ES2556711T3

ES2556711T3 - Formulaciones liofilizadas de ADN para el aumento de la expresión del ADN plasmídico

Info

Publication number: ES2556711T3
Application number: ES09730532.0T
Authority: ES
Inventors: Jong-Mook Kim; Sujeong Kim; Woong Hahn; Wonsun Yoo
Original assignee: Viromed Co Ltd
Current assignee: Helixmith Co Ltd
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2016-01-19
Anticipated expiration: 2029-04-09
Also published as: CA2720611A1; MX2010010993A; RU2010145261A; BRPI0911511A2; EP2281040A2; EP2281040B1; KR101290322B1; AU2009234598A1; AU2009234598B2; US8389492B2; BRPI0911511B8; CN102046792A; JP5579164B2; WO2009125986A3; KR20100129341A; CN102046792B; US20090258932A1; WO2009125986A2; EP2281040A4; RU2470995C2

Abstract

Una formulación liofilizada de ADN que comprende un ADN plasmídico, una sal y un carbohidrato, en la que (i) dicho ADN plasmídico comprende un gen del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o variante del mismo, que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 2 (flHGF), la SEC ID Nº: 3 (dHGF), la SEC ID Nº: 4 (NK1), la SEC ID Nº: 5 (NK2), la SEC ID Nº: 6 (NK4), (ii) dicha sal es NaCl, (iii) dicho carbohidrato es sacarosa, y en la que, antes de la liofilización, el NaCl estaba presente en la formulación de ADN en una cantidad de entre 0,5 % y 2 % y la sacarosa estaba presente en la formulación de ADN de entre 0,8 % y 5 %, para el uso en un método de tratamiento o prevención de enfermedad isquémica o hepática en un sujeto, comprendiendo dicho método la administración de una composición reconstituida de dicha formulación liofilizada de ADN mediante inyección directa.

Description

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Una "construcción" tal como se usa en el presente documento denota generalmente una composición que no aparece en la naturaleza. Una construcción puede producirse mediante tecnologías sintéticas, p. ej., técnicas sintéticas químicas o preparación y expresión de ADN recombinante para ácidos nucleicos o aminoácidos. Una construcción también puede producirse mediante la adición o asociación de un material con otro de modo que el resultado no se encuentra en la naturaleza en esa forma.

Un "gen" se refiere a un polinucleótido que comprende nucleótidos que codifican una molécula funcional, incluyendo moléculas funcionales producidas sólo mediante transcripción (p. ej., una especie bioactiva de ARN) o mediante transcripción y traducción (p. ej., un polipéptido). El término "gen" engloba ácidos nucleicos de ADNc y ADN genómico. "Gen" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa un ARN, proteína o polipéptido específicos, incluyendo las secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes en 5') y siguen (secuencias no codificantes en 3') a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza, con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y/o codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que proceden de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes procedentes de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a como se encuentran en la naturaleza. Un gen quimérico puede comprender secuencias codificantes procedentes de diferentes fuentes y/o secuencias reguladoras procedentes de diferentes fuentes. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" o "heterólogo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, sino que se ha introducido dentro del organismo huésped mediante transferencia genética. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o a genes quiméricos. Un "transgén" es un gen que se ha introducido dentro de la célula mediante un procedimiento de transferencia genética.

"ADN heterólogo" se refiere a ADN que no se localiza de forma natural en la célula o en un sitio cromosómico de la célula. El ADN heterólogo puede incluir un gen extraño a la célula.

Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que acompañan normalmente al material tal como se encuentra en su estado nativo. Por tanto, los péptidos aislados preferentemente no contienen materiales normalmente asociados con los péptidos en su entorno in situ.

Formulaciones liofilizadas de ADN

Como se describe en el presente documento, la estabilidad de una formulación liofilizada de ADN para utilizar como un agente diagnóstico o terapéutico puede aumentarse mediante la formulación del ADN antes de la liofilización con una solución acuosa que comprende una cantidad estabilizante de sacarosa.

La solución de carbohidrato antes de la liofilización puede corresponder a carbohidrato en agua sola o puede incluirse un tampón. Ejemplos de dichos tampones incluyen PBS, HEPES, TRIS o TRIS/EDTA. La solución de carbohidrato se combina con el ADN hasta una concentración final de entre 0,8% y 5%, preferentemente 1% a 5% de sacarosa, 1% a 3% sacarosa, y más preferentemente alrededor de 1,1% sacarosa.

Una sal de la formulación de ADN de la invención es NaCl. La sal de la formulación de ADN antes de la liofilización está en una cantidad de entre 0,5% y 2%, p. ej., entre alrededor de 0,8% y 1,5%, o entre alrededor 0,8% y 1,2% m/v. En ciertas otras realizaciones, la sal de la formulación de ADN está en una cantidad de alrededor de 0,9 % m/v.

Antes de la liofilización, la concentración de ADN en la formulación es desde 1 ng/ml a 30 mg/ml de plásmido. Por ejemplo, antes de la liofilización, una formulación de uso en la presente invención puede tener una concentración de alrededor de 1 ng/ml, alrededor de 5 ng/ml, alrededor de 10 ng/ml, alrededor de 50 ng/ml, alrededor de 100 ng/ml, alrededor de 200 ng, alrededor de 500 ng/ml, alrededor de 1 µg/ml, alrededor de 5 µg/ml, alrededor de 10 µg/ml, alrededor de 50 µg/ml, alrededor de 100 µg/ml, alrededor de 200 µg/ml, alrededor de 400 µg/ml, alrededor de 500 µg/ml, alrededor de 600 µg/ml, alrededor de 800 µg/ml, alrededor de 1 mg/ml, alrededor de 2 mg/ml, alrededor de 2,5 mg/ml, alrededor de 3 mg/ml, alrededor de 3,5 mg/ml, alrededor de 4 mg/ml, alrededor de 4,5 mg/ml, alrededor de 5 mg/ml, alrededor de 5,5 mg/ml, alrededor de 6 mg/ml, alrededor de 7 mg/ml, alrededor de 8 mg/ml, alrededor de 9 mg/ml, alrededor de 10 mg/ml, o alrededor de 20 mg/ml, del plásmido. En ciertas realizaciones de la invención, la concentración final de ADN es desde alrededor de 100 µg/ml hasta alrededor de 2,5 mg/ml. En realizaciones particulares de la invención, antes de la liofilización, la concentración de ADN es desde alrededor de 0,5 mg/ml hasta 1 mg/ml.

La formulación liofilizada de ADN de uso en la invención se prepara mediante liofilización en condiciones habituales conocidas en la técnica. Un método para preparar la formulación liofilizada de ADN de uso en la invención puede comprender (a) carga en un liofilizador de un envase, p. ej., un vial, con el ADN plasmídico, la sal, y el carbohidrato, en el que el liofilizador tiene una temperatura de inicio de alrededor de 5 ºC hasta alrededor de -50 ºC; (b) enfriamiento de la formulación de ADN a temperaturas bajo cero (p. ej., de -10 °C a -50° C); y (c) deshidratación sustancial de la formulación de ADN. Un experto habitual en la técnica puede ajustar las condiciones de liofilización,

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p. ej., temperatura y duración, teniendo en cuenta factores que influyen en los parámetros de liofilización, p. ej., el tipo de liofilizadora, la cantidad de ADN y el tamaño del envase que vaya a utilizarse.

El envase que contiene la formulación liofilizada de ADN puede sellarse después y conservarse durante un periodo de tiempo prolongado a diversas temperaturas (p. ej., temperatura ambiente hasta alrededor de -180 ºC, preferentemente alrededor de 2-8 °C hasta alrededor de -80 °C, más preferentemente alrededor de -20 °C hasta alrededor de -80°C, y lo más preferentemente, alrededor de -20°C). En ciertos aspectos, las formulaciones liofilizadas de ADN son estables preferentemente dentro de un intervalo de desde alrededor de 2-8 ºC hasta alrededor de -80 ºC durante un periodo de al menos 6 meses sin perder una actividad significativa. La conservación estable de la formulación de ADN plasmídico también puede corresponder a conservación del ADN plasmídico en una forma estable durante largos periodos de tiempo antes de su uso, tal como para investigación o terapia a base de plásmidos. El tiempo de conservación puede ser de varios meses, 1 año, 5 años, 10 años, 15 años, de hasta 20 años. Preferentemente, la preparación es estable durante un periodo de al menos alrededor de 3 años.

ADN plasmídico de HGF

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es una glicoproteína de unión a heparina, conocida también como factor de dispersión o hepatopoyetina A. Un gen endógeno que codifica el HGF humano está localizado en el cromosoma 7q21.1 y comprende 18 exones y 17 intrones que tienen la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 1 (Seki T., y cols., Gene 102:213-219 (1991)). Del gen se transcribe un transcrito de 6 kb y a partir de él se sintetiza después un polipéptido precursor de HGF que consiste en 728 aminoácidos (SEC ID Nº: 2). Simultáneamente, también se sintetiza un polipéptido precursor de dHGF que consiste en 723 aminoácidos mediante un corte y empalme alternativo del gen de HGF. Los precursores biológicamente inactivos pueden convertirse a formas activas de heterodímero unido por puentes disulfuro mediante proteasa en el suero. En los heterodímeros, la cadena alfa que tiene un alto peso molecular forma cuatro dominios kringle y una horquilla N-terminal igual que una región peptídica preactivada de plasminógeno. Los dominios kringle de una estructura de bucle unida por puentes disulfuro triples que consiste en alrededor de 80 aminoácidos puede jugar un importante papel en la interacción proteína-proteína. La cadena beta de bajo peso molecular forma un dominio de serina similar a proteasa. El dHGF que consiste en 723 aminoácidos es un polipéptido con deleción de cinco aminoácidos en el 1er dominio kringle de la cadena alfa, es decir, F, L, P, S y S.

El HGF segregado por células procedentes de mesodermo tiene diversas funciones biológicas, p. ej., 1) inducción de una estructura tubular en las células epiteliales; 2) estimulación in vivo e in vitro de la vascularización a partir de células endoteliales; 3) regeneración del hígado y el riñón, debido a su actividad antiapoptótica; 4) organogénesis del riñón, los ovarios y los testículos; 5) control de la osteogénesis; 6) estimulación del crecimiento y la diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas eritroides; y 7) brote axonal de las neuronas (Stella, M.C. y Comoglio, P.M., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31:1357-1362 (1999)). Sobre la base de estas diferentes funciones puede formularse HGF o un gen codificador de HGF o de una variante del mismo como agente terapéutico para tratar enfermedades isquémicas o hepáticas. En realidad, el HGF puede existir in vivo, bien como HGF, o bien como dHGF, y, por tanto, la coexpresión de HGF y dHGF es importante para aumentar al máximo el efecto terapéutico. Un gen de HGF híbrido que puede expresar simultáneamente HGF y dHGF con una alta eficiencia para terapia génica es una variante de HGF que podría ser ventajoso utilizar en la formulación de ADN plasmídico de uso en la presente invención.

El gen de HGF híbrido se ha descrito previamente en la solicitud de patente internacional Nº WO 03/078568 y en la public. de Estados Unidos Nº. 2005/0079581 A1. El gen de HGF híbrido se prepara mediante la inserción de un intrón inherente o extraño entre los exones 4 y 5 en el ADNc de HGF. El gen de HGF híbrido tiene una eficacia de expresión mayor que el ADNc de HGF y expresa simultáneamente dos heterotipos de HGF y HGFd (variante delecionada de HGF).

La expresión "isoforma de HGF" se refiere a cualquier polipéptido de HGF que tenga una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 80 % (p. ej., idéntica al menos en un 90 % o 95%) a una secuencia de aminoácidos de HGF que se produce naturalmente en un animal, incluyendo todas las variantes alélicas. El término se refiere a isoformas que se sabe que tienen actividad de proliferación celular. Las isoformas de HGF incluyen, sin limitación flHGF, dHGF, NK1, NK2, y NK4, p. ej., correspondientes a las SEC ID Nos: 2-6, y variantes de las mismas (p. ej., las variantes de NK2, SEC ID Nos: 11-12).

El término "flHGF" se refiere a la proteína completa de HGF de un animal, p. ej., un mamífero, p. ej., los aminoácidos 1-728 (SEC ID Nº: 2) de HGF humano.

El término "dHGF" se refiere a la variante delecionada de la proteína HGF producida por corte y empalme alternativo del gen de HGF en un animal, p. ej., un mamífero, p. ej., HGF humano, que consiste en 723 aminoácidos (SEC ID Nº: 3) con deleción de cinco aminoácidos en el 1er dominio kringle de la cadena alfa (F, L, P, S y S) de la secuencia completa de HGF.

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El término "NK1" se refiere a una isoforma de HGF de un animal, p. ej., un mamífero, p. ej., un ser humano, que consiste en los dominios de la horquilla N-terminal y kringle.

El término "NK2" se refiere a una isoforma de HGF de un animal, p. ej., un mamífero, p. ej., un ser humano, que consiste en los dominios de la horquilla N-terminal, kringle 1 y kringle 2.

El término "NK4" se refiere a una isoforma de HGF de un animal, p. ej., un mamífero, p. ej., un ser humano, que consiste en los dominios de la horquilla N-terminal, kringle 1, kringle 2 kringle 3, y kringle 4.

La estructura y la función de HGF se han estudiado ampliamente y uno de los expertos en la técnica está al tanto de los aminoácidos de la secuencia de HGF que son importantes para retener sustancialmente toda la actividad biológica de la proteína y que preferentemente no se cambian o sólo se cambian de forma conservativa en cualquier secuencia variante de HGF. Véase, p. ej., Hartmann y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11574 (1992); Lokker y cols., EMBO J. 11:2503 (1992), Zhou y cols., Structure 6:109 (1998), Ultsch y cols., Structure 6:1383 (1998), Shimizu y cols., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189:1329 (1992), Yoshiyama y cols., Biochem. Biophys. Res. Commun.

175:660 (1991). Por ejemplo, parece que los dominios de la horquilla N-terminal y kringle 1 se requieren para la actividad de proliferación celular. Otros aminoácidos que no son críticos para la actividad biológica pueden delecionarse y/o sustituirse más libremente. Uno de los expertos en la técnica puede preparar variantes de isoformas de HGF usando técnicas rutinarias de mutagénesis, tales como las que se describen en las referencias citadas anteriormente, e identificar variantes que retienen sustancialmente toda la actividad biológica de la isoforma de HGF.

Una realización del gen de HGF híbrido de la formulación liofilizada de ADN de uso en la presente invención que comprende el intrón inherente tiene 7113 pb de longitud y tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 7.

Un gen de HGF híbrido puede comprender un fragmento de intrón inherente que, opcionalmente, tiene una pequeña secuencia recombinante insertada en el mismo entre los exones 4 y 5 del ADNc de HGF. En el presente documento, dicho gen de HGF híbrido que comprende un fragmento de intrón inherente se designa como "HGF-X". Ejemplos de genes HGF híbridos incluyen HGF-X2 (SEC ID Nº: 13), HGF-X3 (SEC ID Nº: 14), HGF-X6 (SEC ID Nº: 8), HGF-X7 (SEC ID Nº: 9) y HGF-X8 (SEC ID Nº: 10).

Administración y métodos de tratamiento

El término "reconstituido" o "reconstitución" se refiere a la restauración de la forma original, p. ej., mediante rehidratación, de una sustancia previamente alterada para su conservación y almacenamiento, p. ej., la restauración a un estado líquido de una formulación de ADN plasmídico que ha sido deshidratada y almacenada. La composición liofilizada de uso en la presente invención puede reconstituirse en cualquier solución acuosa que produce una solución estable monodispersa adecuada para su administración. Dichas soluciones acuosas incluyen, pero no se limitan a: agua estéril, TE, PBS, tampón Tris o solución salina normal.

La concentración de la formulación liofilizada reconstituida de ADN de uso en la presente invención se ajusta dependiendo de muchos factores, incluyendo la cantidad a liberar de una formulación, la edad y el peso del sujeto, el método de liberación y la vía y la inmunogenicidad del antígeno que se libera.

La formulación liofilizada reconstituida de ADN de uso en la invención puede administrarse mediante inyección directa intramuscular, intraendocárdica, intramiocárdica, intrapericárdica, intraventricular, intraarticular, intradérmica, intracerebral, intrarrenal, intrahepática, intraesplénica, intralinfática, subcutánea, intraabdominal, intratesticular, intraovárica, intrauterina, esternal, intratraqueal, intrapleural, intratorácica, intradural, intrarraquídea, intramedular e intraparietal. En ciertas realizaciones, el método de liberación es por vía de inyección directa intramuscular, intramiocárdica, intracerebral o intrarrenal.

Debe entenderse que la dosis diaria típica de la formulación liofilizada reconstituida de uso en la presente invención debería determinarse teniendo en cuenta diversos factores de interés, incluyendo las condiciones para ser tratado, la vía de administración seleccionada, la edad, el género y el peso corporal del paciente individual, y la gravedad del síntoma del paciente, y puede administrarse en una dosis única o en dosis dividida. Por tanto, la dosis diaria no debe interpretarse en modo alguno como una limitación del alcance de la invención.

El término "tratar" o "tratamiento" de una enfermedad isquémica o hepática, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la administración a un sujeto de un factor, p. ej., un HGF, p. ej., un HGF híbrido, o variante de los mismos, en una cantidad suficiente para dar como resultado una mejoría de uno o más síntomas de la enfermedad isquémica o hepática, o evitar el avance de la enfermedad isquémica o hepática.

Una "enfermedad isquémica" se refiere a una enfermedad asociada con un aporte insuficiente de sangre a una parte del organismo (como el corazón o el cerebro) que se debe a la obstrucción de la afluencia de sangre arterial (como el estrechamiento de las arterias por espasmo o enfermedad). Ejemplos de enfermedades isquémicas incluyen la arteriopatía coronaria (AC) y la arteriopatía periférica (AP).

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El término "enfermedad hepática" se aplica a muchas enfermedades y trastornos que ocasionan que el hígado funcione de forma inadecuada o deje de funcionar. HGF es un agente esencial en la inducción de la proliferación de los hepatocitos, y actúa en conjunto con el factor transformante del crecimiento alfa y el factor de crecimiento ligado a la heparina durante la regeneración del hígado. Adicionalmente, HGF mejora el daño hepático por medio de efectos antiapoptóticos en modelos animales de insuficiencia hepática fulminante, y atenúa la fibrosis hepática en animales con cirrosis hepática. En consecuencia, se considera que HGF no solo induce la regeneración del hígado, sino que también inhibe la progresión de la enfermedad y mejora la fibrosis hepática en pacientes que padecen enfermedades hepáticas intratables. Con respecto al tratamiento de la enfermedad hepática, la formulación liofilizada reconstituida de ADN de uso en la invención puede administrarse de acuerdo con los métodos de liberación expuestos anteriormente. En ciertas realizaciones, el método de liberación del tratamiento de la enfermedad hepática será la inyección intrahepática directa.

En ciertos aspectos de la invención, la formulación liofilizada reconstituida de ADN de uso en la invención puede comprender dos o más isoformas de HGF. Las isoformas de HGF pueden liofilizarse previamente por separado o en la misma formulación de ADN. Tras su reconstitución, estas dos isoformas pueden administrarse por separado o al mismo tiempo, es decir, coadministrarse; pueden administrarse o coadministrarse formulaciones reconstituidas separadas de ADN plasmídico de las dos o de más isoformas de HGF, o puede administrarse un único plásmido de expresión que contiene genes de dos o más isoformas de HGF y es capaz de expresar los genes de las dos o más isoformas de HGF. Por ejemplo, las dos isoformas flHGF y dHGF pueden administrarse usando dos plásmidos separados. Alternativamente, los dos plásmidos separados que contienen genes de flHGF y dHGF pueden usarse para su coadministración. Finalmente, puede administrarse un único plásmido de expresión que contiene genes tanto de flHGF como de dHGF. En ciertos aspectos de la invención, los flHGF y dHGF en un único plásmido de expresión están codificados por el mismo polinucleótido o por polinucleótidos separados.

Hay numerosos planteamientos para incluir más de un polinucleótido capaz de expresar una isoforma de HGF en un único plásmido. Estos incluyen, por ejemplo, el uso de secuencias del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, Internal Ribosome Entry Site), casetes dobles de promotor/expresión, y proteínas de fusión. Las dos o más isoformas expresadas a partir del mismo plásmido o en dos plásmidos separados, como se discute anteriormente, se seleccionan del grupo que consiste en flHGF, dHGF, NK1, NK2, y NK4 o se seleccionan del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 2 a 6. Las dos o más isoformas también pueden incluir isoformas adicionales de HGF conocidas por alguien con experiencia habitual en la técnica.

En ciertos aspectos de la invención, el ADN plasmídico se administra a través de inyección intracelular directa y, más preferentemente, mediante el uso de una jeringa o un catéter. Se han usado catéteres para introducir genes recombinantes in vivo (véase, p. ej., E.G. Nabel, y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5157 (1992); E.G. Nabel, y cols., Science 249, 1285 (1990); E.G. Nabel, y cols., Science 244, 1342 (1989); E.G. Nabel, y cols., J. Clin. Invest. 91, 1822 (1993); G. Plautz, y cols., Circ. 83, 578 (1991); E.G. Nabel, y cols., Nature (1993) (en prensa)). La utilización de un catéter proporciona la capacidad de liberar el ADN plasmídico dentro de células que son de difícil acceso mediante el uso de una jeringa.

La administración del ADN plasmídico de la invención también puede lograrse mediante transferencia genética a las células diana in situ, para optimizar la posterior liberación de genes in vivo.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular (incluida la PCR), vacunología, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., Sambrook y cols., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis

(M. J. Gait ed., 1984); Mullis y cols. Patente de Estados Unidos Nº: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); The treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, vols. 154 y 155 (Wu y cols. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London, 1987); y en Ausubel y cols., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).

Los siguientes ejemplos se dan a efectos de muestra solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Preparación del plásmido

En el experimento se usó el plásmido pCK-HGF-X7 (documento WO 03/078568) que está diseñado para expresar la proteína del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

Se transformaron E. coli (TOP10, Invitrogen, USA) con pCK-HGF-X7, y se aisló una colonia única. La colonia aislada se cultivó después en medio LB que contenía 30 µg/ml de kanamicina. El ADN plasmídico se purificó usando un kit

EndoFree plasmid Giga (Qiagen, EE. UU.), y se resuspendió en solución salina que contenía NaCl al 0,9% a una concentración final de ADN de 1,0 a 2,0 mg/ml.

Ejemplo 2: Liofilización 5 Se prepararon formulaciones de pCK-HGF-X7 en solución salina que contenía NaCl al 0,9% a una concentración final de ADN de 0,5 o 1 mg/ml, con sacarosa (0,25, 1,1, 5, 10 o 20 % m/v) o manitol (1,2, 4,85 o 10 % m/v). Las tablas A y B muestran el porcentaje de sacarosa y manitol, respectivamente, y las proporciones correspondientes de carbohidrato/ADN (m/m) para las formulaciones ensayadas de pCK-HGF-X7. 10 Tabla 1A Porcentaje de sacarosa

ADN (mg/ml): Sacarosa (%) Sacarosa (mg/ml) Proporción de sacarosa a ADN (m/m)

0,5: 0,25 2,5 5

0,5: 1,1 11 22

0,5: 5 50 100

0,5: 10 100 200

0,5: 20 200 400

1: 0,25 2,5 2,5

1: 1,1 11 11

1: 5 50 50

1: 10 100 100

1: 20 200 200

Tabla 1B Porcentaje de manitol

ADN (mg/ml): Manitol (%) Manitol (mg/ml) Proporción de manitol a ADN (m/m)

0,5: 1,2 12 24

0,5: 4,85 48,5 97

0,5: 10 100 200

1: 1,2 12 12

1: 4,85 48,5 48,5

1: 10 100 100

15 El ADN plasmídico suspendido se liofilizó después con Production-Master Freeze Dryer (C&H Cooling and Heating Systems, Corea). La temperatura se redujo a -50 ºC durante 4 horas a 100 mTorr. Después, la temperatura se elevó hasta -40 ºC durante 12 horas,-30 ºC durante 6 horas, -20 ºC durante 6 horas, -10 ºC durante 6 horas, 0º C durante 6 horas, 10 ºC durante 6 horas, y 30 ºC durante 24 h, progresivamente a 28∼29 mTorr. El ADN plasmídico liofilizado se conservó a -20 ºC hasta su análisis.

20 El ADN plasmídico suspendido se liofilizó también con Production-Master Freeze Dryer (C&H Cooling and Heating Systems, Corea). La temperatura se redujo a 5 ºC durante 1 minuto y a -50 ºC durante 2 horas a 100 mTorr. Después, la temperatura se elevó hasta -40 ºC durante 6 horas,-35 ºC durante 3 horas, -30 ºC durante 6 horas, -25 ºC durante 3 horas, -20 ºC durante 3 horas, -15 ºC durante 3 horas, -10 ºC durante 6 horas, -5°C durante 3 horas,

25 0°C durante 6 horas, y 30 ºC durante 17 horas, progresivamente a 28∼29 mTorr. El ADN plasmídico liofilizado se conservó a -20 ºC hasta su análisis.

El ADN plasmídico suspendido se liofilizó también con Production-Master Freeze Dryer (C&H Cooling and Heating Systems, Corea). La temperatura se redujo a 5°C durante 1 minuto, -10 °C durante 1 minuto, -20 °C durante 1

30 minuto, -30 °C durante 1 minuto, and -50 °C durante 1 minuto a 150 mTorr. La temperatura se mantuvo a -50 ºC durante otras 2 horas a 150 mTorr. Después, la temperatura se elevó hasta -45 ºC durante 6 horas,-40°C durante 3 horas, -35 ºC durante 6 horas, -30 ºC durante 3 horas, -25 ºC durante 6 horas, -20 ºC durante 3 horas, -15 ºC durante 6 horas, -10 ºC durante 3 horas, -5 °C durante 3 horas, 0°C durante 12 horas, 10 ºC durante 3 horas, -20 ºC

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Se obtuvieron once cerdos Yorkshire (machos, de 28 a 30 kg. Instituto de Investigación Clínica, del Hospital Universitario Nacional de Seúl) y se les proporcionó agua y alimento dos veces al día a voluntad. Se permitió descansar a los cerdos durante 7 días antes de someterlos al experimento. El diseño experimental completo se muestra en la fig. 3.

(2) Establecimiento del modelo porcino de cardiopatía isquémica

Se inyectaron a cada cerdo Xilacina (2 mg/kg), ketamina (20 mg/kg), y atropina (0,05 mg/kg) por vía intramuscular. Veinte minutos más tarde, se insertó una vía Medicut del calibre 22 en la arteria femoral superficial para el control continuo de la tensión arterial. Se inyectó tiopental sódico (10 mg/ml) por vía intravenosa, y la intubación endotraqueal se realizó por vía orotraqueal. La anestesia se mantuvo mediante inhalación de enflurano Durante la operación, se mantuvieron una presión de ventilación positiva y una fracción de oxígeno de 30 % ∼ 40 %. Los electrocardiogramas, la saturación de oxígeno y la tensión arterial se controlaron continuamente.

Después, se realizó una toracotomía izquierda. Tras la apertura del pericardio, seguida de la exploración de la arteria coronaria anterior izquierda descendente (AID), se inyecto lidocaína al 2% (1 mg/kg) por vía intravenosa y el tercio distal de la AID se ligó durante 3 minutos dejando la segunda ramificación diagonal tanto como fue posible. Se realizó una reperfusión (preacondicionamiento isquémico) durante 5 minutos, usando suturas de polipropileno 5-0 reforzadas con un trozo pequeño de Nelaton (4 Fr). Después de este único preacondicionamiento isquémico, se ligó la AID distal y se confirmó la depresión o elevación del segmento ST en el electrocardiograma controlado. Se inyectó lidocaína adicional (1 mg/kg) por vía intravenosa 15 minutos después del ligamiento, y se cerraron las heridas del pericardio y la toracotomía. Se retiró una única sonda pleural de 28 Fr conectada a la succionador de pared Inmediatamente después de que retornase suficientemente la respiración espontánea, a lo que siguió la retirada del tubo endotraqueal.

Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité para el Cuidado y el Uso de Animales de la Universidad Nacional de Seúl.

(3): Inyección intramiocárdica de los plásmidos

Veintiocho días después del ligamiento de la arteria coronaria, se realizó una nueva toracotomía. Mediante el uso de agujas de inyección para insulina del calibre 27, se inyectó una dosis total de 1 mb de pCK-HGF-X7 liofilizado con sacarosa al 1,1% y NaCl al 0,9 % (L-HGF-X7, n= 3) o pCK-HGF-X7 no liofilizado, que contenía NaCl al 0,9 % (NLHGF-X7, n= 4) en el margen de la zona isquémica anterolateral, que se encuentra entre el área del infarto fibrótico y el miocardio macroscópicamente normal, a lo largo del curso de la segunda ramificación diagonal. Se inyectaron un total de cinco sitios En cada sitio se inyectaron 0,2 mg de ADN plasmídico y el intervalo entre sitios de inyección fue de 1,5 cm. El ADN plasmídico liofilizado se reconstituyó con agua hasta la concentración final de 1 mg/ml antes de la inyección. Como control, se inyecto la cantidad idéntica de pCK no liofilizado que contenía NaCl al 0,9 % (n= 4) en el margen de la zona isquémica anterolateral. Los puntos de inyección se marcaron con etiquetas de sutura utilizando anillos de metal.

(4): Tomografía computarizada miocárdica de emisión monofotónica

Veintiséis días después de la inducción quirúrgica del infarto de miocardio, se realizó una tomografía computarizada de emisión monofotónica (SPECT, single photon emission computed tomography) seleccionada con 99mTc-MIBI (Vertex EPIC, ADAC Labs, CA., EE. UU.) para establecer unos valores iniciales antes de la inyección del plásmido. La SPECT regulada se repitió 28 días más tarde (el día 54 después de la inducción del infarto de miocardio).

Se eligió un modelo de 20 segmentos para el análisis segmentario. Seis segmentos correspondientes a la base cardiaca se excluyeron del análisis porque la atenuación diafragmática o algunos artefactos alrededor del corazón podrían influir fácilmente sobre esta región; también porque la base del corazón estaba lejos de los sitios del ligamiento coronario distal y de la inyección del plásmido.

Las imágenes de la SPECT construidas mediante electrocardiograma seleccionado se analizaron mediante un programa de autocuantificación (AutoQUANT, ADAC Labs, CA., EE.UU.), que se cree que elimina el posible sesgo asociado a cualquier manipulación del técnico.

La cantidad de perfusión segmentaria se cuantificó mediante la medición de la captación de 99mTc-MIBI, y se calculó como un porcentaje de la captación máxima. Cuando la perfusión segmentaria así estimada fue inferior al 70 %, se definió como un segmento hipoperfundido y se usó como la diana de la liberación del plásmido. Los segmentos que siguieron bien perfundidos después del ligamiento coronario también se excluyeron, ya que, probablemente, no obtendrían beneficio de la angiogénesis terapéutica. El engrosamiento parietal en la fase sistólica se indicó como un porcentaje del engrosamiento diastólico final en las imágenes seleccionadas.

(5) Estadística

Claims

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