LT3998B - Endogenous gene expression modification with regulatory element - Google Patents

Endogenous gene expression modification with regulatory element Download PDF

Info

Publication number
LT3998B
LT3998B LTIP1595A LTIP1595A LT3998B LT 3998 B LT3998 B LT 3998B LT IP1595 A LTIP1595 A LT IP1595A LT IP1595 A LTIP1595 A LT IP1595A LT 3998 B LT3998 B LT 3998B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
gene
dna
cell line
genome
segment
Prior art date
Application number
LTIP1595A
Other languages
English (en)
Inventor
Scott C Chappel
Original Assignee
Applied Research Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23806064&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT3998(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Applied Research Systems filed Critical Applied Research Systems
Publication of LTIP1595A publication Critical patent/LTIP1595A/xx
Publication of LT3998B publication Critical patent/LT3998B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Šis išradimas surištas su procesu, kurio pagalba modifikuojamos geno, kuris natūraliai yra genome stabilių ląstelių linijoje ar klonuotame mikroorganizme, ekspresijos charakteristikos. Šis išradimas surištas su geno, kuris yra stabilių ląstelių linijoje ir normaliai netranskribuojamas arba inertiškas, aktyvacijos ir ekspresijos procesu. Rezultate - šio geno koduojamas baltymas yra ekspresuojamas. Šis reiškinys pasireiškia be ląstelių transfektingo su DNR, kuri koduoja produktą. Greičiausia, rezidentinis genas, kuoduojantis norimą produktą, identifikuojamas ląstelėje ir aktyvuojamas įterpiant tinkamą reguliatorinį segmentą, panaudojant metodą, kuris vadinamas homologinė rekombinacija. Teigiami ir (arba) neigiami pasirinkti markeriai taip pat gali būti įterpti tam, kad padėtų atrinkti ląsteles, kuriose teisinga homologinė rekombinacija įvyko. Papildomai išradime pasirinktas genas gali būti amplifikuotas tam, kad padidintų ekspresijos greičius, nežiūrint kad genas yra normaliai netranskribuojamas ir gali būti aktyvuotas pagal šį išradimą arba kaip endogeniškai ekspresuojamas produktas.
Gerai žinoma, kad kiekviena ląstelė organizme turi genetinę informaciją, kuri koduoja visus baltymus, randamus organizme. Bet, labai nedidelis genų, esančių duotąjame ląstelės tipe, procentas yra transkribuojamas. Viduląstelinis mechanizmas, kuriuo reguliuojamas transkribuojamų genų masyvas, yra jau suprastas. Specifiniai ląstelių baltymai, kurie yra branduojyje, sąveikauja su DNR reguliatoriniais segmentais, kurie yra susieti su tam tikrais genais. Ši sąveika branduolio baltymų su DNR reguliatorinėmis sekomis yra reikalinga genų traskripcijai. Rezultate vyksta iRNA biosintezė ir koduojamų genų ekspresija (Mitchell and Tjian, Science, 245:371,1989).
Šie DNR reguliatoriniai segmentai arba elementai kiekviename gene yra 5'krypties, ir atskirais atvejais, viduje arba net 3'-krypties. Dėka sąveikos su ląstelės specifiniais branduolio baltymais DNR reguliaciniai segmentai įtakoja RNR polimerazės, ekspresijos greitį limituojančio fermento aktyvumui, legvina priėjimo prie geno ir iRNR sintezę. Taigi, šie DNR segmentai ir rezidentiniai branduoliniai baltymai turi esminę reikšmę specifinių genų ekspresijos reguliacijai (Johnson and McKnight, Ann, Rev, Biochem., 58:799, 1989).
DNR reguliatoriniai segmentai yra surišimo su branduolio baltymais sritis. Šie branduolio baltymai jungiasi su DNR spirale ir, matyt, pakeičia jos struktūrą taip, kad reikalingą geną atpažįsta RNR polimerazė ir tai palengvina geno transkripciją. Šių specifinių reguliacinių baltymų ekspesija ląstelėse apsprendžia, kuris genas bus transkribuojamas ląstelės viduje ir greitį kuriuo ši ekspresija vyktų.
Šios specifinės sistemos pavyzdys: hipofizio ląstelės, bet ne kepenų ląstelės, ekspresuoja hipofizio baltymus, nepaisant to, kad, hipofizio genai, yra visose kepenų ląstelėse. Kepenų ląstelių branduoliai neturi specifinių DNR baltymų, kurie sąveikauja su hipofizio rezidentiniais genais kepenų ląstelėse.
Dabartiniai baltymų ekspresijos metodai, panaudojant rekombinantinės DNR technologiją.
Žinodami, kad specifinės DNR reguliatorinės sekos yra reikalingos aktyvuoti geno transkripciją tam tikrame ląstelės tipe, mokslininkai ekspresavo svetimus genus, naudojant genetinę inžineriją. Pagrinde, DNR reguliaciniai segmentai, kurie yra atpažįstami ląstelės branduolio baltymų, yra 5' krypties ekspresuojamam svetimo geno koduojamam regionui. Šiuo būdu po insercijos į ląstelę, svetima DNR gali būti ekspresuojama, kadangi ląstelės branduolio reguliatoriniai baltymai dabar atpažįsta šias reguliacines sekas. Šis metodas buvo naudojamas baltymų gavimui, kuriuos buvo sunku gauti ir išvalyti iš gamtinių šaltinių tradiciniais baltymų valymo būdais.
Šalia atpažįstamų DNR sekų ir dominančio geno yra naudojamas markeris prijungiamas prie DNR konstrukcijos. Šiuo būdu atrenkamos tiktai tos ląstelės, kurios išgyvena selekcijos terpėje. Pavyzdžui, neomicinui atsparus genas gali būti įterptas į ekspresijos vektorių. Po transfekcijos ląstelės auginamos G418 terpėje, kurioje esantis neomicinas yra letalus žinduolių ląstelėms. Ląstelės, turinčios reikalingą atsparumo neomicinui geną, bus atsparios šiam toksiškam poveikui. Tokiu būdu, tik ląstelės, turinčios transfekuotą DNR, išlieka kultūroje. Suprantama, kad bet koks markeris gali būti naudojamas pakankamai ilgai ląstelių, turinčių transfekuotą DNR, selekcijai. Taip pat suprantama, kad papildoma genetinė informacija gali būti bet kur ląstelėje. Bet svarbu, kad abu -reguliatorinis segmentas ir svetimas genas (taip pat ir markeris jame) būtų įvesti kartu.
Dabartinių genų ekspresijos metodų trūkumai
Nors aukščiau aprašyti metodai suteikia didesnes galimybes genų inžinierijai, jie ne visada būna efektyvūs genų ekspresijai. Tai surišta su tuo faktu, kad įterpimas DNR į ląstelės linijos branduolį paprastai pasiekiamas transfekcijos metodu. Išskiriama dominanti DNR , kuri įvedama į ląstelę, tam kad ji būtų ekspresuota, ištirpinant ląstelės membraną, kad būtų prieinama DNR. Kaip pažymėta aukščiau, tiksli vieta, į kurią įjungiama DNR į genomą niekada nenusakoma; iš tikrųjų DNR gali išlikti episomine (neintegruota į genomą). Rezultate nenuspėjama, kaip ir produkuojamo baltymo ekspresijos lygis taip ir ląstelės linijos stabilumas.
Kitas šio metodo trūkumas tai, kad ekspresijos vektoriaus konstravimas labai sudėtingas, kai interesuojantis genas yra santykinai didelis (didesnis nei 5-10 kilobazių). Dauguma baltymų, ekspresuojamų DNR technologijos pagalba, koduojami kDNR, o ne didesnių genominių klonų DNR. Tai sumažina bendrą intarpų dydį. Nors, naudojant kDNR genų inžinierija yra patogesnė, nukenčia geno transkripcijos greitis ir baltymų produkcija. Kaip dabar parodyta, didesnis ekspresijos lygis pasiekiamas naudojant genominės o ne kDNR intarpus (Brinster et ai., Proc. Natl, Acad. Sci., 85:836-840, 1988, and Chung and Perry, Mol. Cell, Biol., 9:4395-4405, 1988). Nors mechanizmas, kurio dėka vyksta šie reiškiniai, nėra gerai suprastas, yra žinoma, kad kai kuriais atvejais papildomi elementai, esantys intronuose, gali padidinti geno transkripcinį efektyvumą. Taip pat yra įrodymų, kad intronai arba splaisingas, kuris atsiranda dėka intronų, turi įtakos RNR procesingui, kuris seka po traskripcijos iniciavimo (Buchman and Berg, Mol. Cell, Biol., 8:4395-4405, 1988). Tai gali stabilizuoti transkriptą, tuo pačiu pagerinti iRNR akumuliacijos greitį. Abiejuose cituojamuose Brinster ir kitų straipsniuose postuluojama, kad intronų padėtis gene gali būti svarbi nukleosomų išsidėstymui promotoriaus atžvilgiu. Įvairių reguliacinių elementų įtaka eukariotų genų transkripcijai yra diskutuojama: Khoury et ai, Cell. 33:313-14 (1983), Maniatis et ai, Science, 236:1237-45 (1987) ir Muller et ai, Eur, J, Biochem., 176:485-95 (1988).
Trečia, tam kad įvesti į branduolį transfekuojamą DNR, su tiksliu koduojamu svetimo geno regionu, turi būti pernešta per pralaidžia padaryta ląstelės membraną iki branduolio. Tuo metu DNR gali kontaktuoti su liposomų fermentais, kurie gali pakeisti arba pilnai suardyti DNR. Todėl koduojantis DNR regionas gali būti ne toks, koks būna transfekuojamas.
Naudojant naują genų aktyvacijos ir (arba) ekspresijos modifikacijos metodą, kuris aprašomas žemiau, negaunamos tikslinių baltymų mutacinės formos, todėl kad tikslinio geno koduojantis regionas nėra veikiamas fermentų.
Apibendrinant galima pasakyti: didelė dalis transfekuojamos į ląstelę DNR, naudojant tradicinius metodus, ir ypatingai koduojantis regionas gali būti neteisingai transkribuojamas. Degradacija gali įvykti prieš įvedant į branduolį, fermentai gali pakeisti koduojamą tikslinį baltymą arba iškirpti reikalingus reguliatorinius segmentus, būtinus transkripcijai. Galimas įsijungimas genomo dalyje, kurioje nevyksta transkripcija. Jei kDNR transkribuojama, tikslinis baltymas gali būti efektyviai neprodukuojamas dėl intronų stokos, kurie padidina arba įgalina efektyvų iRNR procesingą. Pabaigoje, DNR gali išlikti episomine: baltymų produkcija gali būti išsaugoma, bet ląstelės gali būti nestabilios.
Norima buvo patobulinti genų ekspresijos indukcijos metodą taip, kad gauti ląstelių liniją su reikalingais požymiais kaip ir egzistuojančiais metodais, bet be neigiamų reiškinių. Taip pat buvo norima ekspresuoti arba modifikuoti endogeninę ekspresiją norimų genų pasirinktame ląstelių tipe. Buvo norima pasiekti privalumus, kurie gaunami iš pilnos genomo sekos, kuri gali būti sudaryta iš kryptinio transkripcinio sustiprintojo, kuris gali būti intronų viduje, taip pat tikamai išdėsčius intronus, tam kad vyktų būdingas nukleosomos fazavimas, ar efektyvesnė iRNR sintezė. Paprastai šie privalumai nėra naudojami rekombinantinės DNR ekspresijos metoduose, dėl geno dydžio. Jeigu pavyktų ekspresuoti geną jau esantį genome, tai yra, endogeninį geną, ląstelių linijos stabilumas ir ekspresijos greitis taptų pastovesniu ir nuspėjamu.
Šio išradimo tikslas yra eliminuoti aukščiau paminėtus trūkumus.
Kitas Šio išradimo tikslas - sukurti reguliacijos ir (arba) geno ekspresijos sustiprinimo metodą, išsaugant teigiamus rekombinantinės genų technologijos požymius, bet išvengiant neigiamų.
Kitas šio išradimo tikslas - sukurti ekspresijos metodą specifinių genų, kurie normaliai netranskribuojami pasirinktoje ląstelių linijoje.
Dar vienas šio išradimo tikslas - sukurti baltymų ekspresijos metodą, kuris apima pilnas genomines sekas, atsakingas už iRNR kaupimą ir(arba) transkripciją.
Tolesnis šio išradimo tikslas yra pateikti dominančio geno ekspresijos charakteristikų modifikavimo metodą, kai įvedami DNR reguliaciniai ir (arba) amplifikuojantys segmentai į stabilių ląstelių linijų arba klonuotų mikroorganizmų genomą 5' kryptimi, geno viduje arba kitoje vietoje arti dominančio natyvaus geno.
Sekantis šio išradimo tikslas yra pateikti ekspresijos charakteristikų modifikavimo metodą geno, kuris natūraliai yra stabilių ląstelių linijų arba klonuotų mikroorganizmų genome, ir tuo pačiu padaryti taip, kad būtų galima atrinkti ląsteles, kurios buvo tinkamai modifikuotos.
Kitas šio išradimo tikslas yra pertvarkyti genomą taip, kad reguliaciniai ir amplifikuojantys segmentai, kurie natūraliai neegzistuoja, būtų prie dominančio geno koduojančio regiono ar egzono.
Dar vienas šio išradimo tikslas paruošti DNR konstrukcijas, kurios gali būti panaudotos homologinės rekombinacijos tobulinimui.
Sekantis šio išradimo tikslas paruošti ląstelių linijas ir mikroorganizmus, kurie apima genomus, atitinkančius šį išradimą.
Šie ir kiti esamo išradimo objektai buvo tobulinti pasitelkus homologinę rekombinaciją, kurios pagalba su paprastu įgudimu galima iššaukti ekspresiją, greičiau, amplifikaciją esamų, nors netranskribuojamų genų. Šios technikos pagalba kiekvienas gali modifikuoti geno, kuris egzistuoja natūraliai, bet nebūtinai tylintis ar inertiškas stabilių ląstelių linijos genome, ekspresijos charakteristikas, pavyzdžiui, padaryti sąlyginę ekspresiją, t.y., represyvią ar indukuotą, arba sustiprinti ekspresijos laipsnį.
Šiuo išradimu pateikiamas geno, esančio ląstelės linijos ar mikroorganizmo genome, ekspresijos charakteristikų modifikavimo metodas. DNR konstrukcija yra įterpiama į tą genomą homologinės rekombinacijos pagalba. Konstrukcija turi DNR reguliacinį segmentą, sugebantį modifikuoti ekspresijos charakteristikas bet kokio geno, prie kurio jis yra efektyviai prijungtas šeimininko lątelių linijoje ar mikroorganizme, ir taikinio segmentą homologišką genomo regionui, prie kurio turi būti įterptas reikiamas DNR reguliacinis segmentas. Konstrukcija ir įterpimo technika sukurti taip, kad sukeltų naujo DNR reguliacinio segmento efektyvų prisijungimą prie dominančio geno. Todėl, neįterpiant kokį nors naują koduojantį egzoną, ekspresijos charakteristikos yra modifikuojamos. Pateiktoje medžiagoje genas yra tas, kuris yra normaliai tylintis ar inertiškas šeimininko ląstelių linijoje ar mikroorganizme ir kuris DNR reguliacinio regiono pagalba yra nutaikytas tiesiog prie atitinkamos šio geno pozicijos homologinės rekombinacijos pagalba, ir tuo būdu jis yra aktyvuotas savo produkto ekspresijai.
Paprastai DNR konstrukcija turi du taikinio segmentus, kurie, atskyrus vieną nuo kito konstrukcijoje ir įterpti į genomą, greičiausiai yra artimi ir natyviame gene.
Be to konstrukcija paprastai turi mažiausiai vieną ekspresyvų selektyvų markerinį geną, pavyzdžiui suteikiantį atsparumą neomicinui. Šis markerinis genas, turintis promotorių, yra taip pat išsidėstęs tarp dviejų konstrukcijos taikinio regionų.
Kitu atveju konstrukcija turi ekspresyvų amplifikacijos geną, tam kad amplifikuoti mus dominančio geno ekspresiją. Šis, promotorių turintis genas, taip pat yra tarp dviejų konstrukcijos taikinio regionų. Kai kuriais atvejais selektyvus ir amplifikacijos markeris gali būti tas pats.
Sekančije šio išradimo dalyje DNR konstrukcija turi negatyvų selektyvų markerinį geną, kuris neekspresuotas ląstelėse, kuriose DNR konstrukcija yra tinkamai įterpta. Šis negatyvus selektyvus markerinis genas yra už dviejų taikinio regionų taip, kad gali būti pašalintas, kai konstrukcija yra tinkamai suderinta homologinės rekombinacijos pagalba. Tokio negatyvaus selektyvaus markerinio geno pavyzdys yra Herpes viruso timidinkinazės genas.
Dar kitu atveju, įmanoma modifikuoti ekspresijos charakteristikas specifinio geno, kuris jau ekspresuoja dominantį produktą ląstelių linijoje ar mikroorganizme. Tai gali būti pasiekta įterpiant homologinės rekombinacijos būdu DNR konstrukciją, kuri turi (1) ekspresyvų amplifikacijos geną, kuris didina dominančio geno kopijų skaičių, kai ląstelių linija ar mikroorganizmas yra paveikiami amplifikacijos sąlygų ir (arba) (2) promotorinį (stiprinantį) elementą, (arba kitą reguliacinį elementą), kuris modifikuoja dominančio geno ekspresiją taip kaip, pavyzdžiui, transkripcijos laipsnio didinimas, transliacijos laipsnio didinimas, iRNR kaupimo didinimas, ekspresijos induktyvumo veikimas ir t.t. Geno ekspresija, kuri yra modifikuota šiuo būdu, gali būti natūrali ekspresija arba ekspresija, kuri gali būti iššaukta ląstelių linijos ar mikroorganizmo ankstesnės genetinės manipuliacijos. Minėta genetinė manipuliacija gali būti atlikta įprasta technika arba remiantis šiuo išradimu homologinės rekombinacijos būdu. Kitu atveju, DNR įterpimas, kurio pasekmė ekspresijos charakteristikų modifikacija, gali būti įvykdytas kaip dalis genetinės manipuliacijos, kuri baigiasi geno ekspresija, arba atliktas kaip sekantis žingsnis.
Šis išradimas taip pat apima konstrukcijas, paruoštas remiantis ankstesnėmis diskusijomis, ir genomus, kurie buvo tinkamai paveikti homologinės rekombinacijos būdu šių konstrukcijų pagalba, bei ląstelių linijas ir mikroorganizmus, turinčius šiuos genomus.
Be to, šiame išradime norimo produkto paruošimo procese taip pat aprašytas transformuotų ląstelių kultivavimas.
TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS
Fig. 1 charakterizuota bendra DNR konstrukcija pagal šį išradimą.
Fig. 2A parodytas DNR konstrukcijos nehomologinės arba atsitiktinės rekombinancijos integracijos į genomą būdas.
Fig. 2B parodytas DNR konstrukcijos homologinės rekombinancijos integracijos į genomą būdas.
Fig. 3 parodyta galima homologinės rekombinacijos vektoriaus konstrukcija pagal šį išradimą.
Fig. 4 parodytas fragmentas žiedinės DNR homologinės rekombinacijos integracijos būdas, kai tik vienintelis DNR fragmentas naudojamas.
Fig. 5 parodyta pRSVCAT plazmidė su kirpimo sritimis joje.
Fig. 6 parodyta pRSV plazmidės konstrukcija su kirpimo sritimis joje.
Fig. 7 parodyta pSV2NEO plazmidė su kirpimo sritimis joje.
Fig. 8 parodyta pSVNEOBAM plazmidės konstrukcija su kirpimo sritimis joje.
Fig. 9 parodyta pRSVNEO plazmidės konstrukcija su kirpimo sritimis joje.
Fig. 10 parodyta pRSVCATNEO plazmidės konstrukcija su kirpimo sritimis joje.
Fig. 11 parodytas žiurkių TSHp geno 15.3 kb fragmentas su kirpimo sritimis jame.
Fig. 12 parodyta pRSVCATNEOTSHB3 plazmidės konstrukcija su kirpimo sritimis joje.
Fig. 13 parodyta pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI plazmidės konstrukcija su kirpimo sritimis joje.
Fig. 14 parodyta dalis TSHp nukleotidų sekos su sritimis, kurioms atitinka kiekvienas GPR amplifikacijos pradmuo. Egzonai 2 ir 3 yra parodyti didžiosiomis raidėmis. 247 bazių porų amplifikuojami fragmentai parodyti pabraukiant žvaigždutėmis.
Ί
Fig. 15 parodyti rezultatai elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje kDNR, susintetintos iš RNR, ekstrahuotos iš įvairių ląstelių populiacijų ir kurios ΤβΗβ cDNR, jei aptikta, buvo amplifikuota PCR keliu. Lusteliu prigimtis nurodyta žemiau gelio.
Homologinės rekombinacijos metodas išvystytas per paskutinius kelis metus ir skirtas pakeisti genus arba pataisyti mutaciją transkriptiškai aktyviuose genuose (Kucherlapati, Prog, in Nucl. Acid Res, and Mol. Biol., 36:301 (1989)). Šis homologinės rekombinacijos metodas buvo išvystytas kaip metodas specifinėms mutacijoms iššaukti specifiniuose žinduolių genomų regionuose (Thomas et ai., Cell, 44:419-428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell, 51:503-512, 1987; Doetschman et ai., Proc. Natl. Acad, Sci., 85:8583-8587, 1988) arba koreguoti specifinės mutacijas defektiniuose genuose (Doetschman et ai., Nature, 330:576-578, 1987).
Šio metodo pagalba DNR segmentas, kurį norima įterpti į genomą, gali būti nukreipiamas į interesuojamo geno specifinį regioną prijungiant jį prie taikinio DNR. Taikinio DNR yra DNR, kuri yra komplementari (homologinė) genominės DNR regionui. Jei dvi homologinės vienspiralės DNR dalys (tai yra taikinio DNR ir genominė DNR) yra labai artimos, tai jos hibridizuojasi sudarydamos dvispiralę. Prijungiama prie taikinio DNR yra DNR seka, kurią norime įterpti į genomą.
Yra daugybė metodų, kurių pagalba pasireiškia homologinė rekombinacija. Pavyzdys - DNR replikacijos proceso metu, kai vyksta ląstelių mitozė.
Mechanizmo, kuris nėra pilnai suprastas, pagalba, tėvinė dvispiralė DNR yra staigiai išardoma prieš ląstelės skilimą lokaliame regione, vadinamame replikacijos burbulu. Dvi išskirtos DNR grandinės tarnauja kaip pagrindas, nuo kurio sintezuojama nauja DNR grandinė. Viena replikacinė atšaka turi DNR kodą nuo 5' į 3' kryptimi, kuri yra tinkama orientacija nuo kurios fermentas DNR polimerazė gali nuskaityti. Šis fermentas sąveikauja su 5' galu vienspiralės DNR ir atitinkamai grandinei pradeda sintetinti komplementarią DNR. Kita tėvinė DNR grandinė yra koduojama nuo 3' į 5' kryptimi. Ji negali būti DNR polimerazės nuskaitoma šia kryptimi. Šiai DNR replikacijos mechanizmas yra specialus.
Specializuotas fermentas, RNR praimazė, prisijungia prie 3' 5' DNR grandinės ir sintetina trumpą RNR pradmenį su intervalais grandinėje. Panaudojant šiuos trumpus RNR segmentų pradmenis, DNR polimerazė jau gali prisijungti prie pradmens ir sintetina komplementarią dalį DNR 5' 3' kryptimi. Šios naujai susintetintos DNR dalys yra vadinamos Okazaki fragmentais. RNR pradmenys, kurie yra atsakingi už pilną reakciją yra pašalinami egzonukleazine DNR polimerazės funkcija ir pakeičiami DNR. Šis reiškinys tęsiasi tol, kol pasiekia DNR šaką, neturinčią pradmens, čia ir sustoja lokalinis sintezės procesas. Taigi, nors komplementari tėvinė šaka yra ištisai sintetinama 3' 5' kryptimi, ištikrųjų susiuvama 5' 3' kryptimi. Jokių trūkių, kurie gali atsirasti DNR susiuvimo metu, nebūna, nes jie sujungiami fermentu, vadinamu DNR ligaze.
Absoliučiam DNR kodų adekvatumui patvirtinti, teisingai nuskaitymo funkcijai yra naudojama DNR polimerazė. DNR polimerazei reikalingi DNR pradmenys nuo kurių sintetinama nauja DNR spiralė. Kaip pažymėta aukščiau, tai gali būti vienguba DNR grandinė, kuri sintetinama pradmenų pagalba su RNR, arba komplementari DNR grandinei. Kai DNR polimerazė suranda neatitikimą komplementariam DNR gabale, ji gali veikti kaip endonukleazė ir pašalinti DNR bazes 3' 5' kryptimi, kol nepakeičia klaidingų sričių.
Tai žinant, galima suprasti aprašyto metodo pagrindus. Maži gabalai taikinio DNR, kuri yra komplementari specifiniam genomo regionui, sąveikauja su tėvine DNR grandine replikacijos proceso metu. Tai pagrindinė DNR, kuri įterpiama į hibridizuojamą ląstelę, savybė ir todėl rekombinuoja su kitais DNR gabalais išmėtytais homologiniame regione. Jei ši komplementari grandinė yra prijungiama prie oligonukleotido, kuriame yra mutacija arba skirtumai DNR sekoje, tai taip pat ji įjungiama į naujai sitetinamą grandinę, kaip rekombinacijos rezultatas. Teisingo nuskaitymo funkcijos rezultate galima gauti naują DNR seką, kuri tarnauja matrica. Tagi, transfekuojama DNR yra įjungiama į genomą.
Jei tam tikro geno seka žinoma, tai gabalai DNR , kurie yra komplementarūs pasirinktam geno regionui, gali būti susintetinti arba kitu būdu gaunami, tokiu kaip atitinkama restrikcija natyvios DNR specifiniuose atpažinimo vietose, interesuojančiame regione. Šis gabalas naudojamas kaip taikinys įvedimui į ląstelę ir gali hibridizuotis su jam homologiniu genomo regionu. Jei ši hibridizacija vyksta DNR replikacijos metu, tai šis DNR gabalas ir bet kokia papildoma prijungta seka, gali veikti kaip Okazaki fragmentas ir gali susiūti į naujai sintetinamą dukterinę DNR grandinę.
Šiame išradimo metode šie gabalai prijungti prie taikinio DNR yra DNR regionai, kurie yra žinomi, kad sąveikauja su reguliatoriniais baltymais, esančiais ląstelėje, ir nebūtinai ekspresiją sustiprinančiais ir DNR selektyvumo markeriais. Tagi, specifinių baltymų ekspresija gali būti pasiekta ne per DNR transfekciją, kuri koduoja patį geną ir DNR markerius, kaip plačiausiai naudojamas, bet geriau naudojant taikinio DNR (homologiniai regionai su dominančiu endogeniniu genu) sujunta su DNR reguliatoriniais segmentais, kurie padaro geną atpažįstamą transkripcijai. Su šio metodo pagalba galima ekspresuoti ir sustiprinti ekspresiją bet kokio giminingo geno, kuris yra tame ląstelės tipe, be šio geno transfektingo. Papildant, šio geno ekspresija kontroliuojama visa genomine DNR , o ne geno dalimis arba kDNR, tuo būdu padidina transkripcijos greitį ir iRNR procesingo efektyvumą. Be to bet kokio giminingo geno, esančio tame ląstelės tipe, ekspresijos charakteristikos gali būti modifikuojamos atitinkamu intarpu su pilnu koduojančiu genu.
Sutinkamai su šiais aspektais, šis išradimas įgalina nauju metodu ekspresuoti normaliai traskriptiškai inertiškus dominančius genus arba modifikuoti ekspresiją endogeniškai ekspresuojamų genų diferencijuotoje ląstelėje. Giminingos genominės sekos, kurias norima ekspresuoti, arba modifikuoti jų ekspresiją, turi būti papildytos reikalingomis ląstelei specifinėmis DNR sekomis (reguliatorinėmis ir (arba) ekspresijos sustiprinimo segmentais) tam kad būtų galima valdyti arba modifikuoti ląstelėje esančių genų ekspresiją. Galutinė DNR apima DNR seką, koduojančią norimą baltymą, sujungtą su heterologine (gimininga DNR seka) reguliaciniais ir (arba) amplifikaciniais segmentais. Teigiamas atrinkimo markeris pasirinktinai įjungiamas į konstrukciją, tam kad būtų galima atrinkti pakeistas ląsteles. Pirmenybė teikiama atsparumo neomicinui genams net jei naudojami ir kiti markeriai. Neigiami atrinkimo markeriai nebūtinai gali būti naudojami. Pavyzdžui, Herpes viruso timidinkinazės (HSVtk) genas gali būti naudojamas kaip atrankos markeris atrinkti nuo atsitiktinai integruotų vektorių DNR. Sulietos DNR arba esančios ekspresuojamos DNR gali būti amplifikuojamos, jei taikinio DNR yra sujungiama su amplifikacijos markeriu.
Taip pat, pagal pateikiamo išradimo metodą bet koks specifinės eukariotų ląstelės, ypatingai diferencijuotų ląstelių, genas, kuris yra normaliai ekspresuojamas gali stimuliuoti ekspresiją ląstelių linijoje, kurioje normalioje būsenoje neekspresuojami. Tai pasireiškia ir be įterpimo pinos DNR sekos šiam genui. Papildomai, šis genas arba normaliai ekspresuojamas genas gali būti amplifikuojamas ekspresijos greičiui padidinti. Papildomai, genų,, kurie nepilnai neekspresuojami, ekspresijos chrakteristikos gali būti modifikuojamos kaip ir mikroorganizmų ląstelių ekspresijos chrakteristikos.
Vienoje pateikiamo išradimo dalyje eukariotinės ląstelės, kurios turi, bet nenormaliai transkribuojamą specifinį dominantį geną, indukuojamos čia aprašomo metodo pagalba. Homologinis rekombinacinis vektorius, kuris yra žemiau aprašomas, įterpiamas į ląstelių kloną ir cheminės selekcijos pagalba stebima specifinio geno produkcija bet kuriuo būdu, tokiu kaip, pavyzdžiui naujai aktyvuoto geno traskribuojamos iRNR nustatymas, imunologinė specifinių geno produktų analizė arba specifinio geno produkto aktyvumo nustatymas.
Bendras DNR konstrukcijos, kuri naudojama transkriptiškai aktyvuoti endogeniniam genui homologinės rekombinacijos metodu, planas pavaizduotas Fig.l.
Bendrai DNR konstrukcija susideda mažiausia iš dviejų iki šešių arba daugiau atskirų DNR segmentų. Segmentai susideda iš mažiausia iš vieno, paprastai iš dviejų, DNR taikinio segmentų (A ir B) homologinių ląstelės genomo regionui arba artimo ekspresuojamam genui, teigiamos selekcijos geno (C), amplifikacijos geno (D), neigiamos selekcijos geno (E) ir DNR reguliacinio segmento (F), kuris traskribuojamas ląstelėse, kurios trasiekuojamos. Pagrindiniuse pateikiamo išradimo dalyse naudojami tik vienas taikinio segmentas (B) ir reguliacinis segmentas (F). Visi kiti regionai yra nebūtini pasirenkant konstrukciją.
Regionai A ir B yra DNR sekos, kurios yra homologinės interesuojamo endogeninio geno regionams, kuriuos norima padaryrti traskribuojamais. Specifiniai endogeninio geno regionai A ir B pasirenkami atitinkamai 5' arba 3' krypties, kurioje norima, kad reguliacinis segmentas būtų įterpiamas. Nors šie regionai išskirti konstrukcijoje, bet pageidujama, kad jie būtų vientisi endogeniniame gene. Galimi atvejai kai naudojamos nevientisos genomo, kuris naudojamas taikinio segmentu, dalys, pavyzdžiui, gali būti iškirpta dalis genomo, tokia kaip negatyvus reguliacinis elementas.
Kai pasirenkami du taikinio regionai A ir B, tam kad padidinti homologinį regioną ir rekombinacijos efektyvumą, pateikiamas išradime metodas taip pat įgalina panaudoti tik vieną taikinio regioną. Šiame paprastesniame būde (kai tik įvedami reguliacinis segmentas F, selektyvaus markerio genas C ir promotorius C') yra naudojama plazmidinė DNR, kuri susideda iš elementų kartu su taikinio DNR (žiūr. Fig. 4). Šiuo būdu, homologinis regionas (B) hibridizuojasi su atitinkančia genomine dalimi. C' segmentas, C ir F yra įvedami į giminingą geno B dalį krosingoverio pagalba.
Kai norima kad DNR reguliacinė seka būtų įvesta 5' kryptimi į interesuojamą geną, pavyzdžiui, kai norima aktyvuoti ir ekspresuoti normaliai netranskribuojamą geną, pageidaujama, kad homologinis regionas būtų nekoduojančioje genomo dalyje, 5' kryptimi koduojančiai dominančio geno daliai. Kai yra du taikinio regionai, 5' krypties regionas (A) turi turėti savyje 5' krypties (A) dalį,kuri turi turėti sąvyje koduojantį regioną, nors pageidaujama, kad ištisas koduojantis regionas eitų po. Papildomai pageidaujama, kad homologiniai regionai būtų pasirenkami taip, kad DNR reguliacinė seka būtų įvesta 5' krypties natyviam interesuojamo geno promotoriui, ypač kai natyvus promotorius yra negatyvus, o ne reguliuojamas teigiamas promotorius.
Taikinio regionų dydis, tai yra, homologijos regionų, nėra kritinis, nors trumpesni regionai su mažesne tikimybe suras atitinkamus homologinius regionus ir rekombinuosis norimoje vietoje. Taigi, trumpesni homologiniai regionai mažiau efektyvūs homologinėje rekombinacijoje, tai yra, gaunama mažesnė dalis sėkmimingai rekombinuotų klonų. Nustatyta, kad mažiausia homologinei sekai reikalingos 25 bazių poros (Ayares et ai, PNAS, USA. 83:5199-5203, 1986). Jeigu bet koks kitas konstrukcijos elementas surandamas šeimininko ląstelės genome, tai rekombinacija gali vykti klaidingoje vietoje. Kadangi šio metodo galimybės vykdyti teigiamą ir neigiamą atranką yra puikios, jis gali būti sėkmingai panaudotas net ir tais atvejais, kai efektyvumas mažas. Optimalūs rezultatai pasiekiami, kai bendras homologinis regionas, kuris susideda iš abiejų taikinio regionų, yra didelis, pavyzdžiui, nuo vienos iki trijų kilobazių. Reguliatorinis F segmentas gali būti tokio ilgio, kokį dar galima operatyviai sujungti su interesuojančiu genu, jo ilgis nelimituojamas taikinio regionu ir ypatingai kai taikinio regionas yra 3' krypties.
Empyriškai lengva nustatyti ar taikinio regionas yra per ilgas, ar reguliacinis segmentas F išsidėsto per toli nuo koduojamo prijungiamo geno regiono. Tokiu būdu, regionai A ir B gali būti padaryti homologiniais skirtingose interesuojamo geno dalyse ir procesas kartojamas tol, kol reguliacinis segmentas F tinkamai bus įterptas ir sujungtas su interesuojamu genu. Pavyzdžiui, restrikcijos sritis sujungtų endogeninio geno regionų A-B gali būti pakeista ir procesas pakartotas. Žinant šio išradimo koncepciją ir čia aprašytus metodus, kiekvienas, turintis įgūdžių šioje srityje, galės jį panaudot bet kokiam genui, bet kokioj ląstelių linijoj ar mikroorganizme, nedarant jokių preliminarių eksperimentų.
Regionas C yra teigiamas geno selekcijos markeris, kuris gali perteikti transfekuotai ląstelių linijai atsparumą normaliai toksiškai terpei. Tokių genų pavyzdžiai yra tokie kaip: adenozindeaminazė (ADA), aminoglikozidfosfotransferazė (neo), dihidrofolatreduktazė (DHFR), higromicin-B-fosfattransferazė (HPH), timidinkinazė (tk), ksantino-guanino fosforiboziltransferazė (gpt), keliems reaktyvams atsparumo genas (MDR), ornitindekarboksilazė (ODC) ir N(fosfonacetil)-L-aspartatui atsparumo (CAD).
Papildomai prie teigiamo selekcijos markerio geno įjungiamas į konstrukciją amplifikacijos genas prie regiono D. Amplifikacijos genai, tai tokie genai, kurie padidina kopijų skaičių, esant teigiamam poveikui. Genų, išdėstytų greta amplifikacijos geno, kopijų skaičius dar padidėja. Amplifikacijos genai įjungiantys DHFR, MDR, ODC, ADA ir CAD gali būti panaudojami. Šie markeriniai selekcijos genai ir amplifikuojantys genai persidengia taip, kad teoriškai, vietoj dviejų genų, vieno atrankai ir vieno amplifikavimui, gali būti panaudotas vienas genas abiem tikslams. Kadangi dauguma ląstelių linijų turi endogenines kopijas šių amplifikavimo genų, ląstelės gali būti atsparios atrankos sąlygoms ir tada sunku atrinkti ląsteles, kuriose įvyko transfekcija. Tais atvejais, kai reikalingas amplifikacijos genas, teigiamos selekcijos genas, kuris yra dominuojantis, toks kaip HPH, gpt, neo ir tk (tk_ ląstelėse), turi būti įjungtas į konstrukciją. Kai kuriais atvejais yra galimybė ar pirmenybė neįtraukti amplifikacijos markerį. Interesuojantis genas gali nereikalauti amplifikacijos kaip, pavyzdžiui, transkripcinė aktyvacija heterologine DNR reguliacine seka yra pakankama ir be amplifikacijos. Taip pat, jei homologinės rekombinacijos efektyvumas yra žemas, tai būtina neįjungti amplifikacijos geną, todėl, kad santykis nehomologinės DNR su homologine DNR tiesiogiai surištas su homologinės rekombinacijos efektyvumu (Letsou, Genetics, 177:759-770, 1987). Taip pat galima eliminuoti teigiamą selekcijos geną ir atrinkti ląsteles tiktai tikrinant produkciją reikalingo baltymo arba iRNR. Geriau yra daugumoje atvejų įjungti bent teigiamą selekcijos geną.
Konstrukcijos regionas E yra neigiamas selekcijos markerio genas. Toks genas neekspresuojamas ląstelėse, į kurias DNR konstrukcija tinkamai įterpiama homologinės rekombinacijos pagalba, bet ekspresuojamas ląstelėse, į kurias DNR konstrukcija įterpiama klaidingai, atsitiktinės integracijos būdu. Vienas iš tokių genų yra Herpes viruso timidinkinazės genas (HSVtk). HSVtk turi mažesnį griežtumą nukleotidams ir jis pajėgia fosforilinti nukleotidų analogus, o to normalios žinduolių ląstelės nesugeba. Jei HSVtk yra ląstelėse, tai nukleotidų analogai, tokie kaip aciklovir ir ganciklovir yra fosforilinami ir įjungiami į šeimininko ląstelę ir nužudo ląstelę. Esant neigiamam selekcijos markeriui, homologinės rekombinacijos metu įgalina vygdyti teigiamą-neigiamą selekciją pagal Mansour et ai (Nature, 336:348-352, 1988). Capecchi naudojama strategija suteikia galimybę palyginti skirtingus integracijos būdus, kurie galimi, kai tiesinis DNR vektorius įterpiamas homologinės rekombinacijos pagalba su intarpais, kurie gaunami atsitiktinės integracijos pagalba. Jei DNR vektorius įterpiamas atsitiktinės integracijos pagalba, tai dauguma intarpų įterpiami per galus (Folger et ai, Mol. Cel. Biol.. 2:1372-1387, 1982; Roth et ai, Mol. Cel, Biol·· 5:2599-2607, 1985 ir Thomas et ai, Cell, 44:419-428, 1986). Kitu atveju, jei vektorius įterpiamas homologinės rekombinacijos pagalba, tai gali rekombinuotis per homologijos regionus, ko pasėkoje prarandamos sekos, kurios yra už šių regionų.
Naudojant konstrukciją pavaizduotą Fig.l, homologinės rekombinacijos palyginimas su atsitiktine integracija iliustruotas Fig. 2A ir 2B. Nehomologinės rekombinacijos atveju (Fig. 2A) vektorius įterpiamas per konstrukcijos galus.Tai įgalina regioną E, šiuo atveju HSVtk genas, įterpti į genomą. Nors, kai vyksta homologinbė rekombinacija (Fig. 2B), HSVtk genas prarandamas. Pirmas selekcijos etapas - pasirinkimas tinkamo teigiamos selekcijos reaktyvo arba selekcijos sąlygų pasirinkimas. Ląstelės, turinčios integruotą DNR, kaip homologinės rekombinacijos pagalba, taip ir atsitiktine integracija, turi turėti šį selekcijos etapą. Išlikusios ląstelės turi būti išlaikomos su selekcijos reagentu, tokiu kaip gancikloviru, kuris nužudo visas ląsteles, kurios turi HSVtk geną. Tuo bubu, dauguma ląstelių, į kurias vektorius yra integruojamas atsitiktinės integracijos pagalba, turi HSVtk geną ir yra nužudomos selekcijos reaktyvo, o tos ląstelės, į kurias vektorius įvedamas homologinės rekombinacijos pagalba praranda HSVtk geną ir išgyvena. Tai įgalina atskirti daugumą ląstelių, kurios turi integruotą DNR atsitiktinės integracijos pagalba, nuo ląstelių, kurios turi sąvyje DNR, įvestą homologinės rekombinacijos pagalba. Tai labai palengvina teisingos rekombinacijos indentifikavimą.
Negatyvios selekcijos etapas taip pat gali būti eliminuojamas, jei tai būtina. Tai reikalauja, inensyvesnio atrinkimo etapo, reikalaujančio tokių metodų, kaip grandininės polimerazinės reakcija (GPR) arba immunologinio tyrimo.
Šeštas regionas (F) turi sąvyje reguliacinį DNR segmentą, kuris naudojamas interesuojamo geno transkripciniam aktyvumui padidinti. DNR reguliacinio sekmento pasirinkamas priklauso nuo ląstelių tipo. Paprastai reguliacinis segmentas pasirenkamas toks, kad apie jį žinoma, kad jis palaiko diferencijuotų ląstelių linijos geno ekspresiją. Pavyzdžiui, jei šeimininko ląstelės yra hipofizio ląstelės, kurios natūraliai ekspresuoja tokius baltymus, kaip augimo hormoną ir prolaktiną, kiekvieno iš šių genų promotorius gali būti naudojamas kaip DNR reguliacinis elementas F. Pagal šį išradimą įterpus, reguliacinis segmentas prijungiamas prie normaliai neekspresuojamo interesuojamo geno, gali stimuliuoti transkripciją ir (arba) šeimininko ląstelių linijos geno ekspresiją. Taip pat galima naudoti sumaišytus DNR reguliacinius elementus, kurie veikia įvairiose ląstelių tipuose, tokius kaip Rous sarkomos viruso (RSV) promotorius. Kol reguliacinis segmentas stimuliuoja transkripciją ir (arba) ekspresiją, ar gali būti indukuojama transkripcijos stimuliacija ir (arba) ekspresija interesuojamo geno po to, kai jis įterpiamas į šeimininko ląstelės liniją, kuris prijungiamas prie interesuojamo geno pagal šį išradimą, toks reguliatorinis segmentas gali būti naudojamas šiame išradime. Kai jungiamas reguliacinis segmentas F prie taikinio segmento A svarbu, kad nebūtų pradžios kodonas atsitiktinai įvestas į seką, todėl kad negali būti pakeistas ekspresuojamo geno skaitymo rėmelis. Žinoma, konstrukcija turi būti sudaryta ir įterpta taip, kad reguliacinis segmentas F būtų prijungtas prie interesuojamo geno.
DNR reguliacinio segmento, regiono F, gali nebūti tais atvejais, kai jis reikalingas išplėsti ar amplifikuoti geno transkripciją, kuri egzistuoja pasirinktoje ląstelėje, todėl, kad jis natūraliai ekspesuojamas šiose ląstelėse, ar ląstelių linijos DNR turi būti pakeista taip, kad būtų iššaukta ši ekspresija. Kai kuriais atvejais įvedus amplifikuojantį geną, regioną D, kartu su teigiamu selekcijos markerio genu, regionu C, ir nebūtinai su neigiamu selekcijos markerio genu, regionu E, pakanka tam, kad padidėtų interesuojamo geno kopijų skaičius ir kad padidėtų transkripcija. Taip pat, jei naujas reguliacinis segmentas, regionas F, iš esmės aktyvuoja (ar kitaip modifikuoja), transkripcijos greičio padidėjimą, palyginus su egzistuojančiu interesuojamo geno reguliacijos regionu, jis gali būti įvestas egzistuojančiai interesuojamo geno transkricijai padidinti. Toks naujas reguliacinis segmentas gali turėti sąvyje promotorius arba sustiprintojus, kurie padidina transkripcijos efektyvumą,
Regionai C', D' ir E' yra promotoriaus regionai, ir yra naudojami valdymui atitinkamų regionų: C, D ir E. Šie promotoriai transkribuojami pasirenkamoje ląstelių linijoje ir gali būti tokie pat ar skirtingi, nei regiono F promotoriai, kurie valdo interesuojamą endogeninį geną. Transkripcijos kryptis, pažymėta Fig. 1, nėra kritinė. Šio būdo dėka galima pasirinkti genų C, D ir E ir jų promotorių vietą, taip, kad šie promotoriai stimuliuotų asocijuotus genus, be interesuojamo geno sugadinimo ar bet kokių kitų genų kostrukcijos pažeidimų.
Pateikiamas išradimas gali būti iliustruotas žiurkių -tyrotropino subvieneto (TSH) aktyvacija GHj (ATCC CCL 82), GH3 (ATCC CCL 82.1) arba GH4, ląstelių linijose (GH). GH ląstelių linijos kilusios iš radiacija žiukėse indukuoto hipofizio auglio, jos žymimos MtT/W5 (Takemoto, Cancer Res., 22:917, 1962) ir adaptuotos auginimui kultūroje Tashjian et ai, Endocrinology, 82:342-352, 1968. Šių ląstelių linijos gali būti subklonuotos ir atrinktos pagal jų sugebėjimą produkuoti augimo hormoną ir TSH. Tokia atranka gali būti atlikta Northern blotavimo pagalba, nustatant žirkių augimo hormono geno iRNR ir įrodant, kad šis genas yra ir TSH geno iRNR neprodukuojama. Taip pat ląstelės gali būti tikrinimos Southern blotavimo pagalba, tam kad nustatyti ar tikrai yra bet viena TSH geno kopija genome. Tolesniam darbe naudojamos tik tos GH ląstelės, kurios produkuoja augimo hormoną, bet ne TSH , bet turinčios TSH geno kopiją.
Specifinis homologinės rekombinacijos vektorius gali būti toks (Fig. 3). Regionas A turi turėti 5' krypties netransliuojamą TSH geno segmetą, iškirptą HindlII pagalba nuo -74 iki -2785 ir regionas B turi turėti apie 2,1 kb DNR fragmentą, kuris iškerpamas HindlII pagalba nuo -2785 iki Ncol saito yra aprašytas Carr et ai (J.Biol. Chem., 262:981-987, 1987) ir Croyle et ai (DNA, 5:299-304, 1986). Teigiamos atrankos genas (regionas C) gali būti 1067 bp ilgio, BglII-SmaI pagalba gautas fragmentas iš plazmidės pSV2neo (ATCC No. 37, 149) (Southern et ai, T Mol. Appl. Gen., 1:327-341, 1982). Genas neo gali būti valdomas Rous Sarkomos viruso (RSV) promotoriaus pagalba (regionas Cj, kuris paimamas iš Ndel-Hindll fragmento plazmidės pRSVcat (ATCC No. 37,152) (Gorman et ai, PNAS, 79:67776781, 1982). Šiame pavyzdyje nereikalinga naudoti amplifikacijos markerio, todėl nereikalingi regionai D, tam kad būtų optimizuotas homologinės rekombinacijos efektyvumas. Efektyvumas atvirkščiai proporcingas nehomologinės sekos santykiui su homologinėmis sekomis, esančiomis šioje konstrukcijoje (Letsou et ai, Genetics. 177:759-770, 1987). Regionas E, arba neigiamos selekcijos genas, gali būti iš HSVtk geno, kurio Xho fragmentas 2 kb dydžio paimamas iš plazmidės pMCITK (Capecchi et ai, Nature, 336:348-352, 1988). Šioje konstrukcijoje genas HSVtk gali būti paimamas iš polinomos viruso promotoriaus ir sustiprintojas (regionas Ej sukonstruotas pagal Thomas et ai (Cell, 51:503-512, 1987). Sekančioje DNR konstrukcijoje polinomos promotorius gali būti pakeistas RSV promotorių, aprašytu aukščiau. DNR reguliacinė seka, kuria aktyvuojamas TSH genas, gali būti kaip RSV promotorius, taip ir žiurkių augimo hormono promotorius. Žiurkių augimo hormono promotorius yra SacI-EcoRI fragmete, gaunamas iš plazmidės pRGH237CAT (Larson et , PNAS, 83:8283-8287, 1986). RSV promotorius gali būti naudojamas ne tik GH ląstelėse, nes GH promotorius aktyvus GH ląstelėse ir gali būti specifiškai indukuotas (Brent et ai, J. Biol. Chem., 264:178-182, 1989). Žiurkių augimo hormono promotorius ir RSV promotorius atskirose konstrukcijose gali būti įvestas F pozicijoje.
Po šios konstrukcijos transfekcijos į GH ląstelių liniją, ląstelės gali augti terpėje, kurioje yra G418. Tai leidžia augti tik toms ląstelėms, kuriose yra integruota DNR plazmidė į genomą kaip homologinės rekombinacijos, taip ir atsitiktinės integracijos pagalba. Išgyvenusios ląstelės augs ir terpėje, kurioje yra gancykloviro. Dauguma ląstelių išlaikusių šią sekeciją, bus tos, kuriose DNR plazmidės vektorius integruotas homologinės rekombinacijos pagalba. Šios ląstelės gali būti skrininguojamos, tam kad įrodyti, kad jos produkuoja iRNR, kuri atitinka ΤΞΗβ geną ir kad jos produkuoja TSHP baltymą. Genominės DNR sritis, į kurią įvedamas heterologinis promotorius, gali būti sekvenuojamas tam, kad įrodyti, kad rekombinacija teisingai įvyko.
PAVYZDYS - ΤΞΗβ geno aktyvacija žiukių hipofizio ląstelėse
Naudojant žemiau aprašytą metodiką, tyrotropino beta subvieneto (TSHp) geno transkripcija, kuri normaliai nevyksta žiurkių GH^ hipofizio ląstelėse, aktyvuojama šiose ląstelėse homologinės rekombinacijos pagalba, įvedant aktyvuojantį elementą 5' kryptimi TSH3 kodavimo regionui. Yra žinoma, kad Rous sarkomos viruso (RSV) promotorius efektyviai funkcionuoja GH^ ląstelėse (Christian Nelson et ai, Nature, 322:557-562, 1986); Zheng-Sheng Ye et ai, The Journal of Biological Chemistrv, 263:7821-7829, 1988), ir todėl pasirenkamas aktyvuojančiu elementu. Plazmidės vektorius konstruojamas taip, kad turėtų RSV aktyvuojantą elementą, 5' flankuojančią TSH0 geno dalį ir reaktyvo selekcijos markerį, aminoglikozidfosfotransferazės geną (NEO), reikalingą trasfekuotų ląstelių populiacijų atrankai. Ribonukleininė rūgštis (RNR) ekstrahuojama iš GHg ląstelių, kurios išlieka atsparios selekcijos rektyvui, ir paverčiama į komplementarią dezoksiribonukleininę rūgštį (kDNR). Polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) pagalba patikrinama ar kDNR yra TSHp. Homologinės rekombinacijos vektoriai ir kontrolės vektoriai yra aprašomi eksperimente ir rezultatuose.
PLAZMIDĖS KONSTRAVIMAS
Homologinės rekombinacijos (HR) vektoriaus (pRSVCATNEO) karkasas
Rous sarkomos viruso (RSV) promotorius konstruojamas iš plazmidės pRSVCAT (Cornelia M. Gorman et ai, Proceedings of National Academy of Science. 79:6777-6781, 1982) (Fig. 5) išskiriant 580 bazių porų (bp) Ndel-Hindll fragmente esantį funkcionuojantį promotorių. Šio fragmento galai užbukinami DNR polimerazės I Klenovo fragmento pagalba ir Xbal linkeriai liguojami prie bukų galų. Po nuskėlimo Xbal restrikcijos endonukleazes pagalba ir valymo, gautas fragmentas liguojamas pUC18 plazmidės Xbal saite. Bakterijų kolonija, turinti plazmidę, kurioje yra RSV intarpas schematiškai parodyta Fig. 6, toliau žymima pRSV. Aminoglikozidfosfotransferazės genas (NEO) klonuojamas iš pSV2NEO (P.J. Southern et ai, Journal of Molecular and Applied Genetics, 1:327-341, 1982) išskiriant BglII ir BamlII (Fig. 7) fragmentą ir liguojant prie BamHI saito pRSV plazmidės (Fig. 6). Plazmidė, kurioje yra NEO genas schematiškai pavaizduota piešinėlyje 8 ir yra žymima pRSVNEOBAM. pRSVNEOBAM plazmidė kerpama SmaI pagalba ir 4328 bp fragmentas, kuriame yra RSV promotorius ir pagrindinė NEO geno ir plazmidės pUC18 dalis, išskiriamas elektroforezės pagalba. Suliguoti Xhol likeriai SmaI galuose nukerpami Xhol restrikcijos fermento pagalba ir plazmidė ligavimo pagalba vėl sujungiama į žiedą. Gauta plazmidė pavaizduota Fig. 9 ir vadinama pRSVNEO. Paskutinio klonavimo rezultate iškerpamas iš NEO nuo 3' galo 786 bp ilgio fragmentas, kuris nėra būtinas funkcionaliai ekspresijai. Šios konstrukcijos dėka gaunama plazmidė su NEO genu, kuri traskriptiškai reguliuojama RSV promotoriumi.
Sekantis NdeI saitas, esantis 5' RSV promotoriaus gale, plazmidėje pRSVCAT (Fig. 5) pervedamas į Salį saitą. Tai pasiekiama sulkaldant pRSVCAT plazmidę su NdeI, DNR polimerazės I Klenovo fragmentu užpildant galus ir liguojant bukus galus Salį linkeriais. Linkeriai nukerpami su Salį ir plazmidė reciklizuojama ligavimo pagalba. Naujai sukonstruotame Salį saite yra klonuotas Sall-Xhol fragmentas iš pRSVNEO plazmidės (Fig. 9), kuriame yra RSV promotorius iš NEO geno. Plazmidė, pavaizduota Fig. 10, su RSV promotoriumi ir NEO genu iškirta ir pavadinta pRSVCATNEO. Ši plazmidė trasfekuota į GHg ląsteles, suteikia šioms ląstelėms atsparumą G418, sugebėjimą RSV promotoriumi reguliuoti NEO geno transkripciją ir sugebėjimą RNR transliuoti j funkcinius baltymus (duomenys nepateikiami). Šių transfekantų RNR analizuojama polimerazinės grandininės reakcijos pagalba (PGR), kad nustatyti ar CAT genas yra transkribuojamas. PGR rezultatai parodė, kad CAT genas tikrai transkribuojamas visose G418 atspariose ląstelių kolonijose (duomenys nepateikiami) ir kad RSV promotorius CAT geno 5' gale sugeba reguliuoti transkripciją geno esančio 3' gale. Tai svarbu, nes šis RSV promotorius gali būti atsakingas už TSHP geno transkripcijos reguliavimą, kai TSH3 HR vektorius, kuris aprašomas vėliau, integruojamas homologinės rekombinacijos pagalba į GH^ genomą.
TSHP HR vektorius
Vektorius, sugebantis integruotis į GHg genomą homologinės rekombinacijos pagalba, sukonstruojamas įterpiant dvi sekas 5' flankuojančių regionų iš tirotropino beta subvieneto (TSHP) geno į unikalų Salį ir HindlII saitą, esantį pRSVCATNEO plazmidėje (Fig. 10). Žiurkės blužnies genominė biblioteka, kurioje yra 15 kilobazių (kb) ar didesni intarpai, klonuota į lambda DASH buvo gauta iš Stratagene, San Diego, CA. Panaudojus standartines ooeracijas (Current protocols in Molecular Biology, pp.1.9.1-1.13.6, 6.1.1-6.4.10), buvo išskirts žiurkių genominis TSH geno 15,3 kb klonas, kuriame yra 9 kb ilgio 5' seka iš pirmo egzono. 15,3 kb ilgio fragmentas susideda iš dviejų Xbal fragmentų, 10,6 kb fragmentas yra 15,3 kb fragmento 5' gale ir 4,7 kb dalis yra 15,3 kb fragmento 3' gale (Fig. 11). Abu šie Xbal fragmentai subklonuoti į pUC18 ir plazmidės, turinčios intarpus abiejomis orentacijomis yra išskirtos. 2,3 kb Xbal - HindlII fragmentas įeina į 4,7 kb Xbal fragmentą (Fig. 11) buvo išvalytas ir Xbal šio fragmento saitas pakeistas HindlII saitu su Klenovo fragmento pagalba ir buvo liguojamas HindlII linkeriais. šis fragmentas buvo suliguotas su unikaliu HindlII saitu, kuris yra pRSVCATNEO plazmidėje (Fig. 10). Darinys, atitinkantis plazmidei su 2,3 kb intarpu, su teisinga orentacija parodytas Fig. 12 pažymėtas pRSVCATNEOTSHB3.
10,6 kb Xbal fragmentas iš žiurkių TSH klono (Fig. 11) buvo išskirtas ir Xbal galai pakeisti į Salį saitus DNR polimerazės I Klenovo fragmento pagalba ir prijungti Salį linkeriai. šis 10,6 kb ilgio SA1I fragmentas buvo klonuojamas į Salį saitą plazmidėje pRSVCATNEOTSHB3 (Fig. 12). Plazmidė turinti sąvyje teisingos orentacijos intarpą buvo indentifikuota ir pavadinta pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Fig. 13). Vėliau plazmidė buvo atiduota saugojimui Amerikos kultūrų kolekciją, Rockvile, MD, suteikiant jai saugojimo numerį ATCC 40933. Ji buvo pervadinta į pHRTSH. Šis atidavimas saugojimui buvo atliktas pagal visus Budapešto sutarties reikalavimus.
LĄSTELIŲ LINIJA
GHg ląstelės yra subklonuota MtT/W5 populiacija, kuri buvo gauta iš radiacija indukuoto žiurkių hipofizio auglio (B.K. Takemoto, Cancer research, 22:917, 1962) ir adaptuotos augimui kutūroje Tashjian et ai., Endocrynology, 82:342-352, 1968. GHg ląstelės buvo paimtos iš Amerikos kultūrų kolekcijos ląstelių banko ir auginamos šios sudėties terpėje: Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM) + 15% Arklio serumo (HS) 4- 2,5% embrioninio veršiukų serumo (FBS) + 1% L-gliutamino (GH3 terpė) 37° C temperatūroje, esant 5% CCŲ koncentracijai.
DNR PARUOŠIMAS
Didelio kiekio plazmidės DNR išskyrimas
Plazmidės, kurios naudojamos stabilioms transfekcijoms, valomos šarminio lizavimo būdu. Šis būdas apršytas Current Protocols in Molecular Biology. vol. 1, pp 1.7.1 -1.7.2. Išskirta šarminio lizavimo būdu DNR papildomai buvo valoma cezio chlorido gradiente. Šis valymo būdas aprašytas Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, pp 1.7.5 -1.7.7.
Prieš trasfekciją HR vektoriai buvo apdorojami arba AatlI arba Apal. ApaI buvo naudojama plazmidės pRSVCATNEO linerizavimui ir AatlI - HR plazmidės pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI linerizavimui. AatlI ir Apal skėlimo saitai pavaizduoti atitinkamai Fig. 10 ir 13. Po kirpimo tikamais restrikcijos fermentais, reakcijos mišinys ekstrahuojamas fenolio-chloroformo mišiniu, ekstrahuojamas chloroformu, išsodinama etilo alkoholiu ir kartą praplaunamas 70% etanoliu. Plazmidės suspenduojamos steriliame dejonizuotame vandenyje (d^O) taip, kad koncentracija būtų lygi 1 mikrogramui/ mikrolitre (ųg/μΐ), nustatant absorbcija OD26O· Tam kad padidinti transfekcijos efektyvumą ir/ arba padidinti homologinės rekombinacijos santykį su atsitiktine integracija, pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI buvo apdorojama Apal. Apal iškerpa tris atskirus saitus plazmidėje pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI ir pašalina visus vektorius, iškyrus reikalingus homologinei rekombinacijai (Fig. 13). Po apdorojimo Apal, reakcijos mišinys elektroforezuojamas 0.8 % agarozės gelyje ir, viršutinė juosta atitinka 10922 bp ilgio fragmentui. Šis fragmentas susidedantis iš dviejų 5' flankuojančiu TSHp geno regionų, RSV promotoriaus - NEO regiono ir ΤβΗβ geno - aktyvuojančio RSV promotoriaus buvo išskirtas iš gelio elektroeliucijos pagalba dializės maišelyje. Elektroeliuuota DNR toliau buvo valoma elutip minikolonėle (Schleicher and Schuell) pagal gamintojo standartines rekomendacijos. DNR buvo eliuuojama nuo kolonos, išsodinama etanoliu, praplaunama 70% etanoliu ir suspenduojama iki koncentracijos - lųg/ųl.
STABILI TRANSFEKCIJA
Kalcio fosfato transfekcija valandas prieš transfekciją 3χ10θ GHg ląstelių patalpinama į 10 centimetrų (cm) lėkšteles. Į kiekvieną lėkštelę įdedama po 0.5 mililitro (ml) transfekcijos buferio, kuriame yra 10 pg DNR vektoriaus su 30 ųg ultragarsu apdorotos lašišų spermos DNR. Transfekcijos buferis paruošiamas iš 4 g NaCl, 0,185 g KC1, 0,05 g Ν32ΡΟψ 0.5 g dekstrozės, 2,5 g HEPES, tūris privedamas iki 500 ml, pH privedamas iki 7,5. 31 μϊ 2 moliarinio (M) CaC^ tirpalo pridedama į 0.5 ml DNR + transfekcijos buferį ir išmaišoma. Šis tirpalas gali būti saugomas 45 minutes kambario temperatūroje. Kai paruošiamas DNR - CaC^ - transfekcijos buferis, GH3 terpė nupilama nuo GH3 ląstelių ir DNR - CaC^ - transfekcijos buferis užsluoksniuojamas ant ląstelių. Ląstelės paliekamos kambario temperatūroje 20 minučių. Po 20 minučių pripilama 5 ml GH3 terpės ir lėkštelės inkubuojamos 6 valandas 37° C temperatūroje. Nuo ląstelių pašalinama terpė ir pridedama 3,5 minutėms 5 ml šviežio transfekcijos buferio, į kurį įdedama 15 % glicerino. Ląstelės du kartus praplaunamos su PBS, užpilama 10 ml GH3 terpės. Po 48 valandų transfekcijos, terpė nupilama ir užpilama GH3 terpė, kurioje yra 400 ųg/ ml G418. Elektroporacija
Elektroporacija -vykdoma naudojant ΒΤΧ 300 Transfektorių su 3,5 milimetro n (mm) tarpais tarp elektrodų. lxlOr GHg ląstelių logaritminėje augimo fazėje nuimamos nuo lėkštelių tripsinizacijos pagalba, surenkamos centrifuguojant ir praplaunamos kartą su PBS. Ląstelės suspenduojamos 1,0 ml PBS ir supilamos į 2,9 ml talpos vienkartines Ultra-UV kiuvetes (American Scientific products), kurios laikomos lede. Į ląsteles pridedama 10 ųg DNR, sumaišoma ir išlaikoma 5 minutes ant ledo. Po 5 minučių elektrodai įkišami į kamerą, ląstelės elektroporuojamos, esant 750 mikrofaradams su 200 voltų pulsacija. Kiuvetė 10 minučių grąžinama atgal ant ledo. Ląstelės išimamos iš kiuvetės, pernešamos į konusinius 15 ml mėgintuvėlius su 9 ml GH3 terpės, kurioje yra 1 % penicilino ir 1 % strpetomicino, ir paliekama 10 minučių kambario temperatūroje. 1x10T elektroporuotų ląstelių pernešama į tris 10 cm skersmens lėkšteles, kiekvienoje lėkštelėje gaunama apytikriai po 3x10θ ląstelių. Po 48 valandų pridedama GH3 terpė, kurioje yra 400 ųg/ml G418.
GHo ląstelių transfekcija su pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (kirpimas su AatlI), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (kirpimas su ApaI) ir pRSVCATNEO (kirpimas su
ApaI), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (kirpimas su AatlI), pRSVCATNEOTSHB35XbaI (kirpimas su ApaI) ir pRSVCATNEO (kirpimas su ApaI) plazmidės transfekuojamos į GHg ląsteles be DNR kontrolės proceso metu, naudojant kaip kalcio fosfatinį taip ir ei ektr op oracijos metodus. Praėjus 48 valandoms po transfekcijos, ląstelės selekcionuojamos terpėje su G418. Maždaug po 14 - 21 dienos ląstelių kolonijos tampa matomos akimi, suskaičiuojamos kolonijos. Tais atvejais, kai nebuvo įvestos plazmidės, kolonijos nesusidaro, tai įrodo, kad selekcija vykdoma su G418 efektyvi ir kad tam būtina plazmidė, turinti RSV-NEO regioną, tam kad ląstelės turėtų atsparumą G418. Kolonijos nuimamos ir surekamos 17 mm skersmens klonavimo žiedo pagalba. Jei susidaro lėkštelėje daug kolonijų - nuo 10 iki 70 tai galima ląsteles surinkti tripsinizacijos pagalba. Tripsinizuotos kolonijos pernešamos į 6 šulinėlių lėkšteles ir paliekamos augti GH3 terpėje su G418. Pasiekus 70 % - 80% paviršiaus užpildymą, po 80000 ląstelių pernešama į 24 šulinėlių lėkšteles ir užšaldoma tam, kad išsaugoti ląsteles vėlesniems tyrimams. 24 šulinėlių lėkštelėse ląstelės auginamos, kol užpildomas paviršius 50% -70%. Bendra RNR išskiriama iš GH3 ląstelių pagal žemiau apašomą metodą.
RNR IŠSKYRIMAS IŠ TRASFEKUOTŲ GH3 LĄSTELIŲ, AUGINANT JAS 24 ŠULINĖLIŲ LĖKŠTELĖSE.
Toliau aprašoma metodo, kuris aprašytas Choczynski ir Sacchi, Anai. Biochem., 162:156-159, 1987, modifikavimas. Terpė, į kurą pernešamos GH3 ląstelės 24 šulinėlių lėkštelėse, pašalinama ir ląstelės praplaunomos 1 ml PBS. Pripilama 1 ml GTC tirpalo ir ląstelės inkubuojamos kambario temperatūroje 5 minutes. GTC tirpalas gaminamas ištirpinant 250 g guanidintiociano (Fluka) 293 ml dL^O, pridedant 17,6 ml 0,75 M natrio citratotirpalo, kurio pH 7,0, 10% sarkosilo (Llaurilsarkosilas). Prieš pat naudojimą 50 ml GTC tirpalą įpilama 360 μΐ βmerkaptoetanolio. Išlaikius 5 minutes kambario temperatūroje, 1 ml GTC-ląstelių lizato pernešama į Sarstedt 55.518 mėgintuvėlius, kuriuose yra 2 ml GTC tirpalo. Į kiekvieną mėgintuvėlį pripilama po 300 μΐ 2 M natrio acetato tirpalo, kurio pH 4,0 ir išmaišoma. Po to įpilama 3 ml dL^O prisotinto fenolio ir vėl išmaišoma. Į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama po 600 μΐ chloroformo ir izoamilo alkoholio mišinio, santykiu 49:1, mėgintuvėliai rankomis purtomi 10 sekundžių ir paliekami ant ledo 15 minučių. Po to centrifūguojama 20 minučių Sorval RC-5B centrifūga su rotoriumi SM24, kai rotoriaus apsisukimai - 8000 apsisukimų per minutę (RPM) ir temperatūra palaikoma 4° C. Vandens fazė nupilama į naują Sarstedt mėgintuvėlį, kuriame yra 3 ml izopropanolio ir išlaikoma -20° C temperatūroje. Po valandos centrifūguojama 20 minučių Sorval RC-5B centrifūga su rotoriumi SM24, rotoriaus apsisukimai - 8000 RPM ir temperatūra palaikoma 4° C. Supernatantas nupilamas, nuosėdos suspenduojamos 500 μΐ GTC tirpalo. Suspenduota RNR pernešama į 1,5 ml talpos ependorfą, kuriame yra 500 μΐ izopropanolio. Mėgintuvėliai vėl išlaikomi valandą -20° C temperatūroje. Po to nucentrifūguojama per 5 minutes mikrocentrifūgoje, supernatantas nupilamas. Nuosėdos du kartus praplaunamos 70 % etanolio tirpalu tam, kad būtų galima pilnai nugarinti etanolį. Nuosėdos suspenduojamos 20 1 vandeniniame dietilpirokarbonate (depe) ir kaitinama 65° C temperatūroje 5 minutes. Tokia RNR buvo naudojama kDNR sitezei, būbais aprašytais žemiau.
kDNR REAKCIJOS
Būdas
Pirmos kDNR spiralės sintezė vykdoma iš 2,5-6.0 mikrolitrų bendros RNR (apytiksliai 0,5-6 mikrogramai) reakcijos mišinyje, kurio tūris 10-20 mikrolitrai. Bendra RNR gaunama aukščiau aprašytu ekstrakcijos metodu, 5-10 minutes denatūruojama 70° C temperatūroje ir po to greitai atšaldoma ant ledo prieš įdedant reakcijos komponentus. Reakcijos sąlygos: 50 milimolių (mM) Tris-HCl (pH 8,3) 10 mM MgC^, lOmM DTT, dCTP, dATP, dTTP kiekvieno po 0,5 mM (Pharmacia), 40 mM KC1, 500 vienetų/ml RNasino (Promega Biotech), 85 ųg/ml oligo(dT)|2-i8 (Collaborative Research, Ine.), ir 15000-20000 vienetų/ml pelių
Moleney leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės (Bethesda research Laboratories), inkubacija vykdoma 37° C temperatūroje 60 minučių. Reakcija sustabdoma pridėjus 40 mM EDTA, nukleino rūgštys išsodinamos pridedant natrio acetato iki 0,3 M koncentracijos ir du reakcijos mišinio tūrius etanolio. Nuosėdoms leidžiama subręsti 30 minučių ir jos nusodinamos trisdešimt minučių centrifūguojant mirocentrifūgoje, esant 14 000 rpm apsisukimams. Nuosėdos praplaunamos 70% etanoliu, išdžiovinamos ir suspenduojamos 15-25 ml vandeninio depe.
Būdas
Pirmos kDNR spiralės sintezės iš RNR sąlygos buvo adaptuotos, palyginus su aprašytu būdu Carol A. Brenner et ai, BioTechnigues, Vol. No. 10, pp. 1096-1103, 1989. Prie 1 μΐ bendros RNR paimtos po išsodinimo operacijos, kuri aprašoma aukščiau, pridedama iki 9 μΐ reakcijos buferio 0,5 ml tūrio ependorfe. Reakcijos buferio sudėtis: 200 vienetų pelių Moleney leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės (MMLVRT Bethesda Research Labs) ir sekantys reaktyvai, kurių galutinė koncentracija: 70 mM Tris-HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton Χ-100, 1 mM kiekvieno dNTP, 4 mM MgC^ ir 0,45 OD2gg vienetų atsitiktinių heksamerų (Pharmacia). Po sumaišymo mėgintuvėliai 10 minučių inkubuojami kambario temperatūroje ir po to išlaikomi 42° C temperatūroje vieną valandą. Po valandos mėgintuvėliai pakaitinami 90° C temperatūroje 1 minutę, tam kad deaktyvuotųsi MMLWT.
LĄSTELIŲ GH3 RNR AMPLIFIKACIJA POLIMERAZINĖS GRANDININĖS REKCIJOS (PGR) PAGALBA
Geno TSHP kDNR sitetinama PGR amplifikacijos pagalba iš RNR transkriptų, kurie gaunami GH3 ląstelių pagalba, kaip HR plazmidės aktyvavimo homologine rekombinacija rezultatas endogeniniame gene TSHp, naudojant sekančius pradmenis.
pradmuo 5' 3'
TSHp5 AGTATATGATGTACGTGGACAGG
TSH03 CACTTGCCACACTTGCAGCTCAGG
Fig. 14 nurodyti TSH geno regionai, kuriuos atitinka kiekvienas pradmuo.
PGR REAKCIJOS SĄLYGOS
Visos PGR reakcijos buvo vykdomos Ericomp Twinblock termocikleryje. Jei kDNR buvo sitetinama PGR amplifikacija pagal 2 metodą, tai papildomai 40 μΐ buvo pridedama reakcijos mišinio prie 10 μΐ, kDNR sitezė vykdoma 50 μΐ tūryje. Galutinė reaktyvų koncentracija 50 μΐ tūryje yra: 70 mM Tris-HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton Χ-100, 2,25 vienetai Tag polimerazės (Pharmacia), po 0,2 mikromolių (μΜ) kiekvieno pradmes, 200 μΐ kiekvieno dNTP ir 0,8 mM MgC^.
Jei kDNR buvo sitetinama PGR amplifikacija pagal 1 metodą, aprašytą aukščiau, tai nuo 5 iki 10 μΐ suspenduotos kDNR įdedama į nuo 40 iki 45 μΐ tirpalą, kuriame galutinės reaktyvų koncentracijos yra: 70 mM Tris-HCl pH 8,8, 40 mM KC1, 0,1% Triton Χ-100, 2,25 vienetai Tag polimerazės, po 0,2 μΜ kiekvieno pradmes, po 200 μΐ kiekvieno dNTP ir 0,8 mM MgC^·
Reakcijos buvo vykdomos sekančiu rėžimu.
minutė 94° C temperatūroje sekundžių 55° C temperatūroje minutes 72° C temperatūroje
Šie ciklai buvo kartojami 30 - 40 kartų. 10 μΐ kiekvieno reakcijos mišinio buvo tiriama elektroforezės pagalba 6% poliakrilamidininiame gelyje, tam kad patikrinti ar yra 247 bp PGR fragmentas, kurio buvimas parodo, kad teisingas ΤΞΗβ geno iRNR splaisingas.
TSH GENO RNR IŠ GH3 LĄSTELIŲ IR ŽIURKIŲ HIPOFIZIO BENDROS DNR PGR AMPLIFIKACIJOS REZULTATAI
Tam kad nustatyti ar GH3 ląstelės normaliai sintetina TSHĖ geno RNR, buvo tiriamos PGR reakcijos pagalba, sąlygomis, kurios aprašytos aukščiau, kDNR iš netransfekuotų GH3 ląstelių ir kDNR iš žiurkių hipofizio. Teisingas TSHĖ geno iRNR fragmetas buvo stebimas teigiamoje kontrolėje, žiurkių hipofizio pavyzdžiuose, bet jo nebuvo bendroje RNR mėginyje iš GHg ląstelių net po 60 ciklų (duomenys nepateikiami).
TRANSFEKCIJOS REZULTATAI
G418 atsparios ląstelių kolonijos, esančios 10 cm skersmens lėkštelėse, buvo skaičiuojamos tarp 14 ir 21 dienos po G418 įdėjimo į terpę.
Transkripcijos metodas Kolonijų skaičius 10 cm skersmens lėkštelėse pRSVCATNEO pRSVCATNEOTSHB3-5XBAI kirpimas ApaI kirpimas Aat2
Kalcio fosfato 1 48 13 29
Kalcio fosfato 2 — 21 58
Elektroporacija 1 — 1295 415
Elektroporacija 2 — 1051 723
Bendra RNR buvo išskirta iš ląstelių surinktų kolonijų iš 24 šulinėlių lėkštelių, taip kaip aprašyta aukščiau. Iš RNR buvo susintetinta kDNR ir panaudota PGR amlifikavimui. Teigiamų ląstelių, produkuojančių TSHP geno iRNR, kolonijų skaičius buvo nustatomas pagal 247 bp fragmentą elektroforezės pagalba poliakrilamidiniam gelyje. Kiekvieno eksperimento metu surinktų ląstelių kolonijų skaičius buvo nuo 10 iki 70 kolonijų. Ląstelių kolonijų skaičius po transfekcijos buvo artimas skaičiui atsparių G418 GHg ląstelių, kuriose ΤΞΗβ genas buvo traskriptiškai aktyvuotas, klonų. Jei surinktos ląstelės nutestuojamos ir yra teigiamos, tai daroma prielaida, kad šios ląstelės yra kaip vienas klonas, esantis šiose surinktose ląstelėse.
plazmidė G418 atsparios kolonijos pozitvvios ΤΞΗβ RNR
pRSVCATNEO 60 0
pRSVCATNEOTSHB3-XBAI 4942 3
(Aat2 kirpimas)
pRSVCATNEOTSHB3-XBAI 8580 6
(Apal kirpimas)
Šie rezultatai demonstruoja normaliai transkriptiškai inertiško ΤβΗβ geno sėkmingą aktyvaciją, naudojant šiame išradime pateiktą metodą. Nors kolonijų, traskribuojančių TSF-Ιβ geną, skaičius yra nedidelis palyginus su kolonijomis, kurios atsparios G418 (apytikriai viena vienam tūkstančiui atsparių kolonijų), šis rezultatas pagrinde sutampa su kitų homologinių rekombinacijų gautais rezultatais,(Michael Krieger, Gene transfer and Expresion A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990, pp. 56-60). Pastebėta, kad homologinės rekombinacijos greitis, matyt, praporcingas taikinio geno transkripcijos greičiui (M. Frohman and G. Martin, Cell, 56:145, 1989; S. L. Mansour et ai, Nature, 336:348, 1988 ). Pažymėtina, kad pasiektas TSHP ekspresijos greitis yra dešimt kartų didesnis, nei atsitiktinės mutacijos atveju.
Tam kad įsitikinti, kad gauti rezultatai atsikartoja kiekvienamai surinktai kolonijai ir kad RNR transkripcija yra stabili, kolonijos pirma užšaldomos atskirai prieš pirmą testavimą ir tik po testavimo atšildomos ir padauginamos. Šviežiai atšildytos atrinktos GH3 ląstelės užsėjamos į T 25 audinių kultūrų indus ir padauginamos iki 70% -80% indo paviršiaus padengimo. Po 80 000 ląstelių įdedama į 24 šulinėlių lėkšteles ir auginamos iki 50% -80% šulinėlio paviršiaus padengimo. Ekstrahuojama RNR, pervedama į kDNR ir vėl tikrinamas TSHP geno RNR buvimas po PGR elektroforeze 6% poliakriamidiniame gelyje. Antro patikrinimo PGR reakcijos rezultatai pateikti Fig. 15. Poliakrilamidinis gelis buvo ryškinamas etidio bromidu, tam kad fluorescuotų ultaviolete RNR fragmentai. Takeliuose 1, 2 ir 3 užnešti GHg ląstelių, kurios buvo transfekuojamos pRSVCATNEO pagalba, kDNR PGR reakcijos produktai. pRSVCATNEO neturi homologinių regionų su ΤΞΗβ genu ir todėl nesugeba aktyvuoti TSHp geno homologinės rekombinacijos pagalba. Kaip galima matyti iš Fig. 15, šiuose takeliuose nėra 247 bp juostos, tai įrodo, kad TSHp genas nėra aktyvuojamas. Takelyje 6 užnešta neigiama kontrolė. Šiame takelyje užnešti trys apjungti pavyzdžiai GH3 ląstelių, kurios buvo transfekuojamos pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI pagalba (kerpant ApaI), bet kurios pirmos atrankos metu neturėjo TSHP geno transkripcijos. Kaip matoma, 6 takelyje nėra juostos, atitinkančios 247 bp ilgui, tai parodo, kad plazmidė pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (kerpant ApaI) įvesta atsitiktinės integracijos pagalba į genomą, nesugeba produkuoti 247 bp ilgio ΤΞΗβ geno fragmento, gaunamo PGR pagalba. Takeliuose 7, 8, 9 ir 10 užnešti atitinkamai 25 nanogramai, 100 nanogramų, 200 nanogramų ir 400 nanogramų kDNR susintetintos iš bendros žiurkių hipofizio RNR, produktai, gauti PGR reakcijos pagalba. Šiuose takeliuose esančios 247 bp ilgio juostos, produkuojamos iš kDNR, išskirtos iš žiukių ląstelų, kurios normaliai ekspresuoja ΤΞΗβ geną, parodo, kad PGR reakcijos sąlygos yra tinkamai optimizuotos ir kad gaunamos 4 ir 5 takelyje PGR juostos parodo, kad yra ekspresuojamas ir yra korektiško ilgio ΤβΗβ genas, gautas homologinės rekombinacijos pagalba. Dvi apjungtų ląstelių grupės, transfekuotos su pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ApaI kirpimas), kurios buvo teigiamos pirmoje atrankoje, ApaI-107 užnešta 4 takelyje ir ApaI-136 užnešta 5 takelyje, papildomai buvo testuojamos, ar turi aktyvuotą Τ8Ηβ geną. Šio geno buvimą ir jo teisingumą įrodo juostos elektroforegramoje, gautos PBR reakcijos pagalba. Taip pat iš gautų rezultatų galima pasakyti, kad TSHP geno transkripcija yra stabiliai aktyvuota. 247 bp ilgio juostų, kurios gaunamos iš ApaI-107 ir ApaI-136 teigiamų klonų, buvimas 4 ir 5 takeliuose ir šių juostų nebuvimas neigiamoje kontrolėje GH3 ląstelių, kurios buvo transfekuojamos pRSVCATNEO pagalba takeliuose 1 - 3 ir neigiamos kontrolės GHg ląstelių, kurios buvo transfekuojamos pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (ApaI kirpimas) pagalba takelyje 6, parodo, kad geno ΤΒΗβ RNR neprodukuojama ląstelėse, kai RNR įjungiama homologinės rekombinacijos pagalba.
Pateikiamas išradimas neapsiriboja aprašytomis ląstelėmis. Visos ląstelės turi genetinę informaciją, kuri normaliai būna tyli arba inertiška. Dauguma jų sugeba ekspresuoti tik kai kuriuos genus. Nors bet kurių ląstelių linijos normaliai transkriptiškai tylius ar inertinius genus galima aktyvuoti, kad genas ekspresuotų produktą pagal šį išradimą ir bet kurio genomo geno eksresijos charakteristikas galima modifikuoti pagal šį išradimą, Net ir prieš tai transformuotas ląstelių linijos gali būti naudojamos taip ilgai, kol pirmoji transformacija nesuardys interesuojamo geno. Ląstelių linijų šaltinis nėra svarbus. Ląstelių linijos gali būti gyvūnų arba augalų, pirminės, nenutrūkstamai kultivuojamos arba immortalizuotos. Žinoma, svarbu, kad ląstelės būtų stabilios ir imortalizuotos, nes po apdorojimo šio išradimo metodo pagalba, ekspresija gali būti komercilizuota. Klonuotiems mikroorganizmams, kaip prokariotams taip ir eukariotams, gali būti taikomas šis išradimo metodas.
Nors šis metodas išradime naudojamas normaliai transkriptiškai tylių arba inertiškų genų ekspresijai, jis gali būti pritaikytas ir genų, kurie yra natūraliai ekspresuojami šeimininko ląstelėse, ekspresijos charakteristikų modifikavimui. Pavyzdžiui, jei reikalinga pritaikyti geno ekspresiją priklausomai nuo kultivavimo sąlygų, arba kad ekspresija būtų valdoma, tinkamas reguliatorinis DNR segmentas, toks kaip reguliuojamas promotorius, gali būti įterptas, kuris pakeis tokias chrakteristikas, kaip represija arba indukcija. Pavyzdžiui, jei žinoma, kad ląstelės tipas turi branduolio steroidų receptorius, tokius kaip estrogeno, testosterono ar gliukokortikoido ar tiroksino receptorius, tai įgalina naudoti F segmentu steroido ar tiroksino elementus. Kaip atsparumo elementas gali bet kuri DNR, kuri suriša tokius receptorius tam kad įgytų santykinį atsparumą transkripcijos metu. Jei net natūraliai ląstelės nėra atsparios glukokortikoidams, pavyzdžiui, DNR fragmetas, kuris koduoja gliukokortokoido receptorių, gali būti įterptas į konstrukciją, arba kitu būdu į įterptas į genomą, ko pasėkoje gaunamos ląstelės atsparios gliukokortikoidams. Reguliacinio promotoriaus gali būti naudojamas tuo atvejai, kai interesuojamas genas normaliai yra silpnai transkribuojamas. Kiti reguliavimo būdai gali būti gauti įterpiant tinkamą DNR reguliacinį segmentą norimoje vietoje šio išradimo pagalba.
Tokiu būdu, šiame išradime aprašytu metodu galima ne tik stimuliuoti normaliai trnskriptiškai tylius genus, bet platesne prasme šis būdas gali būti pritaikytas ir bet kokio endogeninio šeimininko ląstelių linijos geno ekspresijos modifikavimui.
Specifinis homologinės rekombinacijos metodas nėra iš esmės šio išradimo naujumas. Tokie metodai žinomi, jų pagalba šiame išradime taikinio reguliacinė DNR seka įvedama į norimą vietą, tam kad aktyvuoti interesuojamą geną. Nors šio metodo pagalba, naudojant linearizuotas konstrukcijas su dviem homologiniais regionais, kur bet kuris iš galų gali būti įterptas, bet koks kitas metodas, kurio pagalba galima tai atlikti, pavyzdžiui, naudojant žiedines konstrukcijas, gali būti naudojamas šiame išradime. Šio išradimo ypatybė yra homologinės rekombinacijos panaudojimas DNR reguliacinės sekos įvedimui, kurios pagalba modifikuojamos ląstelių linijos arba mikroorganizmų ekspresijos charakteristikos, kontroliuojamai sujungiant ją su genu, kuris pagrinde yra normaliai transkripciškai tylus ar inertiškas, ląstelės linijos genome, arba amplifikuojančios sekos, be reguliacinės sekos, įterpimui pakankamai arti geno ląstelės linijos genomo, kuris tampa trankribuojamu dėka amplifikuojančios sekos. Nėra būtina, kad būtų įterptas selekcijos markeris. Atranka gali būti vykdoma tik sekant interesuojamą geno produktą, arba iRNR terpėje arba ląstelėse po DNR konstrukcijos įterpimo. Be to, apibrėžtyje, kur įterpta reguliatorinė seka, amplifikacija, jei to norima, nėra būtina. Neigiamas selekcijos markeris palengvina ląstelių atranką, bet nėra būtinas sėkmingam šio išradimo panaudojimui. Tokiu būdu, išradimas reikalauja tik DNR reguliacinio segmento arba amplifikuojančio segmento, jei to reikia, įterpimo į specifinę vietą. Bet papildomas teigiamo ir (arba) neigiamo selekcijos markerio įvedimas ir papildoma geno amplifikacija, jei to pageidaujama, gali būti atliktas šiame metode, kai įvedamas reguliatorinis segmentas.
Terminas ekspresijos modifikacija, naudojamas šio išradimo aprašyme ir apibrėžtyse, yra apibrėžiamas, kaip ekspresijos terminavimo pašalinimas, įterpiant homologinės rekombinacijos pagalba, mutacijos, delecijos, stop kodoną arba kitas nukleotidų sekas į interesuojamą geną, tam, kad išvengti interesuojamo produkto ekspresijos. Ankstesni darbai nurodo, kaip panaudoti homologinę rekombinaciją specifinių mutacijų įterpimui ir ląstelės produkto ekspresijos specifiškam nutraukimui (pavyzdžiui, Schwarzberg et ai, PNAS (USA), 87:3210-3214, 1990). Šiame išradime šios procedūros nėra įtrauktos. Šiame išradime ekspresijos modifikacija atliekama, įterpiant reguliacinius ir/arba amplifikuojančius regionus į specifinę norimą vietą homologinės rekombinacijos pagalba. Šios modifikacijos yra aktyvuoj ančios ir/arba sustiprinančios interesuojamo produkto ekspresiją.
Visur, kur naudojama šiame aprašyme frazė DNR reguliacinis segmentas yra veiksmingai surištas su genu, tai reiškia, kad DNR reguliacinis segmentas įterptas taip, kad interesuojamo geno ekspresija reguliujama šio DNR reguliacinio segmento. Reguliacinis segmentas paprastai būna 5'kryptimi, bet gali būti ir 3' kryptimi ar geno viduje, svarbu kad jis galėtų bet kokiu būdu reguliuoti geno ekspresiją. DNR reguliacinis segmentas gali būti promotorius, terminatorius, operatorius, sustiprintojas, geno tylėjimą sukeliantis, sulėtintojas ar panašūs, ar bet kokia jų kombinacija.
Visur terminai prieš srovę arba pasroviui, kurie yra naudojami išradimo aprašyme ir apibrėžtyse, reiškia atitinkamai 5'-kryptį ar 3'-kryptį lyginant su interesuojamo geno koduojančia grandine. Šie, išradimo aprašyme naudojami, apibrėžimai pilnai atskleidžia metodą, kitur jie gali būti modifikuoti ir/arba adaptuoti įvairiuose pritaikymuose, nenukrypstant nuo pagrindinės koncepcijos. Ketinama apimti bet kuriuos pritaikymus ir modifikacijas, esančius terminų reikšmėse ir jų ekvivalentuose, kurie yra atskleisti išradime. Taip pat turi būti suprasta, kad frazeologija ir terminologija naudojama apibrėžimui ir ne apribojimui.

Claims (27)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Normaliai transkriptiškai tylaus geno ląstelių linijos genome aktyvavimo tam, kad nurodyta ląstelių linija galėtų ekspresuoti anksčiau minėto geno produktą, būdas besiskiriantis tuo, kad apimaDNR konstrukcijos įterpimą į minėtą genomą homologinės rekombinacijos būdu, kai ta DNR konstrukcija turi veiksmingai prijungtą (DNR) reguliacinį segmentą, galintį stimuliuoti minėto geno ekspresiją ir (DNR) nukreipiantįjį segmentą, homologišką nurodyto genomo sričiai, kurioje yra minėtas genas arba arčiausiai prie jo, ir minėta konstrukcija įterpta taip, kad tas reguliacinis segmetas yra veiksmingai prijungtas prie minėto dominančio geno.
  2. 2. Geno ląstelių linijos genome ekspresijos charakteristikų modifikavimo būdas, besiskiraintis tuo, kad apima DNR konstrukcijos įterpimą į minėtą genomą homologinės rekombinacijos būdu, kai minėta DNR konstrukcija turi DNR reguliacinį segmentą, kuris tinkamai prijungtas, sugeba modifikuoti minėto geno ekspresijos charakteristikas, lyginant su jo esamu DNR reguliaciniu segmentu, ir DNR taikinio segmentą, homologišką minėto genomo regionui ir esantį minėtame gene arba prie jo, kur ta konstrukcija yra įterpta taip, kad reguliacinis segmentas yra veiksmingai prijugtas prie dominančio geno.
  3. 3. Geno ląstelių linijos genome ekspresijos charakteristikų modifikavimo būdas, besiskiraintis tuo, kad apima DNR konstrukcijos įterpimą į minėtą genomą homologinės rekombinacijos būdu, kai minėta DNR konstrukcija turi ekspresyvų, amplifikalų geną ir sugeba amplifikuoti minėtą geną, jei jis įterptas pakankamai arti, ir DNR taikinio segmentą, homologišką minėto genomo regionui, esančiam minėto geno ribose arba arti prie jo, kur ta konstrukcija įterpta taip, kad minėtas amplifikalus genas, esantis pakankamai arti prie minėto dominančio geno, kad sukeltų jo amplifikaciją, kai minėtas amplifikalus genas yra amplifikuojamas.
  4. 4. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija papildomai turi mažiausiai vieną ekspresyvų selektyvų markerinį geną, išsidėsčiusi taip, kad galėtų būti įterptas su minėtu ekspresyviu, amplifikuojančiu genu.
  5. 5. Būdas pagal 1, 2 arba 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija turi du DNR taikinio segmentus, homologiškus minėto genomo regionui ir esančius minėtame gene arba už jo, vienas iš minėtų taikinio segmentų yra 3' krypties lyginant su regulicinu segmentu, o kitas 5' krypties, lyginant su reguliaciniu segmentu.
  6. 6. Būdas pagal 1, 2 arba 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija papildomai turi mažiausiai vieną ekspresyvų selektyvų markerinį geną, išsidėsčiusį taip, kad galėtų būti įterptas su minėtu reguliaciniu segmentu.
  7. 7. Būdas pagal 1, 2, 3, 4, 5, arba 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija papildomai turi negatyvų selektyvų markerinį geną, išsidėsčiusį minėto taikinio segmento atžvilgiu taip, kad nebūtų įterptas, kada minėta konstrukcija yra tinkamai įterpta homologinės rekombinacijos būdu, ko pagalba negatyvus selektyvus markeris neekspresuojamas ląstelėse, kuriose ta DNR konstrukcija yra tinkamai įterpta.
  8. 8. Būdas pagal 1, 2, 5, 6 arba 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija papildomai turi ekspresyvų amplifikalų geną, išsidėsčiusį taip, kad galėtų būti įterptas su minėtu reguliaciniu segmentu.
  9. 9. Būdas pagal 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 arba 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelių linija yra eukariotinių ląstelių linija.
  10. 10. Būdas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelių linija yra gyvulių ląstelių linija.
  11. 11. Būdas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelių linija yra žinduolių ląstelių linija.
  12. 12. Būdas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelių linija yra augalų ląstelių linija.
  13. 13. Būdas pagal 6 punktą ir papildomai sukeliant minėto geno produkto ekspresiją, besiskiriantis tuo, kad toliau apima pakopas, sekančias minėtus įterpimo žingsnius:
    minėtų ląstelių linijų, kurios ekspresuoja minėto selektyvaus markerinio geno produktą, klonų atrinkimas;
    atrinktų klonų kultivavimas pakankamomis sąlygomis, kuriose ekspresuotųsi minėto geno produktas; ir minėto geno produkto surinkimas,
  14. 14 .Būdas pagal 13 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas selektyvus markerinis genas yra neomicino atsparumo genas, ir minėta atrinkimo pakopa vyksta, atrenkant tuos neomicinui atsparius klonus.
  15. 15. Būdas pagal 13 arba 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija papildomai turi negatyvų selektyvų markerinį geną, išsidėčiusį taikinio segmento atžvilgiu taip, kad nebūtų įterpta, minėta konstrukcija yra tinkamai įterpta homologinės rekombinacijos būdu, ko pagalba tas negatyvus selektyvus markeris neekspresuojamas ląstelėse, kuriose minėta DNR konstrukcija yra tinkamai įterpta, ir minėta atrinkimo pakopa toliau apima tų klonų, kurie neekspresuoja minėto negatyvaus selektyvaus markerinio geno, atrinkimą.
  16. 16. Būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas negatyvus selektyvus markerinis genas yra Herpes simplex viruso timidinkinazės genas, ir minėtas selekcinis žingsnis apima selekciją tų klonų, kurie atlaiko veikimą terpės, užmušančios ląsteles, kurios ekspresuoja minėtą geną.
  17. 17. Ląstelių linijos genomas, turintis DNR reguliacinį segmentą, veiksmingai prijungtą prie natūraliai esančio geno inserciniame saite, kuris charakterizuojamas kaip predeterminuota DNR seka, besiskiriantis tuo, kad minėtas DNR reguliacinis segmentas minėtoje genomo vietoje natūraliai neegzistuoja.
  18. 18. Ląstelių linija, galinti ekspresuoti normaliai transkripciškai tylaus geno produktą minėtų ląstelių linijos genome besiskiriantis tuo, kad minėtas genomas, turi įterptą DNR reguliacinį segmentą, veiksmingai prijungtą prie minėto normaliai transkripciškai tylaus geno o minėtas DNR reguliacinis segmentas, sugeba pagreitinti minėtų ląstelių linijos geno produkto ekspresiją.
  19. 19. Ląstelių linija, kuriai būdinga sustiprinta geno produkto ekspresija, palyginus su ląstelių linija, iš kurios ji yra gauta, besiskirianti tuo, kad minėtas produktas yra endogeninio geno, esančio minėtos ląstelės genome, produktas, o minėtas genomas turi įterptus į jį, prie arba netoli minėto endogeninio geno, egzogeninės DNR reguliacinį segmentą ir/arba amplifikalų geną, sugebančius sustiprinti minėto geno produkto ekspresiją minėtoje ląstelių linijoje.
  20. 20. Ląstelių linija pagal 19 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas egzogeninės DNR reguliacinis segmentas ir (arba) amplifikacinis genas yra egzogeninės DNR reguliacinis segmentas.
  21. 21. Ląstelių linija pagal 19 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas egzogeninės DNR reguliacinis segmentas ir (arba) amplifikacinis genas yra egzogeninis amplifikacijos genas.
  22. 22. Ląstelių linija pagal 18 arba 20 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas DNR reguliacinis segmentas sugeba pagreitinti geno produkto, normaliai ekspresuojamo minėtoje ląstelių linijoje arba mikroorganizme, ekspresiją.
  23. 23. Ląstelių linija pagal 22 punktą, besiskirianti tuo, kad įterptas DNR reguliacinis segmentas yra dalis DNR konstrukcijos, turinčios minėtą DNR reguliacinį segmentą ir mažiausiai vieną selektyvų markerinį geną.
  24. 24. Ląstelių linija pagal 23 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta DNR konstrukcija papildomai turi amplifikacinį geną.
  25. 25. Ląstelių linijos geno prdukto gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima diferencijuotų ląstelių linijos, pagal bet kurį nuo 15 iki 24 punktą, kultivavimą tokiomis sąlygomis, kurios pagreitina minėto geno produkto ekspresiją ir kaupimąsi.
  26. 26. DNR konstrukcija, skirta įterpimui į predeterminuotų šeimininko ląstelių liniją, besiskirianti tuo, kad turi veiksmingai prijungtą DNR reguliacinį segmentą, galintį modifikuoti šeimininko ląstelių linijos genų ekspresijos charakteristikas, ir DNR taikinio segmentą, homologišką šeimininko ląstelių linijos genome esnčio preselektyvuoto geno regionui.
  27. 27. DNR konstrukcija, skirta įterpimui į predeterminuotų šeimininko ląstelių liniją, besiskirianti tuo, kad turi įterptą pakankamai arti ekspresyvų amplifikacinį geną, galintį amplifikuoti šeimininko ląstelių linijos geną, ir DNR taikinio segmentą, homologišką šeimininko ląstelių linijos genome esančio preselektyvuoto geno regionui.
LTIP1595A 1989-12-22 1993-12-15 Endogenous gene expression modification with regulatory element LT3998B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45478389A 1989-12-22 1989-12-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1595A LTIP1595A (en) 1995-07-25
LT3998B true LT3998B (en) 1996-06-25

Family

ID=23806064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1595A LT3998B (en) 1989-12-22 1993-12-15 Endogenous gene expression modification with regulatory element

Country Status (26)

Country Link
EP (5) EP0779362B2 (lt)
JP (3) JP3501286B2 (lt)
KR (1) KR0176693B1 (lt)
AR (1) AR245776A1 (lt)
AT (2) ATE156189T1 (lt)
AU (1) AU645294B2 (lt)
BG (1) BG60624B1 (lt)
BR (1) BR9007937A (lt)
CA (1) CA2071989C (lt)
DE (3) DE69034135T3 (lt)
DK (2) DK0779362T4 (lt)
ES (2) ES2104690T3 (lt)
FI (1) FI107391B (lt)
GR (1) GR3025057T3 (lt)
HK (2) HK1000547A1 (lt)
HU (1) HU217212B (lt)
IL (4) IL116046A (lt)
LT (1) LT3998B (lt)
LV (1) LV10655B (lt)
NO (1) NO311896B1 (lt)
OA (1) OA09594A (lt)
RO (1) RO109864B1 (lt)
RU (1) RU2128227C1 (lt)
UA (1) UA42675C2 (lt)
WO (1) WO1991009955A1 (lt)
ZA (1) ZA9010392B (lt)

Families Citing this family (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6048729A (en) 1987-05-01 2000-04-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
DE69032809T2 (de) * 1989-11-06 1999-07-08 Cell Genesys, Inc., Foster City, Calif. Herstellung von Proteinen mittels homologer Rekombination
GB9008746D0 (en) * 1990-04-18 1990-06-13 Connaught Lab The use of autologous promoters to express gene products in bordetella
US5643753A (en) 1990-04-18 1997-07-01 Connaught Laboratories Limited Use of autologous promoters to express gene products in bordetella
KR100259933B1 (ko) * 1991-05-06 2000-06-15 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 게놈 엘리먼트를 이용한 유전자 조작 및 발현방법
US6692737B1 (en) 1991-11-05 2004-02-17 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6054288A (en) * 1991-11-05 2000-04-25 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo protein production and delivery system for gene therapy
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
WO1993023553A1 (en) * 1992-05-19 1993-11-25 Exemplar Corporation Production of transgenics by joining regulatory and coding regions in vivo
AU4401993A (en) * 1992-06-04 1993-12-30 Exemplar Corporation Insertion of heterologous dna outside of known chromosomal genes
US6531124B1 (en) 1992-07-10 2003-03-11 Transkaryotic Therapies, Inc. In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
DK153992D0 (da) * 1992-12-22 1992-12-22 Novo Nordisk As Metode
US5733753A (en) * 1992-12-22 1998-03-31 Novo Nordisk A/S Amplification of genomic DNA by site specific integration of a selectable marker construct
DK0731845T3 (da) * 1993-12-23 2003-10-20 Merck & Co Inc Homologt rekombinant antistofekspressionssystem til murine celler
AU738395B2 (en) * 1994-05-13 2001-09-20 Transkaryotic Therapies, Inc. DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6471956B1 (en) 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6124439A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockefeller University OB polypeptide antibodies and method of making
US6124448A (en) * 1994-08-17 2000-09-26 The Rockfeller University Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene
US6350730B1 (en) 1994-08-17 2002-02-26 The Rockefeller University OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6048837A (en) * 1994-08-17 2000-04-11 The Rockefeller University OB polypeptides as modulators of body weight
US6001968A (en) * 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US6645933B1 (en) 1995-08-01 2003-11-11 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Receptor ligand VEGF-C
US6130071A (en) * 1997-02-05 2000-10-10 Helsinki University Licensing, Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) ΔCys156 protein and gene, and uses thereof
US6818220B1 (en) 1994-11-14 2004-11-16 Licentia Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof
US6737513B1 (en) 1996-06-07 2004-05-18 Icos Corporation Macrophage derived chemokine (MDC) and chemokine analogs and assay to identify modulators of MDC activity, and therapeutic uses for same
US6498015B1 (en) 1995-06-07 2002-12-24 Icos Corporation Methods of identifying agents that modulate the binding between MDC and an MDC receptor
US7018627B1 (en) 1995-06-07 2006-03-28 Icos Corporation Macrophage derived chemokine (MDC), MDC analogs, MDC inhibitor substances, and uses thereof
US7423125B2 (en) 1995-08-01 2008-09-09 Vegenics Limited Antibodies to VEGF-C
US6361946B1 (en) 1997-02-05 2002-03-26 Licentia Ltd Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
US7148004B1 (en) 1997-01-16 2006-12-12 The Rockefeller University Oligonucleotides of the OB-R isoforms and methods of diagnosing body weight
US7063958B1 (en) 1996-01-16 2006-06-20 The Rockefeller University Nucleic acids db, the receptor for leptin
US7084252B1 (en) 1996-01-16 2006-08-01 The Rockefeller University DB, the receptor for leptin
US7619079B2 (en) 1996-02-14 2009-11-17 The Rockefeller University Db, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof
GB2321642B8 (en) 1996-10-01 2006-08-22 Geron Corp Human telomerase reverse transcriptase promoter
US5925544A (en) * 1996-11-18 1999-07-20 Novo Nordisk A/S Method of homologous recombination followed by in vivo selection of DNA amplification
US7125714B2 (en) 1997-02-05 2006-10-24 Licentia Ltd. Progenitor cell materials and methods
US5888809A (en) * 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
EP0986644B1 (de) * 1997-07-23 2006-10-04 Boehringer Mannheim GmbH Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
US6391633B1 (en) 1997-07-23 2002-05-21 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
US6897066B1 (en) 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US5932465A (en) 1997-10-16 1999-08-03 Icos Corporation Phosphodiesterase 8A
AU757930B2 (en) 1997-12-01 2003-03-13 Roche Diagnostics Gmbh Optimization of cells for endogenous gene activation
AU3307999A (en) 1998-02-23 1999-09-06 Icos Corporation Phosphodiesterase 10
US6479256B1 (en) 1998-03-04 2002-11-12 Icos Corporation Lectomedin materials and methods
US6200951B1 (en) 1998-03-12 2001-03-13 Icos Corporation Chitinase chitin-binding fragments
US6337072B1 (en) 1998-04-03 2002-01-08 Hyseq, Inc. Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof
US6541623B1 (en) 1998-04-03 2003-04-01 Hyseq, Inc. Interleukin—1 receptor antagonist and uses thereof
US6294655B1 (en) 1998-04-03 2001-09-25 Hyseq, Inc. Anti-interleukin-1 receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6426191B1 (en) 1998-04-03 2002-07-30 Hyseq, Inc. Assays involving an IL-1 receptor antagonist
US6071691A (en) * 1998-04-27 2000-06-06 Oregon Health Science University Materials and methods for modulating differentiation
US6492138B1 (en) 1998-05-21 2002-12-10 Amgen Canada Inc. Polynucleotides encoding a novel SHC-binding protein
EP1080210A2 (en) * 1998-05-27 2001-03-07 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide by modifying the copy number of a gene
US6476211B1 (en) 1998-07-16 2002-11-05 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
US6387645B1 (en) 1998-07-16 2002-05-14 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
WO2000004041A2 (en) 1998-07-16 2000-01-27 Hyseq, Inc. Methods and molecules relating to cd39-like polypeptides
US6447771B1 (en) 1999-03-19 2002-09-10 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
US6773911B1 (en) 1998-11-23 2004-08-10 Amgen Canada Inc. Apoptosis-inducing factor
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
WO2000038536A2 (en) 1998-12-23 2000-07-06 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Inhibitors of the bitter taste response
US6350447B1 (en) 1999-01-29 2002-02-26 Hyseq, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6899875B1 (en) 1999-01-29 2005-05-31 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6783959B1 (en) 1999-01-29 2004-08-31 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6780977B1 (en) 1999-01-29 2004-08-24 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
AU3003700A (en) * 1999-02-19 2000-09-04 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US6335013B1 (en) 1999-03-19 2002-01-01 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
AU3770800A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Amgen, Inc. Beta secretase genes and polypeptides
WO2000077179A2 (en) 1999-06-16 2000-12-21 Icos Corporation Human poly(adp-ribose) polymerase 2 materials and methods
US6632665B1 (en) 1999-08-09 2003-10-14 Wake Forest University Human gene encoding 3′-5′ exonuclease
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US6900043B1 (en) 1999-09-21 2005-05-31 Amgen Inc. Phosphatases which activate map kinase pathways
US6344549B1 (en) 1999-10-14 2002-02-05 Icos Corporation ATR-2 cell cycle checkpoint
AU783082B2 (en) 1999-10-22 2005-09-22 Pharmacia & Upjohn Company Drosophila G protein coupled receptors, nucleic acids, and methods related to the same
US7314716B2 (en) 1999-11-19 2008-01-01 Mount Sinai School Of Medicine Gustducin γ subunit materials and methods
US6635742B1 (en) 2000-01-25 2003-10-21 Nuvelo, Inc. Antibodies specific for semaphorin-like polypeptides
US6465620B1 (en) 2000-01-21 2002-10-15 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel von Willebrand/Thrombospondin-like polypeptides and polynucleotides
US6586390B1 (en) 2000-01-21 2003-07-01 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel prothrombinase-like polypeptides and polynucleotides
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US7514239B2 (en) 2000-03-28 2009-04-07 Amgen Inc. Nucleic acid molecules encoding beta-like glycoprotein hormone polypeptides and heterodimers thereof
US6734005B2 (en) 2000-05-22 2004-05-11 Pharmacia & Upjohn Company Matrix metalloproteinases
EP2077279B1 (en) 2000-06-28 2012-09-05 Amgen Inc. Thymic stromal lymphopoietin receptor molecules and uses thereof
AU2001271839A1 (en) 2000-07-05 2002-01-14 Pharmacia And Upjohn Company Human ion channels
GB0018876D0 (en) 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
US6787684B2 (en) 2000-10-16 2004-09-07 E. & J. Gallo Winery Lipoxygenase genes from Vitis vinifera
ATE505204T1 (de) 2000-12-20 2011-04-15 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
EP1407787B1 (en) 2001-06-20 2009-04-29 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method of promoting nucleic acid transfer
EP1412750B1 (en) 2001-06-26 2012-05-23 Senomyx, Inc. T1r2-t1r3 hetero-oligomeric sweet taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of sweet taste compounds
IL159640A0 (en) 2001-07-10 2004-06-01 Senomyx Inc Use of specific t2r taste receptors to identify compounds that block bitter taste
US7662924B2 (en) 2002-02-22 2010-02-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Beta chain-associated regulator of apoptosis
US7205398B2 (en) 2002-05-24 2007-04-17 Schering-Plough Animal Health Corporation Eta-1 gene and methods for use
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CA2500577C (en) 2002-10-08 2013-12-17 Charles A. Dinarello The use of cytokine able to bind il-18bp and of inhibiting the activity of a second cytokine
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
ES2565327T3 (es) 2003-01-14 2016-04-04 Dana Farber Cancer Institute Sensibilizador de terapia del cáncer
US7527944B2 (en) 2003-06-27 2009-05-05 Monell Chemical Senses Center Taste receptors of the T1R family from domestic cat
RU2006106920A (ru) 2003-08-06 2007-09-20 Синомикс Инк. (Us) Гетеро-олигомерные вкусовые рецепторы t1r, клеточные линии, которые экспрессируют указанные рецепторы и вкусовые соединения
US7645733B2 (en) 2003-09-29 2010-01-12 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
WO2005061717A1 (ja) * 2003-12-19 2005-07-07 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 新規な核酸導入法
EP1753864A2 (en) 2004-04-14 2007-02-21 Monell Chemical Senses Center Taste receptors of the t1r family from domestic dog
ES2570665T3 (es) 2004-04-23 2016-05-19 Zoetis Services Llc Factor de permisividad celular para virus, y usos del mismo
IL161673A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Applied Research Systems Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
EP2338994B1 (en) 2004-09-02 2014-03-19 Yale University Regulation of oncogenes by microRNAs
US7785807B2 (en) 2004-12-13 2010-08-31 Monell Chemical Senses Center Voltage-gated, pH-sensitive anion channel and its novel splice variant involved in taste sensation
ES2732623T3 (es) 2005-01-06 2019-11-25 Innate Pharma Sa Tratamientos y métodos de combinación anti-KIR
WO2006101629A2 (en) 2005-02-17 2006-09-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated SODIUM CHANNEL PROTEIN TYPE III α-SUBUNIT SPLICE VARIANT
RS59399B1 (sr) 2005-03-23 2019-11-29 Genmab As Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma
US8354384B2 (en) 2005-06-23 2013-01-15 Yale University Anti-aging micrornas
EP1951395B1 (en) 2005-09-14 2012-02-29 Ares Trading S.A. Method for the quantitative determination of poloxamers
US7972813B2 (en) 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
ES2658859T3 (es) 2005-10-20 2018-03-12 Senomyx, Inc. Receptores del sabor dulce-umami y umami-dulce humanos quiméricos
CA2630782C (en) 2005-12-08 2015-02-03 Amgen Inc. Improved host cells and culture methods
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
DK3235811T3 (en) 2006-04-21 2018-11-12 Senomyx Inc PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF OXALAMIDS
KR101563753B1 (ko) 2007-05-11 2015-10-27 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 피부 궤양의 치료 방법
KR101461659B1 (ko) 2007-05-11 2014-11-17 토마스 제퍼슨 유니버시티 신경변성 질환 및 장애의 치료 및 예방 방법
CL2008002054A1 (es) 2007-07-17 2009-05-29 Hoffmann La Roche Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico.
CL2008002053A1 (es) 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
ES2567561T3 (es) 2007-07-27 2016-04-25 Universiteit Gent Células permisivas y sus usos
CN101828111B (zh) 2007-08-21 2014-07-23 塞诺米克斯公司 人t2r苦味受体及其用途
GB0803076D0 (en) 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
CN102625811B (zh) 2008-10-10 2016-09-21 安姆根有限公司 Fgf21突变体及其用途
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
UY32607A (es) 2009-05-05 2010-12-31 Amgen Inc Mutantes de fgf21 y usos del mismo
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
KR20120117728A (ko) 2009-09-23 2012-10-24 바이오제너릭스 에이지 재조합 인간 에리트로포이에틴(ｅｐｏ)의 정제 방법, 이렇게 정제된 ｅｐｏ 및 이를 포함하는 약학적 조성물
EP2325194A1 (en) 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2528933A1 (en) 2010-01-28 2012-12-05 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
DK2580243T3 (da) 2010-06-09 2020-01-13 Genmab As Antibodies against human cd38
EP2582728B1 (en) 2010-06-15 2017-08-23 Genmab A/S Human antibody drug conjugates against tissue factor
WO2012035037A1 (en) 2010-09-14 2012-03-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for purifying pegylated erythropoietin
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
WO2013009971A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Detection and screening method and materials useful in performance thereof
WO2013020044A1 (en) 2011-08-03 2013-02-07 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority D/B/A Carolinas Medical Center Treatment of fibrosis using microrna-19b
CA3226329A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Targetgene Biotechnologies Ltd Compositions and methods for modifying a predetermined target nucleic acid sequence
US10196601B2 (en) 2013-08-20 2019-02-05 Lek Pharmaceuticals D.D. Cell culture medium and process for controlling α-amidation and/or C-terminal amino acid cleavage of polypeptides
KR102473092B1 (ko) 2014-09-15 2022-12-01 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 히스톤 h3-리신 트리메틸화를 제거함으로써 체세포 핵 이식(scnt) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물
EP3484911B1 (en) 2016-07-15 2020-11-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for purifying pegylated erythropoietin
PL3731873T3 (pl) 2017-12-29 2022-04-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób dostarczania kompozycji pegylowanego białka
SG11202005990RA (en) 2017-12-29 2020-07-29 Hoffmann La Roche Process for providing pegylated protein composition
CN111801120A (zh) 2017-12-29 2020-10-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte
WO2024129459A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 University Of Rochester Repairmen! of barrier dysfunction in esophagus

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2615027B2 (ja) * 1985-04-08 1997-05-28 アムジェン インコーポレイテッド 外来遺伝子の転写を制御するための方法及びハイブリッドプロモーター
EP0273085A1 (en) * 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
ZA88319B (en) * 1987-02-06 1988-08-12 Lubrizol Enterprises, Inc. Ocs enhancer
GB8807683D0 (en) * 1988-03-31 1988-05-05 Ici Plc Regulation of gene expression
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
WO1991005052A1 (en) * 1989-09-28 1991-04-18 Leningradsky Gosudarstvenny Universitet Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae
DE69032809T2 (de) * 1989-11-06 1999-07-08 Cell Genesys, Inc., Foster City, Calif. Herstellung von Proteinen mittels homologer Rekombination
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARR FE ET AL.: "Isolation and characterization of the rat thyrotropin beta-subunit gene. Differential regulation of two transcriptional start sites by thyroid hormone", J. BIOL. CHEM., 1987, pages 981 - 987
JOHNSON PF, MCKNIGHT SL: "Eukaryotic transcriptional regulatory proteins.", ANNU REV BIOCHEM., 1989, pages 799
KHOURY G, GRUSS P.: "Enhancer elements", CELL, 1983, pages 313 - 314, XP027462995, DOI: doi:10.1016/0092-8674(83)90410-5
KUCHERLAPATI RS: "Homologous recombination in mammalian somatic cells.", PROG NUCLEIC ACID RES MOL BIOL., 1989, pages 301 - 310, XP002052225
MANIATIS T, GOODBOURN S, FISCHER JA.: "Regulation of inducible and tissue-specific gene expression", SCIENCE., 1987, pages 1237 - 1245, XP008003017, DOI: doi:10.1126/science.3296191
MANSOUR L.S. ET AL.: "Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes", NATURE, 1988, pages 348 - 352, XP002936573, DOI: doi:10.1038/336348a0
MITCHELL PJ, TJIAN R.: "Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins", SCIENCE, 1989, pages 371 - 378, XP002149354, DOI: doi:10.1126/science.2667136
MULLER M. ET AL.: "nser sequences and regulation of gene transcription", EUR. J. BIOCHEM., 1988, pages 485 - 495
SOUTHERN PJ, BERG P.: "Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter.", J MOL APPL GENET., 1982, pages 327 - 341
THOMAS KR, FOLGER KR, CAPECCHI MR: "High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome.", CELL, 1986, pages 419 - 428, XP023883170, DOI: doi:10.1016/0092-8674(86)90463-0

Also Published As

Publication number Publication date
RO109864B1 (ro) 1995-06-30
ES2151463T3 (es) 2004-10-01
EP1375666A2 (en) 2004-01-02
ZA9010392B (en) 1992-01-29
NO311896B1 (no) 2002-02-11
HU9202068D0 (en) 1992-10-28
AU645294B2 (en) 1994-01-13
JP2004000233A (ja) 2004-01-08
NO922436L (no) 1992-06-19
HK1000786A1 (en) 2005-01-14
CA2071989C (en) 1999-07-27
EP1484412A3 (en) 2007-10-17
DK0779362T4 (da) 2012-07-30
HUT62657A (en) 1993-05-28
IL96765A0 (en) 1991-09-16
ATE156189T1 (de) 1997-08-15
DE779362T1 (de) 2001-04-05
BR9007937A (pt) 1992-11-17
DE69031172D1 (de) 1997-09-04
EP0779362A1 (en) 1997-06-18
LV10655B (en) 1995-08-20
GR3025057T3 (en) 1998-01-30
IL116046A (en) 2007-03-08
WO1991009955A1 (en) 1991-07-11
AU7183691A (en) 1991-07-24
OA09594A (en) 1993-04-30
EP1482053A2 (en) 2004-12-01
JP3740134B2 (ja) 2006-02-01
FI922863A (fi) 1992-06-18
EP0779362B2 (en) 2012-06-13
ATE264916T1 (de) 2004-05-15
KR0176693B1 (ko) 1999-04-01
DE69031172T2 (de) 1998-03-12
DE69034135T3 (de) 2012-08-23
UA42675C2 (uk) 2001-11-15
ES2151463T5 (es) 2012-10-29
EP1482053A3 (en) 2007-10-17
HK1000547A1 (en) 1998-04-03
EP1484412A2 (en) 2004-12-08
DK0779362T3 (da) 2004-05-10
FI922863A0 (fi) 1992-06-18
JP2004089200A (ja) 2004-03-25
DE69034135D1 (de) 2004-05-27
BG60624B1 (bg) 1995-10-31
ES2151463T1 (es) 2001-01-01
DK0505500T3 (da) 1997-08-25
HU217212B (hu) 1999-12-28
EP0505500B1 (en) 1997-07-30
ES2104690T3 (es) 1997-10-16
NO922436D0 (no) 1992-06-19
LV10655A (lv) 1995-04-20
EP1375666A3 (en) 2007-09-26
IL164252A0 (en) 2005-12-18
IL116046A0 (en) 1996-01-31
JP3501286B2 (ja) 2004-03-02
AR245776A1 (es) 1994-02-28
FI107391B (fi) 2001-07-31
LTIP1595A (en) 1995-07-25
BG96515A (bg) 1993-12-24
CA2071989A1 (en) 1991-06-23
JPH05504682A (ja) 1993-07-22
DE69034135T2 (de) 2004-08-26
EP0505500A1 (en) 1992-09-30
EP0779362B1 (en) 2004-04-21
RU2128227C1 (ru) 1999-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT3998B (en) Endogenous gene expression modification with regulatory element
US5272071A (en) Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
Swergold Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter
US6638768B1 (en) Procedure for specific replacement of a copy of a gene present in the recipient genome by the integration of a gene different from that where the integration is made
EP1115852B1 (en) Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
WO2008027384A1 (en) Methods and compositions for transposon-mediated transgenesis
EA008439B1 (ru) Экспрессионная кассета и вектор для временной или постоянной экспрессии экзогенных молекул
KR20190093171A (ko) CRISPR/Cas9 시스템을 통한 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류의 제조방법
CN110199020B (zh) 用于快速产生用于细胞系开发的同源重组载体的dna质粒
CN113604473B (zh) 一种可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用
CN110177878B (zh) 转基因动物和生物生产方法
Liu et al. In vivo exon replacement in the mouse Atp7b gene by the Cas9 system
US20240271164A1 (en) Synthetic genomic safe harbors and methods thereof
CN111909986B (zh) 一种基因治疗安全评估与毒副作用预防的方法
US20070031920A1 (en) High expression locus vector based on ferritin heavy chain gene locus

Legal Events

Date Code Title Description
PC9A Transfer of patents

Owner name: LABORATOIRES SERONO SA, CH

Effective date: 20070925

MK9A Expiry of a patent

Effective date: 20131215