BG108125A

BG108125A - Peg-конюгати на хепатоцитния растежен фактор (hgt-nk4)

Info

Publication number: BG108125A
Application number: BG108125A
Authority: BG
Inventors: Michael Brandt; Apollon Papadimitriou
Original assignee: F.Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2004-09-30
Also published as: US20030012775A1; CA2438308A1; PA8540501A1; BR0207510A; JP2004521139A; MXPA03007130A; AU2002233354B2; CN1571679A; PL367402A1; HUP0400979A2; EP1389132A2; CZ20032511A3; RU2293574C2; EP1234583A1; MA26998A1; US7846896B2; SK11652003A3; GT200200038A; NO20033737D0; PE20020992A1

Description

Изобретението се отнася до конюгати на N-терминалния четири крингелов фрагмент на хепатоцитния растежен фактор (NK4) с полиетилен гликол (PEG), както и до неговите фармацевтични състави и метода за използването им.

Предшестващо състояние на техниката

Хепатоцитният растежен фактор (HGF/SF) е полипептид, който е идентифициран и пречистен от Nakamura, Т., Biochem.Biophys.Res.Commun., 22, (1984) 1450-1459. По-късно е установено, че хепатоцитният растежен фактор е идентичен със скатер фактора (SF) (Weidner, К.М. et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1991) 7001-7005). Хепатоцитният растежен фактор HGF е глюкопротеин с молекулно тегло от около 100 kDa, който участва в развитието на много клетъчни фенотипове, включително пролиферацията, митогенезата, образуването на разклонени тюбюли, и в случаите на туморни клетки, на инвазията и метастазите. Такива случаи са цитирани в литература (Stuart К.А. et al, International Journal of Experimental Pathology 81 (2000) 17-30. Двата вида HGF от плъх и от човек са били секвенирани и клонирани (Miyazawa К. et al, Biochem. Biophys. Res.Comm.,163, (1989) 967-973; Nakamura, T., et al., Nature, 342 (1989) 440-443; Seki T., et al., Biochem. And Biophys., 172 (1990) 321-327; Tashiro, K., et al., Proc. Natl. Sci. USA 87 (1990) 3200-3204; Okajima, A., et al., Eur. J. Biochem. 193 (1990) 375-381). Фармакокинетичното и фармакологичното

Чвми*· действие на HGF, на който липсват първите пет N-крайни амино киселини (dHGF) е изследвано от Uematsu, Y., et al., Sciences, 88 (1999) 131-135. Установено е, че серумната концентрация на dHGF бързо намалява, и поради това като форма на приложение инфузията е за предпочитане пред болусната инжекция.

В патент US 5 977 310 е описан PEG-модифициран HGF. Такъв PEG-модифициран HGF има удължено отделяне in vivo и има същата физиологична активност както HGF. Обаче съгласно патент US 5 977 310 възможно е да се удължи полуживотът на HGF от 59.2 min само до 76.7 min или до 95.6 min, съответно (виж пример 5 от патент US 5 977 310). Освен това в този патент е показано, че моларното количество PEG реагент може да бъде избрано от порядъка на 5 до 100 пъти от молекулното тегло на HGF. В случая на модифициране на една амино група на лизин или на N-края на протеин, предпочитаното молекулното тегло на PEGреагента е от 10 до 25 пъти от молекулното тегло на HGF. Молекулното тегло на прикачената верига от PEG е около 10 kDa. Методите за синтез на конюгати, които съдържат PEG и полипептиди като HGF, сащо са описани в патентна заявка WO 94/13322. Тези конюгати са свързани заедно при предварително дефинирани позиции, тъй като произволната конюгация, според авторите, води до въвеждане на полимерни части в домените на молекулата, която медиира терапевтично и диагностично желаните активности. Следователно молекулите могат да придобиват удължен полуживот in vivo, и в случая на хетероложни протеини и понижена имуногенност, но за сметка на значителна или пълна загуба на желаните биологични активности (виж Kitamura К., et al, Cancer Res, 51 (1991) 4310-4315, Maiti P.K., Int. J. Cancer Suppl. 3 (1988) 17-22). Например PEG-илиран IFN-α показва само 7% от активността, в сравнение е не PEG-илиран IFN-α, (Bailon Ρ., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 195-202).

Освен това е намерено, че фрагментът на HGF/SF, с окончание NK4, който се състои от N-краен херпинов домен и четири крингеловите домени на HGF/SF има фармакологични свойства, които са напълно различни от тези на HGF/SF, и той е антагонист на влиянието на HGF/SF върху двигателните способности и проникването на туморните клетки в дебелото черво, и освен това е ангиогенезисен инхибитор, който подтиска растежа на тумора и метастазите (WO 93/23541; Parr С., et al, Int. J. Cancer 85 (2000) 563-570; Kuba K. et al, Cancer Res. 60 (2000) 6737-6743; Date K., et al, FEBS Letters 420 (1997) 1-6; Date K., et al.,Oncogene 17 (1989) 30453054; Tomioka D., et al, Cancer Res. 61 (2001) 7518-7524).

Както става известно от публикацията на (Kuba К. Et al, Cancer Res., 60 (2000) 67376743), за установяването на действието на NK4 върху метастази в белия дроб при експериментални животни, е необходимо NK4 да се инфузира в продължение на две седмици.

Известно е, че закачването на полимерите към някои полипептиди може да повиши серумния полуживот на такива полипептиди. Това е установено например за PEGилиран интерлевкин-6 (патент ЕР 0442 724) или интерлевкин-2 (патент

WO 90/07938) и еритропоетин (WO 01/02017). Обаче закачването на полиетилен гликол и други полимери не води непременно до продължаване на техния серумен полуживот. Известно е например, че свързването на различни полиетилен гликоли с интерлевкин-8, G-CSF и други интерлевкини има за резултат продуцирането на молекули с влошени свойства (Mehrvar R., J. Pharm. Pharm. Sci. 3 (1) (2000) 125136). Така че резултатът от пегилирането на полипептиди може да бъде силно непредвидим. В публикацията на Gaertner, Н. F., и Offord R. Е., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 38-44 е описано странично специфично прикачване на PEG към крайната амино група на протеините. Gaertner et al., допуска, (както вече беше споменато погоре в патент WO 94/13222), че пегилирането представлява голям проблем, ако местата на прикрепване не могат да бъдат точно контролирани, и това би могло да има важни последствия за стабилността и за действието на протеина.

В публикацията на Francis G.E, et al, Int. J. Hematol. 68 (1998), 1-18, е представен обзор относно пегилирането на цитокини и други терапевтични протеини. Francis et al, твърдят, че при повечето от методите за пегилиране значителното намаляване на биоактивността е било описано (най-вече около 20-95%). Според Francis et al, пегилирането на протеините винаги се основава на опита и грешките, и фактически всички параметри на такова пегилиране може да имат изненадващи и много важни ефекти върху функционалността на продукта. Tsutzumi et al, Thromb. Haemost. 77 (1997),168-173, описват пегилирането на интерлевкин -6. Съгласно Tsutzumi et al около 54% от амино групите на лизин в интерлевкин -6 (IL-6) се свързват с PEG с молекулно тегло 5 kDa за PEG група. Tsutsumi et al, в Proc. Natl. Sci. USA 97 (2000) 8548-8553 описва химичната модификация на имунотоксин чрез PEG. Тъй като произволното PEG-илиране се придружава от значителна загуба на специфичната цитотоксична активност, Tsutsumi осъществява пегилиране на специфично място, като използва мутант на имунотоксин с един или два допълнителни цистеини, които се използват за PEG свързването. Публикацията на Heinzerling L., et al, Dermatol, 201 (2000) 154-157 описва свързване на PEG с интерферон-α с молекулно тегло 5kDa. Tsutsumi Y., et al., в J. Pharmacol. Exp. Ther. 278, (1996), 1006-1011 описват PEG модификация на TNF-α, където молекулното тегло на използваните PEG групи също е 5 kDa. Тъй като използваният пегилиран TNF-α има молекулно тегло поне 84 kDa (при молекулно тегло 17 kDa на TNF-a) на лице са поне 13 PEG групи с 5 kDa, които са прикачени за TNF-a.

PEG-илирането на протеини и техните фармакологични действия също така са описани от Reddy, К. R. Ann. Pharmacotherapy, 34 (2000), 915-923. Отново е било установено, че PEG-илирането на терапевтични протеини трябва внимателно да се преценява. Всеки протеин според Reddy et al., е различен и изисква различни оптимизиращи химични методи, и поради това влиянието на PEG-илирането не може да бъде предсказано.

Предмет на настоящето изобретение е да се намерят подобрени полипептиди с NK4 активност и техните фармацевтични състави, които да могат да се прилагат под формата само на няколко болуси в продължение на седмица и/или в много ниски дози и които са способни да подтискат растежа на тумори, ангиогенези и метастази.

Същност на изобретението

Настоящето изобретение дава възможност да се получат конюгати на NK4, които съдържат NK4, който е ковалентно свързан с една група на полиетилен гликол (PEG) с около 20-40 kDa (моно PEG-илиран NK4), за предпочитане чрез ε-амино групата на NK4 лизин или чрез N-терминалната амино група. Изненадващо бе установено, че моно PEG-илиран NK4 съгласно изобретението притежава по-добри свойства по отношение на терапевтичната приложимост в сравнение с NK4 или по друг начин PEG-илиран NK4.

Освен това изобретението се отнася до метод за получаване на моно PEG-илиран NK4, съгласно изобретението.

Освен това изобретението се отнася до фармацевтични препарати, които съдържат моно PEG-илиран NK4.

Също така изобретението се отнася до методи за приготвяне на фармацевтични препарати, съдържащи моно PEG-илиран NK4.

Също така изобретението се отнася и до методите за лечение на тумори при хора (например на рак на гърдата, на белия дроб, простатата, панкреаса или на дебелото черво), които се характеризират с това, че фармацевтично активно количество от моно PEG-илиран NK4 се прилага под форма на болуси от един до седем пъти седмично на пациенти, които се нуждаят от такова лечение.

Изненадващо беше установено, че цялото количество от произволно PEG-илиран NK4, съгласно изобретението, което трябва да се прилага по време на лечението, е значително по-малко в сравнение с прилагания не-пегилиран NK4. При това количеството на пегилиран NK4, което се използва при фармацевтично приложение е около 50% или по-ниско, за предпочитане около 20% или по-ниско, и още попредпочитано около 10% или по-ниско от необходимото количество от непегилиран NK4.

Детайлно описание на изобретението

Човешкият HGF е дисулфидно свързан хетеродимер, които може да бъде разкъсан на α-субединица от 463 амино киселини и β-субединица от 234 амино киселини, чрез разцепване между амино киселините R494 и V495. N-краят на α-веригата се предшества от 31 амино киселини, като се започва с метионинова група. Този сегмент включва сигнална секвенция от 31 амино киселини. α-Веригата започва при 32-та амино киселина и съдържа четири крингелови домени. Така нареченият “херпинов домен” се състои от амино киселините от 70 до 96-та. Крингеловият домен 1 съдържа амино киселините от 128 до 206. Приблизително крингеловият домен 2 съдържа амино киселините от 211 до 288, крингеловият домен 3 се състои от амино киселините от 305 до 383 и крингеловият домен 4 се състои от амино киселините 391 до 469 от α-веригата. Съществуват вариации на тези секвенции, главно такива, които не засягат биологичните свойства на NK4 (по-специално, които не засягат неговата активност като антагонист на HGF, и неговата антиангиогенна активност), които вариации се описани, например в патент WO 93/23541). Също така дължината на NK4 може да варира с няколко амино киселини, доколкото неговите биологични свойства не се засягат.

NK4 се състои от 447 N-терминални амино киселини на HGF/SFa-веригата, която включва гореспоменатия херпинов домен и четири крингеловите домени. Той може да се продуцира рекомбинантно чрез получаване на рекомбинантен човешки HGF/SF и се усвоява с еластаза (Date К., FEBS Letters 420 (1997) 1-6), или чрез рекомбинантна експресия на NK4 кодирана нуклеинова киселина в подходящи гостоприемникови клетки, както е описано по-долу. Гликопротеинът NK4 има молекулно тегло около 57 kDa (52 kDa за самостоятелната полипептидна част) и има in vivo биологична активност, която може да предизвика растеж на тумора, ангиогенеза и/или метастази.

“Моно PEG-илиран NK4” както е използван тук означава, че NK4 има прикачена ковалентно полиетилен гликолова група с молекулно тегло от 20 до 40 kDa. Групата може да бъде прикачена, за предпочитане произволно, на различни места в молекулата на NK4, обаче за предпочитане е най-реактивоспособното място, например при страничната верига на лизин и при N-терминалната амино група. Моно PEG-илираният NK4 (който при това за предпочитане е смес от молекули на моно PEG-илиран NK4, пегилиран на различни места, които са ε-амино групи на NK4 лизин и N-терминалната амино група) представлява 90% от продукта, и попредпочитано, моно PEG-илираният NK4 е 92% или повече от препарата. Моно PEG-илираните NK4 препарати съгласно изобретението поради това са фактически достатъчно хомогенни, за да проявяват предимствата на хомогенния препарат, например при фармацевтично приложение.

“Фактически хомогенен” както е използван тук означава, че само продуцираните молекули на PEG-NK4 конюгата, които се съдържат или се използват, са тези, които имат прикачена една PEG група. Препаратът може да съдържа нереагирал протеин, (например с липсваща PEG група). Както се установява чрез пептидната карта и N-терминалното секвениране, един пример по-долу описва получаването, което осигурява най-малко 90% моно PEG-илиран конюгат и най-много 2% нереагирал протеин.

Използваните в изобретението PEG полимерни молекули имат молекулно тегло около 20 до 40 kDa, като предпочитани са PEG полимери с около 20, 30 или 40 kDa (под “молекулно тегло”, както е използвано тук, трябва да се разбира средното молекулно тегло на PEG, терминът “около” показва, че в споменатите PEG препарати, някои молекули ще имат по-голямо тегло и други по-малко, отколкото установеното молекулно тегло).

“PEG или PEG група” съгласно изобретението означава остатък, който съдържа поли-(етилен гликол) като основна част. Такъв PEG може да съдържа също и други химични групи които са необходими за реакциите на свързване; който е резултат от химичния синтез на молекулата; или който е спейсър на оптималното разстояние за части от молекулата. Освен това, такъв PEG може да се състои от една или повече PEG странични вериги, които са свързани заедно. Полиетиленгликоли с повече от една PEG верига се наричат многоразклонени или разклонени полиетилен гликоли. Разклонените полиетилен гликоли могат да се получат например чрез прибавяне на полиетилен оксид към различни полиоли, включително глицерол, пентаеритрол и сорбитол. Например разклонен PEG с четири разклонения може да се получи от пентаеритрол и етилен оксид. Разклонени PEG са описани например в ЕР-А 0473 084 и патент US 5932462. Специално предпочитани са полиетилен гликоли с две PEG странични вериги (PEG2), свързани чрез първичните амино групи на лизин. (Monfardini, С., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Като PEG полимери c молекулно тегло около 20-30 kDa предпочитани са линейните PEG молекули, и като PEG полимери с молекулно тегло повече от 30 kDa, особено с 40 kDa, предпочитани са разклонените PEG. Като PEG 40 kDa най-вече е предпочитан двуразклоненият PEG (PEG2).

Според изобретението е представен метод за получаване на действително хомогенен моно PEG-илиран NK4. PEG-илирането на NK4 може да се осъществи съгласно методи, известни от нивото на техниката, например чрез реакция на NK4 с електрофилно активирани полиетилен гликоли (от Shearwater Corp., USA, www. shearwatercorp, com). Предпочитани PEG- реагенти са например N-хидроксисукцинимидил пропионати (PEG-SPA) или бутаноати (PEG-SBA) или разклонени N-хидроксисукцинимиди като mPEG2-NHS (Monfardini, С., et al, Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Такива методи водят до получаване на NK4 полипептид, който е произволно PEG-илиран при ε-амино групата на NK4 лизин или при Nтерминалната амино група. Не произволно PEG-илиран NK4 може да се получи както е описано съгласно патент WO 94/01451.

В предпочитан вариант на изобретението споменатият NK4 е ковалентно свързан към една поли-(етилен гликолова) група с формула -CO-(CH₂)x-(OCH2CH₂)m-OR-, която има -СО-група (например карбонил) на поли-(етилен гликолната) група, като образува амидна връзка с една от амино групите на NK4; при което R е нисш алкил; х е 2 или 3; m е от около 450 до около 950; и η и m са избрани така, че молекулното тегло на конюгата минус NK4 протеина е от около 20 до 40 kDa. При това достъпна свободна амино група на NK4 е ε-амино групата на лизина в NK4.

По-специално горните конюгати могат да се представят с формула I

P-NHCO-(CH₂)x-(OCH₂CH₂)m-OR (I) където Р е групата на NK4 протеин както е описано тук (например без амино групата или амино групи, които образуват амидна връзка с карбонила, показан във формула (I); и където R е нисш алкил, х е 2 или 3; ш е от около 450 до около 950 и е избран така, че молекулното тегло на конюгата минус NK4 протеина е от около 20 до 40 kDa. Както са използвани тук, дадените интервали за “т” почти имат ориентировачни значения. Интервалът на “т” се определя за всеки случай, и поточно чрез молекулното тегло на PEG групата.

В следващ вариант на изобретението споменатият NK4 е ковалентно свързан с поли-(етилен гликолова) група с формула:

О (CH2)yNHCO(OCH2CH2)nOF

където у е 1 до 4, за предпочитане 4, η и р заедно са избрани така, че молекулното тегло на конюгата минус ЬГК4протеина и от около 20 до 40 kDa, за предпочитане 40 kDa, и η и р се различават с не повече от 25%, за предпочитане с не повече от 10%, и най-предпочитано са идентични, a R е нисш алкил.

Както е използван тук терминът “нисш алкил” означава алкилна група с линейна или разклонена верига с един до шест въглеродни атоми (Ci-C₆) алкил. Примери за нисши алкидни групи включват метил, етил и изопропил. В съответствие с това изобретение, R може да е какъв да е нисш алкил. Предпочитани са конюгатите, в които R е метил.

Символът “т” представлява броят на етилен оксидните групи (ОСН2СН2) в полиетилен оксидната) група. Единичната PEG субединица на етилен оксид има молекулно тегло от около 44 далтона. Така молекулното тегло на конюгата (без молекулното тегло на NK4) зависи от числото “т”. За конюгатите от това изобретение “ш” е от около 450 до около 950 (което отговаря на молекулно тегло от около 20 kDa до около 40 kDa). Числото “т” е избрано така, че полученият съгласно изобретението конюгат да има физиологична активност, сравнима с немодифицирания NK4, чиято активност може да бъде същата, повече от или част от сътветната активност на немодифицирания NK4. Молекулно тегло “около” известен брой означава, че то е в разумни граници от този брой, както е определено чрез конвенционални аналитични техники. Числото “ш” е избрано така, че молекулното тегло на всяка поли-(етилен гликолова) група, ковалентно свързана с протеина на NK4 е от около 20 kDa до около 40 kDa.

Съединението с формула I може да се получи например от известен активиран полимерен материал:

RO(CH2CH₂O)m(CH2)nC(XN· (П) в който R и m имат значенията, както са описани по-горе, чрез кондензиране на съединение с формула II с протеина на NK4. Съединения с формула II, в която х е 3 * са сукцинимидилови естери на алфа-нисша алкоксибутанова киселина с полиетилен гликол) (нисш алкокси-PEG-SBA). Всеки традиционен метод за реакция на активиран естер с амин за образуването на амид може да бъде използван. В описаната по-горе реакция, примерно посоченият сукцинимидилов естер е напускаща група, която предизвиква образуването на амид. Използването на сукцинимидилов естер, каквито са съединенията с формула II, за получаване на конюгати с протеини са описани в патент US 5672 662, 30.09.1997 (Harris et al.). Човешкият NK4 съдържа 30 свободни ε-амино групи на 30 лизинови остатъци. Установено е, че когато реактивът за PEG-илиране се комбинира с SB А съединение с формула II, при концентрация на протеина от около 5 до 10 mg/ml, при pH около 7.0-8 0 , съотношение на протеин: PEG около 1:3 и реакционна температура от 2025°С се получава смес от моно-, ди- и следи от TpH-PEG-илирани разновидности. Когато съотношението протеин: PEG е около 1:1 или 1:2 (например за предпочитане около 1:2 за 30 kDa PEG-SBA и около 1:5 за 40 kDa PEG2-NHS) се продуцира предимно моно PEG-илираният вид. Като се влияе върху реакционните условия (например съотношение на реактивите, pH, температура, концентрация на протеина, реакционно време и др.) относителните количества на различните моноPEG-илирани разновидности може да се оптимизират. Типично е, без да се ограничава до това, условията да са около 8 до 12 mg/ml NK4, 0.3 М калиев фосфат, pH 8, 25°С, и реакционното време да е lh. При такива условия като се използва 30 kDa PEG-SABA (1:2, протеин : PEG) добивът е около 38% MOHoPEG-илиран NK4. Монопегилиран NK4 също може да се получи съгласно методите, описани в патент WO 94/01451. Този патент WO 94/01451 описва метод за получаване на рекомбинантен полипептид с модифицирана крайна амино киселинна алфавъглеродна група. Стадиите на метода включват образуване на рекомбинантен полипептид и защитата му с една или повече биологично добавени защитни групи при N-терминалния алфа-амин и С-терминалния алфа-карбоксил. След това полипептидът може да реагира с химически защитени реактиви за да се защитят '•St·' селективно реактивните странични верижни групи и при това да се предпазят да бъдат модифицирани страничните верижни групи. След това полипептидът се разцепва с агент за отцепване, който е специфичен за биологични защитни групи, за да се образува незащитена терминална амино киселинна алфа-въглеродна реактивна група. Незащитената терминална амино киселинна алфа-въглеродна реактивна група се обработва с химически модифициращ реактив. Страничната верига на терминално защитено модифицирано единично копие на полипептида после се депротектира при страничните верижни групи, за да се образува терминално модифицирано рекомбинантно единично копие на полипептида. Броят и последователността на стадиите в метода могат да варират до постигане на **’ селективна модификация при N-и/или С-терминалната амино киселина на полипептида.

Други предпочитани конюгати съгласно изобретението се състоят от NK4 протеин, който е ковалентно свързан към нисш-алкокси поли-(етилен гликолна) група чрез линкер с формула -C(O)-X-S-Y-, като С(О) на линкера образува амидна връзка с амино групата на NK4 (както беше споменато по-горе, ε-амино групата на лизиновия остатък е достъпна), X е (СН₂)_К или -СН₂(О-СН₂-СН₂)к, к е от 1 до 10, У представлява или

Г 1? 1		Гг-€° 1
/ S—\		П/Х
II		^xz
0		П
	L о —¹

средното молекулно тегло на поли-(етилен гликоловия) остатък е от около 20 kDa до около 40 kDa и молекулното тегло на конюгата е от около 72 kDa до около 92 kDa при молекулно тегло 52 kDa за NK4 полипептида, или от около 77 kDa до около 97 kDa при молекулно тегло 57 kDa за NK4 гликопротеина.

Така NK4 разновидностите може също да бъдат представени с формула (III) P-NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)m-OR (III) където R може да бъде всеки нисш алкил, под който се разбира алкилна група с права или разклонена верига с един до шест въглеродни атоми, например метил, етил, изопропил и други. Предпочитан алкил е метил. X може да бъде -(СН₂)к- или -СН₂(О-СН₂-СН₂)к-, където к е от 1 до 10. За предпочитане к е 1 или 2. Найпредпочитано X е ~(СН₂).

Във формула III, У е

или

за предпочитане:

и най-предпочитано:

Във формула III числото m е избрано така, че полученият конюгат с формула III да има физиологична активност, сравнима с немодифицирания NK4, чиято активност може да бъде същата, по-висока или част от съответстващата активност на немодифицирания NK4. При това m представлява броят на етилен оксидните вериги в PEG единицата. Единична PEG субединица на -(ОСН₂СН₂)- има молекулно тегло около 44 kDa. Така молекулното тегло на конюгата (като не се включва молекулното тегло на NK4), зависи от броя на ш. Молекулно тегло “около” известен брой означава, че той е в разумни граници на този брой, както е определено чрез обичайните аналитични методи. За това m е цяло число от порядъка на 450 до около 950 (съответстващо на молекулно тегло от около 20 до 40 kDa).

Предпочитаните NK4 протеините с формула III могат да бъдат представени със следните формули:

Най-предпочитани продукти на протеините на NK4 се представят с формулата:

Тези NK4 протеини могат да се получат по следните начини:

А) Свободна амино група, за предпочитане ε-амино група на лизин, амино киселина на NK4 протеин, или N-терминална амино група, представена с формула P-NH₂, реагира ковалентно с би-функционален реактив, представен с формулата Z-CO-X-SQ и се образува междинен продукт с амидна връзка със следната формула: P-NH-CO-X-S-Q, в която Р е NK4 протеин, без амино групата, която образува амидна връзка; Z е реактивна група, например карбоксилов-NHS-ecTep; X е -(СН₂)_Кили -СН₂(О-СН₂-СН₂)к-, където к е от 1 до около 10; и Q е защитна група като алканоил, например ацетил.

Б) Междинният продукт с амидна връзка от стадий (а) реагира ковалентно с активиран дериват на полиетилен гликол, който може да се представи с формулата W-[OCH₂CH₂]m-OR, да образува продукт на NK4 протеин, който се представя с формулата:

н

където W е сулфхидрилен реактив, образуван от У; m е цяло число от порядъка на от около 450 до около 950; R е нисш алкил; и У е както е дифиниран по-горе. В този вариант бифункционалният реактив за предпочитане е М-сукцинимидил-вацетилтиопропионат или Ь1-сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат, Z е за предпочитане N-хидрокси-сукцинимид, и активираният дериват на полиетилен гликол с формула W-[OCH₂CH₂]m-OR са избрани за предпочитане от групата, която се състои от йодо-ацетил-метокси-PEG, метокси-PEG, метокси-РЕО-винилсулфон и метоксиPEG-малеимид.

По-подробно NK4 протеините с формула III могат да се получат чрез ковалентно свързване на тиолната група на NK4 (“активиране”) и полученият активиран NK4 купелува с производно на поли-(етилен гликол) (PEG). Първият стадий от получаването на MOHO-PEG-илиран NK4 съгласно настоящето изобретение се състои от ковалентно свързване на тиолна група чрез Ь1Н₂-групите на NK4. Активирането на NK4 се осъществява с бифункционални реактиви, които носят защитна тиолна група и допълнителна реактивоспособна група, например активиран естер (като сукцинимидилестер), анхидриди, естери на сулфонови киселини, халогениди на карбоксилни киселини и сулфонови киселини, съответно. Тиолната група е защитена чрез групи, които са известни от нивото на техниката, например ацетилни групи. Тези бифункционални реактиви са способни да реагират с амино групите, като образуват амидна връзка.

В предпочитан вариант активирането на амидните групи се осъществява чрез реакция на бифункционални реактиви, които имат сукцинимидилов остатък. Бифункционалните реактиви могат да носят различни видове групи, например -(СН₂)к- или -СН₂-(О-СН₂СН₂)к-остатъци, където к е от 2 до около 10, за предпочитане от 1 до около 4, и още по-предпочитано 1 или 2, и най-предпочитано е 1. Примери за такива реактиви са М-сукцинимидил-Б-ацетилтиопропионат (SATP) и М-сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (SATA).

Ацетилтиоалкил-карбоксилов-NHS-естер

2-(ацетилтио)-(етокси)_к-оцетно-кисел-НН5-естер

СНз

SATA където к е както е дефинирано по-горе.

Получаването на бифункционалните реактиви е известно от нивото на техниката. Прекурсори на 2-(ацетилтио)-(етокси)_к-оцетно-кисели-1ЧН8-естери са описани в патент DE 3924705, докато получаването на производни на ацетилтиолното съединение е описано от March J., Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376. SATA е търговски достъпен (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL).

Добавянето само на една тиолна група към NK4 молекулата може да бъде селектирано чрез нагласяване на реакционните параметри, например чрез концентрацията на NK4 протеина и съотношението протеин/функционален реактив. Реакцията се провежда например във воден буферен разтвор, pH 6.5-8.0, например в 10 или 100 тМ калиев фосфат с или без 300 mM NaCl, pH 7.3. Бифункционалният реактив може да се прибави в DMSO. След приключване на реакцията, за предпочитане след 30 min, тя се спира чрез прибавяне на лизин. Излишъкът от бифункционален реактив може да бъде разделен чрез известни методи от нивото на техниката, например чрез диализа или колонно филтриране. Средният брой на тиолови групи, прибавени към NK4 може да се определи чрез фотометрични методи, описани например от Grassetti D.R., Murray J.F. в J.Appl. Biotechnol. 119 (1967)41-49.

Гореописаната реакция е последвана от ковалентно купелуване на активирано производно на поли-(етилен гликол) (PEG). Подходящи PEG производни са активирани PEG молекули с приблизително молекулно тегло от около 20 до 40 kDa. Активирани PEG деривати са известни от нивото на техниката и са описани например в Morpurgo М., et al. J. Bioconj. Chem. 7 (1996) 363) за PEG-винилсулфон. Различни PEG видове c права или разклонена верига са подходящи за получаване на съединенията с формула I. Примери за реактивни PEG реагенти са йодо-ацетилметокси-PEG и метокси-РЕС-винилсулфон:

Използването на тези йодо-активирани субстанции е известно от нивото на техниката и е описано от Hermanson G.T., Bioconjugate Technoques, Academic Press, San Diego (1996) 147-148.

Най-предпочитано PEG разновидностите се активират чрез малеимид, като се използва (алкокси-РЕС-малеимид), например метокси-РЕС-малеимид (м.т. 20 000 до 40000; Shearwater Polymers Inc ). Структурата на алкокси-РЕО-малеимид е:

или

като R и m имат значенията, дефинирани първоначално, и за предпочитане има следващата структура:

Реакцията на купелуване с алкокси-РЕС-малеимид се провежда след in situ разцепването на тиолната защитна група във воден буферен разтвор, например 10 тМ калиев фосфат, 300 mM NaCl, 2 тМ EDTA, pH 6.2. Отцепването на защитната група може да се осъществи например с хидроксиламин в DMSO при 25°С, pH 6.2 за около 90 min.За PEG модификацията молното съотношение на активирания ИКД/алкокси-РЕС-малеимид трябва да бъде от около 1.1 до около 1.6. Реакцията може да се спре чред прибавяне на цистеин и реагирането на останалите тиолни групи (-SH) с N-метилмалеимид или други подходящи съединения, способни да образуват дисулфидни връзки. Поради реакцията на всяка останала активна тиолна група със защитна група като N-метилмалеимид или друга подходяща защитна група, NK4 протеините в конюгатите от изобретението може да съдържат такива защитни групи. Обикновено методът, описан тук води до получаване на смес от молекули, които имат различен брой защитени тиоли с различен брой защитни групи, в зависимост от броя на активираните тиолни групи на протеина, които не са конюгирани към PEG-малеимид.

Докато N-метилмалеимидът образува същият вид ковалентна връзка, когато се използва, за да блокира оставащите тиолни групи на PEG-илирания протеин, то дисулфидните съединения ще доведат чрез междумолекулна сулфид/дисулфидна обменна реакция до дисулфидно мостово свързано купелуване на блокиращия реагент. Предпочитани блокиращи реагенти за този вид спиране на реакцията са оксидиран глутатион (GSSG), цистеин и цистамин. Докато с цистеин не се внасят допълнителни свързани заряди в PEG-илирания протеин, използването на блокиращи реагенти GSSG или цистеин води до получаване на допълнителен отрицателен или положителен заряд.

Следващото пречистване на съединенията с формула III, включително разделянето на моно- от ди-, три- и мулти-РЕО-ил ирани NK4 разновидности, може да се направи чрез известни методи от нивото на техниката, например с колонна хроматография. Процентът на моно-PEG конюгати може да се контролира като се събират по-широки фракции около пика на елуиране, за да се намали процента на моно-PEG, или по-тесни фракции- за да се увеличи процента на моно-PEG в състава. Около деветдесет процента моно-PEG конюгати е добро съотношение на *** добива и активността. Съставите, в които например поне 92% или най-малко 96% от конюгатите са MOHO-PEG-видове са желани. В един вариант на това изобретение процентът на моно-PEG конюгатите е от деветдесет до деветдесет и шест процента.

Фармацевтични състави

Съединенията от настоящето изобретение могат да се формулират съгласно методите за получаване на фармацевтични състави, които методи са известни на специалиста в областта на техниката. За получаването на такива състави моноPEG-илиран NK4 съгласно изобретението се смесва с фармацевтично приемливи носители. Такива фармацевтично приемливи носители са описани например в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18^th издание, 1990, Mack Publishing Company, Oslo et al., страници 1435-1712. Типичните състави съдържат ефективно количество от субстанцията съгласно изобретението, например от около 0.1 до 100 mg/ml, заедно с подходящо количество носител. Съставите могат да се прилагат парентерално.

Освен това съгласно изобретението се получават фармацевтични състави, които съдържа конюгати, които са описани тук и в които процентът на moho-PEGконюгатите за предпочитане е поне 90%, по-предпочитан е поне 92%. Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да се получат според известни методи от нивото на техниката. Обикновено разтворите на moho-PEGилиран NK4 се диализират през буфера, който ще се използва във фармацевтичния състав и желаната крайна концентрация на протеин се нагласява чрез концентриране или разреждане.

Такива фармацевтичните състави могат да се използват за прилагане като инжекции и съдържат ефективно количество от MOHO-PEG-илирания NK4 заедно с фармацевтично приемливи разредители, консерванти, солубилизатори, емулгатори, адюванти и/или носители. Тези състави включват разредители с различно буферно съдържание (например аргинин, ацетат, фосфат), pH и йонни адитиви като детергенти и солубилизиращи агенти (например твин 80/полисорбат, плуроник F68, натриев хлорид, натриев сулфат), антиоксиданти (например аскорбинова киселиан, L-метионин), консерванти (Тимерсол, бензилов алкохол) и обемни пълнителни субстанции (например захароза, манитол), инкорпориране на материала в специални препарати от полимерни съединения като полиактилова киселина и други, или инкорпориране в липозоми. Тези състави могат да повлияват върху степента на физически стабилно състояние на освобождаване и отделяне на моноPEG-илирания NK4 съгласно изобретението.

Дозировки и лекарствени концентрации

Обикновено в стандартните групи за лечение на тумори, пациентите се третират с дозировки от порядъка между 1 и 30 mg MOHO-PEG-илиран NK4 за kg/ден за известен период от време, който продължава от един ден до около 30 дни или дори по-дълго. Лекарството се прилага като единична дневна подкожна или интравенозна болус инжекция или като фармацевтичен състав, който съдържа от 0.1 до 100 mg MOHO-PEG-илиран NK4/ml. Това лечение може да бъде комбинирано с всяко стандартно (например химиотерапевтично) лечение, като се прилага моноPEG-илиран NK4 преди, по време или след стандартното лечение. Това води до подобрен резултат в сравнение с обичайното самостоятелно лечение.

Във всеки случай общото количество от прилагания пегилиран NK4 съгласно изобретението е значително по-ниско, отколкото количеството на NK4 за същото лечение.

Слеедващите примери, цитирана литература и лист на секвенциите са представени, за да подпомогнат разбирането на настоящето изобретение и целият обхват на защита, който се съдържа в приложените претенции. От само себе си се разбира, че могат да бъдат правени модификации в методите за получаване, без да се излиза от духа на изобретението.

Описание на секвенциите

SEQ ID NO: 1 показва ДНК и полипептидната секвенция на NK4.

SEQ ID N0:2 показва полипептидната секвенция на NK4.

Описание на фигурите

Фиг. 1 Инхибиране на HGF-индуцирана HUVEC пролиферация с NK4,20 kDamoho-PEG-NK4 и 30kDa-MOHO-PEG-NK4

Фиг. 2 Инхибиране на HGF-индуцирана HUVEC пролиферация с NK4 и 40 kDamoho-PEG-NK4

Фиг.З Инхибиране на HGF-индуцирана HUVEC пролиферация с NK4, 30 kDa-моноPEG-NK4 и 40kDa-MOHO-PEG-NK4

Фиг.4 Крива, която изразява изменението на концентрацията на NK4 във времето, за 30kDa-MOHO-PEG-NK4 и 40 kDa -moho-PEG-NK4 в плазма след интравенозна (фиг.4а) или подкожна (фиг.4б) инжекция.

ПРИМЕР 1

Рекомбинантно получаване на NK4

За терапевтично използване NK4 може да се получи чрез рекомбинантни методи, като се използват бактериални или еукариотни експресионни системи. Подходящи еукариотни експресионни системи са например инженеринг HeLa, ВНК или за предпочитане СНО клетки. Клетки, които са подготвени за получаването на NK4 (инженеринг клетки) се култивират в подходяща среда. Обикновено се използва 1 до 5 L клетъчна култура като инокулат за 10 литров ферментатор. След 3 до 5 дни културата от 10 литровия ферментатор може да се използва като инокулат за 100 литров ферментатор. След още 3 до 5 дни на ферментация, тази култура може да се използва като инокулат за продуциране в 1000 литров ферментатор. След 3 до 4 дни клетките се отделят чрез филтриране или центрофугиране и се изхвърлят. Супернатантът, който съдържа NK4 се филтрира, събира се и се обработва чрез пречистване. Процесът на пречистване е описан в следващия пример.

ПРИМЕР 2

Пречистване

Хепаринова Sepharose се състои от цефарозни подложки, към повърхността на която хепаринът се свързва ковалентно. Тъй като NK4 показва висок афинитет към хепарин, той се задържа от тази колона и може да се елуира с високи концентрации от соли, докато онечистванията от протеини и други примеси или не се свързват, или елуират при ниски концентрации на соли. Фракциите, които съдържат NK4, се елуират при около 0.7 до 1. IM NaCl в 50 mM Hepes с pH 7.5, събират се и се зареждат върху хидроксиапатитна колона. Полученият NK4 се елуира с около 0.4 до 0.7 М калиев фосфат, при pH 7.5. Получените фракции са практически свободни от онечистващи протеини и могат по-нататък да се пречистят чрез S-цефарозна хроматография.

ПРИМЕР 3

Получаване на MOHO-PEG-илиран NK4

Пречистеният NK4 съгласно горепосочения метод се използва за реакции на PEGилиране. Три от горепосочените подходящи методи са описани в примерите. А) PEG-илиране на NK4 с mPEG-SBA

Аликвоти на NK4 реагират с метокси-PEG-SBA ( 5 kDa за сравнение, 20 kDa и 30 kDa, съответно; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). Реакцията се провежда при съотношение на протеина към реактива около 1:1 до 1:5 за около 2h при стайна температура (съотношението от 1:2 е за предпочитане, когато се използва 20 и 30 kDa PEG). Реакцията се спира чрез прибавяне на 10 mM Tris-буфер или аргинин.НС1, при pH 8 и пробите се анализират с SDS-PAGE или разделителна ексклузионна хроматография върху колона Superose 6 (Pharmacia), като се използва буферен разтвор 500 mmol/калиев фосфат, pH 6.8 за стабилизиране и елуиране. Реакцията се оптимизира чрез изменения в съотношението на протеин към реактива, pH, времето и температурата, така че да се получи предимно moho-PEGилиран NK4.

Такива условия например са: Концентрация на NK4 Буферна система/рН Температура

Реакционно време

8-12 mg/ml

0.3 М калиев фосфат, pH 8

25°С h

Моларно съотношение (протеин.реактив) 1:2

Добив

38%

MoHoPEG-илиран NK4

17%

He-PEG-илиран NK4 45%

Б) PEG-илиране на NK4 с mPEG-SPA

Аликвоти на NK4 (концентрация на протеин 8 до 12 mg/ml в 0.3 М калиев фосфат, pH 8) реагират c метокси-PEG-SPA (5 kDa за сравнение, и 20 kDa, респективно; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). Реакцията се провежда при съотношение на протеина към реактива от 1:2 за около 2h при стайна температура. Реакцията се спира чрез прибавяне на 10 тМ Tris-буфер или аргинин НС1 и пробите се анализират чрез SDS-PAGE, реверсивно фазова HPLC или разделителна ексклузионна хроматография върху колона Superose 6 (Pharmacia), като се използва буферен разтвор на 500 mmol/1 калиев фосфат, pH 6.8 за стабилизиране и елуиране. Реакцията се оптимизира за да се получи предимно MOHo-PEG-илиран NK4, вместо ди- и три-РЕС-илиран NK4.

В) PEG-илиране на NK4 с mPEG2-NHS

Това пегилиране се осъществява както е описано в пример 36, с изключение на това, че вместо PEG-SPA се използва mPEG2-NHS (40 kDa PEG, разклонен чрез лизиновия линкер) в моларно съотношение 1:5 (протеин : PEG реактив).

ПРИМЕР 4

Изолиране на монопегилиран NK4

Монопегилиран NK4 може да се раздели от непегилиран, ди-пегилиран и трипегилиран NK4 като се провежда препаративна разделителна ексклузионна хроматография (например Superose 6 или Superdex 200; Pharmacia), използвайки като буферен разтвор 500 mmol/1 калиев фосфат pH 6.8 за стабилизиране и елуиране, или чрез йонообменна хроматография. Пречистеният протеин съдържа предимно MOHO-PEG-илираните видове. Фракциите се събират и анализират чрез SDS-PAGE и реверсивно фазова хроматография.

ПРИМЕР 5

Молекулно характеризиране на MOHO-PEG-илиран NK4

а) Разделителна ексклузионна хроматография

MoHO-PEG-илираните видове елуират по-рано при разделителна ексклузионна хроматография (например Superose 6 или Superdex 200; Pharmacia, когато се използва за буферен разтвор 500 mmol/1 калиев фосфат pH 6.8 за стабилизиране и елуиране) в сравнение с немодифицираната форма. Това се дължи на повишения хидродинамичен радиус на молекулата.

б) SDS-PAGE

При SDS-PAGE протеините се разделят според тяхното молекулно тегло. Поради повишаване на молекулното тегло при пегилирането, MOHO-PEG-илираният NK 4 показва по-късо миграционно разстояние в сравнение с немодифицирания NK4. Миграционното разстояние е обратно противоположно на дължината на веригата на PEG остатъка и на броя на PEG групите, закачени за молекулата на NK4.

в) Пептидна карта

Разпадането на MOHO-PEG-илиран NK4 със специфични за секвенцията ендопротеинази (например LysC или трипсин) води до получаване на характеризищата пептидна карта. Получените пептиди могат да бъдат разделени чрез реверсивно фазова хроматография и се анализират чрез мас спектрометрия и/или N-терминално секвениране. Това позволява определянето на PEG-модифицираните групи в NK4 молекулата.

г) Реверсивно фазова хроматография

MoHO-PEG-илираният NK4 също може да се охарактеризира чрез реверсивно фазова хроматография. Пегилирането на NK4 води до промяна във времето на задържане, в сравнение с немодифизциран NK4.

ПРИМЕР 6

Сравнение на MOHO-PEG-илиран, He-PEG-илиран и мулти-РЕС-илиран NK4

В този пример се използват He-PEG-илиран NK4, NK4 MOHO-PEG-илиран с PEG 5 kDa, PEG 20 kDa, PEG 30 kDa, PEG 40 kDa и мултиРЕС-илиран NK4 (NK4 PEGилиран c повече от една PEG верига).

А) Скатер експеримент

Клетки MDCK се отглеждат субконфлуентно в тъканни културални пластини. Клетките се обработват с 10 mg/ml HGF или с комбинация от HGF и NK4. В тези опити разсейването на клетки, индуцирано с HGF, се инхибира чрез прибавянето на 10 до 100 пъти моларен излишък на NK4, което показва функционалната активност на PEG-илирания NK4. Установено е, че in vitro активността на MOHO-PEG-илирани kDa-PEG-NK4, 20 kDa-PEG-NK4, 30 kDa-PEG-NK4 и 40 kDa-PEG-NK4 е подобна на непегилирания NK4. Намерено бе съшо, че прибавянето на повече от една PEGверига (20 до 40 kDa) води до значителна загуба на in vitro активността. (Таблица 1)

Таблица 1

Резултати от MCDK скатер изследването

NK4 контрола	40 kDa-PEG-NK4	30 kDa-PEG-NK4
NK4 (mg/ml)	NK	NK4	Моно- PEG	ДиPEG	Три- PEG	Моно- PEG	Дии триPEG	Трии тетраPEG	ПентаPEG
5.00	++	++	++	+	+/-	++	++	+	-
1.67	++	++	++	+	-	++	+	+/-	-
0.56	++	++	++	+/-	-	++	+	-	-
0.19	+	+	+	-	-	+	+/-	-	-
0.06	+/-	+/-	+/-	-	-	+/-	-	-	-
0.02	-	-	-	-	-	-	-	-	-

20 kDa- PEG-NK4	5 kDa-PEG-NK4
NK4 (pg/ml)	Моно PEG	Ди- PEG	Три- PEG	Моно- PEG	Ди- PEG	Три- PEG	Тетра- PEG	Пента- PEG	Хекса- PEG	Хепта- PEG
5.00	++	++	+	++	++	++	++	+	-	-
1.67	++	+	+	++	++	++	++	+	-	-
0.56	++	+	+/-	++	++	+	+	+/-	-	-
0.19	+	+/-	-	+	+	+	+/-	-	-	-
0.06	+/-	-	-	+/-	+/-	-	-	-	-	-
0.02	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Относителното действие на различните пегилирани форми на NK4 при инхибирането на HGF (10 ng/ml) индуциран скатеринг на MDCK клетки е изследвано. Използваните означения в таблицата са както следва: (++) означава пълно инхибиране; (+) означава инхибиране; (+/-) означава слабо инхибиране и (-) означава липса на инхибиране.

б) Експеримент за HUVEC пролиферация

Инхибирането на митогенната активност на HGF от NK4 се определя чрез измерване пролиферацията на HUVEC в култура, както е описано от Nakamura Т., et al., Nature 342 (1989) 440-443. В тези опити клетъчната пролиферация, индуцирана чрез HGF се инхибира чрез прибавяне на 10 до 100 пъти моларен излишък от NK4, който показва функционалната активност на MOHO-PEG-илиран NK4 (фигури 1 и 2). Алтернативно експеримента на HUVEC пролиферацията се провежда чрез инхибиране на митогенната активност на bFGF (базичен фибробластен растежен фактор) чрез NK4. Инхибирането се определя чрез измерване пролиферацията на HUVEC в култура, както е описано от Kuba К., et al., Cancer Res. 60 (2000) 67376743. В тези опити FGF-индуцираната клетъчна пролиферация се инхибира чрез прибавянето на 10 до 100 пъти моларен излишък от NK4, при което се изявява функционалната активност на MOHO-PEG-илирания NK4 (фигура 3).

в) експеримент на инвазията (проникване)

В този опит се анализира инвазивната мощ на туморните клетки. Експериментът се провежда главно по метода, описан от Albini A., et al., (1987) като се използват клетки НТ115. Тук също може да се инхибира индуцираната чрез HGF (10 ng/ml) клетъчна инвазия с 10 до 100 пъти моларен излишък на PEG-илиран NK4, като се проявява функционалната активност на MOHO-PEG-илиран NK4.

ПРИМЕР 7

Активност in vivo

Модел: Pane Tul човешки панкреатичен тумор ортотопичен модел SCID при мишки (Alves F., et al., Pancreas 23 (2001) 227-235).

Лечение: след 8 дни, едно прилагане дневно на MOHo-PEG-илиран NK4 за период от 21 дни. Дози: 16 mg/kg/ден; 4 mg/kg/ден; 1 mg/kg/ден; плацебо

Резултат: Лечението с MOHO-PEG-илиран NK4 показва подтискане на растежа на първичния тумор и метастазите в зависимост от дозата, докато при третираните групи с плацебо не се наблюдава никакъв ефект.

ПРИМЕР 8

Фармацевтични състави

Подходящи фармацевтични състави са например:

до 30 mg/ml MOHoPEG-илиран NK4

150mMNaCl mM натриев фосфат, pH 7.2 до 30 mg/ml MOHoPEG-илиран NK4

150mMNaCl

0.01% Tween 80 или Tween 20 или Pluronic F68 mM натриев фосфат, pH 7.2 до 30 mg/ml MOHoPEG-илиран NK4

50mMNaCl

3% манитол lOmM натриев фосфат, pH 7.2 до 30 mg/ml MOHoPEG-илиран NK4

50mMNaCl

3% манитол

0.01% Tween 80 или Tween 20 или Pluronic F68 lOmM натриев фосфат, pH 7.2

Съставите се получават като MOHO-PEG-илиран NK4 се диализира през гореспоменатия буферен разтвор (с или без манитол). Концентрацията на протеина се нагласява чрез концентриране или разреждане с буферен разтвор. Към 10%-ов съхраняван разтвор се прибавят детергент и NaCl.

ПРИМЕР 9

Фармакокинетичен анализ на NK4, 30 kPa moho-PEG-NK4 и 40 kPa moho-PEG-NK4 Възрастни мишки (разпределени по 4 в група) по интравенозен или подкожен път получават болусна инжекция с NK4,30 kPa moho-PEG-NK4 или 40 kPa моно-PEGΝΚ4 (4 mg/ml в 0.25 ml инжекционен обем), респективно. През няколко интервала от времето се вземат кръвни проби и се анализират за съдържанието на ΝΚ4, 30 kPa moho-PEG-NK4 или 40 kPa moho-PEG-NK4 чрез метода ELISA. Кривата времеконцентрация се пресмята и се представя на фигура 4. Тези данни показват, че 30 kPa-MOHO-PEG-NK4 и 40 kPa-MOHO-PEG-NK4 имат значително подобрена стабилност in vitro, което води до значително повишаване на плазмените стойности на полу-живот, в сравнение с тези за немодифициран ΝΚ4.

Claims

1 .Конюгат, който съдържа N-терминален фрагмент на хепатоцитен растежен фактор (HGF/SF), състоящ се от херпинов домен и четири крингелови области на аверигата и полиетилен гликолова група с молекулно тегло от около 20 до 40 kDa.

2. Конюгат съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатата полиетилен гликолова група има формула

-CO-(CH₂)x-(OCH₂CH₂)mOR и посочената -СО-група образува амидна връзка с една от амино групите на посочения N-терминален фрагмент на хепатоцитния растежен фактор, където X е 2 или 3;

m е от около 450 до около 950;

и R е (С1-Се)алкил.

3. Конюгат съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатата полиетилен гликолова група има формула (CH2)yNHCO(OCH2CH2)nOB

О и посочената -СО-група образува амидна връзка с една от амино групите на посочения N-терминален фрагмент на хепатоцитния растежен фактор, където у е 1 до 10;

пир заедно са от около 450 до около 950, и

R е (СгСб)алкил.

4. Конюгат съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че полиетилен гликоловата група има молекулно тегло от около 30 до 40 kDa.

5. Конюгат съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатата полиетилен гликолова група/и е/са монометокси полиетилен гликолна група/и.

6. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа конюгат съгласно претенция от 1 до 5 и фармацевтично приемлив носител.

7. Метод за получаване на фармацевтичен състав съгласно претенция 6.

8. Използване на конюгат съгласно претенции от 1 до 5 за получаване на лекарствени средства, полезни за лечение на тумори.

9. Метод за лечение на ракови заболявания, характеризиращ се с това, че на пациенти, които се нуждаят от такова лечение, се прилага фармацевтичен състав съгласно претенция 6.