールされた耐薬物性ＧＨ3 細胞集団から抽出し、そして相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に転換した。次に、そのｃＤＮＡを、ＴＳＨβ ｃＤＮＡの存在について、ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の技法によりスクリーンした。相同的組換えベクター及び制御ベクターの構成は、実験方法及び結果と共に、下記に概略されている。
プラスミド構成
相同的組換え（ＨＲ）バックボーンベクター（ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ）
ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターを、機能的なプロモーター単位を含む５８０塩基対（bp）のＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを単離することによって、プラスミドｐＲＳＶＣＡＴ（Ｇｏｒｎｅｌｉａ Ｍ．Ｇｏｒｍａｎなど．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７９：６７７７〜６７８１（１９８２）（第５図）から誘導した。このフラグメントの末端を、ＤＮＡポリマラーゼＩクレノウフラグメントを用いてブラント化し、そしてＸｂａＩリンカーをそのブラント末端に連結した。ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化及びゲル精製の後、得られたフラグメントをＰＵＣ１８のＸｂａＩ部位中に連結した。第６図に示される配向でＲＳＶ挿入体を有するプラスミドを含む細菌コロニーを、ｐＲＳＶと命名した。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を、ＢｇｌII及びＢａｍＨＩフラグメント（第７図）を単離し、そしてそのフラグメントをｐＲＳＶのＢａｍＨＩ部位（第６図）中に連結することによって、ｐＳＶ２ＮＥＯ（Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｍなど．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：３２７〜３４１（１９８２））からクローン化した。第８図に示される配向でＮＥＯ遺伝子を含むプラスミドを取り出し、そしてｐＲＳＶＮＥＯＢＡＭと命名した。そのｐＲＳＶＮＥＯＢＡＭを、ＳｍａＩにより消化し、そしてＲＳＶプロモーター領域、ＮＥＯ遺伝子の大部分及びｐＵＣ１８を含む４３２８bpのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離した。このフラグメントのＳｍａＩ末端にＸｈｏＩを連結し、ＸｈｏＩ制限酵素により切断し、そしてそのプラスミドを連結により再環状化した。得られたプラスミドは第９図に示され、そしてｐＲＳＶＮＥＯと命名される。この最後のクローニング段階は、その機能的な発現のためには必要でないＮＥＯフラグメントの３′末端から７８６bpのフラグメントの欠失をもたらした。この構成は、ＮＥＯ遺伝子がＲＳＶプロモーターにより転写的に駆動されるプラスミドを生成する。
【００６０】
次に、ｐＲＳＶＣＡＴ（第５図）におけるＲＳＶプロモーターの５′に位置するＮｄｅＩ部位を、ＳａｌＩ部位に転換した。これは、ＮｄｅＩによりｐＲＳＶＣＡＴを消化し、ＤＮＡポリマラーゼＩクレノウフラグメントを用いてそれらの末端をフィルインし、そして得られたブラント末端にＳａｌＩリンカーを連結することによって達成された。リンカーを、ＳａｌＩにより完全に消化し、そしてそのプラスミドを連結により再環状化した。新しく構成されたＳａｌＩ部位中に、ＲＳＶプロモーター及びＮＥＯ遺伝子を含むｐＲＳＶＮＥＯ（第９図）からのＳａｌＩ−ＸｈｏＩフラグメントをクローン化した。第１０図に示されるように配向されたＲＳＶプロモーター及びＮＥＯフラグメントを有するプラスミドを単離し、そしてｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯと命名した。このプラスミドは、ＧＨ3 細胞中にトランスフェクトされる場合、それらの細胞に耐Ｇ４１８性を付与することができ、ＮＥＯ遺伝子の転写を駆動するＲＳＶプロモーターの能力及び機能的タンパク質中に翻訳されるそのＲＮＡの能力を示す（データは示されていない）。上記安定したトランスフェクタントからの全体のＲＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により分析し、ＣＡＴ遺伝子が転写されたかどうかを決定した。ＰＣＲ結果は、ＣＡＴ遺伝子が試験される耐Ｇ４１８性コロニーのすべてにおいて実際に転写されたことを示し（データは示されていない）、ＣＡＴ遺伝子のＲＳＶプロモータ５′がそれに対して３′仍りに位置する遺伝子の転写を駆動することができたことを示した。これは、このＲＳＶプロモーターが、下記ＴＳＨβＨＲベクターが相同的組換によりＧＨ3 ゲノム中に組込む場合、そのＴＳＨβ遺伝子の転写の駆動を担当するであろうから重要である。
ＴＳＨβ ＨＲベクター
相同的組換えによりＧＨ3 ゲノム中に組込むことができるベクターを、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（第１０図）に含まれるユニークＳａｌＩ及びＨｉｎｄ III部位中にチロトロピンβサブユニット（ＴＳＨβ）遺伝子の５′フランキング領域の２種の拡張部を挿入することによって創造した。λＤＡＳＨ中にクローン化された１５kb又はそれ以上の挿入体を含むラット脾臓ゲノムライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得た。標準方法（Ｃｕｒｐｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１．９．１−１．１３．６，６．１．１−６．４．１０）を用いて、第１エキソンの９kbの配列５′を含むラットゲノムＴＳＨβ遺伝子の１５．３kbクローンを単離した。その１５．３kbのフラグメントは、２種のＸｂａＩフラグメント、すなわち１５．３kbフラグメントの５′末端に対応する１０．６kbのフラグメント及び１５．３kbフラグメントの３′領域に対応する４．７kb断片から成った（第１１図）これらのＸｂａＩフラグメントの両者を、ＰＵＣ１８中にサブクローンし、そして両配向で挿入体を含むプラスミドを単離した。４．７kbのＸｂａＩフラグメント（第１１図）に含まれる２．３kbのＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを精製し、そしてこのフラグメントのＸｂａＩ部位を、クレノウフラグメントによりそれらの末端をフィルインし、そしてＨｉｎｄ IIIリンカー上で連結することによってＨｉｎｄ III部位に転換した。このフラグメントを、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（第１０図）に含まれるユニークＨｉｎｄ III部位中に連結した。第１２図に示されるような正しい配向で２．３kbの挿入体を有するプラスミドに対応する単離体を、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３と命名した。
【００６１】
ラットＴＳＨβ細胞からのサブクローンされた１０．６kbのＸｂａＩフラグメント（第１１図）を単離し、そしてＸｂａＩ末端を、そのフラグメントをＤＮＡポリマラーゼＩクレノウフラグメントによりブラント末端化し、そしてＳａｌＩリンカーを結合することによってＳａｌＩ部位に転換した。次に、この１０．６kbのＳａｌＩフラグメントを、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３のＳａｌＩ部位中にクローン化した（第１２図）。正しい配向でその挿入体を含むプラスミドを同定し、そしてｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（第１３図）と命名した。後者のプラスミドを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃａｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託し、そして寄託番号ＡＴＣＣ ４０９３３号を得た。この寄託のために、前記プラスミドをｐＨＲＴＳＨと命名した。この寄託は、ブタペスト条約のすべての必要条件に従って行なわれた。
細胞系
ＧＨ3 細胞は、放射線誘発されたラットの脳下垂体腫瘍に由来し（Ｂ．Ｋ．Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：９１７（１９６２））、そしてＴａｓｈｊｉａｎなど．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，８２：３４２〜３５２（１９６８）により培養増殖するように適合されたＭｔＴ／Ｗ５のサブクローンされた集団である。ＧＨ3 細胞をＡＴＣＣ細胞バンクから得、そしてダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１５％・馬血清（ＨＳ）＋２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％Ｌ−グルタミン（ＧＨ3 培地）中で３７℃で５％ＣＯ2 において増殖することによって培養維持する。
ＤＮＡ調製
プラスミドＤＮＡの大規模調製
安定したトランスフェクションのために使用されるすべてのプラスミドを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．１．７．１−１．７．２に記載されるように大規模なプラスミドＤＮＡ精製のためにアルカリ溶解方法を用いて精製した。そのアルカリ溶解方法により単離されたＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．１．７．５−１．７．７に記載されるように塩化セシウムグラジエントでの二重バンディング（ｄｏｒｉｂｌｅ ｂａｎｄｉｎｇ）によりさらに精製した。
【００６２】
トランスフェクションの前、ＨＲベクターを、ＡａｔII又はＡｐａＩのいづれかにより消化した。ＡｐａＩを用いて、対照のプラスミドｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯを線状化し、そしてＡａｔIIを用いて、ＨＲプラスミドｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩを線状化した。ＡｐａＩ及びＡａｔIIの切断部位の位置は、それぞれ第１０及び１３図に見出され得る。適切な制限酵素による消化の後、その反応をフェノールクロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿化し、そして７０％エタノールにより１度洗浄した。次に、プラスミドを、脱イオン水（ｄＨ2 Ｏ）に再懸濁し、ＯＤ260 での吸光度により測定される場合、１μｇ／μｌの濃度にした。トランスフェクション効率及び／又は相同的組換え陽性：ランダム組込みによる陽性の比を高めるために、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩをＡｐａＩにより消化した。ＡｐａＩによる消化は、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩにおいて３種の別々の部位で切断し、そして相同的組換えのために必要なものを除く、すべてのベクター領域を除去する（第１３図）。ＡｐａＩによる消化の後、その反応を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてＴＳＨβ遺伝子の２つの５′フランキング領域、ＲＳＶプロモーター−ＮＥＯ領域及びＴＳＨβ遺伝子−活性化ＲＳＶプロモーターを含む１０，９９２bpのフラグメントに対応する上部バンドを、透析管への電気溶出によりゲルから単離した。電気溶出されたＤＮＡを、製造業者の標準の方法により、ｅｌｕｔｉｐ ｍｉｎｉｃｏｌａｍｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いることによってさらに精製した。ＤＮＡを、そのカラムから溶出し、エタノール沈殿し、７０％エタノールにより洗浄し、そして再懸濁し、１μｇ／μｌの濃度にした。
安定トランスフェクション
リン酸カルシウムトランスフェクション
トランスフェクションの４８時間前、３×１０6 個のＧＨ3 細胞を、１０cmの皿上にプレートした。個々の皿のために、ベクターＤＮＡ１０μｇ及び音波処理されたサケ精子ＤＮＡ３０μｇを、トランスフェクション緩衝液０．５mlに添加した。トランスフェクション緩衝液は、ＮａＣｌ４ｇ，ｋｃｌ０．１８ｇ，０．０５ｇのＮａ2 ＨＰＯ4 、デキストロース０．５ｇ，ＨＥＤＥＳ２．５ｇをｄＨ2 Ｏと共に組合して５００mlの最終体積にし、そしてそのpHを７．５にすることによって調製された。３１μｌの２ＭのＣａＣｌ2 を、ＤＮＡ０．５ml＋トランスフェクション緩衝液に添加し、そして攪拌した。この溶液を、室温で４５分間静置した。ＤＮＡ−ＣａＣｌ2 −トランスフェクション緩衝液が準備された後、ＧＨ3 培地をＧＨ3 細胞から除き、そしてＤＮＡ−ＣａＣｌ2 −トランスフェクション緩衝液を細胞上に被覆した。細胞を室温で２０分間静置した。２０分後、５mlのＧＨ3 培地を添加し、そしてプレートを３７℃で６時間インキュベートした。次に、培地をアスピレートし、そして１５％グリセロールを含む新鮮なトランスフェクション緩衝液５mlを３．５分間にわたって添加することによってショックをその細胞に与えた。細胞をＰＢＳにより２回すすぎ、そしてＧＨ3 培地１０mlを供給した。トランスフェクションの４８時間後、培地を除き、そして４００μｇ／mlのＧ４１８を含むＧＨ3 培地１０mlを添加した。
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションを、３．５mmのギャップの電極を有するＢＴＸ３００Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒを用いて行なった。対数相で増殖する１×１０7 個のＧＨ3 細胞を、トリプシン処理によりそれらのプレートから除去し、遠心分離によりペレット化し、そしてＰＢＳにより１度洗浄した。細胞を、ＰＢＳ１．０mlに再懸濁し、そして氷上２．９mlのＵｌｔｒａ−ＵＶ使い捨てキュベット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に移した。ＤＮＡ１０μｇを細胞に添加し、混合し、そして氷上に５分間戻した。５分後、電極をチャンバーに配置し、そして細胞を、７５０μファラド及び２００Ｖのパルスの設定下でエレクトロポレートした。そのキュベットを１０分間氷上に戻した。細胞を、１５mlの円錐形管において室温で１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを含むＧＨ3 培地９mlに前記キュベットから移した。１×１０7 個の細胞の全体のエレクトロポレーションを、３個の１０cmプレートに移し、約３×１０6 個の細胞／プレートを付与した。４８時間後、４００μｇ／mlのＧ４１８を含むＧＨ3 培地を添加した。
ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（Ａａｔ II 切断）、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）及びｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（ＡｐａＩ切断）によるＧＨ 3 細胞のトランスフェクション
ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡａｔII切断）、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）及びｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（ＡｐａＩ切断）プラスミドを、リン酸カルシウム法及びエレクトロポレーション法の両者を用いて、ＤＮＡ対照と共にＧＨ3 細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＧ４１８選択下に置いた。約１４〜２１日後、コロニーは１０cmの皿上で眼により見えるようになり、そして計数した。ＤＮＡ対照のすべてにおいては、眼に見えるコロニーは存在せず、これは、Ｇ４１８選択が作用し、そしてＲＳＶ−ＮＥＯ領域を含むプラスミドの存在がＧ４１８耐性を付与するために必要であることを示す。この時点で、コロニーを取り、そして１７mmの幅のクローニング環を有する１０cmの皿上の領域を単離することによってプールした。これらの大きなクローニング環は、プレート当たりのコロニーの密度に依存して１０〜７０個のコロニーを包含し、そしてその単離された領域におけるＧＨ3 細胞の除去を可能にし、そして同時に、トリプシン処理によりプールした。個々の環におけるトリプシン処理されたコロニーを、６ウェルプレートに移し、そしてＧ４１８を含むＧＨ3 培地での増殖を可能にした。７０％〜８０％の集密性に達した後、８０，０００個の細胞を２４ウェルプレートに移し、そして残る細胞を後でさらに試験するために凍結保存した。２４ウェルプレートにおける細胞を、それらが５０％〜８０％の集密性に達するまで増殖せしめた。次に、全体のＲＮＡをそれらのＧＨ3 細胞から次の方法により収穫した。
２４ウェルプレートにおいて増殖されたトランスフェクトされたＧＨ3 細胞からのＲＮＡ単離
次の方法は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６〜１５９（１９８７）により記載される方法の改良である。２４ウェルプレートにおけるＧＨ3 細胞を被覆する培地を除去し、そして細胞をＰＢＳ１mlにより洗浄した。ＧＴＣ溶液１mlを添加し、そして細胞を室温で５分間インキュベートした。ＧＴＣ溶液を、ｄＨ2 Ｏ２９３mlにグアニジウムチオシアネート（Ｆｌａｋａ）２５０ｇを溶解し、そして次に０．７５μのクエン酸ナトリウム（pH７．０）１７．６ml及び１０％のサルコシル（Ｌ−ラウリルサルコシン）２６．４mlを添加することによって調製した。使用のすぐ前、ＧＴＣ溶液５０ml当たりβ−メルカプトエタノール３６０μｌを添加した。室温で５分後、ＧＴＣ−細胞溶解物１mlを、ＧＴＣ溶液２mlを含むＳａｒｓｔｅｄｔ５５．５１８スナップ−キャップ管に移した。個々の管に、２μの酢酸ナトリウム（pH４．０）３００μｌを添加し、そしてその管を攪拌した。次に、ｄＨ2 Ｏ飽和フェノール３mlを添加し、そして再びその管を攪拌した。個々の管に、クロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）溶液６００μｌを添加し、そして管を手により１０秒間、振り、そして氷上に１５分間置いた。次に、管を、４℃で２０分間、８０００回転／分（ＲＰＭ）でＳＭ２４ローターを用いてＳｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ中において遠心分離した。水性相を、イソプロパノール３mlを含む新しいＳａｒｓｔｅｄｔ管に移し、そして−２０℃で１時間置いた。１時間後、管を、４℃で２０分間、８０００rpm でＳＭ２４ローターを用いてＳｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ中で回転せしめた。上清液を除去し、そしてペレットをＧＴＣ溶液５００μｌに再懸濁した。再懸濁されたＲＮＡを、１．５mlのエペンドーフ（ｅｐｐｅｎ ｄｏｒｆ）管に移し、それにイソプロパノール５００μｌを添加した。その管を、もう１度−２０℃で１時間静置した。エペンドーフ管をマイクロフュージ中で５分間回転せしめ、そして上清液を除去した。ペレットを７０％エタノールにより２度洗浄し、そしてエタノールが完全に蒸発するまで乾燥せしめた。ペレットを、水により処理されたジエチルピロカーボネート（ｃｌｅｐｃ）２０μｌに再懸濁し、そして６５℃で５分間加熱した。次にこのＲＮＡを用いて、下記２種の方法の１つでｃＤＮＡを製造した。
ｃＤＮＡ反応方法１
第１鎖ｃＤＮＡを、１０〜２０μｌの反応体積中、合計ＲＮＡ（約０．５〜６μｇ）２．５〜６．０μｌから合成した。合計ＲＮＡを、上記抽出方法により得、そして７０℃で５〜１０分間変性せしめ、そして反応成分を添加する前、氷上ですばやく急冷せしめた。その反応条件は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH８．３），１０ｍＭのＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭのＤＴＴ，０．５ｍＭの個々のｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），４０ｍＭのｋｃｌ，５００単位／mlのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），８５μｇ／mlのオリゴ（ｄＴ）１２−１８（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）及び３７℃で６０分間インキュベートされた１５，０００〜２０，０００単位／mlのＭｏｌｏｎｙネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。反応を、４０ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより停止し、そして核酸を、０．３Ｍの濃度の酢酸ナトリウム及び２体積のエタノールを添加することにより沈澱せしめた。沈澱物を０℃で３０分間形成せしめ、そして１４，０００rpm で３０分間、ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中においての遠心分離によりペレット化した。ペレットを７０％エタノールにより洗浄し、乾燥せしめ、そして１５〜２５μｌの体積のｄｅｐｃ処理された水に再懸濁した。
方法２
ＲＮＡからのｃＤＮＡの第１鎖の合成のための条件は、Ｃａｒｏｌ Ａ．Ｂｒｅｎｎｅｒなど、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第７巻、第１０号、１０９６〜１１０３ページ（１９８９）から適合せしめられた。上記方法により調製されたＲＮＡからの合計ＲＮＡ１μｌを、０．５mlのエペンドーフ管中における反応緩衝液９μｌに添加した。その反応緩衝液は、２００単位のＭｏｌｏｎｅネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶＲＴ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）及び次の試薬の最終濃度から成る：７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，pH８．８，４０ｍＭのｋｃｌ，０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭの個々のｄＮＴＰ，４ｍＭのＭｇＣｌ2 及び０．４５ＵＤ260 単位のランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。混合の後、管を室温で１０分間インキュベートし、そして次に、４２℃で１時間置いた。１時間後、管を９０℃で１分間加熱し、ＭＭＬＶＲＴを不活性化し、そして次に室温に冷却した。
ＧＨ3 細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅
次のプライマーを用いて、相同的組換えにより内因性ＴＳＨβ遺伝子を活性化するＨＲプラスミドの結果としてＧＨ3 細胞により生成されたＲＮＡ転写物から合成されたＴＳＨβｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅した。
【００６３】
プライマー ５′ ３′
TSHβ5 AGTATATGATGTACGTGGACAGG
TSHβ3 CACTTGCCACACTTGCAGCTCAGG
第１４図は、個々のプライマーが応答するＴＳＨβ遺伝子の領域を示す。
ＰＣＲ反応条件
すべてのＰＣＲ反応を、Ｅｒｉｃｏｍｐ Ｔｗｉｎｂｌｏｃｋ熱サイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅａｒ）で行なった。ＰＣＲ増幅が方法２により製造されるｃＤＮＡに対して行なわれる場合、４０μｌの追加の反応ミックスを、ｃＤＮＡ反応物１０μｌに添加し、合計体積を５０μｌまでにした。その５０μｌにおける試薬の最終濃度は、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH８．８），４０ｍＭのＫｃｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２．２５単位のＴａｑポリマラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），０．２μＭの個々のプライマー、２００μＭの個々のｄＮＴＰ及び０．８ｍＭのＭｇｃｌ2 であった。
【００６４】
ＰＣＲが上記方法１により製造されるｃＤＮＡに対して行なわれる場合、再懸濁されたｃＤＮＡ５〜１０μｌを、次の最終濃度の成分を含む反応ミックス４０〜４５μｌに添加した：７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，pH８．８，４０ｍＭのＫＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２．２５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．２μＭの個々のプライマー、２００μＭの個々のｄＮＴＰ及び０．８ｍＭのＭｇｃｌ2 。
【００６５】
次に反応を次のＰＣＲサイクルにゆだねた。
【００６６】
９４℃で１分間、
５５℃で３０秒間、
７２℃で２分間。
【００６７】
上記サイクルを３０〜４０回くり返した。１０μｌの個々の反応ミックスを、６％ポリアクリルアミドゲルにかけ、そしてＴＳＨβのための適切にスプライスされたｍＲＮＡの存在を示す２４７bpのＰＣＲフラグメントの存在についてスクリーンした。
ＧＨ3 細胞及びラット下垂体の合計ＲＮＡからのＴＳＨβＲＮＡの増幅のためのＰＣＲ結果
ＧＨ3 細胞が通常ＴＳＨβ ＲＮＡを合成するかどうかを決定するために、トランスフェクトされていないＧＨ3 細胞からのｃＤＮＡ及びラット下垂体からのｃＤＮＡを、上記ＰＣＲ反応条件にゆだねた。ＴＳＨβ ｍＲＮＡの存在を示す正しい２４７bpのバンドがラット下垂体サンプルの正の対照に見出されたが、しかし６０サイクルの後でさえ、ＧＨ3 細胞からの合計ＲＮＡサンプルからはバンドは見出されなかった（データは示されていない）。
トランスフェクション結果
１０cmの皿上に存在するＧ４１８耐正コロニーの数を、培地にＧ４１８の添加後１４〜２１日間にわたって表化した。
全体のＲＮＡを、上記のようにして２４ウェルプレートに含まれるコロニープールから収穫した。ｃＤＮＡを、これらのＲＮＡ調製物から製造し、そしてＰＣＲ増幅にゆだねた。ＴＳＨβ ｍＲＮＡを生成する正のコロニーの数を、ポリアクリルアミドゲル上で可視化されるような２４７bpのフラグメントの存在により決定した。スクリーンされた個々のプールから、１０〜７０個のコロニーを得た。推定されるコロニーの数／プール／トランスフェクションを用いて、ＴＳＨβ遺伝子転写が活性化されているＧ４１８耐性ＧＨ3 細胞クリーンの数を評価した。プールが陽性であると試験された場合、それは、その特定のプールに存在する１つの陽性コロニーを表わすことが推定された。
プラスミド G418 耐性コロニー TSH β RNA 陽性
PRSVCATNEO 60 0
PRSVCATNEOTSHB3-5XBA1 4942 3
(Aat2 消化された)
PRSVCATNEOTSHB3-5XBA1 8580 6
(Apa1 消化された)
これらの結果は、本発明の方法による通常転写的に不活性なＴＳＨβ遺伝子の好都合な活性化を示す。ＴＳＨβ転写のために陽性であるコロニーの数は、Ｇ４１８耐性であるコロニーの数に比較して少数であるが（１０3 個のＧ４１８耐性コロニー当たり約１個）、この結果は一般的に、他の相同的組換え実験のために報告される速度と一致する（Michael Kriegler, Gene Transfer and Expression A Loboratory Manual, Stockton Press, New York, NY(1990), 56〜60ページ）。相同的組換え速度は、標的決定された遺伝子の転写の割合に比例すると思われることが一般的に観察された（M.Frohmanand G.Martin, Cell, 56 : 145 (1989); S.L.Mansourなど、Nature, 336 : 348 (1988)) 。示された速度は、ＴＳＨβ遺伝子に対して生じるランダム変異のために予測される速度よりも３桁程度早いことが注目されるべきである。
【００６８】
個々のコロニープールについての結果が再生可能であり、そしてＲＮＡ転写の活性化が安定していることを確かめるために、第１回のスクリーニングで陽であると試験されたプールに対応する前もって凍結されたコロニープールを融解し、そして培養により拡張した。新しく融解されたＧＨ3 陽性プールを、Ｔ２５組織培養フラスコに接種し、そして細胞が７０％〜８０％の集密性に達するまで拡張した。次に、８０，０００個の細胞を、個々のフラスコからの２４ウェルプレートにプレートし、そしてそれらが５０〜７０％の集密性に達するまで増殖せしめた。ＲＮＡを、細胞から抽出し、ｃＤＮＡに転換し、そして６％ポリアクリルアミドゲル上に個々のＰＣＲ反応物１０μｌを負荷することによってＴＳＨβ ＲＮＡの存在についてもう１度スクリーンした。第１５図は、エチジウムブロミド染色及び蛍光によりポリアクリルアミドゲル上で可視化される場合の第２スクリーンからの代表的なＰＣＲ反応の結果を示す。レーン１，２及び３は、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯによりトランスフェクトされたＧＨ3 細胞からのｃＤＮＡに対して行なわれたＰＣＲ反応物を含む。ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯはＴＳＨβに相同の領域を含まず、そして従って、相同的組換えによりＴＳＨβ遺伝子を活性化することはできない。第１５図におけるゲル上に見出されるように、ＴＳＨβ遺伝子が活性化されないことを示すそれらのレーンにおける２４７bpに対応するバンドは存在しない。レーン６はまた、負の対照を含む。そのレーンにおいては、３種のプールが、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）によりトランスフェクトされているが、しかし第１スクリーニングに基づくＴＳＨβ遺伝子の転写のためには陰性であるＧＨ3 細胞のサンプルから組合された。レーン６における２４７bpのフラグメントの不在は、ゲノム中にランダムに組込まれたトランスフェクトされたｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）プラスミドの存在が２４７bpのＴＳＨβ ＰＣＲフラグメントを生成することができないことを示す。レーン７，８，９及び１０は、ラット下垂体から収穫された合計ＲＮＡから製造されたｃＤＮＡに対して行なわれたＰＣＲ反応物を、それぞれ反応当たり２５ng，１００ng, ２００ng及び４００ngの量で含む。通常ＴＳＨβを発現するラット組織から調製されたｃＤＮＡから生成された、予測される２４７bpのバンドのこれらのレーンにおける存在は、ＰＣＲ反応条件が正しく最適化され、そして相同的組換えＴＳＨβ陽性を含むレーン４及び５に得られるＰＣＲバンドが正しい大きさのものであることを示した。第１スクリーンにおいて陽性であるｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）によりトランスフェクトされた２種のプール、すなわちレーン４におけるＡｐａＩ−１０７及びレーン５におけるＡｐａＩ−１３６は、ＴＳＨβ遺伝子の転写が安定して活性化されたことを示すそれらのプールからの合計のＲＮＡ抽出物から製造されたｃＤＮＡから増幅された正しいＴＳＨβ ＰＣＲバンドの存在により示されるように、ＴＳＨβ遺伝子活性化のために陽性であることを再び示した。前の陽性ＡｐａＩ−１０７及びＡｐａＩ−１３６からのＲＮＡを含むレーン４及び５における２４７bpでのバンドの存在及びレーン１〜３におけるｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯトランスフェクトされたＧＨ3 細胞の負の対照及びレーン６におけるｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ−３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）トランスフェクトされた負の対照におけるバンドの不在は、前記ＲＮＡを通常生成しない細胞系におけるＴＳＨβ ＲＮＡの生成が相同的組換えにより安定して開始されたことを示した。
【００６９】
本発明は、本明細書に記載される細胞系に限定されない。すべての細胞系は、通常不活性である遺伝子情報を有する。ほとんどは、一定の遺伝子のみを発現することができる。しかしながら、そのうよないづれかの細胞系の通常転写的に不活性な遺伝子は本発明に従って遺伝子生成物を発現するために活性化され得、そしてゲノム中のいづれかの遺伝子は、本発明に従って変性されたその発現特徴を有する。前の形質転換が対象の遺伝子を破壊しない限り、前もって形質転換された細胞系が使用され得る。細胞系の源は重要でない。その細胞系は、動物又は植物系であり得、連続的又は不滅的であり得る。もちろん、そのような細胞系は、本発明の技法による処理の後、発現が商業化され得るように安定し且つ不滅的であることが所望される。クローンされた微生物は、真核又は原核生物のいづれであっても、また本発明の技法により処理され得る。
【００７０】
本発明は好ましくは、通常転写的に不活性な遺伝子の発現に関して記載されて来たが、本発明の技法はまた、宿主細胞系に天然において発現される遺伝子の発現特徴の変性に適用できる。たとえば、発現が意志により開始され、そして停止されるように、遺伝子の発現を培養条件又は同様のものに対して依存性にすることが所望される場合、抑制能力又は誘発能力のような特徴を付与する適切なＤＮＡ調節セグメント、たとえば調節可能プロモーターが挿入され得る。たとえば、細胞型が核ステロイド受容体、たとえばエストロゲン、テストステロン又はグルココルチコイド、又はチロキシン受容体を含むことが知られている場合、領域Ｆとしてステロイド又はチロキシン応答要素を使用することができる。そのような応答要素は、転写に対する正の応答を誘発するためにそのような受容体に結合するいづれかのＤＮＡである。たとえ細胞がグルココルチコイドに天然において応答しない場合でさえ、グルココルチコイド受容体をコードするＤＮＡの断片が、グルココルチコイドに対して応答性の細胞を製造するために、構造体に付加され、又はゲノムのどこかに挿入され得る。調節可能なプロモーターの使用が、対象の遺伝子が通常転写的に不活性であろうとなかろうと所望される。他の種類の調節がまた、本発明の方法により対象の正確な位置に適切なＤＮＡ調節セグメントを標的決定することによって得られる。
【００７１】
従って、通常転写的に不活性な遺伝子の発現の刺激は本発明の好ましい適用であるが、その広い意味において、それは宿主細胞系に対して内因性のいづれかの遺伝子の発現特徴の変性に適用できる。
【００７２】
相同的組換えの特定技法は、それ自体、本発明の新規部分ではない。そのような技法は知られており、そして当業者は、そのような技法が、対象の遺伝子に関して所望する位置にＤＮＡ調節配列の標的決定を可能にする限り、本発明に使用され得ることを理解するであろう。好ましい技法が、挿入されるべき配列のいづれかの末端上に２つの相同領域を有する線状化された構造体を用いて開示されているが、たとえば環状構造体を用いることによって、この機能を達成するであろういづれか他の技法もまた、本発明により包含される。本発明の臨界特徴は、細胞系のゲノムにおける遺伝子、好ましくは通常転写的に不活性な遺伝子により操作的に結合された、使用される細胞系又は微生物における発現特徴の変性を引き起こすＤＮＡ調節配列を挿入するために、又は増幅可能な配列の変性に基づいてそのような遺伝子の増幅を引き起こすためにすでに転写している細胞系のゲノムにおける遺伝子の十分に近くに、調節配列を伴わないで、増幅可能な配列を挿入するためへの相同的組換え技法の使用である。選択可能マーカーがまた包含されることは絶対的に必要なものではない。選択は、ＤＮＡ構造体の挿入に続く培地又は細胞における対象の遺伝子生成物又はｍＲＮＡの検出のみに基づかれている。さらに、調節配列が挿入される態様においては、所望には、増幅は操作能力のために臨界ではない。同じことが、スクリーニング工程を容易にする負の選択遺伝子のために真であるが、しかし本発明の成功のためには臨界でない。従って、基本的な態様は、所望する特定の位置にＤＮＡ調節セグメント又は増幅可能なセグメントの挿入のみを必要とする。しかしながら、調節セグメントが付加されている態様での増幅可能な遺伝子の付加のように、選択技法に使用するために正及び／又は負の選択可能マーカー遺伝子の付加が好ましい。
【００７３】
本明細書及び請求の範囲を通して使用される用語“発現の変性”とは、対象の生成物の発現を阻止するために、相同的組換えにより、対象の遺伝子中に変異、欠失、停止コドン又は他のヌクレオチド配列、たとえば全体の遺伝子を挿入することによって発現の終結を除外するように定義される。従来の技術は、特異的変異を導入するために相同的組換えの使用を教授し、そして細胞生成物の発現は、その手段により本質的に停止せしめられ得る(たとえばＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇなど、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８７：３２１０〜３２１４（１９９０）を参照のこと）。本発明は、そのような方法を包含しない。本発明においては、“発現の変性”は、相同的組換えにより特定の所望する位置で調節及び／又は増幅領域を挿入することによって達成される。好ましい変性は、対象の生成物の発現を活性化し、そして／又は増強する変性である。
【００７４】
本明細書は、ＤＮＡ調節セグメントが遺伝子“により操作的に結合される”という句を使用する場合、そのような用語は、ＤＮＡ調節セグメントが、そのような遺伝子の転写がそのＤＮＡ調節セグメントにより調節されるように対象の遺伝子に関して配置されることを意味する。調節セグメントは好ましくは、遺伝子の上流に存在するが、しかしその遺伝子の下流又はその遺伝子内に存在することができるが、但し、それはある手段において遺伝子の発現を調節するために作用する。ＤＮＡ調節セグメントは、プロモーター、ターミネーター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、アテニュエーター又は同様のもの、又はそれらのいづれかの組合せであり得る。
【００７５】
用語“上流”又は“下流”が本明細書及び請求の範囲に使用される場合、これは対象の遺伝子のコード鎖に対して、それぞれ５′−方向又は３′−方向を意味する。
【００７６】
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。本明細書に使用される誘法及び用語法は、記載の目的であって、限定的ではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、本発明のＤＮＡ構造体の一般的な外形を示す。
【図２】第２Ａ図は、非相同又はランダム組換えの出来事におけるゲノム中へのＤＮＡ構造体の組込みの態様を示す。第２Ｂ図は、相同的組換えの出来事におけるゲノム中へのＤＮＡ構造体の組込みの態様を示す。
【図３】第３図は、本発明に従っての好ましい相同的組換えベクターの構成を示す。
【図４】第４図は、単にＤＮＡの単一の標的断片が使用される場合、相同的組換えによるＤＮＡの環状断片の組込みの態様を示す。
【図５】第５図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴプラスミドを示す。
【図６】第６図は、その制限部位を含むｐＲＳＶプラスミドの構成を示す。
【図７】第７図は、その制限部位を含むｐＳＶ２ＮＥＯプラスミドを示す。
【図８】第８図は、その制限部位を含むｐＳＶＮＥＯＢＡＭプラスミドの構成を示す。
【図９】第９図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＮＥＯプラスミドの構成を示す。
【図１０】第１０図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯプラスミドの構成を示す。
【図１１】第１１図は、ラットＴＳＨβ遺伝子の１５．３kbフラグメント及びその種々の制限セグメントを示す。
【図１２】第１２図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３プラスミドの構成を示す。
【図１３】第１３図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩプラスミドの構成を示す。
【図１４】第１４図は、ＰＣＲ増幅のための個々のプライマーが対応するその領域にそってのＴＳＨβのヌクレオチド配列の一部を示す。エキソン２及び３は大文字で示される。２４７個の塩基対の増幅されたフラグメントは、大線を引かれた星印により示される。
【図１５】第１５図は、種々の細胞集団から抽出されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示し、そしてそのＴＳＨβ ｃＤＮＡは、存在する場合、ＰＣＲにより増幅されている。種々のラインを表わす細胞の性質がゲル下の第１５図に示される。
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム内に天然に存在する遺伝子の発現特徴の変性のための方法に関する。好ましい態様においては、本発明は、安定細胞系内に存在し、そして通常、転写的に静かで又は不活性である遺伝子の活性化及び発現のための方法に関する。結果として、その遺伝子のタンパク質生成物が発現される。この現象は、その生成物をコードするＤＮＡにより細胞をトランスフェクトしないで生じる。むしろ、所望する生成物をコードする常在性遺伝子が、細胞内で同定され、そしていわゆる相同的組換え技法を通して適切な調節セグメントを挿入することによって活性化される。陽性及び／又は陰性選択マーカーがまた、適切な相同的組換え出来事が生じている細胞の選択を助けるために挿入され得る。追加の態様として、特定化された遺伝子は、その遺伝子が通常転写的に静かであり、そして本発明により活性化されているか又は内因的に生成物を発現するかにかかわらず、早められた発現速度のために増幅され得る。
【０００２】
【従来の技術】
生物内の個々の細胞は、その生物内に見出されるすべてのタンパク質をコードする遺伝子情報を含むことが良く知られている。しかしながら、一定細胞型内に存在するひじょうに少数％の遺伝子のみが実際的に転写される。転写されるべき遺伝子配列を調節する細胞内機構が現在理解される。核内に存在する細胞特異的タンパク質は、特定の遺伝子により連結されるＤＮＡ調節セグメントと相互作用する。ＤＮＡ調節配列と核タンパク質とのこの相互作用は、遺伝子転写のために必要とされる。これは、ｍＲＮＡの生合成及びコードされたタンパク質の究極的な発現をもたらす（Ｍｉｔｃｈｅｌｌａｎｄ Ｔｊｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：３７１，１９８９）。
【０００３】
個々の遺伝子のためのこれらのＤＮＡ調節セグメント又は要素は、コード領域から上流に及び多くの場合、コード領域内又はその下流に存在する。細胞特異的核タンパク質との相互作用を通して、ＤＮＡ調節セグメントは、遺伝子の本体に接近し、そしてｍＲＮＡ転写体を合成するためのＲＮＡポリマラーゼの能力、すなわちタンパク質発現における酵素を制限する速度に影響を及ぼす。従って、これらのＤＮＡセグメント及び常在性核タンパク質は、特定遺伝子の発現の調節に臨界的な役割を示す（Ｊｃｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｍｃｋｎｉｇｈｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：７９９，１９８９）。
【０００４】
ＤＮＡ調節セグメントは、核タンパク質のための結合部位である。これらの核タンパク質は、ＤＮＡヘリックスに結合し、そして遺伝子転写を促進する、ＲＮＡポリマラーゼ認識のために利用できる所望する遺伝子を製造するためにその構造を明らかに変える。これらの細胞特異的調節タンパク質の発現は、遺伝子が細胞内で転写され、そしてその速度で発現が生じるであろうことを決定する。このシステムの特異的な例として、たとえ脳下垂体タンパク質のための遺伝子がすべての肝臓細胞内に存在したとしても、脳下垂体細胞（但し、肝臓細胞ではない）は脳下垂体タンパク質を発現する。肝臓細胞の核は、肝臓細胞内に存在する脳下垂体遺伝子の要素と相互作用する特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含まない。
組換えＤＮＡ技法を用いてタンパク質を発現するために使用される現在の方法
特異的ＤＮＡ調節配列が特定細胞型内で遺伝子転写を活性化するために必要とされる知識により、科学者は、遺伝子工学を通して特定の細胞型内に外来性遺伝子を発現して来た。一般的に、細胞の核タンパク質により認識されるＤＮＡ調節セグメントは、発現されるべき外来性遺伝子のコード領域から上流で置換される。この方法においては、細胞中への挿入の後、外来性ＤＮＡは、細胞の核調節タンパク質がこれらのＤＮＡ調節配列を認識するので、発現され得る。この技法は、従来の精製技法により天然源から得又は精製するために困難であったタンパク質を生成するために使用されて来た。
【０００５】
認識できるＤＮＡ配列及び対象の遺伝子の他に、選択可能マーカーがＤＮＡ構造体に結合される。この手段においては、ＤＮＡを摂取した細胞のみが選択培地における培養の後、生存する。たとえば、耐ネオマイシン性のための遺伝子が発現ベクターに含まれ得る。トランスフェクションに続いて、細胞は、Ｇ４１８、すなわち哺乳類細胞に対しては致死的であるネオマイシン抗生物質中で培養される。しかしながら、その細胞が耐ネオマイシン性遺伝子を得たならば、それらは薬物の毒性効果に耐えることができるであろう。この手段においては、トランスフェクトされたＤＮＡを摂取した細胞のみが、培養物中に維持される。いづれかの選択可能マーカーは、それがトランスフェクトされたＤＮＡを摂取した細胞の選択を提供する限り使用され得ることが理解される。細胞内の挿入された遺伝子材料の特異的位置に関しての臨界性は存在しないことがさらに理解される。調節セグメント及び外来性遺伝子（並びに選択可能マーカー）の両者が一緒に挿入される場合、それが核内のいづれかに摂取されることが単に重要である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子発現の現在の方法における欠陥
上記技法は遺伝子工学の力を開発する助けになって来たが、それらは必ずしも遺伝子を発現するのに最っとも効果的な方法ではなかった。これは、細胞系の核中へのＤＮＡの挿入が通常、トランスフェクションとして知られる技法を通して達成される事実による。対象の細胞系における発現のために構築されたＤＮＡが沈澱せしめられ、そして細胞膜が、ＤＮＡの侵入を可能にするために溶解される。上記のようにして、ＤＮＡがゲノム中に組込む正確な部位は決して予測できず；実際、ＤＮＡはエピソーム（ゲノム中に組込まれていない）のまま存続することができる。これは、生成されるタンパク質の発現のレベル及び細胞系の安定性のレベルの非予測性をもたらす。
【０００７】
この技法の第２の欠点は、発現ベクターの構成が、対象の遺伝子が比較的大きい（５〜１０Ｋ塩基以上）場合、ひじょうに困難である事実である。組換えＤＮＡ技法により発現されるタンパク質の多くは、より大きなゲノムクローンよりもむしろｃＤＮＡによりコードされていた。これは、対象の全体の大きさを減ずるために行なわれる。ｃＤＮＡの使用は遺伝子工学をより便利にするが、遺伝子転写及びタンパク質生成の速度が結果として損害を受ける。発現レベルは、時々、ｃＤＮＡ挿入体よりもむしろゲノムの使用によりひじょうに高められることが最近示された（Ｂｒｉｎｓｔｅｒなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８３６〜８４０，１９８８及びＣｈｕｎｇ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：２０７５〜２０８２，１９８９）。この観察を担当する機構は十分に理解されていないが、ある状況下で、イントロン内に存在するエンハンサー要素が遺伝子の転写効能を改良することができることは知られている。イントロン、又はイントロンの存在に起因するスプライシング出来事が、転写の開始に続くＲＮＡプロセッシング出来事に対して効果を有する証拠がまた存在する（Ｂｕｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：４３９５〜４４０５，１９８８）。これは、転写体を安定化し、それによってｍＲＮＡ蓄積の速度を改良する。上記に引用されなＢｒｉｎｓｔｅｒなどの文献においては、遺伝子内のイントロンの位置がプロモーターに対するヌクレオソームの相化のために重要であることがまた仮定される。真核生物の遺伝子の転写に対する種々の調節要素の影響が、Ｋｈｏｕｒｙなど．，Ｃｅｌｌ，３３：３１３〜１４（１９８３），Ｍａｎｉａｔｉｓなど，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：１２３７〜４５（１９８７）及びＭｕｌｌｅｒなど，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７６：４８５〜９５（１９８８）に論ぜられている。
【０００８】
第３に、核中への侵入を得るために、外来性遺伝子の全コード領域を含むトランスフェクトされたＤＮＡは、細胞の透過形質膜を通しての侵入に従って細胞質を横切る。その時間の間、ＤＮＡは、ＤＮＡの統合を変えることができ又は完全に破壊するリソソーム酵素と接触することができる。従って、ＤＮＡのコード領域は、トランスフェクトされた領域と同じではない。
【０００９】
下記遺伝子活性化及び／又は発現変性の新規方法は、所望する遺伝子のコード領域が酵素変性にゆだねられないので、所望するタンパク質の変異形の生成をもたらすことができない。
【００１０】
要約すれば、従来技法を用いての細胞中にトランスフェクトされた多量のＤＮＡ及び特にそのコード領域は、正確に転写されないであろう。それは酵素的に混乱された核中への侵入の前、少化し、その結果、所望する全タンパク質をコードせず又は転写を可能にするすべての必要な調節セグメントを含まない。それは、転写を妨げるゲノムの一部中に挿入され得る。ｃＤＮＡが転写される場合、対象のタンパク質は、エンハンサーを含み、又は効果的なｍＲＮＡのプロセッシングを可能にするイントロンの脱落により効果的に生成され得ない。最後に、それはエピソームのまま存続し、タンパク質生成を促進するが、しかし細胞集団は細胞分裂を通して増殖するので不安定である。
【００１１】
存在する方法の陽性特性を組込んでいるが、しかし興味のない特徴を包含しない細胞系を生成する遺伝子発現の誘発方法を開発することが最っとも所望される。細胞タイプの選択において特定の遺伝子の内因性発現を発現し、又は変性することができることがさらに所望される。適切なヌクレオソーム相化のためにイントロンの適切な置換により又はより効果的なｍＲＮＡプロセッシング出来事により、イントロン内に存在する隠れた転写エンハンサーを含むことができる完全なゲノム配列により付与され得る可能性ある利点を利用するこがさらに所望される。これらの利点は、遺伝子の大きさにより、組換えＤＮＡ発現方法に通常有されない。ゲノムに通常存在する遺伝子、すなわち内因性遺伝子を発現することができる場合、細胞系の安定性及び発現速度はより適合、且つ予測可能になる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
従って、従来技術における上記欠点を排除することが本発明の目的である。
【００１３】
組換え遺伝子技法の陽正特性を組込んでいるが、しかし興味のない特徴を包含しない遺伝子発現の調節及び／又は増幅の方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１４】
細胞系の選択において存在するが、しか通常、転写的には作動しない特定の遺伝子を発現するための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１５】
ｍＲＮＡの蓄積及び／又は転写を担当する完全なゲノム配列の十分な利点を有するタンパク質を発現するための方法を提供することがまた本発明の追加の目的である。
【００１６】
対象の生来の遺伝子の上流、その遺伝子内又はその遺伝子に最っとも近くの安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム中にＤＮＡ調節セグメントを挿入し、そして／又はセグメントを増幅することによって対象の遺伝子の発現特徴を変性するための方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００１７】
安定細胞系又はクローン化された微生物のゲノム内に天然に存在する遺伝子の発現特徴及び同時に、適切に変性された細胞の選択において助力するであろう挿入体特徴を変性するための方法を提供することが本発明の追加の目的である。
【００１８】
対象の遺伝子のコード領域又はエキソン近くに、そこで天然において現われない調節又は増幅セグメントを有するゲノムを提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００１９】
本発明の相同的組換え方法を達成するために使用され得るＤＮＡ構造体を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００２０】
本発明のゲノムを含む細胞系及び微生物を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００２１】
本発明のこれらの及び他の目的が相同的組換え技法により達成され、これにより当業者は、常在性であるが、但し転写的には不活性な遺伝子の発現及び好ましくは増幅を引き起こすことができる。この技法によれば、たとえば発現を条件付き、すなわち抑制可能又は誘発可能にするために、又は発現の速度を早めるために、安定細胞系のゲノムで天然に存在するが、しかし必ずしも不活性でない遺伝子の発現特徴をだれでも変性することができる。
【００２２】
本発明は、細胞系又は微生物のゲノム内での遺伝子の発現特徴を変性するための方法を提供する。ＤＮＡ構造体は、相同的組換えの技法によりそのゲノム中に挿入される。その構造体は、宿主細胞系又は微生物内で操作可能的に結合されるいづれかの遺伝子の発現特徴を変性することができるＤＮＡ調節セグメント、及び挿入されるべきＤＮＡ調節セグメントのために所望されるゲノムの領域に相同の標的セグメントを含む。構成及び挿入技法は、新規ＤＮＡ調節セグメントの、対象の遺伝子への操作的結合を引き起こすために企画される。従って、いづれか新規のコードエキソンを必ずしも挿入しなければ、その遺伝子の発現特徴は変性される。好ましい態様においては、その遺伝子は、宿主細胞系又は微生物内で通常転写的に静かであり又は不活性である遺伝子であり、そして相同的組換えによりその遺伝子に関して適切な位置に直接的に目標を決定されるＤＮＡ調節領域により、その遺伝子はその遺伝子生成物の発現のために活性化される。
【００２３】
ＤＮＡ構造体は好ましくは、ゲノム中に挿入されるそれらの要素により構造体においてお互いから分離されるが、好ましくは生来の遺伝子に隣接する２つの標的セグメントを含む。
【００２４】
構造体はさらに好ましくは、少なくとも１種の発現可能な選択可能マーカー遺伝子、たとえば耐ネオマイシン性を付与する遺伝子を含む。そのためのプロモーターを含むこのマーカー遺伝子はまた、構造体の２種の標的領域間に配置される。
【００２５】
もう１つの態様において、構造体は、対象の遺伝子の発現を増幅するために発現可能な増幅可能遺伝子を含む。そのためのプロモーターを含むこの遺伝子はまた、構造体の２種の標的領域間に配置される。多くの場合、選択可能マーカー及び増幅可能マーカーは同じであり得る。
【００２６】
本発明の追加の態様においては、ＤＮＡ構造体は、そのＤＮＡ構造体が正しく挿入されている細胞において発現されない負の選択可能マーカー遺伝子を含む。この負の選択可能マーカー遺伝子は、その構造体が均質組換えにより遺伝子中に正しく組合される場合、除去するために２種の標的領域外に配置される。そのような負の選択可能マーカー遺伝子の例は、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子である。
【００２７】
さらにもう１つの態様においては、対象の細胞系又は微生物においてすでに生成物を発現している特定の遺伝子の発現特徴を変性することが可能である。これは、（１）細胞系又は微生物が増幅条件にゆだねられる場合、対象の遺伝子のコピー数を高める発現可能な増幅可能遺伝子及び／又は（２）たとえば転写速度を早め、翻訳効率を高め、ｍＲＮＡの蓄積を高め、発現を誘導的にし、等により、対象の遺伝子の発現を変性するプロモーター／エンハンサー要素（又は他の調節要素）を含むＤＮＡ構造体を均質組換えにより挿入することによって達成され得る。この態様で変性される遺伝子発現は、細胞系又は微生物のこれまでの遺伝子操作により引き起こされて来た天然の発現又は発現であり得る。これまでの遺伝子操作は、従来の技法により又は本発明の相同的組換えによってであった。後者の場合、発現特徴の変性をもたらすＤＮＡ挿入は、遺伝子の発現をもたらす同じ遺伝子操作の一部として達成され得、又は続く段階として行なわれ得る。
【００２８】
本発明はまた、上記論議に従って調製された構造体及びそのような構造体により相同的組換えに適切にゆだねられたゲノム並びにそれらのゲノムを含む細胞系及び微生物も包含する。さらに、本発明の形質転換された細胞を培養することによる所望する生成物の調製方法もまた包含される。
【００２９】
【発明の実施の形態】
相同的組換えは、転写的に活性的な遺伝子における変異を誘発し又は補正するための標的遺伝子のために過去数年間開発されて来た技法である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｃ；Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｍｏｌ . Ｂｉｏｌ．，３６：３０１（１９８９））。この相同的組換えの技法は、哺乳類ゲノムの特異的領域中への特異的変異の導入方法として（Ｔｈｏｍａｓなど．，Ｃｅｌｌ，４４：４１９〜４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３〜５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ . Ｓｃｉ．，８５：８５８３〜８５８７，１９８８）又は欠陥遺伝子内での特異的変異を補正するために（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎなど．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６〜５７８，１９８７）開発された。
【００３０】
この技法を通して、ゲノム中に挿入したいＤＮＡの断片は、それを“標的ＤＮＡ”に結合することによって対象の遺伝子の特異的領域に向けられ得る。“標的ＤＮＡ”とは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるＤＮＡである。一本鎖ＤＮＡの２つの相同断片（すなわち標的ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ）がひじょうに隣接して存在する場合、それらは二本鎖ヘリックスを形成するためにハイブリダイズするであろう。ゲノム中に挿入することが所望されるＤＮＡ配列は、その標的ＤＮＡに結合される。
【００３１】
相同的組換えが生じ得る多くの方法が存在する。１つの例は、細胞中での有糸分裂の間、ＤＮＡの複製の工程である。
【００３２】
完全には理解されていない機構を通して、親二本鎖ＤＮＡは、複製バブルと呼ばれる局部領域で、細胞分裂のすぐ前で開環される。２種の分離されたＤＮＡの鎖は、新規ＤＮＡ鎖が合成される鋳型として作用することができる。複製フォークの１つのアームは、５′から３′方向にＤＮＡコードを有し、それは酵素ＤＮＡポリマラーゼが“読取る”ことができる適切な配向である。この酵素は一本鎖ＤＮＡの５′部分に結合し、そして鋳型としてその鎖を用いて、相補的ＤＮＡ鎖を合成し始める。ＤＮＡの他の親鎖は、３′から５′の方向にコードされる。それはＤＮＡポリマラーゼによりこの方向で読取られ得ない。複製するこのＤＮＡ鎖のためには、特別な機構が生じるはずである。
【００３３】
特殊化された酵素、すなわちＲＮＡプライマーゼは、ＤＮＡの３′から５′の鎖にそれ自体結合し、そしてその鎖にそってある間隔で短いＲＮＡプライマーを合成する。プライマーとしてそれらのＲＮＡセグメントを用いて、ＤＮＡポリマラーゼはプライムされたＤＮＡに結合し、そして５′から３′の方向にＤＮＡの相補的断片を合成する。新しく合成されたＤＮＡのこれらの断片は、オカザキフラグメントと呼ばれる。全反応の開始を担当するＲＮＡプライマーは、ＤＮＡポリマラーゼのエキソヌクレアーゼ機能により除去され、そしてＤＮＡにより置換される。この現象は、ポリマラーゼが、局部的合成工程が停止するＤＮＡのプライムされていない長さに達するまで続く。従って、相補的親鎖は３′から５′の方向に全体的に合成されるが、それは実際、５′から３′の方向に“バックスティチ（ｂａｃｋｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）”することによって生成される。その“バックスティチ”工程の間、ＤＮＡに生じ得るいづれかのニックは、いわゆるＤＮＡリガーゼと呼ばれる酵素により閉じられる。
【００３４】
ＤＮＡコードの絶対的な正確さを維持するために、校正機能がＤＮＡポリマラーゼ内に存在する。ＤＮＡポリマラーゼは、新規ＤＮＡ鎖の合成に基づいてＤＮＡのプライムされた断片を必要とする。上記のように、これは、ＲＮＡによりプライムされた一本鎖ＤＮＡ又はＤＮＡの相補的鎖であり得る。ＤＮＡポリマラーゼがＤＮＡの相補的断片をミスマッチしたことが見出された場合、それはエンドヌクレアーゼとして作用し、そしてそれが完全な対合に再び達するまで、３′から５′の方向にＤＮＡ塩基を除去することができる。
【００３５】
この背景１より、本明細書に記載される技法の基本を理解することが可能である。ゲノムの特定領域に対して相補的である標的ＤＮＡの小さな断片が、ＤＮＡ複製工程の間、親鎖と接触せしめられる。それは、共有される相同領域を通してＤＮＡの他の断片とハイブリダイズし、そして従って組換えするために細胞中に挿入されたＤＮＡの一般的な性質である。この相補的鎖が変異又はＤＮＡの異なった配列を含むオリゴヌクレオチドに結合される場合、それは組換えの結果として新しく合成された鎖中に組込まれる。校正機能の結果として、そのＤＮＡの新規配列が鋳型として作用することが可能である。従って、トランスフェクトされたＤＮＡはゲノム中に組込まれる。
【００３６】
特定遺伝子の配列が知られている場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的であるＤＮＡの断片が、たとえば対象の領域の境界を示す特異的認識部位で生来のＤＮＡの適切な制限により合成され又は得られる。この断片は、細胞中への挿入に基づいて標的装置として作用し、そしてゲノム内でその相同領域にハイブリダイズするであろう。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの断片及びそれに結合されるいづれか追加の配列は、オカザキフラグメントとして作用し、そして新しく合成されたＤＮＡの娘鎖中にバックスティチされるであろう。
【００３７】
本発明の技法においては、これらの標的ＤＮＡの断片に、細胞内に存在する核調節タンパク質及び場合によっては、増幅可能で且つ選択可能なＤＮＡマーカーと相互作用することが知られているＤＮＡの領域が結合される。従って、特定タンパク質の発現は、遺伝子自体及びマーカーＤＮＡをコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、転写のための認識できるシグナルを遺伝子に付与するＤＮＡ調節セグメントにより結合される標的ＤＮＡ（対象の内因性遺伝子と相同性の領域）の使用により達成され得る。この技法により、その遺伝子を実際にトランスフェクトしないで、細胞タイプ内に存在するいづれかの同種遺伝子を発現し、そして増幅することが可能である。さらに、この遺伝子の発現は、その遺伝子の一部又はｃＤＮＡよりもむしろ完全なゲノムＤＮＡにより制御され、従って転写の速度及びｍＲＮＡプロセッシングの効率を改良する。さらに、細胞タイプ内に存在するいづれかの同種遺伝子の発現特徴は、ＤＮＡ調節セグメントの適切な挿入により及び対象の遺伝子の完全なコード部分の挿入を伴わないで変性され得る。
【００３８】
本発明のこれらの観点によれば、分化された細胞系内で、対象の通常転写的に不活な遺伝子を発現し、又は対象の内因的に発現する遺伝子の発現を変性するための新規方法が提供される。発現され、又は変性されたそれらの発現を有することが所望される同種ゲノム配列が、細胞内での遺伝子の発現を指図し、又は変性するために必要な細胞特異的ＤＮＡ配列（調節及び／又は増幅セグメント）により供給されるであろう。得られるＤＮＡは、異種（同種ＤＮＡ配列に対して）調節及び／又は増幅セグメントに操作的に直接的に結合される所望するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むであろう。正の選択マーカーは、場合によっては、得られる細胞のスクリーニングを促進するために構造体内に含まれる。いづれの選択可能マーカーでも使用され得るが、耐ネオマイシン性遺伝子の使用が好ましい。負の選択マーカーも、場合によっては使用され得る。たとえばヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子は、ランダムに組込まれたベクターＤＮＡに対して選択するマーカーとして使用され得る。融合されたＤＮＡ又は存在する発現ＤＮＡは、標的ＤＮＡが増幅可能なマーカーに結合される場合、増幅され得る。
【００３９】
従って、本発明の方法によれば、その特定の真核細胞系、特に分化された細胞系に存在する場合に通常発現されるいづれかの遺伝子は、その遺伝子が不活性な形で存在する、その遺伝子に対して特異的でない細胞系における発現を余儀なくされ得る。これは、その遺伝子のための十分なＤＮＡ配列を実際に挿入しないで生じる。さらに、その遺伝子、又は通常発現する遺伝子は、増強された発現速度のために増幅され得る。さらに、完全には転写的に不活性でない遺伝子の発現特徴は、微生物における遺伝子の発現特徴を変性できるように変性され得る。
【００４０】
本発明の１つの態様において、対象の特定遺伝子を含むが、しかし通常転写しない真核細胞は、本明細書に記載される技法により転写するように誘導される。下記相同組換えベクターはクローン性細胞系中に挿入され、そして化学的選択に従って、いづれか適切な手段により、たとえば新しく活性化された遺伝子から転写されるｍＲＮＡの検出、特定の遺伝子生成物の免疫学的検出又は特定の遺伝子生成物についての機能的アッセイにより特定の遺伝子生成物の生成についてモニターされる。
【００４１】
相同的組換えにより内因性遺伝子を転写的に活性化するために使用されるＤＮＡ構造体の一般的な外形が第１図に示される。
【００４２】
一般的に、ＤＮＡ構造体は、少なくとも２種〜６種までの又はそれ以上の別々のＤＮＡセグメントを含む。そのセグメントは、発現されることが所望される遺伝子内の又はその遺伝子に最っとも近い細胞ゲノムの領域に相同の少なくとも１種、好ましくは２種のＤＮＡ標的セグメント（Ａ及びＢ）、正の選択遺伝子（Ｃ）、増幅可能な遺伝子（Ｄ）、負の選択遺伝子（Ｅ）及びトランスフェクトされるべき細胞において転写的に活性的であるＤＮＡ調節セグメント（Ｆ）を含んで成る。本発明の最っとも基本的な態様においては、単に、単一の標的セグメント（Ｂ）及び調節セグメント（Ｆ）が存在すべきである。他の領域のすべては任意であり、そして好ましい構造体を生成する。
【００４３】
領域Ａ及びＢは、転写的に活性化される対象の内因性遺伝子の領域に相同であるＤＮＡ配列である。内因性遺伝子の特定領域Ａ及びＢは、挿入されるべき調節セグメントのために所望される特定の位置でのそれぞれ上流及び下流に存在するように選択される。これらの領域は構造体において分離されるが、それらは好ましくは内因性遺伝子において隣接する。ゲノムの非隣接部分が標的セグメントとして利用され、たとえばゲノムの一部、たとえば負の調節セグメントを削除することが所望される出来事が存在し得る。
【００４４】
２種の標的領域、Ａ及びＢは、相同の全領域を高め、そして従って組換え効率を高めるために好ましいが、本発明の方法はまた、単一の標的領域の使用も包含する。その単純な形においては（調節セグメントＦ及び選択可能マーカー遺伝子Ｃ及びプロモーターＣ′のみが挿入される予定である場合）、標的ＤＮＡと共にそれらの要素を含むＤＮＡの環状断片が使用される。この手段においては、相同領域（Ｂ）が、そのゲノム対応部分とハイブリダイズする。セグメントＣ′，Ｃ及びＦは、クロスオーバー出来事に続いて、同種遺伝子のＢ部分内に挿入される。
【００４５】
ＤＮＡ調節配列が対象の遺伝子の上流に挿入されることが所望される場合、たとえば通常転写的に不活性的な遺伝子を活性化し、そして発現することが所望される場合、相同の領域は好ましくは、対象の遺伝子のコード部分の上流のゲノムの非コード部分に相同である。２つの標的領域が存在する場合、下流の領域（Ａ）はコード領域の一部を含むことができるが、但し、それはそのコード領域の完全に上流に存在することが好ましい。相同領域は、ＤＮＡ調節配列が、特に生来のプロモーターがターンオフされた正のプロモーターよりもむしろ負のプロモーターである場合、対象の遺伝子のために生来のプロモーターの下流に挿入されるように選択されることがさらに好ましい。
【００４６】
標的領域、すなわち相同の領域の大きさは、臨界ではないが、但しより短い領域ほど、それらは相同の適切な領域を見出し、そして所望するスポットで組換えが生じる傾向が低くなる。従って、相同領域が短いほど、相同組換えの効率がより低くなり、すなわち都合良く組換えされるクローンの％が低くなる。配列相同のための最少必要条件は、２５個の塩基対であることが示唆されている（Ａｙａｒｅｓなど、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８３：５１９９〜５２０３，１９８６）。さらに、構造体中の他の要素のいづれかがまた、宿主細胞のゲノムに見出される場合、誤った場所で組換えの可能性が存在する。しかしながら、本発明の卓越した正の及び負の選択能力の観点から、その効率が低くても、それは好都合良く実施され得る。両標的領域を含む相同の全領域が大きい、たとえば１〜３kbである場合に最適な結果が達成される。調節可能なセグメントＦが対象の遺伝子に操作的に結合され得る限り、標的領域及び特に上流の標的領域Ｂの大きさに対する限界が存在しない。
【００４７】
標的領域が大き過ぎるか又はいなか、又は調節セグメントＦがそれに操作的に結合される遺伝子のコード領域から遠く離れて過ぎているのか又はいなかは実験的に容易に決定され得る。そのような場合、領域Ａ及びＢは対象の遺伝子の異なったセクションに相同され得、そして調節可能なセグメントＦが対象の遺伝子に操作的に結合されるように正しく挿入されるまで、その工程は反復される。たとえば、内因性遺伝子の組合された領域Ａ−Ｂの制限部位は変更され得、そしてその工程は反復される。本発明の概念が本明細書に開示される技法と共に知られた後、当業者は過度の実験を行なわないでいづれかの細胞系又は微生物における対象のいづれか与えられた遺伝子に関して本発明を使用することができる。
【００４８】
領域Ｃは、トランスフェクトされた細胞系を通常毒性の環境に対して耐性にすることができる正の選択可能マーカー遺伝子である。そのような遺伝子の例は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、複数薬物耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパーラート耐性遺伝子（ＣＡＤ）である。
【００４９】
正の選択可能マーカー遺伝子の他に、増幅可能な遺伝子がまた、領域Ｄで構造体に任意に含まれる。増幅可能な遺伝子は、選択的な圧力下で、コピー数の上昇を導びく遺伝子である。その増幅可能な遺伝子に隣接して位置づけされた遺伝子のコピー数がまた上昇するであろう。使用され得る増幅可能な遺伝子は、ＤＨＦＲ，ＭＤＲ，ＯＤＣ，ＡＤＡ及びＣＤＡを包含する。正の選択可能マーカー遺伝子群のメンバー及び増幅可能な遺伝子群のメンバーはオーバーラップし、その結果、理論的には、２種の遺伝子、たとえば
正の選択のための遺伝子及び増幅のための遺伝子を用いる代わりに、１種の遺伝子が両目的のために使用され得る。しかしながら、ほとんどの細胞系はこれらの増幅可能遺伝子の内因性コピーを含むので、細胞はその選択条件に対してすでにいく分耐性であり、そしてトランスフェクトされたＤＮＡを受容しない細胞とトランスフェクトされたＤＮＡを有する細胞との区別は困難である。従って、たとえば増幅可能な遺伝子が所望される場合、優性である正の選択遺伝子、たとえばＨＰＨ，ｇｐｔ，ｎｅｏ及びｔｋ（ｔｋ−細胞における）がまた、構造体に含まれるべきである。いくつかの用途のためには、増幅可能なマーカーを削除することが可能であり又は好ましい。たとえば、対象の遺伝子は、たとえば異種ＤＮＡ調節配列による転写活性化が増幅を伴わないで十分である場合、増幅される必要はない。また、相同組換え効率がひじょうに低い場合、非相同ＤＮＡ：相同ＤＮＡの比は相同組換え効率に直接的に関係されるので、増幅可能遺伝子を除外することが必要である（Ｌｅｔｓｏｕ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１７：７５９〜７７０，１９８７）。所望するタンパク質又はｍＲＮＡの生成のためにスクリーニングにより、正の選択遺伝子を排除し、そして細胞を単に選択することもまた可能である。しかしながら、ほとんどの場合、少なくとも正の選択遺伝子を含むことが好ましい。
【００５０】
構造体中の領域Ｅは、負の選択可能マーカー遺伝子である。そのような遺伝子は、ＤＮＡ構造体が相同的組換えにより正しく挿入されている細胞においては発現されないが、しかしＤＮＡ構造体が、たとえばランダム組込みにより不適切に挿入されている細胞においては発現される。１つのそのような遺伝子は、ヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）である。ＨＳＶｔｋは、ヌクレオチドに対して低い緊縮性を有し、そして通常の哺乳類細胞がリン酸化できないヌクレオチド相同体をリン酸化することができる。ＨＳＶｔｋが細胞に存在する場合、ヌクレオチド相同体、たとえばアシクロバー（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）及びガンシクロバー（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）がリン酸化され、そして宿主細胞のＤＮＡ中に組込まれ、従って細胞を殺害する。負の選択可能マーカー遺伝子の存在は、Ｍａｎｓｏｕｒなど（Ｎａｔｕｎｅ，３３６：３４８〜３５２，１９８８）により記載されるように相同組換えのために負−正の選択の使用を可能にする。Ｃａｐｅｃｃｈｉは、線状化されたベクターＤＮＡがランダム組込みにより挿入する場合に比べて、それが相同的組換により挿入する場合に生じる組込みの異なった態様の利点を有する手段を使用する。ベクターＤＮＡがランダムに挿入する場合、その挿入体の大部分は、末端を通して挿入するであろう（Ｆｏｌｇｅｒなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１３７２〜１３８７，１９８２；Ｒｏｔｈなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２５９９〜２６０７，１９８５；及びＴｈｏｍａｓなど、Ｃｅｌｌ，４４：４１９〜４２８，１９８６）。他方、ベクターが相同的組換により挿入する場合、それは、それらの領域の外側の配列の損失を引き起こす相同の領域を通して組換えするであろう。
【００５１】
例として第１図に示される構造体を用いて、相同的組換えのための組込みｖｓランダム組込みの態様が第２Ａ及び２Ｂ図に示される。非相同的組換えの場合（第２Ａ図）、ベクターは、構造体の末端を通して挿入される。これは、領域Ｅ、この場合ＨＳＶｔｋ遺伝子のゲノム中への挿入を可能にする。しかしながら、相同的組換えが起こる場合（第２Ｂ図）、ＨＳＶｔｋ遺伝子は失なわれる。第１回目の選択は、構造体内に存在する正の選択のために適切な薬物又は条件を使用する。相同的組換え又はランダム組込みのいづれかにより組込まれるＤＮＡを有する細胞は、この回の選択を生存するであろう。次に生存細胞が、薬物、たとえばＨＳＶｔｋ遺伝子を含むすべての細胞を殺害するであろうガンシクロバーに暴露される。この場合、ランダム組込みにより組込まれたベクターがＨＳＶｔｋ遺伝子を含む細胞のほとんどは殺害されるが、しかし相同的組換えにより組込まれたベクターがＨＳＶｔｋ遺伝子を失っている細胞は生存する。これは、ランダムに組込まれたＤＮＡを含む細胞のほとんどの排除を可能にし、相同的組換えを通して組込まれたＤＮＡを含む生存細胞の大部分を残す。これは、正しい組換え出来事の同定をひじょうに促進する。
【００５２】
負の選択段階はまた、必要なら排除され得る。それは、ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）又は免疫学的スクリーニングのような技法の必要性を包含するスクリーニング段階はより集中的な労力を必要とするであろう。
【００５３】
６番目の領域（Ｆ）は、対象の遺伝子を転写的に活性にするために使用されるＤＮＡ調節セグメントを含む。適切なＤＮＡ調節セグメントは、使用される細胞タイプに依存して選択される。使用される調節セグメントは、分化された宿主細胞系における与えられた遺伝子の発現を促進することが知られているセグメントである。たとえば、宿主細胞系が、タンパク質、たとえば成長ホルモン及びプロラクチンを天然で発現する脳下垂体細胞から成る場合、それらの遺伝子のいづれかのためのプロモーターは、ＤＮＡ調節要素Ｆとして使用され得る。本発明に従って挿入される場合、調節セグメントは、通常転写的に不活性な対象の遺伝子に操作的に結合され、そして宿主細胞系におけるその遺伝子の転写及び／又は発現を刺激するであろう。細胞タイプを通して作用する無差的なＤＮＡ調節セグメント、たとえばラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターもまた有用である。調節セグメントが転写及び／又は発現を刺激し、又は本発明により対象の遺伝子に操作的に結合されるように宿主細胞系中に挿入された後、対象の遺伝子の転写及び／又は発現を刺激するために誘発され得る限り、それは本発明に使用され得る。それは開始コドンが配列中に突然的に導入されていない標的セグメントＡに調節セグメントＦを連結する場合、そのような発生が発現されることが所望される遺伝子の読取り枠を変えるので、重要である。もちろん、構造体は、調節セグメントＦが対象の遺伝子に操作的に結合されるように構成され、そして挿入されるべきである。
【００５４】
ＤＮＡ調節セグメント、すなわち領域Ｆは、たとえばそれは細胞系において天然において発現するので又は細胞系はそのような発現を引き起こすために操作されたそのＤＮＡを前もって有しているのて、対象の細胞系においてすでに発現している遺伝子の転写を増強し、又は増幅することが所望される場合、存在する必要はない。そのような場合、増幅可能遺伝子、領域Ｄ、好ましくは正の選択可能マーカー遺伝子、領域Ｃ及び場合によってはまた、負の選択可能マーカー遺伝子、領域Ｅの挿入は、対象の遺伝子のコピー数を高め、そして従って全体量の転写を高めるのに十分であろう。他方、対象の遺伝子のための存在する調節領域に比べて転写の増強された（又は変性された）速度を本質的に促進する新規調節セグメント、領域Ｆは、対象の存在する発現遺伝子の転写をさらに増強するために含まれ得る。そのような新規調節セグメントは、転写効率を改良するプロモーター又はエンハンサーを含む。
【００５５】
領域Ｃ′，Ｄ′及びＥ′は、それぞれ領域Ｃ，Ｄ及びＥにおける遺伝子を誘導するために使用されるプロモーター領域である。これらのプロモーターは、選択された細胞系において転写的に活性であり、そして対象の内因性遺伝子を誘導するために使用される領域Ｆにおけるプロモーターと同じか又は異なったものであり得る。第１図に特定された転写の特異的方向は臨界ではない。当業者は、対象の遺伝子又は構造体中の他のいづれかの遺伝子の発現を同時に妨げないで、プロモーターがそれらの関連する遺伝子の発現を刺激するように、遺伝子Ｃ，Ｄ及びＥ及びそれらのプロモーターＣ′，Ｄ′及びＥ′のいづれか適切な配置を決定することができる。
【００５６】
本発明は、ＧＨ1(ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２），ＧＨ3(ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８２．１）又はＧＨ4 ｃｌ細胞系（ＧＨ）においてのラットチロトロピンβサブユニット（ＴＳＨβ）活性化により例示され得る。ＧＨ細胞系は、ＭｔＴ／Ｗ５（Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２２：９１７，１９６２）と命名され、そしてＴａｓｈｊｉａｎなど、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，８２：３４２〜３５２，１９６８により培養で増殖するように適合された、ラットにおける放射線誘発性脳下垂体腫瘍に由来する。これらの細胞系は、成長ホルモン及びＴＳＨβを生成するそれらの能力についてサブクローンされ、そしてスクリーンされ得る。そのようなスクリーニングは、好ましくはノザンブロット分析により行なわれ、ラット成長ホルモン遺伝子のためのｍＲＮＡが存在するかいづれかが決定され、そして生成されるＴＳＨβ遺伝子のためのｍＲＮＡが存在しないことが確立される。その細胞系はまた、ゲノム内に存在するＴＳＨβ遺伝子の少なくとも１つのコピーが存在することを決定するためにサガン分析によりスクリーンされ得る。成長ホルモンを生成し、そしてＴＳＨβを生成しないが、しかしＴＳＨβ遺伝子のコピーを含むＧＨ細胞系のみが使用される。
【００５７】
ＧＨ細胞に使用するための特定の相同的組換えベクターは、次の態様で企画され得る（第３図）。領域Ａは、−７４から−２７８５に伸びるＨｉｎｄ IIIフラグメントにより定義されるＴＳＨβ遺伝子の５′上流の末翻訳領域から成り、そして領域Ｂは、−２７８５Ｈｉｎｄ III部位から、さらに上流のＮｃｏＩ部位に伸びる約２．１kbのＤＮＡフラグメントを含むことができる（Ｃａｒｒなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.,２６２：９８１〜９８７，１９８７及びＣｒｏｙｌｅなど、ＤＮＡ，５：２９９〜３０４，１９８６）。正の選択遺伝子（領域Ｃ）は、プラスミドｐＳＶＺｎｅｏ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７，１４９）に由来るす１０６７bpのＢｇｌII−ＳｍａＩフラグメントであり得る（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．，１：３２７〜３４１，１９８２）。そのｎｅｏ遺伝子は、プラスミドｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣＮｏ．３７，１５２）からのＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントに由来するラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のプロモーター（領域Ｃ′）により駆動され得る。この例においては、増幅可能マーカーは使用される必要がなく、そして従って、相同的組換えの効率を最適化するために領域Ｄの必要性が存在しない。その効率は、構造体に存在する非相同配列：相同配列の割合に反比例する（Ｌｅｔｓｏｕなど、Ｃｒｅｎｅｔｉｃｓ，１１７：７５９〜７７０，１９８７）。領域Ｅ又は負の選択遺伝子は、プラスミドｐＭＣＩＴＫ（Ｃａｐｅｃｃｈｉなど、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８〜３５２，１９８８）から得られる２kbのＸｈｏフラグメントであるＨＳＶｔｋ遺伝子から成る。その構造体におけるＨＳＶｔｋ遺伝子は、Ｔｈｏｍａｓなど（Ｃｅｌｌ，５１：５０３〜５１２，１９８７）により構成されるようにポリオーマウィルスのプロモーター及びエンハンサー（領域Ｅ′）により駆動され得る。第２のＤＮＡ構造体において、そのポリオーマプロモーターは、上記のＲＳＶプロモーターにより置換され得る。ＴＳＨβ遺伝子を活性化するために使用されるＤＮＡ調節配列は、ＲＳＶプロモーター又はラット成長ホルモンプロモーターのいづれかであり得る。ラット成長ホルモンプロモーターは、プラスミドｐＲＧＨ２３７ＣＡ７（Ｌａｒｓｏｎなど、ＰＮＡＳ，８３：８２８３〜８２８７，１９８６）から得られるＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントから成る。ＲＳＶプロモーターは、ＧＨ細胞の他に他の細胞系において有用である利点を有し、そしてＧＨプロモーターは、ＧＨ細胞において活性的であることが知られており、そして特異的に誘発され得る（Ｂｒｅｎｔなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７８〜１８２，１９８９）。ラット成長ホルモンプロモーター及びＲＳＶプロモーターは、別々の構造体において位置Ｆで挿入され得る。
【００５８】
ＧＨ細胞系中への上記構造体のトランスフェクションの後、その細胞はＧ４１８を含む培地中で増殖され得る。これは、相同的組換え又はランダム組込みのいづれかによりゲノム中にプラスミドＤＮＡを組込まれたそれらの細胞のみの増殖を可能にするであろう。生存細胞は、ガンシクロバーを含む培地中で増殖され得る。この回の選択を生存する細胞の大部分は、ペクタープラスミドＤＮＡが相同的組換えにより組込まれているものであろう。これらの細胞は、それらがＴＳＨβ遺伝子に対応するｍＲＮＡを生成し、そしてそれらがＴＳＨβタンパク質を生成することを示すためにスクリーンされ得る。ゲノムＤＮＡはまた、適切な組換え出来事が生じたかを確めるために異種プロモーターの挿入の部分近くを配列決定され得る。
【００５９】
【実施例】
例−ラット脳下垂体細胞におけるＴＳＨβ遺伝子の活性化
次の手段を用いて、ラットＧＨ3 脳下垂体細胞系においては通常存在しないチロトロピンβサブユニット（ＴＳＨβ）遺伝子転写を、相同的組換えの方法を用いることによってそれらの細胞中で活性化し、ＴＳＨβコード領域の上流の活性化要素の標的を決定した。ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターは、ＧＨ3 細胞において効果的に機能することが知られており（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｎｅｌｓｏｎなど、Ｎａｔｕｒｅ，３２２：５５７〜５６２（１９８６）；Ｚｈｅｎｇ−Ｓｈｅｎｇ Ｙｅなど、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｏｍｉｓｔｒｙ，２６３：７８２１〜７８２９（１９８８））、そして従って、活性化要素として選択された。トランスフェクトされた細胞集団の単離のために、ＲＳＶ活性化要素、ＴＳＨβ遺伝子座の５′フランキング領域の部分及び選択可能な薬物マーカー、たとえばアミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を含むプラスミドベクターを構成した。リボ核酸（ＲＮＡ）を、プールされた耐薬物性ＧＨ3 細胞集団から抽出し、そして相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に転換した。次に、そのｃＤＮＡを、ＴＳＨβ ｃＤＮＡの存在について、ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の技法によりスクリーンした。相同的組換えベクター及び制御ベクターの構成は、実験方法及び結果と共に、下記に概略されている。
プラスミド構成
相同的組換え（ＨＲ）バックボーンベクター（ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ）
ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターを、機能的なプロモーター単位を含む５８０塩基対（bp）のＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを単離することによって、プラスミドｐＲＳＶＣＡＴ（Ｇｏｒｎｅｌｉａ Ｍ．Ｇｏｒｍａｎなど．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７９：６７７７〜６７８１（１９８２）（第５図）から誘導した。このフラグメントの末端を、ＤＮＡポリマラーゼＩクレノウフラグメントを用いてブラント化し、そしてＸｂａＩリンカーをそのブラント末端に連結した。ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化及びゲル精製の後、得られたフラグメントをＰＵＣ１８のＸｂａＩ部位中に連結した。第６図に示される配向でＲＳＶ挿入体を有するプラスミドを含む細菌コロニーを、ｐＲＳＶと命名した。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を、ＢｇｌII及びＢａｍＨＩフラグメント（第７図）を単離し、そしてそのフラグメントをｐＲＳＶのＢａｍＨＩ部位（第６図）中に連結することによって、ｐＳＶ２ＮＥＯ（Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｍなど．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：３２７〜３４１（１９８２））からクローン化した。第８図に示される配向でＮＥＯ遺伝子を含むプラスミドを取り出し、そしてｐＲＳＶＮＥＯＢＡＭと命名した。そのｐＲＳＶＮＥＯＢＡＭを、ＳｍａＩにより消化し、そしてＲＳＶプロモーター領域、ＮＥＯ遺伝子の大部分及びｐＵＣ１８を含む４３２８bpのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離した。このフラグメントのＳｍａＩ末端にＸｈｏＩを連結し、ＸｈｏＩ制限酵素により切断し、そしてそのプラスミドを連結により再環状化した。得られたプラスミドは第９図に示され、そしてｐＲＳＶＮＥＯと命名される。この最後のクローニング段階は、その機能的な発現のためには必要でないＮＥＯフラグメントの３′末端から７８６bpのフラグメントの欠失をもたらした。この構成は、ＮＥＯ遺伝子がＲＳＶプロモーターにより転写的に駆動されるプラスミドを生成する。
【００６０】
次に、ｐＲＳＶＣＡＴ（第５図）におけるＲＳＶプロモーターの５′に位置するＮｄｅＩ部位を、ＳａｌＩ部位に転換した。これは、ＮｄｅＩによりｐＲＳＶＣＡＴを消化し、ＤＮＡポリマラーゼＩクレノウフラグメントを用いてそれらの末端をフィルインし、そして得られたブラント末端にＳａｌＩリンカーを連結することによって達成された。リンカーを、ＳａｌＩにより完全に消化し、そしてそのプラスミドを連結により再環状化した。新しく構成されたＳａｌＩ部位中に、ＲＳＶプロモーター及びＮＥＯ遺伝子を含むｐＲＳＶＮＥＯ（第９図）からのＳａｌＩ−ＸｈｏＩフラグメントをクローン化した。第１０図に示されるように配向されたＲＳＶプロモーター及びＮＥＯフラグメントを有するプラスミドを単離し、そしてｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯと命名した。このプラスミドは、ＧＨ3 細胞中にトランスフェクトされる場合、それらの細胞に耐Ｇ４１８性を付与することができ、ＮＥＯ遺伝子の転写を駆動するＲＳＶプロモーターの能力及び機能的タンパク質中に翻訳されるそのＲＮＡの能力を示す（データは示されていない）。上記安定したトランスフェクタントからの全体のＲＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により分析し、ＣＡＴ遺伝子が転写されたかどうかを決定した。ＰＣＲ結果は、ＣＡＴ遺伝子が試験される耐Ｇ４１８性コロニーのすべてにおいて実際に転写されたことを示し（データは示されていない）、ＣＡＴ遺伝子のＲＳＶプロモータ５′がそれに対して３′仍りに位置する遺伝子の転写を駆動することができたことを示した。これは、このＲＳＶプロモーターが、下記ＴＳＨβＨＲベクターが相同的組換によりＧＨ3 ゲノム中に組込む場合、そのＴＳＨβ遺伝子の転写の駆動を担当するであろうから重要である。
ＴＳＨβ ＨＲベクター
相同的組換えによりＧＨ3 ゲノム中に組込むことができるベクターを、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（第１０図）に含まれるユニークＳａｌＩ及びＨｉｎｄ III部位中にチロトロピンβサブユニット（ＴＳＨβ）遺伝子の５′フランキング領域の２種の拡張部を挿入することによって創造した。λＤＡＳＨ中にクローン化された１５kb又はそれ以上の挿入体を含むラット脾臓ゲノムライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得た。標準方法（Ｃｕｒｐｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１．９．１−１．１３．６，６．１．１−６．４．１０）を用いて、第１エキソンの９kbの配列５′を含むラットゲノムＴＳＨβ遺伝子の１５．３kbクローンを単離した。その１５．３kbのフラグメントは、２種のＸｂａＩフラグメント、すなわち１５．３kbフラグメントの５′末端に対応する１０．６kbのフラグメント及び１５．３kbフラグメントの３′領域に対応する４．７kb断片から成った（第１１図）これらのＸｂａＩフラグメントの両者を、ＰＵＣ１８中にサブクローンし、そして両配向で挿入体を含むプラスミドを単離した。４．７kbのＸｂａＩフラグメント（第１１図）に含まれる２．３kbのＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを精製し、そしてこのフラグメントのＸｂａＩ部位を、クレノウフラグメントによりそれらの末端をフィルインし、そしてＨｉｎｄ IIIリンカー上で連結することによってＨｉｎｄ III部位に転換した。このフラグメントを、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（第１０図）に含まれるユニークＨｉｎｄ III部位中に連結した。第１２図に示されるような正しい配向で２．３kbの挿入体を有するプラスミドに対応する単離体を、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３と命名した。
【００６１】
ラットＴＳＨβ細胞からのサブクローンされた１０．６kbのＸｂａＩフラグメント（第１１図）を単離し、そしてＸｂａＩ末端を、そのフラグメントをＤＮＡポリマラーゼＩクレノウフラグメントによりブラント末端化し、そしてＳａｌＩリンカーを結合することによってＳａｌＩ部位に転換した。次に、この１０．６kbのＳａｌＩフラグメントを、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３のＳａｌＩ部位中にクローン化した（第１２図）。正しい配向でその挿入体を含むプラスミドを同定し、そしてｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（第１３図）と命名した。後者のプラスミドを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃａｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託し、そして寄託番号ＡＴＣＣ ４０９３３号を得た。この寄託のために、前記プラスミドをｐＨＲＴＳＨと命名した。この寄託は、ブタペスト条約のすべての必要条件に従って行なわれた。
細胞系
ＧＨ3 細胞は、放射線誘発されたラットの脳下垂体腫瘍に由来し（Ｂ．Ｋ．Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：９１７（１９６２））、そしてＴａｓｈｊｉａｎなど．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，８２：３４２〜３５２（１９６８）により培養増殖するように適合されたＭｔＴ／Ｗ５のサブクローンされた集団である。ＧＨ3 細胞をＡＴＣＣ細胞バンクから得、そしてダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１５％・馬血清（ＨＳ）＋２．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％Ｌ−グルタミン（ＧＨ3 培地）中で３７℃で５％ＣＯ2 において増殖することによって培養維持する。
ＤＮＡ調製
プラスミドＤＮＡの大規模調製
安定したトランスフェクションのために使用されるすべてのプラスミドを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．１．７．１−１．７．２に記載されるように大規模なプラスミドＤＮＡ精製のためにアルカリ溶解方法を用いて精製した。そのアルカリ溶解方法により単離されたＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、ｐｐ．１．７．５−１．７．７に記載されるように塩化セシウムグラジエントでの二重バンディング（ｄｏｒｉｂｌｅ ｂａｎｄｉｎｇ）によりさらに精製した。
【００６２】
トランスフェクションの前、ＨＲベクターを、ＡａｔII又はＡｐａＩのいづれかにより消化した。ＡｐａＩを用いて、対照のプラスミドｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯを線状化し、そしてＡａｔIIを用いて、ＨＲプラスミドｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩを線状化した。ＡｐａＩ及びＡａｔIIの切断部位の位置は、それぞれ第１０及び１３図に見出され得る。適切な制限酵素による消化の後、その反応をフェノールクロロホルム抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿化し、そして７０％エタノールにより１度洗浄した。次に、プラスミドを、脱イオン水（ｄＨ2 Ｏ）に再懸濁し、ＯＤ260 での吸光度により測定される場合、１μｇ／μｌの濃度にした。トランスフェクション効率及び／又は相同的組換え陽性：ランダム組込みによる陽性の比を高めるために、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩをＡｐａＩにより消化した。ＡｐａＩによる消化は、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩにおいて３種の別々の部位で切断し、そして相同的組換えのために必要なものを除く、すべてのベクター領域を除去する（第１３図）。ＡｐａＩによる消化の後、その反応を０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてＴＳＨβ遺伝子の２つの５′フランキング領域、ＲＳＶプロモーター−ＮＥＯ領域及びＴＳＨβ遺伝子−活性化ＲＳＶプロモーターを含む１０，９９２bpのフラグメントに対応する上部バンドを、透析管への電気溶出によりゲルから単離した。電気溶出されたＤＮＡを、製造業者の標準の方法により、ｅｌｕｔｉｐ ｍｉｎｉｃｏｌａｍｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いることによってさらに精製した。ＤＮＡを、そのカラムから溶出し、エタノール沈殿し、７０％エタノールにより洗浄し、そして再懸濁し、１μｇ／μｌの濃度にした。
安定トランスフェクション
リン酸カルシウムトランスフェクション
トランスフェクションの４８時間前、３×１０6 個のＧＨ3 細胞を、１０cmの皿上にプレートした。個々の皿のために、ベクターＤＮＡ１０μｇ及び音波処理されたサケ精子ＤＮＡ３０μｇを、トランスフェクション緩衝液０．５mlに添加した。トランスフェクション緩衝液は、ＮａＣｌ４ｇ，ｋｃｌ０．１８ｇ，０．０５ｇのＮａ2 ＨＰＯ4 、デキストロース０．５ｇ，ＨＥＤＥＳ２．５ｇをｄＨ2 Ｏと共に組合して５００mlの最終体積にし、そしてそのpHを７．５にすることによって調製された。３１μｌの２ＭのＣａＣｌ2 を、ＤＮＡ０．５ml＋トランスフェクション緩衝液に添加し、そして攪拌した。この溶液を、室温で４５分間静置した。ＤＮＡ−ＣａＣｌ2 −トランスフェクション緩衝液が準備された後、ＧＨ3 培地をＧＨ3 細胞から除き、そしてＤＮＡ−ＣａＣｌ2 −トランスフェクション緩衝液を細胞上に被覆した。細胞を室温で２０分間静置した。２０分後、５mlのＧＨ3 培地を添加し、そしてプレートを３７℃で６時間インキュベートした。次に、培地をアスピレートし、そして１５％グリセロールを含む新鮮なトランスフェクション緩衝液５mlを３．５分間にわたって添加することによってショックをその細胞に与えた。細胞をＰＢＳにより２回すすぎ、そしてＧＨ3 培地１０mlを供給した。トランスフェクションの４８時間後、培地を除き、そして４００μｇ／mlのＧ４１８を含むＧＨ3 培地１０mlを添加した。
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションを、３．５mmのギャップの電極を有するＢＴＸ３００Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒを用いて行なった。対数相で増殖する１×１０7 個のＧＨ3 細胞を、トリプシン処理によりそれらのプレートから除去し、遠心分離によりペレット化し、そしてＰＢＳにより１度洗浄した。細胞を、ＰＢＳ１．０mlに再懸濁し、そして氷上２．９mlのＵｌｔｒａ−ＵＶ使い捨てキュベット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に移した。ＤＮＡ１０μｇを細胞に添加し、混合し、そして氷上に５分間戻した。５分後、電極をチャンバーに配置し、そして細胞を、７５０μファラド及び２００Ｖのパルスの設定下でエレクトロポレートした。そのキュベットを１０分間氷上に戻した。細胞を、１５mlの円錐形管において室温で１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを含むＧＨ3 培地９mlに前記キュベットから移した。１×１０7 個の細胞の全体のエレクトロポレーションを、３個の１０cmプレートに移し、約３×１０6 個の細胞／プレートを付与した。４８時間後、４００μｇ／mlのＧ４１８を含むＧＨ3 培地を添加した。
ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（Ａａｔ II 切断）、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）及びｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（ＡｐａＩ切断）によるＧＨ 3 細胞のトランスフェクション
ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡａｔII切断）、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）及びｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯ（ＡｐａＩ切断）プラスミドを、リン酸カルシウム法及びエレクトロポレーション法の両者を用いて、ＤＮＡ対照と共にＧＨ3 細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＧ４１８選択下に置いた。約１４〜２１日後、コロニーは１０cmの皿上で眼により見えるようになり、そして計数した。ＤＮＡ対照のすべてにおいては、眼に見えるコロニーは存在せず、これは、Ｇ４１８選択が作用し、そしてＲＳＶ−ＮＥＯ領域を含むプラスミドの存在がＧ４１８耐性を付与するために必要であることを示す。この時点で、コロニーを取り、そして１７mmの幅のクローニング環を有する１０cmの皿上の領域を単離することによってプールした。これらの大きなクローニング環は、プレート当たりのコロニーの密度に依存して１０〜７０個のコロニーを包含し、そしてその単離された領域におけるＧＨ3 細胞の除去を可能にし、そして同時に、トリプシン処理によりプールした。個々の環におけるトリプシン処理されたコロニーを、６ウェルプレートに移し、そしてＧ４１８を含むＧＨ3 培地での増殖を可能にした。７０％〜８０％の集密性に達した後、８０，０００個の細胞を２４ウェルプレートに移し、そして残る細胞を後でさらに試験するために凍結保存した。２４ウェルプレートにおける細胞を、それらが５０％〜８０％の集密性に達するまで増殖せしめた。次に、全体のＲＮＡをそれらのＧＨ3 細胞から次の方法により収穫した。
２４ウェルプレートにおいて増殖されたトランスフェクトされたＧＨ3 細胞からのＲＮＡ単離
次の方法は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６〜１５９（１９８７）により記載される方法の改良である。２４ウェルプレートにおけるＧＨ3 細胞を被覆する培地を除去し、そして細胞をＰＢＳ１mlにより洗浄した。ＧＴＣ溶液１mlを添加し、そして細胞を室温で５分間インキュベートした。ＧＴＣ溶液を、ｄＨ2 Ｏ２９３mlにグアニジウムチオシアネート（Ｆｌａｋａ）２５０ｇを溶解し、そして次に０．７５μのクエン酸ナトリウム（pH７．０）１７．６ml及び１０％のサルコシル（Ｌ−ラウリルサルコシン）２６．４mlを添加することによって調製した。使用のすぐ前、ＧＴＣ溶液５０ml当たりβ−メルカプトエタノール３６０μｌを添加した。室温で５分後、ＧＴＣ−細胞溶解物１mlを、ＧＴＣ溶液２mlを含むＳａｒｓｔｅｄｔ５５．５１８スナップ−キャップ管に移した。個々の管に、２μの酢酸ナトリウム（pH４．０）３００μｌを添加し、そしてその管を攪拌した。次に、ｄＨ2 Ｏ飽和フェノール３mlを添加し、そして再びその管を攪拌した。個々の管に、クロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）溶液６００μｌを添加し、そして管を手により１０秒間、振り、そして氷上に１５分間置いた。次に、管を、４℃で２０分間、８０００回転／分（ＲＰＭ）でＳＭ２４ローターを用いてＳｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ中において遠心分離した。水性相を、イソプロパノール３mlを含む新しいＳａｒｓｔｅｄｔ管に移し、そして−２０℃で１時間置いた。１時間後、管を、４℃で２０分間、８０００rpm でＳＭ２４ローターを用いてＳｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ中で回転せしめた。上清液を除去し、そしてペレットをＧＴＣ溶液５００μｌに再懸濁した。再懸濁されたＲＮＡを、１．５mlのエペンドーフ（ｅｐｐｅｎ ｄｏｒｆ）管に移し、それにイソプロパノール５００μｌを添加した。その管を、もう１度−２０℃で１時間静置した。エペンドーフ管をマイクロフュージ中で５分間回転せしめ、そして上清液を除去した。ペレットを７０％エタノールにより２度洗浄し、そしてエタノールが完全に蒸発するまで乾燥せしめた。ペレットを、水により処理されたジエチルピロカーボネート（ｃｌｅｐｃ）２０μｌに再懸濁し、そして６５℃で５分間加熱した。次にこのＲＮＡを用いて、下記２種の方法の１つでｃＤＮＡを製造した。
ｃＤＮＡ反応方法１
第１鎖ｃＤＮＡを、１０〜２０μｌの反応体積中、合計ＲＮＡ（約０．５〜６μｇ）２．５〜６．０μｌから合成した。合計ＲＮＡを、上記抽出方法により得、そして７０℃で５〜１０分間変性せしめ、そして反応成分を添加する前、氷上ですばやく急冷せしめた。その反応条件は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH８．３），１０ｍＭのＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭのＤＴＴ，０．５ｍＭの個々のｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），４０ｍＭのｋｃｌ，５００単位／mlのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），８５μｇ／mlのオリゴ（ｄＴ）１２−１８（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）及び３７℃で６０分間インキュベートされた１５，０００〜２０，０００単位／mlのＭｏｌｏｎｙネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。反応を、４０ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより停止し、そして核酸を、０．３Ｍの濃度の酢酸ナトリウム及び２体積のエタノールを添加することにより沈澱せしめた。沈澱物を０℃で３０分間形成せしめ、そして１４，０００rpm で３０分間、ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中においての遠心分離によりペレット化した。ペレットを７０％エタノールにより洗浄し、乾燥せしめ、そして１５〜２５μｌの体積のｄｅｐｃ処理された水に再懸濁した。
方法２
ＲＮＡからのｃＤＮＡの第１鎖の合成のための条件は、Ｃａｒｏｌ Ａ．Ｂｒｅｎｎｅｒなど、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第７巻、第１０号、１０９６〜１１０３ページ（１９８９）から適合せしめられた。上記方法により調製されたＲＮＡからの合計ＲＮＡ１μｌを、０．５mlのエペンドーフ管中における反応緩衝液９μｌに添加した。その反応緩衝液は、２００単位のＭｏｌｏｎｅネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶＲＴ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）及び次の試薬の最終濃度から成る：７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，pH８．８，４０ｍＭのｋｃｌ，０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭの個々のｄＮＴＰ，４ｍＭのＭｇＣｌ2 及び０．４５ＵＤ260 単位のランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。混合の後、管を室温で１０分間インキュベートし、そして次に、４２℃で１時間置いた。１時間後、管を９０℃で１分間加熱し、ＭＭＬＶＲＴを不活性化し、そして次に室温に冷却した。
ＧＨ3 細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅
次のプライマーを用いて、相同的組換えにより内因性ＴＳＨβ遺伝子を活性化するＨＲプラスミドの結果としてＧＨ3 細胞により生成されたＲＮＡ転写物から合成されたＴＳＨβｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅した。
【００６３】
プライマー ５′ ３′
TSHβ5 AGTATATGATGTACGTGGACAGG
TSHβ3 CACTTGCCACACTTGCAGCTCAGG
第１４図は、個々のプライマーが応答するＴＳＨβ遺伝子の領域を示す。
ＰＣＲ反応条件
すべてのＰＣＲ反応を、Ｅｒｉｃｏｍｐ Ｔｗｉｎｂｌｏｃｋ熱サイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅａｒ）で行なった。ＰＣＲ増幅が方法２により製造されるｃＤＮＡに対して行なわれる場合、４０μｌの追加の反応ミックスを、ｃＤＮＡ反応物１０μｌに添加し、合計体積を５０μｌまでにした。その５０μｌにおける試薬の最終濃度は、７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH８．８），４０ｍＭのＫｃｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２．２５単位のＴａｑポリマラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），０．２μＭの個々のプライマー、２００μＭの個々のｄＮＴＰ及び０．８ｍＭのＭｇｃｌ2 であった。
【００６４】
ＰＣＲが上記方法１により製造されるｃＤＮＡに対して行なわれる場合、再懸濁されたｃＤＮＡ５〜１０μｌを、次の最終濃度の成分を含む反応ミックス４０〜４５μｌに添加した：７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，pH８．８，４０ｍＭのＫＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２．２５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．２μＭの個々のプライマー、２００μＭの個々のｄＮＴＰ及び０．８ｍＭのＭｇｃｌ2 。
【００６５】
次に反応を次のＰＣＲサイクルにゆだねた。
【００６６】
９４℃で１分間、
５５℃で３０秒間、
７２℃で２分間。
【００６７】
上記サイクルを３０〜４０回くり返した。１０μｌの個々の反応ミックスを、６％ポリアクリルアミドゲルにかけ、そしてＴＳＨβのための適切にスプライスされたｍＲＮＡの存在を示す２４７bpのＰＣＲフラグメントの存在についてスクリーンした。
ＧＨ3 細胞及びラット下垂体の合計ＲＮＡからのＴＳＨβＲＮＡの増幅のためのＰＣＲ結果
ＧＨ3 細胞が通常ＴＳＨβ ＲＮＡを合成するかどうかを決定するために、トランスフェクトされていないＧＨ3 細胞からのｃＤＮＡ及びラット下垂体からのｃＤＮＡを、上記ＰＣＲ反応条件にゆだねた。ＴＳＨβ ｍＲＮＡの存在を示す正しい２４７bpのバンドがラット下垂体サンプルの正の対照に見出されたが、しかし６０サイクルの後でさえ、ＧＨ3 細胞からの合計ＲＮＡサンプルからはバンドは見出されなかった（データは示されていない）。
トランスフェクション結果
１０cmの皿上に存在するＧ４１８耐正コロニーの数を、培地にＧ４１８の添加後１４〜２１日間にわたって表化した。
プラスミド G418 耐性コロニー TSH β RNA 陽性
PRSVCATNEO 60 0
PRSVCATNEOTSHB3-5XBA1 4942 3
(Aat2 消化された)
PRSVCATNEOTSHB3-5XBA1 8580 6
(Apa1 消化された)
これらの結果は、本発明の方法による通常転写的に不活性なＴＳＨβ遺伝子の好都合な活性化を示す。ＴＳＨβ転写のために陽性であるコロニーの数は、Ｇ４１８耐性であるコロニーの数に比較して少数であるが（１０3 個のＧ４１８耐性コロニー当たり約１個）、この結果は一般的に、他の相同的組換え実験のために報告される速度と一致する（Michael Kriegler, Gene Transfer and Expression A Loboratory Manual, Stockton Press, New York, NY(1990), 56〜60ページ）。相同的組換え速度は、標的決定された遺伝子の転写の割合に比例すると思われることが一般的に観察された（M.Frohmanand G.Martin, Cell, 56 : 145 (1989); S.L.Mansourなど、Nature, 336 : 348 (1988)) 。示された速度は、ＴＳＨβ遺伝子に対して生じるランダム変異のために予測される速度よりも３桁程度早いことが注目されるべきである。
【００６８】
個々のコロニープールについての結果が再生可能であり、そしてＲＮＡ転写の活性化が安定していることを確かめるために、第１回のスクリーニングで陽であると試験されたプールに対応する前もって凍結されたコロニープールを融解し、そして培養により拡張した。新しく融解されたＧＨ3 陽性プールを、Ｔ２５組織培養フラスコに接種し、そして細胞が７０％〜８０％の集密性に達するまで拡張した。次に、８０，０００個の細胞を、個々のフラスコからの２４ウェルプレートにプレートし、そしてそれらが５０〜７０％の集密性に達するまで増殖せしめた。ＲＮＡを、細胞から抽出し、ｃＤＮＡに転換し、そして６％ポリアクリルアミドゲル上に個々のＰＣＲ反応物１０μｌを負荷することによってＴＳＨβ ＲＮＡの存在についてもう１度スクリーンした。第１５図は、エチジウムブロミド染色及び蛍光によりポリアクリルアミドゲル上で可視化される場合の第２スクリーンからの代表的なＰＣＲ反応の結果を示す。レーン１，２及び３は、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯによりトランスフェクトされたＧＨ3 細胞からのｃＤＮＡに対して行なわれたＰＣＲ反応物を含む。ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯはＴＳＨβに相同の領域を含まず、そして従って、相同的組換えによりＴＳＨβ遺伝子を活性化することはできない。第１５図におけるゲル上に見出されるように、ＴＳＨβ遺伝子が活性化されないことを示すそれらのレーンにおける２４７bpに対応するバンドは存在しない。レーン６はまた、負の対照を含む。そのレーンにおいては、３種のプールが、ｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）によりトランスフェクトされているが、しかし第１スクリーニングに基づくＴＳＨβ遺伝子の転写のためには陰性であるＧＨ3 細胞のサンプルから組合された。レーン６における２４７bpのフラグメントの不在は、ゲノム中にランダムに組込まれたトランスフェクトされたｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）プラスミドの存在が２４７bpのＴＳＨβ ＰＣＲフラグメントを生成することができないことを示す。レーン７，８，９及び１０は、ラット下垂体から収穫された合計ＲＮＡから製造されたｃＤＮＡに対して行なわれたＰＣＲ反応物を、それぞれ反応当たり２５ng，１００ng, ２００ng及び４００ngの量で含む。通常ＴＳＨβを発現するラット組織から調製されたｃＤＮＡから生成された、予測される２４７bpのバンドのこれらのレーンにおける存在は、ＰＣＲ反応条件が正しく最適化され、そして相同的組換えＴＳＨβ陽性を含むレーン４及び５に得られるＰＣＲバンドが正しい大きさのものであることを示した。第１スクリーンにおいて陽性であるｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）によりトランスフェクトされた２種のプール、すなわちレーン４におけるＡｐａＩ−１０７及びレーン５におけるＡｐａＩ−１３６は、ＴＳＨβ遺伝子の転写が安定して活性化されたことを示すそれらのプールからの合計のＲＮＡ抽出物から製造されたｃＤＮＡから増幅された正しいＴＳＨβ ＰＣＲバンドの存在により示されるように、ＴＳＨβ遺伝子活性化のために陽性であることを再び示した。前の陽性ＡｐａＩ−１０７及びＡｐａＩ−１３６からのＲＮＡを含むレーン４及び５における２４７bpでのバンドの存在及びレーン１〜３におけるｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯトランスフェクトされたＧＨ3 細胞の負の対照及びレーン６におけるｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ−３−５ＸｂａＩ（ＡｐａＩ切断）トランスフェクトされた負の対照におけるバンドの不在は、前記ＲＮＡを通常生成しない細胞系におけるＴＳＨβ ＲＮＡの生成が相同的組換えにより安定して開始されたことを示した。
【００６９】
本発明は、本明細書に記載される細胞系に限定されない。すべての細胞系は、通常不活性である遺伝子情報を有する。ほとんどは、一定の遺伝子のみを発現することができる。しかしながら、そのうよないづれかの細胞系の通常転写的に不活性な遺伝子は本発明に従って遺伝子生成物を発現するために活性化され得、そしてゲノム中のいづれかの遺伝子は、本発明に従って変性されたその発現特徴を有する。前の形質転換が対象の遺伝子を破壊しない限り、前もって形質転換された細胞系が使用され得る。細胞系の源は重要でない。その細胞系は、動物又は植物系であり得、連続的又は不滅的であり得る。もちろん、そのような細胞系は、本発明の技法による処理の後、発現が商業化され得るように安定し且つ不滅的であることが所望される。クローンされた微生物は、真核又は原核生物のいづれであっても、また本発明の技法により処理され得る。
【００７０】
本発明は好ましくは、通常転写的に不活性な遺伝子の発現に関して記載されて来たが、本発明の技法はまた、宿主細胞系に天然において発現される遺伝子の発現特徴の変性に適用できる。たとえば、発現が意志により開始され、そして停止されるように、遺伝子の発現を培養条件又は同様のものに対して依存性にすることが所望される場合、抑制能力又は誘発能力のような特徴を付与する適切なＤＮＡ調節セグメント、たとえば調節可能プロモーターが挿入され得る。たとえば、細胞型が核ステロイド受容体、たとえばエストロゲン、テストステロン又はグルココルチコイド、又はチロキシン受容体を含むことが知られている場合、領域Ｆとしてステロイド又はチロキシン応答要素を使用することができる。そのような応答要素は、転写に対する正の応答を誘発するためにそのような受容体に結合するいづれかのＤＮＡである。たとえ細胞がグルココルチコイドに天然において応答しない場合でさえ、グルココルチコイド受容体をコードするＤＮＡの断片が、グルココルチコイドに対して応答性の細胞を製造するために、構造体に付加され、又はゲノムのどこかに挿入され得る。調節可能なプロモーターの使用が、対象の遺伝子が通常転写的に不活性であろうとなかろうと所望される。他の種類の調節がまた、本発明の方法により対象の正確な位置に適切なＤＮＡ調節セグメントを標的決定することによって得られる。
【００７１】
従って、通常転写的に不活性な遺伝子の発現の刺激は本発明の好ましい適用であるが、その広い意味において、それは宿主細胞系に対して内因性のいづれかの遺伝子の発現特徴の変性に適用できる。
【００７２】
相同的組換えの特定技法は、それ自体、本発明の新規部分ではない。そのような技法は知られており、そして当業者は、そのような技法が、対象の遺伝子に関して所望する位置にＤＮＡ調節配列の標的決定を可能にする限り、本発明に使用され得ることを理解するであろう。好ましい技法が、挿入されるべき配列のいづれかの末端上に２つの相同領域を有する線状化された構造体を用いて開示されているが、たとえば環状構造体を用いることによって、この機能を達成するであろういづれか他の技法もまた、本発明により包含される。本発明の臨界特徴は、細胞系のゲノムにおける遺伝子、好ましくは通常転写的に不活性な遺伝子により操作的に結合された、使用される細胞系又は微生物における発現特徴の変性を引き起こすＤＮＡ調節配列を挿入するために、又は増幅可能な配列の変性に基づいてそのような遺伝子の増幅を引き起こすためにすでに転写している細胞系のゲノムにおける遺伝子の十分に近くに、調節配列を伴わないで、増幅可能な配列を挿入するためへの相同的組換え技法の使用である。選択可能マーカーがまた包含されることは絶対的に必要なものではない。選択は、ＤＮＡ構造体の挿入に続く培地又は細胞における対象の遺伝子生成物又はｍＲＮＡの検出のみに基づかれている。さらに、調節配列が挿入される態様においては、所望には、増幅は操作能力のために臨界ではない。同じことが、スクリーニング工程を容易にする負の選択遺伝子のために真であるが、しかし本発明の成功のためには臨界でない。従って、基本的な態様は、所望する特定の位置にＤＮＡ調節セグメント又は増幅可能なセグメントの挿入のみを必要とする。しかしながら、調節セグメントが付加されている態様での増幅可能な遺伝子の付加のように、選択技法に使用するために正及び／又は負の選択可能マーカー遺伝子の付加が好ましい。
【００７３】
本明細書及び請求の範囲を通して使用される用語“発現の変性”とは、対象の生成物の発現を阻止するために、相同的組換えにより、対象の遺伝子中に変異、欠失、停止コドン又は他のヌクレオチド配列、たとえば全体の遺伝子を挿入することによって発現の終結を除外するように定義される。従来の技術は、特異的変異を導入するために相同的組換えの使用を教授し、そして細胞生成物の発現は、その手段により本質的に停止せしめられ得る(たとえばＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇなど、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８７：３２１０〜３２１４（１９９０）を参照のこと）。本発明は、そのような方法を包含しない。本発明においては、“発現の変性”は、相同的組換えにより特定の所望する位置で調節及び／又は増幅領域を挿入することによって達成される。好ましい変性は、対象の生成物の発現を活性化し、そして／又は増強する変性である。
【００７４】
本明細書は、ＤＮＡ調節セグメントが遺伝子“により操作的に結合される”という句を使用する場合、そのような用語は、ＤＮＡ調節セグメントが、そのような遺伝子の転写がそのＤＮＡ調節セグメントにより調節されるように対象の遺伝子に関して配置されることを意味する。調節セグメントは好ましくは、遺伝子の上流に存在するが、しかしその遺伝子の下流又はその遺伝子内に存在することができるが、但し、それはある手段において遺伝子の発現を調節するために作用する。ＤＮＡ調節セグメントは、プロモーター、ターミネーター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、アテニュエーター又は同様のもの、又はそれらのいづれかの組合せであり得る。
【００７５】
用語“上流”又は“下流”が本明細書及び請求の範囲に使用される場合、これは対象の遺伝子のコード鎖に対して、それぞれ５′−方向又は３′−方向を意味する。
【００７６】
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。本明細書に使用される誘法及び用語法は、記載の目的であって、限定的ではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、本発明のＤＮＡ構造体の一般的な外形を示す。
【図２】第２Ａ図は、非相同又はランダム組換えの出来事におけるゲノム中へのＤＮＡ構造体の組込みの態様を示す。第２Ｂ図は、相同的組換えの出来事におけるゲノム中へのＤＮＡ構造体の組込みの態様を示す。
【図３】第３図は、本発明に従っての好ましい相同的組換えベクターの構成を示す。
【図４】第４図は、単にＤＮＡの単一の標的断片が使用される場合、相同的組換えによるＤＮＡの環状断片の組込みの態様を示す。
【図５】第５図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴプラスミドを示す。
【図６】第６図は、その制限部位を含むｐＲＳＶプラスミドの構成を示す。
【図７】第７図は、その制限部位を含むｐＳＶ２ＮＥＯプラスミドを示す。
【図８】第８図は、その制限部位を含むｐＳＶＮＥＯＢＡＭプラスミドの構成を示す。
【図９】第９図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＮＥＯプラスミドの構成を示す。
【図１０】第１０図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯプラスミドの構成を示す。
【図１１】第１１図は、ラットＴＳＨβ遺伝子の１５．３kbフラグメント及びその種々の制限セグメントを示す。
【図１２】第１２図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３プラスミドの構成を示す。
【図１３】第１３図は、その制限部位を含むｐＲＳＶＣＡＴＮＥＯＴＳＨＢ３−５ＸｂａＩプラスミドの構成を示す。
【図１４】第１４図は、ＰＣＲ増幅のための個々のプライマーが対応するその領域にそってのＴＳＨβのヌクレオチド配列の一部を示す。エキソン２及び３は大文字で示される。２４７個の塩基対の増幅されたフラグメントは、大線を引かれた星印により示される。
【図１５】第１５図は、種々の細胞集団から抽出されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示し、そしてそのＴＳＨβ ｃＤＮＡは、存在する場合、ＰＣＲにより増幅されている。種々のラインを表わす細胞の性質がゲル下の第１５図に示される。
Claims (26)
- 相同組換えにより所定の真核宿主細胞系内の所定の遺伝子の発現特性を改変するのに適切であり、且つ当該所定の遺伝子を標的決定するのに適切であるＤＮＡ構造体であって：
作用可能式に連結されている場合に前記所定の遺伝子の発現を活性化及び／増強するＤＮＡ調節セグメント（Ｆ）；
前記宿主細胞内の前記所定の遺伝子内にある又はその付近にあるゲノム領域に相同性である二つのＤＮＡ標的決定セグメント（Ａ，Ｂ）、ここでその一方、即ちセグメント（Ａ）は前記調節セグメント（Ｆ）の挿入された特異的な領域の下流に位置するゲノム領域に対し相同性であり、そして他方のセグメント（Ｂ）は当該調節セグメント（Ｆ）の挿入された特異的な領域の上流に位置するゲノム領域に対し相同性である；
前記ＤＮＡ標的決定セグメントＡとＢとの間に配置された正の選択可能マーカー；
前記ＤＮＡ標的決定セグメントＡとＢとの間の外側に配置された負の選択可能マーカー；並びに
前記ＤＮＡ標的決定セグメントＡとＢとの間に配置された増幅可能な遺伝子；
を含んで成るＤＮＡ構造体。 - 前記ＤＮＡ調節セグメント（Ｆ）がプロモーターである、請求項１記載のＤＮＡ構造体。
- 少なくとも前記ＤＮＡ標的決定セグメントＢが前記ゲノムの非コーディング領域に対し相同性である、請求項１又は２記載のＤＮＡ構造体。
- 前記ＤＮＡ標的決定セグメントＡが前記所定の遺伝子の一部を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 前記正の選択可能マーカーが前記ＤＮＡ調節セグメント（Ｆ）とは異なる転写活性プロモーター領域を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 前記負の選択可能選択マーカーが前記ＤＮＡ調節セグメント（Ｆ）とは異なる転写活性プロモーター領域を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 前記増幅可能な遺伝子が前記ＤＮＡ調節セグメント（Ｆ）とは異なる転写活性プロモーター領域を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 前記正の選択可能マーカーがアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＢＰ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、複数薬物耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパーラート耐性遺伝子（ＣＡＤ）から成る群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 前記負の選択可能マーカーが単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 前記増幅可能な遺伝子がＤＨＦＲ、ＭＤＲ、ＯＤＣ、ＡＤＡ及びＣＡＤから成る群から選ばれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 線状化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 環状化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体。
- 所定の真核宿主細胞系における所定の遺伝子の発現特性を改変することにおいて、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体を利用する方法。
- 所定の真核宿主細胞系において所定のタンパク質を発現することにおいて、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体を利用する方法。
- 前記真核宿主細胞系が安定な細胞系である、請求項１３又は１４記載の方法。
- 前記真核宿主細胞系が分化した細胞系である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体によりトランスフェクトされた真核宿主細胞。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造体を含んで成るゲノム。
- 遺伝子生成物を製造するために請求項１７記載の細胞を利用する方法。
- 前記遺伝子生成物が前記遺伝子のｍＲＮＡ遺伝子である、請求項１９記載の方法。
- 前記遺伝子生成物がタンパク質である、請求項１９記載の方法。
- 請求項１７記載の細胞を培養する工程を含んで成る、遺伝子生成物を製造する方法。
- 化学的選択の段階を含んで成る、請求項２２記載の方法。
- 真核宿主細胞系において新たに活性化された遺伝子の特異的な遺伝子生成物の製造をモニターする段階をさらに含んで成る、請求項２２又は２３記載の方法。
- 遺伝子生成物の製造のための方法であって、
所定の真核宿主細胞系に対し、作用可能式に連結されている場合に当該真核宿主細胞系において所定の遺伝子の発現を活性化させる少なくともＤＮＡ調節セグメントと、正の選択可能マーカー及び／又は負の選択可能マーカーと、当該宿主細胞系内の当該所定の遺伝子内にある又はその付近にある領域に対し相同性である標的決定セグメントとを含んで成るＤＮＡ構造体を挿入し；
化学的選択を行い；そして
当該真核宿主細胞系において新たに活性化された遺伝子の特異的な遺伝子生成物の製造をモニターする；
ことを含んで成る方法。 - 前記細胞を培養する工程をさらに含んで成る、請求項２５記載の方法。
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