CN102046792B

CN102046792B - 用于提高质粒dna表达的冻干dna制剂

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Publication number: CN102046792B
Application number: CN200980119962.6A
Authority: CN
Inventors: 金钟默; 金水晶; 韩熊; 俞源善
Original assignee: Viromed Co Ltd
Current assignee: Helixmith Co Ltd
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2029-04-09
Also published as: US20090258932A1; BRPI0911511B8; CA2720611A1; HK1155776A1; RU2470995C2; EP2281040A4; WO2009125986A3; US8389492B2; BRPI0911511B1; AU2009234598B2; US20110166211A1; AU2009234598C1; EP2281040A2; MX2010010993A; KR20100129341A; AU2009234598A1; JP2011516545A; JP5579164B2; KR101290322B1; WO2009125986A2

Abstract

本发明提供了由包含质粒DNA、盐和碳水化合物之组合物冻干的DNA制剂，其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体。

Description

用于提高质粒DNA表达的冻干DNA制剂

技术领域

本发明涉及由包含质粒DNA、盐和碳水化合物的组合物冻干而成的DNA制剂，其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体。

背景技术

冻干法常常是治疗性物质的优选配制方法，因为许多物质的长期稳定性在冻干状态下增加。但是，对于质粒DNA来说，冻干制剂却不是首选的制剂。在使用裸(非复合质粒)DNA作为递送载体的大多数临床试验中，优选制剂是液体制剂。

尽管冻干质粒DNA可能是优选的保存形式，但是质粒DNA的冻干制剂被认为是造成基因表达效率降低的原因。冻干法导致失去分子周围的水化球(hydration sphere)。对于DNA来说，似乎每个核苷酸对约有20个水分子紧密结合DNA，其在低温冷却时不形成冰样结构。在0％相对湿度下用吸湿性盐对DNA脱水后，仅剩余五或六个水分子。因此，冻干法可增加长期保存时DNA的稳定性，但是在最初的冻干过程后也可造成一些损伤，这可能是通过DNA二级结构或反应性成分(例如杂质金属)浓度的变化造成的。因此，冻干质粒DNA基因之表达效率损失的一个可能机制是质粒的总体结构改变。

在Poxon等，Pharmaceutical Development and Technology 5：115-122(2000)中，作者证明了质粒DNA(pRL-CMV)的冻干导致转染效率统计学显著的损失。测量转染活性的生物功能性测定表明，与保持在溶液中的对照质粒相比，冻干后质粒DNA活性损失超过75％。尽管Poxon等人使用碳水化合物改善了保存于EDTA缓冲液中的表达Renilla萤光素酶的非治疗性质粒pRL-CMV的体外转染活性降低，但是Poxon等人并未提及使用冻干的裸DNA制剂体内用于疾病治疗或预防。

因此，本领域需要不影响基因表达效率的稳定冻干制剂。本发明提供了这样的质粒DNA冻干制剂，其不但保留了所表达基因的生物活性而且在某些情况下能够提高生物活性。

发明内容

本发明涉及冻干DNA制剂。在本发明的一个方面，在冻干前，DNA制剂包含质粒DNA、盐和碳水化合物；其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体。在本发明的另一方面中，所述DNA制剂被冻干。在本发明的另一方面中，所述冻干DNA制剂被重构(reconstituted)。

在一个实施方案中，本发明DNA制剂中的碳水化合物是单糖、寡糖或多糖，例如蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、甘露醇、甲基α-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖(threose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖(psicose)、塔格糖(tagatose)、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、神经氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、左聚糖(levan)、硫酸岩藻聚糖、角叉藻聚糖、半乳卡罗聚糖、果胶类、果胶酸类、直链淀粉、普鲁兰多糖(pullulan)、糖原、支链淀粉、纤维素、右旋糖酐、环糊精、石耳素(pustulan)、甲壳素、琼脂糖、角质素(keratin)、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原胶(xantham gum)或淀粉。

在本发明的某些实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖或甘露醇。

在另一实施方案中，本发明DNA制剂中的碳水化合物的量选自：约0.05％至约30％、约0.1％至约15％、约0.2％至约10％、约0.5％至5％、约0.75％至3％、约0.8％至2％以及约0.8％至1.5％。在一些特定实施方案中，所述碳水化合物是蔗糖或甘露醇。在某些另外的实施方案中，所述DNA制剂的碳水化合物的量约为1.1％。

在另一实施方案中，所述DNA制剂中的盐选自NaCl或KCl。在另一些实施方案中，所述DNA制剂中的盐的量选自：约0.01％至10％、约0.1％至5％、约0.1％至4％、约0.5％至2％、约0.8％至1.5％、约0.8％至1.2％(重量/体积)。在某些实施方案中，所述DNA制剂中的盐的量约为0.9％(重量/体积)。

在另一实施方案中，本发明的质粒DNA包含HGF基因或其变体。在某些实施方案中，所述HGF基因是哺乳动物HGF基因或其变体。在另一些实施方案中，所述HGF基因是人HGF基因或其变体。在本发明的某些方面，所述HGF基因是杂合的HGF基因，例如包含HGF cDNA和固有或外源内含子或其片段(例如人HGF基因的固有内含子4或其片段)的杂合HGF基因。在一些特定实施方案中，所述杂合HGF基因包括HGF-X2(SEQ ID NO：13)、HGF-X3(SEQ ID NO：14)、HGF-X6(SEQID NO：8)、HGF-X7(SEQ ID NO：9)或HGF-X8(SEQ ID NO：10)。在另一些实施方案中，包含杂合HGF基因的质粒DNA选自：pCK-HGF-X2、pCK-HGF-X3、pCK-HGF-X6、pCK-HGF-X7、pCK-HGF-X8、pCP-HGF-X2、pCP-HGF-X3、pCP-HGF-X6、pCP-HGF-X7和pCP-HGF-X8，其中HGF-X2、HGF-X3、HGF-X6、HGF-X7和HGF-X8分别对应于SEQ ID NO：13-14和8-10。

所述冻干DNA制剂维持或提高质粒DNA的表达。在某些方面，所述冻干DNA制剂提供了所表达蛋白质之生物活性的提高。在本发明的某些另外方面中，所述质粒DNA表达的提高或者所表达蛋白质生物活性的提高是由于制剂中存在碳水化合物所致。在一些实施方案中，该碳水化合物是蔗糖或甘露醇。

本发明还提供了重构的冻干质粒DNA制剂。在某些实施方案中，所述冻干DNA在可药用溶液中重构。在另一些实施方案中，所述可药用溶液选自：水、PBS、TE、Tris缓冲液和生理盐水。

在另一实施方案中，所述重构的冻干制剂中质粒DNA终浓度为约1ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约50ng/mL、约100ng/mL、约250ng/mL、约500ng/mL、约1μg/mL、约5μg/mL、约10μg/mL、约50μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约300μg/mL、约400μg/mL、约500μg/mL、约600μg/mL、约700μg/mL、约800μg/mL、约900μg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约30mg/mL。在另一实施方案中，所述重构的冻干制剂中质粒DNA终浓度为约1ng/mL至约30mg/mL。在某些方面中，所述重构的冻干制剂中质粒DNA终浓度为约100μg/mL至约2.5mg/mL。在另一些方面中，所述重构的冻干制剂之质粒DNA终浓度为约500μg/mL至约1mg/mL。

本发明还涉及治疗或预防对象中缺血性疾病或肝脏疾病的方法，包括施用由冻干的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)DNA制剂重构的组合物，其中所述DNA制剂包含质粒DNA、盐和碳水化合物；其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体。在某些方面，所述由冻干HGF DNA制剂重构的组合物通过直接注射进行施用。

本发明还涉及制备冻干HGF DNA制剂的方法，包括：(a)制备包含质粒DNA、盐和碳水化合物的DNA制剂，其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体；以及(b)冻干所述DNA制剂。

冻干步骤可包括对本发明的DNA制剂以零下温度(例如-10℃至-50℃)进行冷冻，然后进行一个或多个干燥循环，其包括逐渐加热DNA制剂到约20℃至低于或等于约30℃，其中冻干进行约50至约100小时。在本发明的另一方面中，冻干方法包括：(a)形成包含质粒DNA、盐和碳水化合物的DNA含水制剂，其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体；(b)将该DNA制剂溶液冷却到约-10℃至约-50℃的温度，直至冻结；(c)通过加热到约20℃至约30℃来干燥所述DNA制剂；以及(d)回收冻干的DNA制剂组合物，其具有基于所回收DNA制剂之总重量的约0.1(重量)％至约5(重量)％的水含量。

在某些实施方案中，依次在下列条件下进行DNA制剂冻干，所述条件包括(a)在高于或等于约-50℃且低于约0℃的温度下，约30小时至约50小时，和(b)在高于或等于约0℃至低于或等于约30℃的温度下，约20小时至约50小时，其中(a)中最低温度为约-50℃至约-30℃，(b)中最高温度为约20℃至约30℃。在一个方面中，依次在下列条件下进行DNA制剂冻干：-50℃4小时，-40℃12小时，-30℃6小时，-20℃6小时，-10℃6小时，0℃6小时，10℃6小时以及30℃24小时。在另一方面中，依次在下列条件下进行DNA制剂冻干：5℃1分钟，-50℃2小时，-40℃6小时，-35℃3小时，-30℃6小时，-25℃3小时，-20℃3小时，-15℃3小时，-10℃6小时，-5℃3小时，0℃6小时，以及30℃17小时。在另一方面中，依次在下列条件下进行DNA制剂冻干：5℃1分钟，-10℃1分钟，-20℃1分钟，-30℃1分钟，-50℃1分钟，-50℃2小时，-45℃6小时，-40℃3小时，-35℃6小时，-30℃3小时，-25℃6小时，-20℃3小时，-15℃6小时，-10℃3小时，-5℃6小时，0℃12小时，10℃3小时，20℃6小时以及30℃29小时。

本发明还涉及如上所述的冻干核酸制剂或重构的冻干核酸制剂，其中所述核酸是编码HGF或其变体的RNA。

附图说明

本发明的上述及其它目的和特征通过以下对本发明的描述并参考附图得以显现，其中：

图1显示比较多种制剂中体外HGF表达的柱状图。使用ELISA测量分离自用冻干质粒DNA pCK-HGF-X7转染之293T细胞分离的培养物上清中的HGF表达水平，所述质粒配制于0.9％NaCl中，DNA终浓度为0.5mg/mL，并含有0.25％(第3泳道)、1.1％(第4泳道)、5％(第5泳道)、10％(第6泳道)或20％(第7泳道)的蔗糖或者1.2％(第8泳道)、4.85％(第9泳道)或10％(第10泳道)的甘露醇。使用利用阴性对照(第1泳道)和非冻干DNA(第2泳道)的对照反应进行比较。

图2显示比较非冻干和冻干pCK-HGF-X7之间体内HGF表达的柱状图。将含有0.9％NaCl的100μg非冻干pCK-HGF-X7(NL-HGF-X7)或者与1.1％蔗糖和0.9％NaCl冻干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7)注射到小鼠的胫骨前肌(tiabialis cranialis)中。在第7天处死小鼠后，使用ELISA测量肌肉组织裂解物中HGF的表达水平。显示了阴性对照(第1泳道)、含有0.9％NaCl的非冻干pCK-HGF-X7(NL-HGF-X7；第2泳道)和与1.1％蔗糖和0.9％NaCl冻干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7；第3泳道)的HGF表达水平。

图3显示使用猪缺血性心脏病模型的实验步骤示意图。NL-HGF-X7对应于含有0.9％NaCl的非冻干pCK-HGF-X7。L-HGF-X7对应于与1.1％蔗糖和0.9％NaCl冻干的pCK-HGF-X7。

图4是显示非冻干和冻干pCK-HGF-X7对心肌灌注之作用的柱状图。显示了当使用猪缺血性心脏病模型时相比于基线的心肌灌注改善百分比。显示了仅用质粒(pCK；第1泳道)、用含有0.9％NaCl的非冻干pCK-HGF-X7(NL-HGF-X7；第2泳道)以及用与1.1％蔗糖和0.9％NaCl冻干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7；第3泳道)注射猪的结果。

图5是显示非冻干和冻干pCK-HGF-X7对壁增厚之作用的柱状图。显示了当使用猪缺血性心脏病模型时相比于基线的左心室所注射缺血性边界区域中壁增厚之改善百分比。显示了仅用质粒(pCK；第1泳道)、用含有0.9％NaCl的非冻干pCK-HGF-X7(NL-HGF-X7；第2泳道)以及用与1.1％蔗糖和0.9％NaCl冻干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7；第3泳道)注射猪的结果。

发明详述

定义

术语“DNA”或“核酸”或“核酸片段”是指多核苷酸或构建物中存在的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。可以线性(例如mRNA)或环状(例如质粒)形式以及双链或单链形式提供核酸或其片段。“分离”的核酸或多核苷酸旨在表示已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就本发明的目的而言，载体中所含的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或者溶液中的(部分地或基本上)纯化多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。

本文使用的“编码区”是由翻译成氨基酸之密码子组成的核酸部分。尽管″终止密码子″(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但也可认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子等则不是编码区的一部分。本发明的两种或更多种核酸或核酸片段可存在于单个多核苷酸构建物中(例如在单个质粒上)或者在分开的多核苷酸构建物中(例如在分开的(不同的)质粒上)。此外，任何核酸或核酸片段可编码单个HGF多肽或其片段、衍生物或变体，例如，或者可编码多于一种多肽，例如核酸可编码两种或更多种多肽。另外，核酸可包含调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子，或者可编码与HGF编码区融合的异源编码区，例如专门的元件或基序(例如分泌信号肽或异源功能结构域)。

对于DNA来说，包含编码多肽之核酸的多核苷酸通常还包含与编码所述多肽之核酸片段有效连接的启动子和/或其它转录或翻译调控元件。有效连接是指编码基因产物(例如多肽)的核酸片段与一个或多个调节序列以使得将所述基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制之下的方式进行连接。

本发明的DNA多核苷酸可以是环状或线性化的质粒或载体，或者是也可以为非感染性和非整合性(即不整合进脊椎动物细胞的基因组中)的其它线性DNA。线性化质粒是指先前为环状但已被线性化(例如通过用限制性核酸内切酶进行消化)的质粒。本文使用的术语“质粒”和“载体”可互换地使用。

术语“冻干的DNA”是指通过快速冷冻和脱水制备的、在高度真空下呈冷冻状态的、干燥形式的任何DNA。“冻干”是指使溶液冷冻和干燥的方法。冻干的DNA常通过加入无菌蒸馏水而进行使用。

“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移进入宿主细胞的任何运载体(vehicle)。载体可以是可与另一DNA区段连接从而复制所连接区段的复制子。“复制子”是指用作DNA体内自主复制(即能够在自身控制下进行复制)单元的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括体外、离体或体内将核酸引入细胞的运载体。本领域中已知的许多载体可用于操作核酸，将应答元件和启动子掺入基因等。可能的载体包括例如：质粒(如pBR322或pUC质粒衍生物)或Bluescript载体。例如，可通过将合适DNA片段连接进具有互补粘性末端的所选载体来实现将对应于响应元件和启动子的DNA片段插入合适载体。或者，可用酶修饰DNA分子的末端，或者可通过将核苷酸序列(接头)连接进DNA末端来产生任意位点。可改造这些载体使其含有提供对细胞进行选择的选择标记基因。这些标记允许鉴定和/或选择表达由所述标记编码之蛋白质的宿主细胞。

另外的载体包括lipoplex(阳离子脂质体-DNA复合物)、polyplex(阳离子聚合物-DNA复合物)和蛋白质-DNA复合物。除了核酸之外，载体还可包含一个或多个调节区和/或可用于选择、测量和监测核酸转移结果(转移至哪些组织、表达持续时间等)的选择标记。

术语“质粒”是指染色体外元件，其常常携带不作为细胞核心代谢机制之一部分的基因，并且其通常是环状双链DNA分子的形式。这些元件可以是来自于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经连接或重组为能够将启动子片段和所选基因产物之DNA序列以及合适的3′非翻译序列引入细胞的独特构建物。本文使用的术语“质粒”是指由遗传物质(即核酸)构成的构建物。通常，质粒含有在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中有功能的复制起点，以及用于检测包含该质粒之细菌宿主细胞的选择标记。

本发明的质粒可包含本文所述的遗传元件，其布置成使得所插入编码序列可在真核细胞中转录和翻译。在本文所述的某些实施方案中，质粒是闭环DNA分子。

术语“表达”是指使用生物方法产生由编码序列编码的产物。在大多数情况下，包含编码序列的DNA序列转录形成信使RNA(mRNA)。随后，信使RNA翻译形成具有相应生物活性的多肽产物。同时，表达过程可包括对RNA转录产物的进一步加工步骤(例如剪接以除去内含子)和/或对多肽产物的翻译后加工。

术语“表达载体”是指设计成使得在转化进宿主之后表达所插入核酸序列的载体、质粒或运载体。通常将所克隆基因(即所插入的核酸序列，例如HGF基因或其变体)置于调控元件(例如启动子、最小启动子、增强子等)的控制下。可用于驱动核酸在期望的宿主细胞中表达的起始调控区或启动子有很多种，并且为本领域技术人员所熟知。事实上，任何能够驱动这些基因表达的启动子均可用于表达载体中，包括但不限于病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、致病或疾病相关启动子、发育特异性启动子、可诱导启动子、光调节启动子；包括但不限于SV40早期(SV40)启动子区、劳氏肉瘤病毒的3′长末端重复(LTR)中所含的启动子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)、人巨细胞病毒(HCMV)立即早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、泛素C(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子的调节序列和转录调控区、普遍表达启动子(HPRT、波形蛋白、β-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间丝(结蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)的启动子、治疗性基因(MDR、CFTR或VIII型因子等)的启动子、致病或疾病相关启动子以及显示出组织特异性以及已用于转基因动物的启动子，例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区，在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区，在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区；在肝脏中有活性的白蛋白基因、Apo AI和Apo AII调控区，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因调控区，在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区，在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因调控区，在脑的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因调控区，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区以及在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因调控区，丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、与脂肪酸结合之肠蛋白的启动子、平滑肌细胞β-肌动蛋白的启动子等。另外，这些表达序列可通过添加增强子或调节序列等进行修饰。本发明表达载体的非限制性实例包括pCK(Lee等，Biochem.Biophys.Res.Commun.272：230(2000)；WO 2000/040737)和pCP(pCDNA3.1，Invitrogen，USA)。

本文使用的“构建物”一般表示在自然界中不存在的组成。构建物可通过合成技术产生，例如重组DNA制备和表达或者针对核酸或氨基酸的化学合成技术。还可通过将一种物质添加或归属到另一种物质而产生自然界中不存在之形式的构建物。

“基因”是指包含编码功能性分子之核苷酸的多核苷酸，所述功能性分子包括由仅由转录产生的功能性分子(生物活性RNA类别)或通过转录和翻译产生的功能性分子(例如多肽)。术语“基因”涵盖cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还指表达特定RNA、蛋白质或多肽的核酸片段，其包含编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指在自然界中发现的、具有其自身之调节序列的任何基因。“嵌合基因”是指并非天然基因的、包含自然界中未发现共同存在之调节和/或编码序列的任何基因。因此，嵌合基因可包含来自不同来源的调节序列和编码序列，或者来自同一来源但以不同于自然界中所发现之方式安排的调节序列和编码序列。嵌合基因可包含来自不同来源的编码序列和/或来自不同来源的调节序列。“内源基因”是指位于生物体基因组中其天然位置的天然基因。“外源”基因或“异源”基因是指通常不在宿主生物体中发现而通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外源基因可包括插入非本源生物体中的天然基因，或者嵌合基因。“转基因”是已通过基因转移方法引入细胞的基因。

“异源DNA”是指并非天然位于细胞中或者细胞的染色体位点中的DNA。异源DNA可包括对细胞而言外来的基因。

短语“分离的”或“生物学上纯的”是指物质基本上不含天然状态下存在的通常伴随所述物质的组分。因此，本发明中“分离的肽”优选不包含在其原位环境中通常与该肽相结合的物质。

冻干的DNA制剂

在冻干之前，本发明的DNA制剂与某些赋形剂(包括碳水化合物和盐)配制在一起。

如本文所述，待用作诊断或治疗剂的DNA冻干制剂的稳定性可通过在冻干前将所述DNA与包含稳定化量之碳水化合物的水溶液一起配制而提高。

本发明DNA制剂中的碳水化合物是单糖、寡糖或多糖，例如蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、甘露醇、甲基α-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、神经氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、左聚糖、硫酸岩藻聚糖、角叉藻聚糖、半乳卡罗聚糖、果胶类、果胶酸类、直链淀粉、普鲁兰多糖、糖原、支链淀粉、纤维素、右旋糖酐、环糊精、石耳素、甲壳素、琼脂糖、角质素、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原胶或淀粉。

在一个方面中，所述碳水化合物是甘露醇或蔗糖。

冻干前的碳水化合物溶液可对应于仅在水中的碳水化合物，或者可包含缓冲液。所述缓冲液的实例包括PBS、HEPES、TRIS或TRIS/EDTA。通常，碳水化合物溶液与DNA组合至蔗糖终浓度约0.05％至约30％，通常蔗糖为0.1％至约15％，例如0.2％至约5％、10％或15％，优选地蔗糖为约0.5％至10％、1％至5％、1％至3％，最优选地蔗糖为约1.1％。

本发明DNA制剂中的盐是NaCl或KCl。在某些方面，所述盐是NaCl。在另一些方面，所述DNA制剂中的盐的量选自：约0.001％至约10％，约0.1％至5％，约0.1％至4％，约0.5％至2％，约0.8％至1.5％，约0.8％至1.2％(重量/体积)。在某些实施方案中，所述DNA制剂中的盐的量为约0.9％(重量/体积)。

在本发明的DNA制剂中，DNA终浓度为约1ng/mL至约30mg/mL的质粒。例如，本发明的制剂可包含终浓度为约1ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约50ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL、约1μg/mL、约5μg/mL、约10μg/mL、约50μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约400μg/mL、约500μg/mL、约600μg/mL、约800μg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或者约30mg/mL的质粒。在本发明的某些实施方案中，DNA的终浓度为约100μg/mL至约2.5mg/mL。在本发明的一些特定实施方案中，DNA的终浓度为约0.5mg/mL至1mg/mL。

本发明的DNA制剂在本领域中已知的标准条件下进行冻干。冻干本发明DNA制剂的方法可包括(a)将盛有DNA制剂(例如包含质粒DNA、盐和碳水化合物的DNA制剂，其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体)的容器(例如小瓶)装入冻干机，其中冻干机具有约5℃至约-50℃的起始温度；(b)将DNA制剂冷却至零下温度(例如-10℃至-50℃)；以及(c)使DNA制剂基本干燥。本领域技术人员考虑到影响冻干参数的因素(例如所用的冻干机类型、所用的DNA量以及所用的容器大小)可以对本发明DNA制剂的冻干条件(例如温度和持续时间)进行调整。

然后，可将装有冻干DNA制剂的容器密封，并在多种温度(例如室温至约-180℃，优选约2～8℃至约-80℃，更优选-20℃至约-80℃，最优选约-20℃)下长时间保存。在某些方面，冻干的DNA制剂优选在约2～8℃至约-80℃范围内在至少6个月期间是稳定的，没有显著的活性丧失。稳定保存质粒DNA制剂还可对应于以稳定形式保存质粒DNA至用于研究或基于质粒之治疗之前的长时间。保存时间可以长达数月、1年、5年、10年、15年或多至20年。优选地，所述制剂在至少约3年内是稳定的。

HGF质粒DNA

本发明提供了冻干的DNA制剂，其中在冻干之前所述DNA制剂包含质粒DNA，所述质粒DNA包含HGF基因或其变体。

肝细胞生长因子(HGF)是肝素结合糖蛋白，亦称为“扩散因子(scatterfactor)”或“肝生成素-A”。编码人HGF的内源基因位于染色体7q21.1，包含18个外显子和17个内含子，具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(SekiT.等，Gene 102：213-219(1991))。由HGF基因转录得到约6kb的转录物，然后，由其合成由728个氨基酸组成的多肽HGF前体(SEQ ID NO：2)。同时，由723个氨基酸组成的dHGF前体多肽也通过HGF基因的选择性剪接而合成。血清中的蛋白酶可将无生物学活性的前体转变为活性形式的以二硫键连接的异二聚体。在所述异二聚体中，具有高分子量的α链形成四个kringle结构域和N端发夹环，类似于纤溶酶原的前活化肽区域。由约80个氨基酸组成的三个以二硫键连接的环结构的kringle结构域在蛋白质-蛋白质相互作用中起重要作用。低分子量β链形成无活性丝氨酸蛋白酶样结构域。由723个氨基酸组成的dHGF是在α链的第一kringle结构域中缺失了五个氨基酸(即F、L、P、S和S)的多肽。

中胚层来源之细胞分泌的HGF具有多种生物学功能，例如1)诱导上皮细胞形成管状结构；2)在体外和体内刺激来自内皮细胞的脉管形成；3)肝和肾的再生，由其抗凋亡活性所致；4)肾、卵巢和睾丸的器官发生；5)控制骨生成；6)刺激红系造血前体细胞(erythroid hematopoieticrecursor cell)的生长和分化；和7)神经元的轴突出芽(Stella，M.C.和Comoglio，P.M.，The International Journal of Biochemistry&CellBiology 31：1357-1362(1999))。基于这些不同功能，HGF或者编码HGF或其变体的基因可被开发成治疗缺血性疾病或肝脏疾病的治疗剂。事实上，在体内，HGF可以HGF或dHGF存在，因此HGF和dHGF的共表达对于使治疗效果最大化来说十分重要。可以基因治疗的高效率同时表达HGF和dHGF的杂合HGF基因是HGF变体，其有利地用于本发明的质粒DNA制剂中。

杂合HGF基因先前已描述于国际专利申请No.WO 03/078568和美国专利公开No.2005/0079581A1中，其各自内容通过引用并入本文。杂合HGF基因通过将固有的或外源的内含子插入到HGF cDNA的第4和第5外显子之间来制备。杂合HGF基因具有高于HGF cDNA的表达效率，并同时表达两种不同类型——HGF和dHGF(HGF缺失变体)。

术语“HGF同工型”是指与动物中天然产生的HGF氨基酸序列具有至少80％同一性(例如至少90％或95％同一性)的氨基酸序列的任何HGF多肽，包括所有等位基因变体。在一个实施方案中，该术语是指已知具有细胞增殖活性的同工型。HGF的同工型包括但不限于flHGF、dHGF、NK1、NK2和NK4(例如对应于SEQ ID NO：2-6)，以及其变体(例如NK2变体，SEQ ID NO：11-12)。

术语“flHGF”是指动物(例如哺乳动物)的全长HGF蛋白，例如人HGF的1-728位氨基酸(SEQ ID NO：2)。

术语“dHGF”是指由动物(例如哺乳动物)中HGF基因选择性剪接产生的HGF蛋白缺失变体，例如由723个氨基酸(SEQ ID NO：3)组成的、在全长HGF序列中α链的第一个kringle结构域中缺失五个氨基酸(F、L、P、S和S)的人HGF。

术语“NK1”是指来自动物(例如哺乳动物(例如人))的HGF同工型，其由N端发夹环和kringle1结构域组成。

术语“NK2”是指来自动物(例如哺乳动物(例如人))的HGF同工型，其由N端发夹环、kringle1和kringle2结构域组成。

术语“NK4”是指来自动物(例如哺乳动物(例如人))的HGF同工型，其由N端发夹环、kringle1、kringle2、kringle3和kringle4结构域组成。

HGF的结构和功能已被广泛地研究，本领域技术人员知晓HGF序列中对于基本维持该蛋白质全部生物活性来说重要的氨基酸，以及在HGF的任何序列变体中优选不发生改变或者仅保守性改变的氨基酸。参见例如Hartmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11574(1992)；Lokker等，EMBO J.11：2503(1992)，Zhou等，Structure 6：109(1998)，Ultsch等，Structure 6：1383(1998)，Shimizu等，Biochem.Biophys.Res.Commun.189：1329(1992)，Yoshiyama等，Biochem.Biophys.Res.Commun.175：660(1991)，其均通过引用以整体并入本文。例如N端发夹环和kringle1结构域似乎是细胞增殖活性所需的。对于生物活性不关键的其它氨基酸可以缺失和/或更自由地替换。本领域技术人员可使用常规诱变技术(例如上文引用的参考文献中所记载地)制备HGF同工型的变体，以及鉴定基本上保留HGF同工型全部生物学活性的变体。

本发明中包含固有内含子的杂合HGF基因的一个实施方案为7113bp长，并具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列。

杂合HGF基因可包含固有内含子片段，其任选地具有插入到HGFcDNA第4和第5个外显子之间的小重组序列。在本文中，包含固有内含子片段的这些杂合HGF基因称为“HGF-X”。杂合HGF基因的实例包括：HGF-X2(SEQ ID NO：13)、HGF-X3(SEQ ID NO：14)、HGF-X6(SEQ IDNO：8)、HGF-X7(SEQ ID NO：9)和HGF-X8(SEQ ID NO：10)。

施用和治疗方法

如上所述，HGF具有多种生物学功能，基于这些不同的生物学功能，HGF、编码HGF的基因或其变体可被开发成治疗缺血性疾病或肝脏疾病的治疗剂。在本发明中，HGF DNA制剂在重构经冻干DNA制剂之后施用。

术语“重构”是指将先前为了保存和存储而改变的物质恢复成原始形式(例如通过再水化来实现)，例如将先前经干燥和保存的DNA质粒制剂恢复成液体状态。本发明的冻干组合物可在产生适于施用的稳定、单分散(mono-dispersed)溶液的任何水溶液中重构。这类水溶液包括但不限于：无菌水、TE、PBS、Tris缓冲液或生理盐水。

根据多种因素(包括待递送制剂的量、对象的年龄和重量、递送方法和途径以及所递送抗原的免疫原性)来调节本发明方法中重构的冻干DNA的浓度。

本发明的经重构之冻干DNA制剂可通过下列途径施用：经口或经肠胃外途径例如静脉内、肌内、心内膜内、心肌内、心包内、心室内、动脉内、皮内、脑内、肾内、肝内、脾内、淋巴内、皮下、腹内、睾丸内、卵巢内、子宫内、胸骨、气管内、胸膜内(intraplueral)、胸内、硬膜内、脊柱内、脊髓内、壁内(intramural)、阴囊内(intrascorionic)和动脉的注射或输注，或者通过直肠、鼻内、吸入或眼内进行外部施用。在某些实施方案中，递送方法是肌内、心肌内、静脉内、脑内或肾内。

应理解，本发明经重构之冻干DNA制剂的典型每日剂量应根据多种相关因素(包括待治疗的状况，所选施用途径，患者个体的年龄、性别和体重，以及患者症状的严重程度)来确定，并且可以单一剂量或分开的剂量来施用。因此，每日剂量不应视为以任何方式对本发明进行限制。

本文使用的术语“治疗”缺血性疾病或肝脏疾病是指以足以改善缺血性疾病或肝脏疾病之一种或多种症状或者防止缺血性疾病或肝脏疾病发展的量向对象施用因子(例如HGF(如杂合HGF)，或其变体)。

“缺血性疾病”是指由于动脉血流入阻塞所造成的(如痉挛或疾病导致的动脉狭窄)向身体部分(如心或脑)供血不足有关的疾病。缺血性疾病的实例包括冠状动脉病(coronary artery disease，CAD)和外周动脉病(peripheral artery disease，PAD)。

术语“肝脏疾病”是指导致肝脏功能异常或停止发挥功能的多种疾病和病症。HGF是促进肝细胞增殖的主要物质，并且在肝脏再生期间与转化生长因子-α和肝素结合表皮生长因子共同作用。另外，HGF在暴发性肝衰竭动物模型中通过抗凋亡作用改善肝损伤，在患有肝硬化的动物中减弱肝纤维化。因此，在患有难治性肝脏疾病的患者中，HGF被认为不但诱导肝脏再生，还抑制疾病发展并改善肝纤维化。就肝脏疾病的治疗而言，可根据上述递送方法施用本发明的经重构之冻干DNA制剂。在某些实施方案中，肝脏疾病治疗中的递送方法是静脉内、动脉内或肝内的。

在本发明的某些方面，经重构的HGF DNA制剂可包含两种或更多种HGF同工型。所述HGF同工型可以之前分别冻干，或者在同一DNA制剂中。这些冻干同工型在重构后可分别施用或同时施用(即共施用)；可施用或共施用两种或更多种HGF同工型的分开的经重构质粒DNA制剂用，或者可施用含有两种或更多种HGF同工型并且能够表达两种或更多种HGF同工型基因的单个表达质粒。例如，可使用两种分开的质粒施用两种同工型flHGF和dHGF。或者，可使用含有flHGF和dHGF基因的两种分开的质粒用于共施用。最后，可施用含有flHGF和dHGF基因的单一表达质粒。在本发明的某些方面，单个表达质粒上的flHGF和dHGF由同一多核苷酸编码或者由分开的多核苷酸编码。

有多种方法可以在单个质粒上包含能够表达HGF同工型的多于一种多核苷酸。这些方法包括，例如，使用内部核糖体进入位点(InternalRibosome Entry Site，IRES)序列、双启动子/表达盒以及融合蛋白。如上所述，从同一质粒表达的或者在两个分开质粒上表达的两种或更多种同工型选自：flHGF、dHGF、NK1、NK2和NK4，或者选自SEQ ID NO：2至6。所述两种或更多种同工型还可包括本领域技术人员已知的其它HGF同工型。

在本发明的某些方面，通过直接细胞内注射施用质粒DNA，更优选地，通过利用注射器或导管来实现。导管已用于体内引入重组基因(参见例如E.G.Nabel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5157(1992)；E.G.Nabel等，Science 249，1285(1990)；E.G.Nabel等，Science 244，1342(1989)；E.G.Nabel等，J.Clin.Invest.91，1822(1993)；G.Plautz等，Circ.83，578(1991)；E.G.Nabel等，Nature(1993)(印制中))。利用导管提供了将质粒DNA递送到难以利用注射器到达的细胞中的能力。

可通过动脉内或静脉内注射施用质粒DNA，更优选地，通过利用注射器或导管来实现。例如，可利用股动脉来递送质粒DNA到心脏；可利用门静脉来递送质粒DNA到肝脏。

本发明质粒DNA的施用还可通过将基因原位转移进靶细胞来实现，以优化随后的体内基因递送。

除非另有指明，本发明的实施会用到细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括PCR)、疫苗学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域的常规技术之内。这些技术在文献中有充分的阐述。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook等编，ColdSpring Harbor Laboratory Press：(1989)；DNA Cloning，卷I和II(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Mullis等U.S.专利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins编1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Methods In Enzymology，卷154和155(Wu等编)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编，Academic Press，London，1987)；以及Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)中。本段所引用的每篇参考文献均通过引用以整体并入本文。

下列实施例仅以举例的目的给出，不旨在对本发明的范围产生限制。

实施例1：质粒的制备

在本实验中，使用设计用于表达肝细胞生长因子(HGF)蛋白的质粒pCK-HGF-X7(WO 03/078568)。

用pCK-HGF-X7转化大肠杆菌(TOP10，Invitrogen，USA)，分离单菌落。然后将所分离的单菌落在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。使用EndoFree质粒Giga试剂盒(Qiagen，USA)纯化质粒DNA，重悬于含有0.9％NaCl的盐水中，DNA终浓度为1.0～2.0mg/mL。

实施例2：冻干

在含有0.9％NaCl以及蔗糖(0.25、1.1、5、10或20％(重量/体积))或甘露醇(1.2、4.85或10％(重量/体积))的盐水中制备pCK-HGF-X7，DNA终浓度为0.5mg/mL或1mg/mL。表1A和1B分别显示所测试的pCK-HGF-X7制剂中蔗糖和甘露醇的百分比，以及对应的碳水化合物/DNA(重量/重量)比值。

表1A.蔗糖百分比

DNA(mg/ml)	蔗糖(％)	蔗糖(mg/ml))	蔗糖与DNA的比值(w/w)
				0.5	0.25	2.5	5
0.5	1.1	11	22
				0.5	5	50	100
0.5	10	100	200
				0.5	20	200	400
1	0.25	2.5	2.5
				1	1.1	11	11
1	5	50	50
				1	10	100	100
1	20	200	200

表1B.甘露醇百分比

DNA(mg/ml)	甘露醇(％)	甘露醇(mg/ml))	甘露醇与DNA的比值(w/w)
				0.5	1.2	12	24
0.5	4.85	48.5	97
				0.5	10	100	200
1	1.2	12	12
				1	4.85	48.5	48.5
1	10	100	100

然后用Production-Master冷冻干燥器(C&H Cooling&HeatingSystems，Korea)将悬浮的质粒DNA冻干。在100mTorr下将温度降至-50℃4小时。然后，在28～29mTorr下，依次将温度升至-40℃12小时，-30℃6小时，-20℃6小时，-10℃6小时，0℃6小时，10℃6小时以及30℃24小时。将冻干的质粒DNA保存于-20℃待分析。

还用Production-Master冷冻干燥器(C&H Cooling&HeatingSystems，Korea)将悬浮的质粒DNA冻干。在100mTorr下，将温度降至5℃1分钟，-50℃2小时。然后，在28～29mTorr下，依次将温度升至-40℃6小时，-35℃3小时，-30℃6小时，-25℃3小时，-20℃3小时，-15℃3小时，-10℃6小时，-5℃3小时，0℃6小时，以及30℃17小时。将冻干的质粒DNA保存于-20℃待分析。

还用Production-Master冷冻干燥器(C&H Cooling&HeatingSystems，Korea)将悬浮的质粒DNA冻干。在150mTorr下，将温度降至5℃1分钟，-10℃1分钟，-20℃1分钟，-30℃1分钟，以及-50℃1分钟。在150mTorr下，再将温度维持于-50℃2小时。然后，在30mTorr下，依次将温度升至-45℃6小时，-40℃3小时，-35℃6小时，-30℃3小时，-25℃6小时，-20℃3小时，-15℃6小时，-10℃3小时，-5℃6小时，0℃12小时，10℃3小时，20℃6小时，以及30℃29小时。将冻干的质粒DNA保存于-20℃待分析。

根据实施例3所述方法，分析上述制备的冻干制剂的体外基因表达效率。这些制剂的体外结果是一致的。

实施例3：冻干对质粒DNA体外基因表达效率的作用

1.材料和方法

为了评估冻干对质粒DNA基因表达效率的作用，将冻干质粒DNA转染进293T细胞，测量HGF的表达水平。还转染了非冻干质粒DNA，作为对照。

使用FuGENE6(Roche Diagnostics，Germany)将4μg不同制剂的pCK-HGF-X7(如上文实施例1中所述)转染进1×10⁶个293T细胞(n＝5)。转染之前，用2ml注射用水将1mg冻干质粒DNA重构，至终浓度0.5mg/mL。

转染后两天，获取培养上清，根据制造商的建议使用人HGF ELISA试剂盒(R&D Systems，MN，USA)分析HGF表达。使用SPSS程序(13.0版，SPSS，Inc.，USA)通过Dunnett多重比较检验对ELISA结果进行统计学评估。

2.结果和讨论

HGF基因表达的结果在图1中提供。与先前报道不同的是，冻干不影响质粒DNA的体外基因表达效率。在多种制剂中，来自与1.1％蔗糖和0.9％NaCl一起冻干的pCK-HGF-X7的HGF水平显著高于来自非冻干pCK-HGF-X7的HGF水平(p＝0.001)(图1)。

这些结果显示，与非冻干制剂相比，含有1.1％蔗糖和0.9％NaCl的冻干制剂更适合pCK-HGF-X7。

实施例4：非冻干和冻干pCK-HGF-X7的体内基因表达的比较分析

1.材料和方法

获得13只5周龄BALB/c小鼠(雄性，Charles River)用于每个组，不限量提供食物和水。在接受实验之前使小鼠休息7天。

将100μg含有0.9％NaCl的非冻干pCK-HGF-X7(NL-HGF-X7)或与1.1％蔗糖和0.9％NaCl冻干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7)注射进小鼠胫骨前肌，在处理后第7天处死。注射前，用水将冻干质粒DNA重构为终浓度0.5mg/mL。为了测量HGF蛋白质表达水平，收集所注射的肌肉，用500μL细胞裂解缓冲液(50mM NaCl，0.2％十二烷基硫酸钠，0.5％脱氧胆酸钠，2％IGEPAL CA-630，25mM Tris-HCl，pH7.4，1mM苯甲基磺酰氟)在4℃下将肌肉组织裂解16小时。以12000rpm离心裂解物5分钟，收获上清，使用人HGF ELISA试剂盒(R&D Systems)分析HGF表达。

使用SPSS程序(13.0版)通过单向ANOVA和随后的Tukey检验对ELISA结果进行统计学评估。

2.结果和讨论

施用与1.1％蔗糖和0.9％NaCl一起冻干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7)的动物产生平均246ng/mL的HGF蛋白，而施用非冻干pCK-HGF-X7的动物表达76ng/ml的HGF(图2)。此结果显示，与非冻干pCK-HGF-X7相比，与1.1％蔗糖和0.9％NaCl一起冻干的pCK-HGF-X7可以更高效地表达HGF蛋白(p＜0.001)。

实施例5：非冻干和冻干pCK-HGF-X7对猪缺血性心脏病模型治疗性作用的比较分析

1.材料和方法

(1)动物

获得11只Yorkshire猪(雄性，28～30kg，Clinical Research Institutein Seoul National University Hospital)，每天不限量提供食物和水。在接受实验之前使猪休息7天。总体实验方案示于图3中。

(2)建立猪缺血性心脏病模型

将噻拉嗪(xylazine)(2mg/kg)、氯胺酮(ketamine)(20mg/kg)和阿托品(0.05mg/kg)肌内注射到每只猪体内。20分钟后，将22号Medicutsheath插入股浅动脉，用于连续监测血压。静脉内注射硫喷妥钠(10mg/kg)，经口腔气管途径进行气管内插管。通过吸入安氟醚维持麻醉。在手术期间，维持正压换气和30％～40％的氧分压。持续监测心电图、氧饱和和动脉血压。

然后，进行左胸廓切开术。打开心包并随后检查左前降支冠状动脉(left anterior descending，LAD)，静脉内注射2％利多卡因(1mg/kg)，将LAD的远端三分之一结扎3分钟，尽可能多地留下第二对角支。使用由一小片Nelaton(4Fr)支持的5-0聚丙烯缝合线进行5分钟再灌注(缺血预处理)。该单一缺血预处理之后，结扎远端LAD，确定所监测的心电图上ST区段降低或升高。结扎后15分钟静脉内注射额外的利多卡因(1mg/kg)，闭合心包和胸廓切开术创口。当足够的自发呼吸恢复之后，立即去除连接到壁式引流器(wall suction)的单个28Fr胸管，然后除去气管内导管。

所有方案均经过首尔国立大学动物管理委员会(Seoul NationalUniversity Animal Care and Use Committee)的批准。

(3)质粒的心肌内注射

结扎冠状动脉后第28天，再次进行胸廓切开术。使用27号胰岛素注射针，将总剂量为1mg的与1.1％蔗糖和0.9％NaCl一起冻干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7，n＝3)或者含有0.9％NaCl的pCK-HGF-X7(NL-HGF-X7，n＝4)沿着第二对角支注射进位于纤维化梗死形成区域与大致正常的心肌之间的前外侧缺血性边界区中。总共注射五个部位。每个部位注射0.2mg质粒DNA，注射部位之间的间隔是1.5cm。注射之前，用水将冻干质粒DNA重构为终浓度1mg/mL。将同等量的含有0.9％NaCl的非冻干pCK(n＝4)注射到前外侧缺血性边界区，作为对照。使用金属环以缝合线便签对注射点进行标记。

(4)心肌单光子发射计算机断层分析

在手术诱导心肌梗死后第26天，进行^99mTc-MIBI门控单光子发射计算机断层分析(SPECT)(Vertex EPIC，ADAC Labs，CA.，USA)，以确定质粒注射前的基线值。在28天后(诱导心肌梗死后第54天)重复该门控SPECT。

选择20区段模型用作区段分析。将对应于心底(cardiac base)的六个区段排除出该分析，因为所述区域容易受到隔膜衰减(diaphragmaticattenuation)或者心脏周围一些人为因素的影响；还因为心底远离远端冠状动脉结扎和质粒注射的部位。

通过自定量程序(AutoQUANT，ADAC Labs，CA.，USA)分析心电图门控所构建的SPECT图像，其被认为去除了任何相关技术人员操作产生的可能偏好性。

通过测量^99mTc-MIBI的摄取对区段灌注量进行定量，计算为最大摄取的百分比。当由此估计的区段灌注小于70％时，定义为低灌注区段，并用作质粒递送的靶标。还排除掉即便在冠状动脉结扎后仍然良好灌注的区段，因为它们可能无法从治疗性血管生成中获益。心脏收缩期中的壁增厚表示为门控图像中末端心脏舒张壁厚度的百分比。

(5)统计学分析

数据表示为相对于基线值的改善百分比。所有数据使用SPSS(13.0版)分析。心肌灌注和区段壁增厚的统计分析使用成对样品Student t-检验来进行。

2.结果

在每个处理组中，比较质粒DNA注射前后区段灌注的变化。针对pCK、NL-HGF-X7和L-HGF-X7处理组，在LAD结扎后第26天所测量的平均区段灌注的基线值分别为39.0±14.6、43.4±13.4和36.9±16.3％。在第54天进行的^99mTc-MIBI门控SPECT显示pCK和NL-HGF-X7组中区段灌注平均值分别为37.8±13.9％和44.0±14.5％，其与第26天所测的基线值没有显著差异(对于pCK，p＝0.320；对于NL-HGF-X7，p＝0.721)。与之不同，L-HGF-X7处理组中区段灌注平均值为41.2±17.6％，显示相对于基线值有显著增加(p＝0.003)。在比较组之间区段灌注相比于基线值百分比增加的幅度时，L-HGF-X7处理组的区段灌注百分比增加比pCK处理组高出14.74％(p＝0.003)，而NL-HGF-X7处理组不显示与pCK处理组的显著差异(p＝0.254)(图4)。

在每个处理组中，还比较了DNA施用前后区段壁增厚的变化。在第26天，pCK、NL-HGF-X7和L-HGF-X7处理组的区段壁增厚的平均值分别为24.7±16.5、33.4±15.9和16.5±15.9％，各组之间没有显著差异(p值未标明)。在第54天，pCK、NL-HGF-X7和L-HGF-X7处理组的区段壁增厚的平均值分别为27.9±18.4、43.1±11.8和30.2±10.7％。当比较处理组之间区段壁增厚相对于基准值的百分比增加的幅度时，L-HGF-X7处理组的百分比增加为83.54％，其显著高于NL-HGF-X7组(28.99％)(图5)。

这些结果表明，与非冻干制剂(NL-HGF-X7)相比，冻干制剂(L-HGF-X7)的心肌内施用可更有效地增加左心室所注射缺血边界区的局部血流以及壁增厚。不希望受理论的限制，这可能是由于所表达之HGF-X7的血管发生和抗纤维化活性所致的。

3.总结

与非冻干pCK和pCK-HGF-X7处理组相比，在冻干pCK-HGF-X7处理组中，区段灌注和壁增厚显著增加。

这些结果表明，与非冻干pCK-HGF-X7相比，向患病猪经心肌内施用与1.1％蔗糖和0.9％NaCl一起冻干的pCK-HGF-X7可更有效且稳定地增加缺血心肌的局部灌注以及壁增厚。

尽管本发明已通过上述具体实施方案进行了描述，但是应理解，本领域技术人员可对本发明进行落入所附权利要求定义之本发明范围内的多种修改和改动。

Claims

1.包含质粒DNA、盐和碳水化合物的冻干DNA制剂，其中所述质粒DNA是pCK-HGF-X7，其中所述质粒DNA的终浓度为0.5mg/mL或1mg/mL，其中所述盐为0.9％的量的NaCl，其中所述碳水化合物为1.1％(w/v)的量的蔗糖。

2.权利要求1的冻干DNA制剂，其中所述DNA制剂的冻干包括：(a)将盛有所述DNA制剂的容器装入冻干机；(b)将所述DNA制剂冷却至零下的温度；以及(c)干燥所述DNA制剂。

3.权利要求1的冻干DNA制剂重构的组合物在制备用于治疗或预防对象中缺血性心脏病的药物中的用途，

其中所述冻干DNA制剂包含质粒DNA、盐和碳水化合物；以及

其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体。

4.权利要求3的用途，其中所述冻干DNA重构在可药用溶液中。

5.权利要求4的用途，其中所述可药用溶液选自：水、PBS、TE、Tris缓冲液和生理盐水。

6.权利要求3的用途，其中所述重构组合物通过直接注射来施用。

7.制备权利要求1的冻干DNA制剂的方法，其包括：

制备包含质粒DNA、盐和碳水化合物的DNA制剂，其中所述质粒DNA包含HGF基因或其变体；以及

冻干所述DNA制剂，由此制备所述冻干DNA制剂。

8.权利要求7的方法，其中所述DNA制剂的冻干还包括：(a)将盛有所述DNA制剂的容器装入冻干机；(b)将所述DNA制剂冷却至零下的温度；以及(c)干燥所述DNA制剂。